CN103030693B - 高致病性禽流感的中和分子及其制备方法 - Google Patents
高致病性禽流感的中和分子及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103030693B CN103030693B CN201210376959.6A CN201210376959A CN103030693B CN 103030693 B CN103030693 B CN 103030693B CN 201210376959 A CN201210376959 A CN 201210376959A CN 103030693 B CN103030693 B CN 103030693B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- binding molecule
- virus
- light chain
- avian influenza
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 title claims abstract description 39
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 title claims abstract description 33
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 title abstract description 42
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 145
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims abstract description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 75
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 37
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 33
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 26
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 21
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- 108700020490 Drosophila S Proteins 0.000 claims description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 10
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 10
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 9
- -1 alkane amine Chemical class 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 7
- 229940123424 Neuraminidase inhibitor Drugs 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- VSZGPKBBMSAYNT-RRFJBIMHSA-N oseltamivir Chemical compound CCOC(=O)C1=C[C@@H](OC(CC)CC)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](N)C1 VSZGPKBBMSAYNT-RRFJBIMHSA-N 0.000 claims description 5
- 229960003752 oseltamivir Drugs 0.000 claims description 5
- 238000012797 qualification Methods 0.000 claims description 5
- 239000002911 sialidase inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- DKNWSYNQZKUICI-UHFFFAOYSA-N amantadine Chemical compound C1C(C2)CC3CC2CC1(N)C3 DKNWSYNQZKUICI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- PGZUMBJQJWIWGJ-ONAKXNSWSA-N oseltamivir phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.CCOC(=O)C1=C[C@@H](OC(CC)CC)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](N)C1 PGZUMBJQJWIWGJ-ONAKXNSWSA-N 0.000 claims description 4
- 229940061367 tamiflu Drugs 0.000 claims description 4
- UBCHPRBFMUDMNC-UHFFFAOYSA-N 1-(1-adamantyl)ethanamine Chemical compound C1C(C2)CC3CC2CC1(C(N)C)C3 UBCHPRBFMUDMNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960003805 amantadine Drugs 0.000 claims description 3
- 229960000888 rimantadine Drugs 0.000 claims description 3
- 229960001028 zanamivir Drugs 0.000 claims description 3
- ARAIBEBZBOPLMB-UFGQHTETSA-N zanamivir Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)C=C(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO ARAIBEBZBOPLMB-UFGQHTETSA-N 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 45
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 abstract description 8
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 abstract description 8
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 abstract description 8
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 abstract description 8
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 abstract description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 105
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 66
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 64
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 58
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 58
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 46
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 37
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 29
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 29
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 29
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 29
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 29
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 29
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 29
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 26
- 230000008859 change Effects 0.000 description 25
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 24
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 23
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 23
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 17
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 14
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 13
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 11
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 11
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 239000005723 virus inoculator Substances 0.000 description 9
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 7
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 5
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 5
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 5
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 5
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 5
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 5
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 210000001806 memory b lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 4
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 4
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 4
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 4
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 4
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 4
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 4
- 210000003456 pulmonary alveoli Anatomy 0.000 description 4
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 3
- 206010020565 Hyperaemia Diseases 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 241000282341 Mustela putorius furo Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- BQINXKOTJQCISL-GRCPKETISA-N keto-neuraminic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)C[C@H](O)[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO BQINXKOTJQCISL-GRCPKETISA-N 0.000 description 3
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 3
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 3
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 3
