JP2018150260A - インフルエンザウイルスの増殖を阻害するモノクローナル抗体 - Google Patents
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1.ハイブリドーマ PA 11-9.4 の樹立
インフルエンザウイルス H1N1 由来の RNA 依存性 RNA ポリメラーゼ PA サブユニット(239aa-716aa)タンパク質およびPB1 サブユニット(1aa- 81aa)タンパク質を大腸菌で共発現作製させ精製した。その精製タンパク質を常法に従いマウスに免疫し、精製タンパク質を用いた ELISA 法によりハイブリドーマ PA 11-9.4 を選別樹立した。これらの操作は、より具体的には、次のようにして行った。
RNA 依存性 RNAポリメラーゼのPAサブユニット(239-716aa)タンパク質を発現する遺伝子領域を、pET14bに組み込まれたcDNA (influenza/ Puerto Rico/ 8/ 1934, H1N1) を鋳型として、PCR法により増幅した。PCR産物を制限酵素BamHI及びNotIで処理し、pET28aベクターとライゲーションを行った。市販のpET28aベクターのXbaI及びBamHIサイトの間にSD(Shine Dargarno)配列、開始ATG、ヒスチジンタグとTEV(tobacco etch virus)プロテアーゼ切断サイトのDNA配列を付加し、発現されたPAサブユニット(239-716aa)タンパク質のN末端側にヒスチジンタグ及びTEVプロテアーゼ切断サイトが付加されるように、発現系プラスミドpET28a-PA(239-716)を構築した。
構築した発現系プラスミドpET28a-PA(239-716)を用いて、タンパク質発現用大腸菌BL21(DE3)codonplus RILPを形質転換し、抗生物質カナマイシン40 μg/mlとクロラムフェニコール35 μg/ml含有のLBプレート培地上にて、37℃で16時間培養した。培養した大腸菌のコロニーを、カナマイシン50 μg/mlとクロラムフェニコール35 μg/ml含有のLB液体培地1Lで振盪培養した。37℃で培養を開始し、OD600の値が0.6になった段階で氷上にて1時間冷却した。冷却後、終濃度0.5 mM IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)を添加し、15℃で16時間振盪培養しPAサブユニット(239-716aa)タンパク質を発現させた。培養液を5,000 rpm、15 minで遠心処理し、培養上清と菌体を分離させ、菌体のみを回収した。
回収した菌体を、菌体破砕用バッファー(20 mM Tris-HCl(pH8.0), 500mM NaCl, 500 mM Urea, 25 mM Imidazole, 10 mM 2-mercaptoethanol)で懸濁し、超音波破砕装置(Vibra cell)を用いて破砕した。破砕条件をAmplitude: 80、Pulse: 1 sec、Time: 10 minに設定し、これを2サイクル行った。破砕液を19,000 rpm、30 minの条件で遠心分離し、上清を回収した。
上記で作製精製したインフルエンザウイルス H1N1 由来の RNA 依存性 RNA ポリメラーゼPA サブユニット(239aa-716aa)タンパク質およびPB1 サブユニット(1aa- 81aa)タンパク質をTiterMax Gold (CytRx社)でエマルジョン化し、BALB/c マウス(8週齢、メス)に皮下注射し、免疫を開始した。2週間間隔で合計4回の免疫をした後、採血し、取得した血清を用いてイムノブロット(myc3 タグ融合 PA サブユニット(239aa-716aa)および myc3 タグ融合 PB1 サブユニット(1aa-81aa)を293T 細胞に発現させた細胞溶解液をSDS-PAGEで泳動、コントロールには遺伝子を導入していない293T 細胞の細胞溶解液を泳動)により抗体価を確認した。
ハイブリドーマ PA 11-9.4が生産するPA 11-9.4モノクローナル抗体を、IsoStrip マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット(Roche)を用いて、アイソタイプを確認したところ、 IgG1 であった。
myc3 タグ融合 PA サブユニット(239aa-716aa)を 293T細胞に発現させた。免疫沈降法における有用性について、既存の Mycタグ抗体(9E10)と比較し評価した。既存の Flag タグ抗体(M2)はネガティブコントロール抗体として使用した。
myc3 タグ融合 PA サブユニット(239aa-716aa)および myc3 タグ融合 PB1 サブユニット(1aa-81aa)を 293T 細胞に発現させた。そして、ウエスタンブロット法を用いて抗体を評価した。
PA 11-9.4モノクローナル抗体を腹水から、免疫グロブリン(IgG)として単離精製し、PA タンパク質あるいは PA/PB1 タンパク質を混合させ、合計分子量の測定を行った。測定機器は、分析用超遠心機(AUC)を使用した。
