CN113480644A - 一种抗冠状病毒的抗体及其应用 - Google Patents

一种抗冠状病毒的抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗冠状病毒的抗体及其应用，所述冠状病毒为新型冠状病毒，特别涉及一种特异性结合新型冠状病毒S‑RBD蛋白的抗体及其抗原结合片段。所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述的轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3。各CDR以及可变区的序列详见本发明。本发明的抗体或其抗原结合片段与新冠病毒具有较高的结合能力，且具有较优的中和活性(中和活性的IC50值都低于μg/mL级别)、较好的突变病毒覆盖谱，多样的结合表位。

Description

一种抗冠状病毒的抗体及其应用
本申请要求申请日为2020/8/10的中国专利申请2020107970201的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗冠状病毒的抗体及其应用，所述冠状病毒为新型冠状病毒，特别涉及一种特异性结合新型冠状病毒抗原S-RBD蛋白的抗体及其抗原结合片段。
背景技术
新型冠状病毒感染(世界卫生组织正式命名新型冠状病毒引发的疾病为COVID-19，新型冠状病毒为SARS-CoV-2)对全球的公共卫生和经济造成了巨大破坏。它快速传播并成为全球大流行病，严重程度是前所未有的。它对全球经济和医疗体系造成了巨大破坏，而且这种影响很可能将持续很长时间。
研究表明，SARS-CoV-2病毒利用自生的刺針蛋白(S蛋白)与人细胞膜上的血管紧张素转换酶II(ACE2)结合，从而侵入并进一步感染目标细胞。SARS-CoV-2的S蛋白由S1和S2子单元组成，而其用于结合ACE2蛋白的结构域(又被称为受体结合结构域，RBD)位于S1亚基中(SARS-CoV-2Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by TMPRSS2and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor,Hoffmann et al.,2020,Cell 181,1–10)。如果能够阻断S-RBD结构域与ACE2蛋白的相互作用，则很大程度上有可能阻断SARS-CoV-2的感染途径，从而进一步阻止病毒的感染。上述研究成果都提示，SARS-CoV-2的S-RBD蛋白很有可能成为新冠治疗的一个重要靶标。
目前，全球都在为快速开发有效治愈新冠感染的方法上付出努力。大量新型或是已经上市的小分子药物的临床试验，疫苗和抗体等大分子药物的临床前到临床开发等，都在全球范围内快速推进。然而，由于新冠病毒的特殊性，至今整个治疗以及预防药物的开发工作仍在等待重大的突破或成功。
正在开发的治疗手段中，小分子药物，例如瑞德西韦、氯喹在某些治疗病例中显示出某些阳性结果，但在随后的临床试验中并未证明有效。此外，这些小分子药物的副作用可能很严重(Rethinking the role of hydroxychloroquine in the treatment of COVID-19，Meyerowitz et al.,FASEB J.2020May；34(5):6027-6037；Hydroxychloroquine andchloroquine:a potential and controversial treatment for COVID-19,Zou et al.,Arch Pharm Res.2020Aug 1；Remdesivir for the Treatment of COVID-19:ASystematic Review of the Literature,Musa et al.,West J Emerg Med.2020May 20；21(4):737-741)。
疫苗是最常见的抗病毒感染的治疗方法，已按预期大量感染。这包括传统疫苗和新型疫苗，例如mRNA疫苗。大量的患者血液样本为疫苗开发提供了足够的资源，与开发其他新药物相比，估计的疫苗生产时间表相对较快。目前，临床试验中目前报告了数十种疫苗。但是，一些最新研究开始质疑疫苗刺激的中和抗体对SARS-CoV-2的耐受性，这可能会严重影响这种治疗的有效性(QX Long et al.,Clinical and immunological assessment ofasymptomatic SARS-CoV-2infections,Nature Medicine 26,1200–1204(2020))。
另一个选择是抗体药物，它已成为治疗重大疾病(如癌症)的重要力量。通常，抗体药物在特异性，给药频率和毒副作用方面具有明显的优势。尽管抗体药物的开发可能需要很长时间。目前，抗SARS-CoV-2抗体的第一轮研发成果大部分集中于从康复患者血液中筛选中和抗体，或从以往冠状病毒(如2003年的SARS病毒)的中和抗体中筛选与SARS-CoV-2有较好的交叉反应的中和抗体。目前以及报道了十几种有治疗前景的中和抗体，其中一些已进入临床阶段(CY Wang et al.,A human monoclonal antibody blocking SARS-CoV-2infection,Nature Communications,11,2251(2020)；R Shi et al.,A humanneutralizing antibody targets the receptor binding site of SARS-CoV-2,Nature,584,120–124(2020)；D Pinto et al.,Cross-neutralization of SARS-CoV-2by a humanmonoclonal SARS-CoV antibody,Nature,583,290–295(2020)；M Yuan et al.,A highlyconserved cryptic epitope in the receptor-binding domains of SARS-CoV-2andSARS-CoV,Science,08May 2020:Vol.368,Issue6491,pp.630-633)。这些抗体虽然获得快速，但是往往表现出相对较低的靶标亲和力，和相对较弱的中和活性。抗SARS-CoV-2抗体的第二波浪潮则大部分使用SARS-CoV-2S1蛋白或SARS-CoV-2S-RBD蛋白作为特抗原进行特异性免疫筛选，获得特异性更好，亲和力更高的抗体。以这种方式产生的抗体需要经历更多更长时间的筛选开发，因此有望具有更好的性能，如更高的结合亲和力，更高的中和活性，更突出的稳定性，以及更优的临床效果等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中缺乏有效地抗冠状病毒的抗体，提供一种抗新型冠状病毒的抗体，特别是特异性结合新型冠状病毒抗原S-RBD蛋白的抗体及其抗原结合片段。
本发明主要通过以下技术手段解决上述技术问题。
本发明第一方面提供一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述的轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中：
所述HCDR1包含如SEQ ID NO.1所示的序列或其变体1、如SEQ ID NO.2所示的序列或其变体2、如SEQ ID NO.3所示的序列或其变体3、如SEQ ID NO.9所示的序列或其变体7、如SEQ ID NO.112、52、28～31所示的序列构成的群组中的氨基酸序列，所述HCDR2包含选自由如SEQ ID NO.4所示的序列或其变体4、如SEQ ID NO.5所示的序列或其变体5、如SEQ IDNO.6所示的序列或其变体6、如SEQ ID NO.8所示的序列或其变体8、如SEQ ID NO.7、32～34、68和189所示的序列构成的群组中的氨基酸序列，所述HCDR3包含选自由SEQ ID NO.10或其变体10、如SEQ ID NO.12所示的序列或其变体12、SEQ ID NO.69、35、73、36、37～42以及74所示的序列组成的群组中的氨基酸序列；
所述LCDR1包含选自由如SEQ ID NO.14所示的序列或其变体14、如SEQ ID NO.15所示的序列或其变体15、如SEQ ID NO.16所示的序列或其变体16、如SEQ ID NO.17所示的序列或其变体17、如SEQ ID NO.18所示的序列或其变体18、如SEQ ID NO.19所示的序列或其变体19以及如SEQ ID NO.43所示的序列组成的群组中的氨基酸序列，所述LCDR2包含选自由如SEQ ID NO.20所示的氨基酸或其变体20、如SEQ ID NO.21所示的氨基酸或其变体21、如SEQ ID NO.22所示的氨基酸或其变体22、SEQ ID NO.44～47所示的序列组成的群组中的氨基酸序列，所述LCDR3包含选自由如SEQ ID NO.23所示的序列或其变体9、如SEQ IDNO.24所示的序列或其变体11、如SEQ ID NO.25所示的序列或其变体25、如SEQ ID NO.26所示的序列或其变体26、如SEQ ID NO.27所示的序列或其变体13、SEQ ID NO.48～50、95、104以及101组成的群组中的氨基酸序列；
所述变体1含有突变F2Y、S5N/T、S6D/Y/E、Y7N/F以及G8T中的一个或多个，所述变体2含有突变T6S和/或T10N，所述变体3含有突变E6R、T8D、M9I以及H10Y/L/N中的一个或多个，所述变体7含有突变G6S；
所述变体4含有突变I2L、N6Q、G7D、T9N、S10T/G以及F15L中的一个或多个，所述变体5含有突变T9S和/或K16M，所述变体6含有突变V1I、N8Y、K9R/T/Q、F10Y以及Q16K中的一个或多个，所述变体8含有突变V7A和/或K16Q；
所述变体10含有突变A1G、D2G、G3T以及E5D中的一个或多个，所述变体12含有突变D1E、Y7F以及M9L中的一个或多个；
所述变体14含有突变G10S，所述变体15含有突变S3T、E4K、D7S、S8T、Y9S、N11Y、F13Y以及H15F中的一个或多个，所述变体16含有突变T3S和/或H10Y、所述变体17含有突变G7D，所述变体18含有突变I6V、W9Y/D以及A11N中的一个或多个，所述变体19含有突变H8Q、N10D以及F14Y中的一个或多个；
所述变体20含有突变Y4H/S，所述变体21含有突变K1A、A2T以及K6E/Q中的一个或多个，所述变体22含有突变S1R/L、T2A以及A6E中的一个或多个，所述变体9含有突变N5T，所述变体11含有突变G3A，所述变体25含有突变T5S和/或T7P，所述变体26含有突变S7W，所述变体13含有Q1S、N4T、E5H以及G6V/D中的一个或多个。
在本发明所述的抗体或其抗原结合片段中，较佳地：所述的HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或其变体3所示、所述的HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或其变体4所示且所述HCDR3如SEQ ID NO.12或其变体12所示；
或者，所述的HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或其变体1所示、所述的HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6或其变体6所示且所述的HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.38、40、42或者74所示。
在本方面一较佳实施方案中，所述变体1的序列如SEQ ID NO.51、54、55或者108所示，所述变体2的序列如SEQ ID NO.11或者81所示，所述变体3的序列如SEQ ID NO.109、110、111或者13所示，所述变体7的序列如SEQ ID NO.53所示，所述变体4的序列如SEQ IDNO.56～59以及SEQ ID NO.187中任一所示，所述变体5的序列如SEQ ID NO.60所示，所述变体6的序列如SEQ ID NO.106或者61～67中任一个所示，所述变体8的序列如SEQ ID NO.107所示，所述变体10的序列如SEQ ID NO.70或者SEQ ID NO.186所示，所述变体12的序列如SEQ ID NO.71、72或者188所示。
进一步较佳地：
所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.51所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.56所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.69所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.60所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.112所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.107所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.73所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.70所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.52所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.109所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.71所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.110所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.57所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.111所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.58所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.72所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.81所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.53所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.73所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.69所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.68所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.54所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.106所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.55所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.61所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.74所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.62所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.74所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.55所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.63所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.74所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.64所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.74所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.108所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.65所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.74所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.66所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.74所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.67所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.81所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.186所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.109所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.187所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.188所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.189所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.73所示；