- 238000013456 study Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 208000034657 Convalescence Diseases 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006035 Tryptophane Substances 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 2
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical group NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000913232 Anser fabalis Species 0.000 description 1
- 241000272813 Anser indicus Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000432824 Asparagus densiflorus Species 0.000 description 1
- 241001415825 Bubo bubo Species 0.000 description 1
- 102000016362 Catenins Human genes 0.000 description 1
- 108010067316 Catenins Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 229910021555 Chromium Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 206010011831 Cytomegalovirus infection Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 239000004278 EU approved seasoning Substances 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241001072915 Hypsipetes leucocephalus Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001020297 Lonchura atricapilla Species 0.000 description 1
- 241000920471 Lucilia caesar Species 0.000 description 1
- 206010025327 Lymphopenia Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 241000272157 Nycticorax nycticorax Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 206010068676 Pneumoretroperitoneum Diseases 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000005727 Retropneumoperitoneum Diseases 0.000 description 1
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004141 Sodium laurylsulphate Substances 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 1
- 240000006474 Theobroma bicolor Species 0.000 description 1
- 231100000768 Toxicity label Toxicity 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 1
- 241000557601 Urocissa erythrorhyncha Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003667 anti-reflective effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- QSWDMMVNRMROPK-UHFFFAOYSA-K chromium(3+) trichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cr+3] QSWDMMVNRMROPK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001761 ethyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010944 ethyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 231100001023 lymphopenia Toxicity 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008288 physiological mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Natural products CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008866 synergistic binding Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明涉及高致病性禽流感的中和分子及其制备方法。公开了新的抗禽流感病毒的中和分子，所述的中和分子对于禽流感病毒具有良好的中和作用；还公开了所述结合分子在禽流感病毒血球凝集素上的结合位点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和免疫学领域；更具体地，本发明涉及高致病性禽流感的中和分子及其制备方法。
背景技术
自1997年以来高致病性禽流感H5N1病毒已感染了约5亿只禽类，同时在亚洲、欧洲和非洲已有越来越多的人被感染。虽然，目前为止人类的感染都是由禽类传播的，但H5N1病毒经过重组和进化可能演变出来具有人传人能力的新的病毒株。这种新病毒的广泛蔓延加之人们对H5N1病毒缺少预成的免疫力将会对人类造成重大的发病率和死亡率。
感染了高致病性禽流感H5N1病毒的主要表现是严重的肺炎、淋巴细胞减少、高淋巴因子血症及呼吸道的高病毒载量2-6。病毒通常可以从患者的脑脊液、粪便、痰液和血清样本中培养出来。目前对此病的治疗主要是依靠抗病毒药物，但一些H5N1病毒株可以对三环癸胺类离子通道阻滞剂药物产生耐药性7。虽然奥塞米韦等神经氨酸抑制剂对季节性流感有一定的疗效但对于H5N1病毒的效果还存在争议。动物实验表明神经氨酸抑制剂药物的疗效只有在感染前或感染后瞬间给药才能发挥疗效2，且H5N1病毒对奥塞米韦等神经氨酸抑制剂类药物也可产生耐药性8。因此寻找能有效的治疗禽流感和控制禽流感在人类中传播的方法是急需的。
应用单克隆抗体和多克隆抗体的抗体疗法已有效的应用于甲肝、乙肝、狂犬病、水痘及巨细胞病毒感染等多种疾病的治疗9。婴儿通过后天的抗体免疫也可获得针对流感病毒的免疫力10-13。从1918年西班牙流感大流行的幸存者体内所分离得到的单克隆抗体可以有效的将流感的死亡率降低50%14。输入感染过H5N1的康复病人的血浆可以有效的降低H5N1病毒感染病人的病毒载量并可以完全康复15。将免疫小鼠、雪貂、马和人获得的流感抗体打入小鼠体内可以有效的预防和治疗流感16-25。最近，Koudstaal等人发现小鼠单次注射15毫克/公斤的人单克隆抗体CR6261比感染后连续5天注射10毫克/公斤/天的奥塞米韦更能有效预防和治疗致命的H5N1和H1N1感染 26。因此，应用被动免疫获得的抗体治疗高致病性禽流感H5N1病毒人类感染性疾病将是一种有效可行的方法。
血凝素基因(HA)是禽流感病毒基因组中变异最大的基因。从HA的序列方面看，自2000来有10个H5HA的分支在不同的物种中出现27。其中分支2又可分为5亚分支。亚分支2.3又可分为2.3.1、2.3.2、2.3.3和2.3.4四个亚亚分支28。目前为止感染人类的高致病性禽流感H5N1病毒分为0、1、2和7分支，在中国比较流行的感染 人的高致病性禽流感H5N1病毒属于2.3.4亚亚分支27，28。此外，在东南亚和东亚感染家禽和鸟类的高致病性禽流感H5N1病毒也属于2.3.4亚亚分支29。研究显示，在人类H5HA至少有四种不同的抗原30。
此外，流感病毒通过其遗传漂移和重组来逃逸免疫监视的特性使其一直以来是公共卫生健康的重大威胁，导致临床上常用的两类抗病毒药物对其效果都不是很理想，且有耐药株出现，因此寻找新的有效的治疗方法是急需的。
综上，鉴于禽流感的高变异性，寻找对尽可能多的禽流感变异病毒株均具有良好的中和能力的中和分子是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供高致病性禽流感的中和分子及其制备方法。
在本发明的第一方面，提供一种结合分子，其识别禽流感病毒的血球凝集素HA1，并结合于血球凝集素N端区域上的表位上，该表位包含以下位点：
血球凝集素氨基酸序列第121位的Ser；和
血球凝集素氨基酸序列第162位的Arg。
在另一优选例中，所述的表位还包含以下位点：
血球凝集素氨基酸序列第117位的Ile；
血球凝集素氨基酸序列第118位的Pro；
血球凝集素氨基酸序列第161位的Lys；
血球凝集素氨基酸序列第164位的Tyr；或
血球凝集素氨基酸序列第167位的Thr。
在另一优选例中，所述的N端区域是血球凝集素氨基酸序列第51～260位氨基酸区域。
在另一优选例中，所述结合分子(例如65C6或其类似物)包含SEQ ID NO:7所示的重链CDR1，SEQ ID NO:8所示的重链CDR2，SEQ ID NO:9所示的重链CDR3。
在另一优选例中，所述结合分子(例如65C6或其类似物)包含SEQ ID NO:10所示的轻链CDR1，SEQ ID NO:11所示的轻链CDR2，SEQ ID NO:12所示的轻链CDR3。
在另一优选例中，所述结合分子(例如65C6或其类似物)包含SEQ ID NO:7所示的重链CDR1，SEQ ID NO:8所示的重链CDR2，SEQ ID NO:9所示的重链CDR3；以及SEQ ID NO:10所示的轻链CDR1，SEQ ID NO:11所示的轻链CDR2，SEQ ID NO:12所示的轻链CDR3。
在另一优选例中，所述的结合分子(例如65C6或其类似物)包含重链可变区，该重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的结合分子(例如65C6或其类似物)包含轻链可变区，该轻链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的结合分子(例如65C6或其类似物)包含：
重链可变区，该重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；以及
轻链可变区，该轻链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述结合分子包含SEQ ID NO:13所示的重链CDR1，SEQ ID NO:14所示的重链CDR2，SEQ ID NO:15所示的重链CDR3；和/或
包含SEQ ID NO:16所示的轻链CDR1，SEQ ID NO:17所示的轻链CDR2，SEQ ID NO:18所示的轻链CDR3。
在另一优选例中，所述的结合分子(例如100F4或其类似物)包含重链可变区，该重链可变区具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的结合分子(例如100F4或其类似物)包含轻链可变区，该轻链可变区具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的结合分子包含：
重链可变区，该重链可变区具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；以及
轻链可变区，该轻链可变区具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述结合分子包含SEQ ID NO:19所示的重链CDR1，SEQ ID NO:20所示的重链CDR2，SEQ ID NO:21所示的重链CDR3；和/或
包含SEQ ID NO:22所示的轻链CDR1，SEQ ID NO:23所示的轻链CDR2，SEQ ID NO:24所示的轻链CDR3。
在另一优选例中，所述的结合分子(例如3C11或其类似物)包含重链可变区，该重链可变区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的结合分子(例如3C11或其类似物)包含轻链可变区，该轻链可变区具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的结合分子包含：重链可变区，该重链可变区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的结合分子是人单克隆抗体、Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体；优选的，所述的结合分子是人单克隆抗体；更优选的，所述的人单克隆抗体其重链恒定区选择下组中重链类型之一的恒定区：IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3，和其轻链恒定区选择下组轻链类型的恒定区之一：κ链和λ链；更优选的，所述的人单克隆抗体其重链恒定区和轻链恒定区分别具有Genebank号ACK87036和ACK87038所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，在所述结合分子的重链或轻链中，所述的CDR1、CDR2和CDR3区从氨基酸至羧基端依次串联排列。
在另一优选例中，所述的CDR1之前，CDR1与CDR2之间，CDR2与CDR3区之 间，CDR3之后，还包括框架区；较佳地，所述的框架区的氨基酸长度为6-40个；较佳地8-35个；更佳地10-32个。
在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，它编码前面任一所述的结合分子。
在本发明的另一方面，提供一种表达载体，所述表达载体中含有：
编码前面任一所述的结合分子的重链的多核苷酸；和/或
编码前面任一所述的结合分子的轻链的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有所述的表达载体；或其基因组中整合有所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞是果蝇S2细胞。
