JP7190675B2 - ノロウイルスに結合する抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法 - Google Patents

ノロウイルスに結合する抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法 Download PDF

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Description

本開示は、ノロウイルスに結合する抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法に関する。
特許文献１は、二価構造物である抗体を開示している。特許文献１に開示された抗体の少なくとも一部は、ノロウイルスに結合する。特許文献１は、本明細書に参照として援用される。
特開２０１１－５２１６６２号公報
本開示の目的は、ノロウイルスに結合する新規な抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法を提供することである。
本開示は、ＮからＣの方向に、以下のノロウイルスに結合可能である構造ドメイン：
Ｎ － ＦＲ１ － ＣＤＲ１ － ＦＲ２ － ＣＤＲ２ － ＦＲ３ － ＣＤＲ３ － ＦＲ４ － Ｃ、ここで、
ＦＲは、フレームワーク領域のアミノ酸配列を示し、かつＣＤＲは、相補性決定領域のアミノ酸配列を示す、
を含み、さらに構造ドメインに連結された蛋白質分子を含む蛋白質結合抗体であって、前記ＣＤＲ１～３が：
（ｉ）前記ＣＤＲ１は配列番号：１～６により表されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記ＣＤＲ２は、配列番号：７～１２により表されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、および前記ＣＤＲ３は、配列番号：１３～１７により表されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）前記ＣＤＲ１は配列番号：１～６により表されるアミノ酸配列のいずれかの１～３個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、前記ＣＤＲ２は、配列番号：７～１２により表されるアミノ酸配列のいずれかの１～３個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、および前記ＣＤＲ３は、配列番号：１３～１７により表されるアミノ酸配列のいずれかの１～３個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を含む；または、
（ｉｉｉ）前記ＣＤＲ１は配列番号：１～６により表されるアミノ酸配列のいずれかを含む、前記ＣＤＲ２は、配列番号：７～１２により表されるアミノ酸配列のいずれかを含む、および前記ＣＤＲ３は、配列番号：１３～１７により表されるアミノ酸配列のいずれかを含む、
蛋白質結合抗体、に関する。
本開示は、ノロウイルスに結合する新規な抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法を提供する。
図１Ａは、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれる様々な遺伝子をライゲーションするために用いられたベクターのマップを示す。図１Ｂは、図１Ａに示されるベクターマップの詳細を示す。 図２は、ＶＨＨ抗体を発現するために用いられたベクターの合成手順を示す。 図３は、配列番号：３８により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を濃度１．６ｎＭ、８ｎＭ、４０ｎＭ、２００ｎＭおよび１０００ｎＭに調製し順次加えたときのノロ抗原への結合力の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）評価結果を示すグラフである。 図４は、配列番号：３９により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を濃度１．６ｎＭ、８ｎＭ、４０ｎＭ、２００ｎＭおよび１０００ｎＭに調製し順次加えたときのノロ抗原への結合力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図５は、配列番号：４０により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を濃度１．６ｎＭ、８ｎＭ、４０ｎＭ、２００ｎＭおよび１０００ｎＭに調製し順次加えたときのノロ抗原への結合力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図６Ａ～Ｇは、配列番号：４１により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度、Ａ：５００ｎＭ、Ｂ：２５０ｎＭ、Ｃ：１２５ｎＭ、Ｄ：６２．５ｎＭ、Ｅ：３１．２５ｎＭ、Ｆ：１５．６３ｎＭ、Ｇ：７．８１ｎＭ）のノロ抗原への結合力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図７Ａ～Ｈは、配列番号：４２により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度、Ａ：５００ｎＭ、Ｂ：２５０ｎＭ、Ｃ：１２５ｎＭ、Ｄ：６２．５ｎＭ、Ｅ：３１．２５ｎＭ、Ｆ：１５．６３ｎＭ、Ｇ：７．８１ｎＭ、Ｈ：３．９１ｎＭ）のノロ抗原への結合力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図８Ａ～Ｈは、配列番号：４３により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度、Ａ：５００ｎＭ、Ｂ：２５０ｎＭ、Ｃ：１２５ｎＭ、Ｄ：６２．５ｎＭ、Ｅ：３１．２５ｎＭ、Ｆ：１５．６３ｎＭ、Ｇ：７．８１ｎＭ、Ｈ：３．９１ｎＭ）のノロ抗原への結合力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図９は、配列番号：３８により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を固定し、ノロ抗原を濃度１．６ｎＭ、８ｎＭ、４０ｎＭ、２００ｎＭおよび１０００ｎＭに調製し順次加えたときのノロ抗原への結合力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図１０は、配列番号：３９により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を固定し、ノロ抗原を濃度１．６ｎＭ、８ｎＭ、４０ｎＭ、２００ｎＭおよび１０００ｎＭに調製し順次加えたときのノロ抗原への結合力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図１１は、配列番号：４０により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を固定し、ノロ抗原を濃度１．６ｎＭ、８ｎＭ、４０ｎＭ、２００ｎＭおよび１０００ｎＭに調製し順次加えたときのノロ抗原への結合力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図１２は、配列番号：４１により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を固定し、ノロ抗原を濃度１．６ｎＭ、８ｎＭ、４０ｎＭ、２００ｎＭおよび１０００ｎＭに調製し順次加えたときのノロ抗原への結合力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図１３は、配列番号：４２により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を固定し、ノロ抗原を濃度１．６ｎＭ、８ｎＭ、４０ｎＭ、２００ｎＭおよび１０００ｎＭに調製し順次加えたときのノロ抗原への結合力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図１４は、配列番号：４３により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を固定し、ノロ抗原を濃度１．６ｎＭ、８ｎＭ、４０ｎＭ、２００ｎＭおよび１０００ｎＭに調製し順次加えたときのノロ抗原への結合力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図１５は、蛋白質結合抗体遺伝子をライゲーションするために用いられたベクターの詳細なマップを示す。 図１６は、配列番号：３８により表されるアミノ酸配列を含む抗体（単量体抗体）および配列番号：４５により表されるアミノ酸配列を含む抗体（蛋白質結合抗体）（いずれも濃度５００ｎＭ）のノロ抗原への結合力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図１７は、配列番号：４５により表されるアミノ酸配列を含む抗体を濃度０．０４ｎＭ、０．２ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭおよび２５ｎＭに調製し順次加えたときのノロ抗原への結合力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図１８は、配列番号：３８、４４、４５、４６により表されるアミノ酸配列を含む抗体（それぞれ、配列番号６６、７２、１００、１０１）のノロウイルスへの結合力をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示すグラフである。
本明細書における「抗体」は、例えば抗体、一本鎖抗体、重鎖抗体、抗原結合部分、ＶＨＨ抗体を含む。本発明の抗体は、ペプチド、オリゴペプチドまたは蛋白質と結合されてもよく、または融合されていてもよい。
本明細書で用いる場合、「配列同一性」とは、二以上の配列（塩基配列又はアミノ酸配列）が、配列の一致度が最大となるように、ギャップおよび挿入を考慮してアラインメントされる場合の、二以上の配列における対応する位置での同一の塩基又はアミノ酸のパーセンテージを意味する。同一性を決定する方法は、アラインメントされる配列間に最大の一致度を与えるように設計される。二つの配列間の同一性を決定する方法は、限定するものではないが、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ等が挙げられる。また、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ジェネティクス製）を用いて決定することもできる。あるいは、短鎖ペプチドであれば、単純に配列を比較して決定することもできる。当業者であれば、上述のような方法で、配列間の同一性を決定することができる。
本開示において、抗体の抗原への結合力は当業者に公知の方法により評価できる。より具体的には、下記のノロ抗原および表面プラズモン共鳴評価装置を用いた方法（ＳＰＲ法）により、解離定数Ｋｄを求めることにより評価できる。また、例えば抗原を固定したＥＬＩＳＡ法を用いた方法によっても評価できる。
本開示は、ノロウイルスに結合する抗体に関する。ある実施形態において、本開示による抗体は、ＧＩＩ／４型ノロウイルスに結合する。より具体的な実施形態において、本開示による抗体は、配列番号：４８に含まれるエピトープを認識する。本開示によるノロウイルスに結合する抗体は、ＮからＣの方向に、以下の構造ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
Ｎ － ＦＲ１ － ＣＤＲ１ － ＦＲ２ － ＣＤＲ２ － ＦＲ３ － ＣＤＲ３ － ＦＲ４ － Ｃ
ここで、ＦＲは、フレームワーク領域のアミノ酸配列を示し、かつＣＤＲは、相補性決定領域のアミノ酸配列を示す。
ある態様において、本開示における構造ドメインのＣＤＲ１は、配列番号：１～６により表されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはからなる。またある態様において、本開示における構造ドメインのＣＤＲ２は、配列番号：７～１２により表されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはからなる。またある態様において、本開示における構造ドメインのＣＤＲ３は、配列番号：１３～１７により表されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはからなる。
本開示における、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の組み合わせの具体例として、
ＣＤＲ１＝配列番号：１、ＣＤＲ２＝配列番号：７、ＣＤＲ３＝配列番号：１３、
ＣＤＲ１＝配列番号：２、ＣＤＲ２＝配列番号：８、ＣＤＲ３＝配列番号：１４、
ＣＤＲ１＝配列番号：３、ＣＤＲ２＝配列番号：９、ＣＤＲ３＝配列番号：１３、
ＣＤＲ１＝配列番号：４、ＣＤＲ２＝配列番号：１０、ＣＤＲ３＝配列番号：１５、
ＣＤＲ１＝配列番号：５、ＣＤＲ２＝配列番号：１１、ＣＤＲ３＝配列番号：１６、
ＣＤＲ１＝配列番号：６、ＣＤＲ２＝配列番号：１２、ＣＤＲ３＝配列番号：１７、等が挙げられる。
ある実施形態において、本開示の構造ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３には、上記のいずれかで表されるアミノ酸配列のそれぞれと、例えば少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ配列も含まれる。
またある実施形態において、本開示の構造ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３には、上記のアミノ酸配列のそれぞれについて、１個または数個、例えば、２または３個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３も含まれる。
ある実施形態において、ＦＲ１は、配列番号：１８～２３により表されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはからなる。ある実施形態において、ＦＲ２は、配列番号：２４～２８により表されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはからなる。ある実施形態において、ＦＲ３は、配列番号：２９～３４により表されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはからなる。ある実施形態において、ＦＲ４は、配列番号：３５～３７により表されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはからなる。
本開示における、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の組み合わせの具体例として、
ＦＲ１＝配列番号：１８、ＦＲ２＝配列番号：２４、ＦＲ３＝配列番号：２９、ＦＲ４＝配列番号：３５、
ＦＲ１＝配列番号：１９、ＦＲ２＝配列番号：２５、ＦＲ３＝配列番号：３０、ＦＲ４＝配列番号：３６、
ＦＲ１＝配列番号：２０、ＦＲ２＝配列番号：２４、ＦＲ３＝配列番号：３１、ＦＲ４＝配列番号：３５、
ＦＲ１＝配列番号：２１、ＦＲ２＝配列番号：２６、ＦＲ３＝配列番号：３２、ＦＲ４＝配列番号：３７、
ＦＲ１＝配列番号：２２、ＦＲ２＝配列番号：２７、ＦＲ３＝配列番号：３３、ＦＲ４＝配列番号：３７、
ＦＲ１＝配列番号：２３、ＦＲ２＝配列番号：２８、ＦＲ３＝配列番号：３４、ＦＲ４＝配列番号：３７、
等が挙げられる。
ある実施形態において、本開示の構造ドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４には、上記のいずれかで表されるアミノ酸配列のそれぞれと、例えば少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＦＲ配列も含まれる。
またある実施形態において、本開示の構造ドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４には、上記のいずれかで表されるアミノ酸配列のそれぞれについて、１個または数個、例えば、２または３個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４も含まれる。
より具体的な実施形態において、本開示における抗体は、配列番号：３８～４３のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、またはからなる構造ドメインを含む。
ある実施形態において、本開示における抗体は、配列番号：３８～４３で表されるアミノ酸配列のそれぞれと、例えば少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる構造ドメインを含む。