更佳地，所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.113～137或其变体所示，所述变体与突变前的序列具有至少90％、至少95％或者至少99％的序列同一性，同时至少保留突变前序列的功能；所述变体的序列优选SEQ ID NO.164～166、SEQ ID NO.171～179中任一个所示。
基于如上所述的抗体或其抗原结合片段，较佳地：
所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.15或其变体15所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.22或其变体22所示且所述LCDR3如SEQ ID NO.27或其变体13所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.17或其变体17所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.20或其变体20所示且所述LCDR3如SEQ ID NO.23或其变体9所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18或其变体18所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.21或其变体21所示且所述LCDR3如SEQ ID NO.26或其变体26所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.19或其变体19所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示且所述LCDR3如SEQ ID NO.24或其变体11所示。
更具体地，所述变体14的序列优选如SEQ ID NO.75所示，所述变体15的序列优选如SEQ ID NO.76或者77所示，所述变体16的序列优选如SEQ ID NO.78或者79所示，所述变体17的序列优选如SEQ ID NO.80所示，所述变体18的序列优选如SEQ ID NO.82或者83所示，所述变体19的序列优选如SEQ ID NO.84～86中任一个所示，所述变体20的序列优选如SEQ ID NO.89或者90所示，所述变体21的序列优选如SEQ ID NO.93或者94所示，所述变体22的序列优选如SEQ ID NO.87、88或者92所示，所述变体9的序列优选如SEQ ID NO.96所示，所述变体11的序列优选如SEQ ID NO.103所示，所述变体25的序列优选如SEQ IDNO.100所示，所述变体26的序列优选如SEQ ID NO.105所示，所述变体13的序列优选如SEQID NO.98或者99所示，较佳地：
所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.44所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.95所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.87所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.98所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.77所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.88所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.48所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.78所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.76所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.87所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.45所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.99所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.80所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.89所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.96所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.80所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.96所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.90所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.100所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.75所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.101所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.79所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.92所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.49所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.82所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.93所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.50所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.83所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.46所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.102所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.94所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.84所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.85所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.103所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.105所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.86所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.103所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.103所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.84所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.104所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.80所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.90所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.96所示；
更佳地，所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.138～157、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.97或其变体所示，所述变体与突变前的序列具有至少90％、至少95％或者至少99％的序列同一性，同时至少保留突变前序列的功能；所述变体的序列优选如SEQ IDNO.158～163、SEQ ID NO.167～170以及SEQ ID NO.180～183中的任一个所示。
在本发明一具体实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.113所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.138所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.114所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.139所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.115所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.140所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.116所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.141所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.117所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.142所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.118所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.143所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.119所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.144所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.120所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.145所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.121所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.146所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.122所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.147所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.123所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.139所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.124所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.148所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.125所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.149所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.126所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.150所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.127所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.151所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.128所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.152所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.129所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.153所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.130所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.154所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.131所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.155所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.132所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.156所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.133所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.154所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.134所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.157所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.135所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.155所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.136所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.91所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.137所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.97所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.174所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.150所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.173所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.169所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.173所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.168所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.173所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.167所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.172所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