在本发明的另一方面，提供一种制备前面任一所述的结合分子的方法，所述方法包括：培养前面所述的宿主细胞，从而表达所述的结合分子。
在本发明的另一方面，提供所述的结合分子的用途，用于制备预防、缓解或治疗禽流感病毒感染的组合物(如药物)。
在另一优选例中，所述的禽流感病毒是H5亚型的病毒。
在另一优选例中，所述的禽流感病毒是H5N1病毒。
在另一优选例中，所述的禽流感病毒是除H5N1的7.2分支外的H5亚型的病毒；较佳地为除H5N1的7.2分支外的H5N1病毒。
在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，它含有有效量的前面所述的结合分子，以及药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物还含有有效量的其它抗流感药物，选自：烷胺类药物或流感病毒神经氨酸酶抑制剂。
在另一优选例中，所述的烷胺类药物包括金刚烷胺或金刚乙胺；或所述的流感病毒神经氨酸酶抑制剂包括：奥司他韦或扎那米韦。
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的结合分子的用途，用于制备鉴定禽流感病毒的试剂或试剂盒。
在本发明的另一方面，提供一种预防、缓解或治疗禽流感病毒感染的方法，所述的方法包括给予患者有效量的前面任一所述的结合分子。
在本发明的另一方面，提供一种鉴定禽流感病毒的方法，所述方法包括：将前面任一所述的结合分子与待检测样品接触，观察所述的结合分子与待检测样品的结合情况，若所述的结合分子与待检测样品发生结合，则该样品中存在禽流感病毒。
在本发明的另一方面，提供一种抗禽流感病毒的免疫原(疫苗)，其包含有一段能与前面任一所述的结合分子结合的抗原表位。
在另一优选例中，所述的抗原表位包含以下位点：
相对于血球凝集素的氨基酸序列第121位的Ser；和
相对于血球凝集素的氨基酸序列第162位的Arg。
在另一优选例中，所述的抗原表位还包含以下位点：
相对于血球凝集素的氨基酸序列第117位的Ile；
相对于血球凝集素的氨基酸序列第118位的Pro；
相对于血球凝集素的氨基酸序列第161位的Lys；
相对于血球凝集素的氨基酸序列第164位的Tyr；或
相对于血球凝集素的氨基酸序列第167位的Thr。
在另一优选例中，所述的免疫原不包括全长的禽流感H5N1病毒的血球凝集素。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1a、抗体表达载体的构建示意图。其中，MT-P表示MT启动子，Bip表示信号肽编码区；VL-λ表示轻链λ可变区；VL-κ表示轻链κ可变区；VH表示重链可变区；CL-λ1表示轻链λ1恒定区；CL-κ1表示轻链κ1恒定区；CH-γ1表示重链γ1恒定区；poly-A为含有表达腺嘌呤核苷酸链的序列。
图1b、SDS/PAGE电泳鉴定抗体的识别区域。
图1c、不同浓度的血凝素与抗体100F4、65C6和3C11的结合和游离曲线。
图2、65C6、100F4、3C11和TG15纯化抗体的台盼蓝染色结果。其中，HC表示重链的条带，LC表示轻链的条带。
图3、抗体100F4、65C6、3C11和TG15对19个所有H5N1和1个H1N1亚类的假病毒以及VSV-G包埋假病毒的中和活性测试的结果。以抗体TG15作为阴性对照。
图4、来自于野生型A/Shenzhen/406H/06与其两株100F4逃逸株变体中H5HA蛋白序列的对比结果。
图5a-b、HPAI H5N1A/Shenzhen/406H/06病毒接种后的14天内小鼠的体重改变和存活率。
图5c-d、HPAI H5N1 A/Cambodia/P0322095/05病毒接种后的14天内小鼠的体重改变和存活率。
图6、感染H5N1 A/Shenzhen/406H/06和HPAI H5N1 A/Cambodia/P0322095/054天后的肺部组织进行病理切片。其中，
a、给予15mg/kg 65C6抗体的经H5N1A/Shenzhen/406H/06感染的小鼠肺部组织病理切片；
b、给予5mg/kg 65C6抗体的经H5N1A/Shenzhen/406H/06感染的小鼠肺部组织病理切片；
c、给予1mg/kg 65C6抗体的经H5N1A/Shenzhen/406H/06感染的小鼠肺部组织病理切片；
d、给予15mg/kg TG15抗体的经H5N1A/Cambodia/P0322095/05感染的小鼠肺部组织病理切片；
e、给予15mg/kg 65C6抗体的经H5N1A/Cambodia/P0322095/05感染的小鼠肺部组织病理切片；
f、给予5mg/kg 65C6抗体的经H5N1A/Cambodia/P0322095/05感染的小鼠肺部组织病理切片；
g、给予1mg/kg 65C6抗体的经H5N1A/Cambodia/P0322095/05感染的小鼠肺部组织病理切片；
h、给予15mg/kg TG15抗体的经H5N1A/Cambodia/P0322095/05感染的小鼠肺部组织病理切片。
图7a-b、HPAI H5N1A/Shenzhen/406H/06病毒接种后的14天内小鼠的体重改变和存活率。
图7c-d、HPAI H5N1A/Cambodia/P0322095/05病毒接种后的14天内小鼠的体重改变和存活率。
图8a和c、感染H5N1A/Shenzhen/406H/06和HPAI H5N1A/Cambodia/P0322095/05感染后24小时经65C6抗体处理的小鼠组在感染4天后未出现任何明显的炎症反应。
图8b和d、感染H5N1A/Shenzhen/406H/06和HPAI H5N1A/Cambodia/P0322095/05感染后24小时经TG15抗体处理的小鼠在感染4天后出现明显的肺部炎症病理改变包括肺泡壁增厚、炎症细胞浸润和血管扩张充血。
图9、电镜下观察到的经负染的HA和抗体65C6的复合物及其示意图。
a、一个抗体与两个HA分子形成的复合体；
b、一个抗体与两个HA分子形成的复合体；
c、一个抗体与两个HA分子形成的复合体；
d、一个抗体与五个HA分子形成的复合体，五个HA分子C端连接形成Rossett结构，由此推测抗体65C6是结合在HA的N端；
e、两个抗体与两个HA分子形成的复合体；
每个抗体的Fab段与HA分子结合时都形成固定的105度的角度。
图10、涉及到中和表位的氨基酸。
A、血球凝集素(HA)上23个单氨基酸的突变位点。这些单个氨基酸的突变能够使酿酒酵母表面展示的带有该单个氨基酸突变的血球凝集素的51-260个氨基酸的片段失去和抗体65C6的结合能力。而这其中有10个突变的氨基酸从血球凝集素的三维结构上看是埋在里面的，而另外13个突变的氨基酸是暴露在表面的。
B、对13个单个氨基酸发生突变的HA形成的假病毒，要达到95%的中和效果所需要的抗体65C6的浓度以及相对于中和原始株抗体浓度增加的倍数。红色所示为对 单克隆抗体65C6的中和更加耐受的单个氨基酸的突变。
C、通过酵母展示和假病毒中和试验所鉴定出来的7个分别位于H5N1的7.1亚型的A/Beijing/01/03株的血球凝集素蛋白上117，118，121，161，162，164和167(红色所示)位的氨基酸。
D、从血球凝集素蛋白的三维结构上来看那7个氨基酸117，118，121，161，162，164和167(红色和蓝色所示)相互挨在一起。
E、比较抗体65C6中和7.1亚类的原始株和该株的5个单个氨基酸的突变以及5个氨基酸的联合突变的滴度。
F、在假病毒中和实验中，中和5个单个氨基酸的突变和5个氨基酸的联合突变要达到80%的中和所需要的抗体65C6的浓度，以及相比之中和原始株病毒抗体浓度的增加倍数。红色标记的为对抗体65C6中和耐受的单个氨基酸突变或者多个氨基酸的联合突变。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，获得含有独特的CDR区的抗禽流感病毒的结合分子，所述的结合分子对于禽流感病毒具有良好的中和作用。本发明人还深入研究了其中一种结合分子在禽流感病毒血球凝集素(HA)上的结合位点，获得了所述结合分子的中和表位。在此基础上完成了本发明。
结合分子
本发明提供了能特异性结合禽流感病毒的结合分子。优选地，所述结合分子结合的是禽流感的H5N1病毒。本发明的结合分子呈现对于禽流感病毒良好的中和活性。
本发明人应用高敏感的HA和NA假病毒筛选法及分子克隆技术，成功地从感染2.3.4亚亚分支H5N1病毒的恢复期病人的记忆性B细胞分离得到了三株人源的抗H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体65C6、100F4和3C11。三株单克隆抗体都与HA1具有良好的亲和力。其中，65C6、100F4能够中和许多种(19中或更多)H5亚型的禽流感病毒，是广谱的中和性抗体；3C11能够中和4种或多于4种的H5亚型的禽流感病毒。
本发明中较为优选的抗体是65C6抗体，其对几乎所有的H5N1病毒的分支均有良好的中和能力并在动物体内有良好的预防与治疗的效果。电子显微镜及体外抗体筛选的实验结果表明，65C6抗体结合在H5HA的头部区域保守的抗原表位，且体外诱变实验表明经11代的抗体筛选并没有发现逃逸的突变株，可见65C6抗体所识别的保守中和表位位于HA的头部区域且该表位在所有的H5N1中都很难发生突变。因此，一方面，65C6抗体单独使用或与其它抗体或与小分子抑制剂联合使用在治疗H5N1各种分支引起的感染方面将有很大的潜力；另一方面，利用H5HA共同的中和表位作为免疫原有可能制备出针对所有H5N1分支的广谱抗病毒抗体。
本发明的结合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，所述结合分子可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体以及至少含有足以赋予与禽流感病毒毒株的特异性抗原结合的免疫球蛋白的片段的(多)肽或其片段。
本发明还提供了所述的结合分子在制备预防、缓解和/或治疗禽流感病毒感染的药物中的应用。这种感染可以在小群体中发生，但是也可以以季节流行病方式在世界范围传播，或者更严重地在全球蔓延，数百万个体处于危险之中。本发明提供了可以中和导致这种流行病以及潜在的全球性流行病的禽流感病毒毒株的感染的结合分子。本发明的结合分子可以大规模地制备和贮存，因为其提供了针对不同的流行性毒株的保护作用，且对于为将来可能发生的禽流感爆发做准备是有利的。
根据本领域公知的技术，抗体的CDR区是免疫学感兴趣的蛋白质的序列。在本发明的实施方案中，每一种结合分子可包含本文揭示的二、三、四、五或者所有六个CDR区。优选地，本发明的结合分子包含本文揭示的至少两个CDR。
本发明还包括所述的结合分子的“功能变体”。如果变体能与亲代结合分子(变异前的结合分子)竞争特异性结合禽流感病毒或其蛋白片段，则认为该变体分子是亲代结合分子的功能变体。换句话说，所述功能变体仍能结合禽流感病毒的HA1蛋白或其片段，且与变异前的结合分子具有相同或相似的结合特性(例如，识别的抗原决定区域的相同的)。功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似、但是含有例如在亲代结合分子中未发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这种修饰包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。换句话说，亲代结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶位。
所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。
保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族己经在本领域中限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技 术人员明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸残基家族分类方式。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失和/或插入。使用本领域熟知的计算机程序可以发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性的指导。
此外，功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代结合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合禽流感病毒或其片段。例如，本发明的功能变体与亲代结合分子相比对于禽流感病毒H5亚型病毒的HA1或其片段可具有增加或降低的结合亲和性。在本发明范围内的功能变体与本文所述亲代结合分子具有至少大约50%至大约99%、优选至少大约60%至大约99%、更优选至少大约70%至大约99%、甚至更优选至少大约80%至大约99%、最优选至少大约90%至大约99%、特别是至少大约95%至大约99%，以及特别是至少大约97%至大约99%的氨基酸序列同源性。本领域技术人员已知的计算机算法如Gap或者Bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域已知的普通分子生物学方法改变亲代结合分子或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错PCR、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。因此，应理解，当使用术语(人)结合分子时，其也涵盖所述(人)结合分子的功能变体。
结合分子的抗原结合特性通常由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，所述的CDR区将可变区间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了结合分子的抗原结合位点。可以通过比较同类型的结合分子的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。较佳地，所述的取代、插入或者缺失可以发生在CDR区以外的区域，例如抗体重链或轻链的FR区上；由于FR区不参与与抗原的直接结合，该区的适当变化是可以的。
作为本发明的优选方式，所述的结合分子是单克隆抗体，其包括人源的恒定区(如人源恒定区IgH序列和IgKappa序列)。所述的抗禽流感病毒单克隆抗体的重链可变区、轻链可变区以及位于重链可变区和轻链可变区的互补决定区(CDR)均具有独特的不同于现有技术的结构，且它们是全人源的。
