JP6868763B2 - インフルエンザウィルスに結合する抗体 - Google Patents
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Description
N − FR1 − CDR1 − FR2 − CDR2 − FR3 − CDR3 − FR4 − C
FRは、フレームワーク領域のアミノ酸配列を示し、かつCDRは、相補性決定領域のアミノ酸配列を示し、
前記CDR1はSYYMS(配列番号:01)により表されるアミノ酸配列からなり、
前記CDR2は、TINTGGGSTYYADSVKG (配列番号: 02)により表されるアミノ酸配列からなり、
前記CDR3は、DGPYGGYDY (配列番号: 03)により表されるアミノ酸配列からなり、かつ
前記抗体は、H12N1インフルエンザウィルスに結合可能である。
N − FR1 − CDR1 − FR2 − CDR2 − FR3 − CDR3 − FR4 − C
ここで、FRは、フレームワーク領域のアミノ酸配列を示し、かつCDRは、相補性決定領域のアミノ酸配列を示す。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRVSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSTINTGGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMDSLKSEDTAVYYCAKDGPYGGYDYWGQGTQVTVSP(配列番号:08)
(実施例1)
H12N1インフルエンザウィルスA型に含まれるヘマグルチニン(以下、「HA」という)に結合するVHH抗体が、以下の手順に従って調製された。本明細書において、VHH(またはVHH抗体)とは、重鎖抗体の重鎖の可変領域を意味する。
VHH抗体遺伝子ライブラリを作製するため、H12N5インフルエンザウィルスA型(A/green-winged teal/ALB/199/1991)由来のリコンビナントHA蛋白質(H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、およびH16、Sino Biologicalから購入、カタログ番号:11055-V08H)を抗原として用いてアルパカが免疫された。
次に、単核球からTOTAL RNAを抽出し、そしてVHH抗体のcDNA遺伝子ライブラリが以下の手順で作製された。以下の手順では、RNase free gradeの試薬および器具が使用された。
10x buffer 5 マイクロリットル
dNTPs 4 マイクロリットル
Primer F 2 マイクロリットル
Primer R 2 マイクロリットル
cDNA template 1 マイクロリットル
Ex-taq 0.25 マイクロリットル
まず、混合液は、摂氏95度で2分間で加熱された。
次いで、混合液の温度は、以下のサイクルに従って変化された。
摂氏96度で30秒間
摂氏52度で30秒間、そして
摂氏68度で40秒間。
このサイクルが30回繰り返された。
最後に、混合液は、摂氏68度で4分間加熱した後、摂氏4度で保存された。
このPCR法においては、以下のプライマーが使用された。
primer 1: 5’- GGTGGTCCTGGCTGC -3’ (配列番号:09)
primer 2: 5’- ctgctcctcgcGGCCCAGCCGGCCatggcTSAGKTGCAGCTCGTGGAGTC -3’ (配列番号:10)
primer 3: 5’- TGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG -3’ (配列番号:11)
primer 4: 5’- TTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG -3’ (配列番号:12)
primer 5: 5’- tttgCtctGCGGCCGCagaGGCCgTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG -3’ (配列番号:13)
primer 6: 5’- tttgCtctGCGGCCGCagaGGCCgaTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG -3’ (配列番号:14)
(参考文献:Biomed Environ Sci, 2012; 27(2):118-121)
1回目のPCRアッセイでは、cDNA、Primer 1 およびPrimer 3からなるプライマーセットA、およびcDNA、Primer 1 およびPrimer 4からなるプライマーセットBが用いられた。
2回目のPCRアッセイでは、プライマーセットAを用いて増幅された遺伝子、Primer 2 およびPrimer 3からなるプライマーセットC、およびプライマーセットBを用いて増幅された遺伝子、Primer 2 およびPrimer 4からなるプライマーセットDが用いられた。
3回目のPCRアッセイでは、プライマーセットCを用いて増幅された遺伝子、Primer 2 およびPrimer 5からなるプライマーセットE、およびプライマーセットDを用いて増幅された遺伝子、Primer 2 およびPrimer 6からなるプライマーセットFが用いられた。
このようにして、VHH抗体の遺伝子ライブラリが形成された。言い換えれば、VHH抗体の遺伝子ライブラリは、プライマーセットEおよびプライマーセットFを用いて増幅された遺伝子を含んでいた。
次に、VHH抗体の遺伝子ライブラリから、以下の手順に従ってファージライブラリが作製された。
gacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccAAGCTTCGAAGGAGACAGTCATAatgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgcGGCCCAGCCGGCCatggagcTCAAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCAGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCGATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTATTACACATCAAGTTTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCGGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTTGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTgtaGGCCtctGCGGCCGCagaGcaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggccgcaTAGggttccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttagcgctggtaaaccatatgaattttctattgattgtgacaaaataaacttattccgtggtgtctttgcgtttcttttatatgttgccacctttatgtatgtattttctacgtttgctaacatactgcgtaataaggagtctTAATAAgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgCATATGaAAATTGTAAgcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacaGGGCGCGTcccatATGgtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcga(配列番号:17)
HA蛋白質に特異的に結合するVHH抗体が、ファージライブラリから以下の手順に従って得られた。
(A) HA抗原の固定化
HAをPBSと混合し、HA溶液を調製した。HAの濃度は10マイクログラム/ミリリットルであった。HA溶液(2ミリリットル)が、イムノチューブ(ヌンク社より購入)に注入された。HA溶液はイムノチューブ内で1時間静置された。このようにして、イムノチューブの内部にHAが固定された。
次いで、イムノチューブの内部がPBSを用いて3回、洗浄された。
3%スキムミルク(和光純薬株式会社より入手)を含有するPBSをイムノチューブに満たした。このようにして、HAが抗原としてイムノチューブの内部にブロッキングされた。
イムノチューブは、室温にて1時間、静置された。その後、イムノチューブの内部がPBSを用いて3回、洗浄された。
VHH抗体を提示するファージのライブラリ(濃度:およそ10E+11/ミリリットル)が、3%のスキムミルクを含有した2ミリリットルのPBSと混合され、混合液を調製した。混合液は、HA抗原が固定化されたイムノチューブに注入された。
イムノチューブには、パラフィルムからなる蓋が取り付けられた。次いで、イムノチューブは、ローテーターを用いて、10分間、転倒しながら回転された。
イムノチューブは、室温にて1時間、静置された。
イムノチューブの内部は、0.05%のtween20を含有するPBS(以下、「PBST」という)で10回、洗浄された。
イムノチューブの内部は、PBSTにより満たされた。その後、イムノチューブは、10分間、静置された。次いで、イムノチューブの内部は、PBSTで10回、洗浄された。
イムノチューブには、パラフィルムからなる蓋が取り付けられた。次いで、イムノチューブは、ローテーターを用いて、10分間、転倒しながら回転された。
96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific株式会社より購入、商品名:maxisorp)の各ウェルに、100マイクログラム/ミリリットルの濃度を有するHAタンパク質溶液を抗原として添加した。各ウェルにおけるHAタンパク質溶液の容積は、50マイクロリットルであった。96ウェルプレートは、室温で1時間、放置された。このようにして、HA抗原が各ウェルに固定された。
GAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGAGTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCAACTATTAATACTGGTGGTGGTAGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACCCTCTATCTGCAAATGGACAGTCTGAAATCTGAAGATACAGCCGTGTATTATTGTGCAAAAGATGGGCCATATGGCGGGTACGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCCCA (配列番号:18)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRVSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSTINTGGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMDSLKSEDTAVYYCAKDGPYGGYDYWGQGTQVTVSP(配列番号:08)
ベクターpET22b(+)がMerck Millipore社より購入された。Prime STAR Mutagenesis Basal Kit(タカラバイオ株式会社より入手)を用いて、PCR法で3xFlagタグおよび2つの制限酵素サイトSfiI(a)およびSfiI(b)がベクターpET22b(+)に付加された。図2を参照せよ。図2に示される手順が、以下、詳細に説明される。
Primer 1: 5’- GCCGGCTGGGCcGCGAGGAGCAGCAGACCA -3’(配列番号:19)
Primer 2: 5’- GCCCAGCCGGCcATGGCCATGGATATCGGA -3’(配列番号:20)