.169所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.172所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.168所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.172所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.167所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.171所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.169所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.171所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.168所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.171所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.167所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.179所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.183所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.178所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.182所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.178所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.181所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.178所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.180所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.177所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.182所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.177所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.181所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.177所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.180所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.176所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.182所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.176所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.181所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.176所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.180所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.175所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.182所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.175所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.181所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.175所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.180所示。
具体详见下表，表中数字指的是SEQ ID NO.。本发明使用Chothia编号规则，CDR区划分则参考Chothia和KABAT混合规则。
抗体名称 VH VL HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
PR300872 113 138 51 56 69 14 44 95
PR300874 114 139 11 60 10 15 87 98
PR300886 115 140 112 32 35 77 88 48
PR300902 116 141 9 107 73 78 22 25
PR300911 117 142 2 5 70 76 87 27
PR300914 118 143 52 33 36 43 45 99
PR300928 119 144 109 4 71 80 89 96
PR300929 120 145 110 57 12 17 20 23
PR300950 121 146 111 4 12 80 20 96
PR300953 122 147 3 58 72 17 90 23
PR300961 123 139 81 5 10 15 87 98
PR300965 124 148 53 8 73 16 22 100
PR300985 125 149 3 59 69 75 44 101
PR300992 126 150 28 68 37 79 92 49
PR301042 127 151 54 106 38 82 93 50
PR301052 128 152 29 34 39 83 46 102
PR301056 129 153 1 6 40 18 94 26
PR301077 130 154 55 61 74 84 47 24
PR301078 131 155 30 62 74 85 47 103
PR301086 132 156 13 7 41 18 21 105
PR301099 133 154 55 63 74 84 47 24
PR301100 134 157 31 64 74 86 47 103
PR301103 135 155 108 65 74 85 47 103
PR301105 136 91 1 66 74 19 47 103
PR301261 137 97 1 67 42 84 47 104
PR301441 173 169 81 5 10 15 87 98
PR301555 173 168 81 5 10 15 87 98
PR301556 173 167 81 5 10 15 87 98
PR301557 172 169 81 5 10 15 87 98
PR301442 172 168 81 5 10 15 87 98
PR301558 172 167 81 5 10 15 87 98
PR301559 171 169 81 5 186 15 87 98
PR301560 171 168 81 5 186 15 87 98
PR301443 171 167 81 5 186 15 87 98
PR301444 178 182 109 4 71 80 89 96
PR301561 178 181 109 4 71 80 89 96
PR301562 178 180 109 4 71 80 90 96
PR301563 177 182 109 4 71 80 89 96
PR301445 177 181 109 4 71 80 89 96
PR301564 177 180 109 4 71 80 90 96
PR301565 176 182 109 4 71 80 89 96
PR301566 176 181 109 4 71 80 89 96
PR301446 176 180 109 4 71 80 90 96
PR301567 175 182 109 187 188 80 89 96
PR301568 175 181 109 187 188 80 89 96
PR301447 175 180 109 187 188 80 90 96
如上所述的抗体或其抗原结合片段，其可为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、双特异性抗体、多特异性抗体、重链抗体、单域抗体或单区抗体的形式，或为由上述抗体制得的单克隆抗体或多克隆抗体。
当为全长抗体时，其轻链恒定区可包含人源的κ、λ链或其变体，本发明一较佳实施例中所用轻链恒定区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.184所示；其重链恒定区可包含人源的IgG1,2,3,4或其变体。本发明一较佳实施例中所用重链恒定区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.185所示。
另外，本发明所述抗体或其抗原结合片段能够其特异性结合，但不限于新型冠状病毒抗原S-RBD蛋白。
本发明的第二方面提供了一种分离的核酸，其编码如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明的第三方面提供了一种包含如本发明第二方面所述的分离的核酸的表达载体。
本发明的第四方面提供了一种宿主细胞，其包含如本发明第三方面所述的表达载体；优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
本发明的第五方面提供了一种抗新型冠状病毒抗原S-RBD蛋白或其抗原结合片段的制备方法，其包含培养如本发明第四方面所述的宿主细胞。
本发明的第六方面提供了一种药物组合物，其包含如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明的第七方面提供了如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段在制备治疗新型冠状病毒相关的疾病的药物中的应用。
本发明的第八方面提供一种嵌合抗原受体，其包含如上所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明的第九方面提供一种抗体药物偶联物，其包含细胞毒性剂，以及如上所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明的第十方面提供一种试剂盒，其包括如如上所述的抗体或其抗原结合片段、如上所述的药物组合物、如上所述的嵌合抗原受体和/或如上所述的抗体药物偶联物。
本发明的第十一方面提供一种套装药盒，其包含药盒A和药盒B，其中：
所述药盒A含有如上所述的抗体或其抗原结合片段、如上所述的药物组合物、如上所述的嵌合抗原受体和/或如上所述的抗体药物偶联物；
所述药盒B含有其他抗肿瘤抗体或者包含所述其他抗肿瘤抗体的药物组合物，和/或由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。
本发明的第十一方面提供一种诊断、治疗和/或预防冠状病毒介导的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的如上所述的抗体或其抗原结合片段、如上所述的嵌合抗原受体、如上所述的抗体药物偶联物或如上所述的药物组合物，或者使用如上所述的套装药盒治疗有需要的患者。
本发明的第十二方面提供一种免疫检测或者测定冠状病毒的方法，其包括使用如上所述的抗体或其抗原结合片段、如上所述的嵌合抗原受体、如上所述的抗体药物偶联物或如上所述的药物组合物；优选地，所述检测为非诊断和/或治疗目的的。
本发明的第十三方面提供一种联合疗法，其包括分别向有需要的患者施用如上所述的抗体或其抗原结合片段、如上所述的嵌合抗原受体、如上所述的抗体药物偶联物或如上所述的药物组合物，和第二治疗剂；所述第二治疗剂较佳地包含其他抗肿瘤抗体或者包含所述其他抗肿瘤抗体的药物组合物，和/或由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。
本发明的第十四方面提供一种给药装置，其特征在于，所述给药装置包括如上所述的抗体或其抗原结合片段、如上所述的嵌合抗原受体、如上所述的抗体药物偶联物或如上所述的药物组合物；
优选地，所述给药装置还包括将所述抗体或其抗原结合片段、所述嵌合抗原受体、所述抗体药物偶联物或者所述药物组合物施用于受试者的部件，例如注射器或输液装置。
此处需要说明的是：本发明中所述“变体1”、“变体2”以及“变体3”等中的数字本身并无特殊含义，仅为区分相同术语。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的抗体或其抗原结合片段与新冠病毒具有较高的结合能力，且具有较优的中和活性(中和活性的IC50值都低于μg/mL级别)、较好的突变病毒覆盖谱，多样的结合表位。此外，本发明抗体或其抗原结合片段具有更优的对于新冠S蛋白与人ACE2蛋白的阻断效果，以及较优的稳定性与成药性。
附图说明
图1显示了人源化抗体的中和活性。
图2显示了鼠源抗体的中和活性。
图3显示了PR300902VH和VL的变体与原始序列的比对。
图4显示了PR300928VH和VL的变体与原始序列的比对。
图5显示了PR300961VH和VL的变体与原始序列的比对。
图6显示了PR301077小鼠病毒预防和治疗实验。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
在本申请中，术语“抗体”通常是指包含结合抗原的部分的蛋白质，以及任选地允许结合抗原的部分采用促进抗体与抗原结合的构象的支架或骨架部分。可典型地包含抗体轻链可变区(VL)、抗体重链可变区(VH)或上述两者。例如本申请中的“重链抗体”不含VL区，仅含VH区。VH或VL区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为框架区(FR)的更保守的区域中。每个VH或VL可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的实例包括但不限于全长抗体、重链抗体(HCAb)、抗原结合片段(Fab，Fab’、F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv和/或dAb)、免疫缀合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、抗体衍生物、抗体类似物或融合蛋白等，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
在本申请中，术语“可变”通常是指这样的事实，即抗体的可变结构域的序列的某些部分变化强烈，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性并非均匀地分布在抗体的整个可变区中。它集中在轻链和重链可变区中的三个区段，称为CDR或高变区(HVR)，FR为可变域中更高度保守的部分。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，大部分采用β-折叠构型，通过三个CDRs连接，形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDRs通过FR区紧密靠近在一起，并与来自另一条链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点，恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
在本申请中，术语“核酸”是指DNA分子和RNA分子。其可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
在本申请中，术语“特异性结合”通常是指抗体通过其抗原结合域与表位结合，并且该结合需要抗原结合域和表位之间的一些互补性。根据该定义，当抗体相比于其将结合随机的，不相关的表位而言更容易通过其抗原结合域与表位结合时，抗体被称为“特异性结合”该抗原。
在本申请中，术语“Fab”通常指常规抗体(例如IgG)中与抗原结合的部分，包括抗体的重链可变区VH、轻链可变区VL和重链恒定区结构域CH1以及轻链恒定区CL。在常规抗体中，VH的C端与CH1的N端联结形成重链Fd片段，VL的C端与CL的N端联结形成轻链，CH1的C端又进一步与重链的铰链区和其他恒定区结构域联结形成重链。在一些实施例中，“Fab”也指Fab的变体结构。例如，在某些实施例中，VH的C端与CL的N端联结形成一个多肽链，VL的C端与CH1的N端联结形成另一个多肽链，形成Fab(cross VH/VL)的结构；在某些实施例中，Fab的CH1不与铰链区联结，而是CL的C端与重链的铰链区联结，形成Fab(cross Fd/LC)的结构。
在本申请中，术语“VH”通常指抗体的重链可变区VH结构域，即可以是人或者其他动物的常规抗体(H2L2结构)的重链可变区VH，也可以是骆驼科等动物的重链抗体(HCAb结构)的重链可变区VHH，还可以是利用Harbour HCAb转基因小鼠产生的全人源重链抗体(HCAb结构)的重链可变区VH。
