JP2022142155A - 抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒト血清アルブミンに結合する新規な抗体を提供する。【解決手段】抗体は、構造ドメインＮ－ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４－Ｃを含み、ＤＲ１はＧＦＴＦＥＲＦ（配列番号：０１）、ＧＳＤＶＳＳＤ（配列番号：０２）、ＧＲＩＶＴＶＡ（配列番号：０３）、ＧＲＴＦＲＦＳ（配列番号：０４）、又はＧＳＩＰＳＩＧ（配列番号：０５）を含み、ＣＤＲ２はＮＳＤＤＧＲ（配列番号：０６）、ＡＷＧＧＳ（配列番号：０７）、ＳＷＳＧＲＳ（配列番号：０８）、ＳＷＴＧＧＴ（配列番号：０９）、又はＳＱＧＧＨ（配列番号：１０）を含み、ＣＤＲ３はＣＱＡＹＴＳＣＴＤＡＥＤ（配列番号：１１）、ＲＮＹ（配列番号：１２）、ＧＧＮＳＹＳＳＤＹＡＲＹＤＹ（配列番号：１３）、ＧＰＩＰＳＰＡＳＲＹＤＤ（配列番号：１４）、又はＦＷＬＰＬＲＬＮＤＹ（配列番号：１５）を含む。【選択図】なし

Description

本開示は、ヒト血清アルブミンに結合する抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法に関する。

特許文献１は、ヒト血清アルブミンに結合する抗体を開示している。特許文献１に開示された抗体の少なくとも一部は、アルパカに由来する。特許文献１は、本明細書に参照として援用される。

米国特許出願公開第２０１９／０３７５８２４号明細書

本開示の目的は、ヒト血清アルブミンに結合する新規な抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法を提供することである。

本開示は、アミノ酸配列からなる抗体であって、前記アミノ酸配列は、ＮからＣの方向に、以下の構造ドメインからなり：
Ｎ － ＦＲ１ － ＣＤＲ１ － ＦＲ２ － ＣＤＲ２ － ＦＲ３ － ＣＤＲ３ － ＦＲ４ － Ｃ
ＦＲは、フレームワーク領域のアミノ酸配列を示し、かつＣＤＲは、相補性決定領域のアミノ酸配列を示し、
前記ＣＤＲ１は、ＧＦＴＦＥＲＦ（配列番号：０１）、又は、ＧＳＤＶＳＳＤ（配列番号：０２）、又は、ＧＲＩＶＴＶＡ（配列番号：０３）、又は、ＧＲＴＦＲＦＳ（配列番号：０４）、又は、ＧＳＩＰＳＩＧ（配列番号：０５）により表されるアミノ酸配列からなり、
前記ＣＤＲ２は、ＮＳＤＤＧＲ（配列番号：０６）、又は、ＡＷＧＧＳ（配列番号：０７）、又は、ＳＷＳＧＲＳ（配列番号：０８）、又は、ＳＷＴＧＧＴ（配列番号：０９）、又は、ＳＱＧＧＨ（配列番号：１０）により表されるアミノ酸配列からなり、
前記ＣＤＲ３は、ＣＱＡＹＴＳＣＴＤＡＥＤ（配列番号：１１）、又は、ＲＮＹ（配列番号：１２）、又は、ＧＧＮＳＹＳＳＤＹＡＲＹＤＹ（配列番号：１３）、又は、ＧＰＩＰＳＰＡＳＲＹＤＤ（配列番号：１４）、又は、ＦＷＬＰＬＲＬＮＤＹ（配列番号：１５）により表されるアミノ酸配列からなる。

本開示は、ヒト血清アルブミンに結合する新規な抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法を提供する。

図１Ａは、ＶＨＨ（Ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）抗体の遺伝子ライブラリに含まれる様々な遺伝子をライゲーションするために用いられたベクターのマップを示す図である。 図１Ｂは、図１Ａに示されるベクターマップの詳細を示す図である。 図２は、ＶＨＨ抗体を発現するために用いられたベクターマップを示す図である。 図３Ａは、配列番号：３６により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：２．１ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）評価結果を示すグラフである。 図３Ｂは、配列番号：３６により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：６．２ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図３Ｃは、配列番号：３６により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：１８．６ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図３Ｄは、配列番号：３６により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：５５．７ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図３Ｅは、配列番号：３６により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：１６７ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図３Ｆは、配列番号：３６により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：５００ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図４Ａは、配列番号：３７により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：４．１ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図４Ｂは、配列番号：３７により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：１２．３ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図４Ｃは、配列番号：３７により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：３７ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図４Ｄは、配列番号：３７により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：１１１ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図４Ｅは、配列番号：３７により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：３３３ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図４Ｆは、配列番号：３７により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：１０００ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図５Ａは、配列番号：３８により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：４．１ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図５Ｂは、配列番号：３８により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：１２．３ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図５Ｃは、配列番号：３８により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：３７ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図５Ｄは、配列番号：３８により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：１１１ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図５Ｅは、配列番号：３８により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：３３３ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図５Ｆは、配列番号：３８により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：１０００ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図６Ａは、配列番号：３９により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：４．１ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図６Ｂは、配列番号：３９により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：１２．３ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図６Ｃは、配列番号：３９により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：３７ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図６Ｄは、配列番号：３９により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：１１１ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図６Ｅは、配列番号：３９により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：３３３ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図６Ｆは、配列番号：３９により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：１０００ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図７Ａは、配列番号：４０により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：０．０４１ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図７Ｂは、配列番号：４０により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：０．１２３ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図７Ｃは、配列番号：４０により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：０．３７ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図７Ｄは、配列番号：４０により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：１．１ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図７Ｅは、配列番号：４０により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：３．３ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図７Ｆは、配列番号：４０により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：１０ｎＭ）のヒト血清アルブミンへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。 図８Ａは、ヒト血清アルブミン及びウシ血清アルブミンに対する配列番号：３６により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図８Ｂは、ヒト血清アルブミン及びウシ血清アルブミンに対する配列番号：３７により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図８Ｃは、ヒト血清アルブミン及びウシ血清アルブミンに対する配列番号：３８により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図８Ｄは、ヒト血清アルブミン及びウシ血清アルブミンに対する配列番号：３９により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図８Ｅは、ヒト血清アルブミン及びウシ血清アルブミンに対する配列番号：４０により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体の交差反応性の測定結果を示すグラフである。 図９は、配列番号：３６～配列番号：４０により表されるアミノ酸配列を含む５つのＶＨＨ抗体の性質を示す表である。 図１０は、配列番号：３６～配列番号４０により表されるアミノ酸配列を含む５つのＶＨＨ抗体の示差走査カロリメトリー（ＤＳＣ）による測定結果を示すグラフである。

本明細書における「抗体」は、例えば、抗体、一本鎖抗体、重鎖抗体、抗原結合部分、及び、ＶＨＨ抗体を含む。本明細書において「含む」は、「からなる」と、「本質的にからなる」とを含む。また、用語「ＨＳＡ」は、特に、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤナンバーＰ０２７６８を有するヒト血清アルブミン又はその変異体を含む。

本開示に係る抗体は、ヒト血清アルブミンに結合する。特許文献１にも開示されているように、ヒト血清アルブミンに結合する抗体は、ＮからＣの方向に、以下の構造ドメインを含むアミノ酸配列を含む。

Ｎ － ＦＲ１ － ＣＤＲ１ － ＦＲ２ － ＣＤＲ２ － ＦＲ３ － ＣＤＲ３ － ＦＲ４ － Ｃ
ここで、ＦＲは、フレームワーク領域のアミノ酸配列を示し、かつＣＤＲは、相補性決定領域のアミノ酸配列を示す。
本開示に係る抗体は、上記の構造ドメインを含むアミノ酸配列を含む。

本開示においては、ＣＤＲ１はＧＦＴＦＥＲＦ（配列番号：０１）、又はＧＳＤＶＳＳＤ（配列番号：０２）、又はＧＲＩＶＴＶＡ（配列番号：０３）、又はＧＲＴＦＲＦＳ（配列番号：０４）、又はＧＳＩＰＳＩＧ（配列番号：０５）により表されるアミノ酸配列を含む。