作为本发明的优选方式，本发明包括：具有所述单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体，具有所述单克隆抗体可变区链的单克隆抗体。本发明还包括具有含所述的互补决定区(CDR)的轻链和重链的任何抗体，以及CDR区与本发明的单克隆抗体的CDR具有90%以上(更佳地95%以上)的同源性的任何抗体。
经验证，本发明的抗禽流感病毒单克隆抗体的CDR区是全新的，其针对的是一个 独特的禽流感病毒HA1蛋白上的抗原表位，技术构思不同于现有的抗禽流感病毒抗体。
本发明的单克隆抗体可以是全人源的，其重链、轻链可变区以及恒定区均来源于人抗体。因此，其在具有特别优异的识别和中和禽流感病毒的作用的同时，还具有免疫原性低、安全性高的特点。
另一方面，本发明包括免疫缀合物，即包含本发明所述至少一个结合分子以及进一步包含至少一个其它治疗分子、治疗剂或可检测物质。适于治疗和/或预防的标记可以是毒素或者其功能部分、抗生素、酶、增强吞噬作用或者免疫刺激作用的其它结合分子。包含可检测物质的免疫缀合物可诊断性地用于例如评定对象是否已经感染禽流感病毒毒株或者作为临床实验程序的一部分监测禽流感病毒感染的发生或进展以例如确定指定治疗方案的功效。然而，它们也可以用于其它检测和/或分析和/或诊断目的。可检测的部分/物质包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记单克隆抗体的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术、激光扫描细胞计量术检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、生物测定(例如吞噬作用测定)、蛋白质印迹应用等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。
本发明的结合分子可以与一或多个抗原缀合/附着。优选地，这些抗原是由给予了结合分子-抗原缀合物的对象的免疫系统识别的抗原。所述抗原可以彼此相同，但也可以是不同的。使附着抗原和结合分子的缀合方法为本领域所熟知，包括但不限于使用交联剂。
除了通过直接或间接(例如通过接头)缀合而化学产生免疫缀合物之外，所述免疫缀合物可以作为融合蛋白而产生，所述融合蛋白包含本发明的结合分子及合适的治疗分子、治疗剂或可检测物质。融合蛋白可以通过本领域已知方法产生，例如通过构建核酸分子以及随后表达所述核酸分子而重组产生，所述核酸分子包含符合读框的编码结合分子的核苷酸序列以及编码合适标记的核苷酸序列。
本发明另一方面提供了编码本发明的至少一种结合分子、其功能变体或者免疫缀合物的核酸分子。这种核酸分子可以用作中间物以进行克隆。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子是分离或纯化的。DNA分子的序列可以用常规技术，或利用杂交瘤技术获得。
本领域技术人员可以理解，这些核酸分子的变体也是本发明的一部分。核酸分子的变体是这样的核酸序列，通过使用标准遗传密码可以将其直接翻译以提供与从亲代核酸分子中翻译的序列相同的氨基酸序列。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的结合分子(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的结合分子的序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。优选的，本发明的载体是例如含病毒启动子的质粒表达载体，且在所述表达载体中分别插入了抗禽流感病毒结合分子重链可变区(VH)与恒定区的IgH(来自人源IgH的恒定区)融合序列和轻链可变区VL与人体Ig kappa(来自人源Ig kappa的恒定区)融合序列。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：细菌细胞如大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS7、NSO或Bowes黑素瘤细胞等。特别适用于本发明的宿主细胞是真核宿主细胞，如果蝇S2细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，或常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的结合分子。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的结合分子也可以在转基因非人哺乳动物如兔、山羊或者牛中产生，并且分泌进例如其乳中。
中和表位
本发明人的深入研究发现，本发明的一种中和分子(65C6)能够识别一个位于HA上远膜区的球形末端上保守的中和表位，该抗体可以很好地中H5N1病毒。因此，可以设计基于抗体65C6的表位的免疫原，从而诱导出可以中和各种(亚)型的H5N1病毒的免疫反应。
所述的免疫原较好地包含以下抗原表位：相对于血球凝集素的氨基酸序列第121位的Ser；和相对于血球凝集素的氨基酸序列第162位的Arg，上述表位是与所述结合分子结合的表位。
所述的免疫原更好地还包含以下抗原表位：相对于血球凝集素的氨基酸序列第117位的Ile；相对于血球凝集素的氨基酸序列第118位的Pro；相对于血球凝集素的氨基酸序列第161位的Lys；相对于血球凝集素的氨基酸序列第164位的Tyr；或相对于血球凝集素的氨基酸序列第167位的Thr。
基于上述所示的表位可设计出合适的免疫原，以诱导产生一些新的广谱中和性结合分子(如抗体)。所述的免疫原的设计可以参照本领域已知的一些技术，其原则是将上述的中和性表位暴露于其空间结构的表面上。
药物组合物
本发明的结合分子可用于制备抑制禽流感病毒的组合物。
基于本发明的新发现，还提供了一种可抑制禽流感病毒或禽流感病毒感染相关疾病的组合物，其包含：有效量的本发明所述的结合分子；以及药学上可接受的载体。
本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的结合分子相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。
可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如 润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。
本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。
本发明的结合分子可以以未分离的或者分离的形式使用。此外，本发明的结合分 子可以单独应用或者于包含至少一种本发明的结合分子(或其变体或片段)的混合物中应用。换句话说，所述结合分子可以组合应用，例如作为包含两或更多种本发明的结合分子、其变体或片段的药物组合物。例如，具有不同但互补活性的结合分子可以组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用，但是或者也可以将具有相同活性的结合分子组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用。任选地，所述混合物进一步包含至少一种其它治疗剂。
所述药物组合物可包含两或多个对于禽流感病毒具有中和活性的结合分子。在一个实施方案中，当组合应用时，所述结合分子呈现协同中和活性。换句话说，所述组合物包含至少两种具有中和活性的结合分子，特征在于所述结合分子在中和禽流感病毒中起协同作用。如本文所用，术语“协同”是指当组合应用时，结合分子的组合作用高于单独应用时的加合作用。所述协同作用的结合分子可以结合禽流感病毒的相同或不同片段上的不同结构。计算协同作用的方式是通过组合指数计算。组合指数(CI)的概念己经由Chou and Talalay(1984)描述。所述组合物也可包含具有中和活性的一种结合分子以及一种非中和性禽流感病毒特异性结合分子。所述非中和性及中和性禽流感病毒特异性结合分子在中和禽流感病毒H5亚型中也可以协同作用。
本发明的结合分子或药物组合在用于人体之前可以在合适的动物模型系统中检测。这种动物模型系统包括但不限于小鼠、雪貂(ferret)和猴。
本发明的结合分子还可与其它抗流感病毒的药物联合用药，所述的抗流感药物例如但不限于：烷胺类药物(金刚烷胺和金刚乙胺)；2)流感病毒神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦和扎那米韦)。因此本发明还提供了包含本发明的结合分子以及上述抗流感药物的药物组合物。
可以调整给药方案以提供最佳的所需应答(例如治疗应答)。合适的剂量范围可例如是0.01-500mg/kg体重，优选0.1-50mg/kg体重。此外，例如可以给予一次推注、随时间给予多次分开剂量或者根据治疗情况的紧急性而可以按比例降低或增加剂量。本发明的分子和组合物优选是无菌的。使得这些分子和组合物无菌的方法为本领域所熟知。用于诊断、预防和/或治疗的其它分子可以以与本发明的结合分子相似的给药方案给予。如果单独给予其它分子，则可以在给予本发明的一或多种人结合分子或药物组合物之前、同时或者之后给予患者。对于人患者的精确给药方案通常在临床实验期间挑选出。
检测试剂和试剂盒
本发明的结合分子可用于制备检测流感病毒的试剂或试剂盒。
如本文所用，术语“待检测样品”或“待测样品”涵盖了多种样品类型，包括生物学来源的血液及其它体液样品，实体组织样品如活检组织样品或者组织培养物，或者衍生自其中的细胞或者其后代。该术语还包括在获得后已经通过任何方式处理的样 品，例如用试剂处理、溶解、或者富集某些成分如蛋白质或者多核苷酸。该术语涵盖了得自任何物种的各种临床样品，也包括培养的细胞、细胞上清和细胞溶解产物。
以所述的结合分子为基础，可制备方便、快速且准确地检测禽流感病毒(如H5N1)的试剂盒。
因此，本发明提供了一种用于检测样品中是否存在禽流感病毒的检测试剂盒，该试剂盒中含有本发明的结合分子。
在获得了本发明提供的结合分子后，可以方便地制备出用于特异性检测禽流感病毒的检测试剂盒。
作为本发明的一种检测方式，采用间接ELISA法，将待测的抗原包被于固相载体上，利用本发明的结合分子进行检测。
作为本发明的一种优选方式，所述的结合分子是抗体，可根据双抗夹心法的原理来检测。双抗夹心法常规的做法是将一抗(如本发明的单克隆抗体)固定于载体，然后使一抗与抗原反应，洗涤后再与二抗反应(所述的二抗携带可检测信号，或可与携带可检测信号的物质结合)，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。双抗夹心法特别适用于具有两个或两个以上表位的抗原的检测。
为了在检测时更方便，所述试剂盒中除了含有本发明的结合分子以外，还可以包含其它检测试剂或辅助试剂，所述的辅助试剂例如是ELISA试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的，如显色剂、标记物、二抗、抗抗体、增敏剂等。本领域人员应理解，各种变化形式的检测试剂盒均是包含在本发明中的，只要在其中利用了本发明的结合分子作为识别禽流感病毒的试剂。
此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。
在获得了本发明提供的结合分子和/或试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中HA蛋白或其含量，从而得知待测样品的供体是否感染禽流感病毒，这些方法均被包含在本发明中。较佳地，所述的方法是以非疾病诊断为目的的。
作为一种优选方式，本发明提供一种体外(非诊断或治疗性地)检测禽流感病毒的方法，包括以下步骤：
(a1)将待测样品包被于固相载体；
(a2)将本发明的结合分子加样于(a1)的固相载体，从而使待测样品中的禽流感病毒与结合分子结合，形成带有“禽流感病毒-本发明的结合分子”二元复合物的固相载体；
(a3)将特异性结合本发明的结合分子的检测物加样于(a2)的固相载体，形成带有“禽流感病毒-本发明的结合分子-检测物”三元复合物的固相载体；所述的检测物上携带一标记物；
(a4)检测三元复合物中的标记物，确定待检测样品中禽流感病毒的存在与否以或存在的量。
按照上述方法，只要设置已知浓度的抗原对照，制作浓度标准曲线，通过比照浓度标准曲线就可以得出待测样品中的流感病毒含量。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
I.方法材料
人H5N1病例
该深圳病人于2006年6月被诊断出感染了高致病性H5N1禽流感病毒，通过输入感染过高致病性H5N1禽流感病毒的康复期病人血浆，该病人被治愈了。血液样品在该病人康复6个月后采集，通过Ficoll密度梯度离心，分离出外周血单核细胞。血浆和外周血单核细胞样品于-80℃储存31。
动物
实验小鼠为6-8周雌性BALB/c小鼠购自Charles River Laboratories (L’Arbresle，France)饲养在负压，微生物隔离装置中，空气通过HEPA过滤装置过滤。12小时光照和12小时黑暗周期。攻毒实验在柬埔寨巴斯德研究所生物安全3级实验室中进行。小鼠在接种前通过腹腔注射75mg/kg的戊巴比妥钠先麻醉小鼠。
细胞系
培养病毒包装细胞系293FT(购自Invitrogen)的培养液为完全DMEM培养液[高糖，10%胎牛血清，2mM L-谷氨酸，1 mM丙酮酸钠，青霉素(100U/ml))和链霉素(100μg/ml)；Invitrogen Life Technologies]含有0.5mg/ml of G418。MDCK细胞(购自美国组织培养公司)的培养液为完全DMEM培养液，果蝇S2细胞(Invitrogen)的培养液为完全SFM含有10%(v/v)FBS，50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素和2mM L-谷氨酸]，S2细胞培养温度为28℃。
病毒
高致病性H5N1病毒A/Shenzhen/406H/06和A/Cambodia/P0322095/05分别获自深圳东湖医院、柬埔寨巴斯德研究所。病毒在MDCK细胞中繁殖，含有病毒的上清最后分装后储存于-80℃32。
半数组织感染剂量的计算：通过系列稀释病毒，并感染MDCK细胞，通过Reed and Muench公式计算出半数组织感染剂量33。
半数致死量的计算：每组5只老鼠鼻腔滴注50ul的10倍系列稀释的病毒，观察14天，体重下降超过35%的老鼠被安乐死。最后通过Reed and Muench公式计算出半数致死量。
所有高致病性H5N1禽流感病毒相关实验都在生物安全3级实验室中完成。
HA/NA假病毒的制备
H5病毒包括10个分枝以及5个分枝2的亚分枝，其中分枝0、1、2.1、2.2、2.3和7分离自人，其余分离自禽类。构建密码子优化的H5病毒和H1HA及flag标签的N1NA的方法以及生产流感HA/NA假病毒的方法参考以前发表的文章中的描述34，35
VSV-G包埋假病毒：VSV-G病毒包膜蛋白所包埋的假病毒，其包埋方法请参照Vaccine 27:6777-6790(2009)文章所述的方法。
用于包装HA和NA假病毒所用的HA基因的原始病毒株来源及其Accession Number见表1。HA是通过常规的合成方法获得的。