在本领域中，可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于序列可变性的Kabat定义规则(参见，Kabat等人，免疫学的蛋白质序列，第五版，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991))和基于结构环区域位置的Chothia定义规则(参见，A1-Lazikani等人，JMol Biol 273:927-48,1997)。本申请还可使用包含Kabat定义和Chothia定义的Combined定义规则确定可变结构域序列和全长抗体序列中的氨基酸残基。在本发明中，根据Chothia定义确定各序列。
本发明涉及的多种抗SARS-CoV-2抗体，是相关研发人员使用SARS-CoV-2-S-RBD作为特异性抗原，免疫野生型或者人源化小鼠(H2L2 https://harbourantibodies.com/science-technology/h2l2/#.Xxj_oZ4zbIU)，并进一步通过Beacon平台(Ref.https://www.berkeleylights.com/systems/beacon/,Rapid single B cell antibody discoveryusing nanopens and structured light,mAbs,https://doi.org/10.1080/19420862.2019.1624126)进行单B细胞筛选得到的。它们具有较高的针对S-RBD的亲和力，以及优异的对SARS-CoV-2病毒的中和效果。这些抗体有可能发展成为有效的药物和疗法，从而为COVID-19提供有效的治疗方法。
本发明对选定的鼠源中和抗体进行了人源化，同时对于几个选定的中和抗体都进行了翻译后修饰的序列优化。对于人源化以及序列优化的抗体，都使用BLI(或者ELISA)的方法考察了其对于新冠S蛋白的亲和力变化，用竞争ELISA法考察了其对于新冠S蛋白与人ACE2蛋白相互左右的阻断活性变化。同时，利用293瞬转的表达量，蛋白纯度(SEC以及SDS-PAGE考察)，以及Uncle(Unchained Labs)检测Tm，Tagg，分子聚集度等指标，考察并比较其成药性。结果显示，这些候选蛋白都表现出较好的成药性，且其人源化和翻译后修饰改良都很成功。
以下将通过具体实施例详细介绍本发明。
实施例1能高效结合新冠RBD蛋白以及新冠S蛋白的候选抗体的初步获得
使用2019新型冠状病毒(SARS-CoV2-2019)的S蛋白中的RBD结构域(受体结合结构域)免疫野生型(BALB/c，共5只)或者人源化(H2L2，共10只)小鼠，并通挑选血浆对抗原阳性反应的小鼠取其的脾细胞和骨髓细胞，用Miltenyi(Miltenyi Biotec,#130-092-530)和Stem Cell的试剂盒(Stemcell,#18957)富集表达抗体的浆细胞(plasma B cell)。再通过Beacon(Berkeley Lights，
Figure BDA0003203482730000171
Optofluidic System)初步考察单个B细胞培养上清对新冠RBD蛋白的结合情况，并导出培养上清能有效结合新冠RBD的阳性细胞，随后通过分子克隆手段扩增出单个B细胞中的抗体可变区序列，并进行测序。测序后进行分析，将CDR区序列完全一致的抗体作为一个独立序列，共获得191个独立的鼠源抗体重轻链对(一个独立鼠源抗体对包括一个VH，一个VL两个序列)，以及105个独立的人源抗体重轻链对。
将获得的独立序列通过基因合成以及分子克隆手段，得到相应抗体的哺乳动物表达载体，并将其使用PEI(SIGMA,#24885)转染至HEK293T细胞在24孔板中培养3天。培养条件：37℃,5％二氧化碳。取0.1mL培养上清通过ELISA的方法检测其对新冠S蛋白(后简称S蛋白)的结合活性。
方法描述：S蛋白SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike Protein(S1 Subunit,His Tag),(Sino Biological,#40591-V08H)4℃包被免疫板过夜，封闭之后加入100μL上清，室温反应1小时，之后加入二抗anti-Human IgG(Fc)HRP(Jackson Immuno Research Labs，#109-035-098)反应1小时。使用TMB显色试剂盒(潮州英创生物科技有限公司，TMB-S-003)进行显色，反应终止之后在SpectraMax PLUS 384酶标仪(Molecular Devices)上，读取其OD405。OD405>0.25被标注为阳性。
24孔版培养上清检测之后，共有56株全人候选抗体，71株鼠源候选抗体序列在ELISA上的OD405>0.25，被初步确认为阳性候选。
筛选出的候选抗体株将在HEK293悬浮细胞体系中进行瞬时培养，并获得纯化的抗体蛋白用于进一步的考察。
实施例2候选阳性抗体使用HEK293细胞进行瞬时表达和纯化
将实施例1筛选获得的阳性抗体株的哺乳动物表达载体，使用PEI(SIGMA,#24885)转染至HEK293F悬浮细胞(Gibco,#R79007)中，并在所述培养条件中培养7天。培养条件：37℃,5％二氧化碳,125rpm。培养上清收获之后，通过Protein A(AmMag Protein A MagneticBeads,Genscript,L00695)纯化用填料进行亲和层析纯化。得到的蛋白通过SDS-PAGE的方式(SurePAGE,Bis-Tris,10x8,4-12％,12wells,Genscript,M00653)初步考察其纯度。
所有候选蛋白在HEK293瞬时表达体系中的表达情况在约10mg/L～100mg/L之间。且这些候选抗体的SDS-PAGE结果都显示其获得的抗体纯度>90％。
上述瞬时表达结果表明初步筛选获得的阳性抗体，都具有较好的成药性，为后续开发提供了保障。
实施例3候选阳性抗体的ELISA结合活性考察
将上一步获得的阳性候选抗体，通过ELISA的方法，检测其对于新冠S蛋白的结合活性
方法描述：S蛋白SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike Protein(S1 Subunit,His Tag),(Sino Biological,#40591-V08H)和2019-nCoV Spike Protein(S1 Subunit,His Tag)(Genscript，批号：P9FE001)，4℃包被免疫板过夜，封闭之后加入梯度稀释的候选抗体(梯度稀释选择的浓度，如15μg/mL起始，10倍梯度稀释，到0.000015μg/mL，共7个浓度)，室温反应1小时，之后加入二抗anti-Human IgG(Fc)HRP(Jackson Immuno Research Labs，#109-035-098)反应1时间。使用TMB显色试剂盒(潮州英创生物科技有限公司，TMB-S-003)进行显色，反应终止之后在SpectraMax PLUS 384酶标仪(Molecular Devices)上，读取其OD405。用Graphpad将每个抗体的OD405对其浓度的对数值作图，并通过四参数拟合，获得该抗体结合新冠S蛋白的EC50值。
部分阳性抗体的EC50值见下表1-1。
表1-1
Figure BDA0003203482730000191
上述抗体与新冠S蛋白ELISA检测的EC50值基本都达到了～10pM甚至更低的级别。这一结果比目前文献报道的现有抗体要更优(D.Wrapp et al.,Structural Basis forPotent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain CamelidAntibodies,2020,Cell 181,1–12；Z.Lv et al.,Structural basis for neutralizationof SARS-CoV-2and SARS-CoV by a potent therapeutic antibody,Science 10.1126/science.abc5881(2020))，预示了本发明的候选抗体与新冠病毒S蛋白有更强的结合能力。
对上述抗体的VH和VL序列使用Chothia规则进行编号，并综合考虑Chothia和KABAT的规则确定其CDR区。具体见表1-2、1-3。
表1-2
Figure BDA0003203482730000192
Figure BDA0003203482730000201
表1-3
Figure BDA0003203482730000202
Figure BDA0003203482730000211
实施例4候选阳性抗体的ELISA阻断活性考察
将实施例2种获得的阳性候选抗体，通过ELISA的方法，检测其对于新冠S蛋白-人ACE2蛋白相互作用的阻断活性
方法描述：ACE2蛋白Human ACE2 protein,His tag(Acro，#AC2-H52H8)和HumanACE2 protein,hFc tag(Genscript，#T80801(no catalog product),Lot:T2006002)4℃包被免疫板过夜，封闭之后加入待检测的候选抗体(梯度稀释选择的浓度，如15μg/mL起始，10倍梯度稀释，到0.000015μg/mL，共7个浓度)，同时加入人RBD蛋白(mFc-tag)(SinoBiological,#40592-V05H)，37℃反应1小时。之后加入二抗anti-Mouse IgG(Fc)HRP(Sigma，#A0168)反应1时间。使用TMB显色试剂盒(潮州英创生物科技有限公司，#TMB-S-003)进行显色，反应终止之后在SpectraMax PLUS 384酶标仪(Molecular Devices)上，读取其OD405。用Graphpad将每个抗体的OD405对其浓度的对数值作图，并通过四参数拟合，获得该抗体阻断新冠S蛋白与人ACE2蛋白的IC50值。
部分阳性抗体的IC50值见下表2。对于不完全阻断的抗体，不呈现IC50值，只写最高浓度的抑制率，完全不阻断的抗体用“NA”表示。
表2
Figure BDA0003203482730000212
Figure BDA0003203482730000221
上述抗体中，明确具有阻断效果的候选抗体，其阻断新冠S蛋白与人ACE2蛋白相互作用的效果，IC50值较低，基本都达到了nM或者sub-nM的级别，更有部分达到了～10pM级别。这些数据与文献报道的现有抗体相比较(D.Wrapp et al.,Structural Basis forPotent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain CamelidAntibodies,2020,Cell 181,1–12；Z.Lv et al.,Structural basis for neutralizationof SARS-CoV-2and SARS-CoV by a potent therapeutic antibody,Science 10.1126/science.abc5881(2020))，展示出了更优的对于新冠S蛋白与人ACE2蛋白的阻断效果。
实施例5候选阳性抗体通过BLI方法考察其亲和力
将实施例2获得的阳性候选抗体，通过生物膜干涉(Biolayerinterferometry，BLI)的方法，检测其对于新冠S蛋白，以及新冠RBD蛋白的结合动力学方法描述：将候选稀释至终浓度6μg/mL直接固化到AHC biosensor上，对动力学测量，将抗原蛋白(新冠S蛋白，或新冠RBD蛋白，相关信息见前述)用10X Kinetics buffer分别稀释至800nM,400nM,200nM，100nM，50nM，25nM其中的3个浓度(取决于结合信号的强弱)，进样100s，解离时间为400-800s，10mM glycine HCl(pH1.5)再生15s。使用简单一对一Languir结合模型(Octet Red96数据分析软件)，计算结合速率(kon)和解离速率(kdis)。平衡解离常数(kD)以比率kdis/kon计算。
测量的亲和力结果见表3-1。
表3-1
Figure BDA0003203482730000231
上述抗体与新冠S蛋白的亲和力达到nM和0.1nM级别，与新冠RBD蛋白的结合能达到pM的级别。这些结果显示本发明的候选抗体与新冠病毒有很高的结合能力。
实施例6候选阳性抗体通过体外病毒感染法考察其中和活性
将SARS-CoV-2病毒(100TCID50每孔)和稀释的抗体的混合物在37℃孵育1小时，然后接种至预先传代至96孔板的VeroE6细胞，在37℃继续培养48小时。采用免疫荧光检测抗体中和效率：弃去细胞上清，用在PBS(pH＝7.2)配置的4％多聚甲醛于室温固定细胞15分钟，PBS洗涤细胞3次后，再用0.25％的Triton-X 100透化细胞10-15分钟。PBS洗涤3次后，使用含5％BSA的PBS在37℃封闭细胞1小时，然后与自制的抗SARS-CoV-2NP兔血清作为一抗37℃孵育2小时，经PBS洗涤后再与荧光素488标记的羊抗兔IgG二抗孵育。用Hoechst 33258将细胞核染色10分钟。用Operetta CLSTM高内涵细胞分析系统扫描细胞荧光图并计数分析每孔细胞总数与病毒感染细胞个数。采用Graphpad软件计算抗体抑制病毒的IC50和IC90。
实验结果详见图1和图2，通过图1和图2可知：上述抗体对新冠病毒具有极高的中和活性，其IC50均达到几十到几百ng/ml的级别，展示出优异的抑制病毒效果，预示其将来在临床上会展示出优秀的抗病毒疗效。
各分子的IC50值信息见下表3-2(表中IC50单位为μg/mL)。
表3-2
抗体名称 IC50 抗体名称 IC50 抗体名称 IC50
PR301052 0.6482 PR301078 0.5416 PR300902 1.093
PR301056 0.4059 PR301100 ～0.6077 PR300911 0.8193
PR301077 0.02791 PR301103 0.04720 PR300914 ～0.1048
PR301086 0.4353 PR301261 1.302 PR300928 0.04681
PR301099 ～0.05034 PR300872 0.6417 PR300992 0.1798
PR301105 0.4044 PR300874 0.1155 PR300961 0.1723
PR301042 1.752 PR300886 0.1488 PR300953 0.01659
PR300929 0.03002 PR300950 0.06778 PR300985 0.1598
PR300965 1.489
实施例7中和抗体通过竞争ELISA考察其相互之间的结合表位差异
将实施例6确认的具有中和活性的候选抗体，通过竞争ELISA的方法考察其相互之间的结合表位差异
方法描述：待检测抗体1μg/mL浓度下，4℃包被免疫板过夜，封闭之后加入与新冠S蛋白(GenScript,批号P9FE001，进行Biotin标记)混合的竞争抗体。竞争抗体浓度选择10μg/mL或者25μg/mL。没有加入竞争抗体的为对照组，37℃反应1小时。之后加入StreptavidinHRP(sigma,#S2438)反应1时间。使用TMB显色试剂盒(潮州英创生物科技有限公司，#TMB-S-003)进行显色，反应终止之后在SpectraMax PLUS 384酶标仪(Molecular Devices)上读取其OD405。使用该公式，得出两个抗体的阻断百分比(对照组的OD405-检测组的OD405)/对照组的OD405×100％。
根据这些抗体相互阻断的情况，对这些候选抗体进行抗原表位分组。其中，在同一个抗原表位组中的抗体，两两之间的ELISA阻断百分比>40％。这些候选抗体共可以分成如下几个抗原表位组。其中组1、2、3之间两两不竞争(即，抗原表位组1中的抗体，与抗原表位组2和3的抗体两两之间的阻断百分比小于20％)，组1.5与组1和2有部分竞争，组2.5与组2及组3部分竞争。组4与组1完全竞争，与组2，2.5，1.5部分竞争，与组3基本不竞争。具体见表4。
表4
Figure BDA0003203482730000241
Figure BDA0003203482730000251
通过竞争ELISA获得的抗原表位分组结果，显示了本发明获得的新冠病毒候选抗体，其结合表位的多样性。
实施例8中和抗体通过SEC考察其瞬时表达蛋白纯度
将实施例6中确认的具有中和活性的候选抗体，通过HPLC-SEC的方法考察其纯度
方法描述：按照实施例2所述方法瞬时转染表达并通过蛋白A亲和层析一步纯化，得到相应候选抗体。使用安捷伦1260Infinity II高效液相色谱仪，月旭Welch XtimateSEC-300分离柱，1X PBS，pH 7.4为流动相进行HPLC-SEC分析。得到的蛋白主峰纯度见下表。所有抗体的瞬时表达一步纯化后纯度都大于90％，大部分抗体都大于95％。该结果表明这些候选抗体具有较好的结构稳定性，将有助于后续药学开发。具体见表5。
表5
Figure BDA0003203482730000252
Figure BDA0003203482730000261
实施例9候选中和抗体通过假病毒法考察其体外中和活性
根据理化性质，抗原表位组，以及其他活性结果，挑选部分实施例6中确认的具有中和活性的候选抗体，通过体外假病毒感染的方法考察其中和活性。假病毒中和实验使用的是常规murine leukemia virus(MLV)体系构建的新冠假病毒。MLV新冠假病毒制备方法在相关文献(Millet,J.K.&Whittaker,G.R.Murine Leukemia Virus(MLV)-basedCoronavirus Spike-pseudotyped Particle Production and Infection.Bio Protoc 6,https://doi.org/10.21769/BioProtoc.2035 10.21769/BioProtoc.2035.(2016)和Cross-neutralization of SARS-CoV-2by a human monoclonal SARS-CoV antibody,Nature,583,290–295(2020))有详细描述。