本開示においては、ＣＤＲ２は、ＮＳＤＤＧＲ（配列番号：０６）、又はＡＷＧＧＳ（配列番号：０７）、又はＳＷＳＧＲＳ（配列番号：０８）、又はＳＷＴＧＧＴ（配列番号：０９）、又はＳＱＧＧＨ（配列番号：１０）により表されるアミノ酸配列を含む。

本開示においては、ＣＤＲ３は、ＣＱＡＹＴＳＣＴＤＡＥＤ（配列番号：１１）、又はＲＮＹ（配列番号：１２）、又はＧＧＮＳＹＳＳＤＹＡＲＹＤＹ（配列番号：１３）、又はＧＰＩＰＳＰＡＳＲＹＤＤ（配列番号：１４）、又はＦＷＬＰＬＲＬＮＤＹ（配列番号：１５）により表されるアミノ酸配列を含む。

望ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号：０１、配列番号：０６、及び、配列番号：１１により表されてもよい。この場合、より望ましくは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び、ＦＲ４は、それぞれ、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＦＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳ（配列番号：１６）、ＤＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＳＬＥＷＶＳＲＦ（配列番号：１７）、ＫＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＡＩＳＲＤＮＡＥＮＴＬＹＬＱＭＮＮＬＩＰＥＤＴＡＭＹＹＣＶＫ（配列番号：１８）、及び、ＲＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号：１９）により表されるアミノ酸配列を含む。

言い換えれば、本開示による抗体は、以下のアミノ酸配列を含むことができる。
EVQLVESGGGFVQPGGSLRLSCVASGFTFERFDMGWVRQAPGKSLEWVSRFNSDDGRKSYADSVKGRFAISRDNAENTLYLQMNNLIPEDTAMYYCVK/CQAYTSCTDAEDRGQGTQVTVSS（配列番号：３６）

また、望ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号：０２、配列番号：０７、及び、配列番号：１２により表される。この場合、より望ましくは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び、ＦＲ４は、それぞれ、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＨＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳ（配列番号：２０）、ＴＭＧＷＦＲＲＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩ（配列番号：２１）、ＴＨＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＬＳＮＬＫＰＥＤＴＡＶＹＬＣＮＴ（配列番号：２２）、及び、ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号：２３）により表されるアミノ酸配列からなる。

言い換えれば、本開示による抗体は、以下のアミノ酸配列を含むことができる。
EVQLVESGGGLVHPGGSLRLSCVASGSDVSSDTMGWFRRAPGKQRELVAAIAWGGSTHYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQLSNLKPEDTAVYLCNTRNYWGQGTQVTVSS（配列番号：３７）

また、望ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号：０３、配列番号：０８、及び、配列番号：１３により表される。この場合、より望ましくは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び、ＦＲ４は、それぞれ、ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＴＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号：２４）、ＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＳＩ（配列番号：２５）、ＲＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＡＹＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＧＶＹＹＣＡＬ（配列番号：２６）、及び、ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号：２７）により表されるアミノ酸配列からなる。

言い換えれば、本開示による抗体は、以下のアミノ酸配列を含むことができる。
QVQLVESGGGLVQTGGSLRLSCAASGRIVTVAAMGWFRQAPGKEREFVASISWSGRSRSYADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMSSLKPEDTGVYYCALGGNSYSSDYARYDYWGQGTQVTVSS（配列番号：３８）

また、望ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号：０４、配列番号：０９、及び、配列番号：１４により表される。この場合、より望ましくは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び、ＦＲ４は、それぞれ、ＱＬＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号：２８）、ＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＡＡＡＩ（配列番号：２９）、ＴＡＹＡＥＳＶＫＧＲＦＩＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号：３０）、及び、ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号：３１）により表されるアミノ酸配列からなる。

言い換えれば、本開示による抗体は、以下のアミノ酸配列を含むことができる。
QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFRFSAMGWFRQAPGKEREFAAAISWTGGTTAYAESVKGRFIISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA/GPIPSPASRYDDWGQGTQVTVSS（配列番号：３９）

また、望ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号：０５、配列番号：１０、及び、配列番号：１５により表される。この場合、より望ましくは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び、ＦＲ４は、それぞれ、ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＫＳＬＲＬＳＣＴＡＳ（配列番号：３２）、ＶＴＧＷＨＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＴＩ（配列番号：３３）、ＩＮＹＦＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＧＶＹＹＣＮＡ（配列番号：３４）、及び、ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号：３５）により表されるアミノ酸配列を含む。

言い換えれば、本開示による抗体は、以下のアミノ酸配列を含むことができる。
QVQLVESGGGLVQAGKSLRLSCTASGSIPSIGVTGWHRQAPGKQRELVATISQGGHINYFESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTGVYYCNAFWLPLRLNDYWGQGTQVTVSS（配列番号：４０）

例えば、本開示に係る抗体は、ヒト血清アルブミンに結合可能である。この場合、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、及び、配列番号：４０により表されるアミノ酸配列からなる抗体は、いずれも、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような、ヒト血清アルブミン以外の血清アルブミンに対して抗原交差反応性を示さない。

本開示の抗体は、例えば、ヒト血清アルブミン検出するための検出装置又は検出方法において用いられてもよい。この場合、本開示の抗体は、担体及び標識物質の少なくとも一方に結合した複合体の状態で用いられる。

担体は、抗原抗体反応の反応系における溶媒に不溶な担体であれば、その形状及び材質は特に制限されない。担体の形状としては、例えば、プレート、ビーズ、ディスク、チューブ、フィルター、又は、薄膜などが挙げられる。担体の材質としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、及び、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、金、銀、及び、アルミニウム等の金属、又は、ガラスなどが挙げられる。抗体を担体へ結合させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、又は、架橋法などの公知の方法が使用される。

標識物質としては、例えば、蛍光物質、発光物質、色素、酵素、又は、放射性物質などが使用される。抗体を標識物質へ結合させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、又は、架橋法などの公知の方法が使用される。

本開示の抗体を用いた検出方法は、当該抗体を含む複合体と、被分析物とを接触させるステップと、被分析物中のヒト血清アルブミンと複合体との抗原抗体反応に基づく物理量の変化を検出するステップとを含む。当該方法では、当該抗体を含む複合体と、被分析物とが接触させられ、被分析物中のヒト血清アルブミンと、複合体中の抗体との抗原抗体反応に基づく物理量の変化が検出される。当該物理量としては、例えば、発光強度、色度、光透過度、濁度、吸光度、又は、放射線量などが挙げられる。検出方法の具体例としては、酵素免疫測定法、イムノクロマト法、ラテックス凝集法、放射免疫測定法、蛍光免疫測定法、又は、表面プラズモン共鳴測定法などの公知の方法が挙げられる。

本開示の抗体を用いた検出装置は、抗原抗体反応に基づき変化する上記物理量のいずれかを検出するための検出部を含む。検出部は、各種光度計、分光器、又は、線量計など公知の装置で構成される。

以下、実施例を用いて本開示に係る抗体をより具体的に説明するが、これらの実施例は、本開示を何ら制限するものではない。
（実施例１）
ヒト血清アルブミンに結合するＶＨＨ抗体（すなわち、重鎖抗体の重鎖の可変領域）が、以下の手順に従って調製された。以下、ヒト血清アルブミンは「ＨＳＡ」と呼ばれる。また、ヒト血清アルブミンに結合するＶＨＨ抗体は、「抗ＨＳＡ抗体」とも呼ばれる。

（ファージライブラリの作製）
ヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて作成されたＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリから、以下の手順に従ってファージライブラリが作製された。なお、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリは、例えば、ヒト血清アルブミン又はヒト血清アルブミンと適当なアジュバントとの複合体を抗原として用いて、従来公知の任意の方法で作成されてもよい。

市販されているプラスミドｐＵＣ１１９（例えば、タカラバイオ株式会社より入手可能）由来のプラスミドベクター１（４０５７塩基対、図１Ａ参照）が、制限酵素ＳｆｉＩにより処理された。図１Ａにおける制限酵素サイトＳｆｉＩ（ａ）は、GGCCCAGCCGGCC（配列番号：４１）により表される遺伝子配列からなる。制限酵素サイトＳｆｉＩ（ｂ）は、GGCCTCTGCGGCC（配列番号：４２）により表される遺伝子配列からなる。図１Ｂは、プラスミドベクター１の詳細なベクターマップを示す。

