CN103804493B - 针对甲型流感病毒h1n1的重链抗体vhh及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种针对甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH，所述的抗体具有核苷酸序列：SEQ？ID？NO.36、37、38、39或40，它们编码本发明所述的甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH；所述的抗体具有氨基酸系列：包括框架区FR和互补决定区CDR，即框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列和互补决定区CDR氨基酸序列。还公开了该甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH用于诊断甲型H1N1流感的应用及一种宿主细胞。本发明通过所公布的纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，特异识别甲型流感病毒H1N1，能够用于甲型H1N1流感检测试剂的研发。
Description
技术领域
本发明属于生物医学或生物制药技术领域，涉及一种针对甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH。
背景技术
H1N1属于正粘病毒科，甲型流感病毒属。典型病毒颗粒呈球状，直径为80nm-120nm，有囊膜。囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是红细胞血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）和基质蛋白M2。病毒颗粒内为核衣壳，呈螺旋状对称，直径为10nm。为单股负链RNA病毒，基因组约为13.6kb，由大小不等的8个独立片段组成。甲型流感病毒H1N1是人类最常感染的流感病毒之一。一些H1N1的种类可以在人类间传播，包括1918年的流感大爆发，另一些可在雀鸟和猪之间传播。2009年3至4月，墨西哥爆发H1N1疫潮，导致过百人感染。疫情其后传播到全世界。2009年4月30日凌晨，世界卫生组织把全球流感大流行警告级别提高到第5级。我国甲型H1N1流感相当严重，根据官方统计，从2009年5月11日确诊首例甲型H1N1流感至2010年8月10日24时，中国内地累计报告甲流感确诊病例128033例，死亡805例。卫生部已将甲型H1N1流感纳入《传染病防治法》规定的乙类传染病，并采取甲类传染病的预防、控制措施。目前针对人间甲型H1N1流感大流行的防控措施主要采用化学药物和疫苗，但是化学药物的过量使用产生的副作用及疫苗开发往往滞后于疫情暴发和疫苗只能对易感人群起预防作用的弊端显著。作为化学药物和疫苗的有效补充，由抗体介导的预防和诊断已显现良好的效果，其应用前景得到专家的认同。但是常规抗体仍然存在稳定性差，溶解性低及获得较麻烦等方面的问题。1993年比利时科学家首次在Nature报道骆驼血液中存在不含轻链的抗体，这些缺失轻链的“单域重链抗体”（VHH）能像正常抗体一样与抗原等靶标紧密结合，而且不会像scFv那样互相沾粘，甚至聚集成块，另外不会因为含有传统抗体的Fc段而引起补体反应。这种抗体只包含一个重链可变区和两个常规的CH2与CH3区，更重要的是单独克隆并表达出来的VHH具有很好的结构稳定性与抗原结合活性。由于此种VHH的分子量只是普通抗体的1/10，所以VHH也称Nanobody（纳米抗体）；与此同时纳米抗体化学性质也更加灵活，稳定性好，可溶性高且容易获得，同时方便偶联其他分子，因此应用甲型流感病毒H1N1纳米抗体研发甲型H1N1流感诊断试剂具有广阔的前景。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种针对甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH，同时提供该重链抗体VHH的编码序列及该重链抗体VHH在制备检测试剂中的应用。
技术方案：本发明的技术方案为：即：
本发明的第一方面，提供了一种针对甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述的框架区FR由四个框架区组成，分别为FRl、FR2、FR3和FR4，它们的氨基酸序列选自以下的氨基酸序列：
FR1为SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，FR2为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，FR3为SEQIDNO.3所示的氨基酸序列，FR4为SEQIDNO.4所示的氨基酸序列；
或FR1为SEQIDNO.5所示的氨基酸序列，FR2为SEQIDNO.6所示的氨基酸序列，FR3为SEQIDNO.7所示的氨基酸序列，FR4为SEQIDNO.8所示的氨基酸序列；
或FR1为SEQIDNO.9所示的氨基酸序列，FR2为SEQIDNO.10所示的氨基酸序列，FR3为SEQIDNO.11所示的氨基酸序列，FR4为SEQIDNO.12所示的氨基酸序列；
或FR1为SEQIDNO.13所示的氨基酸序列，FR2为SEQIDNO.14所示的氨基酸序列，FR3为SEQIDNO.15所示的氨基酸序列，FR4为SEQIDNO.16所示的氨基酸序列；
或FR1为SEQIDNO.17所示的氨基酸序列，FR2为SEQIDNO.18所示的氨基酸序列，FR3为SEQIDNO.19所示的氨基酸序列，FR4为SEQIDNO.20所示的氨基酸序列；
所述的互补决定区CDR由三个互补决定区组成，分别CDRl、CDR2和CDR3，它们的氨基酸序列选自以下的氨基酸序列：
CDR1为SEQIDNO.21所示的氨基酸序列，CDR2为SEQIDNO.22所示的氨基酸序列，CDR3为SEQIDNO.23所示的氨基酸序列；
或CDR1为SEQIDNO.24所示的氨基酸序列，CDR2为SEQIDNO.25所示的氨基酸序列，CDR3为SEQIDNO.26所示的氨基酸序列；
或CDR1为SEQIDNO.27所示的氨基酸序列，CDR2为SEQIDNO.28所示的氨基酸序列，CDR3为SEQIDNO.29所示的氨基酸序列；
或CDR1为SEQIDNO.30所示的氨基酸序列，CDR2为SEQIDNO.31所示的氨基酸序列，CDR3为SEQIDNO.32所示的氨基酸序列；
