JP2008058208A - 単鎖可変部抗体を用いたイムノクロマト法 - Google Patents
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Abstract
【課題】抗原に対する結合性を有する組換え蛋白を用いたサンドイッチ式免疫測定法、とりわけイムノクロマトグラフィー測定法、並びに、これに用いるに好適な組換え蛋白を提供する。
【解決手段】測定対象である抗原に対する第一の結合物と第二の結合物とを用いたサンドイッチ式免疫測定法であって、第一の結合物と第二の結合物の少なくとも一つが、該抗原に対する抗体の重鎖可変部と軽鎖可変部とを備えた組換え蛋白からなる。組換え蛋白はファージディスプレイ法で得られた一本鎖（単鎖）可変部断片型抗体（ｓｃＦｖ抗体）であることが好ましい。
【選択図】図８
【解決手段】測定対象である抗原に対する第一の結合物と第二の結合物とを用いたサンドイッチ式免疫測定法であって、第一の結合物と第二の結合物の少なくとも一つが、該抗原に対する抗体の重鎖可変部と軽鎖可変部とを備えた組換え蛋白からなる。組換え蛋白はファージディスプレイ法で得られた一本鎖（単鎖）可変部断片型抗体（ｓｃＦｖ抗体）であることが好ましい。
【選択図】図８
Description
本発明は、抗原に対する結合性を有する組換え蛋白、特に、一本鎖（単鎖）可変部断片型抗体（ｓｃＦｖ抗体）を用いたサンドイッチ式免疫測定法、特に、イムノクロマトグラフィー測定法及びイムノクロマト法テストストリップ、並びに、これに用いるに好適な組換え蛋白に関する。
抗原を２つの抗体でサンドイッチすることにより検出するサンドイッチ式免疫測定法では、現在、モノクローナル抗体が広く使用されている。
モノクローナル抗体は、精製した抗原でマウスを免疫し、数ヶ月後に抗原に対する抗体価が十分に上昇していることを確認した後、脾臓を取り出し、マウスミエローマー細胞と融合させ、ハイブリドーマを作製する。その後、抗原を認識する抗体を産生している融合細胞をクローニングする。次に、その細胞を培養するか、マウス腹腔内に移植することで、同一な性能を持った抗原を認識する抗体を作製することができる。しかしながら、上記方法により抗体を作製するためには、多くの労力、時間、費用がかかる。
一方、抗体を取得する他の方法として、最近、ファージ提示法が研究されている。
ファージ提示法に関する技術的経緯は、伊庭、抗体作製の新技術、癌の臨床、４８巻、２号、ｐ５５−６６、２００２、特許ＷＯ０１／６２９０７，堀内ら、蛋白質・核酸・酵素，Ｖｏｌ３４，Ｎｏ１４，ｐ．２５８９−２５９８、（１９９２）などに記載されており、これを整理すると次のようになる。
ファージディスプレイ法はＳｍｉｔｈにより１９８５年（Ｓｍｉｔｈ ＧＰ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８５ ２２８：４０７５ １３１５−１３１７）に考案された。
Ｐａｒｍｌｅｙ，Ｓ．Ｆ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．は１９８８年（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２４０、１０３８−１０４１）にｇ３ｐ蛋白のシグナルペプチド直後の２番目と３番目のアミノ酸の間に異種蛋白の遺伝子を組込み雑種蛋白としてｇ３ｐを発現させ、本来のｇ３ｐの機能も損なわれないことを示した。
Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８８）（Ｂｅｔｔｅｒ Ｍ，Ｃｈａｎｇ ＣＰ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＲＲ，Ｈｏｒｗｉｔｚ ＡＨ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８，２４０：４８５５ １０４１−３）とＳｋｅｒｒａとＰｌｕｋｔｈｕｎ（１９８８）（Ｓｋｅｒｒａ Ａ，Ｐｌｕｋｔｈｕｎ Ａ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８，２４０：４８５５ １０３８−４１）は、Ｆａｂ型とＦｖ型抗体を大腸菌中で分泌シグナル発現で活性型抗体の作製法を示した。
Ｈｕｓｅ．Ｗ．Ｄ．， Ｌｅｒｎｅｒらは、（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９，２４６，１２７５−１２８１）λ―ファージを用いてハプテン（ＮＰＮ）に対する抗体を単離できることを報告した。
Ｏｒｌａｎｄｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８９ ８６：１０ ３８３３−７，Ｓａｓｔｒｙ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８９ ８６：１５ ５７２８−３２）は、１９８８年に発表されたＰＣＲ法を用い、抗体可変領域をコードするＶＨＤＪＨ、ＶＬＪＬ遺伝子を増幅するためのプライマー配列を考案した。
Ｈｕｓｅ ＷＤ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９ ２４６：４９３５ １２７５−８１，Ｗａｒｄ ＧＥ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９８９ ２７：１２ ２７１７−２３）は、これらのプライマーによって増幅した抗体遺伝子を利用して、大腸菌中で抗体を産生させるためのベクターが構築された。
ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ Ｊ， Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３４８ １９９０，５５２−５５４）は、繊維上ファージに活性を持った形でｓｃＦｖ抗体を提示する方法を示した。この時点では、抗体遺伝子はファージＤＮＡに組込んでいた。この技術は、目的抗原に結合するファージを単離すればその抗体遺伝子を単離できたことになる。
Ｎｉｓｓｉｍ Ａ，Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．（ＥＭＢＯ Ｊ １９９４ １３：３ ６９２−８）は、親和性向上試みの一つとして、人為的に遺伝子に変異を導入する方法を報告している。これは、単離した全てのＶＨ、ＶＬ遺伝子と、ＪＨ、ＪＬ遺伝子の間にランダムな配列を挿入する半人工的配列を持つ抗体ライブラリーを作製することにより、親和性に優れた抗体の取得を可能とする抗体ライブラリーを得るというものである。
Ｄｅ ＫｒｕｉｆＪ，Ｂｏｅｌ Ｅ，Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ Ｔ （Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９５ ２４８：１ ９７−１０５）も同様のライブラリー作製法を報告している。
Ｖａｕｇｈａｎ ＴＪ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９６ １４：３ ３０９−１４）は、ライブラリーの大きさを拡充し充分な大きさの抗体レパートリーを確保したとしている。
ファージ提示法の利点として次のことが考えられる。
（１）短期間で作製可能である。すなわち、ファージ抗体はハイブリドーマ法から作製するモノクローナル抗体に比較して、開発期間を大幅に短縮できる可能性が高い。また、大腸菌での培養により抗体を作製できるため安価に短期で作製できる。
（２）遺伝子配列が解かるので、改変が容易であるため、特異性・反応性を容易に向上させることが期待でき、また、修飾が容易であるため、Ｈｉｓ−Ｔａｇなどの精製用タグやＧＦＰなど蛍光タンパクを導入することが容易になり、精製や検出も容易となる。
（３）プラスミドＤＮＡとしておけば、−２０℃で半永久的に、また、常温でも数日間保てるので、保存が容易である。
（４）抗体価の上昇が十分ならば、脾臓の一部すなわち１０％以下、場合によっては１％でも作製が可能であるので、ハイブリドーマ法との併用も可能である。理論的には、血液のみから作製できる。
（５）マウス以外の動物でもモノクローナル抗体が作製できる。
（６）ハイブリドーマ法に比べスクリーニング時の抗原量が少なくてよい。
（７）抗体価が必ずしも十分上昇していなくても作製可能である。
（８）免疫は必ずしも必須ではないので、通常マウス等で免疫出来ない毒性のある物質に対しても抗体を作製できる。
（１）短期間で作製可能である。すなわち、ファージ抗体はハイブリドーマ法から作製するモノクローナル抗体に比較して、開発期間を大幅に短縮できる可能性が高い。また、大腸菌での培養により抗体を作製できるため安価に短期で作製できる。
（２）遺伝子配列が解かるので、改変が容易であるため、特異性・反応性を容易に向上させることが期待でき、また、修飾が容易であるため、Ｈｉｓ−Ｔａｇなどの精製用タグやＧＦＰなど蛍光タンパクを導入することが容易になり、精製や検出も容易となる。
（３）プラスミドＤＮＡとしておけば、−２０℃で半永久的に、また、常温でも数日間保てるので、保存が容易である。
（４）抗体価の上昇が十分ならば、脾臓の一部すなわち１０％以下、場合によっては１％でも作製が可能であるので、ハイブリドーマ法との併用も可能である。理論的には、血液のみから作製できる。
（５）マウス以外の動物でもモノクローナル抗体が作製できる。
（６）ハイブリドーマ法に比べスクリーニング時の抗原量が少なくてよい。
（７）抗体価が必ずしも十分上昇していなくても作製可能である。
（８）免疫は必ずしも必須ではないので、通常マウス等で免疫出来ない毒性のある物質に対しても抗体を作製できる。
以上が一般的に言われている極めて優れた利点であるが、実際に実用的に利用できている例は稀である。原因の一つは、ライブラリー作製が極めて高度な技術蓄積なくてはできないことにあった。
以上のように、目的とするモノクローナル抗体を産生するモノクローナル抗体産生株を選抜、維持するためには、かなりの時間、労力、費用および設備を必要とする。とりわけ、ハイブリドーマ法におけるスクリーニングは多大な労力の上に成り立つ。その上、この方法での最大の欠点は、細胞融合されたものしか扱っていない点である。
一方、ファージ提示法に基づく作製方法は、抗体遺伝子を直接扱うため抗体遺伝子群を網羅するいわゆる抗体遺伝子ライブラリーの作製ができれば、原理的には抗体の抗原認識部位すなわちｓｃＦｖ抗体及び抗体の可変領域のＤＮＡ及びアミノ酸配列を解明することができる。したがって、大腸菌などの異種生物での生産やその配列情報を基に人工的に抗原認識分子の合成が可能になる。しかしながら、非免疫ライブラリーから親和性または特異性の高い抗体を得ることは容易ではなく、変異導入などの親和性等の機能向上を経て利用できるレベルになるのが通例である。また、ライブラリー作製技術をもつ一部の限られた研究機関のみが利用できているに過ぎない。
ライブラリー作製では、抗体遺伝子群にその切断部位を持たないであろう８塩基認識制限酵素が良く使われる。
本発明者らは、ライブラリー作製の失敗の多くは制限酵素処理がうまくいっているかどうか確かめる手段がなく次の工程へ行くことにあることに着目した。
本発明者らは、ライブラリー作製の失敗の多くは制限酵素処理がうまくいっているかどうか確かめる手段がなく次の工程へ行くことにあることに着目した。
そこで、本発明者らは、ＤＮＡ断片を一旦ＴＡクローニングでベクターに組入れ、ＤＮＡ量を増やすとともに、制限酵素切断を確実にする方法を発明した。このことにより、ファージ抗体遺伝子ライブラリーの作製を確実なものとした。その実証としてＣＲＰを認識するマウスｓｃＦｖ抗体をファージ表面に提示させたファージディスプレイライブラリーから単離し、その可変領域のアミノ酸配列を決定することに成功した。そして、このライブラリーから選択した組換え蛋白が、サンドイッチ式免疫測定法、とりわけイムノクロマトグラフィー測定法において使用でき、高感度な免疫測定を可能にすることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の一局面によれば、測定対象である抗原に対する第一の結合物と第二の結合物とを用いたサンドイッチ式免疫測定法であって、第一の結合物と第二の結合物の少なくとも一つが、該抗原に対する抗体の重鎖可変部と軽鎖可変部とを備えた組換え蛋白からなることを特徴とするサンドイッチ式免疫測定法が提供される。
また、本発明の他の局面によれば、測定対象である抗原に対する第一の結合物を予め所定位置に固定せしめて形成された捕捉部位を備える膜担体を用意し、前記抗原に対する第二の結合物と所定量の被験試料との混合液を、前記捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記被験試料中に含まれる抗原と前記第二の結合物との複合体を前記捕捉部位に捕捉させるイムノクロマトグラフィー測定法において、前記第一の結合物と前記第二の結合物の少なくとも一つが、該抗原に対する抗体の重鎖可変部と軽鎖可変部とを備えた組換え蛋白からなることを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法が提供される。
また、本発明の更に他の局面によれば、測定対象である抗原に対する第一の結合物と第二の結合物と膜担体とを少なくとも備え、前記第一の結合物は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の結合物は適当な標識物質で標識され、かつ、前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なよう配置されてなるイムノクロマト法テストストリップにおいて、前記第一の結合物と前記第二の結合物の少なくとも一つが、該抗原に対する抗体の重鎖可変部と軽鎖可変部とを備えた組換え蛋白からなることを特徴とするイムノクロマト法テストストリップが提供される。
また、本発明によれば、Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）を測定する本発明の免疫測定法で第一の結合物及び／または第二の結合物として使用するに好適な組換え蛋白として、配列番号１または配列番号２の重鎖可変部及び軽鎖可変部に対応するアミノ酸配列を備える組換え蛋白が提供される。配列番号１または配列番号２の重鎖可変部及び軽鎖可変部に対応するアミノ酸配列とは、リンカー部のアミノ酸配列を除いた部分を意味する。リンカー部のアミノ酸配列は当業者が適宜選択できる。これらの組換え蛋白は、本発明においては、その均等物、すなわち、配列番号１または配列番号２の重鎖可変部及び軽鎖可変部に対応するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＲＰに対する結合性を有するタンパク質をも包含するものとして定義される。
また、本発明によれば、本発明の組換え蛋白を作製するために有用な抗体遺伝子ライブラリーの作製方法として、抗体遺伝子群をＴベクターにライゲーションして増殖させる工程と、この増殖されたＴベクターを分離する工程と、この分離されたＴベクターから抗体遺伝子群を切り出してファージミドベクターにライゲーションして宿主に導入する工程とを備えることを特徴する抗体遺伝子ライブラリーの作製方法が提供される。
また、本発明によれば、かかる抗体遺伝子ライブラリーの好ましい作製方法として、抗体遺伝子群をＴベクターにライゲーションして増幅させる工程と、この増殖されたＴベクターを制限酵素処理するとともに、予めコントロールインサートが挿入されたファージミドベクターを前記制限酵素と同様の制限酵素で処理して前記制限酵素処理されたＴベクターと混合した後ライゲーションする工程と、このライゲーションに付された混合物に前記コントロールインサート及びＴベクターを消化する制限酵素を作用させた後、抗体遺伝子群がライゲーションされたファージミドベクターを選択的に宿主に導入する工程とを備えることを特徴する抗体遺伝子ライブラリーの作製方法が提供される。
また、本発明によれば、本発明の組換え蛋白を作製するために有用な抗体遺伝子ライブラリーの作製方法として、抗体遺伝子群をＴベクターにライゲーションして増殖させる工程と、この増殖されたＴベクターを分離する工程と、この分離されたＴベクターから抗体遺伝子群を切り出してファージミドベクターにライゲーションして宿主に導入する工程とを備えることを特徴する抗体遺伝子ライブラリーの作製方法が提供される。
また、本発明によれば、かかる抗体遺伝子ライブラリーの好ましい作製方法として、抗体遺伝子群をＴベクターにライゲーションして増幅させる工程と、この増殖されたＴベクターを制限酵素処理するとともに、予めコントロールインサートが挿入されたファージミドベクターを前記制限酵素と同様の制限酵素で処理して前記制限酵素処理されたＴベクターと混合した後ライゲーションする工程と、このライゲーションに付された混合物に前記コントロールインサート及びＴベクターを消化する制限酵素を作用させた後、抗体遺伝子群がライゲーションされたファージミドベクターを選択的に宿主に導入する工程とを備えることを特徴する抗体遺伝子ライブラリーの作製方法が提供される。
本発明によれば、一本鎖（単鎖）可変部断片型抗体（ｓｃＦｖ抗体）などの組換え蛋白を用いることとしたので、イムノクロマトグラフィー測定法などのサンドイッチ式免疫測定法に適する小型化抗体が得られる。ｓｃＦｖ抗体作製のためにファージ提示（ディスプレイ）法を用いることができるが、このファージ提示法により、抗体遺伝子ライブラリーを少なくとも５．０ｘ１０の７乗以上の多様性を保ったライブラリーとして作製することを容易に行えるようになったので、上記免疫測定法において抗原との反応特異性に優れた所望の組換え蛋白が得られる。また、最終的に抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のＤＮＡ及びアミノ酸配列を明らかにすることができるので、当該組換え蛋白の特性を向上させるための改変も容易に行える。
また、この組換え蛋白は、分子量が小さいため、標識物質である金コロイド等への固相化量を上げることができるので、免疫測定法において有利である。