表1
基于假病毒的中和试验
基于假病毒中和试验筛选康复期血清中和抗体的方法以及筛选果蝇S2转染细胞系的上清中和抗体的方法如前所述36。简要讲，将上清和HA和NA(如A/Shenzhen/406H/06)包被的假病毒一起在37℃孵育1小时，然后加入到MDCK细胞中。过夜孵育后，细胞用PBS洗一遍并补充完全培养液，48小时后按照BrightGlo Luciferase试剂盒的说明书中的操作步骤去测定荧光素酶活性。
抑制百分数的计算为：(完全培养液中的假病毒的荧光素酶相对数值-含有系列稀释抗体的完全培养液中的假病毒的荧光素酶相对数值)/完全培养液中的假病毒的荧光素酶相对数值×100%。
为了检测纯化的人单克隆抗体的中和能力，3倍系列稀释的抗体65C6，100F4和3C11与假病毒在37℃孵育1小时，然后加入到MDCK细胞中。过夜培养后，用PBS洗细胞，并置换新鲜完全DMEM培养液。荧光素酶活性测定如前所述。95%抑制浓度(即中和率95%；IC95)通过Graph Pad Prism软件对系列稀释的抗体抑制曲线的拟合计算得出。
血凝抑制试验
病毒与等体积系列稀释的人单克隆抗体65C6于室温孵育。然后加入等体积的0.5%鸡红细胞，室温孵育30分钟。红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，认为血凝抑制。
构建含有人免疫球蛋白重链和轻链恒定区并能在果蝇S2细胞稳定表达的载体
为了方便人单克隆抗体的克隆。EB病毒转化的B细胞总RNA被抽提出来，反转录成cDNA，编码抗体κ1，λ1和γ1恒定区的片段通过PCR扩增出来连接到TA克隆载体上测序，正确的抗体κ1和γ1恒定区的片段经BglII和PmeI酶切后连接到经同样酶切的pMT/Bip空载体(购自Invitrogen)上，得到pMT/Bip/κ1constant，和pMT/Bip/γ1constant质粒。正确的抗体λ1恒定区的片段经XhoI和PmeI酶切后连接到经同样酶切的pMT/Bip空载体上，得到pMT/Bip/λ1constant载体。
扩增各恒定区片段的引物序列如下：
建立能产生人单克隆抗体的稳定转染的果蝇S2细胞
通过Milteny公司的耦连抗人CD22+抗体的磁珠分离CD22+阳性的细胞，具体步骤参照该产品的说明书。分离得到的CD22+细胞每30个铺一个96孔板的孔，在RPMI1640细胞培养液中补充10%的胎牛血清，CpG 2006，EB病毒和作为滋养层细胞的辐射过的异体外周血单核细胞。两周后收集细胞上清，通过假病毒中和实验来筛选阳性克隆。经过一轮亚克隆，抽提出阳性亚克隆的细胞RNA，反转录成cDNA，通过PCR扩增出抗体的轻链和重链38。扩增出的PCR产物被连接到T-载体上，经过SfiI，BsiWI(κ链)，SfiI XhoI(λ链)和SfiI，ApaI(γ链)酶切后连接到经过同样酶切的PMT/Bip载体上。
因为一轮亚克隆后，亚克隆中依然混有分泌其它不相关抗体的B细胞。为了分离出正确的抗体基因，本发明人将包含抗体的重链的混合质粒转化大肠杆菌后，涂板，随机挑出单个菌克隆，抽提出质粒。将单个的抗体的重链与轻链的混合质粒一起瞬转S2细胞，经CdCl2诱导3天后，收集上清通过假病毒的中和实验来筛选出正确的重链的质粒克隆，然后把正确的克隆质粒送去测序得到抗体的重链的序列。用同样的方法，本发明人鉴定得到了抗体的轻链的基因序列。
为了得到稳转的S2细胞系，含有抗体的重链和轻链的质粒和pCoBlast(购自Invitrogen；带有blasticidin抗性基因)一起共转S2细胞。72小时后，加入25ug/ml的blasticidin进行筛选，两周后可得到稳转细胞系。将稳转细胞进行有限稀释，通过测定每个亚克隆细胞的上清中的抗体的量来筛选出高产的单克隆稳转细胞系。
产生和纯化由稳转果蝇S2细胞产生人单克隆抗体
波浪生物反应器20/50EHT带有一个WAVEPOD控制单元(GE，Healthcare)被用来生产人单克隆抗体。简要讲，150ml表达人单克隆抗体(1到2百万每毫升)稳转S2细胞加到1-L的细胞袋中。波浪生物反应器起始转速设定为22rpm最大角度8°在第三天时调整为26rpm角度9度。过滤后的空气以0.15L/分钟的速度流经细胞培养袋，溶液PH在6.0和6.3之间。起始培养6天后，灌注开始进行，灌注速率逐渐从0.3到1.5个培养体积(CV)/天，以保持葡萄糖浓度不低于4克/升。10天后，5uM的氯化铬被加入到细胞培液中。诱导5天后，收集上清。
收集好的上清用12,000×g的转速4℃离心10分钟，通过0.45μm的滤器过滤。过滤后的上清用分子量50KD的Hollow Fiber Cartridge (Model UFP-50-C-4MA)在QuixStand Benchtop系统中浓缩5倍。浓缩后的上清用12，000×g的转速4度离心10分钟，通过0.45m的滤器过滤。加入1mM of PMSF上样5ml的pre-packed Protein G柱子。洗脱后的组 分通过HiTrap desalting柱子脱盐处理，最后抗体溶解于PBS中。抗体浓度通过BCA法测定。
ELISA
用来检测人抗体IgG的酶联免疫试剂盒购自Mabtech AB(瑞典)。具体步骤参考生产商的试剂说明书，简要地讲，将抗人IgG的抗体在pH 7.4的PBS中稀释成1ug/ml然后加到96孔酶连免疫板上于4℃过夜。第二天用PBS洗板再用含有0.1%BSA的PBST室温封闭1小时。一定比例稀释后的细胞培养上清或者纯化的人单克隆抗体加入到孔中，同时从0.1到500ng/ml的人抗体标准品也加到孔里室温孵育2小时。然后用PBST洗4次，加入按1:1000稀释的ALP-conjugated抗人IgG-antibody室温孵育1小时，PBST洗四遍后加入NPD底物显色一定时间后，加入中止液于405纳米波长度数。
Western Blot
病毒样颗粒(VLP)样品的制备：
HA/NA VLP为表达流感病毒HA/NA的病毒样颗粒；HIV-1VLP为表达HIV-1包膜蛋白的病毒样颗粒；它们的制备方法参照2009年发表在Vaccine 27:6777-6790上的文章所述的方法。
为了检测人单克隆抗体的结合的特异性，在HIV-1和H5N1的病毒样颗粒样品加入SDS上样缓冲液含有0.6M DTT然后在90℃水浴中煮15分钟，上样12%的SDS-PAGE，然后转到PVDF膜上，用0.1%Tween 20(TBST)and 5%脱脂奶粉室温封闭1小时。然后与3ml含有TG15，3C11，100F4和65C6(0.5μg/ml)的抗体室温孵育2小时，PBST洗两次后，用AP-耦连的羊抗兔IgG抗体(Southern Biotech，USA)室温孵育1小时，PBST洗两遍后AP底物显色。
膜表面共振(SPR)分析
膜表面共振(SPR)分析按照制造商的说明在BIAcore T100(Biacore AB，Sweden)仪器上进行，抗体3C11，65C6，100F4和一个不相关的TG15抗体(为不识别禽流感病毒的抗体)分别用氨基耦连试剂盒被固定于CM5的芯片上，系列稀释的(从2090nM到84nM)可溶性重组A/Anhui/05/01株的HA蛋白在25℃。以恒定速度50μl/minute流经芯片表面180s。数据经过BIAcore T100evaluation software(版本3.2)，处理分析。
用负染电镜检测65C6抗体和HA复合体
按照以前描述的病毒提纯与Bromelian的酶促反应的方法将可溶性血凝素从H5N1病毒(A/Shenzhen/406H/06)上消化下来39。消化下来的可溶性血凝素按照以前描述的方 法同65C6抗体形成免疫复合物39。简单的描述为可溶性血凝素先用PBS (PH7.2)稀释到50g/ml并将其涂到碳胶片上。抗体65C6逐步地加入到涂有可溶性血凝素的碳胶片上直到所有的可溶性血凝素都与抗体形成复合物。然后通过印迹的方法将其转移到另一个薄碳片上并在空气中干燥。为了在镜下有最佳的观察效果，抗体65C6的量选择在能使其形成复合物的最少量。
抗体65C6在小鼠体内对高致病禽流感的预防和治疗作用
为了检测65C6的预防效果，8组雌性BALB/c小鼠(6个每组，6到8周，平均体重20克)腹腔注射50ul的PBS含有15mg/kg，5mg/kg和1mg/kg的65C6或者15mg/kg的对照抗体TG15。在4个小时后，24只小鼠被鼻腔滴注50ul的PBS含有5MLD50的A/Shenzhen/406H/06另外24只小鼠被鼻腔滴注50ul的PBS含有5MLD50的HPAI H5N1A/Cambodia/P0322095/05。在此后的14天里，每天称重小鼠，记录生存情况，体重下降超过35%的小鼠被安乐死掉。在第四天时，每组一只老鼠被用来取组织做组织病理切片分析。
为了检测65C6的治疗效果，4组雌性BALB/c小鼠(6个每组，6到8周，平均体重20克)鼻腔注射50ul的PBS含有5MLD50的A/Shenzhen/406H/06另外4组雌性BALB/c小鼠被鼻腔滴注50ul的PBS含有5MLD50的HPAI H5N1 A/Cambodia/P0322095/05。在接种病毒24，48，72小时后分别腹腔注射1ml的PBS含有40mg/kg的65C6或者40mg/kg的对照抗体TG15。在此后的14天里，每天称重小鼠，记录生存情况，小鼠体重下降超过35%的小鼠被安乐死掉。在第4天时，每组一只老鼠取其肺组织做组织病理切片分析。
病理学分析
取下的肺部组织经过一定的处理，进行切片。切片经固定进行HE染色为病理学分析提供依据。
病毒变异株的研究
为了产生中和抗体逃逸突变病毒，进而定位抗体识别表位，本发明人将2微升的A/Shenzhen/406H/06病毒原液做5倍系列稀释再与2ug/ml的65C6和7.8ug/ml的100F4分别在37℃孵育一小时，再加到MDCK细胞上去。在接下来的72到96小时里观察细胞的细胞病变(CPE)。将病毒最高稀释度下出现CPE的孔中的病毒上清收集起来按照前面的方法重复下一轮的传代。经过11代的抗体选择性的筛选，65C6没有产生明显的逃逸突变，而100F4明显产生了逃逸突变，通过空斑实验得到了两株100F4的逃逸突变株。
II.实施例
实施例1、制备人单抗65C6、100F4和3C11
血液样本来自于H5N1感染恢复期六个月的个体。实验证明其血清对H5N12.3.4和1分支有高度中和活性。然后将记忆性B细胞分选出来接种到96孔上，每孔含大约30个细胞，然后用EB病毒和CpG按照Traggiai et al的方法36将B细胞永生化。并对收集的上清的中和活性进行筛选。一开始就观察到由EBV转染的B细胞分泌抗体并不稳定。经过两轮亚克隆上清的中和活性显著下降。因此在随后的实验中一旦发现有中和活性的孔就对其细胞进行一轮亚克隆并可以将RNA从阳性细胞中分离出来。重链可变区、κ链可变区、λ链可变区的基因片段经RT-PCR扩增后插入到前述构建的带有重链恒定区、κ链恒定区、λ链恒定区基因表达系统中；构建示意图见图1a。
扩增重链可变区、κ链可变区、λ链可变区的基因片段的引物如下(其中以加黑斜体表示酶切位点)：
这些引物的应用根据已发表的文章Tiller T，Meffre E，Yurasov S，Tsuiji M，Nussenzweig MC，et al.(2008)Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning.J Immunol Methods 329:112-124。
然后在果蝇S2细胞中进行一系列抗体重链和轻链配对共转染实验，来找出产生有效中和抗体的重链和轻链对。从大约16000个EB病毒转染的B细胞的上清中发现了其中6个上清具有99%的中和活性。从几百个重轻链配对转染的果蝇S2细胞株鉴定出三株能够分泌65C6、100F4和3C11三种人的单克隆抗体。
另外，表达抗HIV-1gp41的TG15人单克隆抗体的果蝇S2细胞株也被制备出来用 于阴性对照。其制备方法与制备表达65C6的果蝇S2细胞株相同。
65C6、100F4和3C11三种抗体的重链可变区分别为5-a*03、5-a*03和4-61*03，65C6、100F4和3C11三种抗体的轻链可变区分别为Vκ3D-15*01，Vκ2D-28*01和Vλ1-40*01，抗体的VH和VL链蛋白序列见表2。其中，65C6的重链(VH)的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；轻链(VL)的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。100F4的重链(VH)的氨基酸序列为SEQ ID NO:3；轻链(VL)的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。3C11的重链(VH)的氨基酸序列为SEQ ID NO:5；轻链(VL)的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。它们的CDR区的序列编号见表2。
表2
图2为65C6、100F4、3C11和TG15纯化抗体的台盼蓝染色结果。抗体的重链(50kDa)和轻链(24-26kDa)的染色条带清晰可见，且有很高的纯度。
实施例2、人单抗65C6，100F4和3C11抗原特异性和亲和力实验
用免疫印迹方法来检测人单克隆抗体的抗原特异性实验，首先HIV-1、HA和NA病毒样颗粒经SDS/PAGE电泳再用PVDF膜进行转膜，然后与抗体65C6、100F4、3C11和TG15进行反应，根据印迹可以分析抗体的特异性。如图1b所示阴性对照的抗体TG15能特异的与HIV-1类病毒上的包膜蛋白结合但不能与流感类病毒上的HA和NA结合。阳性对照所用的小鼠的免疫血清(Immune sera)能特异的与流感类病毒上的HA0、HA1和HA2结合但不能与HIV-1类病毒上的包膜蛋白结合。抗体65C6、 100F4和3C11能特异的与HA0和HA1结合但不能与HA2和HIV-1的包膜蛋白结合。由此提示，抗体65C6、100F4和3C11所识别的抗原表位是在流感血凝素蛋白的HA1区域中。
应用表面等离子体共振的方法来测定抗原抗体的亲和力。结果如图1c，显示不同浓度的血凝素与抗体100F4、65C6和3C11的结合和游离曲线。由此估算出100F4、65C6和3C11抗体与血凝素的亲和力(KD)分别为2.42×10-9、4.14×10-8和7.02×10-8，见表3。由此，本发明人得出结论，100F4、65C6和3C11抗体与血凝素都有良好的亲和力。
表3
实施例3、体外验证人单抗65C6，100F4和3C11的中和广度、效力