或CDR1为SEQIDNO.33所示的氨基酸序列，CDR2为SEQIDNO.34所示的氨基酸序列，CDR3为SEQIDNO.35所示的氨基酸序列。
优选地，所述的甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH，它具有SEQIDNO：36、37、38、39或40所示的氨基酸序列。
本发明第二方面，一种针对甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH，它针对甲型H1N1病毒表面抗原，包括两条具有SEQIDNO：36、37、38、39或40所示氨基酸序列的VHH链。
本发明第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本发明所述的甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH。
优选地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列：
SEQIDNO：41、42、43、44或45。
本发明的第四方面，提供了一种表达载体，它含SEQIDNO：41、42、43、44或45所示的核苷酸序列。
本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的表达载体。
本发明的第六方面，提供了本发明所述的针对甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH用于诊断甲型H1N1流感的潜在应用。
有益效果：
与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明将灭活的甲型H1N1流感病毒免疫新疆双峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH基因库，试验中将灭活的甲型H1N1流感病毒偶联在酶标板上，以此形式的甲型H1N1流感病毒表面抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库，从而获得了针对甲型H1N1流感病毒的特异性纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
附图说明
图1是甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH的基因电泳图；
图2是对于所构建的甲型H1N1流感病毒特异性的单域抗体文库进行的菌落PCR电泳图；
图3是用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆的模式图；
图4是表达的针对甲型流感病毒H1N1的#12重链抗体VHH，经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图；其中泳道1是破菌后蛋白总的粗提液样品，泳道2是总的蛋白粗提液过镍柱后的样品，泳道3是含50毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品，泳道4和5是含100毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品，6-7是250毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品，8-11是500毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品；
图5是表达的全部5颗针对甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH，其中泳道1是蛋白分子标准，泳道2是甲型流感病毒H1N1-#12重链抗体VHH，泳道3甲型流感病毒H1N1--#51重链抗体VHH，泳道4是甲型流感病毒H1N1--#71重链抗体VHH，泳道5是甲型流感病毒H1N1--#121重链抗体VHH，6是甲型流感病毒H1N1--#125重链抗体VHH。
具体实施方式
本发明首先将灭活的甲型H1N1流感病毒免疫一只新疆双峰驼，经过4次免疫之后提取该双峰驼外周血淋巴细胞并构建了甲型H1N1流感病毒特异的单域重链抗体文库。将灭活的甲型H1N1流感病毒偶联在NUNC酶标板上，展示蛋白质的正确空间结构，使得灭活的甲型H1N1流感病毒表面的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选甲型H1N1流感病毒免疫性的纳米抗体基因库，而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
本发明的第一方面，提供了一种针对甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述的框架区FR由四个框架区组成，分别为FRl、FR2、FR3和FR4，它们的氨基酸序列选自以下的氨基酸序列：
FR1为SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，FR2为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，FR3为SEQIDNO.3所示的氨基酸序列，FR4为SEQIDNO.4所示的氨基酸序列；
或FR1为SEQIDNO.5所示的氨基酸序列，FR2为SEQIDNO.6所示的氨基酸序列，FR3为SEQIDNO.7所示的氨基酸序列，FR4为SEQIDNO.8所示的氨基酸序列；
或FR1为SEQIDNO.9所示的氨基酸序列，FR2为SEQIDNO.10所示的氨基酸序列，FR3为SEQIDNO.11所示的氨基酸序列，FR4为SEQIDNO.12所示的氨基酸序列；
或FR1为SEQIDNO.13所示的氨基酸序列，FR2为SEQIDNO.14所示的氨基酸序列，FR3为SEQIDNO.15所示的氨基酸序列，FR4为SEQIDNO.16所示的氨基酸序列；
或FR1为SEQIDNO.17所示的氨基酸序列，FR2为SEQIDNO.18所示的氨基酸序列，FR3为SEQIDNO.19所示的氨基酸序列，FR4为SEQIDNO.20所示的氨基酸序列；
所述的互补决定区CDR由三个互补决定区组成，分别CDRl、CDR2和CDR3，它们的氨基酸序列选自以下的氨基酸序列：