プラスミドベクター１は、以下の遺伝子配列からなる。
gacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccAAGCTTCGAAGGAGACAGTCATAatgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgcGGCCCAGCCGGCCatggagcTCAAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCAGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCGATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTATTACACATCAAGTTTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCGGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTTGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTgtaGGCCtctGCGGCCGCagaGcaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggccgcaTAGggttccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttagcgctggtaaaccatatgaattttctattgattgtgacaaaataaacttattccgtggtgtctttgcgtttcttttatatgttgccacctttatgtatgtattttctacgtttgctaacatactgcgtaataaggagtctTAATAAgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgCATATGaAAATTGTAAgcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacaGGGCGCGTcccatATGgtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcga（配列番号：４３）
同様に、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリも制限酵素ＳｆｉＩにより処理された。このようにして、ＶＨＨ抗体遺伝子断片が得られた。

このように処理されたプラスミドベクター１が、ＶＨＨ抗体遺伝子断片と、１：２の割合で混合された。混合液に、酵素（東洋紡株式会社より入手、商品名：Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２）が注入された。混合液は摂氏１６度の温度下で２時間静置された。このようにして、ＶＨＨ抗体遺伝子断片がプラスミドベクター１にライゲーションされた。

このようにしてライゲーションされたプラスミドベクター１を用いて、大腸菌（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：ＨＳＴ０２）がトランスフェクトされた。

次いで、大腸菌は、１００マイクログラム／ミリリットルの濃度を有するアンピシリンを含有する２ＹＴプレート培地上で１５時間、培養された。このようにして、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれる遺伝子断片から得られるタンパク質を提示するファージのライブラリが得られた。

培養後、２ＹＴプレート培地上に形成されたシングルコロニーの数をカウントすることでライブラリの濃度を算出した。その結果、ライブラリは、５ｘ１０^７／ミリリットルの濃度を有していた。

（バイオパニング）
ヒト血清アルブミンに特異的に結合するＶＨＨ抗体が、ファージライブラリから以下の手順に従って得られた。

ＶＨＨ抗体を発現したファージの中から、抗原に結合するクローンを抽出するため、２回のバイオパニングを実施した。

ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれるＶＨＨ抗体遺伝子断片が導入された大腸菌（ＨＳＴ０２）を、吸光度を示す値（ＯＤ_６００）が１．０になるまで摂氏３０度にて１００ｍＬの２ＹＴ ＡＧ（１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び１％グルコースを含有した２ＹＴ培地）の培地中で培養し、大腸菌を増殖させた。

ヘルパーファージ（Ｍ１３ＫＯ７）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を感染多重度（ＭＯＩ）がおよそ２０となるよう大腸菌含有培地へ加えた。

その後、培地が３０分ほど摂氏３７度で保温された。次いで、培地を４０００ｒｐｍの回転数で１０分間遠心し、大腸菌を回収した。１００ｍＬの２ＹＴＡＫ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有した２ＹＴ培地）中で、摂氏３０度で、２１３ｒｐｍにて遠心しながら、大腸菌を一晩培養した。

上記のように培養された大腸菌を含有する培養液（１００ミリリットル）が、２本の遠沈管（容積：５０ミリリットル）に注入された。２つの培養液は、４０００ｒｐｍの回転数で１０分間遠心された。次いで、上清（各２０ミリリットル）が回収された。

上清（４０ミリリットル）が、ＮａＣｌ（２．５Ｍ）を含有する２０％ＰＥＧ溶液（１０ミリリットル）に添加された。次いで、混合液は、転倒混和された。その後、混合液は、およそ１時間氷上にて冷却された。混合液は、４０００ｒｐｍの回転数で１０分間遠心された。次いで、上清が除去された。１０％グリセロールを含有するリン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」という）が沈殿物に向けて注入された。最後に、沈殿物は、ほぐしながら溶解された。このようにして、ＶＨＨ抗体を提示するファージのライブラリが得られた。

（ＨＳＡに特異的に結合するＶＨＨ抗体のスクリーニング）
（Ａ） 抗原（以下、「ＨＳＡ抗原」ともいう）の固定化
ＨＳＡをＰＢＳと混合し、ＨＳＡ溶液を調製した。ＨＳＡの濃度は２マイクログラム／ミリリットルであった。ＨＳＡ溶液（２ミリリットル）が、イムノチューブ（ヌンク社より購入）に注入された。ＨＳＡ溶液はイムノチューブ内で一晩静置された。このようにして、イムノチューブの内部にＨＳＡが固定された。

次いで、イムノチューブの内部がＰＢＳを用いて３回、洗浄された。

３％スキムミルク（和光純薬株式会社より入手）を含有するＰＢＳをイムノチューブに満たした。このようにして、ＨＳＡが抗原としてイムノチューブの内部にブロッキングされた。

イムノチューブは、室温にて１時間、静置された。その後、イムノチューブの内部がＰＢＳを用いて３回、洗浄された。

（Ｂ） パニング
ＶＨＨ抗体を提示するファージのライブラリ（濃度：およそ５Ｅ＋１１／ミリリットル）が、３％のスキムミルクを含有した３ミリリットルのＰＢＳと混合され、混合液を調製した。混合液は、ＨＳＡ抗原が固定化されたイムノチューブに注入された。

イムノチューブには、パラフィルムからなる蓋が取り付けられた。次いで、イムノチューブは、ローテーターを用いて、１０分間、転倒しながら回転された。

イムノチューブは、室温にて１時間、静置された。

イムノチューブの内部は、０．０５％のｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するＰＢＳ（以下、「ＰＢＳＴ」という）で１０回、洗浄された。

イムノチューブの内部は、ＰＢＳＴにより満たされた。その後、イムノチューブは、１０分間、静置された。次いで、イムノチューブの内部は、ＰＢＳＴで１０回、洗浄された。

ＨＳＡ抗原に結合したＶＨＨ抗体を提示するファージを抽出するために、１００ｍＭトリメチルアミン溶液（１ミリリットル）がイムノチューブに注入された。

イムノチューブには、パラフィルムからなる蓋が取り付けられた。次いで、イムノチューブは、ローテーターを用いて、１０分間、転倒しながら回転された。

溶液を中和するため、溶液を、１ｍＬの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ：６．８）を含有するチューブに移した。再度、１００ｍＭトリメチルアミン溶液（１ミリリットル）を用いたファージの抽出を繰り返した。このようにして、３ｍＬの抽出液が得られた。

抽出液（１ｍＬ）が、９ｍＬの大腸菌ＨＳＴ０２培養液と混合された。混合液は、摂氏３０度の温度で１時間、静置された。

コロニーを計数するため、大腸菌ＨＳＴ０２を含有する１０マイクロリットルの混合液は、２ＴＹＡ培地を含む小プレート（１０ミリリットル／プレート）にまかれた。

残りの混合液は遠心分離された。上澄み液は捨てられ、かつ沈殿物は２ＴＹＡ培地を含む大プレート（４０ミリリットル／プレート）にまかれた。これらの２つのプレートは、摂氏３０度の温度下にて一晩静置された。このようにして、１回目のパニングが行われた。

１回目のパニングの手順と全く同様に、２回目のパニングが行われた。言い換えれば、パニングが繰り返された。このようにして、ＶＨＨ抗体を提示するモノクローナルファージが精製された。

２回目のパニングの後、大腸菌のコロニーが爪楊枝でピックアップされた。ピックアップされた１つのコロニーは、９６平底プレートの１つのウェルに置かれた。これが繰り返された。１つのウェルは、２００マイクロリットルの２ＹＴＡＧ培地を含有していた。

ウェル内の溶液が、摂氏３０度で２１３ｒｐｍの回転数で撹拌された。

増殖した大腸菌を含む溶液（５０マイクロリットル）が回収された。回収された溶液は、プレートに含まれる５０マイクロリットルの２ＹＴＡ培地と混合された。２ＹＴＡ培地は、感染多重度（ＭＯＩ）が２０になるようなヘルパーファージを含有していた。溶液は、摂氏３７度の温度で４０分間静置された。