また、この組換え蛋白は抗体の可変部のみを備え、Ｆｃ部分を有さないため、免疫測定時、細菌が産生するプロテインＡやＧによる非特異反応を抑制することができる。例えば、プロテインＡは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、プロテインＧは、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）に由来するため、臨床検体等ではこれらが混在する可能性が高く、測定値に影響を与えることが懸念されるがこれを排除できる。
また、この組換え蛋白は抗体の可変部のみを備え、Ｆｃ部分を有さないため、免疫測定時、細菌が産生するプロテインＡやＧによる非特異反応を抑制することができる。例えば、プロテインＡは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、プロテインＧは、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）に由来するため、臨床検体等ではこれらが混在する可能性が高く、測定値に影響を与えることが懸念されるがこれを排除できる。
加えて、いわゆる開放型サンドイッチ免疫アッセイ法は、低分子化合物のハプテンの検出のために開発されたものである（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００；Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９；Ｙｏｋｏｚｅｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００２）。これらは、いくつかの抗体の別々のＶＨおよびＶＬ鎖の会合が、抗原の存在下で起こる現象を利用した非競合的なアッセイ法である（Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。このためには、ＶＨ及びＶＬを調整する必要があるが、方法では遺伝子配列が解かるので調整が容易となる。
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
本明細書で用いる、いくつかの技術用語を次に定義する。
「ＰＣＲ」：ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
「ｓｃＦｖ」：抗体フラグメントである単鎖Ｆｖを意味する。
「ＶＬ」：軽鎖可変部を意味する。
「ＶＨ」：重鎖可変部を意味する。
「ＰＢＳ」：リン酸緩衝生理食塩水を意味する。
「ａｍｐ」：アンピシリンナトリウムを意味する。
「２×ＬＡＴａｑ ｍｉｘ」は、タカラバイオ社製のＬＡ Ｔａｑ ポリメラーゼ ０．５Ｕ，１０×ＬＡＴａｑ（＋Ｍｇ） ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ，を加え２５μｌとなるよう精製水を加えたもの。通常ＰＣＲ時には鋳型ＤＮＡとプライマーが加えられ、精製水で５０μｌにして用いる。
「２×ＹＴ」：２×ＹＴ培地を意味し、Ｂａｃｔｏ ｔｒｙｐｔｏｎｅ １６ｇ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ、ＮａＣｌ５ｇを精製水で混合し、ｐＨ７．５付近にあわせ、１リットルとしたもの。
「２×ＹＴａ」：「２×ＹＴ」に終濃度１００μｇとなるように「ａｍｐ」を加えたものを意味する。
「２×ＹＴＧａ」：「２×ＹＴａ」に終濃度１％となるように「グルコース」を加えたものを意味する。
本明細書で用いる、いくつかの技術用語を次に定義する。
「ＰＣＲ」：ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
「ｓｃＦｖ」：抗体フラグメントである単鎖Ｆｖを意味する。
「ＶＬ」：軽鎖可変部を意味する。
「ＶＨ」：重鎖可変部を意味する。
「ＰＢＳ」：リン酸緩衝生理食塩水を意味する。
「ａｍｐ」：アンピシリンナトリウムを意味する。
「２×ＬＡＴａｑ ｍｉｘ」は、タカラバイオ社製のＬＡ Ｔａｑ ポリメラーゼ ０．５Ｕ，１０×ＬＡＴａｑ（＋Ｍｇ） ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ，を加え２５μｌとなるよう精製水を加えたもの。通常ＰＣＲ時には鋳型ＤＮＡとプライマーが加えられ、精製水で５０μｌにして用いる。
「２×ＹＴ」：２×ＹＴ培地を意味し、Ｂａｃｔｏ ｔｒｙｐｔｏｎｅ １６ｇ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ、ＮａＣｌ５ｇを精製水で混合し、ｐＨ７．５付近にあわせ、１リットルとしたもの。
「２×ＹＴａ」：「２×ＹＴ」に終濃度１００μｇとなるように「ａｍｐ」を加えたものを意味する。
「２×ＹＴＧａ」：「２×ＹＴａ」に終濃度１％となるように「グルコース」を加えたものを意味する。
本発明で第一の結合物または第二の結合物として使用される組換え蛋白は、抗原に対する抗体の重鎖可変部と軽鎖可変部とを備えたものであれば特に限定されないが、通常、ファージ提示法によって得ることができる。
ファージ提示型抗体は、公知の方法により作製することができる。当該作製方法は、Ｍａｒｋｓ ＪＤほか、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２、ｐ．５８１−５９７、１９９１年；Ｎｉｓｓｉｍ Ａほか、ＥＭＢＯ Ｊ．１３、ｐ．６９２−６９８、１９９４年等、幾つかの文献より知ることができる。特に、Ａ．Ｒ．Ｐｏｐｅら（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９６）には、より具体的なプロトコールとして記載されている。そこで、本明細書記載の方法もこれを基本にして改良を加えて行なった。
実験の概略を次に示す。なお、以下の記述は、抗体作製法確立のためのモデル抗原物質として、乳幼児の感染症の診断に重要視されている炎症マーカーのＣ−反応性タンパク（ＣＲＰ）を用いて行う。しかし、本発明における抗原物質を、これに限定するものではない。
〔１〕抗体遺伝子ライブラリーの作成
（１）ＣＲＰで免疫したマウス脾臓を試料とし、脾臓細胞を用いた。なお、リンパ球を分画し用いてもよい。
（２）（１）からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いて、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する。
（３）ｔｏｔａｌＲＮＡからｍＲＮＡを抽出してもよいがここでは省略できる。
（４）ＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（インビロジェン社）を用いて、ランダムヘキサマーでｃＤＮＡを作製する。抗体特異的なプライマーも既に公知でありこれらを用いてもよい。
（５）ｃＤＮＡを鋳型に、各種プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、抗体遺伝子を増幅する。
（６）増幅した抗体遺伝子を制限酵素ＳｆｉＩとＮｏｔＩで消化し、同じ制限酵素でファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（アマシャム）を消化し、リガーゼを用いて結合し組み込む。なお、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ、ｐＨＥＮ１（ＭＲＣ製）、ｐＨＥＮ１−ＧＴなどのファージミドベクターを用いても良い。
（７）エレクトロポレーション装置を用いて、ＸＬ１−ｂｌｕｅ大腸菌細胞に導入する。なお、ＪＭ１０９、ＴＧ１などその他のＡｍｂｅｒ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ要求性λファージ増殖用宿主大腸菌でも良い。
（８）エレクトロポレーション後、２×ＹＴＧａに懸濁し、Ｏ／Ｎ、３０℃で振とう培養する。
（９）培養菌体を遠心・集菌し、グリセロールストックとして−８０℃に保存する。一部は２×ＹＴＧａ（ＤＩＦＣＯの２×ＹＴをベースに１％グルコース、＋ａｍｐ）培地に再懸濁し３７℃で振とう培養する。
（１０）濁度（ＯＤ６００）が約０．５になったとき集菌し、２×ＹＴａ（２×ＹＴ＋ａｍｐ）に懸濁後、Ｍ１３Ｋ０７を加え３７℃で１時間振とう培養する。
（１１）２×ＹＴａを３倍量追加し、カナマイシンを７０μｇ／ｍｌになるように加えて３７℃で一晩振とう培養する。
（１２）遠心して培養上清を回収し、ＰＥＧ−ＮａＣｌでファージを沈殿後、ＰＢＳで溶解させ、も一度ＰＥＧ−ＮａＣｌで沈殿後、ＰＢＳで溶解させ、不要物を遠心で除いてファージ抗体ライブラリーを得る。
（１３）ファージの一部を希釈し、２×ＹＴ培地中で濁度約０．５まで生育させたＸＬ１−ｂｌｕｅに加えて、３７℃１時間振とう培養して感染させ、ＬＢＧａ（ＬＢ＋１％グルコース，＋ａｍｐ）プレートに捲き、コロニーの数をカウントし、ファージの濃度（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ（ｃｆｕ））を測定する。このコロニー数から換算したファージ数をファージ抗体ライブラリーの大きさとする。
（１）ＣＲＰで免疫したマウス脾臓を試料とし、脾臓細胞を用いた。なお、リンパ球を分画し用いてもよい。
（２）（１）からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いて、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する。
（３）ｔｏｔａｌＲＮＡからｍＲＮＡを抽出してもよいがここでは省略できる。
（４）ＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（インビロジェン社）を用いて、ランダムヘキサマーでｃＤＮＡを作製する。抗体特異的なプライマーも既に公知でありこれらを用いてもよい。
（５）ｃＤＮＡを鋳型に、各種プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、抗体遺伝子を増幅する。
（６）増幅した抗体遺伝子を制限酵素ＳｆｉＩとＮｏｔＩで消化し、同じ制限酵素でファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（アマシャム）を消化し、リガーゼを用いて結合し組み込む。なお、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ、ｐＨＥＮ１（ＭＲＣ製）、ｐＨＥＮ１−ＧＴなどのファージミドベクターを用いても良い。
（７）エレクトロポレーション装置を用いて、ＸＬ１−ｂｌｕｅ大腸菌細胞に導入する。なお、ＪＭ１０９、ＴＧ１などその他のＡｍｂｅｒ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ要求性λファージ増殖用宿主大腸菌でも良い。
（８）エレクトロポレーション後、２×ＹＴＧａに懸濁し、Ｏ／Ｎ、３０℃で振とう培養する。
（９）培養菌体を遠心・集菌し、グリセロールストックとして−８０℃に保存する。一部は２×ＹＴＧａ（ＤＩＦＣＯの２×ＹＴをベースに１％グルコース、＋ａｍｐ）培地に再懸濁し３７℃で振とう培養する。
（１０）濁度（ＯＤ６００）が約０．５になったとき集菌し、２×ＹＴａ（２×ＹＴ＋ａｍｐ）に懸濁後、Ｍ１３Ｋ０７を加え３７℃で１時間振とう培養する。
（１１）２×ＹＴａを３倍量追加し、カナマイシンを７０μｇ／ｍｌになるように加えて３７℃で一晩振とう培養する。
（１２）遠心して培養上清を回収し、ＰＥＧ−ＮａＣｌでファージを沈殿後、ＰＢＳで溶解させ、も一度ＰＥＧ−ＮａＣｌで沈殿後、ＰＢＳで溶解させ、不要物を遠心で除いてファージ抗体ライブラリーを得る。
（１３）ファージの一部を希釈し、２×ＹＴ培地中で濁度約０．５まで生育させたＸＬ１−ｂｌｕｅに加えて、３７℃１時間振とう培養して感染させ、ＬＢＧａ（ＬＢ＋１％グルコース，＋ａｍｐ）プレートに捲き、コロニーの数をカウントし、ファージの濃度（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ（ｃｆｕ））を測定する。このコロニー数から換算したファージ数をファージ抗体ライブラリーの大きさとする。
このようにして抗体遺伝子ライブラリーを作製することができるが、Ｐｏｐｅらの方法に基づく上記方法（概念図を図１に示す）では、コロニーの数をカウントすることで算定したファージ抗体遺伝子ライブラリーの規模は１×１０の５乗個かせいぜい１×１０の６乗個の規模である。この原因は、上記（５）ｓｃＦｖ遺伝子の非特異的増幅と（６）の制限処理時とその後のライゲーション効率の悪さに起因するもの推測された。
そこで、本発明者らは、次ぎに示す２つの方法により、ライブラリーサイズを少なくとも５×１０の７乗容易に構築できる方法へと改良した。
そこで、本発明者らは、次ぎに示す２つの方法により、ライブラリーサイズを少なくとも５×１０の７乗容易に構築できる方法へと改良した。
方法１：抗体遺伝子群（ｓｃＦｖ断片）をいわゆるＴ−ベクターに挿入してＴＡクローニングした後、制限酵素処理して挿入ＤＮＡ断片を切り出し、この制限酵素で確実に切断されていることをアガロースゲル電気泳動で確認し、ゲルから目的のバンドを切り出して、抗体遺伝子群を含むＤＮＡ断片を精製する方法を用いる（概念図を図２に示す）。ＴＡクローニングベクターは、望ましくはｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ（ストラタジーン社）が良い。このことにより、ＰＣＲ産物では、制限酵素処理できているかどうか不明瞭であったが、確実に制限酵素処理が完了しているかどうかがわかるようになった。そして、上記の精製された抗体遺伝子群を含むＤＮＡ断片と、上記と同様の制限酵素で処理されたファージミドベクター（ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ等）とのライゲーション反応を行い、これを大腸菌などの宿主に導入させることによって抗体遺伝子ライブラリーを作製する。
方法２：抗体遺伝子群（ｓｃＦｖ断片）をいわゆるＴ−ベクターに挿入してＴＡクローニングした後、制限酵素処理して挿入ＤＮＡ断片を切り出し、この制限酵素で確実に切断されていることをアガロースゲル電気泳動で確認する。一方、ファージミドベクター（ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ等）として予めコントロールインサートＤＮＡが挿入されたものを用意し、上記と同様の制限酵素で処理する。これら２つの制限酵素消化溶液から回収されたＤＮＡを混合して、抗体遺伝子群を含むＤＮＡ断片をファージミドベクター（ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ等）にライゲーションする。そして、この混合物をＴ−ベクター及びコントロールインサートＤＮＡの両者を切断する制限酵素で処理し、抗体遺伝子群がライゲーションされたファージミドベクターのみを選択的に消化せずに残し、かくして選択的に宿主に導入させることによって抗体遺伝子ライブラリーを作製する。ＴＡクローニングベクターとしては、上記と同様のものを使用できる。Ｔ−ベクター及びコントロールインサートＤＮＡの両者を切断する制限酵素としては、抗体遺伝子に影響のない、つまり切断することのないまたは少ないＳｃａＩ，ＰｓｔＩ等の制限酵素を使用できる。上記２つの制限酵素消化溶液は、ゲルから目的のバンドを切り出すことなく、フェノール／クロロホルム、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収濃縮し、上記ライゲーション反応に供することができる（概念を図３に示す。）
〔２〕ｓｃＦｖ抗体のスクリーニング（パンニング）
（１）イムノチューブ（イムノプレートを用いても良い）に抗原であるＣＲＰを適当量ＰＢＳ緩衝液に溶解し、添加し、一昼夜、低温（４℃程度）で静置する。ただし、抗原が固相に吸着できる時間と抗原の構造に影響の無い温度であればよい。
パンニング方法としては、ビオチンラベル化抗原、ストレプトアビジンマグネチックビーズを使用する方法などいくつかの方法が考案されておりこれに限定されるものではない。
（２）イムノチューブを洗浄後、２％スキムミルク−ＰＢＳで、室温１時間ブロッキングを行う。ブロキング剤もスキムミルク以外のＢＳＡやゼラチンなど夾雑蛋白質として反応に影響しないものであれば良い。
（３）２％スキムミルク−ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中に溶解させたファージ抗体ライブラリー（１×１０１４Ｃｆｕ程度）をイムノプレートに加え、ゆっくり回転（又は振とう）させて、室温で２時間撹拌する。
（４）チューブをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及びＰＢＳでそれぞれ５回ずつ合計１０回洗浄（専用のマグネット台を用いて注意深く行う。）後、終濃度０．１Ｍトリエチルアミン（または、グリシン）となるように加えゆっくり回転（又は振とう）させて、室温で２０分撹拌する。
（５）チューブを換えて１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）（グリシンの中和には２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ）を加えて中和する。
（６）中和したファージ溶液を、２×ＹＴ培地中で濁度約０．５まで生育させてＸＬ１−ｂｌｅｕに加えて、３７℃１時間振とう培養して感染させる。
（７）培養液の一部を適宜に希釈し２×ＹＴＧａプレートに撒いた後、残りの培養液を２×ＹＴＧａに懸濁し、３７℃で浸透培養し濁度が約０．５になるまで生育させる。
（８）集菌し、菌の一部はグリスロールストックとして−８０℃で保存し、残りを利用してファージ抗体を調整し２ｎｄスクリーニングに用いた。