CDR1为SEQIDNO.21所示的氨基酸序列，CDR2为SEQIDNO.22所示的氨基酸序列，CDR3为SEQIDNO.23所示的氨基酸序列；
或CDR1为SEQIDNO.24所示的氨基酸序列，CDR2为SEQIDNO.25所示的氨基酸序列，CDR3为SEQIDNO.26所示的氨基酸序列；
或CDR1为SEQIDNO.27所示的氨基酸序列，CDR2为SEQIDNO.28所示的氨基酸序列，CDR3为SEQIDNO.29所示的氨基酸序列；
或CDR1为SEQIDNO.30所示的氨基酸序列，CDR2为SEQIDNO.31所示的氨基酸序列，CDR3为SEQIDNO.32所示的氨基酸序列；
或CDR1为SEQIDNO.33所示的氨基酸序列，CDR2为SEQIDNO.34所示的氨基酸序列，CDR3为SEQIDNO.35所示的氨基酸序列。
优选地，所述的甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH，它具有SEQIDNO：36、37、38、39或40所示的氨基酸序列。
本发明第二方面，一种针对甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH，它针对甲型H1N1病毒表面抗原，包括两条具有SEQIDNO：36、37、38、39或40所示氨基酸序列的VHH链。
本发明第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本发明所述的甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH。
优选地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列：
SEQIDNO：41、42、43、44或45。
本发明的第四方面，提供了一种表达载体，它含SEQIDNO：41、42、43、44或45所示的核苷酸序列。
本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的表达载体。
本发明的第六方面，提供了本发明所述的针对甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH用于诊断甲型H1N1流感的潜在应用。
本发明将灭活的甲型H1N1流感病毒免疫新疆双峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH基因库，试验中将灭活的甲型H1N1流感病毒偶联在酶标板上，以此形式的甲型H1N1流感病毒表面抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库，从而获得了针对甲型H1N1流感病毒的特异性纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：针对甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH文库的构建：
（1）由灭活的甲型H1N1流感病毒每次免疫将20mg灭活甲型H1N1流感病毒与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼(句容圣龙家畜养殖厂)，每周一次，共免疫4次，除第一次使用完全的弗氏佐剂，剩余几次全部使用弗式不完全佐剂，免疫过程中刺激B细胞表达抗原特异性的甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH。（2）4次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100ml并提取总RNA。（3）将提取的RNA反转录成cDNA并利用套式PCR扩增VHH链，结果如图2显示，该片段的大小约为400bP。通过数次免疫新疆双峰驼，我们提取骆驼外周血淋巴细胞总RNA，并反转录合成cDNA，经过两步PCR成功的获得编码纳米抗体的基因，从左到右的DNA条带分别是：第一为100bP的分子Marker，第二纳米抗体基因电泳带约为400bp。（4）使用限制性的内切酶PstI及NotI酶切20μgpComb3噬菌体展示载体（Biovector供应）及10μgVHH并连接两个片段。（5）将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1（北京神州红叶科技有限公司）中，构建甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小为5*108；与此同时，通过菌落PCR检测所建文库的插入率检测结果插入率约95%，图2显示菌落PCR结果。文库构建完成后，为检测文库的插入率，我们随机的选取24颗克隆做菌落PCR。结果显示：只有1颗为空载体，即我们的插入率已达到95%以上。
实施例2：针对甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH筛选过程：
（1）将溶解在100毫摩尔pH8.2NaHCO3中的灭活甲型H1N1流感病毒200微克偶联在NUNC酶标板上，4℃放置过夜，同时设立负对照。（2）第二天两个孔中分别加入100微升0.1%酪蛋白，室温封闭2小时。（3）2小时后，加入100μl噬菌体（8*1011tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库），在室温下作用1小时。(4）用PBST（PBS中含有0.05%吐温20）洗5遍，以洗掉不结合的噬菌体。(5）用三乙基胺（100mM）将与甲型流感病毒H1N1特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3-4轮。在不断地筛选的过程中，阳性的克隆将不断的被富集，从而达到了利用噬菌体展示技术筛取抗体库中甲型流感病毒H1N1特异抗体的目的。该实验的原理模式图如图3所示。
实施例3：用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆：