图3和表4是抗体100F4、65C6、3C11和TG15对19个所有H5N1和1个H1N1亚类的假病毒以及VSV-G包埋假病毒的中和活性测试的结果，阴性对照的抗体TG15对19个H5N1和1个H1N1亚类的假病毒以及VSV-G包埋假病毒都没有中和活性。抗体3C11对四种H5N1假病毒(A/Hong Kong/156/97，A/Turkey/65-595/2006，A/Xingjiang/1/2006和A/Beijing/01/2003)有良好的中和活性(IC95值分别在0.516，4.04，5.612和3.465g/ml)。相反，抗体100F4可以很好地中和所有19个H5N1亚类的假病毒。在小于0.5g/ml浓度时抗体100F4对其中的6个H5N1的假病毒的中和率就可达到95%；在小于1μg/ml浓度时抗体100F4对其中13个H5N1的假病毒的中和率就可达到95%，而对余下6个H5N1假病毒中和率要达到95%所需的浓度为1.022到8.122μg/ml之间。出乎意料的是虽然抗体65C6与血凝素的结合率低于抗体100F4(如表4)但其中和活性却高于抗体100F4。在小于0.5g/ml浓度时抗体65C6对其中的16个H5N1的假病毒的中和率就可达到95%；在小于1μg/ml浓度时抗体65C6对其中的17个H5N1的假病毒的中和率就可达到95%，而对余下2个H5N1假病毒的中和率要达到95%所需的浓度也仅为1.085μg/ml和1.528μg/ml(表4)。由此本发明人得出结论：抗体65C6可以高效地中和所有19个H5N1亚类的假病毒。
为了进一步验证抗体65C6中和活性的广度和强度，本发明人还进行了血凝抑制试验(表5)，结果表明：抗体65C6在0.3μg/ml和2.7μg/ml浓度间能够完全抑制所有6个H5N1病毒的血凝活性；然而该抗体对H1N1、H2N2和H3N2病毒的血凝活性却没有抑制作用。由此可以得出结论：抗体65C6所识别中和表位是所有H5亚型的HA 共有的，但在H1、H2和H3亚型的HA中是没有的。
表4
*抗体65C6、100F4和3C11的引起H5N1假病毒IC95的剂量(ug/ml)；
**n.d.代表未测到。；
表5
实施例4、逃逸株筛选
为了确定抗体65C6和100F4所识别的氨基酸位点，本发明人利用抗体筛选逃逸的突变株。经过一两代的100F4抗体的筛选，逃逸株便可以检测到；随着传代次数的增加抗100F4抗体的突变株的活性越来越强；传至11代以后在抗体浓度为1600μg/ml的情况下突变株也可以逃逸。随后应用空斑方法克隆了两株突变株并对其完整HA序列进行了测试与比对，发现克隆的两个突变株在抗体浓度为1600μg/ml的情况下突变株也可以逃逸。其中一株变异株的HA序列存在8个单一氨基酸突变位，其中6个突变在HA1区域。另一个突变株有10个单一氨基酸突变，其中8个突变在HA1区域。两个突变株共同的突变序列在HA1区域有6个氨基酸分别在68、120、127、195、209和313位点。由此本发明人推测，100F4抗体所识别的中和表位与该六个位点相关。
与100F4相反，经过11代传代的抗体65C6筛选却没有检测到任何逃逸株。另外，上述两个对100F4抗体的突变株对65C6抗体还是敏感的(表6)。由此本发明人得出结论，上述六个位点与100F4抗体所识别的中和表位有关，而与65C6抗体所识别的中和表位无关，并且65C6抗体所识别的中和表位很难突变，该表位一旦突变将会影响其生存。
两个100F4抗体的逃逸株的HA序列分析发现，逃逸株1含有8个单一的氨基酸突变其中6个在HA1区域；逃逸株2有10个氨基酸突变，其中8个在HA1区域。在HA1中有这两个逃逸株共有的6个氨基酸突变，分别在第68、120，127，195，209和313位，由此提示，上述6个突变点与100F4的识别有关(见图4)。
表6、65C6、100F4抗体的抑制50%由100TCID50病毒引起的CPE所需浓度
*SZ表示 A/Shenzhen/406H/06H5N1病毒
**SZ-65C6-P11表示 A/Shenzhen/406H/06H5N1病毒，经11代传代
***SZ-100F4-P11表示A/Shenzhen/406H/06H5N1病毒，经11代传代
实施例5、抗体65C6的体内预防效果
为了验证抗体65C6在体内的预防效果，雌性的BALB/c小鼠经腹腔注射将15mg/kg、5mg/kg和1mg/kg的65C6抗体(浓度200mg/ml，纯度大于95%)和15mg/kg 对照抗体TG15注入小鼠体内，4小时后再将5个MLD50高致病性禽流感H5N1 A/Shenzhen/406H/06和HPAI H5N1A/Cambodia/P0322095/05经鼻腔滴液注入小鼠上呼吸道。选用5个MLD50高致病性禽流感H5N1A/Shenzhen/406H/06和HPAI H5N1 A/Cambodia/P0322095/05是经预实验证明该剂量对对照组小鼠的致死率可达100%。
图5a和b显示HPAI H5N1A/Shenzhen/406H/06病毒接种后的14天内小鼠的体重改变和存活率，图5c和d显示HPAI H5N1A/Cambodia/P0322095/05病毒接种后的14天内小鼠的体重改变和存活率。注入对照抗体TG15组小鼠经H5N1 A/Shenzhen/406H/06感染的自3天起出现明显的疾病症状和体重下降，其中在8-11天所有5只小鼠均死亡。相反，注入1mg/kg 65C6抗体的小鼠组4-6天出现明显的疾病症状和体重下降，且在11和13天有2只小鼠死亡，三只存活。注入5mg/kg 65C6抗体的小鼠在5-7天出现疾病症状，但体重减轻不明显，其中1只小鼠在11天死亡，余下的4个存活。然而注入15mg/kg 65C6抗体的小鼠未出现疾病症状和体重减轻，且全部存活。
注入对照抗体TG15组小鼠经H5N1A/Cambodia/P0322095/05感染的自3天起出现明显的疾病症状和体重下降，其中在8-11天所有5只小鼠均死亡。相反，注入1mg/kg65C6抗体的小鼠组4-6天出现明显的疾病症状和体重下降，且在10天有1只小鼠死亡，4只存活。然而注入5mg/kg和15mg/kg 65C6抗体的小鼠未出现疾病症状和体重减轻，且全部存活。
为了进一步研究抗体65C6体内的预防作用，本发明人将感染H5N1 A/Shenzhen/406H/06和HPAI H5N1A/Cambodia/P0322095/054天后的肺部组织进行病理切片观察，如图6所示，与临床观察的症状相吻合，TG15抗体处理的小鼠在感染4天后出现明显的肺部炎症病理改变包括肺泡壁增厚、炎症细胞浸润和血管扩张充血(见图6d和6h)。注入1mg/kg 65C6抗体的经H5N1A/Shenzhen/406H/06感染的小鼠组有少量的炎症反应，肺泡壁增厚、炎症细胞浸润和血管扩张充血均不明显(6c)。相反，注入5mg/kg和15mg/kg 65C6抗体经H5N1A/Shenzhen/406H/06组未出现任何炎症反应。注入1mg/kg、5mg/kg和15mg/kg 65C6抗体经HPAI H5N1 A/Cambodia/P0322095/05感染组未出现任何炎症反应。
实施例6、抗体65C6的体内治疗效果
确定了抗体65C6的预防作用后，本发明人进一步验证其治疗作用。雌性的BALB/c小鼠经鼻腔滴液将5个MLD50高致病性禽流感H5N1A/Shenzhen/406H/06和HPAI H5N1A/Cambodia/P0322095/05注入小鼠上呼吸道，24、48和72小时后再将40mg/kg的65C6抗体、40mg/kg和对照抗体TG15注入小鼠腹腔。
图7a和b显示HPAI H5N1A/Shenzhen/406H/06病毒接种后的14天内小鼠的体重 改变和存活率，图7c和d显示HPAI H5N1A/Cambodia/P0322095/05病毒接种后的14天内小鼠的体重改变和存活率。经HPAI H5N1A/Shenzhen/406H/06和HPAI H5N1 A/Cambodia/P0322095/05感染后注入对照抗体TG15组小鼠出现明显的疾病症状、体重下降，且在8-10天所有小鼠均死亡。相反，经HPAI H5N1A/Cambodia/P0322095/05感染后24、48和72小时后注入65C6抗体的小鼠均无明显的疾病症状和体重减轻，且所有小鼠均存活。经HPAI H5N1A/Shenzhen/406H/06感染后72小时后注入65C6抗体除1只小鼠死亡外其他小鼠均存活，且不出现任何疾病症状和体重减轻。
为了进一步研究抗体65C6体内的治疗作用，本发明人将感染H5N1 A/Shenzhen/406H/06和HPAI H5N1A/Cambodia/P0322095/054天后的肺部组织进行病理切片观察；感染后24小时经TG15抗体处理的小鼠在感染4天后出现明显的肺部炎症病理改变包括肺泡壁增厚、炎症细胞浸润和血管扩张充血(见图8b和d)。相反，感染后24小时经65C6抗体处理的小鼠组未出现任何明显的炎症反应(见图8a和c)。
本发明抗体可被用于治疗广谱的H5N1的病毒感染，本文只是举例说明本发明抗体对各H5N1分支(clade)的病毒感染治疗效果所属技术领域人员了解本发明抗体亦可被应用于同类H5N1分支的其他病毒的感染，包括但不限于0分支的A/Chicken/Hong Kong/317.5/2001、A/Chicken/Hong Kong/728/97、A/chicken/Hubei/wf/2002等，1分支的A/chicken/Kohn Kaen/NIAH330/2004、A/chicken/Phichit/NIAH6-4-0001/2006等，2.1分支的A/Chicken/West Java/GARUT-MAY/2006、A/Duck/Bufeleng/BPPV1/2005、A/Duck/Pali/BBVW1358/2005等，2.2分支的A/duck/Romania/TL/nov/2007、A/duck/Switzerland/V389/2006、A/eagle owl/Sweden/V1218/2006等，2.3.2分支的A/bar-headed goose/Mongolia/X25/2009、A/bean goose/Tyva/10/2009、A/black-crowned night heron/Hong Kong/659/2008等，2.3.4分支的A/blue magpie/Hong Kong/1993/2007、A/chestnut munia/Hong Kong/2442/2007、A/chicken/Thailand/NP-172/2006等，2.4分支的A/chicken/China/1204/04、A/Ck/YN/115/2004、A/duck/Yunnan/485/2004等，2.5分支的A/blow fly/Kyoto/93/2004、A/chicken/Guangdong/174/04、A/chicken/Jiangxi/25/2004等，3分支的A/Chicken/Hong Kong/SF219/01、A/Chicken/HongKong/FY150/01、A/chicken/Xiniang/16/2005等，4分支的A/duck/Guangdong/22/2002、A/duck/Shantou/700/2002等，5分支的A/duck/Shantou/5526/2001等，6分支的A/black bulbul/Fuian/439/04等，8分支的A/chicken/Hong Kongi/86.3/2002、A/chicken/Vietnam/G62/2005、A/Ck/HK/YU777/02等，9分支的A/chicken/Henan/210/2004、A/chicken/Hubei/14/2004等，更多的病毒株详见http://h5n1.flugenome.org/show_subtypes.php。
实施例7、65C6抗体识别部位
图9显示电镜下观察到的经负染的HA和抗体65C6的复合物及其示意图。每个抗体分子与两个HA结合。每个抗体的Fab段跟HA的末端相结合并于HA形成固定的110度的角度。其中图9d显示5个HA分子末端相接形成一个聚合体，抗体分子与聚合体中两个HA的另一个末端结合。
已有报道显示HA分子近膜端相互结合形成聚合体，由此提示被抗体结合的N端是HA的头部区。
实施例8、鉴定抗体65C6的表位
为了鉴定出抗体65c6的中和表位，基于区域层次的以及精细表位层次的酵母展示被应用于抗体65c6的中和表位的鉴定实验，精细表位层次的酵母展示方法在以前已有报道(Zuo T，Shi X，Liu Z，Guo L，Zhao Q，et al.(2011)Comprehensive analysis of pathogen-specific antibody response in vivo based on an antigen library displayed on the surface ofyeast.J Biol Chem)。简要的讲，诱导的酿酒酵母细胞(106-107)通过离心收集(12,000转/秒，1分钟)，用PBS洗一次，加上500ng的抗体65C6在冰上孵育1小时。然后用冷的PBS洗两次，接着与PE-标记的抗-人的IgG (1:200稀释)在冰上孵育45分钟。细胞再用冷的PBS洗两次，接着用Aria II (BD，USA)的流式细胞仪进行分析分选，PE-阳性的酵母克隆被分选出来并且测序。为了进行精细的表位鉴定，通过低保真PCR技术在HA的51-260位置的氨基酸上引进了一系列的随机突变，这些随机突变的片段通过胶纯化并用Qiaquick胶回收试剂盒(Qiagen)来回收。具体的构建、生长并在酵母表面表达该文库的方法已在以前的文献中有过描述。
通过对PE-染色阴性的酵母克隆的测序分析，本发明人鉴定出23个单个氨基酸的突变能够破坏抗体65C6对HA的结合。
从HA的三维结构来看，其中13个位于第116，117，118，121，147，152，160，161，162，163，164，167和187位位置的氨基酸突变在HA蛋白的表面上，另外10个氨基酸的突变则埋在HA蛋白里面，意味这这些埋在蛋白里面的氨基酸不会直接和抗体65C6直接接触。见图10A。
为了鉴定这13个HA蛋白表面的氨基酸突变是否会影响抗体65C6的中和活性。13个基于H5N1的7.1亚型的A/Beijing/01/2003株的HA骨架的单点突变被用来构建H5N1的假病毒。
抗体对于这些带有各个单点突变的假病毒的中和性通过中和试验来确定。结果显示，与原始株的7.1亚型的H5N1假病毒相比，H5N1的HA在116，147，152，160，163或者187位置突变形成的假病毒更容易被抗体65C6所中和。而带有117，118，121，161，162，164和167位置的HA突变形成的假病毒则对抗体65C6相比之原始株更加耐受(在IC95的抑制率下，HA第117和162位突变的假病毒对抗体的耐受提 高了2倍，而HA第121和161位突变的假病毒对抗体的耐受提高了超过8倍)，见图10B。有趣的是所有耐受提高的假病毒相应的HA突变氨基酸的位置在HA蛋白的三维结构上看都是相邻的，见图10C和D。
通过比较65C6敏感株A/Beijing/01/2003与65C6耐受株A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/08的HA的氨基酸序列，本发明人发现在117-121和159-167这两段位置上，这两株的HA在第121，159，162，163和165位的5个氨基酸是不同的。
为了鉴定这5个氨基酸在65C6的中和表位中的作用，本发明人将A/Beijing/01/20037.1亚型HA中相应的这5个氨基酸分别替换成了A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/087.2亚型HA中相应的的氨基酸，同时构建了一替换了7.2亚型的所有5个氨基酸的突变并用这些突变去包装假病毒。