２ＹＴＡ培地を含むプレートは、１８００ｒｐｍにて２０分間遠心分離された。上清が捨てられた。沈殿物が大腸菌を含んでいた。沈殿物は、２００マイクロリットルの２ＹＴＡＫ培地と混合された。混合液は、摂氏３０度にて一晩静置された。

混合液は、１８００ｒｐｍにて２０分間遠心分離された。これにより、大腸菌を含む上清が回収された。

（Ｃ） ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）によるファージ提示ＶＨＨ抗体及び抗原の定性評価
９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より購入、商品名：ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウェルに、２マイクログラム／ミリリットルの濃度を有するヒト血清アルブミン溶液を抗原として添加した。各ウェルにおけるヒト血清アルブミン溶液の容積は、５０マイクロリットルであった。９６ウェルプレートは、摂氏４度で一晩、放置された。このようにして、ＨＳＡ抗原が各ウェルに固定された。

各ウェルは、ＰＢＳにより３回、洗浄された。次いで、３％スキムミルク（和光純薬株式会社より入手）を含有するＰＢＳが各ウェルに注入された（２００マイクロリットル／ウェル）。９６ウェルプレートは、室温で１時間、放置された。このようにして、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が各ウェルでブロックされた。その後、各ウェルは、ＰＢＳで３回、洗浄された。

ＶＨＨ抗体を提示するモノクローナルファージが、各ウェルに注入された（５０マイクロリットル／ウェル）。次いで、９６ウェルプレートは、１時間、静置された。このようにして、ファージはＨＳＡ抗原と反応した。

各ウェルは、ＰＢＳＴを用いて３回、洗浄された。次に、抗Ｍ１３抗体（ａｂｃａｍ社より入手、商品名：ａｂ５０３７０、１００００倍希釈）が各ウェルに添加された（５０マイクロリットル／ウェル）。次いで、各ウェルはＰＢＳＴで３回、洗浄された。

発色剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より入手、商品名：１－ＳＴＥＰ ＵＬＴＲＡ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ）が各ウェルに注入された（５０マイクロリットル／ウェル）。９６ウェルプレートは２分間静置され、発色剤を抗体と反応させた。

硫酸水溶液（１規定）が５０マイクロリットル／ウェルの濃度で各ウェルに添加され、反応を停止させた。

４５０ナノメートルの波長での溶液の吸光度が測定された。

良好な吸光度測定の結果を有する５つのウェルが選択された。選択された５つのウェルに含有されるファージに含まれるＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）配列が、グライナー社により解析された。ＤＮＡ配列の解析結果は、以下のとおりである。具体的には、以下の５つのＤＮＡ配列が見いだされた。

１つめのＤＮＡ配列は、以下のとおりである。
GAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTTGTGCAGCCGGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACGTTCGAGCGTTTTGACATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGAAAAAGCCTCGAGTGGGTCTCACGTTTTAATAGTGACGATGGTCGAAAAAGTTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCGCCATTTCCAGAGACAACGCCGAAAACACGCTATATCTACAAATGAACAATCTGATACCTGAAGACACGGCCATGTATTATTGTGTGAAGTGTCAAGCTTACACATCTTGCACTGATGCCGAAGACAGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCTTCG（配列番号：４４）
配列番号：４４により表されるＤＮＡ配列から合成されるタンパク質は、以下のアミノ酸配列からなる。
EVQLVESGGGFVQPGGSLRLSCVASGFTFERFDMGWVRQAPGKSLEWVSRFNSDDGRKSYADSVKGRFAISRDNAENTLYLQMNNLIPEDTAMYYCVK/CQAYTSCTDAEDRGQGTQVTVSS（配列番号：３６）

また、２つめのＤＮＡ配列は、以下のとおりである。
GAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCACCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCTTGTGTAGCCTCTGGAAGCGATGTCAGTTCCGATACCATGGGCTGGTTCCGCCGCGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCAGCTATTGCATGGGGTGGCAGCACACACTATGCAGAATCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAACTGAGCAACCTGAAACCTGAGGACACAGCCGTCTATTTATGTAACACTAGGAACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA（配列番号：４５）
配列番号：４５により表されるＤＮＡ配列から合成されるタンパク質は、以下のアミノ酸配列からなる。
EVQLVESGGGLVHPGGSLRLSCVASGSDVSSDTMGWFRRAPGKQRELVAAIAWGGSTHYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQLSNLKPEDTAVYLCNTRNYWGQGTQVTVSS（配列番号：３７）

また、３つめのＤＮＡ配列は、以下のとおりである。
CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGACTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCATCGTCACTGTCGCCGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAATTTGTAGCGTCTATTAGCTGGAGTGGTCGTAGTAGGAGCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAATACGGCATATCTGCAAATGAGCAGCCTGAAACCTGAGGACACGGGCGTTTATTACTGTGCATTAGGCGGCAACAGCTACTCTAGCGACTATGCGCGGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA（配列番号：４６）
配列番号：４６により表されるＤＮＡ配列から合成されるタンパク質は、以下のアミノ酸配列からなる。
QVQLVESGGGLVQTGGSLRLSCAASGRIVTVAAMGWFRQAPGKEREFVASISWSGRSRSYADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMSSLKPEDTGVYYCALGGNSYSSDYARYDYWGQGTQVTVSS（配列番号：３８）

また、４つめのＤＮＡ配列は、以下の通りである。
CAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGGTTCTCTGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGCCGCAGCTATTAGCTGGACCGGTGGTACCACAGCCTATGCCGAGTCCGTGAAGGGCCGATTCATCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCCGAAGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCAGGCCCAATACCATCTCCGGCAAGCAGATATGACGACTGGGGTCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA（配列番号：４７）
配列番号：４７により表されるＤＮＡ配列から合成されるタンパク質は、以下のアミノ酸配列からなる。
QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFRFSAMGWFRQAPGKEREFAAAISWTGGTTAYAESVKGRFIISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA/GPIPSPASRYDDWGQGTQVTVSS（配列番号：３９）

また、５つめのＤＮＡ配列は、以下の通りである。
CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGTAAGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGAAGCATCCCCAGTATCGGTGTCACGGGCTGGCACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCGACTATTTCGCAGGGTGGTCACATAAACTATTTCGAGTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACAGGCGTCTATTACTGTAATGCGTTTTGGCTTCCATTGCGCCTGAATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA（配列番号：４８）
配列番号：４８により表されるＤＮＡ配列から合成されるタンパク質は、以下のアミノ酸配列からなる。
QVQLVESGGGLVQAGKSLRLSCTASGSIPSIGVTGWHRQAPGKQRELVATISQGGHINYFESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTGVYYCNAFWLPLRLNDYWGQGTQVTVSS（配列番号：４０）

（抗ＨＳＡ ＶＨＨ抗体（以下、「抗ＨＳＡ抗体」ともいう）の発現）
ベクターｐＲＡ２（＋）が発現ベクターとして用いられた（図２参照）。ベクターｐＲＡ２（＋）は、メルク社から購入された。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社より購入）を用いて、ＶＨＨ配列（より詳細には、ＶＨＨ抗体遺伝子配列）がベクターｐＲＡ２（＋）に付加された。以下、付加された手順が詳細に説明される。

まず、以下２つのプライマー（配列番号：４９及び配列番号：５０）を用いて、ＰＣＲ法により、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれるＶＨＨ抗体遺伝子断片がライゲーションされたプラスミドベクター１から、ＶＨＨ抗体遺伝子断片が複製された。このようにして、配列番号：３６により表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を含む以下の１つのＤＮＡ（配列番号：５１）が得られた。
Primer 1: 5’- cagccggccatggctgaggtgcagctcgtggagtctgg -3’ （配列番号：４９）
Primer 2: 5’- atggtggcggccgcgcgaagagacggtgacctgggtcc -3’ （配列番号：５０）

5’- cagccggccatggctgaggtgcagctcgtggagtctggGGGAGGCTTTGTGCAGCCGGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACGTTCGAGCGTTTTGACATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGAAAAAGCCTCGAGTGGGTCTCACGTTTTAATAGTGACGATGGTCGAAAAAGTTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCGCCATTTCCAGAGACAACGCCGAAAACACGCTATATCTACAAATGAACAATCTGATACCTGAAGACACGGCCATGTATTATTGTGTGAAGTGTCAAGCTTACACATCTTGCACTGATGCCGAAGACAGGGGCCAGGggacccaggtcaccgtctcttcgcgcggccgccaccat -3’ （配列番号：５１）

