CN111303279A - 一种针对新型冠状病毒的单域抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种针对新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的人源化单域抗体及其应用。本发明保护SEQ ID No.1～SEQ ID No.5任一所述的单域抗体，实验结果证明，本发明提供的单域抗体与RBD抗原的亲和力好，对SARS‑CoV‑2假型病毒中和活性高。本发明对于新型冠状病毒SARS‑CoV‑2引起的疾病的预防、临床治疗和诊断试剂的研发均具有重要的科学意义和应用前景。

Description

一种针对新型冠状病毒的单域抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的人源化单域抗体及其应用。
背景技术
抗体是一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体药物泛指利用先进技术获得的具有治疗功能的全抗体分子和抗体片段的统称，是靶向性治疗的重要手段之一。抗体药物的具体作用靶点包括但不限制于：癌细胞特异抗原、免疫检查点分子、细胞因子及其受体、病毒蛋白、细菌毒素等。抗体药物治疗的主要疾病类型包括多种癌症、血液病、类风湿关节炎等自身免疫病、心血管疾病、病毒感染等。除了作为治疗手段外，抗体也常常用于疾病的预防、诊断和检测领域。
重链抗体是天然存在的一种抗体类型，其于1993年首次由比利时布鲁塞尔自由大学的Hamers博士及其团队报导(Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans Setal.Naturally occurring antibodies devoid oflight chains.Nature.1993；363:446-8.)。重链抗体是骆驼科动物或软骨鱼类所具有的独特抗体类型，其抗体结构域天然缺失轻链，只由两条重链组成。重链抗体的抗原识别功能主要由重链抗体的可变区(VHH)决定。单独的VHH即可以识别抗原，因此其又被称为单域抗体(Single-domain antibody，sdAb)。单域抗体的分子量只有约13-15KDa，直径约为2.5nm，长4nm，是迄今为止最小的具有抗原结合功能的抗体片段。
经过多年的研究，单域抗体逐渐展现出十分优异的分子特性和成药性。单域抗体除了具有传统抗体的抗原结合能力外，与传统抗体比较它还具有许多独特的性质,比如稳定性好，可抵达特殊抗原表位，砌块模式任意组合，生产成本低等，因此无论在药物应用还是临床诊断等领域都具有广阔的前景(Muyldermans S.Nanobodies:natural single-domain antibodies.Annu Rev Biochem.2013；82:775-97.)。获得单域抗体的常规方法是通过多次免疫骆驼科动物、B淋巴细胞分离、VHH区扩增、噬菌体文库构建和筛选等众多步骤构成。随着合成生物学的发展，构建基于全合成人源化的高质量随机化大容量单域抗体库成为可能。
冠状病毒科是一类主要感染脊椎动物的单股正链RNA病毒家族，其基因组是已知RNA病毒中相对较大的。冠状病毒颗粒的典型特征为在电子显微镜下呈现出“皇冠”样形态，此形态是由分布于病毒包膜上的众多刺突蛋白(Spike,S蛋白)所形成的。冠状病毒科包含4个病毒属，分别为：α冠状病毒属，β冠状病毒属，γ冠状病毒属和δ冠状病毒属。与人类感染相关的冠状病毒主要为α冠状病毒属和β冠状病毒属成员。具体病毒成员包括：229E，NL63,OC43,HKU1,SARS-CoV,MERS-CoV和SARS-CoV-2。冠状病毒通常经呼吸道或粪口途径感染，可导致多种疾病，如：普通感冒、支气管炎、肺炎，肠胃炎以及心脏病变等。某些冠状病毒的致死率较高，并且传播速度较快，能引起严重的社会和公共卫生问题。
2019年末开始出现的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)早期也被称为2019-nCoV,为β冠状病毒属成员，为新发病原体,与SARS-CoV同源性约为80％，主要引起人类新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。SARS-CoV-2病毒在体外可以感染多种细胞，包括Vero-E6，Huh7，Calu-3，以及分化的人呼吸道上皮细胞等。SARS-CoV-2病毒是具有包膜的正链RNA病毒。病毒颗粒直径约为80～140nm。其包膜为脂质双层，含有3类包膜糖蛋白：S蛋白，E蛋白和M蛋白。S蛋白是形成病毒“冠状”形态的主要蛋白之一，介导SARS-CoV-2进入细胞。SARS-CoV-2的S蛋白约由1273个氨基酸组成，结构上属于Ⅰ型膜融合蛋白，分为S1和S2两个区。S1区主要包括受体结合区(receptor binding domain，RBD)，而S2区则为膜融合所必需。SARS-CoV-2的潜在受体是人血管紧张素转换酶2(human angiotensin converting enzyme 2，ACE2)。SARS-CoV-2病毒RBD结构决定了其与潜在受体ACE2结合的效率以及感染的种属特异性，是重要的中和抗体识别与开发靶点。