（1）从上述3-4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于含有100微克每毫升的氨苄青霉素的TB培养基(1升TB培养基中含有2.3克磷酸二氢钾，12.52克磷酸氢二钾，12克蛋白胨，24克酵母提取物，4毫升甘油)中，生长至对数期后，加终浓度1毫摩尔的IPTG，28℃培养过夜。（2）利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1小时。（3）用PBST洗去未结合的抗体，加入一抗mouseanti-HAtagantibody（抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司），在室温下放置1小时。（4）用PBST洗去未结合的抗体，加入anti-mousealkalinephosphataseconjugate（山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司），在室温下放置1小时。（5）用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。（6）当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，判为阳性克隆孔。（7）将阳性克隆孔的菌转摇在含有100微克每毫升的LB液体中以便提取质粒并进行测序。
根据序列比对软件VectorNTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，最终共有5株不同的抗体。其抗体的氨基酸序列分别如SEQIDNO：36、37、38、39或40所示。
实施例4：纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化：
（1）将前面测序分析所获得不同克隆株的质粒电转化到大肠杆菌WK6中，并将其涂布在含有100微克每毫升氨苄青霉素和2%葡萄糖LB固体培养基的板上，37℃过夜，（2）挑选单个菌落接种在15毫升含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜，（3）接种1ml的过夜菌种至330mlTB培养基中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.6-1时，加入IPTG，28℃摇床培养过夜，（4）第二天，离心收菌，（5）将菌体利用渗透法使菌体蛋白释放出来以获得抗体粗提液，（6）经镍柱离子亲和层析纯化抗体蛋白，为获得高纯度的抗体，采用咪唑梯度洗脱法，低浓度咪唑洗脱液（50毫摩尔，100毫摩尔）用于洗去杂带，高浓度咪唑洗脱液（250毫摩尔，500毫摩尔）最终可制备纯度达90%以上的蛋白。图4是表达的针对甲型流感病毒H1N1的#12重链抗体VHH，经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图；其中泳道1是破菌后蛋白总的粗提液样品，泳道2是总的蛋白粗提液过镍柱后的样品，泳道3是含50毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品，泳道4和5是含100毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品，6-7是250毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品，8-11是500毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品；图5是表达的全部5颗针对甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH，其中泳道1是蛋白分子标准，泳道2是甲型流感病毒H1N1-#12重链抗体VHH，泳道3甲型流感病毒H1N1--#51重链抗体VHH，泳道4是甲型流感病毒H1N1--#71重链抗体VHH，泳道5是甲型流感病毒H1N1--#121重链抗体VHH，6是甲型流感病毒H1N1--#125重链抗体VHH。结果显示，纳米抗体经过该纯化后，其纯度可达到95%以上。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCELISTING
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115120125
Claims (6)
1.一种针对甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH，包括框架区FR和互补决定区CDR，其特征在于，所述的框架区FR由四个框架区组成，分别为FRl、FR2、FR3和FR4，它们的氨基酸序列选自以下的氨基酸序列：
FR1为SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，FR2为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，FR3为SEQIDNO.3所示的氨基酸序列，FR4为SEQIDNO.4所示的氨基酸序列；
所述的互补决定区CDR由三个互补决定区组成，分别CDRl、CDR2和CDR3，它们的氨基酸序列选自以下的氨基酸序列：
CDR1为SEQIDNO.21所示的氨基酸序列，CDR2为SEQIDNO.22所示的氨基酸序列，CDR3为SEQIDNO.23所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的针对甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH，其特征在于，它包括SEQIDNO.36所示的氨基酸序列。
3.一种针对甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH，其特征在于，它针对甲型流感病毒H1N1表面抗原的纳米抗体，包括SEQIDNO.36所示氨基酸序列的VHH链。
4.一种DNA分子，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质：权利要求1或2所述的甲型流感病毒H1N1的重链抗体VHH。
5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列：
SEQIDNO.41所示的核苷酸序列。
6.一种表达载体，其特征在于，它含SEQIDNO.41所示的核苷酸序列。
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