中和实验方法描述：按照最终浓度的两倍准备待测抗体(稀释梯度从15μg/mL起始，5倍梯度稀释，到0.000038μg/mL，共9个浓度)。将准备好的待测抗体稀释液与等体积新冠假病毒在96孔板内混合并在室温孵育1个小时。加入20000个ACE2过表达的HEK293细胞，在37℃,5％二氧化碳培养箱中孵育48小时。然后使用Bio-GloTM(Promega，G7064)试剂盒进行检测。通过Envision仪器读取的荧光值确定感染程度，并使用GraphPad进行数据分析，计算出中和活性的IC50。
结果表明，这些候选抗体都在假病毒体系中展示出较优的中和活性，且中和活性的IC50值都低于μg/mL级别，具体如表6所示。该结果与真病毒中和活性结果相吻合。表6中抗体S309、REGN10987分别来源于现有技术文献"Cross-neutralization of SARS-CoV-2bya human monoclonal SARS-CoV antibody Nature.2020Jul；583(7815):290-295.doi:10.1038/s41586-020-2349-y.Epub 2020May 18；和"Studies in humanized mice andconvalescent humans yield a SARS-CoV-2 antibody cocktail Science.2020Aug 21；369(6506):1010-1014.doi:10.1126/science.abd0827.Epub 2020Jun 15。
表6假病毒中和活性结果(IC50)
抗体名称 中和效率(IC 50)(μg/mL)
PR301077 0.0077
PR301056 曲线拟合不好，约1.0
PR301086 3.071
PR300928 0.03039
PR300902 0.19
PR300961 0.1633
PR301099 0.1364
PR300953 0.01517
S309 部分抑制
REGN10987 0.1624
实施例10候选中和抗体的序列优化
根据理化性质、抗原表位组以及其他活性结果，挑选部分实施例6中确认的具有中和活性的候选抗体，根据其氨基酸序列性质进行优化。
方法描述：对于鼠源候选抗体，通过CDR-grafting+back mutation的方法进行人源化。同时对于所有候选抗体，通过突变去除其具有脱氨、异构、N-糖基化修饰，游离巯基的氨基酸残基。
获得的优化后的抗体可变区序列见下表7。得到优化抗体，通过实施例2的方式获得抗体蛋白，并初步考察其成药性，并与原始序列进行比较。通过实施例3的方法，考察其结合活性，并于原始序列抗体进行比较。
表7重链/轻链可变区的变体序列
Figure BDA0003203482730000271
Figure BDA0003203482730000281
几个优化后抗体重轻链可变区与原始序列的比对如附图3～5(与原始序列相同的氨基酸用点表示)。且优化后的抗体其结合活性与原始抗体相当。
表8人源化抗体结合数据
抗体名称 母抗体 可变区重链 可变区轻链 EC50 binds S1,nM
PR300961 SEQ ID NO.174 SEQ ID NO.170 0.005
PR301441 PR300961 SEQ ID NO.173 SEQ ID NO.169 0.0154
PR301555 PR300961 SEQ ID NO.173 SEQ ID NO.168 0.02315/0.01639
PR301556 PR300961 SEQ ID NO.173 SEQ ID NO.167 0.02719
PR301557 PR300961 SEQ ID NO.172 SEQ ID NO.169 0.04382
PR301442 PR300961 SEQ ID NO.172 SEQ ID NO.168 0.02938
PR301558 PR300961 SEQ ID NO.172 SEQ ID NO.167 0.0405
PR301559 PR300961 SEQ ID NO.171 SEQ ID NO.169 不结合
PR301560 PR300961 SEQ ID NO.171 SEQ ID NO.168 不结合
PR301443 PR300961 SEQ ID NO.171 SEQ ID NO.167 不结合
PR300928 SEQ ID NO.179 SEQ ID NO.183 0.01676
PR301444 PR300928 SEQ ID NO.178 SEQ ID NO.182 0.02036
PR301561 PR300928 SEQ ID NO.178 SEQ ID NO.181 0.02197
PR301562 PR300928 SEQ ID NO.178 SEQ ID NO.180 0.01503
PR301563 PR300928 SEQ ID NO.177 SEQ ID NO.182 0.02173
PR301445 PR300928 SEQ ID NO.177 SEQ ID NO.181 0.01472
PR301564 PR300928 SEQ ID NO.177 SEQ ID NO.180 0.01541
PR301565 PR300928 SEQ ID NO.176 SEQ ID NO.182 0.01428
PR301566 PR300928 SEQ ID NO.176 SEQ ID NO.181 0.01487
PR301446 PR300928 SEQ ID NO.176 SEQ ID NO.180 0.009434
PR301567 PR300928 SEQ ID NO.175 SEQ ID NO.182 7.543
PR301568 PR300928 SEQ ID NO.175 SEQ ID NO.181 9.41
PR301447 PR300928 SEQ ID NO.175 SEQ ID NO.180 2.221
实施例11候选中和抗体考察对突变体RBD蛋白或是突变病毒的覆盖程度
根据理化性质，抗原表位组，以及其他活性结果，挑选部分实施例6中确认的具有中和活性的候选抗体，通过ELISA的方法，检测其对于带有不同突变的新冠RBD蛋白的结合活性。同时，使用带有突变的S蛋白的假病毒，使用如以上实施例所述的假病毒中和实验，进一步验证候选抗体对突变体的覆盖程度。考察的突变体包括：F342L，N354D,N354D+D364Y,V367F,R408I,A435S,W436R,K458R,G476S,V483A,D364Y,V341I,D364Y,(Emergence of RBDmutations in circulating SARS-CoV-2strains enhancing the structural stabilityand human ACE2 receptor affinity of the spike protein,https://doi.org/10.1101/2020.03.15.991844)；Q493N(Structural basis of receptor recognition bySARS-CoV-2.Nature.2020May；581(7807):221-224.)；K444Q,V445A,Y453F,L455F,F486V,Q493K(Antibody cocktail to SARS-CoV-2spike protein prevents rapid mutationalescape seen with individual antibodies.Science，10.1126/science.abd0831，2020)；N439K,S494P,V483I,L455I&F456V(Bivalent binding of a fully human IgG to theSARS-CoV-2 spike proteins reveals mechanisms of potent neutralization,bioRxivpreprint doi:https://doi.org/10.1101/2020.03.15.991844)；The Impact ofMutations in SARS-CoV-2 Spike on Viral Infectivity and Antigenicity,Li etal.,2020,Cell 182,1–11文章中报道的突变体；以及近期出现的南非突变体K417N+E484K+N501Y，巴西突变体K417T+E484K+N501Y以及印度突变体L452R+E484Q。
ELISA结合考察的方法描述：上述突变体RBD蛋白4℃包被免疫板过夜，封闭之后加入候选中和抗体(梯度稀释选择的浓度，如15μg/mL起始，10倍梯度稀释，到0.000015μg/mL，共7个浓度)，室温反应1小时，之后加入二抗anti-Human IgG(Fc)HRP(Jackson ImmunoResearch Labs，货号109-035-098)反应1时间。使用TMB显色试剂盒(潮州英创生物科技有限公司，TMB-S-003)进行显色，反应终止之后在SpectraMax PLUS酶标仪(MolecularDevices，型号)上，读取其OD405。用Graphpad将每个抗体的OD405对其浓度的对数值作图，并通过四参数拟合，获得该抗体结合突变体RBD蛋白的EC50值(nM)。根据EC50值，对其结合情况进行考察，部分结果见下表9-1至表9-4。可以看到，本发明的候选抗体能覆盖大部分突变体。
表9-1
Figure BDA0003203482730000301
表9-2
Figure BDA0003203482730000311
表9-3
Figure BDA0003203482730000312
表9-4
Figure BDA0003203482730000313
上述抗体与目前文献报道的新冠RBD蛋白突变体均有结合，且结合能力和与野生型新冠RBD蛋白的结合能力在同一水平。该结果说明本发明的候选抗体具有较好的突变病毒覆盖谱，预示其在临床使用过程中，对于突变毒株会有更好的覆盖率与疗效。
假病毒中和考察的方法描述：将准备好的待测抗体稀释液(稀释梯度从50μg/mL起始，10倍梯度稀释，到0.000005μg/mL，共8个浓度)与等体积新冠假病毒在96孔板内混合并在室温孵育1个小时。加入ACE2过表达的HEK293细胞，在37℃,5％二氧化碳培养箱中孵育48小时。48小时后，取细胞洗净裂解，并加入荧光素酶底物考察通过假病毒感染进入细胞并表达的荧光素酶活性，在化学发光检测仪中读取数值。计算中和抑制率：抑制率＝[1-(样品组的发光强度均值-空白对照均值)/(阴性组的发光强度均值-空白对照均值)]*100％。根据中和抑制率结果，利用Reed-Muench法计算IC50。其IC50(μg/ml)见下表10。
表10
Figure BDA0003203482730000321
实施例12候选中和抗体通过Uncle考察成药性
根据理化性质，抗原表位组，以及其他活性结果，挑选部分实施例6中确认的具有中和活性的候选抗体，使用Uncle初步考察成药性。
方法描述：使用Uncle多功能蛋白质稳定性分析系统，上样9μL候选抗体于Uni管中，采用25-95℃(0.3℃/分钟)程序升温，分别于荧光模式和静态光散射(SLS)模式下测得Tm和Tagg值，动态光散射(DLS)模式下测得粒径分布结果。
获得结果见下表11：
表11
PR300874 PR300886 PR300928 PR301056 PR301077 PR301086
浓度 5mg/mL 3.5mg/mL 5.6mg/mL 2.7mg/mL 10mg/mL 1.8mg/mL
T<sub>m</sub>(℃) 72.71 69 75.03 70.92 70.11 80.7
T<sub>agg</sub>(℃)at 266nm 70.28 68.2 73.14 64.05 67.33 71.97
T<sub>agg</sub>(℃)at 473nm 73.73 71.83 75.57 76.84 69.13 75.38
初始SLS at 266nm(counts x10<sup>4</sup>) 0.31 0.28 0.29 0.29 0.28 0.22
最大SLS at 266nm(counts x10<sup>4</sup>) 13.99 52.22 23.41 6.59 36.68 46.87
初始diameter(nm)(25℃) 11.36 11.13 11.76 11.34 12.14 11.49
初始PDI 0.045 0.057 0.01 0.033 0.036 0.05
最终PDI 0.185 0.305 0.131 0.418 0.172 0.275
由表11可见，检测的抗体都表现出了优良的热稳定性，无聚集现象。
实施例13候选中和抗体通过小鼠模型考察体内药效
根据理化性质，抗原表位组，以及其他活性结果，挑选实施例6中确认的具有中和活性的候选抗体PR301077，使用小鼠模型考察其体内中和效果。
方法描述：选取8周左右的BALB/c小鼠，先注射IFNaR1的中和抗体阻断其IFNaR1的活性，随后注射Adv-hACE2，使其体内细胞表达人ACE2蛋白。约5天后，使用SARS-CoV-2病毒感染小鼠。病毒感染后2～12小时左右，给小鼠注射一定剂量(5mg/kg，20mg/kg两个剂量组)的待考察抗体，其中阴性对照组使用等体积的PBS溶液代替抗体。在随后的4天内观察小鼠的体重变化。感染后第4～5天处死小鼠，并考察小鼠肺部的病毒负载，小鼠体内各种细胞因子分泌情况，以及肺部的组织病理染色结果。
体内实验结果证明，PR301077在小鼠模型中表现出较好的抗病毒效果，如图6所示。
实施例14部分候选中和抗体晶体结构解析
根据理化性质，抗原表位组，以及活性结果，挑选实施例6中确认的具有中和活性的候选抗体PR301077，PR300953和PR300961，进行后续的晶体结构解析。
方法描述：由(GGGGS)3多肽连接子连接候选抗体的轻重链可变区形成单链可变区片段。用含有BamHI和NotI限制位点的pAcGP67载体(BD BaculoGoldTM，554756)合成该片段的cDNA，并用DH10Bac感受态细胞(Thermo Fisher,10361012)转化之后在Sf9细胞(GibcoTM，11496015)内进行表达。将表达出来的病毒去转染Hi5细胞(Thermo Fisher，B85502)，从而由培养上清里面纯化得到抗体的单链可变区片段。
将SARS-CoV-2RBD蛋白和纯化得到的单链可变区片段按1.2:1的摩尔比混合后孵育两小时，再用Superdex 75 16/60尺寸排阻色谱柱(GE Healthcare)进行纯化。4mg/mL和8mg/mL的SARS-CoV-2RBD/单链可变区片段复合体在16℃按照蒸气扩散沉滴法进行结晶筛选。结晶母液成分为1％w/v胰蛋白胨,0.001M叠氮化钠,0.05M HEPES钠盐(pH7.0),12％w/v聚乙二醇3,350，或者containing 0.8M四水酒石酸钠钾,0.1M Tris pH 8.5,0.5％w/v聚乙二醇单甲醚5,000，又或者0.2M氯化钠,0.1M Tris碱pH 8.5,29％w/v聚乙二醇3,350。7天后柱状晶体开始出现。晶体以4M甲酸钠作为保护剂用干燥氮蒸气进行冷冻保存。
晶体衍射数据的采集分别是在Beamline PX06SA of the Swiss Light Source,Paul Scherrer Institute,Villigen,Switzerland(波长,
Figure BDA0003203482730000331
)(PR301077),and ShanghaiSynchrotron Radiation Facility(SSRF)BL17U1(波长,
Figure BDA0003203482730000332
)(PR300953andPR300961)完成。数据处理使用MOSFLM或者HKL3000软件包。结构解析使用分子置换的方法和SARS-CoV-2RBD结构数据(PDB ID:6M0J)在PHASER软件中完成。在COOT软件中建立原始模型并在PHENIX软件里进一步优化。模型的几何结构用MolProbity程序进行验证。再用PyMOL画出结构图。抗体表位，互补位点及其相互作用通过European Bioinformatics Institute的PISA(http://www.ebi.ac.uk/pdbe/prot_int/pistart.html)进行确认。
抗体Fab与抗原Spike-RBD复合物的结构通过X射线晶体学分别获得
Figure BDA0003203482730000333
和
Figure BDA0003203482730000334
分辨率的解析结果。结构结果显示，所有三个单抗均识别出SARS-CoV-2突出蛋白RBD(Spike-RBD)的新型表位。总体而言，PR301077和PR300953结合RBD的表位与hACE2与RBD的结合位点(也成为受体体结合基序，RBM)相互重叠，因此阻断了RBD与细胞受体hACE2的结合。相反，PR300961结合RBD的表位则在受体结合基序(RBM)相邻的位置，从而使PR300961成为SARS-CoV-2的非阻断性中和抗体。
具体来说，PR301077结合表位直接位于SARS-CoV-2Spike RBD的受体结合基序(RBM)区域；重链和轻链的隐埋表面积(BSA)分别为
Figure BDA0003203482730000342
和
Figure BDA0003203482730000343