またある実施形態において、本開示における抗体は、配列番号：３８～４３で表されるアミノ酸配列のそれぞれについて、１個または数個、例えば、２または３個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、またはからなる構造ドメインを含む。
上記の構造ドメインを含む抗体の例として、例えば、配列番号：６６～７１で表されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはからなる抗体が挙げられる。
ある態様において、本開示は、上記の構造ドメインに蛋白質分子が連結された蛋白質結合抗体を提供する。ある実施形態において、本態様における蛋白質分子は、例えば１００～３００アミノ酸長、１００～１５０アミノ酸長、または１１５～１３５アミノ酸長を有する。他の実施形態において、本態様における蛋白質分子は抗体、例えば、抗体、一本鎖抗体、重鎖抗体、抗原結合部分、またはＶＨＨ抗体である。ある実施形態において、本態様における蛋白質分子はノロウイルスに結合しない。
本態様において、構造ドメインと蛋白質分子は、直接連結されていてもよいし、リンカーを経て連結されていてもよい。ある実施形態において、リンカーは、５～６０アミノ酸長を有する。好ましいリンカーの長さの例として、例えば５～３０アミノ酸長、５～２０アミノ酸長、５～１０アミノ酸長、１０～３０アミノ酸長、１０～２０アミノ酸長などが挙げられる。またある実施形態において、リンカーはGGGGS（配列番号：９１）またはSGGGGS（配列番号：９２）で示される配列を含む。より具体的なリンカーの例として、GGGGSGGGASGGGGS（配列番号：９３）、およびSGGGGSAGGGSGGGG（配列番号：９４）が挙げられる。
本態様における蛋白質結合抗体は、それを構成する構造ドメインを１つのみ含む単量体抗体と比較して、より強いノロウイルスへの結合力を有する。より具体的な例として、ＳＰＲ評価による結合力が、単量体抗体が１～１００ｎＭ程度であるところ、その１／５～１／１００、１／５～１／１０００、１／１０～１／１０００、またはそれ以下のＫｄを示す。
ある実施形態において、本態様の蛋白質結合抗体は、配列番号：４５～４７のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、本態様の蛋白質結合抗体は、配列番号：４５～４７で表されるアミノ酸配列のいずれかと、例えば少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
またある実施形態において、本態様の蛋白質結合抗体は、配列番号：４５～４７で表されるアミノ酸配列のいずれかについて、１個または数個、例えば、２または３個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を含む。
本態様の蛋白質結合抗体の具体例として、配列番号：１００～１０２で表されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはからなる蛋白質結合抗体が挙げられる。
本開示の抗体の作製方法は特に限定されず、アミノ酸から合成してもよいし、本開示の抗体をコードするＤＮＡを当業者に知られた方法により宿主細胞に組み込んで産生させてもよい。また、本開示の蛋白質結合抗体を作製する方法も特に限定されず、リンカーにより連結させても、また直接結合させてもよい。リンカーにより連結させる場合、例えばプライマーを用いてＰＣＲにより、リンカーで連結された構造ドメインをコードする配列を作製してもよい。
本開示の抗体は、ノロウイルスを検出するための検出装置または検出方法において用いられ得る。この場合、本開示の抗体は、他の物質と結合した複合体、例えば、担体及び標識物質の少なくとも一方に結合した複合体の状態で用いられてもよい。
担体は、抗原抗体反応の反応系における溶媒に不溶な担体であれば、その形状及び材質は特に制限されない。担体の形状としては、例えば、プレート、ビーズ、ディスク、チューブ、フィルター、薄膜などが挙げられる。担体の材質としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、金、銀、アルミニウム等の金属、ガラスなどが挙げられる。抗体を担体へ結合させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの公知の方法が使用される。
標識物質としては、例えば、蛍光物質、発光物質、色素、酵素、放射性物質などが使用される。抗体を標識物質へ結合させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの公知の方法が使用される。
本開示の抗体を用いた検出方法では、当該抗体を含む複合体と被分析物とが接触させられ、被分析物中のノロウイルスと、複合体中の抗体との抗原抗体反応に基づく物理量の変化が検出される。当該物理量としては、例えば、発光強度、色度、光透過度、濁度、吸光度、放射線量などが挙げられる。検出方法の具体例としては、酵素免疫測定法、イムノクロマト法、ラテックス凝集法、放射免疫測定法、蛍光免疫測定法、表面プラズモン共鳴測定法などの公知の方法が挙げられる。
本開示の抗体を用いた検出装置は、抗原抗体反応に基づき変化する上記物理量のいずれかを検出するための検出部を含む。検出部は、各種光度計、分光器、線量計など公知の装置で構成される。
本開示の抗体は、他の物質と結合した複合体の他、本開示の抗体を含む組成物、または本開示の抗体を含むキットとしても用いられ得る。
実施例１：単量体抗体の作製
ノロウイルスＧ１１／４型の表面に存在するタンパク質に結合するペプチドとして、ＶＨＨ抗体（すなわち、重鎖抗体の重鎖の可変領域）が、以下の手順に従って調製された。
（アルパカへの免疫および単核球の取得）
ＶＨＨ抗体遺伝子ライブラリを作製するため、ノロウイルスＧＩＩ／４型（ＮＳＷ－２０１２）由来の抗原が作製された。すなわち、この型のカプシドタンパク質のＰドメインタンパク質をリコンビナントし、ノロウイルスの抗原（配列番号：４８）としてアルパカに免疫された（以下、ノロ抗原）。ノロ抗原はアジュバントを用いてアルパカに投与される前に調製された。
実施例１において用いられたノロ抗原（配列番号：４８）の配列は以下の通りである。なお、本明細書における塩基またはアミノ酸の略号は、特許庁発行の、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」に従った。
MKMASNDANPSDGSTANLVPEVNNEVMALEPVVGAAIAAPVAGQQNVIDPWIRNNFVQAPGGEFTVSPRNAPGEILWSAPLGPDLNPYLSHLARMYNGYAGGFEVQVILAGNAFTAGKIIFAAVPPNFPTEGLSPSQVTMFPHIIVDVRQLEPVLIPLPDVRNNFYHYNQSNDPTIKLIAMLYTPLRANNAGDDVFTVSCRVLTRPSPDFDFIFLVPPTVESRTKPFSVPVLTVEEMTNSRFPIPLEKLFTGPSSAFVVQPQNGRCTTDGVLLGTTQLSPVNICTFRGDVTHITGSRNYTMNLASQNWNSYDPTEEIPAPLGTPDFVGKIQGVLTQTTRTDGSTRGHKATVYTGSADFSPKLGRVQFATDTDNDFETNQNTKFTPVGVIQDGGTTHRNEPQQWVLPSYSGRNTHNVHLAPAVAPTFPGEQLLFFRSTMPGCSGYPNMDLDCLLPQEWVQYFYQEAAPAQSDVALLRFVNPDTGRVLFECKLHKSGYVTVAHTGQHDLVIPPNGYFRFDSWVNQFYTLAPMGNGTGRRRAL（配列番号：４８）
具体的には、１００マイクログラム／ミリリットルの濃度を有するノロ抗原が、アルパカへ投与された。１週間後、再度、同じ濃度を有するノロ抗原が、アルパカへ投与された。このようにして、５週間かけて５回、アルパカはリコンビナントタンパク質を用いて免疫された。さらに１週間後、アルパカの血液を採取した。次いで、以下のように血液から単核球が取得された。
リンパ球分離チューブ（株式会社グライナージャパンより購入、商品名：Leucosep）に、血球分離溶液（コスモ・バイオ株式会社より購入、商品名：Lymphoprep）が添加された。次いで、溶液は、２０℃で１０００×ｇで１分間遠心された。
アルパカから採取された血液は、ヘパリンによって処理された。次に、このように処理された血液に等量のリン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」という）が添加され、サンプル液を得た。次いで、サンプル液は血球分離溶液が添加されたリンパ球分離チューブに添加された。
リンパ球分離チューブは、２０℃で８００×ｇで３０分遠心された。
単核球を含有する画分が回収され、３倍の容量を有するＰＢＳが添加された。画分は、２０℃で３００×ｇで５分間遠心された。沈殿物が、ＰＢＳを用いて穏やかに懸濁された。懸濁後、細胞数の測定のために１０マイクロリットルの懸濁液が分離された。残りの懸濁液が、２０℃で３００×ｇで５分間遠心された。
沈殿物に２ミリリットルの容積を有するＲＮＡ保存溶液（商品名：RNAlater）が添加された。次いで、溶液は穏やかに懸濁された。懸濁液が、２本の１．５ｍＬチューブに注入された。各チューブは、１ミリリットルの懸濁液を含んでいた。チューブは、－２０℃の温度下で保存された。細胞数の測定のために分離された懸濁液（５マイクロリットル）が、チュルク液（１５マイクロリットル）と混合され、血球計算盤を用いて単核球の数が数えられた。
（ＶＨＨ抗体のｃＤＮＡ遺伝子ライブラリの作製）
次に、単核球からトータルＲＮＡを抽出し、そしてＶＨＨ抗体のｃＤＮＡ遺伝子ライブラリが以下の手順で作製された。以下の手順では、RNase free gradeの試薬および器具が使用された。
単核球分画に、トータルＲＮＡ抽出試薬（商品名：TRIzol Reagent、１ミリリットル）を加えた。試薬は緩やかに混和され、そして室温にて５分間放置された。クロロホルム（２００マイクロリットル）が試薬に加えられ、そして１５秒間、試薬は力強く振られた。試薬は、室温で２～３分間静置された。試薬は、４℃で１５分間、１２，０００×ｇ以下で遠心された。
上清が新しいチューブに移された。ＲＮａｓｅフリー水およびクロロホルム（各２００マイクロリットル）がチューブに加えられた。さらに５００ミリリットルのイソプロパノールがチューブに加えられた。チューブに含まれる液体はボルテックスミキサーを用いて撹拌された。液体は室温で１０分間静置された。次いで、液体は４℃で１５分間、１２，０００×ｇ以下で遠心された。上清が捨てられ、沈殿物が１ミリリットルの７５％エタノールでリンスされた。この溶液は、４℃で５分間、７，５００×ｇ以下で遠心された。溶液は乾燥され、トータルＲＮＡを得た。得られたトータルＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリー水に溶解された。
トータルＲＮＡからｃＤＮＡを取得するため、逆転写酵素を含むキット（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit）が用いられた。キットに含まれるRandom 6 merおよびOligo dT primerがプライマーとして用いられた。キットの標準プロトコルに従って、ｃＤＮＡが取得された。
アルパカに含まれるＶＨＨ抗体の遺伝子が、ｃＤＮＡからＰＣＲ法によって獲得された。ＰＣＲのための酵素はタカラバイオ株式会社よりEx-taqの商品名として入手された。
以下の試薬が混合され、混合液を得た。
10x buffer 5マイクロリットル
dNTPs 4マイクロリットル
Primer F 2マイクロリットル
Primer R 2マイクロリットル
cDNA template1マイクロリットル
Ex-taq 0.25マイクロリットル
混合液は以下のＰＣＲ法に供された。
まず、混合液は、９５℃で２分間加熱された。
次いで、混合液の温度は、以下のサイクルに従って変化された。

９６℃で３０秒間
５２℃で３０秒間、そして
６８℃で４０秒間。

このサイクルが３０回繰り返された。
最後に、混合液は、６８℃で４分間加熱した後、４℃で保存された。
このＰＣＲ法においては、以下のプライマーが使用された。
primer 1: 5’- GGTGGTCCTGGCTGC -3’ （配列番号：49）
primer 2: 5’- ctgctcctcgcGGCCCAGCCGGCCatggcTSAGKTGCAGCTCGTGGAGTC -3’ （配列番号：50）
primer 3: 5’- TGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG -3’ （配列番号：51）
primer 4: 5’- TTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG -3’ （配列番号：52）
primer 5: 5’- tttgCtctGCGGCCGCagaGGCCgTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG -3’ （配列番号：53）
primer 6: 5’- tttgCtctGCGGCCGCagaGGCCgaTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG -3’ （配列番号：54）
(参考文献：Biomed Environ Sci, 2012; 27(2):118-121)
３回のＰＣＲ法が実施された。
１回目のＰＣＲ法では、cDNA、Primer 1 およびPrimer 3からなるプライマーセットＡ、およびcDNA、Primer 1 およびPrimer 4からなるプライマーセットＢが用いられた。
２回目のＰＣＲ法では、プライマーセットＡを用いて増幅された遺伝子、Primer 2 およびPrimer 3からなるプライマーセットＣ、およびプライマーセットＢを用いて増幅された遺伝子、Primer 2 およびPrimer 4からなるプライマーセットＤが用いられた。
３回目のＰＣＲ法では、プライマーセットＣを用いて増幅された遺伝子、Primer 2 およびPrimer 5からなるプライマーセットＥ、およびプライマーセットＤを用いて増幅された遺伝子、Primer 2 およびPrimer 6からなるプライマーセットＦが用いられた。このようにして、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリが形成された。言い換えれば、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリは、プライマーセットＥおよびプライマーセットＦを用いて増幅された遺伝子を含んでいた。
（ファージライブラリの作製）
次に、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリから、以下の手順に従ってファージライブラリが作製された。
市販されているプラスミドｐＵＣ１１９（例えば、タカラバイオ株式会社より入手可能）由来のプラスミドベクター１（４０５７塩基対、図１Ａ参照）が、制限酵素ＳｆｉＩにより処理された。図１Ａにおける制限酵素サイトＳｆｉＩ（ａ）は、GGCCCAGCCGGCC（配列番号：５５）により表される遺伝子配列からなる。制限酵素サイトＳｆｉＩ（ｂ）は、GGCCTCTGCGGCC（配列番号：５６）により表される遺伝子配列からなる。図１Ｂは、プラスミドベクター１の詳細なベクターマップを示す。
プラスミドベクター１は、以下の配列からなる。
gacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccAAGCTTCGAAGGAGACAGTCATAatgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgcGGCCCAGCCGGCCatggagcTCAAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCAGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCGATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTATTACACATCAAGTTTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCGGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTTGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTgtaGGCCtctGCGGCCGCagaGcaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggccgcaTAGggttccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttagcgctggtaaaccatatgaattttctattgattgtgacaaaataaacttattccgtggtgtctttgcgtttcttttatatgttgccacctttatgtatgtattttctacgtttgctaacatactgcgtaataaggagtctTAATAAgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgCATATGaAAATTGTAAgcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacaGGGCGCGTcccatATGgtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcga（配列番号：５７）
同様に、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリも制限酵素ＳｆｉＩにより処理された。このようにして、ＶＨＨ抗体遺伝子断片が得られた。
このように処理されたプラスミドベクター１が、ＶＨＨ抗体遺伝子断片と、１：２の割合で混合された。混合液に、酵素（東洋紡株式会社より入手、商品名：Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２）が注入された。混合液は１６℃の温度下で２時間静置された。このようにして、ＶＨＨ抗体遺伝子断片がプラスミドベクター１にライゲーションされた。
このようにしてライゲーションされたプラスミドベクター１を用いて、大腸菌（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：ＨＳＴ０２）がトランスフェクトされた。
次いで、大腸菌は、１００マイクログラム／ミリリットルの濃度を有するアンピシリンを含有する２ＹＴプレート培地上で１５時間、培養された。このようにして、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれる遺伝子断片から得られるタンパク質を提示するファージのライブラリが得られた。
培養後、２ＹＴプレート培地上に形成されたシングルコロニーの数をカウントすることでライブラリの濃度を算出した。その結果、ライブラリは、５ｘ１０７／ミリリットルの濃度を有していた。
（バイオパニング）
核内タンパク質に特異的に結合するＶＨＨ抗体が、ファージライブラリから以下の手順に従って得られた。
ＶＨＨ抗体を発現したファージの中から、抗原に結合するクローンを抽出するため、２回のバイオパンニングを実施した。
ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれるＶＨＨ抗体遺伝子断片が導入された大腸菌（ＨＳＴ０２）を、吸光度を示す値（ＯＤ６００）が１．０になるまで３０℃にて１００ｍＬの 2YT AG（１００ｕｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１％グルコースを含有した２ＹＴ培地）の培地中で培養し、大腸菌を増殖させた。
ヘルパーファージ（Ｍ１３ＫＯ７）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）が、感染多重度（ＭＯＩ）がおよそ２０となるよう大腸菌含有培地へ加えられた。
その後、培地が３０分ほど３７℃で保温された。次いで、培地を４０００ｒｐｍの回転数で１０分間遠心し、大腸菌を回収した。１００ｍＬの2YTAK培地（１００ｕｇ／ｍＬのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有した２ＹＴ培地）中で、３０℃で、２１３ｒｐｍにて遠心しながら、大腸菌を一晩培養した。
上記のように培養された大腸菌を含有する培養液（１００ミリリットル）が、２本の遠沈管（容積：５０ミリリットル）に注入された。２つの培養液は、４０００ｒｐｍの回転数で１０分間遠心された。次いで、上清（各２０ミリリットル）が回収された。
上清（４０ミリリットル）が、ＮａＣｌ（２．５Ｍ）を含有する２０％ＰＥＧ溶液（１０ミリリットル）に添加された。次いで、混合液は、転倒混和された。その後、混合液は、およそ１時間氷上にて冷却された。混合液は、４０００ｒｐｍの回転数で１０分間遠心された。次いで、上清が除去された。１０％グリセロールを含有するＰＢＳが沈殿物に向けて注入された。最後に、沈殿物は、ほぐしながら溶解された。このようにして、ＶＨＨ抗体を提示するファージのライブラリが得られた。
（ノロ抗原に特異的に結合するＶＨＨ抗体のスクリーニング）
（Ａ）ノロ抗原の固定化
ノロ抗原をＰＢＳと混合し、ノロ抗原溶液を調製した。ノロ抗原の濃度は２μｇ／ｍＬであった。ノロ抗原溶液（２ｍＬ）が、イムノチューブ（ヌンク社より購入）に注入された。ＮＰ溶液はイムノチューブ内で一晩静置された。このようにして、イムノチューブの内部にＮＰが固定された。
次いで、イムノチューブの内部がＰＢＳを用いて３回、洗浄された。
３％スキムミルク（和光純薬株式会社より入手）を含有するＰＢＳをイムノチューブに満たした。このようにして、ノロ抗原が抗原としてイムノチューブの内部にブロッキングされた。
イムノチューブは、室温にて１時間、静置された。その後、イムノチューブの内部がＰＢＳを用いて３回、洗浄された。
（Ｂ）パニング
ＶＨＨ抗体を提示するファージのライブラリ（濃度：およそ５Ｅ＋１１／ｍＬ）が、３％のスキムミルクを含有した３ｍＬのＰＢＳと混合され、混合液を調製した。混合液は、ノロ抗原が固定化されたイムノチューブに注入された。
イムノチューブには、パラフィルムからなる蓋が取り付けられた。次いで、イムノチューブは、ローテーターを用いて、１０分間、転倒しながら回転された。
イムノチューブは、室温にて１時間、静置された。
イムノチューブの内部は、０．０５％のｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（以下、「ＰＢＳＴ」という）で１０回、洗浄された。
イムノチューブの内部は、ＰＢＳＴにより満たされた。その後、イムノチューブは、１０分間、静置された。次いで、イムノチューブの内部は、ＰＢＳＴで１０回、洗浄された。
ノロ抗原に結合したＶＨＨ抗体を提示するファージを抽出するために、１００ｍＭトリメチルアミン溶液（１ｍＬ）がイムノチューブに注入された。
イムノチューブには、パラフィルムからなる蓋が取り付けられた。次いで、イムノチューブは、ローテーターを用いて、１０分間、転倒しながら回転された。
溶液を中和するため、溶液は、１ｍＬの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ：６．８）を含有するチューブに移した。再度、１００ｍＭトリメチルアミン溶液（１ｍＬ）を用いたファージの抽出を繰り返した。このようにして、３ｍＬの抽出液が得られた。
抽出液（１ｍＬ）が、９ｍＬの大腸菌ＨＳＴ０２と混合された。混合液は、３０℃の温度で１時間、静置された。
コロニーを計数するため、大腸菌ＨＳＴ０２を含有する１０マイクロリットルの混合液は、２ＴＹＡ培地を含む小プレート（１０ミリリットル／プレート）にまかれた。
残りの混合液は遠心分離された。上澄み液は捨てられ、かつ沈殿物は２ＴＹＡ培地を含む大プレート（４０ミリリットル／プレート）にまかれた。これらの２つのプレートは、３０℃の温度下にて一晩静置された。このようにして、１回目のパニングが行われた。
１回目のパニングの手順と全く同様に、２回目のパニングが行われた。言い換えれば、パニングが繰り返された。このようにして、ＶＨＨ抗体を提示するモノクローナルファージが精製された。
２回目のパニングの後、大腸菌のコロニーが爪楊枝でピックアップされた。ピックアップされた１つのコロニーは、９６平底プレートの１つのウェルに置かれた。これが繰り返された。１つのウェルは、２００マイクロリットルの２ＹＴＡＧ培地を含有していた。
ウェル内の溶液を、３０℃で２１３ｒｐｍの回転数で撹拌した。
増殖した大腸菌を含む溶液（５０μＬ）を回収した。回収された溶液は、プレートに含まれる５０μＬの２ＹＴＡ培地と混合した。２ＹＴＡ培地は、感染多重度ＭＯＩが２０になるようなヘルパーファージを含有していた。溶液を、３７℃の温度で４０分間静置された。
２ＹＴＡ培地を含むプレートは、１８００ｒｐｍにて２０分間遠心分離された。上清が捨てられた。沈殿物が大腸菌を含んでいた。沈殿物は、２００μＬの２ＹＴＡＫ培地と混合された。混合液は、３０℃にて一晩静置された。
混合液は、１８００ｒｐｍにて２０分間遠心分離された。大腸菌を含む上清が回収された。
（Ｃ） ＥＬＩＳＡによるファージ提示ＶＨＨ抗体および抗原の定性評価
９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より購入、商品名：ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウェルに、２μｇ／ｍＬの濃度を有する核内タンパク質溶液を抗原として添加した。各ウェルにおけるノロ抗原タンパク質溶液の容積は、５０μＬであった。９６ウェルプレートは、４℃で１晩、放置された。このようにして、ノロ抗原が各ウェルに固定された。
各ウェルは、ＰＢＳにより３回、洗浄された。次いで、３％スキムミルク（和光純薬株式会社より入手）を含有するＰＢＳが各ウェルに注入された（２００μＬ／ウェル）。９６ウェルプレートは、室温で１時間、放置された。このようにして、ノロ抗原が各ウェルでブロックされた。その後、各ウェルは、ＰＢＳで３回、洗浄された。
ＶＨＨ抗体を提示するモノクローナルファージが、各ウェルに注入された（５０μＬ／ウェル）。次いで、９６ウェルプレートは、１時間、静置された。このようにして、ファージはノロ抗原と反応した。
各ウェルは、ＰＢＳＴを用いて３回、洗浄された。次に、抗Ｍ１３抗体（ａｂｃａｍ社より入手、商品名：ａｂ５０３７０、１００００倍希釈）が各ウェルに添加された（５０μＬ／ウェル）。次いで、各ウェルはＰＢＳＴで３回、洗浄された。
発色剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より入手、商品名：1-STEP ULTRA TMB-ELISA）が各ウェルに注入された（５０μＬ／ウェル）。９６ウェルプレートは２分間静置され、発色剤を抗体と反応させた。
硫酸水溶液（１規定）が５０μＬ／ウェルの濃度で各ウェルに添加され、反応を停止させた。
４５０ｎｍの波長での溶液の吸光度が測定された。
良好な吸光度測定の結果を有する６ウェルが選択された。選択された６つのウェルに含有されるファージに含まれるＤＮＡ配列が、グライナー社により解析された。ＤＮＡ配列の解析結果は、以下のとおりである。以下の６つのＤＮＡ配列が見いだされた。
（配列番号：５８、５９、６０、６１、６２、６３）
配列番号：５８、５９、６０、６１、６２、６３により表されるＤＮＡ配列から合成される蛋白質は、それぞれ以下のアミノ酸配列からなる。
（配列番号：６６、６７、６８、６９、７０、７１）
（抗ノロウイルス ＶＨＨ抗体の発現）
ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）がＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社より購入された。Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社より入手）を用いて、ＰＣＲ法で３ｘＦｌａｇタグおよび２つの制限酵素サイトＳｆｉＩ（ａ）（ｂ）がベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）に付加された。図２を参照されたい。図２に示される手順が、以下、詳細に説明される。
まず、以下２つのプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いて、ＰＣＲ法により、制限酵素サイトＳｆｉＩ（ａ）が、ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）に付加された。
Primer 1: 5’- GCCGGCTGGGCcGCGAGGAGCAGCAGACCA -3’ （配列番号：７３）
Primer 2: 5’- GCCCAGCCGGCcATGGCCATGGATATCGGA -3’ （配列番号：７４）
次に、以下２つのプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いて、ＰＣＲ法により、５’末端側および３’末端側にそれぞれ制限酵素サイトＢａｍｈＩおよびＸｈｏＩを有する３ｘＦｌａｇタグＤＮＡ断片が作製された。
Primer 1: 5’- CATGGATATCGGAATTAATTCggatccGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCctcgagCACCACCACCACCACCACTGA -3’ （配列番号：７５）

Primer 2: 5’- TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGctcgagGATGTCATGATCTTTATAATCACCGTCATGGTCTTTGTAGTCggatccGAATTAATTCCGATATCCATG -3’ （配列番号：７６）
２つの制限酵素ＢａｍｈＩおよびＸｈｏＩ（タカラバイオ株式会社より入手）を用いて、この３ｘＦｌａｇタグＤＮＡ断片およびベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が処理された。
Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社より入手）を用いて、３ｘＦｌａｇタグＤＮＡ断片が、ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）にライゲーションされた。このようにして、３ｘＦｌａｇタグおよび制限酵素サイトＳｆｉＩ（ａ）が付加されたベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が得られた。
以下２つのプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いて、ＰＣＲ法により、５’末端側および３’末端側にそれぞれ制限酵素サイトＮｃｏＩおよびＢａｍｈＩを有するＤＮＡ断片が作製された。
Primer 1: 5’- AAATACCTGCTGCCGccatggATATCGGAATTAATTCggcctctgcggccGCAggatccGACTACAAAGACCAT-3’ （配列番号：７７）
Primer 2: 5’- ATGGTCTTTGTAGTCggatccTGCggccgcagaggccGAATTAATTCCGATATccatggCGGCAGCAGGTATTT-3’ （配列番号：７８）
次に、２つの制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍｈＩ（タカラバイオ株式会社より入手）を用いて、このＤＮＡ断片およびベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が処理された。
Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社より入手）を用いて、このＤＮＡ断片がベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）にライゲーションされた。このようにして、３ｘＦｌａｇタグおよび制限酵素サイトＳｆｉＩ（ａ）（ｂ）が付加されたベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が得られた。
ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）のシーケンスがグライナー社により解析された。シーケンスの解析のために、一般的なＴ７ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒセットが用いられた。
シーケンスの解析を通して目的通りに形成されたことが確認されたベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が選択された。
ＰＣＲ法により得られた液体に含まれるベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が、ＤＮＡ抽出キット（プロメガ社より入手）を用いて、５０μＬの蒸留水中で精製かつ回収された。このようにして回収されたベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が、ＳｆｉＩ制限酵素により処理された。
一方、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれるＶＨＨ抗体遺伝子断片がライゲーションされたプラスミドベクター１が、ＳｆｉＩ制限酵素で処理された。このようにして、それぞれ配列番号：３８、３９、４０、４１、４２および配列番号：４３により表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を含む以下の６つのＤＮＡ（配列番号：７９、８０、８１、８２、８３および配列番号：８４）が得られた。