Primer 1: 5’- CATGGATATCGGAATTAATTCggatccGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCctcgagCACCACCACCACCACCACTGA -3’(配列番号:21)
Primer 2: 5’- TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGctcgagGATGTCATGATCTTTATAATCACCGTCATGGTCTTTGTAGTCggatccGAATTAATTCCGATATCCATG -3’(配列番号:22)
Primer 1: 5’- AAATACCTGCTGCCGccatggATATCGGAATTAATTCggcctctgcggccGCAggatccGACTACAAAGACCAT-3’(配列番号:23)
Primer 2: 5’- ATGGTCTTTGTAGTCggatccTGCggccgcagaggccGAATTAATTCCGATATccatggCGGCAGCAGGTATTT-3’(配列番号:24)
5’-GGCCCAGCCGGCCATGGCTGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGAGTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCAACTATTAATACTGGTGGTGGTAGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACCCTCTATCTGCAAATGGACAGTCTGAAATCTGAAGATACAGCCGTGTATTATTGTGCAAAAGATGGGCCATATGGCGGGTACGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCCCAGCGCACCACAGCGAAGACCCCACGGCCTCTGCGGCCGCAGGATCCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAAGATGACGATGACAAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGATCTGCGGCC-3’(配列番号:25)
5’-CGGCCATGGCTGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGAGTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCAACTATTAATACTGGTGGTGGTAGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACCCTCTATCTGCAAATGGACAGTCTGAAATCTGAAGATACAGCCGTGTATTATTGTGCAAAAGATGGGCCATATGGCGGGTACGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCCCAGCGCACCACAGCGAAGACCCCACGGCCTCTGCGGCCGCAGGATCCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAAGATGACGATGACAAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGATCTG-3’(配列番号:26)
リコンビナントHAおよび表面プラズモン共鳴評価装置を用いて、抗H12N1抗体が以下のように評価された。表面プラズモン共鳴(以下、「SPR」という)の詳細は以下の通りである。
SPR評価装置:T200(GE Healthcare社より入手)
固定化バッファ:HBS−EP(GE Healthcare社より入手)
ランニングバッファ:HBS−EP+(GE Healthcare社より入手)
センサチップ:CM5(GE Healthcare社より入手)
固定化用試薬:N-ヒドロキシコハク酸イミド(NHS)および1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)
H12:インフルエンザウィルス亜型H12N5由来のリコンビナントヘマグルチニン(HA)タンパク質(Sino Biological社より入手、商品名:17718−V08H)
配列番号:08により表されるアミノ酸配列からなるVHH抗体のHA蛋白質に対する結合能力が、ELISA測定法により評価された。
Claims (2)
- アミノ酸配列からなる抗体であって、前記アミノ酸配列は、NからCの方向に、以下の構造ドメインからなり:
N − FR1 − CDR1 − FR2 − CDR2 − FR3 − CDR3 − FR4 − C
FRは、フレームワーク領域のアミノ酸配列を示し、かつCDRは、相補性決定領域のアミノ酸配列を示し、
前記CDR1はSYYMS(配列番号:01)により表されるアミノ酸配列からなり、
前記CDR2は、TINTGGGSTYYADSVKG(配列番号:02)により表されるアミノ酸配列からなり、
前記CDR3は、DGPYGGYDY(配列番号:03)により表されるアミノ酸配列からなり、かつ
H12N1インフルエンザウィルスに結合可能である、抗体。 - 前記FR1は、EVQLVESGGGLVQPGGSLRVSCAASGFTFS(配列番号:04)により表されるアミノ酸配列からなり、
前記FR2は、WVRQAPGKGLEWVS(配列番号:05)により表されるアミノ酸配列からなり、
前記FR3は、RFTISRDNAKNTLYLQMDSLKSEDTAVYYCAK(配列番号:06)により表されるアミノ酸配列からなり、かつ
前記FR4は、WGQGTQVTVSP(配列番号:07)により表されるアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の抗体。
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