图10E和F显示了抗体65C6对这些假病毒突变的中和活力。与原始株的A/Beijing/01/20037.1亚型相比，带有HA上第159，163或165位单个氨基酸突变的假病毒显得更易于被抗体65C6中和。
相对的，带有HA上第162或121位突变的假病毒则对于65C6的中和更加耐受了(在IC80的抑制率下，抗体浓度分别增加了1.26倍和3.37倍)。值得注意的是，当5个氨基酸一起突变后对于抗体65C6的耐受性相比之在121和162位置的单个点突变的耐受性有了极大的增强(图10F)。
纵观这些结果，可以得出结论，HA上第121和162位位置的氨基酸是在抗体65C6识别的表位里面的，而且这两个氨基酸在7.2亚型的骨架中能够更好地被抗体65C6所识别。
电镜及表位鉴定的结果显示，抗体65C6结合的表位包含氨基酸117，118，121，161，162，164和167，这样一个构象表位位于HA的远离膜端的球形区域的末端。
除了7.2亚型，这些氨基酸在各个型和各个亚型的H5N1里面是高度保守的，但是这些氨基酸在不同亚类的HA里面是很不一样的，这与中和实验的结果是相吻合的。这些结果提示，这些氨基酸所在的区域在自然感染的过程中是一个主要的产生免疫反应的区域，这样一个包含了一个环形结构和一个反向平行的β折叠结构可以被用来设计免疫原从而诱导产生亚类特异性的广谱中和抗体。
讨论
对于人畜共患的高致病性禽流感H5N1病毒感染虽有一些具体的治疗方案，但因其持续的60%的死亡率使其仍然是一个公众健康的重大威胁。本发明中，发明人成功的从感染分支2.3.4H5N1病毒的恢复期病人的记忆性B细胞中分离得到了65C6、100F4和3C11三株人抗H5HA的单克隆抗体。
本发明有两个重要发现，一个是65C6抗体对高致病性禽流感H5N1病毒所有10个分支和5个亚类都有高度的中和效力，且经过11代的体外65C6抗体筛选并没有发现逃逸的突变株。这些结果表明65C6抗体所识别的中和表位包括所有H5N1病毒株，而且65C6抗体所识别的中和表位很难突变，可能因为该表位一旦突变将会影响病毒株本身的生存。因为65C6抗体是从感染H5N1病毒的恢复期病人的记忆性B细胞中分离得到的，因此65C6抗体的这种中和反应是基于人类自然感染并获得免疫的中和抗体反应的，因此针对这种中和表位产生的疫苗不仅对正在人类中传播的H5N1病毒株有中和活性且对目前在禽类传播将来有可能传播到人类的H5N1病毒株也将有很好的中和活性。
另一个重要发现是65C6抗体对高致病性禽流感有很好的预防和治疗效果。腹腔注射5mg/kg的65C6抗体可以保护小鼠免受致死剂量的高致病性禽流感H5N1病毒的感染，即使在小鼠被高致病性禽流感H5N1病毒感染72小时后腹腔注射该抗体也可以使小鼠存活且不发生体重减轻。因此，65C6抗体在治疗人类或人畜共患H5N1病毒感染方面有很大的潜力。
尽管基于抗体的治疗方法并不是一种新的治疗策略，但对于流感病例该疗法还是很有代表性的。通过特异性抗体的后天免疫也可以使婴儿获得针对流感病毒的免疫力 10-13。从1918年西班牙流感大流行的幸存者体内所分离得到的单克隆抗体可以有效的将流感的死亡率降到50%甚至是到37～16%14。输入感染过H5N1的康复病人的血浆可以有效的降低H5N1病毒感染病人的病毒载量并可以完全康复15。这些临床现象的生理机制是血浆中的中和抗体可以调节病毒感染的过程和减缓急性呼吸窘迫综合症及其他并发症的发病速度14。因此，本发明及其他相关研究开发的人单克隆抗体在治疗流感病毒感染方面比感染流感病毒康复病人的血浆有更好的疗效2，21，24，40，41。此外，人单克隆抗体还有两个好处，一个是可以大批量生产，事实上在本发明中就发现超过1g/L/d的人单克隆抗体就可以利用波浪式生物反应器和灌注培养的方法用果蝇S2细胞产生，另一个是该抗体对于人血浆中存在的外在抗原不发生反应，且自应用人源抗体替代其它物质来源抗体治疗疾病以来免疫排斥反应也大大降低了。
尽管目前还未确切地获得65C6抗体所识别的中和表位的氨基酸残基的序列，但负染电镜对65C6抗体和HA复合体的观察表明，65C6抗体结合在HA1头部区域保守的抗原表位。这个结果与本发明人的中和试验结果相一致，即抗体65C6是H5亚型特异性抗体。虽然65C6抗体可以中和所有H5HA(亚类)分支，但其对亚型1、2和3流感病毒却没有中和作用。由此65C6抗体所识别的表位与最近发现的群特异性(group specific)抗体C17942、CR626124，42和F1023所识别的表位不同，后三个抗体所识别的抗原表位位于HA2的颈部区域23、24、42。
综上所述，本发明人利用H5N1假病毒株中和试验技术与分子克隆技术成功的从 H5N1康复的病人的记忆性B细胞筛选出3个有效的人源单克隆抗体15。其中65C6抗体所识别的中和表位位于HA1的头部区域且该抗体对所有的H5N1病毒的分支均有良好的中和能力并在小鼠体内具有良好的预防与治疗的效果，同时本发明人的体外实验证明该表位很难发生突变43，44。因此，一方面65C6抗体单独使用或与其它小分子抑制剂联合使用在治疗H5N1各种分支引起的感染方面将有很大的潜力，另一方面，利用H5HA共同的中和表位作为免疫原有可能制备出针对所有H5N1分支的广谱抗病毒抗体。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
参考文献
1.Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/(H5N1)Reported to WHO.WHO Information Web Site http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/en/.Updated on December 10，2009..
2.Peiris JS，Yu WC，Leung CW，et al.Re-emergence of fatal human influenza A subtype H5N1 disease.Lancet.Feb 212004;363(9409):617-619.
3.Gu J，Xie Z，Gao Z，et al.H5N1 infection of the respiratory tract and beyond：a molecular pathology study.Lancet.Sep 29 2007;370(9593):1137-1145.
4.Tran TH，Nguyen TL，Nguyen TD，et al.Avian influenza A(H5N1)in 10 patients in Vietnam.N Engl J Med.Mar 18 2004;350(12):1179-1188.
5.Beigel JH，Farrar J，Han AM，et al.Avian influenza A(H5N1)infection in humans.N Engl J Med.Sep 29 2005;353(13):1374-1385.
6.de Jong MD，Simmons CP，Thanh TT，et al.Fatal outcome of human influenza A(H5N1)is associated with high viral load and hypercytokinemia.Nat Med.Oct 2006;12(10):1203-1207.
7.Le QM，Kiso M，Someya K，et al.Avian flu：isolation of drug-resistant H5N1 virus.Nature.Oct 202005;437(7062):1108.
8.de Jong MD，Tran TT，Truong HK，et al.Oseltamivir resistance during treatment of influenza A(H5N1)infection.N Engl J Med.Dec 222005;353(25):2667-2672.
9.Sawyer LA.Antibodies for the prevention and treatment of viral diseases.Antiviral Res.Aug 2000;47(2):57-77.
10.Puck JM，Glezen WP，Frank AL，Six HR.Protection of infants from infection with influenza A virus by transplacentally acquired antibody.J Infect Dis.Dec 1980;142(6):844-849.
11.Sweet C，Bird RA，Jakeman K，Coates DM，Smith H.Production of passive immunity in neonatal ferrets following maternal vaccination with killed influenza A virus vaccines.Immunology.Jan 1987;60(1):83-89.
12.Sweet C，Jakeman KJ，Smith H.Role of milk-derived IgG in passive maternal protection of neonatal ferrets against influenza.J Gen Virol.Oct 1987;68(Pt 10):2681-2686.
13.Reuman PD，Paganini CM，Ayoub EM，Small PA，Jr.Maternal-infant transfer of influenza-specific immunity in the mouse.J Immunol.Feb 1983;130(2):932-936.
14.Luke TC，Kilbane EM，Jackson JL，Hoffman SL.Meta-analysis：convalescent blood products for Spanish influenza pneumonia：a future H5N1 treatment? Ann Intern Med.Oct 172006;145(8):599-609.
15.Zhou B，Zhong N，Guan Y.Treatment with convalescent plasma for influenza A(H5N1)infection.N Engl J Med.Oct 42007;357(14):1450-1451.
16.Smirnov YA，Lipatov AS，Gitelman AK，Claas EC，Osterhaus AD.Prevention and treatment of bronchopneumonia in mice caused by mouse-adapted variant of avian H5N2 influenza A virus using monoclonal antibody against conserved epitope in the HA stem region.Arch Virol. 2000;145(8):1733-1741.
17.Renegar KB，Small PA，Jr.，Boykins LG，Wright PF.Role of IgA versus IgG in the control ofinfluenza viral infection in the murine respiratory tract.J Immunol.Aug 12004;173(3):1978-1986.
18.Palladino G，Mozdzanowska K，Washko G，Gerhard W.Virus-neutralizing antibodies of immunoglobulin G(IgG)but not of IgM or IgA isotypes can cure influenza virus pneumonia in SCID mice.J Virol.Apr 1995;69(4):2075-2081.
19.Lu J，Guo Z，Pan X，et al.Passive immunotherapy for influenza A H5N1 virus infection with equine hyperimmune globulin F(ab’)2in mice.Respir Res.2006;7:43.
20.Hanson BJ，Boon AC，Lim AP，Webb A，Ooi EE，Webby RJ.Passive immunoprophylaxis and therapy with humanized monoclonal antibody specific for influenza A H5 hemagglutinin in mice.Respir Res.2006;7:126.
21.Simmons CP，Bernasconi NL，Suguitan AL，et al.Prophylactic and therapeutic efficacy of human monoclonal antibodies against H5N1 influenza.PLoS Med.May 2007;4(5):e178.
22.Okuno Y，Matsumoto K，Isegawa Y，Ueda S.Protection against the mouse-adapted A/FM/1/47strain ofinfluenza A virus in mice by a monoclonal antibody with cross-neutralizing activity among H1 and H2strains.J Virol.Jan 1994;68(1):517-520.
23.Sui J，Hwang WC，Perez S，et al.Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses.Nat Struct Mol Biol.Mar 2009;16(3):265-273.
24.Throsby M，van den Brink E，Jongeneelen M，et al.Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+memory B cells.PLoS One.2008;3(12):e3942.
25.Chen Y，Qin K，Wu WL，et al.Broad cross-protection against H5N1 avian influenza virus infection by means of monoclonal antibodies that map to conserved viral epitopes.J Infect Dis.Jan 1 2009;199(1):49-58.