（９）この操作を数回繰り返す。４から３０回の洗浄で回収率が１０−５〜１０−４程度になったらＥＬＩＳＡで確認する。（抗原反応陽性の組換えファージの検出は、アマシャムファルマシア製のＲＰＡＳ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ 中のＨＲＰ／Ａｎｔｉ−Ｍ１３ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ （ＨＲＰ標識抗Ｍ１３抗体を用いて行う。）
（１０）ＥＬＩＳＡがポジティブなら、Ｏｕｔｐｕｔの測定のために使用したプレートからコロニーを拾い、ファージ抗体をスクリーニングする。
（１１）抗体遺伝子のＤＮＡ配列分析を行う。
（１２）ＨＢ２１５１へ宿主変換する。このことによりＡｍｂｅｒ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ要求性λファージ増殖用宿主ではない大腸菌株にすることで、ＩＰＴＧ誘導によりｓｃＦｖ抗体として発現させることができる。
（１）イムノチューブ（イムノプレートを用いても良い）に抗原であるＣＲＰを適当量ＰＢＳ緩衝液に溶解し、添加し、一昼夜、低温（４℃程度）で静置する。ただし、抗原が固相に吸着できる時間と抗原の構造に影響の無い温度であればよい。
パンニング方法としては、ビオチンラベル化抗原、ストレプトアビジンマグネチックビーズを使用する方法などいくつかの方法が考案されておりこれに限定されるものではない。
（２）イムノチューブを洗浄後、２％スキムミルク−ＰＢＳで、室温１時間ブロッキングを行う。ブロキング剤もスキムミルク以外のＢＳＡやゼラチンなど夾雑蛋白質として反応に影響しないものであれば良い。
（３）２％スキムミルク−ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中に溶解させたファージ抗体ライブラリー（１×１０１４Ｃｆｕ程度）をイムノプレートに加え、ゆっくり回転（又は振とう）させて、室温で２時間撹拌する。
（４）チューブをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及びＰＢＳでそれぞれ５回ずつ合計１０回洗浄（専用のマグネット台を用いて注意深く行う。）後、終濃度０．１Ｍトリエチルアミン（または、グリシン）となるように加えゆっくり回転（又は振とう）させて、室温で２０分撹拌する。
（５）チューブを換えて１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）（グリシンの中和には２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ）を加えて中和する。
（６）中和したファージ溶液を、２×ＹＴ培地中で濁度約０．５まで生育させてＸＬ１−ｂｌｅｕに加えて、３７℃１時間振とう培養して感染させる。
（７）培養液の一部を適宜に希釈し２×ＹＴＧａプレートに撒いた後、残りの培養液を２×ＹＴＧａに懸濁し、３７℃で浸透培養し濁度が約０．５になるまで生育させる。
（８）集菌し、菌の一部はグリスロールストックとして−８０℃で保存し、残りを利用してファージ抗体を調整し２ｎｄスクリーニングに用いた。
（９）この操作を数回繰り返す。４から３０回の洗浄で回収率が１０−５〜１０−４程度になったらＥＬＩＳＡで確認する。（抗原反応陽性の組換えファージの検出は、アマシャムファルマシア製のＲＰＡＳ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ 中のＨＲＰ／Ａｎｔｉ−Ｍ１３ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ （ＨＲＰ標識抗Ｍ１３抗体を用いて行う。）
（１０）ＥＬＩＳＡがポジティブなら、Ｏｕｔｐｕｔの測定のために使用したプレートからコロニーを拾い、ファージ抗体をスクリーニングする。
（１１）抗体遺伝子のＤＮＡ配列分析を行う。
（１２）ＨＢ２１５１へ宿主変換する。このことによりＡｍｂｅｒ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ要求性λファージ増殖用宿主ではない大腸菌株にすることで、ＩＰＴＧ誘導によりｓｃＦｖ抗体として発現させることができる。
本発明で用いられる上記第一の結合物および第二の結合物は、少なくとも何れか一方が上記の組換え蛋白であればよく、その他は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。
通常、第一の結合物と第二の結合物を用いるサンドイッチ式免疫測定法においては、第一の結合物と第二の結合物とは抗原決定基（エピトープ）が相互に異なるものが使用され、所謂「ヘテロ」の組み合わせで用いられる。本発明において、「ヘテロ」の組み合わせで第一の結合物および第二の結合物を構成することは何ら妨げられるものではない。しかしながら、測定対象である抗原の種類によっては、所謂「ホモ」の組み合わせ（すなわち、第一の結合物と第二の結合物が同じ組換え蛋白）でもよい。
本発明において、前記第一の結合物および第二の結合物の何れか一方を担体に固定しておくことも可能であり、これにより、例えば、ＥＬＩＳＡまたはイムノクロマトグラフィー測定法を容易に実施できる。
イムノクロマトグラフィー測定法は、公知のイムノクロマト法テストストリップの構成に準拠して容易に実施できる。
一般に、イムノクロマト法テストストリップは、抗原の第一の抗原決定基にて抗体抗原反応可能な第一の結合物と、前記抗原の第二の抗原決定基にて抗体抗原反応可能で且つ標識された第二の結合物と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一の結合物は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の結合物は前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように配置されて構成される。第一の結合物および第二の結合物は、上述のように、それぞれ上記組換え蛋白であってもモノクローナルまたはポリクローナル抗体であっても良いが、少なくとも何れか一つが上記組換え蛋白である。なお、第一の抗原決定基と第二の抗原決定基は抗原上の位置が異なっていれば構造的に同一であってもよく、その場合、第一の結合物および第二の結合物は上記「ホモ」の組み合わせの組換え蛋白であってよく、例えば、第一の結合物および第二の結合物の両方に上記の好ましい組換え蛋白を使用できる。
イムノクロマトグラフィー測定法は、公知のイムノクロマト法テストストリップの構成に準拠して容易に実施できる。
一般に、イムノクロマト法テストストリップは、抗原の第一の抗原決定基にて抗体抗原反応可能な第一の結合物と、前記抗原の第二の抗原決定基にて抗体抗原反応可能で且つ標識された第二の結合物と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一の結合物は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の結合物は前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように配置されて構成される。第一の結合物および第二の結合物は、上述のように、それぞれ上記組換え蛋白であってもモノクローナルまたはポリクローナル抗体であっても良いが、少なくとも何れか一つが上記組換え蛋白である。なお、第一の抗原決定基と第二の抗原決定基は抗原上の位置が異なっていれば構造的に同一であってもよく、その場合、第一の結合物および第二の結合物は上記「ホモ」の組み合わせの組換え蛋白であってよく、例えば、第一の結合物および第二の結合物の両方に上記の好ましい組換え蛋白を使用できる。
イムノクロマト法テストストリップの具体例としては、例えば、図８に示されるテストストリップが挙げられる。図８において、数字１は粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、３１は捕捉部位、４は吸収用部材、５は試料添加用部材を示している。
図示の例では、膜担体３は、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターで作成されている。
該膜担体３には、そのクロマト展開始点側の末端から７．５ｍｍの位置に、第一の抗体が固定され、検体の捕捉部位３１が形成される。
図示の例では、膜担体３は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いているが、被験試料に含まれる検体をクロマト展開可能で、かつ、上記捕捉部位３１を形成する抗体を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。
図示の例では、膜担体３は、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターで作成されている。
該膜担体３には、そのクロマト展開始点側の末端から７．５ｍｍの位置に、第一の抗体が固定され、検体の捕捉部位３１が形成される。
図示の例では、膜担体３は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いているが、被験試料に含まれる検体をクロマト展開可能で、かつ、上記捕捉部位３１を形成する抗体を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。
含浸部材２は、前記第一の結合物が結合する第一の抗原決定基と異なる部位に位置する第二の抗原決定基にて前記抗原と抗体抗原反応する第二の結合物を含浸せしめた部材からなる。当該第二の結合物は、適当な標識物質で予め標識される。
図示の例では、含浸部材２として、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布を用いているが、これに限定されるものではなく、例えば、セルロース類布（濾紙、ニトロセルロース膜等）、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類なども使用できる。
図示の例では、含浸部材２として、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布を用いているが、これに限定されるものではなく、例えば、セルロース類布（濾紙、ニトロセルロース膜等）、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類なども使用できる。
第二の結合物の標識物質としては、使用可能なものであればいかなる物質であってもよく、呈色標識物質、酵素標識物質、放射線標識物質などが挙げられる。
このうち、捕捉部位３１での色の変化を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便に判定できる点から、呈色標識物質を用いることが好ましい。
呈色標識物質としては、金コロイド、白金コロイド等の金属コロイドの他、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックスや、天然ゴムラテックスなどのラテックスが挙げられ、このうち、金コロイドなどの金属コロイドが特に好ましい。
当該含浸部材２は、標識された第二の抗体の懸濁液を前記ガラス繊維不織布等の部材に含浸せしめ、これを乾燥させることなどによって作製できる。
このうち、捕捉部位３１での色の変化を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便に判定できる点から、呈色標識物質を用いることが好ましい。
呈色標識物質としては、金コロイド、白金コロイド等の金属コロイドの他、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックスや、天然ゴムラテックスなどのラテックスが挙げられ、このうち、金コロイドなどの金属コロイドが特に好ましい。
当該含浸部材２は、標識された第二の抗体の懸濁液を前記ガラス繊維不織布等の部材に含浸せしめ、これを乾燥させることなどによって作製できる。
図８に示されるように、膜担体３を粘着シート１の中程に貼着し、該膜担体３のクロマト展開の開始点側（すなわち図８の左側、以下「上流側」と記す、また、その逆の側、すなわち図８の右側を、以下「下流側」と記す）の末端の上に、含浸部材２の下流側末端を重ね合わせて連接するとともに、この含浸部材２の上流側部分を粘着シート１に貼着して本発明のイムノクロマト法テストストリップを作成できる。
さらに、必要に応じて、含浸部材２の上面に試料添加用部材５の下流側部分を載置するとともに、該試料添加用部材５の上流側部分を粘着シート１に貼着してもよく、また、膜担体３の下流側部分の上面に吸収用部材４の上流側部分を載置するとともに、該吸収用部材４の下流側部分を粘着シート１に貼着せしめることもできる。
さらに、必要に応じて、含浸部材２の上面に試料添加用部材５の下流側部分を載置するとともに、該試料添加用部材５の上流側部分を粘着シート１に貼着してもよく、また、膜担体３の下流側部分の上面に吸収用部材４の上流側部分を載置するとともに、該吸収用部材４の下流側部分を粘着シート１に貼着せしめることもできる。
試料添加用部材５としては、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、ならびに、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または織布もしくは不織布を用いることができる。
吸収用部材４は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。
吸収用部材４は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。
さらに、市販品の場合、図８のイムノクロマト法テストストリップは、試料添加用部材５と捕捉部位３１の上方にそれぞれ被験試料注入部と判定部が開口された適当なプラスチック製ケース内に収容されて提供される。
かくして、生体試料などからなる被験試料を必要に応じて適当な展開溶媒と混合してクロマト展開可能な混合液を得た後、当該混合液を図８に示されるイムノクロマト法テストストリップの試料添加用部材５上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材５を通過して含浸部材２において、標識された第二の結合物と混合する。
その際、該混合液中に検体が存在すれば、抗原抗体反応により検体と第二の結合物との複合体が形成される。
この複合体は、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位３１に到達し、そこに固定された第一の結合物と抗原抗体反応して捕捉される。
このとき、標識物質として金コロイドなどの呈色標識物質が使用されていれば、当該呈色標識物質の集積により発色するので、直ちに、検体の有無を判定することができる。
その際、該混合液中に検体が存在すれば、抗原抗体反応により検体と第二の結合物との複合体が形成される。
この複合体は、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位３１に到達し、そこに固定された第一の結合物と抗原抗体反応して捕捉される。
このとき、標識物質として金コロイドなどの呈色標識物質が使用されていれば、当該呈色標識物質の集積により発色するので、直ちに、検体の有無を判定することができる。
被験試料としては、特に制限はなく、例えば、血液、（全血でも、血清でも、血漿でもよい）、唾液、尿等の体外に採取された体液が挙げられる。被験試料は、展開溶媒などの適当な希釈液で希釈して膜担体に注入してもよい。
なお、全血を被験試料として用いるときで、特に標識結合物の標識物質として金コロイドなどの呈色標識物質が用いられる場合、前記試料添加用部材に血球捕捉膜部材を配置しておくことが好ましい。血球捕捉膜部材は、前記含浸部材と前記試料添加用部材との間に積層することが好ましい。これにより、赤血球が膜担体に展開されるのが阻止されるので、膜担体の捕捉部位における呈色標識の集積の確認が容易になる。血球捕捉膜部材としては、カルボキシメチルセルロース膜が用いられ、具体的には、アドバンテック東洋株式会社から販売されているイオン交換濾紙ＣＭ（商品名）や、ワットマンジャパン株式会社から販売されているイオン交換セルロースペーパーなどを用いることができる。
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１ ＲＮＡ抽出
抗原で免疫し、抗体価の上昇したマウス脾臓を試料とした。
ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ 試薬 ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いて、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。
なお、精製度の高いｔｏｔａｌＲＮＡまたは、ｍＲＮＡを抽出できれば、この方法に限定されるものではない。
１． １０ｍｌビーカーに、ＩＳＯＧＥＮ溶液１ｍｌを加え、脾臓１個分（１００ｍｇ以内）を入れ、すばやくハサミで細かくきり刻んだ。
２． 細かくなったら、さらにＩＳＯＧＥＮ１ｍｌ（３ｍｌ）を加えた。
３． テルモ注射針１８ Ｇを付けたテルモシリンジ１０ ｍｌロック式を用いて、脾臓断片を壊しながら、液を吸引および排出する操作を数回繰り返し、ＩＳＯＧＥＮ中に脾臓を溶解させた。シリンジを通らない場合が多いので、ホモジナイザーまたは、メッシュビーカーを用いて細かくしてから用いた。
４． 脾臓断片がほぼなくなったら、再度液の吸引と排出の操作を、なるべく泡立てないように１０回繰り返した。
５． ニードルを２１Ｇ針に変えて、さらにせん断（ｓｈｅａｒｉｎｇ）を１０回繰り返した。
６． 次ぎに、１．５ｍｌチューブ２本に約１０００μｌづつ分注し、室温５分静置した。
７． １０，０００ｒｐｍ（７．５ｋｇ）以上で５分間遠心し、不溶性画分（沈殿物）を除く上清を別のチューブに取った。