SARS-CoV-2病毒潜在起源于蝙蝠SARS样冠状病毒，经过中间宿主的过度进而完成了感染人类的过程，目前已知SARS-CoV-2在人际间传播力较强，致病力高于引起普通感冒的冠状病毒。由于SARS-CoV-2为新发病原体，人群中普遍缺乏抗体，因此人群对SARS-CoV-2普遍易感。经过基因序列比对分析，SARS-CoV-2的RBD区与普通感冒冠状病毒及MERS-CoV的同源性极低，即使与SARS-CoV的RBD区比较也存在大量突变，因此已知的针对SARS-CoV和MERS-CoV的中和抗体与SARS-CoV-2新发病原体之间普遍缺乏交叉保护效果。鉴于此，开发针对SARS-CoV-2刺突蛋白RBD区域的特异性抗体对于疾病的临床治疗和诊断试剂的研发均具有重要的科学意义和应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的人源化单域抗体及其应用。
第一方面，本发明保护单域抗体，包括互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；
所述单域抗体为如下(a1)-(a5)中的任一种：
(a1)包括SEQ ID No.1自N端第26～34位所示的CDR1、第51～58位所示的CDR2和第97～114位所示的CDR3的单域抗体或其功能活性变体；
(a2)包括SEQ ID No.2自N端第26～34位所示的CDR1、第51～58位所示的CDR2和第97～114位所示的CDR3的单域抗体或其功能活性变体；
(a3)包括SEQ ID No.3自N端第26～34位所示的CDR1、第51～58位所示的CDR2和第97～114位所示的CDR3的单域抗体或其功能活性变体；
(a4)包括SEQ ID No.4自N端第26～34位所示的CDR1、第51～58位所示的CDR2和第97～114位所示的CDR3的单域抗体或其功能活性变体；
(a5)包括SEQ ID No.5自N端第26～32位所示的CDR1、第49～56位所示的CDR2和第95～112位所示的CDR3的单域抗体或其功能活性变体。
所述单域抗体还包括框架区FR1、FR2、FR3和FR4；
所述FR1如SEQ ID No.1自N端第1～25位或SEQ ID No.2自N端第1～25位或SEQ IDNo.3自N端第1～25位或SEQ ID No.4自N端第1～25位或SEQ ID No.5自N端第1～25位所示；
所述FR2如SEQ ID No.1自N端第35～50位或SEQ ID No.2自N端第35～50位或SEQID No.3自N端第35～50位或SEQ ID No.4自N端第35～50位或SEQ ID No.5自N端第33～48位所示；
所述FR3如SEQ ID No.1自N端第59～96位或SEQ ID No.2自N端第59～96位或SEQID No.3自N端第59～96位或SEQ ID No.4自N端第59～96位或SEQ ID No.5自N端第57～94位所示；
所述FR4如SEQ ID No.1自N端第115～125位或SEQ ID No.2自N端第115～125位或SEQ ID No.3自N端第115～125位或SEQ ID No.4自N端第115～125位或SEQ ID No.5自N端第113～123位所示。
所述单域抗体为如下(b1)-(b5)中的任一种：
(b1)SEQ ID No.1所示的单域抗体或其功能活性变体；
(b2)SEQ ID No.2所示的单域抗体或其功能活性变体；
(b3)SEQ ID No.3所示的单域抗体或其功能活性变体；
(b4)SEQ ID No.4所示的单域抗体或其功能活性变体；
(b5)SEQ ID No.5所示的单域抗体或其功能活性变体。
所述功能活性变体为如下(a)或(b)或(c)：
(a)将前文任一所述单域抗体的氨基酸序列经过1个或2个或3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽；
(b)与前文任一所述单域抗体的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的多肽；
(c)将前文任一所述单域抗体的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
第二方面，本发明还保护编码前文任一所述单域抗体的核酸分子。
所述核酸分子为如下(1)-(7)任一所述的核酸分子；
(1)SEQ ID No.1所示的DNA分子；
(2)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(3)SEQ ID No.3所示的DNA分子；
(4)SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(5)SEQ ID No.5所示的DNA分子；
(6)在严格条件下与(1)-(5)任一限定的DNA分子杂交且编码前文所述抗体的DNA分子；
(7)与(1)-(5)任一限定的DNA分子具有80％以上或90％以上的同源性且编码前文所述抗体的DNA分子。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
第三方面，本发明还保护含有前文所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
第四方面，本发明保护前文任一所述单域抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(c1)和/或(c2)：
(c1)预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染引起的疾病；
(c2)抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2感染。
所述新型冠状病毒SARS-CoV-2感染引起的疾病具体为人新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。
第五方面，本发明保护前文任一所述单域抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(d1)-(d4)中的任一种：
(d1)结合新型冠状病毒SARS-CoV-2；
(d2)检测结合新型冠状病毒SARS-CoV-2；
(d3)结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白；
(d4)检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白。
第六方面，本发明保护产品，包括前文任一所述单域抗体；所述产品的用途为如下(c1)和/或(c2)：
(c1)预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染引起的疾病；
(c2)抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2感染。
所述新型冠状病毒SARS-CoV-2感染引起的疾病具体为人新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。
第七方面，本发明保护产品，包括前文任一所述单域抗体；所述产品的用途为如下(d1)-(d4)中的任一种：
(d1)结合新型冠状病毒SARS-CoV-2；
(d2)检测结合新型冠状病毒SARS-CoV-2；
(d3)结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白；
(d4)检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白。
以上任一产品具体可为药物。
第八方面，本发明药物组合物，包括前文任一所述单域抗体和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
本发明通过噬菌体文库筛选得到了针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的人源化单域抗体，实验结果证明，本发明提供的单域抗体与RBD抗原的亲和力好，对SARS-CoV-2假型病毒中和活性高。本发明对于新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的疾病的预防、临床治疗和诊断试剂的研发均具有重要的科学意义和应用前景。
附图说明
图1为单域抗体1E2抑制SARS-CoV-2假型病毒入侵细胞的活性统计结果。
图2为单域抗体2F2抑制SARS-CoV-2假型病毒入侵细胞的活性统计结果。
图3为单域抗体3F11抑制SARS-CoV-2假型病毒入侵细胞的活性统计结果。
图4为单域抗体4D8抑制SARS-CoV-2假型病毒入侵细胞的活性统计结果。
图5为单域抗体5F8抑制SARS-CoV-2假型病毒入侵细胞的活性统计结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、识别SARS-CoV-2刺突蛋白RBD区域的单域抗体的筛选与制备
一、噬菌体文库筛选
噬菌体文库筛选的基本原理和基本操作流程参考邵宁生等人所著的《生物文库技术—噬菌体展示与SELEX技术》，简要描述如下：首先将50μg的SARS-CoV-2刺突蛋白RBD区重组蛋白(北京义翘神州科技有限公司，货号：40592-V08H；下称RBD蛋白)利用赛默飞世尔科技公司商品化试剂盒EZ-LinkTMSulfo NHS-LC-LC-Biotin进行生物素标记，并进行脱盐纯化(脱盐柱购自赛默飞世尔科技公司)。第一轮筛选为液相选择，首先将12μg生物素标记的RBD蛋白与1mL(1012-1013)噬菌体文库混合室温孵育1小时；随后加入100μL链霉素亲和磁珠(GE生命科学公司)，转台转动室温孵育30分钟；然后用PBS-T和PBS洗涤磁珠10-15次，并向磁珠中加洗脱液400μL洗脱5min；取200μL洗脱液加入5mL的对数生长期的TG1大肠杆菌培养物中，37℃培养1小时；上述培养物感染辅助噬菌体CM13后，扩大过夜培养并在第二天利用PEG6000(Sigma公司)对上清中的噬菌体进行纯化，用于下一轮筛选。第二轮筛选为固相选择，首先将50μg的RBD蛋白在4℃条件下包被5mL的免疫吸附管过夜，随后用PBS洗涤免疫管3次并加入1mL第一轮筛选收获的VHH文库1012噬菌体，室温下转台转动30分钟，再静置孵育1.5小时；然后用PBS-T和PBS洗免疫管15-20次，加洗脱液洗脱；取一半的洗脱液加入5mL的对数生长期的TG1大肠杆菌培养物中，37℃培养1小时；上述培养物感染辅助噬菌体CM13后，扩大过夜培养并在第二天利用PEG对上清中的噬菌体进行纯化，用于下一轮筛选。利用相似的方法进行第三轮和第四轮筛选，第三轮为液相筛选，第四轮为固相筛选。最后一轮筛选后，挑取1000个单个克隆进行培养和噬菌体拯救，用于后续阳性克隆的鉴定。
二、噬菌体酶联免疫吸附试验鉴定与RBD蛋白结合的阳性克隆。
酶联免疫吸附试验的基本原理和基本操作流程参考曹雪涛等人所著的《免疫学技术及其应用》。简要描述如下：取RBD蛋白25ng/孔过夜包被96孔免疫板。多孔板用BSA封闭后，加入上述环节中拯救噬菌体100μL/孔，室温静置孵育1小时。PBS-T洗板5次后，加入抗噬菌体抗体Anti-M13 antibody[B62-FE2](HRP)(Abcam公司#ab50370)，室温静置孵育1小时。PBS-T洗板6次后，加入HRP标记的二抗并室温静置孵育0.5小时。PBS-T洗板6次洗掉未结合抗体后，每孔加入TMB底物100μL(北京索莱宝公司)，37℃避光孵育5-30分钟，每孔加入终止液50μL终止反应，于20分钟内测定实验结果，450nm波长下读取吸光值。实验设置一组阴性对照测定孔，当样品孔与对照孔的比值大于5则可判定为阳性结果。
经过上述方法，共筛选得到超过200个阳性克隆，对所有阳性克隆进行序列测定和同源性比对分析，结果显示所有阳性克隆可总结为5个独立的克隆，其代表性克隆分别为：1E2、2F2、3F11、4D8和5F8。
三、抗RBD单域抗体的获得
经过步骤二的筛选，将阳性克隆通过高保真PCR扩增单域抗体的完整读码框，得到抗RBD单域抗体的编码核酸分子及其编码的氨基酸序列。
共筛选得到五个单域抗体，单域抗体依次由框架区FR1、互补决定区CDR1、框架区FR2、互补决定区CDR2、框架区FR3、互补决定区CDR3和框架区FR4组成，具体信息如下：
单域抗体1E2，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。SEQ ID No.1自N端第1～25位为框架区FR1，第26～34位为互补决定区CDR1，第35～50位为框架区FR2，第51～58位为互补决定区CDR2，第59～96位为框架区FR3，第97～114位为互补决定区CDR3，第115～125位为框架区FR4。编码单域抗体1E2的核酸分子如SEQ ID No.6所示。
单域抗体2F2，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。SEQ ID No.2自N端第1～25位为框架区FR1，第26～34位为互补决定区CDR1，第35～50位为框架区FR2，第51～58位为互补决定区CDR2，第59～96位为框架区FR3，第97～114位为互补决定区CDR3，第115～125位为框架区FR4。编码单域抗体2F2的核酸分子如SEQ ID No.7所示。
单域抗体3F11，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。SEQ ID No.3自N端第1～25位为框架区FR1，第26～34位为互补决定区CDR1，第35～50位为框架区FR2，第51～58位为互补决定区CDR2，第59～96位为框架区FR3，第97～114位为互补决定区CDR3，第115～125位为框架区FR4。编码单域抗体3F11的核酸分子如SEQ ID No.8所示。
单域抗体4D8，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。SEQ ID No.4自N端第1～25位为框架区FR1，第26～34位为互补决定区CDR1，第35～50位为框架区FR2，第51～58位为互补决定区CDR2，第59～96位为框架区FR3，第97～114位为互补决定区CDR3，第115～125位为框架区FR4。编码单域抗体4D8的核酸分子如SEQ ID No.9所示。
单域抗体5F8，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。SEQ ID No.5自N端第1～25位为框架区FR1，第26～32位为互补决定区CDR1，第33～48位为框架区FR2，第49～56位为互补决定区CDR2，第57～94位为框架区FR3，第95～112位为互补决定区CDR3，第113～123位为框架区FR4。编码单域抗体5F8的核酸分子如SEQ ID No.10所示。
四、表达抗RBD单域抗体的原核表达载体构建
1、表达单域抗体1E2的原核表达载体
采用DNA分子1替换原核表达载体pET-28b(Novagen公司，货号：69865-3)的NcoI和XhoI之间的DNA分子，得到表达单域抗体1E2(与组氨酸标签融合)的原核表达载体。DNA分子1是在SEQ ID No.6的3'末端添加了XhoI酶切位点和6个组氨酸标签的编码序列(ctcgagcaccaccaccaccaccac)得到的DNA分子。
2、表达单域抗体2F2的原核表达载体
采用DNA分子2替换原核表达载体pET-28b的NcoI和XhoI之间的DNA分子，得到表达单域抗体2F2(与组氨酸标签融合)的原核表达载体。DNA分子2是在SEQ ID No.7的3'末端添加了XhoI酶切位点和6个组氨酸标签的编码序列(ctcgagcaccaccaccaccaccac)得到的DNA分子。
3、表达单域抗体3F11的原核表达载体
采用DNA分子3替换原核表达载体pET-28b的NcoI和XhoI之间的DNA分子，得到表达单域抗体3F11(与组氨酸标签融合)的原核表达载体。DNA分子3是在SEQ ID No.8的3'末端添加了XhoI酶切位点和6个组氨酸标签的编码序列(ctcgagcaccaccaccaccaccac)得到的DNA分子。
4、表达单域抗体4D8的原核表达载体
采用DNA分子4替换原核表达载体pET-28b的NcoI和XhoI之间的DNA分子，得到表达单域抗体4D8(与组氨酸标签融合)的原核表达载体。DNA分子4是在SEQ ID No.9的3'末端添加了XhoI酶切位点和6个组氨酸标签的编码序列(ctcgagcaccaccaccaccaccac)得到的DNA分子。
5、表达单域抗体5F8的原核表达载体
采用DNA分子5替换原核表达载体pET-28b的NcoI和XhoI之间的DNA分子，得到表达单域抗体5F8(与组氨酸标签融合)的原核表达载体。DNA分子5是在SEQ ID No.10的3'末端添加了XhoI酶切位点和6个组氨酸标签的编码序列(ctcgagcaccaccaccaccaccac)得到的DNA分子。
五、抗RBD单域抗体的表达与纯化
1、抗RBD单域抗体的表达
将步骤四得到的五种原核表达载体分别转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞(购自北京全式金公司)，得到重组菌。将重组菌接种于LB液体培养基，在37℃、230rpm条件培养至OD600＝0.5，然后向培养体系中加入终浓度0.3mM的IPTG并在18℃、230rpm条件继续诱导培养16小时后，离心收获菌体，保存于-80℃备用。
2、抗RBD单域抗体的纯化
(1)裂解菌体
将步骤1得到的菌体重悬于裂解缓冲液(50mM Tris-Cl pH8.0，100mM NaCl，5mMImidazole)，超声破碎菌体后，12000×g离心15分钟，上清液转移至新管中。
(2)亲和层析
在AKTAPurifier蛋白纯化仪(GE生命科学公司)上将上述(1)得到的上清液通过Ni-NTA琼脂糖色谱柱(GE生命科学公司)，随后用20个柱体积的清洗液(50mM Tris-ClpH8.0，300mM NaCl，10mMImidazole)洗去未结合蛋白，最后利用仪器自带程序进行0-500mM咪唑的线性洗脱(Sigma公司)并进行蛋白峰的分部收集，洗脱蛋白每1mL收集1管，经过SDS-PAGE鉴定得到纯化后的抗RBD单域抗体。
将上述纯化后的抗RBD单域抗体装入透析袋中经过过夜透析更换PBS缓冲体系，并完成浓缩等步骤，得到五种单域抗体溶液。
实施例2、抗RBD单域抗体的亲和力测定
待测抗体：实施例1制备的五种单域抗体。
利用BIAcore T-200生物分子相互作用仪(GE生命科学公司)进行抗体的亲和力测定，该技术是基于表面等离子共振SPR技术发展起来的，可进行生物大分子间相互作用的无标记、快速、实时、自动化操作与检测。
在测定RBD蛋白与其相应单域抗体间相互作用时，首先将RBD蛋白包被于传感器芯片上，然后以单域抗体作为流动相进行结合常数、解离常数与亲和力常数的测定。
1、RBD蛋白偶联CM5芯片：RBD蛋白偶联温度为25摄氏度，缓冲液为HBS-P(10mMHEPES,150mM NaCl,3mM EDTA and 0.05％P20,pH 7.4)。程序模板Immuobilization,选择CM5芯片通道2氨基偶联，配体为5μg/ml RBD蛋白，蛋白缓冲体系为pH5.5醋酸钠(NaAC5.5)，目标偶联量300RU，洗脱液50mM NaOH。芯片激活剂50mmol/L的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)与200mmol/L的3-(3-二甲基氨基丙基)卡二亚胺盐酸盐(EDC)激活芯片，封闭剂为1mol/L盐酸乙醇胺。
2、RBD单域抗体与RBD亲和力和动力学测定：选择多循环动力学模板，测定温度为25摄氏度，缓冲液为HBS-P，样品流动路径为2-1，样品结合时间180s，流速30ul/min，解离时间300s，再生洗脱液为Glycine-HCL2.5，再生液结合时间30s，流速30ul/min，稳定时间0s，单域抗体浓度系列稀释(3.125、6.25、12.5、25、50nM)。最后所得数据用BiacoreEvaluation Software软件分析，计算结合常数(ka)，解离常数(kd)及亲和力常数(KD)。
上述Biacore分析中所用芯片、试剂及缓冲液，均购自GE生命科学公司。
结果如表1所示。结果显示，本发明所获得的单域抗体与SARS-CoV-2RBD蛋白的亲和力常数介于0.71nMol/L至33.9nMol/L之间。KD值越低说明亲和力越强，本发明所获得的单域抗体总体上均具有较为理想的与RBD蛋白的亲和能力。从结果可知，抗体2F2与5F8最好，3F11次之，1E2与4D8再次之。
表1单域抗体与SARS-CoV-2RBD蛋白相互作用的亲和力参数
抗体编号 KD(M) ka(1/Ms) kd(1/s)
1E2 2.113E-8 2.451E+5 0.005179
2F2 8.461E-10 3.701E+5 3.131E-4
3F11 3.154E-9 2.141E+6 0.006751
4D8 3.397E-8 1.804E+5 0.006128
5F8 7.155E-10 2.954E+5 2.114E-4
实施例3、抗RBD单域抗体的SARS-CoV-2假型病毒中和活性测定
待测抗体：实施例1制备的五种单域抗体。
SARS-CoV-2假型病毒一种以逆转录病毒的复制核心元件与SARS-CoV-2病毒的包膜刺突糖蛋白(即S蛋白)组装形成的新型病毒颗粒。假型病毒感染细胞的能力取决于其外面包裹的糖蛋白的种类与特性，是用于研究SARS-CoV-2的中和抗体抑制效率、受体利用和入侵感染机制的理想工具。
一、SARS-CoV-2假型病毒的包装制备
将293T细胞(来源自中国医学科学院基础医学研究所)接种于10厘米培养皿中，利用含10％胎牛血清(购自Gibco公司)的DMEM培养基(购自赛默飞世尔公司)培养至80％细胞汇合度，共转染15微克SARS-CoV-2S基因表达质粒(北京义翘神州科技公司，货号：VG40589-UT)与15微克PNL4.3-Luc-R-E-质粒(BioVectorNTCC)，转染后36小时更换含2％胎牛血清的DMEM培养基，继续培养12小时并收获含有SARS-CoV-2假型病毒的培养上清，分装并冻存于-80摄氏度长期保存。
二、假型病毒入侵抑制试验
将步骤一制备的SARS-CoV-2假型病毒分别与不同稀释度的单域抗体(所含单域抗体的终浓度分别为0、0.000832、0.00416、0.0208、0.104、0.52、2.6、13μg/mL)混合后，加入预先接种的含Calu-3细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所)的96孔板中，继续孵育48小时。SARS-CoV-2假型病毒含有荧光素酶报告基因，假型病毒具有感染目标靶细胞的能力，通过检测报告基因等方法可以测定假型病毒的感染能力与水平。使用Promega公司的luciferase荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：E4550)，按产品说明书裂解细胞并对细胞裂解液中的报告基因活性进行检测，将荧光素酶原始读值数据转换为百分比数据进行做图并计算IC50。
结果如图1～图5所示。
结果显示，本发明所获得的单域抗体具有优良的抑制SARS-CoV-2假型病毒感染的能力，抗病毒效果从高到低依次为：5F8(IC50＝0.00338μg/mL),3F11(IC50＝0.0038μg/mL),2F2(IC50＝0.0235μg/mL),4D8(IC50＝0.247μg/mL),1E2(IC50＝0.31μg/mL)。
序列表
<110> 中国医学科学院病原生物学研究所
<120> 一种针对新型冠状病毒的单域抗体及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ala Asp Ala Phe Val Ile
20 25 30
Ile Gly Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ala Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ala Trp Thr Asp Gln His Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gln Asp Ser Ala Tyr Ile Lys Ser Lys Gly Ser Arg Ala Tyr
100 105 110
Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ala Gln Ser Lys Trp
20 25 30
Ala Tyr Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ala Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Val Ala Thr Gly Pro Trp Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala His His Ile Pro Thr Lys His Pro Ala Phe Pro Asp Phe Arg
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 3
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Asn Ala Ala Glu Arg
20 25 30
Met Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ala Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Tyr Ala Lys Phe Gly Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Ala Phe Val Gln Ser Pro Tyr Ser Gly Ser His Thr Thr
