JP3886000B2 - 金属コロイド粒子 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫学的測定用標識剤及びタンパク質染色剤として好適な金属コロイド粒子およびその製造方法に関し、さらに詳細には、該金属コロイド粒子を用いた標識抗体または抗原、ならびに、該標識抗体または抗原が組み込まれた免疫学的測定用キットおよび免疫学的測定法に係る。
【0002】
【従来の技術】
免疫学的測定法、就中、イムノクロマト法(ICA法)は、その高い特異性に加え、簡易、迅速を特徴とする臨床診断法として実用化されている。イムノクロマト法は、操作が煩雑で重厚な設備、機器などを必要とせず、軽便な器具を使用した簡便な操作により、目視だけでも被検出物の有無を判定できる点で好都合である。
【0003】
近年、感染症の診断にイムノクロマト法が用いられているが、その検出感度は、一般に、細菌の場合、105〜107CFU/mlである。細菌の検出感度は遺伝子増幅法(PCR法)によれば103〜104CFU/mlまで達成されている。しかしながら、遺伝子増幅法は重厚な設備、機器および煩雑な操作が必要であり、しかも、検出までに数時間という長時間を要する。
【0004】
また、従来、B型肝炎ウイルスの免疫学的測定法による検出も行われているが、その感度は、最も高感度の酵素免疫定量法(ELISA法)でも104〜105PFU/mlである。感染可能なウイルスの濃度は103PFU/mlであるため、早期の診断感染予防には、現行の10倍から100倍の感度を有する診断法の開発が求められている。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
従来、イムノクロマト法(ICA法)では、細菌やウイルスを特異的に検出するために、金コロイドで標識された抗体を用いることが一般的である。しかしながら、この金コロイド標識を用いたイムノクロマト法の感度は、上記感染症診断に要求される感度を達成するためには必ずしも十分とは言えず、一層高感度な標識が求められている。タンパク質の染色に従来使用されている白金コロイド粒子を抗体の標識に用いることも考えられるが、イムノクロマト法においては白金コロイド粒子の平均粒径が小さいために発色が不充分であり、実用には適さないとされていた。
【0006】
本発明は、金コロイド粒子よりも一層高感度で、免疫学的測定用標識剤及びタンパク質染色剤として好適な金属コロイド粒子を提供することを目的とする。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的の下に鋭意研究した結果、金コロイド粒子の表面に白金微粒子を担持させることにより、金コロイドよりも一層高感度で、免疫学的測定用標識剤及びタンパク質染色剤として好適な金属コロイド粒子が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0008】
すなわち、本発明によれば、金コロイド粒子の表面に白金を担持させてなる金属コロイド粒子が提供される。本発明では、金コロイド粒子の表面が部分的にまたは全体的に白金で被覆されている態様も包含され、したがって、上記「担持」の用語は、この白金で被覆された態様も含むものである。
【0009】
タンパク質の染色に従来用いられている白金コロイド粒子は、粒径が最大で32オングストローム程度であったが、本発明の金属コロイド粒子は、金コロイド粒子の表面に白金を担持させた構成であるため、従来の白金コロイド粒子よりも見かけ上大きな粒径を有する白金コロイド粒子として機能するため、視認性に優れ、しかも、その表面は良好な白金活性を維持している。
【0010】
【発明の実施の形態】
本発明の金属コロイド粒子は、溶媒中にて塩化金酸を還元して金コロイド粒子を生成せしめ(以下「第1段還元」と記す)、しかる後、溶媒中にて該金コロイド粒子の存在下で塩化第二白金酸(H2[PtCl6](以下「塩化白金酸」と記す)を還元する(以下「第2段還元」と記す)ことによって製造することができる。とりわけ、還元剤を含む溶媒中にて塩化金酸を還元して適当な粒径まで金コロイド粒子を生成せしめた後、直ちに前記溶媒中に適量の塩化白金酸を添加して還元させることにより、前記溶媒中の金コロイド粒子の表面に白金または白金微粒子を担持させることが好ましい。
【0011】
還元剤としては、クエン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸ナトリウムなどが好適に使用されるが他の化合物を使用することを妨げない。
【0012】
溶媒としては、通常、水が用いられるが、超純水や、イオン交換水を数回蒸留したものを使用することが好ましい。また、第1段還元及び第2段還元の何れも、溶媒を沸騰させるか、または、溶媒に窒素ガスなどの不活性気体を吹き込んで70℃付近に維持して、溶媒から溶存酸素を除去した状態で行うことが好ましい。
【0013】
上記製造方法において、白金を担持させる前の金コロイド粒子の平均粒径は、好ましくは、30〜100nm(ナノメートル)程度とされ、さらに好ましくは、40〜80nm(ナノメートル)程度とされる。金コロイド粒子の平均粒径が過小の場合、白金層が厚くなり触媒活性が低下する。また、過大の場合には金コロイド粒子表面が安定化し、白金の担持が不可能となる。
【0014】
また、本発明の金属コロイド粒子の平均粒径は、実用上、通常は、50〜150nmナノメートル程度とされ、さらに好ましくは、60〜120nm(ナノメートル)程度とされる。金属コロイド粒子の平均粒径が過小の場合、抗体の標識が十分に行えなくなり抗体の機能が失われ、また、過大の場合、メンブレンフィルターを目詰まりさせることになる。
【0015】
本発明において、金コロイド粒子および金属コロイド粒子のそれぞれの平均粒径は、いわゆる重力的光散乱法により求められ、具体的には、各コロイド粒子をゾル状態のままで14000〜5530000×g(重力の大きさ)にて回転せしめた超遠心分離機にかけた際のコロイド粒子の沈降速度から求められる。なお、このようにして求められた金粒子および白金粒子のそれぞれの平均粒径は電子顕微鏡観察により直接測定された金粒子および白金微粒子のそれぞれの平均粒径と実質的に一致する。
【0016】
金コロイドおよび金属コロイドの粒径ならびに担持される白金の量及び厚さは、第1段還元および第2段還元のそれぞれにおける塩化金酸および塩化白金酸の添加量、還元剤の濃度、還元時間などの各種条件を変更することに適宜調節できる。還元剤の濃度は、第1段還元及び第2段還元の何れにおいても、溶媒全量に対して、0.02〜0.5重量/容量%(以下、特に断らない限り、「%」は「重量/容量%(w/v%)」を意味する)とすることが好ましい。
【0017】
第1段還元における塩化金酸の添加量は、溶媒全量に対して、0.001〜0.05%とすることが好ましい。第2段還元における塩化白金酸の添加量は、第1段還元で添加した塩化金酸100重量部に対して、100〜500重量部とすることが好ましい。還元時間は、一般に、第1段還元及び第2段還元のそれぞれにおいて、添加された全ての金コロイド及び白金コロイドが還元される時間に設定することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【0018】
本発明の金属コロイド粒子は、通常の白金コロイド粒子と同様に、タンパク質に吸着して集積することにより黒色を呈するので、各種タンパク質の染色剤として使用でき、また、通常の金コロイド粒子と同様に、免疫学的測定用標識剤として用いることができる。本発明の金属コロイド粒子は、表面に白金が存在するため、パーオキシダーゼ活性など、高い酸化還元触媒活性を有する。したがって、酸化還元反応によって呈色する発色剤と本発明の金属コロイド粒子とを併用することによって、タンパク質を高感度で検出できる。かかる発色剤としては、硫酸銅などの銅(II)イオンや、3,3’,5,5’−テトラメチルベンチジン(TMBZ)などが好適である。本発明の金属コロイド粒子は、TMBZの存在下では濃厚な青色に変色し、また、酸化銅や硫酸銅などの銅(II)イオンの存在下ではさらに濃厚な黒色を呈する。
【0019】
本発明の金属コロイド粒子は、常法により抗原および抗体のそれぞれを標識することができ、イムノクロマト法やその他の各種免疫学的測定法に使用できる。また、このようにして標識された抗原および抗体は、イムノクロマト法測定キットやその他の各種免疫学的測定キットに組み込むことができる。
【0020】
【実施例】
実施例1[白金微粒子被覆金コロイド粒子の調製]
(1)使用するガラス器具の全てを王水で洗浄した。
(2)390mlの超純水をフラスコに入れて沸騰させ、この沸騰水に塩化金酸水溶液(水溶液1リットル当たり金として1g、片山科学工業株式会社製)30mlを加え、その後、1重量%クエン酸ナトリウム水溶液60mlを加え、6分45秒後に、塩化白金酸水溶液(水溶液1リットル当たり白金として1g、和光純薬工業株式会社製)30mlを加えた。塩化白金酸水溶液添加から5分後に1重量%クエン酸ナトリウム水溶液60mlを加え、4時間、還流を行い、白金微粒子被覆金コロイド懸濁液を得た。
(3)得られた白金微粒子被覆金コロイド懸濁液1mlを13800×gで25分間遠心分離を行い、遠心分離後、上清を除き、残った沈殿に超純水を0.5ml加え、攪拌後、超音波で沈殿を再懸濁せしめ、この懸濁液を200mM炭酸カリウム水溶液でpH9.0に調整し、これに超純水を加えて全量を100mlとして白金微粒子被覆金コロイド再懸濁液を得た。この再懸濁液中の白金微粒子被覆金コロイドの平均粒径を、動的光散乱式粒径分布測定装置LB−500((株)堀場製作所製)によって測定したところ、90ナノメートル(nm)であった。
【0021】
実施例2[白金−金コロイド標識抗体の調製]
抗ヒトCRP(C反応性蛋白、C−reactive protein)マウス単クローン抗体(株式会社日本バイオテスト研究所製)の蛋白換算重量1μg(以下、抗体の重量を示すとき、その蛋白換算重量を示す)と、実施例1で得られた白金微粒子被覆金コロイド再懸濁液1mlとを混合し、室温で2分間静置して、この抗体の全量を該再懸濁液中の白金微粒子被覆金コロイド粒子(以下「白金−金コロイド粒子」と記す)と結合させた。
【0022】
これに最終濃度が0.2%となるように1%ウシ血清アルブミン(以下「BSA」と記す)水溶液を加えて、上記抗体に結合せしめられた白金−金コロイド粒子の表面をブロックした。この懸濁液を553×gで25分間遠心分離して、白金−金コロイド粒子の表面がBSAでブロックされた白金−金コロイド標識抗体を沈殿せしめて集めた。この白金−金コロイド標識抗体を、0.05%ツイーン(Tween)20および1%BSAを含有する50mMトリス塩酸塩緩衝液(pH7.4)に再懸濁して、精製白金−金コロイド標識抗体懸濁液を得た。
【0023】
実施例3[イムノクロマト法テストストリップの作成]
図1に示されるイムノクロマト法テストストリップを作成した。すなわち、幅5mm、長さ36mmの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターをクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体3として用意した。該膜担体のクロマト展開始点側の末端から7.5mmの位置に、抗ヒトCRPマウス単クローン抗体6.3mg/mlを含有した抗体液0.5μgをスポット状に塗布して、これを室温で乾燥して捕捉部位31とした。この捕捉部位31が発色を観察する判定ゾーンとされる。なお、この抗ヒトCRPマウス単クローン抗体は、免疫反応において、抗原であるヒトCRPに対する結合部位が、実施例2の白金−金コロイド標識抗体の調製に使用された抗体とは異なる抗体をいう。
(2)また、5mm×15mmの帯状のガラス繊維不織布に、実施例2で得られた精製白金−金コロイド標識抗体懸濁液37.5lμlを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて精製白金−金コロイド粒子標識抗体含浸部材2とした。
【0024】
(3)次に、試料添加用部材である綿布5、上記の精製白金−金コロイド標識抗体含浸部材2、クロマト展開用膜担体3および吸収用部材4である帯状の濾紙のそれぞれを、図1に示されるように、帯状の粘着シート1の粘着面の所定位置に貼着してイムノクロマト法テストストリップとした。すなわち、このクロマト展開用膜担体3を粘着シート1の中程に貼着し、該膜担体3のクロマト展開の開始点側(すなわち図1の左側、以下「上流側」と記す、また、その逆の側、すなわち図1の右側を、以下「下流側」と記す)の末端の上に、精製白金−金コロイド粒子標識抗体含浸部材2の下流側末端を重ね合わせて連接するとともに、この含浸部材2の上流側部分を粘着シート1に貼着し、該含浸部材2の上面に試料添加部材5の下流側部分を載置するとともに、該試料添加部材5の上流側部分を粘着シート1に貼着した。さらに、膜担体3の下流側部分の上面に吸収用部材4の上流側部分を載置するとともに、該吸収用部材4の下流側部分を粘着シート1に貼着せしめて、イムノクロマト法テストストリップを得た。
【0025】
比較例1[金コロイドの調製]
(1)使用するガラス器具の全てを王水で洗浄するかまたはシリコンコーティングした。
(2)99mlの超純水をフラスコに入れて沸騰させ、この沸騰水に塩化金酸(片山科学工業株式会社製)水溶液(水溶液1リットル当たり金として5.8g)1mlを加え、さらにその1分後に、1重量%クエン酸ナトリウム水溶液1.5mlを加え、5分間還流を行い、その後、室温に放置して冷却し、懸濁液を得た。次いで、この懸濁液を200mM炭酸カリウム水溶液でpH9.0に調整し、これに超純水を加えて全量を100mlとして金コロイド懸濁液を得た。
【0026】
比較例2[金コロイド標識抗体の調製]
白金微粒子被覆金コロイド再懸濁液の代わりに比較例1の金コロイド懸濁液を用いた以外、実施例2と同様にして、金コロイド標識抗体を得た。
【0027】
比較例3[イムノクロマト法テストストリップの作成]