从而通过直接的空间位阻，阻碍了受体hACE2与RBD的结合。所有的重链互补决定区(HCDR)和轻链互补决定区(LCDR)都参与与SARS-CoV-2RBD的相互作用，而其主要的相互作用是极性相互作用以及氢键相互作用。HCDR的F27，Y31，Y32，W52，Y53，F59，P101，L103，F105，以及LCDR的Y35，Y37和Y54，与RBD上由Y449，Y453，L455，F456，F486，Y489，F490，L492，Y495和Y505组成的疏水簇之间通过疏水相互作用互相结合。此外，HCDR的Y31，Y32，W52，Y53，D54，S56，N57，R58，G101，G102，R104，R106与LCDR的H31，N33，Y35，Y54，Y37，T99还与RBD之间形成氢键，进一步加强两者之间的结合作用。
PR300953的情况则略有不同。虽然这个抗体同样具有强力的结合，阻断以及中和活性，但它与RBD之间的隐埋表面积相比PR301077要小很多，其中重链为
Figure BDA0003203482730000344
轻链为
Figure BDA0003203482730000345
PR300953的互补决定区(CDR)形成了一个深凹的结合袋，并紧密覆盖了RBM区的柔性尖端(RBD上的I472至F490)，与RBD和hACE2的结合位点部分重叠。PR300953与RBD之间的相互作用主要通过大量氢键网络稳定。HCDR的T33，H35，N52，N55，D57，T59，D99，Y101和Y105识别由RBD上Q474，A475，G476，S477，N487和Y489构成的凸起区域。LCDR的Y91，N92，N93，Y94，W96与和RBD上的S477，S478，N481和F486之间的静电相互作用进一步稳定了抗体与抗原的结合。
实施例15部分候选中和抗体通过体外病毒感染法考察其对新变异毒株的中和活性
根据理化性质，抗原表位组，以及其他活性结果，挑选部分实施例6中确认的具有中和活性的候选抗体(PR301077、PR300953、PR300928、PR301446)，用实施例6同样的实验方法考察其对最新变异毒株(南非株)的中和活性。结果如表12所示，PR301077对武汉株具有很强中和活性，但是对南非株无效。PR300953多武汉株和南非株具有同样的中和活性。PR300928人源化改造得到的PR301446对武汉株和南非株都具有极强的中和活性。
表12
Figure BDA0003203482730000341
Figure BDA0003203482730000351
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 南开大学
<120> 一种抗冠状病毒的抗体及其应用
<130> P21016093CN
<150> CN202010797020.1
<151> 2020-8-10
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Gly Gly Leu Asn Pro Asn Asn Asp Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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<223> Synthetic
<400> 114
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1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu
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Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Met Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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115
<210> 115
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<220>
<223> Synthetic
<400> 115
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Pro Val Ala Pro Ser Gln
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Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
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Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Leu Gln Val Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
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Thr Val Ser Ala
115
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<220>
<223> Synthetic
<400> 116
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Ser Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Ala Arg His Arg Asp Trp Asp Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
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115
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
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Ala Arg Gly Gly Gly Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 118
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 119
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
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<223> PR300928VHhuv2
<400> 177
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Pro Tyr Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 178
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PR300928VHhuv1
<400> 178
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Ala Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Pro Tyr Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 179
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PR300928VHhu
<400> 179
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Pro Tyr Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 180
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PR300928VLhuv3
<400> 180
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Gly Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 181
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PR300928VLhuv2
<400> 181
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Gly Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser His Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 182
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PR300928VLhuv1
<400> 182
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Gly Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser His Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 183
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PR300928VLhu
<400> 183
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser His Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 184
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human ig kappa light chain constant region(ck)
<400> 184
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 185
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human igG1 constant region(include CH1, Hinge, CH2, CH3)
<400> 185
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 186
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 186
Ala Asp Thr Tyr Glu Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 187
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 187
Gly Ile Asn Pro Asn Gln Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 188
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 188
Glu Gly Tyr Pro Tyr Tyr Phe Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 189
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 189
Ser Gln Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Gln Gly
1 5 10 15

Claims (22)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述的轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中：
所述HCDR1包含如SEQ ID NO.1所示的序列或其变体1、如SEQ ID NO.2所示的序列或其变体2、如SEQ ID NO.3所示的序列或其变体3、如SEQ ID NO.9所示的序列或其变体7、如SEQID NO.112、52、28～31所示的序列构成的群组中的氨基酸序列，所述HCDR2包含选自由如SEQ ID NO.4所示的序列或其变体4、如SEQ ID NO.5所示的序列或其变体5、如SEQ ID NO.6所示的序列或其变体6、如SEQ ID NO.8所示的序列或其变体8、如SEQ ID NO.7、32～34、68和189所示的序列构成的群组中的氨基酸序列，所述HCDR3包含选自由SEQ ID NO.10或其变体10、如SEQ ID NO.12所示的序列或其变体12、SEQ ID NO.69、35、73、36、37～42以及74所示的序列组成的群组中的氨基酸序列；
所述LCDR1包含选自由如SEQ ID NO.14所示的序列或其变体14、如SEQ ID NO.15所示的序列或其变体15、如SEQ ID NO.16所示的序列或其变体16、如SEQ ID NO.17所示的序列或其变体17、如SEQ ID NO.18所示的序列或其变体18、如SEQ ID NO.19所示的序列或其变体19以及如SEQ ID NO.43所示的序列组成的群组中的氨基酸序列，所述LCDR2包含选自由如SEQ ID NO.20所示的氨基酸或其变体20、如SEQ ID NO.21所示的氨基酸或其变体21、如SEQ ID NO.22所示的氨基酸或其变体22、SEQ ID NO.44～47所示的序列组成的群组中的氨基酸序列，所述LCDR3包含选自由如SEQ ID NO.23所示的序列或其变体9、如SEQ ID NO.24所示的序列或其变体11、如SEQ ID NO.25所示的序列或其变体25、如SEQ ID NO.26所示的序列或其变体26、如SEQ ID NO.27所示的序列或其变体13、SEQ ID NO.48～50、95、104以及101组成的群组中的氨基酸序列；
所述变体1含有突变F2Y、S5N/T、S6D/Y/E、Y7N/F以及G8T中的一个或多个，所述变体2含有突变T6S和/或T10N，所述变体3含有突变E6R、T8D、M9I以及H10Y/L/N中的一个或多个，所述变体7含有突变G6S；
所述变体4含有突变I2L、N6Q、G7D、T9N、S10T/G以及F15L中的一个或多个，所述变体5含有突变T9S和/或K16M，所述变体6含有突变V1I、N8Y、K9R/T/Q、F10Y以及Q16K中的一个或多个，所述变体8含有突变V7A和/或K16Q；
所述变体10含有突变A1G、D2G、G3T以及E5D中的一个或多个，所述变体12含有突变D1E、Y7F以及M9L中的一个或多个；
所述变体14含有突变G10S，所述变体15含有突变S3T、E4K、D7S、S8T、Y9S、N11Y、F13Y以及H15F中的一个或多个，所述变体16含有突变T3S和/或H10Y、所述变体17含有突变G7D，所述变体18含有突变I6V、W9Y/D以及A11N中的一个或多个，所述变体19含有突变H8Q、N10D以及F14Y中的一个或多个；
所述变体20含有突变Y4H/S，所述变体21含有突变K1A、A2T以及K6E/Q中的一个或多个，所述变体22含有突变S1R/L、T2A以及A6E中的一个或多个，所述变体9含有突变N5T，所述变体11含有突变G3A，所述变体25含有突变T5S和/或T7P，所述变体26含有突变S7W，所述变体13含有Q1S、N4T、E5H以及G6V/D中的一个或多个。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或其变体3所示、所述的HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或其变体4所示且所述HCDR3如SEQ ID NO.12或其变体12所示；
或者，所述的HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或其变体1所示、所述的HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6或其变体6所示且所述的HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.38、40、42或者74所示。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述变体1的序列如SEQ ID NO.51、54、55或者108所示，所述变体2的序列如SEQ ID NO.11或者81所示，所述变体3的序列如SEQ ID NO.109、110、111或者13所示，所述变体7的序列如SEQ ID NO.53所示，所述变体4的序列如SEQ ID NO.56～59以及SEQ ID NO.187中任一所示，所述变体5的序列如SEQ ID NO.60所示，所述变体6的序列如SEQ ID NO.106或者61～67中任一个所示，所述变体8的序列如SEQ ID NO.107所示，所述变体10的序列如SEQ ID NO.70或者SEQ IDNO.186所示，所述变体12的序列如SEQ ID NO.71、72或者188所示；较佳地：
所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.51所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.56所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.69所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.60所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.112所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.32所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.107所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.73所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.70所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.52所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.33所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.109所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.4所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.71所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.110所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.57所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.111所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.4所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.58所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.72所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.81所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.5所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.53所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.8所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.73所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.59所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.69所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.68所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.54所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.106所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.34所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.55所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.61所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.74所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.62所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.74所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.7所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.55所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.63所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.74所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.64所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.74所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.108所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.65所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.74所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.66所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.74所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.67所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.81所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.5所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.186所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.109所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.187所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.188所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示、所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.189所示且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.73所示；
更佳地，所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.113～137或其变体所示，所述变体与突变前的序列具有至少90％、至少95％或者至少99％的序列同一性，同时至少保留突变前序列的功能；所述变体的序列优选SEQ ID NO.164～166、SEQ ID NO.171～179中任一个所示。
4.如权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.15或其变体15所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.22或其变体22所示且所述LCDR3如SEQ ID NO.27或其变体13所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.17或其变体17所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.20或其变体20所示且所述LCDR3如SEQ ID NO.23或其变体9所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18或其变体18所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.21或其变体21所示且所述LCDR3如SEQ ID NO.26或其变体26所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.19或其变体19所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示且所述LCDR3如SEQ ID NO.24或其变体11所示。
5.如权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述变体14的序列如SEQID NO.75所示，所述变体15的序列如SEQ ID NO.76或者77所示，所述变体16的序列如SEQID NO.78或者79所示，所述变体17的序列如SEQ ID NO.80所示，所述变体18的序列如SEQID NO.82或者83所示，所述变体19的序列如SEQ ID NO.84～86中任一个所示，所述变体20的序列如SEQ ID NO.89或者90所示，所述变体21的序列如SEQ ID NO.93或者94所示，所述变体22的序列如SEQ ID NO.87、88或者92所示，所述变体9的序列如SEQ ID NO.96所示，所述变体11的序列如SEQ ID NO.103所示，所述变体25的序列如SEQ ID NO.100所示，所述变体26的序列如SEQ ID NO.105所示，所述变体13的序列如SEQ ID NO.98或者99所示，较佳地：
所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.44所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.95所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.87所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.98所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.77所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.88所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.48所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.78所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.22所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.76所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.87所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.45所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.99所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.80所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.89所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.96所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.20所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.80所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.20所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.96所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.90所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.22所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.100所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.75所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.44所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.101所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.79所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.92所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.49所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.82所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.93所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.50所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.83所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.46所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.102所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.94所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.84所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.47所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.85所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.47所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.103所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.21所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.105所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.86所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.47所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.103所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.47所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.103所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.84所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.47所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.104所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.80所示、所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO.90所示且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.96所示；
更佳地，所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.138～157、SEQ ID NO.91、SEQID NO.97或其变体所示，所述变体与突变前的序列具有至少90％、至少95％或者至少99％的序列同一性，同时至少保留突变前序列的功能；所述变体的序列优选如SEQ ID NO.158～163、SEQ ID NO.167～170以及SEQ ID NO.180～183中的任一个所示。
6.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.113所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.138所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.114所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.139所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.115所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.140所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.116所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.141所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.117所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.142所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.118所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.143所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.119所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.144所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.120所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.145所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.121所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.146所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.122所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.147所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.123所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.139所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.124所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.148所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.125所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.149所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.126所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.150所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.127所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.151所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.128所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.152所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.129所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.153所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.130所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.154所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.131所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.155所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.132所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.156所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.133所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.154所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.134所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.157所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.135所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.155所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.136所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.91所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.137所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.97所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.174所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.150所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.173所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.169所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.173所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.168所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.173所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.167所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.172所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.169所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.172所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.168所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.172所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.167所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.171所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.169所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.171所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.168所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.171所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.167所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.179所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.183所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.178所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.182所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.178所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.181所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.178所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.180所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.177所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.182所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.177所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.181所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.177所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.180所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.176所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.182所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.176所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.181所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.176所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.180所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.175所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.182所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.175所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.181所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.175所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.180所示。
7.如权利要求1～6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、双特异性抗体、多特异性抗体、重链抗体、单域抗体或单区抗体的形式，或为由上述抗体制得的单克隆抗体或多克隆抗体；
当为全长抗体时，其重链恒定区选自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4或其变体，其轻链恒定区选自κ链或者λ链或其突变；较佳地，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.185所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.184所示。
8.如权利要求1～7任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其特异性结合新型冠状病毒抗原S-RBD蛋白。
9.一种分离的核酸，其编码如权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
10.一种包含如权利要求9所述的分离的核酸的表达载体。
11.一种宿主细胞，其包含如权利要求10所述的表达载体；优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
12.一种抗新型冠状病毒抗原S-RBD蛋白或其抗原结合片段的制备方法，其包含培养如权利要求11所述的宿主细胞。
13.一种药物组合物，其包含如权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
14.如权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备治疗新型冠状病毒相关的疾病的药物中的应用。
15.一种嵌合抗原受体，其包含如权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
16.一种抗体药物偶联物，其包含细胞毒性剂，以及如权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
17.试剂盒，其包括如如权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要13所述的药物组合物、如权利要求15所述的嵌合抗原受体和/或如权利要求16所述的抗体药物偶联物。
18.一种套装药盒，其包含药盒A和药盒B，其中：
所述药盒A含有如权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要13所述的药物组合物、如权利要求15所述的嵌合抗原受体和/或如权利要求16所述的抗体药物偶联物；
所述药盒B含有其他抗肿瘤抗体或者包含所述其他抗肿瘤抗体的药物组合物，和/或由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。
19.一种诊断、治疗和/或预防冠状病毒介导的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的如权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求15所述的嵌合抗原受体、如权利要求16所述的抗体药物偶联物或如权利要求13所述的药物组合物，或者使用如权利要求18所述的套装药盒治疗有需要的患者。
20.一种免疫检测或者测定冠状病毒的方法，其包括使用如权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求15所述的嵌合抗原受体、如权利要求16所述的抗体药物偶联物或如权利要求13所述的药物组合物；优选地，所述检测为非诊断和/或治疗目的的。
21.一种联合疗法，其包括分别向有需要的患者施用如权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求15所述的嵌合抗原受体、如权利要求16所述的抗体药物偶联物或如权利要求13所述的药物组合物，和第二治疗剂；所述第二治疗剂较佳地包含其他抗肿瘤抗体或者包含所述其他抗肿瘤抗体的药物组合物，和/或由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。
22.一种给药装置，其特征在于，所述给药装置包括如权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求15所述的嵌合抗原受体、如权利要求16所述的抗体药物偶联物或如权利要求13所述的药物组合物；
优选地，所述给药装置还包括将所述抗体或其抗原结合片段、所述嵌合抗原受体、所述抗体药物偶联物或者所述药物组合物施用于受试者的部件，例如注射器或输液装置。
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