これらの６つのＤＮＡは、ＳｆｉＩ制限酵素により処理された。次に、このようにして処理されたＤＮＡが、電気泳動法により回収された。回収されたＤＮＡ（配列番号：８５、８６、８７、８８、８９および配列番号：９０）は、ＳｆｉＩ制限酵素により処理されたプラスミドに、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ株式会社より入手）を用いてライゲーションされた。
ライゲーション溶液（２．５μＬ）および大腸菌ＤＨ５α（ニッポンジーンより入手、２５μＬ）が氷上にて混合された。混合液は、６分間、氷上にて静置された。次いで、混合液は、４２℃で４５秒間加熱された。最後に、混合液は、１分間、氷上で静置された。この手順は、一般的なヒートショック法として知られている。
全量の混合液が、１００μｇ／ｍＬの濃度でアンピシリンを含有するＬＢＡ培地上に散布された。ＬＢＡ培地は、３７℃で一晩静置された。
ＬＢＡ培地上に形成されたコロニーの中から、３つのコロニーが選択された。選択された３つのコロニーは、ＬＢＡ培地（３ｍＬ）で一晩培養された。
培養された大腸菌に含まれるプラスミドは、プラスミド抽出キット（株式会社キアゲンより入手、商品名：ＱＩＡｐｒｅｐｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ）を用いて、ＬＢＡ培地から抽出された。目的のＶＨＨ抗体の遺伝子がプラスミドに挿入されていることを確認するため、プラスミドの配列がグライナー社によって解析された。シーケンスの解析のために、一般的なＴ７ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒセットが用いられた。
シーケンスの解析を通して目的通りに形成されたことが確認されたプラスミドが選択された。
選択されたプラスミドを用いて、大腸菌（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ ＢＬ２１ （ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ， ライフ テクノロロジーズ社より入手）がヒートショック法によりトランフェクトされた。
トランスフェクトされた大腸菌を含有する溶液に、ＳＯＣ培地（５０マイクロリットル）が添加された。次いで、大腸菌は、２１３ｒｐｍで振とうされながら、３７℃で１時間、回復培養された。
次いで、大腸菌溶液が回収された。回収された大腸菌溶液（５ミリリットル）は、ＬＢＡ培地に散布された。ＬＢＡ培地は、３７℃で一晩、静置された。
ＬＢＡ培地内に形成されたコロニーの中から、１つのコロニーが選択された。選択されたコロニーは、爪楊枝でピックアップされた。ピックアップされたコロニーは、ＬＢＡ培地（３ｍＬ）中で、２１３ｒｐｍで振とうされながら３７℃で培養された。このようにして、培養液を得た。
さらに、培養液（２５ｍＬ）はＬＢＡ培地（５００ｍＬ）に混合された。６００ｎｍの波長での混合液の吸光度が０．５になるまで、混合液は３７℃で１６０ｒｐｍで振とうされた。
吸光度が０．５となったのち、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）溶液が混合液に添加された。ＩＰＴＧ溶液の最終濃度は１ｍＭであった。混合液に含有される大腸菌は、３７℃で６時間、培養された。培養された大腸菌を回収するため、混合液は、６０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心された。
回収された大腸菌は、１０倍の容量を有するＰＢＳに混合された。混合液は、ボルテックスミキサーを用いて撹拌された。このようにして、大腸菌が洗浄された。次いで、混合液は、６０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心され、大腸菌を回収した。回収された大腸菌は、再度、１０倍の容量を有するＰＢＳに混合された。混合液に含有される大腸菌は、超音波を用いて破砕された。
大腸菌を含む破砕液は、１００００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心された。上清が回収された。回収された上清は、０．４５マイクロメートルフィルタを用いて濾過された。
濾液は、Ｈｉｓ－ｔｒａｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）を用いて推奨プロトコルに従って精製された。精製時には、１ｍＬの濾液のために３μＬの全量を有する溶出バッファが用いられた。濾液に含有される緩衝液が、ＰＤ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）を用いて、ＰＢＳに置換された。置換時には、１ｍＬの濾液のために２．５μＬの全量を有するＰＢＳが用いられた。このようにして、ＶＨＨ抗体を含有する溶液が得られた。
このようにして得られた溶液に含有されるＶＨＨ抗体は、吸光度計（スクラム社より入手、商品名：ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて、２８０ｎｍでの波長での吸収測定値に基づいて定量された。その結果、ＶＨＨ抗体の濃度は４ｍｇ／ｍＬであった。
（Ｄ）ノロ抗原を用いたＶＨＨ抗体の表面プラズモン共鳴評価
ノロ抗原および表面プラズモン共鳴評価装置を用いて、ＶＨＨ抗体が以下のように評価された。表面プラズモン共鳴（以下、「ＳＰＲ」という）の詳細は以下の通りである。
ＳＰＲ評価装置：Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）
固定化バッファ：ＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）
ランニングバッファ：ＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）
センサチップ：ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）
固定化用試薬：Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）およびエチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）
ノロ抗原
ノロ抗原は、ＳＰＲ評価装置Ｔ２００のコントロールソフトウェアに含まれているウィザードに従って固定化された。ノロ抗原の固定化のためには、ノロ抗原はｐＨ４．５を有する酢酸溶液で希釈され、５０μｇ／ｍｌの濃度で用いられた。酢酸溶液は、１マイクログラム／ミリリットルの濃度を有していた。
被分析物として、配列番号：３８～４０により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体が用いられた。ランニングバッファに含有されるＶＨＨ抗体の濃度は、それぞれ、１．６ｎＭ、８ｎＭ、４０ｎＭ、２００ｎＭおよび１０００ｎＭに調整され、順次添加された。図３、４、５は、ＳＰＲ評価装置Ｔ２００から得られた評価結果を示すグラフである。解離定数Ｋｄが、評価ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）を用いて算出された。その結果、解離定数Ｋｄは、それぞれ１．１５ｎＭ、１５．８ｎＭ、９．５ｎＭであった。
被分析物として、配列番号：４１～４３により表されるアミノ酸配列を含む抗ノロ抗体が用いられた。１回目～８回目の分析において、ランニングバッファに含有される抗ノロ抗体の濃度は、それぞれ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、３１．２５ｎＭ、１５．６３ｎＭ、７．８１ｎＭおよび３．９１ｎＭに調整された。図６～８は、ＳＰＲ評価装置Ｔ２００から得られた評価結果を示すグラフである。解離定数Ｋｄが、評価ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）を用いて算出された。その結果、解離定数Ｋｄは、それぞれ８１．６ｎＭ、６８．３ｎＭ、５．４５ｎＭであった。
次に、ＶＨＨ抗体（配列番号：６６～７１）を固定し、ノロ抗原との結合について評価した。ＶＨＨ抗体は、ＳＰＲ評価装置Ｔ２００のコントロールソフトウェアに含まれているウィザードに従って固定化された。ノロ抗原の固定化のためには、ノロ抗原はｐＨ５．５を有する酢酸溶液で希釈され、５０μｇ／ｍｌの濃度で用いられた。酢酸溶液は、１マイクログラム／ミリリットルの濃度を有していた。被分析物として、ノロ抗原が用いられた。ランニングバッファに含有されるＶＨＨ抗体の濃度は、それぞれ、１０ｎＭ、３１．６ｎＭ、１００ｎＭ、３１６ｎＭおよび１０００ｎＭに調整され、順次添加された。図９、１０、１１、１２、１３および１４は、ＳＰＲ評価装置Ｔ２００から得られた評価結果を示すグラフである。解離定数Ｋｄが、評価ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）を用いて算出された。その結果、解離定数Ｋｄは、それぞれ４．１５ｎＭ、１５．９ｎＭ、９．５７ｎＭ、４．９８ｎＭ、１３．１ｎＭおよび１０．３ｎＭであった。
実施例２：蛋白質結合抗体の作製
配列番号：３８により表されるアミノ酸配列を有する構造ドメイン、および配列番号：４４により表されるアミノ酸配列を有する蛋白質分子を、リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＡＳＧＧＧＳ（配列番号：９３）で連結した蛋白質結合抗体を作製した。より具体的に、配列番号：６４、６５で表される塩基配列に、以下２つのプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ法により、５’末端側および３’末端側にそれぞれ制限酵素サイトＮｈｅＩを有するＤＮＡ断片が作製された。また、他方の末端には、上記単量体抗体の作製と同様に、プライマーを用いて、制限酵素Ｓｆｉ１認識部位が付加された。
Primer 1: 5’- aaaaGCTAGCGGTGGTGGTGGATCCsagktgcagctcgtggagtc-3’ （配列番号：９５）
Primer 2: 5’- caggtcacygtctcctcaGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGCTAGCaaaa-3’ （配列番号：９６）
ＮｈｅＩ消化およびライゲーションにより、構造ドメインおよび蛋白質分子をコードする配列がリンカーにより連結された配列が得られた。これをＳｆｉＩ消化し、図１５に示されるプラスミドベクターに組み込んだ。このプラスミドベクターで大腸菌をトランスフェクトし、配列番号：３８により表されるアミノ酸配列、および配列番号：４４により表されるアミノ酸配列を有する蛋白質結合抗体を作製した（配列番号：１００）。同様の手順で、配列番号：４４により表されるアミノ酸配列を有する蛋白質分子、および配列番号：３８により表されるアミノ酸配列を有する構造ドメインがリンカーにより連結された蛋白質結合抗体（配列番号：１０１）、ならびに配列番号：４４により表されるアミノ酸配列を有する蛋白質分子、および配列番号：３９により表されるアミノ酸配列を有する構造ドメインがリンカーにより連結された蛋白質結合抗体（配列番号：１０２）を作製した。
配列番号：１００で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質結合抗体は、単量体抗体である配列番号：６６により表されるアミノ酸配列を有するＶＨＨ抗体に比べて、ノロウイルスに対する高い結合力を示した（図１６）。
（ＶＬＰノロ抗原を用いたＶＨＨ抗体の表面プラズモン共鳴評価）
ノロ抗原および表面プラズモン共鳴評価装置を用いて、ＶＨＨ抗体が以下のように評価された。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の詳細は以下の通りである。
ＳＰＲ評価装置：Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）
固定化バッファ：ＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）
ランニングバッファ：ＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）
センサチップ：ＣＭ３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）
固定化用試薬：Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）およびエチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）
ノロ抗原
ＶＬＰノロ抗原はノロ抗原（配列番号：４８）を含むＶＰ１の２量体が９０個会合して構成されたノロウイルスＧＩＩ／４に由来するものである。
ＶＬＰノロ抗原は、ＳＰＲ評価装置Ｔ２００のコントロールソフトウェアに含まれているウィザードに従って固定化された。ノロ抗原の固定化のためには、ノロ抗原はｐＨ４．０を有する酢酸溶液で希釈され、２５μｇ／ｍｌの濃度で用いられた。酢酸溶液は、１マイクログラム／ミリリットルの濃度を有していた。
被分析物として、配列番号：１００により表されるアミノ酸配列を有する蛋白質結合抗体が用いられた。ランニングバッファに含有される蛋白質結合抗体の濃度は、それぞれ、０．１６ｎＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭおよび１００ｎＭに調整され、順次添加された。図１７は、ＳＰＲ評価装置Ｔ２００から得られた評価結果を示すグラフである。解離定数Ｋｄが、評価ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）を用いて算出された。また、配列番号：１０２により表される蛋白質結合抗体についても同様にＫｄを算出した。結果を、下表および図１７に示す。下表では、配列番号：１００、１０２により表されるアミノ酸配列を有する蛋白質結合抗体に含まれる構造ドメインを含む単量体抗体（それぞれ配列番号：６６、６７）のデータも合わせて記載した。
Figure 0007190675000001
上記のとおり、蛋白質結合抗体は、単量体抗体に比べてより低下した解離定数を示しており、ノロウイルスへの結合力が増強されていることが示された。
（ＥＬＩＳＡによる蛋白質結合抗体の結合力の評価）
固相としてＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌ ＧＩＩ４Ｆｒａｇ４、ブロッキング溶液としてＰＢＳＴ中の３％スキムミルクを用いるＥＬＩＳＡ法により、配列番号：６６、７２、１００、１０１により表されるアミノ酸配列を有する単量体抗体および蛋白質結合抗体の、ノロウイルスへの結合力を評価した。結果を図１８に示す。蛋白質結合抗体は、単量体抗体に比べてノロウイルスへの結合力が高いことが示された。
本発明は、ノロウイルスに結合する新規なペプチド、複合体、組成物、キットおよびそれらを用いた検出方法を提供する。

Claims (7)

  1. ＮからＣの方向に、以下のノロウイルスに結合可能である構造ドメイン：
    Ｎ － ＦＲ１ － ＣＤＲ１ － ＦＲ２ － ＣＤＲ２ － ＦＲ３ － ＣＤＲ３ － ＦＲ４ － Ｃ、ここで、
    ＦＲは、フレームワーク領域のアミノ酸配列を示し、かつＣＤＲは、相補性決定領域のアミノ酸配列を示す、
    を含み、さらに構造ドメインに連結された蛋白質分子を含む蛋白質結合抗体であって、
    配列番号：１００、１０２により表されるアミノ酸配列のいずれかを含む、
    蛋白質結合抗体。
  2. 前記ノロウイルスはＧＩＩ／４型である、請求項１に記載の蛋白質結合抗体。
  3. 請求項１または２に記載の蛋白質結合抗体を含み、前記抗体は、担体および標識物質の少なくとも一方と結合されている、複合体。
  4. 前記担体は、プレート、ビーズ、ディスク、チューブ、フィルターおよび薄膜から選択される、請求項３に記載の複合体。
  5. 前記標識物質は、蛍光物質、発光物質、色素、酵素および放射性物質から選択される、請求項３または４に記載の複合体。
  6. 請求項３から５のいずれか１項に記載の複合体と、検出部とを含み、
    前記検出部は、被分析物中の前記ノロウイルスと前記複合体との抗原抗体反応に基づく物理量の変化を検出する、
    検出装置。
  7. 請求項３から５のいずれか１項に記載の複合体と、被分析物とを接触させるステップと、
    前記被分析物中の前記ノロウイルスと前記複合体との抗原抗体反応に基づく物理量の変化を検出するステップとを含む、
    検出方法。
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