８． これに、０．２ｍｌのクロロホルムを加え、ボルテックスでよく混合し、室温で３分置いた。
９． １２，０００ｒｐｍ（１２ｋｇ）以上で、４℃、１０分間遠心すると、青系色の下層と透明な上層に分かれるので、上層（水層）のみをチューブに移した。
１０． これに０．５ｍｌ（等量）のイソプロパノールを加え、混合後、０℃、５分〜１０分静置、 １５，０００ｒｐｍ（１２ｋｇ）以上、１５分間以上、４℃で 遠心しＲＮＡを沈殿させた。
１１． 慎重にイソプロパノールを除き、ＲＮＡペレットに７５％（７０％可）エタノール１ｍｌ（リンスなので適量）を加え、混合後１０，０００ｒｐｍ（７．５ｋｇ）以上、５分、４℃で遠心した。
１２． ペレットを軽く風乾した後、適量（５０μｌ〜１００μｌ）滅菌水にＲＮＡを溶解させた。
１３． ＲＮＡを一つのチューブにまとめ、そこからＲＮＡ溶液２μｌを別のチューブに採り、滅菌水８μｌを加え、５倍に希釈した。
１４． マイクロキャピラリーセルを用いて、２６０と２８０ｎｍの吸光度、及び２００〜３４０ｎｍのスペクトルグラムを描き、定法によりＲＮＡ量の定量と純度を検定した。
１５． さらに、０．８％アガロースゲル電気泳動で、分解の程度など質を検査した。
抗原で免疫し、抗体価の上昇したマウス脾臓を試料とした。
ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ 試薬 ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いて、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。
なお、精製度の高いｔｏｔａｌＲＮＡまたは、ｍＲＮＡを抽出できれば、この方法に限定されるものではない。
１． １０ｍｌビーカーに、ＩＳＯＧＥＮ溶液１ｍｌを加え、脾臓１個分（１００ｍｇ以内）を入れ、すばやくハサミで細かくきり刻んだ。
２． 細かくなったら、さらにＩＳＯＧＥＮ１ｍｌ（３ｍｌ）を加えた。
３． テルモ注射針１８ Ｇを付けたテルモシリンジ１０ ｍｌロック式を用いて、脾臓断片を壊しながら、液を吸引および排出する操作を数回繰り返し、ＩＳＯＧＥＮ中に脾臓を溶解させた。シリンジを通らない場合が多いので、ホモジナイザーまたは、メッシュビーカーを用いて細かくしてから用いた。
４． 脾臓断片がほぼなくなったら、再度液の吸引と排出の操作を、なるべく泡立てないように１０回繰り返した。
５． ニードルを２１Ｇ針に変えて、さらにせん断（ｓｈｅａｒｉｎｇ）を１０回繰り返した。
６． 次ぎに、１．５ｍｌチューブ２本に約１０００μｌづつ分注し、室温５分静置した。
７． １０，０００ｒｐｍ（７．５ｋｇ）以上で５分間遠心し、不溶性画分（沈殿物）を除く上清を別のチューブに取った。
８． これに、０．２ｍｌのクロロホルムを加え、ボルテックスでよく混合し、室温で３分置いた。
９． １２，０００ｒｐｍ（１２ｋｇ）以上で、４℃、１０分間遠心すると、青系色の下層と透明な上層に分かれるので、上層（水層）のみをチューブに移した。
１０． これに０．５ｍｌ（等量）のイソプロパノールを加え、混合後、０℃、５分〜１０分静置、 １５，０００ｒｐｍ（１２ｋｇ）以上、１５分間以上、４℃で 遠心しＲＮＡを沈殿させた。
１１． 慎重にイソプロパノールを除き、ＲＮＡペレットに７５％（７０％可）エタノール１ｍｌ（リンスなので適量）を加え、混合後１０，０００ｒｐｍ（７．５ｋｇ）以上、５分、４℃で遠心した。
１２． ペレットを軽く風乾した後、適量（５０μｌ〜１００μｌ）滅菌水にＲＮＡを溶解させた。
１３． ＲＮＡを一つのチューブにまとめ、そこからＲＮＡ溶液２μｌを別のチューブに採り、滅菌水８μｌを加え、５倍に希釈した。
１４． マイクロキャピラリーセルを用いて、２６０と２８０ｎｍの吸光度、及び２００〜３４０ｎｍのスペクトルグラムを描き、定法によりＲＮＡ量の定量と純度を検定した。
１５． さらに、０．８％アガロースゲル電気泳動で、分解の程度など質を検査した。
実施例２ ｃＤＮＡ合成（ＤＮＡ２００ｎｇスケール）
（ランダムヘキサマーを用いたｃＤＮＡ合成）
１． キット（ＳｕｐｅｒｓＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（インビロジェン社））の試薬を混ぜ軽く遠心しておいた。
２． ０．２ｍｌチューブに次ぎの試薬を混ぜた。
３． ２．のサンプルを６５℃（〜７０℃）、５分（〜１０分）間保温後に、１分間以上氷冷した。
４． 加える本数分の次ぎの試薬を作製した。
１） １０ｘＲＴ ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ
２） ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ４μｌ
３） ０．１Ｍ ＤＴＴ ２μｌ
４） ＲＮａｓｅ ＯＵＴ （Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ） １μｌ
５． ４．の混合試薬を２．に加え、ゆるやかに混合し、スピンダウンした（合計２０μｌ）。
６． ２５℃（室温可）で２分間保温した。
７． ５０ｕｎｉｔ ＳＳＩＩ （ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ） を１μｌ加え、サーマルサイクラーで２５℃で１０分間保温――４２℃５０分間保温――７０℃で１５分間保温し、すみやかに氷冷した。
８． ＲＮａｓｅＨを１μｌ加え、３７℃で２０分保温した。
９． Ｍｉｃｒｏ Ｓｐｉｎ Ｓ−３００ＨＲ（アムシャムバイオサイエンス社）を用いてプライマーの除去を次の手順で行った。
１） チューブにＳ−３００ＨＲのふたを少し緩め、管を折って入れ、３０００ｒｐｍ（７３５ｇ）で１分遠心した。
２） チューブを替え作成したｃＤＮＡ（計１００μｌまで）を添加し３０００ｒｐｍ（７３５ｇ）で２分遠心した。
（ランダムヘキサマーを用いたｃＤＮＡ合成）
１． キット（ＳｕｐｅｒｓＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（インビロジェン社））の試薬を混ぜ軽く遠心しておいた。
２． ０．２ｍｌチューブに次ぎの試薬を混ぜた。
４． 加える本数分の次ぎの試薬を作製した。
１） １０ｘＲＴ ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ
２） ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ４μｌ
３） ０．１Ｍ ＤＴＴ ２μｌ
４） ＲＮａｓｅ ＯＵＴ （Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ） １μｌ
５． ４．の混合試薬を２．に加え、ゆるやかに混合し、スピンダウンした（合計２０μｌ）。
６． ２５℃（室温可）で２分間保温した。
７． ５０ｕｎｉｔ ＳＳＩＩ （ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ） を１μｌ加え、サーマルサイクラーで２５℃で１０分間保温――４２℃５０分間保温――７０℃で１５分間保温し、すみやかに氷冷した。
８． ＲＮａｓｅＨを１μｌ加え、３７℃で２０分保温した。
９． Ｍｉｃｒｏ Ｓｐｉｎ Ｓ−３００ＨＲ（アムシャムバイオサイエンス社）を用いてプライマーの除去を次の手順で行った。
１） チューブにＳ−３００ＨＲのふたを少し緩め、管を折って入れ、３０００ｒｐｍ（７３５ｇ）で１分遠心した。
２） チューブを替え作成したｃＤＮＡ（計１００μｌまで）を添加し３０００ｒｐｍ（７３５ｇ）で２分遠心した。
（ｃＤＮＡからのＨ鎖Ｌ鎖ＰＣＲ増幅）
１． ＰＣＲチューブに次ぎの試薬を混ぜ、氷冷しておいた。
各１００ｐｍｏｌ
（１）ＶＨ１ＦＯＲ：5´- TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC 32mer（配列番号５）
（２）ＶＨ１ＢＡＣＫ：5´-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G 22mer（配列番号６）
（３）ＭＪＫ１ｍｉｘＦＯＮＸ：5´-CCG TTT BAT TTC CAR CTT KGT SCC 24mer（配列番号７）
（４）ＶＫ２ＢＡＣＫ：5´-GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA 24mer（配列番号８）
２． １．を混ぜスピンダウンした。
３． 次条件でＰＣＲを行った。
９５℃２分〔（９５℃３０秒−６５℃３０秒−７２℃１分）ｘ２１＊〕７２℃７分―４℃∞。
４． ＰＣＲ産物の５μｌ程度を（１．２％）アガロースゲル電気泳動でチェックした。なお、スメアバンドとなるので、予備実験でサイクル数を決めてから行った。
１． ＰＣＲチューブに次ぎの試薬を混ぜ、氷冷しておいた。
（１）ＶＨ１ＦＯＲ：5´- TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC 32mer（配列番号５）
（２）ＶＨ１ＢＡＣＫ：5´-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G 22mer（配列番号６）
（３）ＭＪＫ１ｍｉｘＦＯＮＸ：5´-CCG TTT BAT TTC CAR CTT KGT SCC 24mer（配列番号７）
（４）ＶＫ２ＢＡＣＫ：5´-GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA 24mer（配列番号８）
２． １．を混ぜスピンダウンした。
３． 次条件でＰＣＲを行った。
９５℃２分〔（９５℃３０秒−６５℃３０秒−７２℃１分）ｘ２１＊〕７２℃７分―４℃∞。
４． ＰＣＲ産物の５μｌ程度を（１．２％）アガロースゲル電気泳動でチェックした。なお、スメアバンドとなるので、予備実験でサイクル数を決めてから行った。
実施例３ ｓｃＦｖ遺伝子作製
実施例２でＨ鎖（３４０ｂｐ）、Ｌ鎖（３２５ｂｐ）が電気泳動で確認されたので、Ｍｉｃｒｏ Ｓｐｉｎ Ｓ−３００ＨＲを用い、次の操作でプライマーを除去した。
１）チューブにＳ−３００ＨＲのふたを少し緩め、管を折って入れ、３０００ｒｐｍ（７３５ｇ）で１分遠心した。
２）チューブを替え作成したＰＣＲ産物（約５０μｌ）を添加し３０００ｒｐｍ（７３５ｇ）で２分遠心した。
実施例２でＨ鎖（３４０ｂｐ）、Ｌ鎖（３２５ｂｐ）が電気泳動で確認されたので、Ｍｉｃｒｏ Ｓｐｉｎ Ｓ−３００ＨＲを用い、次の操作でプライマーを除去した。
１）チューブにＳ−３００ＨＲのふたを少し緩め、管を折って入れ、３０００ｒｐｍ（７３５ｇ）で１分遠心した。
２）チューブを替え作成したＰＣＲ産物（約５０μｌ）を添加し３０００ｒｐｍ（７３５ｇ）で２分遠心した。
〔１ｓｔ ＰＣＲ：Ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｆｉｌｌ−ｉｎ〕
１．次の試薬を用意した。
Ｈ鎖 ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ（５０ｎｇ） １μｌ
Ｌ鎖 ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ（５０ｎｇ） １μｌ
Ｌｉｎｋｅｒ−ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘ ４μｌ
２ｘＬＡＴａｑ ｍｉｘ ２５μｌ
Ｗａｔｅｒ ｕｐ５０μｌ（１９μｌ）
２． １．を混ぜスピンダウンした。
３． 次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃１分〔（９４℃１分−６３℃４分）×７〕６３℃１分―４℃∞。
１．次の試薬を用意した。
Ｈ鎖 ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ（５０ｎｇ） １μｌ
Ｌ鎖 ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ（５０ｎｇ） １μｌ
Ｌｉｎｋｅｒ−ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘ ４μｌ
２ｘＬＡＴａｑ ｍｉｘ ２５μｌ
Ｗａｔｅｒ ｕｐ５０μｌ（１９μｌ）
２． １．を混ぜスピンダウンした。
３． 次の条件でＰＣＲを行った。
９４℃１分〔（９４℃１分−６３℃４分）×７〕６３℃１分―４℃∞。
〔２ｎｄ ＰＣＲ〕
１． 次の試薬を用意した。
Ｈ＋ｌｉｎｋｅｒ＋Ｌ ｐｒｏｄｕｃｔ （５０ｎｇ） ５０μｌ
ＶＨ１ＢＡＣＫＳｆｉ ２μｌ
ＪＫ１−５ＮｏｔＩｍｉｘ ２μｌ
２ｘＬＡＴａｑ ｍｉｘ ２５μｌ
Ｗａｔｅｒ ｕｐ１００μｌ
２． １．を混ぜスピンダウンする。チューブは氷冷。９０℃付近で入れた。
３． 次の条件でＰＣＲを行った。
例えば、９４℃１分〔（９４℃３０秒−６５℃、４５秒−７２℃１分）ｘ２１〕７２℃１分―４℃∞。
４．ＰＣＲ産物の５μｌを（１．２〜１．５％）アガロースゲル電気泳動でチェックした。
１． 次の試薬を用意した。
Ｈ＋ｌｉｎｋｅｒ＋Ｌ ｐｒｏｄｕｃｔ （５０ｎｇ） ５０μｌ
ＶＨ１ＢＡＣＫＳｆｉ ２μｌ
ＪＫ１−５ＮｏｔＩｍｉｘ ２μｌ
２ｘＬＡＴａｑ ｍｉｘ ２５μｌ
Ｗａｔｅｒ ｕｐ１００μｌ
２． １．を混ぜスピンダウンする。チューブは氷冷。９０℃付近で入れた。
３． 次の条件でＰＣＲを行った。
例えば、９４℃１分〔（９４℃３０秒−６５℃、４５秒−７２℃１分）ｘ２１〕７２℃１分―４℃∞。
４．ＰＣＲ産物の５μｌを（１．２〜１．５％）アガロースゲル電気泳動でチェックした。
＊ＲＳ Ｏｌｉｇｏｓ
（１）ＶＨ１ＢＡＣＫＳｆｉ：GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTS MAR CTG CAG SAG TCW GG 56mer・・・100p mol（配列番号９）
（２）ＪＫ１ＮＯＴ１０：GAG TCA TTC TGC GGC CGC CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC 42mer（配列番号１０）
（３）ＪＫ２ＮＯＴ１０：GAG TCA TTC TGC GGC CGC CCG TTT TAT TTC CAG CTT GGT CCC 42mer（配列番号１１）
（４）ＪＫ４ＮＯＴ１０：GAG TCA TTC TGC GGC CGC CCG TTT TAT TTC CAA CTT TGT CCC 42mer（配列番号１２）
（５）ＪＫ５ＮＯＴ１０：GAG TCA TTC TGC GGC CGC CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC 42mer（配列番号１３）
（２）〜（５）４００ｐｍｏｌを等量混ぜ平均１００ｐｍｏｌに混合したものを（６）ＪＫ１−５ＮｏｔＩｍｉｘとする。
Ｌｉｎｋｅｒ−ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘ：リンカーは、次のグリシン、グリシン、グリシン、グリシン、セリンが３回繰りかえしたフレキリブルリンカーを用いた。
ｌｉｎｋｅｒ配列 5-’GGCACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCGAGCTCACTCAGTCTCCA-3’ （配列番号１４）
（１）ＶＨ１ＢＡＣＫＳｆｉ：GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTS MAR CTG CAG SAG TCW GG 56mer・・・100p mol（配列番号９）
（２）ＪＫ１ＮＯＴ１０：GAG TCA TTC TGC GGC CGC CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC 42mer（配列番号１０）
（３）ＪＫ２ＮＯＴ１０：GAG TCA TTC TGC GGC CGC CCG TTT TAT TTC CAG CTT GGT CCC 42mer（配列番号１１）
（４）ＪＫ４ＮＯＴ１０：GAG TCA TTC TGC GGC CGC CCG TTT TAT TTC CAA CTT TGT CCC 42mer（配列番号１２）
（５）ＪＫ５ＮＯＴ１０：GAG TCA TTC TGC GGC CGC CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC 42mer（配列番号１３）
（２）〜（５）４００ｐｍｏｌを等量混ぜ平均１００ｐｍｏｌに混合したものを（６）ＪＫ１−５ＮｏｔＩｍｉｘとする。
Ｌｉｎｋｅｒ−ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘ：リンカーは、次のグリシン、グリシン、グリシン、グリシン、セリンが３回繰りかえしたフレキリブルリンカーを用いた。
ｌｉｎｋｅｒ配列 5-’GGCACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCGAGCTCACTCAGTCTCCA-3’ （配列番号１４）
〔ＤＮＡの精製〕
次に全量をエタ沈濃縮後、ゲルから切り出し精製した。
１． 酢酸Ｎａを１／１０量（１０μｌ）加え、エタノールを２．５倍量（２５０μｌ）加え、よく攪拌後、−２０℃に３０分以上（−８０℃、１０分）置き、１５０００ｒｐｍ、１５分遠心、上清を丁寧に除き、７０％エタノールを２００μｌ程度入れ、１５０００ｒｐｍ５分、上清を丁寧に除き、乾燥させた。そして、適等量のＴＥ（２０μｌ）に溶解させた。
２． 全量２０μｌに１０ｘｄｙｅを２μｌ加え、１．２％ゲルに１２μｌ程度づつアプライし、５０ｖで電気泳動した。
３． ゲルをハンディＵＶ３３５ｎｍで照射し、目的の７８０ｂｐ付近を切り出し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン）を用い、下記の手順で精製した。
（１）１００ｍｇに３倍量のＱＧを入れる（最大４００ｍｇ）。
（２）５０℃、２０分（時々ボルテックスかける）。