26.Koudstaal W，Koldijk MH，Brakenhoff JP，et al.Pre-and postexposure use of human monoclonal antibody against H5N1and H1N1 influenza virus in mice：viable alternative to oseltamivir J Infect Dis.Dec 152009;200(12):1870-1873.
27.Abdel-Ghafar AN，Chotpitayasunondh T，Gao Z，et al.Update on avian influenza A(H5N1)virus infection in humans.N Engl J Med.Jan 172008;358(3):261-273.
28.Smith GJ，Fan XH，Wang J，et al.Emergence and predominance of an H5N1 influenza variant in China.Proc Natl Acad Sci U S A.Nov 72006;103(45):16936-16941.
29.Gutiérrez R，Naughtin M，Horm S，San S，Buchy P.A(H5N1)Virus Evolution in South East Asia.Viruses.2009;1(3):335-361.
30.Kaverin NV，Rudneva IA，Govorkova EA，et al.Epitope mapping of the hemagglutinin molecule of a highly pahogenic H5N1 influenza virus by using monoclonal antibodies.J Virol.Dec 2007;81(23):12911-12917.
31.Zhou P，Lee J，Moore P，Brasky KM.High-efficiency gene transfer into rhesus macaque primary T lymphocytes by combining 32 degrees C centrifugation and CH-296-coated plates：effect of gene transfer protocol on T cell homing receptor expression.Hum Gene Ther.Oct 102001;12(15):1843-1855.
32.Buchy P，Mardy S，Vong S，et al.Influenza A/H5N1 virus infection in humans in Cambodia.J Clin Virol.Jul 2007;39(3):164-168.
33.REED LJ，MUENCH H.A SIMPLE METHOD OF ESTIMATING FIFTY PER CENT ENDPOINTS.American Journal of Epidemiology.May 1，19381938;27(3):493-497.
34.Luo G，Chung J，Palese P.Alterations of the stalk of the influenza virus neuraminidase：deletions and insertions.Virus Res.Sep 1993;29(3):321.
35.Tsai C，Caillet C，Hu H，et al.Measurement of neutralizing antibody responses against H5N1 clades in immunized mice and ferrets using pseudotypes expressing influenza hemagglutinin and neuraminidase.Vaccine.2009;27(48):6777-6790.
36.Traggiai E，Becker S，Subbarao K，et al.An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells：potent neutralization of SARS coronavirus.Nat Med.Aug 2004;10(8):871-875.
37.Johansson DX，Drakenberg K，Hopmann KH，et al.Efficient expression of recombinant human monoclonal antibodies in Drosophila S2cells.J Immunol Methods.Jan 102007;318(1-2):37-46.
38.Zhou P，Goldstein S，Devadas K，Tewari D，Notkins AL.Human CD4+cells transfected with IL-16cDNA are resistant to HIV-1infection：inhibition of mRNA expression.Nat Med.Jun 1997;3(6):659-664.
39.Wrigley NG，Brown EB，Daniels RS，Douglas AR，Skehel JJ，Wiley DC.Electron microscopy of influenza haemagglutinin-monoclonal antibody complexes.Virology.Dec 1983;131(2):308-314.
40.Bowley DR，Jones TM，Burton DR，Lerner RA.Libraries against libraries for combinatorial selection of replicating antigen-antibody pairs.Proc Natl Acad Sci USA.Feb 32009;106(5):1380-1385.
41.Okuno Y，Isegawa Y，Sasao F，Ueda S.A common neutralizing epitope conserved between the hemagglutinins of influenza A virus H1and H2strains.J Virol.May 1993;67(5):2552-2558.
42.Ekiert DC，Bhabha G，Elsliger MA，et al.Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.Science.Apr 10 2009;324(5924):246-251.
43.Huang CC，Venturi M，Majeed S，et al.Structural basis of tyrosine sulfation and VH-gene usage in antibodies that recognize the HIV type 1coreceptor-binding site on gp 120.Proc Natl Acad Sci USA.Mar 22004;101(9):2706-2711.
44.Luftig MA，Mattu M，Di Giovine P，et al.Structural basis for HIV-1neutralization by a gp41 fusion intermediate-directed antibody.Nat Struct Mol Biol.Aug 2006;13(8):740-747。
Claims (19)
1.一种结合分子，其特征在于，所述结合分子包含SEQ ID NO:7所示的重链CDR1，SEQ ID NO:8所示的重链CDR2，SEQ ID NO:9所示的重链CDR3；以及SEQID NO:10所示的轻链CDR1，SEQ ID NO:11所示的轻链CDR2，SEQ ID NO:12所示的轻链CDR3。
2.如权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述的结合分子包含重链可变区，该重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述的结合分子包含轻链可变区，该轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.如权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述的结合分子包含：
重链可变区，该重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；以及
轻链可变区，该轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.如权利要求1-4任一所述的结合分子，其特征在于，所述的结合分子是人单克隆抗体、Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区片段、单链抗体、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体或四链抗体。
6.如权利要求5所述的结合分子，其特征在于，所述的人单克隆抗体其重链恒定区选择下组中重链类型之一的恒定区：IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3，和其轻链恒定区选择下组轻链类型的恒定区之一：κ链和λ链。
7.如权利要求6所述的结合分子，其特征在于，所述的人单克隆抗体其重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列分别如GenBank号ACK87036和ACK87038所示。
8.一种多核苷酸，其特征在于，它编码权利要求1-7任一所述的结合分子。
9.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中含有：
编码权利要求1-7任一所述的结合分子的重链的多核苷酸；和/或
编码权利要求1-7任一所述的结合分子的轻链的多核苷酸。
10.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有权利要求9所述的表达载体；或其基因组中整合有权利要求8所述的多核苷酸。
11.如权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是果蝇S2细胞。
12.权利要求1-7任一所述的结合分子的用途，用于制备预防、缓解或治疗禽流感病毒感染的组合物。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的禽流感病毒是H5亚型的病毒。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的禽流感病毒是H5N1病毒。
15.一种药物组合物，其特征在于，它含有有效量的权利要求1-7任一所述的结合分子，以及药学上可接受的载体。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还含有有效量的其它抗流感药物，选自：烷胺类药物或流感病毒神经氨酸酶抑制剂。
17.如权利要求16所述的药物，其特征在于，所述的烷胺类药物包括金刚烷胺或金刚乙胺；或
所述的流感病毒神经氨酸酶抑制剂包括：奥司他韦或扎那米韦。
18.权利要求1-7任一所述的结合分子的用途，用于制备鉴定禽流感病毒的试剂或试剂盒。
19.一种非疾病诊断目的的鉴定禽流感病毒的方法，所述方法包括：将权利要求1-7任一所述的结合分子与待检测样品接触，观察所述的结合分子与待检测样品的结合情况，若所述的结合分子与待检测样品发生结合，则该样品中存在禽流感病毒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210376959.6A CN103030693B (zh) | 2011-09-30 | 2012-09-28 | 高致病性禽流感的中和分子及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110295786 | 2011-09-30 | ||
| CN201110295786.0 | 2011-09-30 | ||
| CN2011102957860 | 2011-09-30 | ||
| CN201210376959.6A CN103030693B (zh) | 2011-09-30 | 2012-09-28 | 高致病性禽流感的中和分子及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103030693A CN103030693A (zh) | 2013-04-10 |
| CN103030693B true CN103030693B (zh) | 2015-03-11 |
Family
ID=47994269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210376959.6A Expired - Fee Related CN103030693B (zh) | 2011-09-30 | 2012-09-28 | 高致病性禽流感的中和分子及其制备方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103030693B (zh) |
| WO (1) | WO2013044840A1 (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9969794B2 (en) | 2012-05-10 | 2018-05-15 | Visterra, Inc. | HA binding agents |
| WO2017083627A1 (en) | 2015-11-13 | 2017-05-18 | Visterra, Inc. | Compositions and methods for treating and preventing influenza |
| CA3132521A1 (en) | 2019-03-25 | 2020-10-01 | Visterra, Inc. | Compositions and methods for treating and preventing influenza |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101538327A (zh) * | 2009-05-04 | 2009-09-23 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | 人源抗h5n1血凝素蛋白广谱中和性抗体及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009119722A1 (ja) * | 2008-03-28 | 2009-10-01 | 国立大学法人北海道大学 | 抗ｈ５亜型ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンモノクローナル抗体 |
| EP2328928A2 (en) * | 2008-08-25 | 2011-06-08 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Conserved influenza hemagglutinin epitope and antibodies thereto |
| AU2010359618B2 (en) * | 2010-08-23 | 2015-07-23 | Temasek Life Sciences Laboratory Limited | Monoclonal antibody specific to major neutralizing epitope of influenza H5 hemagglutinin |
-
2012
- 2012-09-28 WO PCT/CN2012/082277 patent/WO2013044840A1/zh active Application Filing
- 2012-09-28 CN CN201210376959.6A patent/CN103030693B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101538327A (zh) * | 2009-05-04 | 2009-09-23 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | 人源抗h5n1血凝素蛋白广谱中和性抗体及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| H5N1 亚型禽流感病毒血凝素Th 和B细胞表位预测及抗原性分析;南文龙等;《中国免疫学杂志》;20091231;第25卷;第630-633，637页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103030693A (zh) | 2013-04-10 |
| WO2013044840A1 (zh) | 2013-04-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liu et al. | Cross-lineage protection by human antibodies binding the influenza B hemagglutinin | |
| US9969778B2 (en) | Influenza virus vaccines and uses thereof | |
| CA2790949C (en) | Human monoclonal antibodies derived from human b cells and having neutralizing activity against influenza a viruses | |
| CN105669838B (zh) | 来自水痘-带状疱疹病毒gE蛋白的中和表位及针对其的抗体 | |
| CN101883789B (zh) | 特异于流感病毒h5亚型或者n1亚型的血凝素和神经氨酸酶的单克隆抗体及其应用 | |
| WO2012045001A2 (en) | Influenza virus antibodies and immunogens and uses therefor | |
| MX2014003745A (es) | Molecula de union que tiene actividad neutralizadora del virus de la influenza a, producida a partir de celulas b humanas. | |
| CN103665155B (zh) | 一种抗流感病毒广谱中和性的中和分子1f2 | |
| CN109265541A (zh) | 流感中和药剂 | |
| CN106243218A (zh) | 抗Flu B 的广谱单克隆抗体及其用途 | |
| CN103030693B (zh) | 高致病性禽流感的中和分子及其制备方法 | |
| CN105555802A (zh) | 靶向h7流感病毒上中和表位的单克隆抗体 | |
| CN103665153B (zh) | 一种抗流感病毒广谱中和性的中和分子1e1 | |
| CN104169297A (zh) | 靶向进化枝2.3的h5流感病毒上的中和表位的单克隆抗体 | |
| CN107216387A (zh) | 一种b型流感病毒广谱中和抗体、其制备方法及应用 | |
| US9834594B2 (en) | Human monoclonal antibodies derived from human B cells and having neutralizing activity against influenza A viruses | |
| CN103665157B (zh) | 一种抗流感病毒广谱中和性的中和分子1c4 | |
| CN103665156B (zh) | 一种抗流感病毒广谱中和性的结合分子3e1 | |
| CN115819566B (zh) | 靶向甲型流感病毒核蛋白的抗体及其应用 | |
| CN103665154B (zh) | 一种抗流感病毒广谱中和性的中和分子3c4 | |
| NZ625973B2 (en) | Influenza virus vaccines and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150311 Termination date: 20170928 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |