CN106928350B

CN106928350B - 一种流感病毒抗体、其制备方法及应用

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Publication number: CN106928350B
Application number: CN201511018278.2A
Authority: CN
Inventors: 高福; 校海霞; 郭天玲; 陈维之; 洪媛媛; 孙中平
Original assignee: Suzhou Jinweizhi Biological Technology Co ltd; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Suzhou Jinweizhi Biological Technology Co ltd; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2035-12-30
Also published as: CN106928350A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种流感病毒抗体，所述流感病毒抗体的轻链可变区具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；所述流感病毒抗体的重链可变区具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明所述抗体能够很好的中和H3N2、H4N6和H14N5亚型的流感病毒，该抗体能结合group 2中的所有亚型的流感病毒的HA蛋白；且所述抗体能够中和H3‑subclade的病毒，抑制H3亚型流感病毒在小鼠体内的复制；所述抗体具有重要的经济和社会意义。

Description

一种流感病毒抗体、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种流感病毒抗体、其制备方法及应用。

背景技术

流感病毒(influenza virus)是引起流行性感冒的人畜共患传染病病原，属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，流感病毒属。按照流感病毒核蛋白和基质蛋白抗原性的不同，流感病毒可分为A、B、C三型。A型流感抗原性变化最频繁，普遍存在于人类和禽类中，带来的危害最大。A型流感根据病毒颗粒表面血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)的不同可分为多个亚型，目前已发现的HA有18个亚型(H1-H18)，NA有11个亚型。18个HA亚型又可进一步划分为group 1和group 2两个组别。

世界上每年都有流感的流行和爆发，给人类的生命安全及经济财产造成巨大的损失。历史上有四次大流感，均是由A型流感病毒引起的。这些大流感造成世界大约30万至5千万的死亡。近年来，仍然不断的有新型流感病毒出现，如2013年的H7N9禽流感跨种传播，由禽到人，到2015年1月，总感染571例，死亡人数达到212人，死亡率达到37.1％。

目前流感的抗病毒治疗药物主要有离子通道抑制剂和神经氨酸酶抑制剂两类。离子通道抑制剂包括金刚烷胺和金刚乙胺及其衍生物。这些药物以A型流感病毒的离子通道蛋白M2为靶标，通过阻断质子的内流，以及阻碍病毒粒子的脱衣壳和基因组释放入细胞质的过程来起到抗流感作用。但是，长期使用金刚胺类药物会出现胃肠道和中枢神经系统的副作用，并且金刚烷胺和金刚乙胺在临床上使用了很长的时间，已出现了非常多的毒力和传播性能均未减弱的耐药毒株。神经氨酸酶抑制剂是以流感病毒的神经氨酸酶NA为靶标，针对病毒粒子释放过程的抗病毒药物。市场上已有治疗流感的神经氨酸酶抑制剂包括扎那米韦和奥司他韦，对感染流感早期病人提供较好的治疗效果。然而治疗后的病人容易对神经氨酸酶抑制剂产生耐药性，有些病人在没有使用治疗的情况下也会对其产生耐药性。

HA是流感表面的保护性抗原，针对HA抗体的研究由来已久。抗体的筛选技术目前有很多种，筛选出来的抗体根据结合在HA的近膜区和远膜区的不同，可以分为两种，一种是结合在HA头部远膜区的抗体，抑制了HA结合细胞表面的唾液酸连接的受体，从而抑制了病毒通过内吞的方式进入细胞。一种是结合在HA近膜区的抗体，有效的抑制了HA蛋白的膜融合活性。

HA头部区的抗体分为两种，一种是结合在受体结合位点的抗体，另一种是结合在受体结合位点旁边不同于受体结合位点的区域，如2015年最新研究出来的能够中和H5亚型流感病毒的抗体H5.3和FLD194。H5.3主要通过所有的CDR区结合H5的受体结合位点及周边区域，而FLD194主要通过5个CDR区结合在受体结合位点旁边不同于受体结合位点，它主要是通过抗体IgG形式的Fc区域的位阻作用阻碍了受体识别。

HA茎部区相对于头部区更为保守，针对HA茎部区的抗体一般为广谱中和抗体，能够中和多个的亚型的HA。所以针对该区域抗体的研究更受青睐。目前已经筛选出多种针对HA茎部区的广谱中和抗体。如筛选出的小鼠单克隆抗体C179可中和group1的A型流感病毒，人源抗体CR8020可中和group2的A型流感病毒，人源抗体CT149可中和部分group1和group2的A型流感病毒，而人源抗体FI6v3则是可中和大多数A型流感病毒的超级广谱抗体。这些抗体的共同点是识别和结合HA茎部区的保守表位，可抑制流感病毒的HA在低pH下诱导的构象变化过程。这些抗体在小鼠或者雪貂的体内预防和治疗都能产生保护效果。

新一代测序和生物信息分析技术的发展将抗体基因组学的研究带入了全新的高通量时代，使得抗体库深度测序成为可能，从而对抗体基因多样性研究、自身免疫病研究、恶性B细胞白血病检测等多个研究领域都起到了促进作用。用高通量DNA序列分析取代传统意义上的人工筛选，整个过程时间缩减到传统筛选方法的三分之一以内，得到的信息量却是传统单克隆抗体制备的万倍以上。此基因组单抗技术摆脱了对以小鼠为主的实验动物的依赖，也不再受限于特定的抗原免疫过程，使我们能够从各种动物的免疫系统中筛选单抗；其中全人源抗体完全避免了鼠源抗体人源化的开发过程，为抗体药物的研发提供一个捷径。CN 102732974 A公开了一种构建高度多样性的大容量天然人源Fab噬菌体抗体库的方法，采用DNA重组技术从15位健康志愿者外周血淋巴细胞中扩增出全套人抗体轻链和重链可变区基因，分别插入噬菌体载体PFK-1，PFL-6相应的位置，建立高容量、高多样性的天然人源Fab噬菌体抗体库。但该方法需要建立抗体库，不适用于对于流感病毒的抗体的制备。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种流感病毒抗体、其制备方法及应用，所述流感病毒抗体为流感的预防和治疗提供了新的治疗方法，具有重要的经济和社会意义。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种流感病毒抗体，所述流感病毒抗体的轻链可变区具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；所述流感病毒抗体的重链可变区具有 SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

所述的氨基酸序列如下：

SEQ ID No.1：

DIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYRASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSFTFGQGTKVEIK；

SEQ ID No.2：

QVQLVESGGGVVQPGTSLRLSCEASGFTSSAYAMHWVRQAPGKGLEWVAVITFDGGYQYYADSVKGRFTISRDISRNTLHLHMNSLRAEDTAVYYCARDPLTKLLPFDWVSGGYFDYWGQGTLVTVSS。

优选地，所述流感病毒抗体的轻链抗原互补决定区具有SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6和SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；所述流感病毒抗体的重链抗原互补决定区具有SEQID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的氨基酸序列。

所述的氨基酸序列如下：

SEQ ID No.5：QSVSSSY；

SEQ ID No.6：RAS；

SEQ ID No.7：QQYGSSFT。

SEQ ID No.8：GFTSSAYA；

SEQ ID No.9：ITFDGGYQ；

SEQ ID No.10：ARDPLTKLLPFDWVSGGYFDY。

优选地，所述流感病毒抗体的轻链的C端带有4-8个HIS标签，优选为6个HIS标签。

第二方面，本发明提供一种编码如第一方面所述流感病毒抗体的DNA片段，其轻链可变区具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，重链可变区具有SEQ ID No.4的核苷酸序列。

所述的核苷酸序列如下：

SEQ ID No.3：

gacatcgtgatgacacagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatcgtgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatggtagctcgttcactttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa；

SEQ ID No.4：

caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggacgtccctgagactctcctgtgaagcctctggattcacctccagtgcctatgctatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggcctagagtgggtggcagttataacatttgatggaggttatcaatactacgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacatttccaggaacactcttcacctgcacatgaacagcctgagagctgaggacacggctgtttattactgtgcgagagatcccctaacaaagttactgccttttgactgggtctctggggggtactttgactactggggccagggaactctggtcaccgtctcctca。

第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含至少一个拷贝的如第二方面所述的DNA片段。

第四方面，本发明提供一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如第三方面所述的表达载体。

第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的流感病毒抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)分离感染者外周血中的PBMC，提取RNA，反转录cDNA；

(2)扩增重链和轻链的高度可变区序列，根据CDR丰度进行挑选并合成；

(3)将合成的抗体片段构建到表达载体中。

优选地，步骤(3)所述的载体为哺乳动物表达载体，优选为pCAGGS哺乳动物表达载体。

第六方面，本发明提供如第一方面所述的流感病毒抗体，或如第二方面所述的流感病毒抗体的DNA片段，或如第三方面所述的表达载体，或如第四方面所述的宿主细胞在制备抑制流感病毒的药物中的应用。

第七方面，本发明提供如第一方面所述的流感病毒抗体在制备对流感病毒的HA抗原多种亚型具有亲和力和中和活性的试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明所述抗体能够很好的中和H3N2、H4N6和H14N5亚型的流感病毒，该抗体能结合group 2中的所有亚型的流感病毒的HA蛋白；

(2)本发明所述抗体能够中和H3-subclade流感病毒，抑制H3亚型流感病毒在体内的复制；

(3)本发明所述抗体的获得为流感的预防和治疗提供了新的候选，具有重要的经济和社会意义。

附图说明

图1是本发明制备的抗体的IgG和Fab经SuperdexTM20010/300GL分子筛层析纯化结果；

图2是本发明体外免疫荧光检测AF4H1K1结合病毒感染后的表面抗原蛋白的结果图；其中，a-l的感染细胞的流感病毒依次为H3_{(A/Aichi/2/1968)}/PR8H3N1(PR8-RS)，A/Jiangxi/262/2005H3N2，A/Beijing-Huairou/11787/2014H3N2，H4_{(A/duck/Czech/1956)}/PR8H4N1(PR8-RS)，A/Anhui/1/2013(inter-species)-RS H7N9，A/Jiangxi-Donghu/346/2013H10N8，A/mallard duck/Astrakhan/263/1982H14N5，A/duck/Australia/341/1983H15N8，A/PuertoRico/8/1934H1N1，A/environment/Guangdong/2/2009H2N3，A/bar-headed goose/Qinghai/1/2005H5N1，A/Chicken/Beijing/2/1997H9N2；

图3(a)为本发明AF4H1K1抑制A/Jiangxi/262/2005H3N2感染的细胞形成合胞体，图3(b)为没有孵育抗体的细胞；

图4为本发明AF4H1K1抑制HA的裂解及构象变化，其中，图4(a)不同比例下AF4H1K1抑制HA被酶切的结果图；图4(b)不同pH下AF4H1K1抑制HA构象发生变化的结果图；

图5为本发明抗体在BALB/c体内预防效力评估，其中，图5(a)为攻毒后3天后的预防效力；图5(b)为攻毒后5天后的预防效力；

图6为本发明抗原抗体复合物结构解析，其中，图6(a)本发明抗体重链和轻链与H4HA和H3HA的复合物结构图；图6(b)本发明抗体重链可变区与H3的复合物结构图；图6(c)本发明抗体重链可变区与H4的复合物结构图；图6(d)本发明抗体轻链可变区与H3的复合物局部结构图；图6(e)本发明抗体轻链可变区与H4的复合物局部结构图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1抗体的制备和纯化

所述的流感病毒抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)分离感染者外周血中的PBMC，提取RNA，反转录cDNA；

(2)扩增出重链和轻链的高度可变区序列，将扩增的目的片段利用Miseq 2X300bp进行测序，并对测序结果进行分析；

(3)以CDR丰度为主要参数挑选感染患者的高频可变区序列，并通过重链轻链配对算法计算自然配对的几率，接着挑选出CDR1、CDR2和CDR3的高频出现的VH和VL序列加上各自的恒定区进行合成；

所述VL的核苷酸序列为：gacatcgtgatgacacagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatcgtgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatggtagctcgttcactttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa；

所述VH的核苷酸序列为：caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggacgtccctgagactctcctgtgaagcctctggattcacctccagtgcctatgctatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggcctagagtgggtggcagttataacatttgatggaggttatcaatactacgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacatttccaggaacactcttcacctgcacatgaacagcctgagagctgaggacacggctgtttattactgtgcgagagatcccctaacaaagttactgccttttgactgggtctctggggggtactttgactactggggccagggaactctggtcaccgtctcctca。

(4)以IgG和Fab形式，在N端加入对应的重链和轻链的分泌信号肽后，将抗体片段构建到pCAGGS哺乳动物表达载体；

(5)将插入重链和轻链序列的pCAGGS表达载体，通过PEI转染试剂共转染293T细胞进行大量表达，并进行纯化。

(6)纯化具体步骤：在转染后96h后收获上清，5000rpm，离心1h，上清经过0.22μM的滤膜过滤，蠕动泵过夜将上清结合HisTrap^TMHP 5mL预装柱或Protein A预装柱，AKTA机器上洗脱目的蛋白(Buffer 110mM Tris，40Mm NaCl，20mM咪唑洗脱杂蛋白，Buffer 210mMTris，40mM NaCl，300mM咪唑与Buffer 1拉梯度洗脱目的蛋白)，若用Protein A预装柱则用0.1M的甘氨酸洗脱结合在Protein A上面的IgG蛋白，洗脱的蛋白浓缩换buffer(10mMTris，40mM NaCl)后，经过Superdex^TM20010/300GL分子筛进一步纯化，纯化后的抗体命名为AF4H1K1。

纯化结果如图1所示，可见，通过纯化后都能得到单一所要抗体的IgG或Fab的形式。

实施例2抗原抗体亲和力测试

利用表面等离子共振技术，将AF4H1K1的Fab(10μg/mL)形式通过氨基偶联的作用固定到CM5芯片上，固定值达到500RU，流动相抗原蛋白HA按2倍比稀释。选取KINJECT模式进行动力学参数测定，机器流速30μL/min，进样时间1-2min，解离时间2-6min，利用两个蛋白的结合或解离造成金属表面的分子质量不同而引起折射率的变化，计算出亲和力大小，结果如表1所示。

表1 AF4H1K1Fab与各种亚型流感病毒HA的亲和力测定

从表1可以看出，AF4H1K1与group 2中各个亚型HA结合解离模式几乎都是慢结合慢解离，亲和力大小在4pM-49nM之间，只有同H15HA的结合是1.8μM。

实施例3抗体的中和实验

准备好汇合度达到90％的96孔板MDCK细胞后准备抗体和病毒。首先，将抗体进行2倍倍比稀释，而后加入等体积的200个TCID₅₀的流感病毒，将流感病毒与抗体混匀后置于37℃，作用1h。然后将抗体-病毒混合物按每孔100μL的量加入已经用PBS洗过两遍的96孔板MDCK细胞中，每个抗体稀释度设置3个复孔。加入有抗体-病毒混合物的96孔板放入37℃，5％CO₂培养箱培养1h，PBS洗一次，每孔加入含有2.5μg/mL终浓度的胰酶的无血清DMEM培养基100μL，37℃，5％CO₂培养，每天观察细胞病变，并在感染3天后测定每孔的血凝活性，结合每孔的细胞病变来判定是否有病毒感染，利用Graphpad软件的Nonlinear regression方式算出IC₅₀，结果如表2所示。

表2 AF4H1K1IgG与不同亚型流感病毒的中和滴度测定

从表2可以看出，制备的AF4H1K1能够中和group2中的H3clade的H3、H4和H14亚型流感病毒。

实施例4抗体结合病毒感染细胞的表面蛋白HA

将100TCID₅₀流感病毒感染底部加入盖玻片的48孔板的MDCK细胞，8h后用含2.5μg/mL终浓度的胰酶的无血清DMEM培养基处理细胞10min，200μL/孔。中间观察细胞不脱落，随后每孔100μL加入FBS终止胰酶反应，无血清DMEM洗3遍后加入待检测抗体，40μg/mL终浓度每孔加入100μL。48孔板置于37℃，5％CO₂培养1h后，PBS洗一遍后3.7％的甲醛固定15min。PBS洗两次，每次5min。0.2％X-triton 100处理2min，立即用PBS洗三遍。然后每孔加入终浓度为1μg/mL的α-NP鼠抗100μL，室温放置1h后，PBS洗三遍。按1:1000比例加入FITC标记山羊抗人二抗和Alexa Fluor 555标记驴抗鼠二抗，同时按1:10加入DAPI染料，室温孵育1h，随后PBS洗三遍，用荧光淬灭剂封片，激光共聚焦显微镜拍照，结果如图2所示。

FITC标记的山羊抗人的二抗将结合在病毒感染细胞表面的HA的AF4H1K1标记在第一列能明显看到一圈特异性的光亮，555标记的驴抗鼠的二抗标记抗流感病毒NP的鼠抗，为第二列，DAPI能将细胞核特异性的显示出来。通过体外免疫荧光实验我们能够清楚的看出AF4H1K1的抗体是否能够结合在病毒感染细胞表面的HA抗原上。从图2中可以看出AF4H1K1能够与group 2中的H3、H4、H7、H10、H14和H15等亚型病毒感染细胞表面的HA蛋白结合，而与group 1中的H1、H2、H5和H9等亚型病毒感染细胞表面的HA蛋白没有结合活性。

实施例5抗体抑制病毒感染细胞形成合胞体

100TCID₅₀病毒感染底部加入盖玻片的48孔板的BHK21细胞，6h后用含 2.5μg/mL终浓度的胰酶的无血清DMEM培养基处理细胞10min，200μL/孔。中间观察细胞不脱落，随后每孔100μL加入FBS终止胰酶反应，无血清DMEM洗3遍后加入待检测抗体，40μg/mL终浓度每孔加入100μL。48孔板置于37℃，5％CO₂培养1h后，用pH 5.0的buffer洗一遍，然后每孔加入500μL pH5.0的buffer处理5min，立即移去所有液体，含2％FBS的DMEM洗一遍后，每孔加入1mL的含有10％FBS的DMEM，37℃，5％CO₂孵育1h，然后用PBS洗一遍，3.7％甲醛固定20min，激光共聚焦显微镜观察，结果如图3(a)和图3(b)所示。

从图3(a)和图3(b)可以看出，BHK21细胞感染A/Jiangxi/262/2005H3N2流感病毒后8h，细胞用TPCK胰酶裂解HA，然后孵育上AF4H1K1的抗体(40μg/mL)1h，再在pH 5.0的buffer下孵育1h，相比较没有孵育抗体的细胞，孵育有抗体的细胞抑制了pH 5.0条件下膜融合的发生，从而抑制了合胞体的形成。

实施例6抗体抑制HA的裂解及构象变化

将未裂解的HA蛋白(HA0)与待检测抗体按摩尔比1:0、1:0.5、1:1、1:2和1:3混合后置于37℃，40min。然后加入终浓度5μg/mL的胰酶，置于37℃酶切15min后，加入适量loadingbuffer，95℃，5min。利用SDS-PAGE还原胶分析，结果如图4(a)所示。

将TPCK处理过的胰酶按5μg/mg的浓度加入为裂解的HA蛋白中，4℃酶切过夜后，过凝胶层析柱进一步提纯蛋白。然后将其与待检测抗体按摩尔比1:1孵育，置于4℃，4h后，用醋酸钠(w:v＝8:5，pH 4.68)调pH至5.0，置于37℃，1h。用200mM Tris(pH 8.0)调pH至7.4。然后加入20μg/mL终浓度胰酶，4℃酶切4h后，加入适量loading buffer，95℃，5min。跑SDS-PAGE非还原胶分析，结果如图4(b)所示。

对于病毒的吸附，膜融合是释放病毒基因组到宿主细胞中开始病毒复制的必不可少的一步。而由HA1和HA2通过二硫键连接的HA0前导体被裂解是激活膜融合发生的前提。在融合pH条件下，被裂解的HA蛋白会发生不可逆的构象变化。经胰酶消化后产物包括HA2及HA1在K27和R224位被裂解的部分。通过酶切试验验证抗体AF4H1K1能够抑制HA被裂解，同时发现裂解的HA与抗体AF4H1K1孵育后在低pH条件下，能够抑制构象变化。图4(a)可以看出，除H15蛋白外，H3、H4、H14随着抗体浓度的增加HA0的条带越来越强，表明AF4H1K1能够抑制胰酶对HA0的切割。图4(b)发现低pH条件下，HA1的部分不能在SDS-PAGE上显现出来，而在抗体与抗原蛋白按1:1摩尔比孵育后，再用pH 5.0处理后，胰酶消化，H3、H4、H14仍然保留部分HA1，可见，AF4H1K1能够抑制HA在低pH值发生的构象变化。

实施例7体内抗体预防效果

(1)病毒小鼠半数感染量(MID₅₀)的测定

将重组病毒A/Aichi/2/1968H3N1-RG(HA基因片段来自于A/Aichi/2/1968H3N2，其他7个基因片段来自于A/PR/8/1934H1N1)按10倍倍比稀释6个梯度，将这6个梯度以及原液通过滴鼻的方式(每只小鼠50μl)分别感染20只6周龄的雌性BALB/c小鼠，5只用来检测感染后三天肺中病毒滴度，5只用来检测感染后五天肺中的病毒滴度，剩下10只用来观察感染后14天小鼠的体重变化及生存率。用Reed-Muench方法计算小鼠的MID₅₀。

(2)预防实验

通过小鼠尾静脉注射抗体AF4H1K1，剂量分别为15mg/kg、10mg/kg、3mg/kg和1mg/kg；同时设定埃博拉病毒中和抗体13C6为阴性对照。24h后干冰麻醉小鼠，而后滴鼻感染50MID₅₀的病毒。每组20只，其中5只用来检测感染后三天肺中病毒滴度，5只用来检测感染后五天肺中的病毒滴度，剩下10只用来观察感染后14天内小鼠的体重变化及生存率。

(3)肺中病毒滴度的测定

将小鼠用1μl的枪头固定在泡沫盒上，表面喷上酒精，酒精棉擦拭后解剖小鼠，取肺放入2ml EP管中。在装有肺的2ml EP管中加入1ml无血清DMEM培养基，匀浆机磨成匀浆后，2000rpm，4℃，10min离心取上清至于一个干净的2ml EP管中。将MDCK在前一天按1:3传代，分入96孔板，培养12h-24h，待细胞单层长满后，用PBS洗两次。将肺匀浆后离心，取上请，按10倍倍比稀释后加入PBS洗两次的MDCK细胞，每孔100μl，每个梯度3个复孔。37℃，5％CO2培养箱培养72h，每天观察细胞病变，并与第三天测定血凝实验结果，用Reed-Muench方法计算肺的TCID₅₀，结果如图5(a)和图5(b)所示。

对于体内保护研究，我们选择A/Aichi/2/1968H3N1-RG作为group2HA亚型的代表毒株。6周龄雌性BALB/c(每组15只，共五组)尾静脉注射15mg/kg、10mg/kg、3mg/kg、1mg/kg的AF4H1K1和15mg/kg 13C6(Eloba病毒抗体，用来作为阴性对照)。抗体注射24h后滴鼻感染50MID₅₀的A/Aichi/2/1968H3N1-RG。感染后三天及五天采肺，研磨后，离心，取上清，做不同稀释后感染MDCK细胞，图5(a)和5(b)看出，从MDCK细胞病变我们可以看出当抗体量达到15mg/kg时，能够中和小鼠体内部分病毒，抑制病毒在小鼠体内的复制，差异极其显著(P<0.001)。

实施例8抗体结合后的抗原抗体复合物的晶体结构

将经过HisTrapTM HP 5mL预装柱，MonoQTM 4.6/100PE及SuperdexTM 20010/300GL纯化的HA蛋白与纯化的待检测的Fab形式的AF4H1K1抗体按摩尔比1:1混合后，置于4℃过夜，经过SuperdexTM 20010/300GL column纯化(buffer是20mM Tris，50mM NaCl，pH8.0)后，通过观察出峰位置的迁移及SDS-PAGE收集抗原抗体结合的管数。超滤浓缩管浓缩至5-10mg/mL，采用坐滴液相扩散法，用Hampton Research公司的PEGRx 1、PEGRx 2等和moleculardimensions公司的ProPlex、MacroSol等结晶试剂盒筛选蛋白结晶条件。将1μL蛋白与1μL池液混合，与180μL池液进行气相平衡，静置于18℃晶体培养间。

蛋白晶体X射线衍射数据在上海同步辐射光源BL17U生物大分子晶体学光束线站或者日本KEK高能物理加速器机构的生物大分子同步辐射站收集。

68H3与AF4H1K1的复合物按5mg/mL的浓度点晶体，在18℃环境下，在PEGRx 2的9号条件(0.19mM

-7，0.1M HEPES pH 7.5，40％v/v Ployethylene glycol 400)长出方形晶体，分辨率达到

从结构上看出该抗体的主要是通过重链结合在HA的茎部区。

H4与AF4H1K1的复合物按5mg/mL的浓度点晶体，在18℃环境下，(0.2M Potassiumsodium tartrate tetrahydrate，0.1M Bis-tris pH 6.5，10％w/v Polyethylene glycol10,000)条件下长出条形晶体，分辨率达到

从结构图中，图6(a)看出不管是68H3/AF4H1K1还是H4/AF4H1K1，AF4H1K1主要是通过重链结合在HA的茎部区。图6(b)和图6(c)看出68H3/AF4H1K1复合物结构中HCDR2与糖链有相互作用，HCDR3结合已知的茎部保守区，而HCDR1和HFR3与退化的酯酶区的下部有相互作用。图6(d)和图6(e)看出抗体结合的氨基酸大部分为重链，轻链的作用比较小，主要是通过LCDR1区域中的Ser30、Ser31和Tyr33与HA中的HA2上的Gln42、Asp46 有相互作用。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种流感病毒抗体，其特征在于，所述流感病毒抗体的轻链可变区为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；所述流感病毒抗体的重链可变区为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的流感病毒抗体，其特征在于，所述流感病毒抗体的轻链抗原互补决定区为SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；所述流感病毒抗体的重链抗原互补决定区为SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的流感病毒抗体，其特征在于，所述流感病毒抗体的轻链的C端带有4-8个HIS标签。

4.根据权利要求3所述的流感病毒抗体，其特征在于，所述流感病毒抗体的轻链的C端带有6个HIS标签。

5.一种编码如权利要求1所述流感病毒抗体的DNA片段，其特征在于，其编码轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.3，编码重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.4。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含至少一个拷贝的如权利要求5所述的DNA片段。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求6所述的表达载体。

8.如权利要求1-4中任一项所述的流感病毒抗体，或如权利要求5所述的流感病毒抗体的DNA片段，或如权利要求6所述的表达载体，或如权利要求7所述的宿主细胞在制备抑制A型流感病毒的药物中的应用。

9.如权利要求1-4中任一项所述的流感病毒抗体在制备对A型流感病毒的HA抗原多种亚型具有亲和力和中和活性的试剂中的应用。