（３）色が黄色であることを確認する。ゲルと等量のイソプロパノールを入れ反転。
（４）付属の２ｍｌチューブにカラムのせ、サンプルをアプライし、１０，０００ｇ（１３，０００ｒｐｍ）で１分遠心。
（５）フロースルー溶液を捨て、カラムにＱＧを５００μｌ添加し、遠心１分。
（６）ＰＥを７５０μｌ添加遠心１分。
（７）フロースルーを捨て、さらに遠心１分。
（８）１．５ｍｌチューブに乗せ換え、適等量（１０μｌ）のＥＢまたは精製水をカラム中央に添加し、１分以上放置後、１分遠心する。
４．ＰＣＲ産物の５μｌ程度を（１．２％）アガロースゲル電気泳動でチェックした。
次に全量をエタ沈濃縮後、ゲルから切り出し精製した。
１． 酢酸Ｎａを１／１０量（１０μｌ）加え、エタノールを２．５倍量（２５０μｌ）加え、よく攪拌後、−２０℃に３０分以上（−８０℃、１０分）置き、１５０００ｒｐｍ、１５分遠心、上清を丁寧に除き、７０％エタノールを２００μｌ程度入れ、１５０００ｒｐｍ５分、上清を丁寧に除き、乾燥させた。そして、適等量のＴＥ（２０μｌ）に溶解させた。
２． 全量２０μｌに１０ｘｄｙｅを２μｌ加え、１．２％ゲルに１２μｌ程度づつアプライし、５０ｖで電気泳動した。
３． ゲルをハンディＵＶ３３５ｎｍで照射し、目的の７８０ｂｐ付近を切り出し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン）を用い、下記の手順で精製した。
（１）１００ｍｇに３倍量のＱＧを入れる（最大４００ｍｇ）。
（２）５０℃、２０分（時々ボルテックスかける）。
（３）色が黄色であることを確認する。ゲルと等量のイソプロパノールを入れ反転。
（４）付属の２ｍｌチューブにカラムのせ、サンプルをアプライし、１０，０００ｇ（１３，０００ｒｐｍ）で１分遠心。
（５）フロースルー溶液を捨て、カラムにＱＧを５００μｌ添加し、遠心１分。
（６）ＰＥを７５０μｌ添加遠心１分。
（７）フロースルーを捨て、さらに遠心１分。
（８）１．５ｍｌチューブに乗せ換え、適等量（１０μｌ）のＥＢまたは精製水をカラム中央に添加し、１分以上放置後、１分遠心する。
４．ＰＣＲ産物の５μｌ程度を（１．２％）アガロースゲル電気泳動でチェックした。
実施例４ Ｔ−ｖｅｃｔｏｒを用いた抗体遺伝子ライブラリーの作成 （Ｔｇ法）
［１］ ｓｃＦｖ遺伝子の増幅
実施例３で得たｓｃＦｖ遺伝子を必要量増幅した。
［１］ ｓｃＦｖ遺伝子の増幅
実施例３で得たｓｃＦｖ遺伝子を必要量増幅した。
［２］ Ｔ−ｖｅｃｔｏｒへのｓｃＦｖ遺伝子の組み込み
（１）［１］により増幅したｓｃＦｖ遺伝子を以下の組成で１６℃／ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔライゲーションした。
ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ １０μｌ（５００ｎｇ，０．３ｐｍｏｌ）
ｓｃＦｖ遺伝子 Ｘμｌ（９５０ｎｇ，２．０ｐｍｏｌ）
Ｉ液 １０＋Ｘμｌ（ＴａＫａＲａ Ｌａｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．１）
Ｔｏｔａｌ ２（１０＋Ｘ）μｌ
（２）エタノール沈殿後、５μｌの滅菌水に溶解させた。
（１）［１］により増幅したｓｃＦｖ遺伝子を以下の組成で１６℃／ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔライゲーションした。
ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ １０μｌ（５００ｎｇ，０．３ｐｍｏｌ）
ｓｃＦｖ遺伝子 Ｘμｌ（９５０ｎｇ，２．０ｐｍｏｌ）
Ｉ液 １０＋Ｘμｌ（ＴａＫａＲａ Ｌａｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．１）
Ｔｏｔａｌ ２（１０＋Ｘ）μｌ
（２）エタノール沈殿後、５μｌの滅菌水に溶解させた。
［３］ ｓｃＦｖ遺伝子ライブラリーＴ−ｖｅｃｔｏｒ（プラスミド）の調整
（１）市販のエレクトロポレーション用コンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ チューブ１本と［２］のＤＮＡ溶液５μｌを混合し、０．１ｃｍキュベットに注入した。
（２）以下の条件でエレクトロポーレーションを行った。
２００Ω、２５μＦ、１．５ｋＶ
（３）エレクトロポーレーションした大腸菌に氷冷したＳＯＣ培地１ｍｌを加えた。
（４）３７℃で１時間振盪した（１６０〜２２５ｒｐｍ）。
（５）３７℃１時間振盪培養後の菌体懸濁液からサンプリングして、トランスフォーメーションされた大腸菌数の計測に使用した。なお、計測する培地はＸ−ｇａｌ、ＩＰＴＧの入った培地を使用し、ｂｌｕｅ／ｗｈｉｔｅの比を確認し、さらに数十個体ＰＣＲによってインサートが入っている確認した。
（６）合計で１０８程度になったら、プラスミドを大量回収し、ｓｃＦｖライブラリー（Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ）とした。
（１）市販のエレクトロポレーション用コンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ チューブ１本と［２］のＤＮＡ溶液５μｌを混合し、０．１ｃｍキュベットに注入した。
（２）以下の条件でエレクトロポーレーションを行った。
２００Ω、２５μＦ、１．５ｋＶ
（３）エレクトロポーレーションした大腸菌に氷冷したＳＯＣ培地１ｍｌを加えた。
（４）３７℃で１時間振盪した（１６０〜２２５ｒｐｍ）。
（５）３７℃１時間振盪培養後の菌体懸濁液からサンプリングして、トランスフォーメーションされた大腸菌数の計測に使用した。なお、計測する培地はＸ−ｇａｌ、ＩＰＴＧの入った培地を使用し、ｂｌｕｅ／ｗｈｉｔｅの比を確認し、さらに数十個体ＰＣＲによってインサートが入っている確認した。
（６）合計で１０８程度になったら、プラスミドを大量回収し、ｓｃＦｖライブラリー（Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ）とした。
［４］ ｐＣＡＮＴＡＢ５ＥのＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ消化
（１）ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（１００μｇ）を以下の組成で消化した。なお、ベクター量はライゲーション時に３．６μｇのベクターを確保できればよいので、ゲル抽出キットの能力に合わせて適宜調整してもよい。
ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ Ｘμｌ （１００μｇ）
Ｍ ｂｕｆｆｅｒ １０μｌ
ＳｆｉＩ ８μｌ
滅菌水 Ｙμｌ
合計 １００μｌ
反応は、５０℃／ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔ行った。そして、０．５μｌを０．８％アガロースゲルで電気泳動し消化されていることを確認した。
（２）続いてＮｏｔＩで［４］−（１）を以下の組成で消化した。
（１）の溶液 ９９．５μｌ
Ｍ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５ ６μｌ
Ｔｒｉｔｏｎ １６μｌ
ＢＳＡ １６μｌ
Ｈ ｂｕｆｆｅｒ １μｌ
滅菌水 ５μｌ
ＮｏｔＩ ４μｌ
合計 １５０μｌ
反応は、３７℃／２ｈ行った。そして、０．５μｌを０．８％アガロースゲルで電気泳動し消化されていることを確認した（約４５００ｂｐと約７２０ｂｐの位置にバンドが確認できる）。
消化が確認できたならば、全量を電気泳動して４５００ｂｐのバンドを回収した。
（１）ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（１００μｇ）を以下の組成で消化した。なお、ベクター量はライゲーション時に３．６μｇのベクターを確保できればよいので、ゲル抽出キットの能力に合わせて適宜調整してもよい。
ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ Ｘμｌ （１００μｇ）
Ｍ ｂｕｆｆｅｒ １０μｌ
ＳｆｉＩ ８μｌ
滅菌水 Ｙμｌ
合計 １００μｌ
反応は、５０℃／ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔ行った。そして、０．５μｌを０．８％アガロースゲルで電気泳動し消化されていることを確認した。
（２）続いてＮｏｔＩで［４］−（１）を以下の組成で消化した。
（１）の溶液 ９９．５μｌ
Ｍ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５ ６μｌ
Ｔｒｉｔｏｎ １６μｌ
ＢＳＡ １６μｌ
Ｈ ｂｕｆｆｅｒ １μｌ
滅菌水 ５μｌ
ＮｏｔＩ ４μｌ
合計 １５０μｌ
反応は、３７℃／２ｈ行った。そして、０．５μｌを０．８％アガロースゲルで電気泳動し消化されていることを確認した（約４５００ｂｐと約７２０ｂｐの位置にバンドが確認できる）。
消化が確認できたならば、全量を電気泳動して４５００ｂｐのバンドを回収した。
［５］ ｓｃＦｖライブラリー（Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ）のＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ消化
（１）ｓｃＦｖライブラリー（Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ）（３０μｇ）を以下の組成で消化した。なお、ベクター量はライゲーション時に１．８μｇのｓｃＦｖ鎖を確保できればよいため、ゲル抽出キットの能力に合わせて適宜調整してもよい。
Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ：：ｓｃＦｖ Ｘμｌ（３０μｇ）
Ｍ ｂｕｆｆｅｒ １０μｌ
ＳｆｉＩ ５μｌ
滅菌水 Ｙμｌ
合計 １００μｌ
反応は、５０℃／ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔ行った。そして、０．５μｌを０．８％アガロースゲルで電気泳動し消化されているかを確認した。
（２）続いてＮｏｔＩで［５］−（１）を以下の組成で消化した。
（１）の溶液 ９９．５μｌ
Ｍ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５ ６μｌ
Ｔｒｉｔｏｎ １６μｌ
ＢＳＡ １６μｌ
Ｈ ｂｕｆｆｅｒ １μｌ
滅菌水 ５μｌ
ＮｏｔＩ ４μｌ
合計 １５０μｌ
反応は、３７℃／２ｈ行った。そして、０．５μｌを０．８％アガロースゲルで電気泳動し消化されているかを確認した（約２８００ｂｐと約７２０ｂｐの位置にバンドが確認できる）。
消化されていることが確認できたら、全量を電気泳動して７２０ｂｐのバンドを回収した。
（１）ｓｃＦｖライブラリー（Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ）（３０μｇ）を以下の組成で消化した。なお、ベクター量はライゲーション時に１．８μｇのｓｃＦｖ鎖を確保できればよいため、ゲル抽出キットの能力に合わせて適宜調整してもよい。
Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ：：ｓｃＦｖ Ｘμｌ（３０μｇ）
Ｍ ｂｕｆｆｅｒ １０μｌ
ＳｆｉＩ ５μｌ
滅菌水 Ｙμｌ
合計 １００μｌ
反応は、５０℃／ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔ行った。そして、０．５μｌを０．８％アガロースゲルで電気泳動し消化されているかを確認した。
（２）続いてＮｏｔＩで［５］−（１）を以下の組成で消化した。
（１）の溶液 ９９．５μｌ
Ｍ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５ ６μｌ
Ｔｒｉｔｏｎ １６μｌ
ＢＳＡ １６μｌ
Ｈ ｂｕｆｆｅｒ １μｌ
滅菌水 ５μｌ
ＮｏｔＩ ４μｌ
合計 １５０μｌ
反応は、３７℃／２ｈ行った。そして、０．５μｌを０．８％アガロースゲルで電気泳動し消化されているかを確認した（約２８００ｂｐと約７２０ｂｐの位置にバンドが確認できる）。
消化されていることが確認できたら、全量を電気泳動して７２０ｂｐのバンドを回収した。
［６］ ｐＣＡＮＴＡＢ５ＥへのｓｃＦｖ遺伝子の組み込み
（１）［４］−（２）及び［５］−（２）で得られた産物を用いて以下の組成で１６℃／ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔライゲーションした。
［４］−（２）溶液 Ｘμｌ （３．６μｇ）
［５］−（２）溶液 Ｙμｌ （１．８μｇ）
Ｔ４Ｌｉｇａｓｅ ６μｌ
１０×Ｔ４ｂｕｆｆｅｒ Ｚμｌ
合計 （Ｘ＋Ｙ＋Ｚ＋６）μｌ
（２）エタノール沈殿後、５μｌの滅菌水に溶解させた。
（１）［４］−（２）及び［５］−（２）で得られた産物を用いて以下の組成で１６℃／ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔライゲーションした。
［４］−（２）溶液 Ｘμｌ （３．６μｇ）
［５］−（２）溶液 Ｙμｌ （１．８μｇ）
Ｔ４Ｌｉｇａｓｅ ６μｌ
１０×Ｔ４ｂｕｆｆｅｒ Ｚμｌ
合計 （Ｘ＋Ｙ＋Ｚ＋６）μｌ
（２）エタノール沈殿後、５μｌの滅菌水に溶解させた。
［７］ ｓｃＦｖ遺伝子ライブラリーｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（プラスミド）の調整
（１）市販のＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｃｅｌｌｓチューブ１本と［６］‐（２）のＤＮＡ溶液５μｌを混合し、０．１ｃｍキュベットに注入した。
（２）以下の条件でエレクトロポーレーションを行った。
２００Ω、２５μＦ、１．５ｋＶ
（３）エレクトロポレーションした大腸菌を氷冷したＳＯＣ培地１ｍｌを加えた。
（４）３７℃で１時間振とうした（１６０〜２２５ｒｐｍ）。
（５）３７℃１時間振盪培養後の菌体懸濁液から１５μｌサンプリングして、トランスフォーメーションされた大腸菌の数の計測に使用した。
（６）予め３７℃で保温（または室温放置）しておいた以下の組成の培地２０ｍｌ、２本（大試験管）に（３）の各大腸菌懸濁液の残りを２等分して（約０．５ｍｌ）加え、３７℃でＯ／Ｎ振盪培養した。
２×ＹＴ培地 １９ｍｌ
２０％グルコース １ｍｌ （ｆｉｎａｌ １％）
１００ｍｇ／ｍｌ ａｍｐ ２０μｌ （ｆｉｎａｌ１００μｇ／ｍｌ）
Ｔｏｔａｌ ２０ｍｌ
（７）（６）の２０ｍｌ×２＝４０ｍｌを次の様にした。
（ｉ）培養液を２０〜３０ｍｌは、そのままファルコンチューブに移し（または遠心濃縮し）−２０℃以下に保存し、結果が良好であれば後日、プラスミドを抽出する（マウス抗体ｓｃＦｖライブラリーの大元として保存する。）。
（ｉｉ）２ｍｌ程度を残しておいた。そして（８）で使用する。
（ｉｉｉ）残り（約８ｍｌ〜１８ｍｌ）は、１．２ｍｌ程度に小分けしグリストする（グリセロールｆｉｎａｌ２０％程度入れ−８０℃保存する）。
（８）（７）−（ｉｉ）は、２×ＹＴＧａ培地１０ｍｌに、ＯＤ０．１程度（０．５ｍｌ程度）再懸濁し（中試験管使用）３７℃で振とう培養し、濁度（ＯＤ６００）が約０．Ｄ０．７程度になったとき遠心（ファルコン５０ｍｌ）集菌し、５ｍｌの２×ＹＴａ（２×ＹＴ＋ａｍｐ、ｏｒＬＢａ；グルコース抜く）に懸濁した。
（９）ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（５ｘ１０１１ｃｆｕ／ｍｌ程度）を０．１ｍｌ加え（ｆｉｎａｌ１〜４ｘ１０１０）３７℃（ｏｒ３０℃）で１時間振とう培養した。
（１０）２×ＹＴａを３倍量（１５ｍｌ）追加し、Ｔｃ２０μｇ／ｍｌ及びＫｍ５０μｇ／ｍｌになるように加えて３０℃で一晩振とう培養した。
（１１）遠心して菌体を沈殿させ（ファルコンチューブ５０ｍｌ、３８５０ｒｐｍで可；もし沈殿がしっかり形成されていないときは、さらに高速回転で再度行う。）、培養上清を回収（約２０ｍｌ）し、滅菌したベックマン専用遠心管３７ｍｌ用に入れ、４．８ｍｌのＰＥＧ−ＮａＣｌ（ｆｉｎａｌ２０％）を加え、よく混ぜてから、氷中に３０分以上おき、１０，０００ｇ（ベックマン高速遠心機で９，５００ｒｐｍ）、２０分遠心した。
（１２）ファージは沈殿にあるので、上清を除き、２０ｍｌ１ｘＰＢＳで溶解させ、もう一度４．８ｍｌＰＥＧ−ＮａＣｌで氷中に３０分以上置き沈殿させ、１０，０００ｇ（ベックマン高速遠心機ＳＶ−２０ローター、９，５００ｒｐｍ）、２０分遠心し、上清を丁寧に除いた。
（１３）沈殿したファージを適量（５ｍｌ）ＰＢＳで溶解させファージ抗体ライブラリー（ＰｈＡｂＬｉｂ．）を得た。
（１４）対数増殖期大腸菌（ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ （Ｔｃｒ））培養液に、回収したファージ溶液（ＰｈＡｂＬｉｂ．）適量を添加し、３７℃、１時間、ゆるやかに振とう培養して感染させた。
感染後の培養液の一部（１０μｌ）を適宜に希釈（希釈無し、１０２、１０３、１０４）し１００μｌを、ＬＢＧａ（ＬＢ＋０．５％グルコース＋ａｍｐ）プレートに撒き、３０℃でＯ／Ｎ培養し、コロニー数からファージの濃度（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ（ｃｆｕ）を測定した。
（１）市販のＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｃｅｌｌｓチューブ１本と［６］‐（２）のＤＮＡ溶液５μｌを混合し、０．１ｃｍキュベットに注入した。
（２）以下の条件でエレクトロポーレーションを行った。
２００Ω、２５μＦ、１．５ｋＶ
（３）エレクトロポレーションした大腸菌を氷冷したＳＯＣ培地１ｍｌを加えた。
（４）３７℃で１時間振とうした（１６０〜２２５ｒｐｍ）。
（５）３７℃１時間振盪培養後の菌体懸濁液から１５μｌサンプリングして、トランスフォーメーションされた大腸菌の数の計測に使用した。
（６）予め３７℃で保温（または室温放置）しておいた以下の組成の培地２０ｍｌ、２本（大試験管）に（３）の各大腸菌懸濁液の残りを２等分して（約０．５ｍｌ）加え、３７℃でＯ／Ｎ振盪培養した。
２×ＹＴ培地 １９ｍｌ
２０％グルコース １ｍｌ （ｆｉｎａｌ １％）
１００ｍｇ／ｍｌ ａｍｐ ２０μｌ （ｆｉｎａｌ１００μｇ／ｍｌ）
Ｔｏｔａｌ ２０ｍｌ
（７）（６）の２０ｍｌ×２＝４０ｍｌを次の様にした。
（ｉ）培養液を２０〜３０ｍｌは、そのままファルコンチューブに移し（または遠心濃縮し）−２０℃以下に保存し、結果が良好であれば後日、プラスミドを抽出する（マウス抗体ｓｃＦｖライブラリーの大元として保存する。）。
（ｉｉ）２ｍｌ程度を残しておいた。そして（８）で使用する。
（ｉｉｉ）残り（約８ｍｌ〜１８ｍｌ）は、１．２ｍｌ程度に小分けしグリストする（グリセロールｆｉｎａｌ２０％程度入れ−８０℃保存する）。
（８）（７）−（ｉｉ）は、２×ＹＴＧａ培地１０ｍｌに、ＯＤ０．１程度（０．５ｍｌ程度）再懸濁し（中試験管使用）３７℃で振とう培養し、濁度（ＯＤ６００）が約０．Ｄ０．７程度になったとき遠心（ファルコン５０ｍｌ）集菌し、５ｍｌの２×ＹＴａ（２×ＹＴ＋ａｍｐ、ｏｒＬＢａ；グルコース抜く）に懸濁した。
（９）ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（５ｘ１０１１ｃｆｕ／ｍｌ程度）を０．１ｍｌ加え（ｆｉｎａｌ１〜４ｘ１０１０）３７℃（ｏｒ３０℃）で１時間振とう培養した。
（１０）２×ＹＴａを３倍量（１５ｍｌ）追加し、Ｔｃ２０μｇ／ｍｌ及びＫｍ５０μｇ／ｍｌになるように加えて３０℃で一晩振とう培養した。
（１１）遠心して菌体を沈殿させ（ファルコンチューブ５０ｍｌ、３８５０ｒｐｍで可；もし沈殿がしっかり形成されていないときは、さらに高速回転で再度行う。）、培養上清を回収（約２０ｍｌ）し、滅菌したベックマン専用遠心管３７ｍｌ用に入れ、４．８ｍｌのＰＥＧ−ＮａＣｌ（ｆｉｎａｌ２０％）を加え、よく混ぜてから、氷中に３０分以上おき、１０，０００ｇ（ベックマン高速遠心機で９，５００ｒｐｍ）、２０分遠心した。
（１２）ファージは沈殿にあるので、上清を除き、２０ｍｌ１ｘＰＢＳで溶解させ、もう一度４．８ｍｌＰＥＧ−ＮａＣｌで氷中に３０分以上置き沈殿させ、１０，０００ｇ（ベックマン高速遠心機ＳＶ−２０ローター、９，５００ｒｐｍ）、２０分遠心し、上清を丁寧に除いた。
（１３）沈殿したファージを適量（５ｍｌ）ＰＢＳで溶解させファージ抗体ライブラリー（ＰｈＡｂＬｉｂ．）を得た。
（１４）対数増殖期大腸菌（ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ （Ｔｃｒ））培養液に、回収したファージ溶液（ＰｈＡｂＬｉｂ．）適量を添加し、３７℃、１時間、ゆるやかに振とう培養して感染させた。
感染後の培養液の一部（１０μｌ）を適宜に希釈（希釈無し、１０２、１０３、１０４）し１００μｌを、ＬＢＧａ（ＬＢ＋０．５％グルコース＋ａｍｐ）プレートに撒き、３０℃でＯ／Ｎ培養し、コロニー数からファージの濃度（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ（ｃｆｕ）を測定した。
実施例５ 抗体のスクリーニング（バイオパンニング）
〔１〕抗原吸着条件の検討
抗原（ＣＲＰ）が十分に吸着する抗原濃度、抗原溶解液濃度、プレート・チューブの材質などの条件を予備検討した。そして、イムノチューブに１０μｇ／ｍｌの抗原（ＯＶＡ）を１００μｌづつに入れ、４℃でＯ／Ｎ吸着させたタンパク量を測定した。
〔１〕抗原吸着条件の検討
抗原（ＣＲＰ）が十分に吸着する抗原濃度、抗原溶解液濃度、プレート・チューブの材質などの条件を予備検討した。そして、イムノチューブに１０μｇ／ｍｌの抗原（ＯＶＡ）を１００μｌづつに入れ、４℃でＯ／Ｎ吸着させたタンパク量を測定した。
〔２〕パンニング（イムノチューブを用いる方法、なお、〔 〕内は、イムノプレートを用いる場合でありこれでも可能。）
（１）抗原（ＣＲＰ）のコーティング：
ＰＢＳに溶解した１〜１０μｇ／ｍｌの抗原（ＣＲＰ）を１ｍｌづつ、イムノチューブに入れた。４℃でＯ／Ｎ（吸着性の良いものは２時間室温、１５℃４時間程度でも良い場合がある。）。〔イムノプレートに１００μｌづつ。〕
（２）洗浄１：
ＰＢＳを３ｍｌ入れ、捨て、３ｍｌ入れ、捨て、３ｍｌ入れ、捨て、を２回行なう。〔３００μｌ〕
（３）ブロッキング：
ブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（例：２％スキムミルク−ＰＢＳ））を３ｍｌ加え室温（または３０℃）で１時間放置し、ブロッキングを行なった。〔１／１０量；３００μｌ〕
（４）洗浄２：
ＰＢＳを３ｍｌ以上入れ、捨て、３ｍｌ入れ、捨て、を計３回行なった。
（５）バインディング：
終濃度２％スキムミルク−ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中に溶解させた実施例４で調整したファージ抗体ライブラリー（１×１０１２Ｃｆｕ）１ｍｌをイムノチューブに加え、パラフィルムをし、ゆっくり振とう（又は回転）させて、室温〔または３０℃〕で１時間撹拌した。〔１／１０量；３００μｌ、シールする。〕
（６）洗浄３，４：
チューブを３ｍｌのＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄、３ｍｌＰＢＳで５回ずつ合計 ３回（２〜５回）洗浄した。〔１／１０量；３００μｌ〕
（７）溶出：
０．１ＭＧｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ２．２， １．２ｍｌ〔１２０μｌ〕）を加え、ゆっくり振とうさせて、室温で２０分静置した。次にファージの溶出液を別のチューブに移し２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌを入れ、中和した。（この条件で中和になっているかｐＨ試験紙で確認した。）
（８）再感染：
中和したファージ溶液１．５ｍｌを、大腸菌溶液２０ｍｇ／ｍｌＴｃ１０μｌ（ｆｉｎａｌ２０μｇ／ｍｌ）入りの２×ＹＴ培地、１０ｍｌに再感染させた。
（１）抗原（ＣＲＰ）のコーティング：
ＰＢＳに溶解した１〜１０μｇ／ｍｌの抗原（ＣＲＰ）を１ｍｌづつ、イムノチューブに入れた。４℃でＯ／Ｎ（吸着性の良いものは２時間室温、１５℃４時間程度でも良い場合がある。）。〔イムノプレートに１００μｌづつ。〕
（２）洗浄１：
ＰＢＳを３ｍｌ入れ、捨て、３ｍｌ入れ、捨て、３ｍｌ入れ、捨て、を２回行なう。〔３００μｌ〕
（３）ブロッキング：
ブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（例：２％スキムミルク−ＰＢＳ））を３ｍｌ加え室温（または３０℃）で１時間放置し、ブロッキングを行なった。〔１／１０量；３００μｌ〕
（４）洗浄２：
ＰＢＳを３ｍｌ以上入れ、捨て、３ｍｌ入れ、捨て、を計３回行なった。
（５）バインディング：
終濃度２％スキムミルク−ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中に溶解させた実施例４で調整したファージ抗体ライブラリー（１×１０１２Ｃｆｕ）１ｍｌをイムノチューブに加え、パラフィルムをし、ゆっくり振とう（又は回転）させて、室温〔または３０℃〕で１時間撹拌した。〔１／１０量；３００μｌ、シールする。〕
（６）洗浄３，４：
チューブを３ｍｌのＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄、３ｍｌＰＢＳで５回ずつ合計 ３回（２〜５回）洗浄した。〔１／１０量；３００μｌ〕
（７）溶出：
０．１ＭＧｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ２．２， １．２ｍｌ〔１２０μｌ〕）を加え、ゆっくり振とうさせて、室温で２０分静置した。次にファージの溶出液を別のチューブに移し２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌを入れ、中和した。（この条件で中和になっているかｐＨ試験紙で確認した。）
（８）再感染：
中和したファージ溶液１．５ｍｌを、大腸菌溶液２０ｍｇ／ｍｌＴｃ１０μｌ（ｆｉｎａｌ２０μｇ／ｍｌ）入りの２×ＹＴ培地、１０ｍｌに再感染させた。
〔３〕回収ファージの再調整法
（１）対数期大腸菌：
ＬＢＧＴｃ（または２ｘＹＴＧＴｃ）で培養した対数期大腸菌を必要量用意した。
大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ （Ｔｃｒ） の前培養液（０．３ｍｌ程度（ＯＤ０．１程度）を２０ｍｇ／ｍｌＴｃ１０μｌ（ｆｉｎａｌ２０μｇ／ｍｌ）入りの１０ｍｌ２×ＹＴＧに添加し、濁度約０Ｄ０．７程度になるまで３７℃で生育させた。
（２）再感染：
対数増殖期大腸菌（ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ （Ｔｃｒ））培養液に、回収したファージ溶液（ＰｈＡｂＬｉｂ．）１．５ｍｌを添加し、３７℃、１時間、ゆるやかに振とう培養して感染させた。
（３）感染数から回収率推定：
ファージのみ感染後の培養液の一部（１０μｌ）を適宜に希釈（希釈無し、１０２、１０３、１０４）し１００μｌを、ＬＢＧａ（ＬＢ＋０．５％グルコース＋ａｍｐ）プレートに撒き、３０℃でＯ／Ｎ培養し、コロニー数からファージの濃度（ｃｆｕ）を推定し、回収率を推定した。
（４）増殖１ｓｔ：
残りの大半の培養液（９．９ｍｌ）に２×ＹＴＧａ（ｏｒＬＢＧａ）を２０ｍｌを加え、３７℃で振とう培養し濁度が０．５程度になるまで生育させた。
（５）ファージ増殖２ｎｄ：
グリスト用に使用した残りの（５）の菌液は、６０００ｒｐｍ、５分、遠心し、上清を除去した。
沈殿物は、除去した上清と等量の２×ＹＴａ（ｏｒＬＢａ）に懸濁し、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（５ｘ１０１１ｃｆｕ／ｍｌ程度）を０．２ｍｌ（ｆｉｎａｌ５ｘ１０１０）加え、１ｈｒゆっくり３７℃で培養した。
（６）適当量の２×ＹＴａ（またはＬＢａ）と最終５０μｇ／ｍｌとなるようＫｍを加え、３０℃で一晩振とう培養した。
（７）ファージ量の推定：
Ｏ／Ｎ後（３）のコロニー数をカウントし、Ｏｕｔｐｕｔ／ Ｉｎｐｕｔを算出した。
（８）ファージ回収、ＰＥＧ沈：
（ｉ）６０００ｒｐｍ１０分遠心して菌体を沈殿させた。
（ｉｉ）培養上清を回収（約２０ｍｌ）し、滅菌したベックマン専用遠心管３７ｍｌ用に入れ、４．８ｍｌのＰＥＧ−ＮａＣｌ（ｆｉｎａｌ１５〜２０％）を加え、よく混ぜてから、氷中に３０分程度おき、１０，０００ｇ（ベックマン高速遠心機で９，５００ｒｐｍ）、２０分遠心した。
（ｉｉｉ）ファージは沈殿にあるので、上清を除き、（８）（ｉｉ）の培養量の１／１０量の１ｘＰＢＳで溶解させ、もう一度ＰＥＧ−ＮａＣｌ（ｆｉｎａｌ１５〜２０％）で氷中に１５分程度置き沈殿させ、１０，０００ｇ（ベックマン高速遠心機ＳＶ−２０ローター、９，５００ｒｐｍ）、２０分遠心し、上清を丁寧に除いた。
（ｉｖ）沈殿したファージを、２ｍｌＰＢＳで溶解させファージの増幅物を得た。必要に応じ、遠心後０．２２μｍフィルターを通した。
（ｖ）４℃保存、０．０５％となるようＮａＮ３（または２０００分の１容量のＰｒｏＣｌｉｎ３００）を入れた。
（ｖｉ）回収ファージを定量した。
（１）対数期大腸菌：
ＬＢＧＴｃ（または２ｘＹＴＧＴｃ）で培養した対数期大腸菌を必要量用意した。
大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ （Ｔｃｒ） の前培養液（０．３ｍｌ程度（ＯＤ０．１程度）を２０ｍｇ／ｍｌＴｃ１０μｌ（ｆｉｎａｌ２０μｇ／ｍｌ）入りの１０ｍｌ２×ＹＴＧに添加し、濁度約０Ｄ０．７程度になるまで３７℃で生育させた。
（２）再感染：
対数増殖期大腸菌（ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ （Ｔｃｒ））培養液に、回収したファージ溶液（ＰｈＡｂＬｉｂ．）１．５ｍｌを添加し、３７℃、１時間、ゆるやかに振とう培養して感染させた。
（３）感染数から回収率推定：
ファージのみ感染後の培養液の一部（１０μｌ）を適宜に希釈（希釈無し、１０２、１０３、１０４）し１００μｌを、ＬＢＧａ（ＬＢ＋０．５％グルコース＋ａｍｐ）プレートに撒き、３０℃でＯ／Ｎ培養し、コロニー数からファージの濃度（ｃｆｕ）を推定し、回収率を推定した。
（４）増殖１ｓｔ：
残りの大半の培養液（９．９ｍｌ）に２×ＹＴＧａ（ｏｒＬＢＧａ）を２０ｍｌを加え、３７℃で振とう培養し濁度が０．５程度になるまで生育させた。
（５）ファージ増殖２ｎｄ：
グリスト用に使用した残りの（５）の菌液は、６０００ｒｐｍ、５分、遠心し、上清を除去した。
沈殿物は、除去した上清と等量の２×ＹＴａ（ｏｒＬＢａ）に懸濁し、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（５ｘ１０１１ｃｆｕ／ｍｌ程度）を０．２ｍｌ（ｆｉｎａｌ５ｘ１０１０）加え、１ｈｒゆっくり３７℃で培養した。
（６）適当量の２×ＹＴａ（またはＬＢａ）と最終５０μｇ／ｍｌとなるようＫｍを加え、３０℃で一晩振とう培養した。
（７）ファージ量の推定：
Ｏ／Ｎ後（３）のコロニー数をカウントし、Ｏｕｔｐｕｔ／ Ｉｎｐｕｔを算出した。
（８）ファージ回収、ＰＥＧ沈：
（ｉ）６０００ｒｐｍ１０分遠心して菌体を沈殿させた。
（ｉｉ）培養上清を回収（約２０ｍｌ）し、滅菌したベックマン専用遠心管３７ｍｌ用に入れ、４．８ｍｌのＰＥＧ−ＮａＣｌ（ｆｉｎａｌ１５〜２０％）を加え、よく混ぜてから、氷中に３０分程度おき、１０，０００ｇ（ベックマン高速遠心機で９，５００ｒｐｍ）、２０分遠心した。
（ｉｉｉ）ファージは沈殿にあるので、上清を除き、（８）（ｉｉ）の培養量の１／１０量の１ｘＰＢＳで溶解させ、もう一度ＰＥＧ−ＮａＣｌ（ｆｉｎａｌ１５〜２０％）で氷中に１５分程度置き沈殿させ、１０，０００ｇ（ベックマン高速遠心機ＳＶ−２０ローター、９，５００ｒｐｍ）、２０分遠心し、上清を丁寧に除いた。
（ｉｖ）沈殿したファージを、２ｍｌＰＢＳで溶解させファージの増幅物を得た。必要に応じ、遠心後０．２２μｍフィルターを通した。
（ｖ）４℃保存、０．０５％となるようＮａＮ３（または２０００分の１容量のＰｒｏＣｌｉｎ３００）を入れた。
（ｖｉ）回収ファージを定量した。
〔４〕パンニング第２回以降
（１）パンニングは５回を目安に回数を繰り返す毎に厳しい洗浄条件にして第１回と同様の操作を５回繰り返した。
（２）培養液の一部を適宜に希釈（例；希釈無し、１０３、１０４、１０５）しＬＢＧａプレートに撒き、３７℃（または３０℃）でＯ／Ｎ培養し、コロニー数から回収率を推定算出した（Ｏｕｔｐｕｔ／Ｉｎｐｕｔ）。
（３）この感染・洗浄の操作を繰り返しで回収率の変動が少なくなったらＥＬＩＳＡ検定で確認した。
（４）ＥＬＩＳＡがポジティブなら、Ｏｕｔｐｕｔの測定のために使用したプレートからコロニーを拾い、ファージ抗体をスクリーニングした。
（１）パンニングは５回を目安に回数を繰り返す毎に厳しい洗浄条件にして第１回と同様の操作を５回繰り返した。
（２）培養液の一部を適宜に希釈（例；希釈無し、１０３、１０４、１０５）しＬＢＧａプレートに撒き、３７℃（または３０℃）でＯ／Ｎ培養し、コロニー数から回収率を推定算出した（Ｏｕｔｐｕｔ／Ｉｎｐｕｔ）。
（３）この感染・洗浄の操作を繰り返しで回収率の変動が少なくなったらＥＬＩＳＡ検定で確認した。
（４）ＥＬＩＳＡがポジティブなら、Ｏｕｔｐｕｔの測定のために使用したプレートからコロニーを拾い、ファージ抗体をスクリーニングした。
〔５〕ファージ抗体の準備（作製）
（１）コロニーを１０個〜（数十）程度爪楊枝で取り、１ｍｌ２×ＹＴＧａＴｃ培地と同プレートに植菌し３０℃Ｏ／Ｎ培養した。
（２）（１）の一部（０．５ｍｌ程度ＯＤ０．１目安）を１０ｍｌ２×ＹＴＧａＴｃに加え、濁度約０．５〜０．７〜０．８になるまで３７℃で生育させた。
（３）（２）の一部１．５ｍｌをエッペンチューブで６０００ｒｐｍ、１０分、遠心し、上清を除去した。
（４）沈殿物は、除去した上清と等量（ｏｒ１．２ｍｌ）の２ｘＹＴａに懸濁し、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（５×１０１１ｃｆｕ／ｍｌ程度）を０．０１ｍｌ（ｆｉｎａｌ５×１０１０）加え、１ｈｒゆっくり３７℃で培養した。
（５）５ｍｌの２×ＹＴａと最終５０μｇ／ｍｌとなるようＫｍを加え、３０℃で一晩振とう培養した。
（６）ファージ回収、ＰＥＧ沈：
（ｉ）６０００ｒｐｍ１０分遠心して菌体を沈殿させた。
（ｉｉ）培養上清を回収しエッペンチューブに移し２４０μｌＰＥＧ−ＮａＣｌ（ｆｉｎａｌ１５〜２０％）を加え、よく混ぜてから、氷中に３０分程度おき、１０，０００ｇ（１２０００ｒｐｍ）、１０分遠心した。
（ｉｉｉ）上清を除き、（６）（ｉｉ）の培養量の１／２量の１×ＰＢＳで溶解させた。これを、ファージＥＬＩＳＡのサンプルとした。
（１）コロニーを１０個〜（数十）程度爪楊枝で取り、１ｍｌ２×ＹＴＧａＴｃ培地と同プレートに植菌し３０℃Ｏ／Ｎ培養した。
（２）（１）の一部（０．５ｍｌ程度ＯＤ０．１目安）を１０ｍｌ２×ＹＴＧａＴｃに加え、濁度約０．５〜０．７〜０．８になるまで３７℃で生育させた。
（３）（２）の一部１．５ｍｌをエッペンチューブで６０００ｒｐｍ、１０分、遠心し、上清を除去した。
（４）沈殿物は、除去した上清と等量（ｏｒ１．２ｍｌ）の２ｘＹＴａに懸濁し、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（５×１０１１ｃｆｕ／ｍｌ程度）を０．０１ｍｌ（ｆｉｎａｌ５×１０１０）加え、１ｈｒゆっくり３７℃で培養した。
（５）５ｍｌの２×ＹＴａと最終５０μｇ／ｍｌとなるようＫｍを加え、３０℃で一晩振とう培養した。
（６）ファージ回収、ＰＥＧ沈：
（ｉ）６０００ｒｐｍ１０分遠心して菌体を沈殿させた。