続いて、以下２つのプライマー（配列番号：５２及び配列番号：５３）を用いて、ＰＣＲ法により、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれるＶＨＨ抗体遺伝子断片がライゲーションされたプラスミドベクター１から、ＶＨＨ抗体遺伝子断片が複製された。このようにして、配列番号：３７により表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を含む以下の１つのＤＮＡ（配列番号：５４）が得られた。
Primer 1: 5’- cagccggccatggctgaggtgcagctcgtggagtctgg-3’ （配列番号：５２）
Primer 2: 5’-atggtggcggccgcgTGAGGAGACGGTGACCTGGGTCC -3’ （配列番号：５３）

5’- cagccggccatggctgaggtgcagctcgtggagtctggGGGAGGCTTGGTGCACCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCTTGTGTAGCCTCTGGAAGCGATGTCAGTTCCGATACCATGGGCTGGTTCCGCCGCGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCAGCTATTGCATGGGGTGGCAGCACACACTATGCAGAATCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAACTGAGCAACCTGAAACCTGAGGACACAGCCGTCTATTTATGTAACACTAGGAACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAcgcggccgccaccat -3’ （配列番号：５４）

続いて、以下２つのプライマー（配列番号：５５及び配列番号：５６）を用いて、ＰＣＲ法により、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれるＶＨＨ抗体遺伝子断片がライゲーションされたプラスミドベクター１から、ＶＨＨ抗体遺伝子断片が複製された。このようにして、配列番号：３８により表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を含む以下の１つのＤＮＡ（配列番号：５７）が得られた。
Primer 1: 5’- cagccggccatggctCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGG -3’ （配列番号：５５）
Primer 2: 5’-atggtggcggccgcgTGAGGAGACGGTGACCTGGGTCC -3’ （配列番号：５６）

5’- cagccggccatggct CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGACTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCATCGTCACTGTCGCCGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAATTTGTAGCGTCTATTAGCTGGAGTGGTCGTAGTAGGAGCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAATACGGCATATCTGCAAATGAGCAGCCTGAAACCTGAGGACACGGGCGTTTATTACTGTGCATTAGGCGGCAACAGCTACTCTAGCGACTATGCGCGGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAcgcggccgccaccat-3’ （配列番号：５７）

続いて、以下２つのプライマー（配列番号：５８及び配列番号：５９）を用いて、ＰＣＲ法により、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれるＶＨＨ抗体遺伝子断片がライゲーションされたプラスミドベクター１から、ＶＨＨ抗体遺伝子断片が複製された。このようにして、配列番号：３９により表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を含む以下の１つのＤＮＡ（配列番号：６０）が得られた。
Primer 1: 5’- cagccggccatggctCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGG -3’ （配列番号：５８）
Primer 2: 5’-atggtggcggccgcgTGAGGAGACGGTGACCTGGGTCC -3’ （配列番号：５９）

5’- cagccggccatggctCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGGTTCTCTGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGCCGCAGCTATTAGCTGGACCGGTGGTACCACAGCCTATGCCGAGTCCGTGAAGGGCCGATTCATCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCCGAAGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCAGGCCCAATACCATCTCCGGCAAGCAGATATGACGACTGGGGTCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAcgcggccgccaccat-3’ （配列番号：６０）

続いて、以下２つのプライマー（配列番号：６１及び配列番号：６２）を用いて、ＰＣＲ法により、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれるＶＨＨ抗体遺伝子断片がライゲーションされたプラスミドベクター１から、ＶＨＨ抗体遺伝子断片が複製された。このようにして、配列番号：４０により表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を含む以下の１つのＤＮＡ（配列番号：６３）が得られた。
Primer 1: 5’- cagccggccatggctCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGG -3’ （配列番号：６１）
Primer 2: 5’- atggtggcggccgcgTGAGGAGACGGTGACCTGGGTCC -3’ （配列番号：６２）

5’- cagccggccatggctCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGTAAGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGAAGCATCCCCAGTATCGGTGTCACGGGCTGGCACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCGACTATTTCGCAGGGTGGTCACATAAACTATTTCGAGTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACAGGCGTCTATTACTGTAATGCGTTTTGGCTTCCATTGCGCCTGAATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAcgcggccgccaccat -3’ （配列番号：６３）

一方、以下２つのプライマー（配列番号：６４及び配列番号６５）を用いて、ＰＣＲ法により、ベクターｐＲＡ２に含まれる一部の塩基配列が増幅された。このようにして、ＤＮＡ（配列番号：６６）が得られた。
Primer 1: 5’- cgcggccgccaccatcatcaccaccattaatag -3’ （配列番号：６４）
Primer 2: 5’- agccatggccggctgggccgcgagtaataac -3’ （配列番号：６５）

cgcggccgccaccatcatcaccaccattaatagcactagtcaagaggatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatgaattccgtgtattctatagtgtcacctaaatcgtatgtgtatgatacataaggttatgtattaattgtagccgcgttctaacgacaatatgtacaagcctaattgtgtagcatctggcttactgaagcagaccctatcatctctctcgtaaactgccgtcagagtcggtttggttggacgaaccttctgagtttctggtaacgccgtcccgcacccggaaatggtcagcgaaccaatcagcagggtcatcgctagccagatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgaatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctttatttcaaggagacagtcataATGaaatacctattgcctacggcagccgctggattgttattactcgcggcccagccggccatggct（配列番号：６６）

以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）に示されるＤＮＡ以外のＤＮＡは、制限酵素ＤｐｎＩ（東洋紡より入手）を用いて断片化された。言い換えれば、以下の（Ｉ）及び（ＩＩ）に示されるＤＮＡはそのままであったが、他のＤＮＡは断片化された。
（Ｉ）配列番号：５１、配列番号：５４、配列番号：５７、配列番号：６０、及び、配列番号：６３により表される５つのＤＮＡ
（ＩＩ）配列番号：６６により表されるＤＮＡ

Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社より購入）を用いて、配列番号：５１により表されるＤＮＡが、配列番号：６６により表されるＤＮＡと融合された。このようにして、ＶＨＨ抗体遺伝子断片がベクターｐＲＡ２（＋）にライゲーションされた。また、配列番号：５４、配列番号：５７、配列番号：６０、及び、配列番号６３により表されるＤＮＡのそれぞれについても、配列番号：５１により表されるＤＮＡと同様にして、ＶＨＨ抗体遺伝子断片がベクターｐＲＡ２（＋）にライゲーションされた。以下では、これらの５つのライゲーション溶液それぞれについて行われる手順が説明される。

ライゲーション溶液（１０マイクロリットル）及び大腸菌ＪＭ１０９（タカラバイオより入手、１００マイクロリットル）が氷上にて混合された。混合液は、３０分間、氷上にて静置された。次いで、混合液は、摂氏４２度で４５秒間加熱された。最後に、混合液は、３分間、氷上で静置された。この手順は、一般的なヒートショック法として知られている。

摂氏３７度で１時間振とう培養後、全量の混合液が、１００マイクログラム／ミリリットルの濃度でアンピシリンを含有するＬＢ培地（以下、ＬＢＡ培地という）上に散布された。ＬＢＡ培地は、摂氏３７度で一晩静置された。

ＬＢＡ培地上に形成されたコロニーの中から、３つのコロニーが選択された。選択された３つのコロニーは、ＬＢＡ培地（３ミリリットル）で一晩培養された。

培養された大腸菌に含まれるプラスミドは、プラスミド抽出キット（Ｓｉｇｍａ社より入手、商品名：Ｇｅｎｅ Ｅｌｕｔｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を用いて、ＬＢＡ培地から抽出された。目的のＶＨＨ抗体の遺伝子がプラスミドに挿入されていることを確認するため、プラスミドの配列がグライナー社によって解析された。シーケンスの解析のために、一般的なＴ７ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒセットが用いられた。

シーケンスの解析を通して目的通りに形成されたことが確認されたプラスミドが選択された。

選択されたプラスミドを用いて、大腸菌（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ ＢＬ２１ （ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ， ライフテクノロロジーズ社より入手）がヒートショック法によりトランフェクトされた。