白金−金コロイド標識抗体の代わりに比較例2の金コロイド標識抗体を使用した以外、実施例3と同様にして、イムノクロマト法テストストリップを得た。
【0028】
試験例1[イムノクロマト法による測定]
実施例3及び比較例3で得られたイムノクロマト法テストストリップを使用して、抗原であるリコンビナントCRPを測定した。すなわち、リコンビナントCRP(オリエンタル酵母工業株式会社製)を、0.25%ツイーン(Tween)20および0.25%BSAを含む0.1mMリン酸緩衝液(pH7.4)と混合し、リコンビナントCRPの濃度が15.6、31.3、62.5、125および250pg(ピコグラム)/mlの供試液を調製した。これらの供試液100μlを、上記のイムノクロマト法テストストリップの試料添加部材5上に滴下して膜担体3に展開せしめ、15分後に捕捉部位31の発色の濃度を肉眼で観察した。ブランクは0.25%ツイーン(Tween)20および0.25%BSAを含む0.1mMリン酸緩衝液(pH7.4)とした。結果を表1に示す。発色濃度の判定は、下記4段階基準に従った。
【0029】
++:濃い黒色に発色、
+ :黒色に発色、
± :薄い黒色に発色、
− :発色せず。
【0030】
【表1】
【0031】
表1の結果から、本発明の白金−金コロイド粒子で標識された抗体を使用した場合には、抗原であるリコンビナントCRPを15.6pg/mlまで測定できるのに対し、金コロイド粒子で標識された抗体を使用した場合には抗原であるリコンビナントCRPを250pg/mlまでしか測定できないことが判る。したがって、本発明の白金−金コロイド粒子は、従来の金コロイド粒子よりも約16倍の感度を有する。
【0032】
試験例2[発色剤を併用したイムノクロマト法による測定]
試験例1における展開後のイムノクロマト法テストストリップの捕捉部位31に3,3’,5,5’−テトラメチルベンチジン(TMBZ)(ペルオキシダーゼ用発色キットST(株式会社タウンズ製))を1μl加え、10分間静置後に青色の発色の濃度を肉眼で観察した。発色の濃度の判定は、下記5段階基準に従った。
【0033】
+++:非常に濃い青色に発色、
++:濃い青色に発色、
+ :青色に発色、
± :薄い青色に発色、
− :発色せず。
【0034】
【表2】
【0035】
表2の結果から、白金−金コロイド粒子で標識された抗体とTMBZを併用した場合には、抗原であるリコンビナントCRPを3.91pg/mlまで測定できることが示された。したがって、本発明の白金−金コロイド粒子に発色剤を併用することによって、従来の金コロイド粒子の約60倍以上も感度を向上できる。
【0036】
【発明の効果】
本発明の金属コロイド粒子は、タンパク質染色剤および免疫学的測定用標識剤として有用であり、特に、イムノクロマト法の標識剤として用いた場合、従来の金コロイドの10倍以上の感度が得られる。さらに、本発明の金属コロイド粒子は、白金同様の酸化還元触媒活性を有するので、酸化還元反応によって呈色する発色剤と併用することにより、従来の金コロイドの60倍以上の感度が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図1】aは本発明によるイムノクロマト法テストストリップの平面図、bはaで示されたクロマト法テストストリップの縦断面図。
【符号の説明】
1 粘着シート
2 標識抗体含浸部材
3 クロマト展開用膜担体
31 捕捉部位
4 吸収用部材
5 試料添加部材
Claims (11)
- 金コロイド粒子の表面に白金を担持させてなる金属コロイド粒子。
- 金属コロイド粒子の平均粒径が50〜150ナノメートルである請求項1に記載の金属コロイド粒子。
- 金コロイド粒子の平均粒径が30〜100ナノメートルである請求項1記載の金属コロイド粒子。
- 溶媒中にて塩化金酸を還元して金コロイド粒子を生成せしめた後、該金コロイド粒子の存在下で塩化白金酸を還元することを特徴とする金属コロイド粒子の製造方法。
- 請求項1に記載の金属コロイド粒子を含有するタンパク質染色剤。
- 請求項1に記載の金属コロイド粒子を含有する免疫学的測定用標識剤。
- 請求項1に記載の金属コロイド粒子によって標識された抗体または抗原。
- 請求項7に記載の抗体または抗原を備える免疫学的測定用キット。
- 請求項7に記載の抗体または抗原を使用することを特徴とする免疫学的測定法。
- 免疫学的測定がイムノクロマト法に基づくものである請求項8に記載の免疫学的測定用キット。
- 免疫学的測定法がイムノクロマト法である請求項9に記載の免疫学的測定法。
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