（ｉｉ）培養上清を回収しエッペンチューブに移し２４０μｌＰＥＧ−ＮａＣｌ（ｆｉｎａｌ１５〜２０％）を加え、よく混ぜてから、氷中に３０分程度おき、１０，０００ｇ（１２０００ｒｐｍ）、１０分遠心した。
（ｉｉｉ）上清を除き、（６）（ｉｉ）の培養量の１／２量の１×ＰＢＳで溶解させた。これを、ファージＥＬＩＳＡのサンプルとした。
〔６〕ＥＬＩＳＡ法による抗体価チェック
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｄｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ ；Ａｍｅｒｓｈａｍ ２７−９４０２−０１をベースとして下記の方法で行った。
方法：
（１）ＥＬＩＳＡ用の９６穴プレートに１０μｇ、５μｇ、１μｇ、５００ｎｇ、１００ｎｇの様にＰＢＳで希釈系をつくり抗原ＣＲＰを１００μｌ添加した。
（２）４℃ Ｏ／Ｎ静置した。
（３）ポジコンに、ポジコン用Ｍ１３ファージ抗原を用いた。
（４）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ 例：２％スキムミルク−ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回ｗａｓｈし、ＰＢＳをきれいに除いた。
（５）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ を２００μｌ／ｗｅｌｌ加え室温で１ｈ〜２ｈ間放置した。
（６）プレートを逆さにしてＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ をきれいに除き、さらにＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ （ＰＢＳ）で２回ｗａｓｈし、プレートを逆さにしてＰＢＳをきれいに除いた。
（７）ファージ抗体（一次抗体）はＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ で（例えば、）２倍の希釈系列をつくり、室温１５分〜３０分間放置した。
（８）ファージ抗体（一次抗体）希釈液を各ｗｅｌｌに１００μｌ 加え、室温１ｈ間放置する。プレートを逆さにしてペーパータオルに押し付けるようにして除いた。
（９）３００μｌ程度のＰＢＳで２回ｗａｓｈした。
（１０）プレートを逆さにしてＰＢＳをきれいに除いた。
（１１）２次抗体をＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで５０００倍に希釈した（４μｌ−ＨＲＰ／Ａｎｔｉ−Ｍ１３に２１ｍｌのＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを入れる）。
（１２）各ｗｅｌｌに希釈二次抗体を１００μｌ／ｗｅｌｌ加えた。
（１３）室温で１時間放置した。
（１４）ＰＢＳで６回ｗａｓｈし、プレートを逆さにしてＰＢＳをきれいに除いた。
（１５）２１ｍｌの１×ＡＢＴＳ溶液に３０ ％過酸化水素水を３６μｌ加えたＡＢＴＳ溶液（用時調製）をすばやく１００μｌ／ｗｅｌｌ加えた。
（１６）３７℃２０分（〜６０分；目視で発色を判断し決める）放置し、すぐにマイクロプレートリーダーで４０５ ｎｍで定量した。
（１７）すぐに測定できない時は、ＳＤＳ／ＤＭＦを１００μｌ ／ｗｅｌｌ加えて、反応を止めてから、４０５ ｎｍで定量した。
次に陽性クローン株、Ｎｏ．２０とＮｏ．４０の株からファージミドを抽出し、定法によりＣ末端に６×ヒスタジンのタグを導入した。
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｄｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ ；Ａｍｅｒｓｈａｍ ２７−９４０２−０１をベースとして下記の方法で行った。
方法：
（１）ＥＬＩＳＡ用の９６穴プレートに１０μｇ、５μｇ、１μｇ、５００ｎｇ、１００ｎｇの様にＰＢＳで希釈系をつくり抗原ＣＲＰを１００μｌ添加した。
（２）４℃ Ｏ／Ｎ静置した。
（３）ポジコンに、ポジコン用Ｍ１３ファージ抗原を用いた。
（４）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ 例：２％スキムミルク−ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回ｗａｓｈし、ＰＢＳをきれいに除いた。
（５）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ を２００μｌ／ｗｅｌｌ加え室温で１ｈ〜２ｈ間放置した。
（６）プレートを逆さにしてＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ をきれいに除き、さらにＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ （ＰＢＳ）で２回ｗａｓｈし、プレートを逆さにしてＰＢＳをきれいに除いた。
（７）ファージ抗体（一次抗体）はＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ で（例えば、）２倍の希釈系列をつくり、室温１５分〜３０分間放置した。
（８）ファージ抗体（一次抗体）希釈液を各ｗｅｌｌに１００μｌ 加え、室温１ｈ間放置する。プレートを逆さにしてペーパータオルに押し付けるようにして除いた。
（９）３００μｌ程度のＰＢＳで２回ｗａｓｈした。
（１０）プレートを逆さにしてＰＢＳをきれいに除いた。
（１１）２次抗体をＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで５０００倍に希釈した（４μｌ−ＨＲＰ／Ａｎｔｉ−Ｍ１３に２１ｍｌのＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを入れる）。
（１２）各ｗｅｌｌに希釈二次抗体を１００μｌ／ｗｅｌｌ加えた。
（１３）室温で１時間放置した。
（１４）ＰＢＳで６回ｗａｓｈし、プレートを逆さにしてＰＢＳをきれいに除いた。
（１５）２１ｍｌの１×ＡＢＴＳ溶液に３０ ％過酸化水素水を３６μｌ加えたＡＢＴＳ溶液（用時調製）をすばやく１００μｌ／ｗｅｌｌ加えた。
（１６）３７℃２０分（〜６０分；目視で発色を判断し決める）放置し、すぐにマイクロプレートリーダーで４０５ ｎｍで定量した。
（１７）すぐに測定できない時は、ＳＤＳ／ＤＭＦを１００μｌ ／ｗｅｌｌ加えて、反応を止めてから、４０５ ｎｍで定量した。
次に陽性クローン株、Ｎｏ．２０とＮｏ．４０の株からファージミドを抽出し、定法によりＣ末端に６×ヒスタジンのタグを導入した。
実施例６ 抗ＣＲＰファージが提示しているｓｃＦｖ抗体のアミノ酸配列の決定
実施例５で吸光度の上昇が確認されたファージを選び、定法に従い、これらのファージが感染している大腸菌からファージミドＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡの塩基配列を決定することにより、ファージが提示しているｓｃＦｖ抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を決定した。チェーンターミネーター法に基づくＢｉｇ ＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステム社製）にて解析することにより決定した。最終結果より特に性能の良いと思われた抗ＣＲＰｓｃＦｖ抗体Ｎｏ．２０，Ｎｏ．４０の重鎖及び軽鎖のＤＮＡの塩基配列とアミノ酸配列を配列表に示す。配列表の配列番号１及び３はそれぞれ抗体Ｎｏ．２０のアミノ酸配列及びDNA配列であり、配列番号２及び４はそれぞれ抗体Ｎｏ．４０のアミノ酸配列及びDNA配列である。
実施例５で吸光度の上昇が確認されたファージを選び、定法に従い、これらのファージが感染している大腸菌からファージミドＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡの塩基配列を決定することにより、ファージが提示しているｓｃＦｖ抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を決定した。チェーンターミネーター法に基づくＢｉｇ ＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステム社製）にて解析することにより決定した。最終結果より特に性能の良いと思われた抗ＣＲＰｓｃＦｖ抗体Ｎｏ．２０，Ｎｏ．４０の重鎖及び軽鎖のＤＮＡの塩基配列とアミノ酸配列を配列表に示す。配列表の配列番号１及び３はそれぞれ抗体Ｎｏ．２０のアミノ酸配列及びDNA配列であり、配列番号２及び４はそれぞれ抗体Ｎｏ．４０のアミノ酸配列及びDNA配列である。
実施例７ ｓｃＦｖ抗体発現と精製
〔１〕ファージミド導入大腸菌（ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ−ＣＲＰ／ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ）の宿主変換（プラスミド法）
（１） ＣＲＰ抗体産生クローンよりファージミドを抽出精製した。
（２） ＨＢ２１５１のケミカルコンピテントセルを用意した。
（３） （１）の１００ｎｇ程度を（２）のセルに定法にて導入した。
（４） 大腸菌をまいた２×ＹＴＧａ プレートより単一コロニーを取って、２ｍｌの２×ＹＴＧａ 培地に植え継ぎ、３０℃で一晩振とう培養した。
（５） ２０ｍｌ２×ＹＴＧａ 培地に０．２ｍｌずつ前培養した大腸菌を植え継ぎ、３０℃でＯＤ６００が０．７（３〜４ｈ）になるまで振とう培養した。
（６）〔２〕以下によりＥＬＩＳＡ試験などで発現の確認をした。
〔１〕ファージミド導入大腸菌（ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ−ＣＲＰ／ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ）の宿主変換（プラスミド法）
（１） ＣＲＰ抗体産生クローンよりファージミドを抽出精製した。
（２） ＨＢ２１５１のケミカルコンピテントセルを用意した。
（３） （１）の１００ｎｇ程度を（２）のセルに定法にて導入した。
（４） 大腸菌をまいた２×ＹＴＧａ プレートより単一コロニーを取って、２ｍｌの２×ＹＴＧａ 培地に植え継ぎ、３０℃で一晩振とう培養した。
（５） ２０ｍｌ２×ＹＴＧａ 培地に０．２ｍｌずつ前培養した大腸菌を植え継ぎ、３０℃でＯＤ６００が０．７（３〜４ｈ）になるまで振とう培養した。
（６）〔２〕以下によりＥＬＩＳＡ試験などで発現の確認をした。
〔２〕ｓｃＦｖ産生大腸菌（ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ−ＣＲＰ／ＨＢ２１５１）のＩＰＴＧ誘導（２０ｍｌスケール）
（１） 単一コロニーを取って、２ｍｌの２×ＹＴＧａ （ｏｒ ＬＢＧａ， ｏｒ ＳＢＧａ以下同様）培地に植え継ぎ、３０℃で一晩振とう培養した。
（２） ２０ｍｌ２ＹＴａＧ培地に０．３ｍｌずつ前培養した大腸菌を植え継ぎ、３０℃でＯＤ６００が０．７程度になるまで（３〜４ｈ）振とう培養した。
（３） （２）を３５００ｇ（３８００ｒｐｍ）程度で集菌し、上清は捨て、２０ｍｌ２×ＹＴａ培地に再懸濁しＩＰＴＧを終濃度０．４〜１．０ｍＭ（２００ｍＭ／ｍｌ溶液なら、１００μＬ）となるように加えた。
（４） ０／Ｎ、３０℃、２４０〜３５０ｒｐｍで培養した。
（５） 培養液２０ｍｌを３５００ｇ（３８００ｒｐｍ）程度の遠心で集菌し、（ｉ）ペレットと（ｉｉ）上清に分けた。
（１） 単一コロニーを取って、２ｍｌの２×ＹＴＧａ （ｏｒ ＬＢＧａ， ｏｒ ＳＢＧａ以下同様）培地に植え継ぎ、３０℃で一晩振とう培養した。
（２） ２０ｍｌ２ＹＴａＧ培地に０．３ｍｌずつ前培養した大腸菌を植え継ぎ、３０℃でＯＤ６００が０．７程度になるまで（３〜４ｈ）振とう培養した。
（３） （２）を３５００ｇ（３８００ｒｐｍ）程度で集菌し、上清は捨て、２０ｍｌ２×ＹＴａ培地に再懸濁しＩＰＴＧを終濃度０．４〜１．０ｍＭ（２００ｍＭ／ｍｌ溶液なら、１００μＬ）となるように加えた。
（４） ０／Ｎ、３０℃、２４０〜３５０ｒｐｍで培養した。
（５） 培養液２０ｍｌを３５００ｇ（３８００ｒｐｍ）程度の遠心で集菌し、（ｉ）ペレットと（ｉｉ）上清に分けた。
〔３〕ペリプラズムからのｓｃＦｖの抽出
（１）〔２〕（５）のペレットに元の培養液の１／１０量（２ｍｌ，１００ｍｌ）のＴＳ（２００ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）＋０．５Ｍｓｕｃｒｏｓｅ）を加え再懸濁しボルテックスでよく攪拌し、３０分間氷冷した。
（２）４℃、１０，０００ × ｇで１０分間遠心して、浸透圧ショックを行った細胞を沈殿させた。上清 （ペリプラズム画分） を別のチューブに移した。
（３）ペリプラズム画分をスピンろ過型の分子量１０，０００分画（アミコン）で濃縮した。スピンろ過カラムは、１５ｍｌ用Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １０，０００ｃｕｔを用い１０倍濃縮した。
（４）ＥＬＩＳＡ試験やタンパク定量、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどに供した。
（１）〔２〕（５）のペレットに元の培養液の１／１０量（２ｍｌ，１００ｍｌ）のＴＳ（２００ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）＋０．５Ｍｓｕｃｒｏｓｅ）を加え再懸濁しボルテックスでよく攪拌し、３０分間氷冷した。
（２）４℃、１０，０００ × ｇで１０分間遠心して、浸透圧ショックを行った細胞を沈殿させた。上清 （ペリプラズム画分） を別のチューブに移した。
（３）ペリプラズム画分をスピンろ過型の分子量１０，０００分画（アミコン）で濃縮した。スピンろ過カラムは、１５ｍｌ用Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １０，０００ｃｕｔを用い１０倍濃縮した。
（４）ＥＬＩＳＡ試験やタンパク定量、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどに供した。
〔４〕結果
バイオパンニングを繰り返すことによりいずれもＣＲＰに特異的なファージが濃縮された。結果を図４に示す。また、本明細書に用いたバイオパンニングに供したライブラリーと、そこから得られた抗体について表３及び図４に示した。
バイオパンニングを繰り返すことによりいずれもＣＲＰに特異的なファージが濃縮された。結果を図４に示す。また、本明細書に用いたバイオパンニングに供したライブラリーと、そこから得られた抗体について表３及び図４に示した。
ヒスチジンタグで精製したｓｃＦｖ抗体のＥＬＩＳＡ試験の結果を図５に示す。
ＥＬＩＳＡでは、抗原濃度に比例し、抗体濃度にも比例した発色が確認された。
Ｎｏ．４０抗体とＮｏ．２０抗体ではＮｏ．４０の方が発色度の高い傾向にあった。
ＥＬＩＳＡでは、抗原濃度に比例し、抗体濃度にも比例した発色が確認された。
Ｎｏ．４０抗体とＮｏ．２０抗体ではＮｏ．４０の方が発色度の高い傾向にあった。
実施例８ イムノクロマト法テストストリップの作製
イムノクロマト法テストストリップの具体例としては、例えば図８に示されるテストストリップが挙げられる。図８において、数字１粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、３１は捕捉部位、４は吸収用部材、５は試料添加用部材を示している。
図示の例では、膜担体３は、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターからなり、同幅の粘着シート１の中程に貼り付けられている。該膜担体３には、そのクロマト展開始点側、すなわち図８の中心（以下「上流側」と記す。なお、その逆の側、すなわち図８におけるクロマト展開方向側は以下「下流側」と記す。）の末端から７．５ｍｍの位置の第一の結合物が固定され、分析対象物質の捕捉部位３１が形成されている。さらに、該膜担体３の上流側の末端から１５．０ｍｍの位置に所謂コントロールライン（図示せず）が設けられている。このコントロールラインは、分析対象物質の存否に係わらず反応が行われたことを確認するためのものであり、通常、前記第二の結合物と免疫学的に特異的に結合する物質（分析対象物質を除く）を膜担体３に固定化することによって形成することができる。例えば、第二の結合物としてマウス抗体を用いた場合は、該マウス抗体に対する抗体を用いることができる。
イムノクロマト法テストストリップの具体例としては、例えば図８に示されるテストストリップが挙げられる。図８において、数字１粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、３１は捕捉部位、４は吸収用部材、５は試料添加用部材を示している。
図示の例では、膜担体３は、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターからなり、同幅の粘着シート１の中程に貼り付けられている。該膜担体３には、そのクロマト展開始点側、すなわち図８の中心（以下「上流側」と記す。なお、その逆の側、すなわち図８におけるクロマト展開方向側は以下「下流側」と記す。）の末端から７．５ｍｍの位置の第一の結合物が固定され、分析対象物質の捕捉部位３１が形成されている。さらに、該膜担体３の上流側の末端から１５．０ｍｍの位置に所謂コントロールライン（図示せず）が設けられている。このコントロールラインは、分析対象物質の存否に係わらず反応が行われたことを確認するためのものであり、通常、前記第二の結合物と免疫学的に特異的に結合する物質（分析対象物質を除く）を膜担体３に固定化することによって形成することができる。例えば、第二の結合物としてマウス抗体を用いた場合は、該マウス抗体に対する抗体を用いることができる。