トランスフェクトされた大腸菌を含有する溶液に、ＬＢＡ培地（１ミリリットル）が添加された。次いで、大腸菌は、２１３ｒｐｍで振とうされながら、摂氏３７度で１時間、回復培養された。

次いで、大腸菌溶液が回収された。回収された大腸菌溶液（１ミリリットル）は、ＬＢＡ培地に散布された。ＬＢＡ培地は、摂氏３７度の温度で一晩、静置された。

ＬＢＡ培地上に形成されたコロニーの中から、１つのコロニーが選択された。選択されたコロニーは、爪楊枝でピックアップされた。ピックアップされたコロニーは、ＬＢＡ培地（３ミリリットル）中で、２１３ｒｐｍで振とうされながら摂氏３７度の温度で培養された。このようにして、培養液を得た。

さらに、培養液（３ミリリットル）はＬＢＡ培地（１０００ミリリットル）に混合された。６００ナノメートルの波長での混合液の吸光度が０．６になるまで、混合液は摂氏２８度の温度で、１２０ｒｐｍで振とうされた。

吸光度が０．６となったのち、イソプロピルチオガラクトシド（以下、「ＩＰＴＧ」という）溶液が混合液に添加された。ＩＰＴＧ溶液の最終濃度は０．５ｍＭであった。混合液に含有される大腸菌は、摂氏２０度で一晩、培養された。培養された大腸菌を回収するため、混合液は、６０００ｒｐｍで１０分間、摂氏４度で遠心された。

回収された大腸菌は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、及び５ｍＭイミダゾールを含有する混合溶媒に混合された。混合溶媒は、５０ミリリットルの容量を有していた。混合液に含有される大腸菌は、超音波を用いて破砕された。

大腸菌を含む破砕液は、４００００ｘｇで３０分間、摂氏４度で遠心された。上清が回収され、溶出液を得た。回収された上清は、ポアサイズ０．４５マイクロメートルのフィルターを用いて濾過された。

濾液は、Ｎｉ－ＮＴＡ－Ａｇａｒｏｓｅ（株式会社キアゲンより入手）を用いて推奨プロトコルに従って精製された。精製時には、１ミリリットルのＮｉ－ＮＴＡ－Ａｇａｒｏｓｅに対して３ミリリットルを有する溶出バッファが用いられた。

さらに、抗ＨＳＡ抗体を含有する溶出液がカラムクロマトグラフィー（ゼネラルエレクトリック社より入手、商品名：Ａｋｔａ ｐｕｒｉｆｉｅｒ）を用いて精製された。このようにして、抗ＨＳＡ抗体を含有する溶液が得られた。

このようにして得られた溶液に含有される抗ＨＳＡ抗体は、吸光度計（スクラム社より入手、商品名：ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて、２８０ナノメートルでの波長での吸収測定値に基づいて定量された。その結果、抗ＨＳＡ抗体の濃度は１．３０ミリグラム／ミリリットルであった。

（Ｄ－１） ヒト血清アルブミンを用いた抗ＨＳＡ抗体の表面プラズモン共鳴（以下、「ＳＰＲ」という）評価
ヒト血清アルブミン及び表面プラズモン共鳴評価装置（以下、「ＳＰＲ評価装置」という）を用いて、抗ＨＳＡ抗体が以下のように評価された。表面プラズモン共鳴の詳細は以下のとおりである。

ＳＰＲ評価装置：Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）
ランニングバッファ：０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ
センサチップ：ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）
固定化用試薬：Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）及びエチル（ジメチルアミノプロピル） カルボジイミド（ＥＤＣ）
ＨＳＡ抗原：Ｓｉｇｍａ社より入手

ＨＳＡ抗原は、ＳＰＲ評価装置Ｔ２００のコントロールソフトウェアに含まれているウィザードに従って固定化された。ＨＳＡ抗原の固定化のためには、５．０のｐＨを有する酢酸溶液が用いられた。

被分析物として、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、及び、配列番号：４０により表されるアミノ酸配列を含む抗ＨＳＡ抗体（以下、それぞれ、「配列番号：３６の配列を含む抗ＨＳＡ抗体」、「配列番号：３７の配列を含む抗ＨＳＡ抗体」、「配列番号：３８の配列を含む抗ＨＳＡ抗体」、「配列番号：３９の配列を含む抗ＨＳＡ抗体」、「配列番号：４０の配列を含む抗ＨＳＡ抗体」ともいう）が用いられた。１回目～６回目の分析において、ランニングバッファに含有される抗ＨＳＡ抗体の濃度は以下のように調整され、順次、ＳＰＲ測定に供された。

配列番号３６の配列を含む抗ＨＳＡ抗体の濃度は、２．１ｎＭ、６．２ｎＭ、１８．６ｎＭ、５５．７ｎＭ、１６７ｎＭ、及び、５００ｎＭに調整された。配列番号：３７、配列番号：３８及び配列番号：３９の配列をそれぞれ含む３つの抗ＨＳＡ抗体の濃度は、４．１ｎＭ、１２．３ｎＭ、３７ｎＭ、１１１ｎＭ、３３３ｎＭ、及び、１０００ｎＭに調整された。配列番号：４０の配列を含む抗ＨＳＡ抗体の濃度は、０．０４１ｎＭ、０．１２３ｎＭ、０．３７ｎＭ、１．１ｎＭ、３．３ｎＭ、及び、１０ｎＭに調整された。

図３Ａ～図３Ｆは、配列番号：３６により表されるアミノ酸配列を含む抗ＨＳＡ抗体のＨＳＡへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。図４Ａ～図４Ｆは、配列番号：３７により表されるアミノ酸配列を含む抗ＨＳＡ抗体のＨＳＡへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。図５Ａ～図５Ｆは、配列番号：３８により表されるアミノ酸配列を含む抗ＨＳＡ抗体のＨＳＡへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。図６Ａ～図６Ｆは、配列番号：３９により表されるアミノ酸配列を含む抗ＨＳＡ抗体のＨＳＡへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。図７Ａ～図７Ｆは、配列番号：４０により表されるアミノ酸配列を含む抗ＨＳＡ抗体のＨＳＡへの結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。これらのグラフは、ＳＰＲ評価装置Ｔ２００から得られた評価結果を示すグラフである。解離定数ＫＤが、評価ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）を用いて算出された。その結果、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、及び配列番号：４０により表されるアミノ酸配列を含む抗ＨＳＡ抗体の解離定数ＫＤは、それぞれ、２２．９ｎＭ、６２．２ｎＭ、１２４ｎＭ、２９６ｎＭ、及び、０．０７７ｎＭであった。詳細は、図９を参照して後述する。

（Ｄ－２） 抗ＨＳＡ抗体のヒト血清アルブミン以外のアルブミンに対する交差反応性の評価
次に、ヒト血清アルブミン以外の血清アルブミンとして、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）に対する交差反応性を評価した。具体的には、ＥＬＩＳＡ法により、配列番号：３６の配列を含む抗ＨＳＡ抗体、配列番号：３７の配列を含む抗ＨＳＡ抗体、配列番号：３８の配列を含む抗ＨＳＡ抗体、配列番号：３９の配列を含む抗ＨＳＡ抗体、及び、配列番号：４０の配列を含む抗ＨＳＡ抗体の牛アルブミン抗原（ＢＳＡ）に対する結合能力が評価された。

ウシ血清アルブミンをＳｉｇｍａ社より入手した。

配列番号：３６により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を含有する溶液Ａ１（以下、「希釈液Ａ１」という）（濃度：１０マイクログラム／ミリリットル）の一部が３％スキムミルク（和光純薬より入手）及び０．０５％ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０の両者を含有するＰＢＳ（以下、この溶液を「スキムミルク含有ＰＢＳＴ」という）で４倍に希釈された。このようにして、配列番号：３６により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を含有する希釈液Ａ１の希釈液Ｂ１（濃度：２．５マイクログラム／ミリリットル）が得られた。これが繰り返され、希釈液Ｃ１（濃度：０．６２５マイクログラム／ミリリットル）、希釈液Ｄ１（濃度：０．１５６２５マイクログラム／ミリリットル）、希釈液Ｅ１（濃度：０．０３９０６２５マイクログラム／ミリリットル）、希釈液Ｆ１（濃度：９．７６５６２×１０^－４マイクログラム／ミリリットル）及び、希釈液Ｇ１（濃度：２．４４１４１×１０^－４マイクログラム／ミリリットル）が得られた。