PA 11-9.4モノクローナル抗体を腹水から、免疫グロブリン(IgG)として単離精製しさらに、ImmunoPure Fab Preparation kit(Pierce 社)を用いて Fab 断片として精製した。そして、Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit(Molecular Probe社)を用いて、Fab 断片として精製したPA 3-1.2 および PA 5-2.1モノクローナル抗体をAlexa Fluor 488で標識した。アイソタイプが同じコントロール抗体G196についても同様に行った。
ハイブリドーマ PA 11-9.4よりRNAを抽出後、oligo-dTプライマーを用いて逆転写しcDNAを作成した。H鎖およびL鎖のプライマーを設計後、PCRにて増幅し、超可変領域の抗体遺伝子の解析を行った。
VH1-1S: 5′-ggggatcc ag gts mar ctg cag sag tcw gg-3 (配列番号5)
s=g+c、m=a+c、r=a+g、w=a+t
IgG2-1AS: 5’-gggaattc ctt gac cag gca tcc tag agt ca-3’ (配列番号6)
VK-1S(BglII): 5′-ggagatct gay att gtg mts acm car wct mca -3′(配列番号7)
y=c+t、m=a+c、s=g+c、r=a+g、w=a+t
CK-2AS: 5’-gggaattc gaa gat gga tac agt tgg tgc-3’ (配列番号8)
実施例1と全く同様な方法により、PAサブユニットと特異的に結合するPA 3-1.2モノクローナル抗体(比較例1)及びPA 5-2.1モノクローナル抗体(比較例2)を得た。
インフルエンザウイルスの増殖阻害実験におけるモノクローナル抗体の統計学的評価
前述のインフルエンザウイルスの増殖阻害実験でコンフォーカル顕微鏡 FV-1000(オリンパス)を用いて各細胞の平均蛍光強度( ROI 直径 30 pixels の円)を arbitrary intensity unit (A.I.U.) として取得した。
ハイブリドーマ PA 11-9.4 が産生するモノクローナル抗体の評価(免疫沈降法)
インフルエンザウイルス H1N1 由来の PA サブユニット(239 - 716aa)、H3N2 由来の PA サブユニット(254 - 716aa)、H5N1 由来の PA サブユニット(254 - 716aa)、H7N9 由来の PA サブユニット(247 - 709aa)、および H9N2 由来の PA サブユニット(254 - 716aa)をそれぞれ myc3 タグ融合タンパク質として 293T 細胞に発現させた。免疫沈降法における有用性について、既存の Myc タグ抗体(9E10)と比較し評価した。既存の Flag タグ抗体(M2)はネガティブコントロール抗体として使用した。ウエスタンブロット法による検出は、抗 myc ポリクローナル抗体を用いた。
Claims (4)
- インフルエンザウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼのPAサブユニットと抗原抗体反応して該インフルエンザウイルスの増殖を阻害するモノクローナル抗体であって、H鎖の可変領域中のCDR1のアミノ酸配列がGFNIKDTY、CDR2のアミノ酸配列がIDPANGNT、CDR3のアミノ酸配列がAYRYDYYFDYであり、L鎖の可変領域中のCDR1のアミノ酸配列がESVDNYGISF、CDR2のアミノ酸配列がAAS、CDR3のアミノ酸配列がQQSKEVPWTである(ただし、上記H鎖の可変領域中のCDR1、CDR2及びCDR3、並びに上記L鎖の可変領域中のCDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列は、それぞれ独立して保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい)モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
- H鎖の可変領域中のCDR1のアミノ酸配列がGFNIKDTY、CDR2のアミノ酸配列がIDPANGNT、CDR3のアミノ酸配列がAYRYDYYFDYであり、L鎖の可変領域中のCDR1のアミノ酸配列がESVDNYGISF、CDR2のアミノ酸配列がAAS、CDR3のアミノ酸配列がQQSKEVPWTである請求項1記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
- H鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号2で表される請求項2記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
- L鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号4で表される請求項2又は3記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
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VIRUS RESEARCH, vol. 24, JPN6021009397, 1992, pages 65 - 75, ISSN: 0004466598 * |
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