実施例９ 抗体のスクリーニング
上記実施例７のｓｃＦｖ抗体Ｈｉｓ２０およびＨｉｓ４０を表４に示すように組み合わせて使用し、サンドイッチ式免疫測定法とりわけイムノクロマトグラフィーにおいて最適のモノクローナル抗体の組み合わせを検討した。抗原としてヒトＣＲＰ抗原を用い、イムノクロマト法テストストリップの試料添加用部材に、当該抗原液１００μＬを表４に示す濃度に希釈して滴下し、室温で１５分放置後、捕捉部位における呈色の度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（極めて弱い着色）、＋（弱い着色）、＋＋（明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）の５段階に区分して判定した。ｗは反応が弱いことを示す。その結果を４に示す。
上記実施例７のｓｃＦｖ抗体Ｈｉｓ２０およびＨｉｓ４０を表４に示すように組み合わせて使用し、サンドイッチ式免疫測定法とりわけイムノクロマトグラフィーにおいて最適のモノクローナル抗体の組み合わせを検討した。抗原としてヒトＣＲＰ抗原を用い、イムノクロマト法テストストリップの試料添加用部材に、当該抗原液１００μＬを表４に示す濃度に希釈して滴下し、室温で１５分放置後、捕捉部位における呈色の度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（極めて弱い着色）、＋（弱い着色）、＋＋（明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）の５段階に区分して判定した。ｗは反応が弱いことを示す。その結果を４に示す。
表４に示されるように、金コロイド標識抗体にＨｉｓ４０を用いた場合、捕捉部位の抗体としてＨｉｓ２０およびＨｉｓ４０の何れを使用しても感度を得ることはできなかった。これに対し、金コロイド標識抗体および捕捉部位の抗体として共にＨｉｓ２０を用いた場合、最適であることが示された。金コロイド標識抗体としてＨｉｓ４０を用い、捕捉部位の抗体としてＨｉｓ２０を用いた場合も実施可能であると考えられるが、Ｂｌａｎｋにおける非特異的呈色が生じ、いわゆる非特異的反応を示した。
このことから、Ｈｉｓ２０ ｓｃＦｖ抗体が最適であることが示された。ＣＲＰは５個のサブユニットが輪状に結合したペンタマー構造のため、１分子中に同一のエピトープが存在するため、金コロイド標識抗体および捕捉部位の抗体として共にＨｉｓ２０を用いることができる。
このことから、Ｈｉｓ２０ ｓｃＦｖ抗体が最適であることが示された。ＣＲＰは５個のサブユニットが輪状に結合したペンタマー構造のため、１分子中に同一のエピトープが存在するため、金コロイド標識抗体および捕捉部位の抗体として共にＨｉｓ２０を用いることができる。
実施例１０ 反応性（抗原）
金コロイド標識抗体および捕捉部位の抗体として共にＨｉｓ２０を用い、実施例８と同じ方法でイムノクロマト法テストストリップを作成した。
ヒトＣＲＰ抗原を検体希釈液で希釈して、各濃度に調製し、被験試料とした。この被験試料１００μＬを上記テストストリップの試料添加用部材にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で１５分放置後、捕捉部位で捕捉されたＣＲＰと金コロイド標識抗体との被合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比較して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（極めて弱い着色）、＋（微弱な着色）、＋＋（明確な着色）、＋＋＋（強い着色）、＋＋＋＋（非常に強い着色）の６段階に区分して判定した。その結果を表５に示した。表５から、約１ｎｇ／ｍＬ以上の濃度のＣＲＰを検出可能であることがわかる。
金コロイド標識抗体および捕捉部位の抗体として共にＨｉｓ２０を用い、実施例８と同じ方法でイムノクロマト法テストストリップを作成した。
ヒトＣＲＰ抗原を検体希釈液で希釈して、各濃度に調製し、被験試料とした。この被験試料１００μＬを上記テストストリップの試料添加用部材にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で１５分放置後、捕捉部位で捕捉されたＣＲＰと金コロイド標識抗体との被合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比較して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（極めて弱い着色）、＋（微弱な着色）、＋＋（明確な着色）、＋＋＋（強い着色）、＋＋＋＋（非常に強い着色）の６段階に区分して判定した。その結果を表５に示した。表５から、約１ｎｇ／ｍＬ以上の濃度のＣＲＰを検出可能であることがわかる。
実施例１１ 検体との反応性および対照試薬との比較
上記実施例１０にて作製したテストストリップと同様の方法にて抗ＣＲＰヤギポリクローナル抗体を用いて作製したテストストリップの感度比較を行った。ＣＲＰ抗原を検体希釈液を用いて各種濃度に調製し、被験試料とした。被験試料１００μＬを上記テストストリップの試料添加用部材にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で１５分放置後、捕捉部位で捕捉されたＣＲＰと金コロイド標識抗体との被合体の捕捉量を肉眼およびイムノクロマトリーダー（大塚電子製）にて測定した。捕捉量は、その量に比較して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、＋（微弱な着色）、＋＋（明確な着色）、＋＋＋（強い着色）の４段階に区分して判定した。その結果を表６及び図６に示した。
上記実施例１０にて作製したテストストリップと同様の方法にて抗ＣＲＰヤギポリクローナル抗体を用いて作製したテストストリップの感度比較を行った。ＣＲＰ抗原を検体希釈液を用いて各種濃度に調製し、被験試料とした。被験試料１００μＬを上記テストストリップの試料添加用部材にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で１５分放置後、捕捉部位で捕捉されたＣＲＰと金コロイド標識抗体との被合体の捕捉量を肉眼およびイムノクロマトリーダー（大塚電子製）にて測定した。捕捉量は、その量に比較して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、＋（微弱な着色）、＋＋（明確な着色）、＋＋＋（強い着色）の４段階に区分して判定した。その結果を表６及び図６に示した。
表６及び図６から、本発明によれば、対照に見られたプロゾーン現象は確認されず、低濃度から高濃度まで幅広い測定範囲を有することが明らかとなった。また対照と同様にｓｃＦｖ抗体を用いた場合でもイムノクロマト法に適用できることが示された。
実施例１３ ヒト血清中のＣＲＰの検出
上記実施例１０にて作製したイムノクロマト法テストストリップを用いて、ヒト血清中のＣＲＰ測定値を測定した。各血清は検体希釈液にて１０００倍希釈し被験試料とした。そして、被験試料１００μＬを上記テストストリップの試料添加用部材にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で１５分放置後、捕捉部位で捕捉されたＣＲＰ蛋白と金コロイド標識抗体との被合体の捕捉量を肉眼およびイムノクロマトリーダー（大塚電子製）にて測定した。それぞれの血清検体はＴＩＡ法（日立製作所製測定機器Ｈｉｔａｃｈｉ ７０７０）にて値を求めた。イムノクロマト法およびＴＩＡ法にてそれぞれ求められたＣＲＰ値について比較検討した。その結果を表７及び図７に示した。
上記実施例１０にて作製したイムノクロマト法テストストリップを用いて、ヒト血清中のＣＲＰ測定値を測定した。各血清は検体希釈液にて１０００倍希釈し被験試料とした。そして、被験試料１００μＬを上記テストストリップの試料添加用部材にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で１５分放置後、捕捉部位で捕捉されたＣＲＰ蛋白と金コロイド標識抗体との被合体の捕捉量を肉眼およびイムノクロマトリーダー（大塚電子製）にて測定した。それぞれの血清検体はＴＩＡ法（日立製作所製測定機器Ｈｉｔａｃｈｉ ７０７０）にて値を求めた。イムノクロマト法およびＴＩＡ法にてそれぞれ求められたＣＲＰ値について比較検討した。その結果を表７及び図７に示した。
表７及び図７から、本発明によればＴＩＡ法との相関は相関係数０．９７より有意に相関していることが示された。現行幅広く使用されているＴＩＡ法と同等の性能を有していることが示された。
実施例１４ 非特異反応性の確認
上記実施例１０にて作製したイムノクロマト法テストストリップを用いて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＫＰＢ３９、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＢＣＢ１０３８及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＪＣＭ２１７９に対する反応性について確認した。各種菌体をＰＢＳにマクファーランド１０相当（３×１０９／ｍＬ相当）に懸濁させた検体を検体希釈液にて適宜希釈し被検試料とした。そして、被験試料１００μＬを上記テストストリップの試料添加用部材にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で１５分放置後、捕捉部位で捕捉された金コロイド標識抗体の捕捉量を肉眼およびイムノクロマトリーダー（大塚電子製）にて測定した。捕捉量は、その量に比較して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）の３段階に区分して判定した。Ｗは反応が弱いことを示す。その結果を表８に示した。
上記実施例１０にて作製したイムノクロマト法テストストリップを用いて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＫＰＢ３９、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＢＣＢ１０３８及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＪＣＭ２１７９に対する反応性について確認した。各種菌体をＰＢＳにマクファーランド１０相当（３×１０９／ｍＬ相当）に懸濁させた検体を検体希釈液にて適宜希釈し被検試料とした。そして、被験試料１００μＬを上記テストストリップの試料添加用部材にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で１５分放置後、捕捉部位で捕捉された金コロイド標識抗体の捕捉量を肉眼およびイムノクロマトリーダー（大塚電子製）にて測定した。捕捉量は、その量に比較して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）の３段階に区分して判定した。Ｗは反応が弱いことを示す。その結果を表８に示した。
表８から、対照のポリクローナル抗体を用いた場合、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ 及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓが産生するＰｒｏｔｅｉｎ Ａによる非特異反応が確認された。本発明によれば抗体のＦｃ部分に結合するＰｒｏｔｅｉｎ Ａとの反応性が無い事が示され、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａによる非特異反応を抑制できることが示された。
本発明は、抗原に対する抗体の重鎖可変部と軽鎖可変部とを備えた組換え蛋白を用いたサンドイッチ式免疫測定法、特に、イムノクロマトグラフィー測定法およびイムノクロマト法テストストリップを提供するものであり、病原性ウイルスなどの抗原を簡単な方法で高感度で迅速に検出できるので、疾病の診断や病原体の検出に有用である。
１ 粘着シート
２ 含浸部材
３ 膜担体
３１ 捕捉部位
４ 吸収用部材
５ 試料添加用部材
２ 含浸部材
３ 膜担体
３１ 捕捉部位
４ 吸収用部材
５ 試料添加用部材
Claims (17)
- 測定対象である抗原に対する第一の結合物と第二の結合物とを用いたサンドイッチ式免疫測定法であって、第一の結合物と第二の結合物の少なくとも一つが、該抗原に対する抗体の重鎖可変部と軽鎖可変部とを備えた組換え蛋白からなることを特徴とするサンドイッチ式免疫測定法。
- 第一の結合物と第二の結合物の少なくとも一つが、配列番号１または配列番号２の重鎖可変部及び軽鎖可変部に対応するアミノ酸配列を備える組換え蛋白である請求項１に記載の免疫測定法。
- 第一の結合物と第二の結合物の両者が、配列番号１の重鎖可変部及び軽鎖可変部に対応するアミノ酸配列を備える組換え蛋白である請求項１に記載の免疫測定法。
- 前記第一の抗体および第二の抗体の何れか一方を担体に固定しておく請求項１乃至３の何れか１項に記載の免疫測定法。
- 測定対象である抗原に対する第一の結合物を予め所定位置に固定せしめて形成された捕捉部位を備える膜担体を用意し、前記抗原に対する第二の結合物と所定量の被験試料との混合液を、前記捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記被験試料中に含まれる抗原と前記第二の結合物との複合体を前記捕捉部位に捕捉させるイムノクロマトグラフィー測定法において、前記第一の結合物と前記第二の結合物の少なくとも一つが、該抗原に対する抗体の重鎖可変部と軽鎖可変部とを備えた組換え蛋白からなることを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法。
- 第一の結合物と第二の結合物の少なくとも一つが、配列番号１または配列番号２の重鎖可変部及び軽鎖可変部に対応するアミノ酸配列を備える組換え蛋白である請求項５に記載のイムノクロマトグラフィー測定法。
- 第一の結合物と第二の結合物の両者が、配列番号１の重鎖可変部及び軽鎖可変部に対応するアミノ酸配列を備える組換え蛋白である請求項６に記載のイムノクロマトグラフィー測定法。
- 前記第二の結合物は金属コロイドまたはラテックスで標識されている請求項５乃至７の何れか１項に記載のイムノクロマトグラフィー測定法。
- 前記膜担体がニトロセルロース膜である請求項５乃至８の何れか１項に記載のイムノクロマトグラフィー測定法。
- 測定対象である抗原に対する第一の結合物と第二の結合物と膜担体とを少なくとも備え、前記第一の結合物は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の結合物は適当な標識物質で標識され、かつ、前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なよう配置されてなるイムノクロマト法テストストリップにおいて、前記第一の結合物と前記第二の結合物の少なくとも一つが、該抗原に対する抗体の重鎖可変部と軽鎖可変部とを備えた組換え蛋白からなることを特徴とするイムノクロマト法テストストリップ。
- 第一の結合物と第二の結合物の少なくとも一つが、配列番号１または配列番号２の重鎖可変部及び軽鎖可変部に対応するアミノ酸配列を備える組換え蛋白である請求項１０に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
- 第一の結合物と第二の結合物の両者が、配列番号１の重鎖可変部及び軽鎖可変部に対応するアミノ酸配列を備える組換え蛋白である請求項１０に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
- 前記第二の結合物は金属コロイドまたはラテックスで標識されている請求項１０乃至１２の何れか１項に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
- 前記膜担体がニトロセルロース膜である請求項１０乃至１３の何れか１項に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
- 配列番号１または配列番号２の重鎖可変部及び軽鎖可変部に対応するアミノ酸配列を備える組換え蛋白。
- 抗体遺伝子群をＴベクターにライゲーションして増殖させる工程と、この増殖されたＴベクターを分離する工程と、この分離されたＴベクターから抗体遺伝子群を切り出してファージミドベクターにライゲーションして宿主に導入する工程とを備えることを特徴する抗体遺伝子ライブラリーの作製方法。
- 抗体遺伝子群をＴベクターにライゲーションして増幅させる工程と、この増殖されたＴベクターを制限酵素処理するとともに、予めコントロールインサートが挿入されたファージミドベクターを前記制限酵素と同様の制限酵素で処理して前記制限酵素処理されたＴベクターと混合した後ライゲーションする工程と、このライゲーションに付された混合物に前記コントロールインサート及びＴベクターを消化する制限酵素を作用させた後、抗体遺伝子群がライゲーションされたファージミドベクターを選択的に宿主に導入する工程とを備えることを特徴する抗体遺伝子ライブラリーの作製方法。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| JP2011209140A (ja) * | 2010-03-30 | 2011-10-20 | Sekisui Medical Co Ltd | ヒトｃ反応性タンパク質（ｃｒｐ）測定用イムノクロマト試薬 |
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2006
- 2006-09-01 JP JP2006237181A patent/JP2008058208A/ja active Pending
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