同様に、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、及び、配列番号：４０により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体各々を含有する希釈液Ａ２、希釈液Ａ３、希釈液Ａ４、及び、希釈液Ａ５（濃度：１０マイクログラム／ミリリットル）の一部がそれぞれスキムミルク含有ＰＢＳＴで４倍に希釈された。このようにして、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、及び、配列番号：４０により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体各々を含有する希釈液Ａ２～Ａ５に対応する希釈液Ｂ２～希釈液Ｂ５（濃度：２．５マイクログラム／ミリリットル）が得られ、上記のＢＳＡと同様にこの操作が繰り返される。これにより、希釈液Ｂ２～希釈液Ｂ５に対応する希釈液Ｃ２～希釈液Ｃ５（濃度：０．６２５マイクログラム／ミリリットル）、希釈液Ｃ２～希釈液Ｃ５に対応する希釈液Ｄ２～希釈液Ｄ５（濃度：０．１５６２５マイクログラム／ミリリットル）、希釈液Ｄ２～Ｄ５に対応する希釈液Ｅ２～Ｅ５（濃度：０．０３９０６２５マイクログラム／ミリリットル）、希釈液Ｅ２～Ｅ５に対応する希釈液Ｆ２～Ｆ５（濃度：９．７６５６２×１０^－４マイクログラム／ミリリットル）、希釈液Ｆ２～Ｆ５に対応する希釈液Ｇ２～Ｇ５（濃度：２．４４１４１×１０^－４マイクログラム／ミリリットル）が得られた。以下では、希釈液Ａ１～Ａ５を「希釈液群Ａ」と呼び、希釈液Ｂ１～Ｂ５、希釈液Ｃ１～Ｃ５、希釈液Ｄ１～Ｄ５、希釈液Ｅ１～Ｅ５、及び、希釈液Ｆ１～Ｆ５をそれぞれ「希釈液群Ｂ」、「希釈液群Ｃ」、「希釈液群Ｄ」、「希釈液群Ｅ」、及び、「希釈液群Ｆ」と呼ぶ。

９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）のウェルに、ヒト血清アルブミン、及びウシ血清アルブミンが注入された。各ウェルは、５０マイクロリットルの溶液を含んでいた。９６ウェルプレートは、室温で２時間静置され、ヒト血清アルブミン及び牛血清アルブミンをウェル内に固定化した。

スキムミルク含有ＰＢＳＴが、各ウェルに注入され、ヒト血清アルブミン及び牛血清アルブミンをブロックした。各ウェルに注入されたＰＢＳＴの容量は、２００マイクロリットルであった。９６ウェルプレートは、室温にて３時間、静置された。

０．０５％ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するＰＢＳＴが各ウェルに注入され、ウェルが洗浄された。ＰＢＳＴは７．４のｐＨを有していた。各ウェルに注入されたＰＢＳＴの容量は、２００マイクロリットルであった。これが３回、繰り返された。

希釈液群Ａ～希釈液群Ｇに含まれるそれぞれの希釈液がウェルに注入された。参照として、スキムミルク含有ＰＢＳＴが他のウェルに注入された。このスキムミルク含有ＰＢＳＴのみを含むウェルは、測定時のバックグラウンドを除去するために参照として用いられた。各ウェルに注入された溶液の容量は５０マイクロリットルであった。９６ウェルプレートは、室温にて静置された。これにより、希釈液群Ａ～希釈液群Ｇに含まれるそれぞれの希釈液に含有されるＶＨＨ抗体（いわゆる、抗ＨＳＡ抗体）は、ウェルに含まれるヒト血清アルブミンに結合した。９６ウェルプレートは、室温にて１時間、静置された。

０．０５％ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するＰＢＳＴが各ウェルに注入され、ウェルが洗浄された。ＰＢＳＴは７．４のｐＨを有していた。各ウェルに注入されたＰＢＳＴの容量は、２００マイクロリットルであった。これが５回繰り返された。

標識抗体（ＭＢＬ社より入手、商品名：Ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ｔａｇ ｍＡｂ－ＨＲＰ－ＤｉｒｅｃＴ）が０．０５％ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するＰＢＳＴで１００００倍に希釈された。このようにして希釈された標識抗体が、各ウェルに注入された（５０マイクロリットル／ウェル）。次いで、９６ウェルプレートは、１時間静置された。

０．０５％ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するＰＢＳＴが各ウェルに注入され、ウェルが洗浄された。ＰＢＳＴは７．４のｐＨを有していた。各ウェルに注入されたＰＢＳＴの容量は、２００マイクロリットルであった。これが５回、繰り返された。

発色剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より入手、商品名：１－ＳＴＥＰ ＵＬＴＲＡ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ）が各ウェルに注入された（５０マイクロリットル／ウェル）。９６ウェルプレートは３０分間静置され、発色剤を標識抗体と反応させた。

低濃度の硫酸及び塩酸を含有する発色停止剤（ＳｃｙＴｅｋ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより入手、商品名：ＴＭＢ Ｓｔｏｐ Ｂｕｆｆｅｒ）が５０マイクロリットル／ウェルの濃度で各ウェルに添加され、反応を停止させた。

４５０ナノメートルの波長での溶液の吸光度が測定された。結果を図８Ａ～図８Ｅに示す。図８Ａは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対する配列番号：３６により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（言い換えると、配列番号：３６の配列を含む抗ＨＳＡ抗体）の交差反応性の測定結果を示すグラフである。図８Ｂは、ＨＳＡ及びＢＳＡに対する配列番号：３７により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（言い換えると、配列番号：３７の配列を含む抗ＨＳＡ抗体）の交差反応性の測定結果を示すグラフである。図８Ｃは、ＨＳＡ及びＢＳＡに対する配列番号：３８により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（言い換えると、配列番号：３８の配列を含む抗ＨＳＡ抗体）の交差反応性の測定結果を示すグラフである。図８Ｄは、ＨＳＡ及びＢＳＡに対する配列番号：３９により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（言い換えると、配列番号：３９の配列を含む抗ＨＳＡ抗体）の交差反応性の測定結果を示すグラフである。図８Ｅは、ＨＳＡ及びＢＳＡに対する配列番号：４０により表されるアミノ酸配列からなるＶＨＨ抗体（言い換えると、配列番号：４０の配列を含む抗ＨＳＡ抗体）の交差反応性の測定結果を示すグラフである。

図８Ａ、図８Ｃ及び図８Ｅから理解されるように、配列番号：３６の配列を含む抗ＨＳＡ抗体、配列番号３８の配列を含む抗ＨＳＡ抗体、及び配列番号４０の配列を含む抗ＨＳＡ抗体は、ＨＳＡに対して高い反応性を示す一方で、ＢＳＡに対して低い反応性を示した。したがって、これらの３つの抗ＨＳＡ抗体は、ＢＳＡに対して交差反応性を有することが確認された。
一方、図８Ｂ及び図８Ｄから理解されるように、配列番号：３７の配列を含む抗ＨＳＡ抗体、及び、配列番号３９の配列を含む抗ＨＳＡ抗体は、ＨＳＡ及びＢＳＡの双方に対して高い反応性を示した。したがって、これらの２つの抗ＨＳＡ抗体は、ＢＳＡに対して高い交差反応性を有することが確認された。

（Ｅ） 各抗ＨＳＡ抗体の性質の比較
次に、配列番号：３６により表されるアミノ酸配列を含む抗ＨＳＡ抗体（以下、「Ｈ０１Ａ」という）、配列番号：３７により表されるアミノ酸配列を含む抗ＨＳＡ抗体（以下、「Ｈ０８Ａ」という）、配列番号：３８により表されるアミノ酸配列を含む抗ＨＳＡ抗体（以下、「Ｈ１０Ａ」という）、配列番号：３９により表されるアミノ酸配列を含む抗ＨＳＡ抗体（以下、「Ｈ１４Ａ」という）、及び、配列番号：４０により表されるアミノ酸配列を含む抗ＨＳＡ（以下、「Ｈ３２Ａ」という）について、抗原に対する結合能及び保存安定性を比較した。結果を図９に示す。図９は、配列番号：３６～配列番号：４０により表されるアミノ酸配列をそれぞれ含む５つのＶＨＨ抗体の性質を示す表である。

各抗ＨＳＡ抗体のＨＳＡ抗原に対する結合能は、上記（Ｄ－１）で述べられたとおり、評価ソフトウェア（Ｃｙｔｉｖａ社より入手）を用いて算出された、解離定数ＫＤにより評価された。解離定数ＫＤは、結合速度定数Ｋｏｎ及び解離速度定数Ｋｏｆｆを用いて算出される（ＫＤ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）。より低いＫＤを有する抗体は、より高いＫＤを有する抗体よりも抗原に対する結合能が高いと解釈されるため、より低いＫＤを有する抗体が好ましい。

また、各抗ＨＳＡ抗体の保存安定性は、示差走査カロリメトリー（ＤＳＣ）による測定結果に基づいて評価された。図１０は、配列番号：３６～配列番号４０により表されるアミノ酸配列を含む５つのＶＨＨ抗体の示差走査カロリメトリー（ＤＳＣ）による測定結果を示すグラフである。ＤＳＣは、タンパク質の相対的構造安定性の指標となる熱変性中点（Ｔｍ）を素早く、また、正確に測定することができる装置である。ＤＳＣを用いてＴｍ値を測定し、その値を比較することにより、抗体の熱安定性の違いを比較することができる。より低いＴｍ値は、より高い凝集性（言い換えると、より低い保存安定性）を示すが、より高いＴｍ値は、より低い凝集性（言い換えると、より高い保存安定性）を示す。したがって、より高いＴｍ値を有する抗体が好ましい。抗体の保存安定性は、抗体の熱安定性とある程度の相関を示すことが知られており、熱安定性を指標に、好適な抗体を選抜することができる。

したがって、図９及び図１０から理解されるように、Ｈ３２Ａ（配列番号４０の配列を含む抗ＨＳＡ抗体）は、５つの抗ＨＳＡ抗体の中で最も結合能が高かったが、保存安定性が最も低かった。Ｈ３２Ａ以外の４つの抗ＨＳＡ抗体は、結合能はさほど変わらず、普通レベルであるが、いずれもＨ３２Ａよりも保存安定性が高かった。

本開示は、例えば、ヒト血清アルブミンに結合する新規な抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法として利用できる。

Claims (12)

1. アミノ酸配列を含む抗体であって、前記アミノ酸配列は、ＮからＣの方向に、以下の構造ドメインを含み、
   Ｎ － ＦＲ１ － ＣＤＲ１ － ＦＲ２ － ＣＤＲ２ － ＦＲ３ － ＣＤＲ３ － ＦＲ４ － Ｃ
   ＦＲは、フレームワーク領域のアミノ酸配列を示し、かつＣＤＲは、相補性決定領域のアミノ酸配列を示し、
   前記ＣＤＲ１はＧＦＴＦＥＲＦ（配列番号：０１）、又はＧＳＤＶＳＳＤ（配列番号：０２）、又はＧＲＩＶＴＶＡ（配列番号：０３）、又はＧＲＴＦＲＦＳ（配列番号：０４）、又はＧＳＩＰＳＩＧ（配列番号：０５）により表されるアミノ酸配列を含み、
   前記ＣＤＲ２は、ＮＳＤＤＧＲ（配列番号：０６）、又はＡＷＧＧＳ（配列番号：０７）、又はＳＷＳＧＲＳ（配列番号：０８）、又はＳＷＴＧＧＴ（配列番号：０９）、又はＳＱＧＧＨ（配列番号：１０）により表されるアミノ酸配列を含み、
   前記ＣＤＲ３は、ＣＱＡＹＴＳＣＴＤＡＥＤ（配列番号：１１）、又はＲＮＹ（配列番号：１２）、又はＧＧＮＳＹＳＳＤＹＡＲＹＤＹ（配列番号：１３）、又はＧＰＩＰＳＰＡＳＲＹＤＤ（配列番号：１４）、又はＦＷＬＰＬＲＬＮＤＹ（配列番号：１５）により表されるアミノ酸配列を含む。
2. 請求項１に記載の抗体であって、
   前記抗体は、ヒト血清アルブミンに結合可能である。
3. 請求項１又は２に記載の抗体であって、
   前記ＦＲ１は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＦＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳ（配列番号：１６）、により表されるアミノ酸配列を含み、
   前記ＦＲ２は、ＤＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＳＬＥＷＶＳＲＦ（配列番号：１７）、により表されるアミノ酸配列を含み、
   前記ＦＲ３は、ＫＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＡＩＳＲＤＮＡＥＮＴＬＹＬＱＭＮＮＬＩＰＥＤＴＡＭＹＹＣＶＫ（配列番号：１８）、により表されるアミノ酸配列を含み、かつ
   前記ＦＲ４は、ＲＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号：１９）により表されるアミノ酸配列を含む。
4. 請求項１又は２に記載の抗体であって、
   前記ＦＲ１は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＨＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳ（配列番号：２０）、により表されるアミノ酸配列を含み、
   前記ＦＲ２は、ＴＭＧＷＦＲＲＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩ（配列番号：２１）、により表されるアミノ酸配列を含み、
   前記ＦＲ３は、ＴＨＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＬＳＮＬＫＰＥＤＴＡＶＹＬＣＮＴ（配列番号：２２）、により表されるアミノ酸配列を含み、かつ
   前記ＦＲ４は、ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号：２３）により表されるアミノ酸配列を含む。
5. 請求項１又は２に記載の抗体であって、
   前記ＦＲ１は、ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＴＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号：２４）、により表されるアミノ酸配列を含み、
   前記ＦＲ２は、ＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＳＩ（配列番号：２５）、により表されるアミノ酸配列を含み、
   前記ＦＲ３は、ＲＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＡＹＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＧＶＹＹＣＡＬ（配列番号：２６）、により表されるアミノ酸配列を含み、かつ
   前記ＦＲ４は、ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号：２７）により表されるアミノ酸配列を含む。
6. 請求項１又は２に記載の抗体であって、
   前記ＦＲ１は、ＱＬＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号：２８）、により表されるアミノ酸配列を含み、
   前記ＦＲ２は、ＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＡＡＡＩ（配列番号：２９）、により表されるアミノ酸配列を含み、
   前記ＦＲ３は、ＴＡＹＡＥＳＶＫＧＲＦＩＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ（配列番号：３０）、により表されるアミノ酸配列を含み、かつ
   前記ＦＲ４は、ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号：３１）により表されるアミノ酸配列を含む。
7. 請求項１又は２に記載の抗体であって、
   前記ＦＲ１は、ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＫＳＬＲＬＳＣＴＡＳ（配列番号：３２）、により表されるアミノ酸配列を含み、
   前記ＦＲ２は、ＶＴＧＷＨＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＴＩ（配列番号：３３）、により表されるアミノ酸配列を含み、
   前記ＦＲ３は、ＩＮＹＦＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＧＶＹＹＣＮＡ（配列番号：３４）、により表されるアミノ酸配列を含み、かつ
   前記ＦＲ４は、ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号：３５）により表されるアミノ酸配列を含む。
8. 請求項１から７のいずれか１項に記載の抗体を含み、
   前記抗体は、担体及び標識物質の少なくとも一方と結合されている、
   複合体。
9. 前記担体は、プレート、ビーズ、ディスク、チューブ、フィルター及び薄膜から選択される、
   請求項８に記載の複合体。
10. 前記標識物質は、蛍光物質、発光物質、色素、酵素及び放射性物質から選択される、
    請求項８に記載の複合体。
11. 請求項８に記載の複合体と、検出部とを含み、
    前記検出部は、被分析物中のヒト血清アルブミンと前記複合体との抗原抗体反応に基づく物理量の変化を検出する、
    検出装置。
12. 請求項８に記載の複合体と、被分析物とを接触させるステップと、
    前記被分析物中のヒト血清アルブミンと前記複合体との抗原抗体反応に基づく物理量の変化を検出するステップとを含む、
    検出方法。

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