100 105 110
Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 4
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Asp Ser Thr Arg
20 25 30
Tyr His Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ala Val
35 40 45
Ala Ala Ile Lys Gly Val Trp Pro Glu Asp Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Gln Tyr Glu Trp Trp Val Pro Gly Glu Val Gly Pro Tyr
100 105 110
Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 5
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Gln Ala Val Val Phe
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ala Val Ala Ala
35 40 45
Ile His Val Pro Ala Lys Asn Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
85 90 95
His Tyr Glu Phe Asn Asp Phe Val Trp Gln Gly Tyr Ser Ser Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caggttcagc tggtggaaag cggtggtgga ttagtgcaac caggtggaag cctccgcctg 60
agctgcgccg cgtcaggtgc tgacgctttc gttatcatcg gtgggtggtt ccgtcaggct 120
ccgggcaaag gcctggaagc agttgcggcc attgcttgga ctgaccagca tgaatattac 180
gcggattccg ttaagggccg ttttacgatc agccgtgata attcaaagaa cacgctttat 240
ctgcagatga acagcctgcg cgctgaagat actgcggtct actattgcgc ggcacaggac 300
tctgcttaca tcaaatctaa aggttctcgt gcttacgaat attggggcca ggggacccaa 360
gtaacagtta gcagt 375
<210> 7
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caggttcagc tggtggaaag cggtggtgga ttagtgcaac caggtggaag cctccgcctg 60
agctgcgccg cgtcaggtct ggctcagtct aaatgggctt acgggtggtt ccgtcaggct 120
ccgggcaaag gcctggaagc agttgcggcc attgacgttg ctactggtcc gtggtattac 180
gcggattccg ttaagggccg ttttacgatc agccgtgata attcaaagaa cacgctttat 240
ctgcagatga acagcctgcg cgctgaagat actgcggtct actattgcgc ggcacatcat 300
atcccgacta aacatccggc tttcccggac ttccgtgact attggggcca ggggacccaa 360
gtaacagtta gcagt 375
<210> 8
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caggttcagc tggtggaaag cggtggtgga ttagtgcaac caggtggaag cctccgcctg 60
agctgcgccg cgtcaggtgg taacgctgct gaacgtatgg ctgggtggtt ccgtcaggct 120
ccgggcaaag gcctggaagc agttgcggcc atttactacg ctaaattcgg tccgtattac 180
gcggattccg ttaagggccg ttttacgatc agccgtgata attcaaagaa cacgctttat 240
ctgcagatga acagcctgcg cgctgaagat actgcggtct actattgcgc ggcagaagct 300
ttcgttcagt ctccgtactc tggttctcat actactaaat attggggcca ggggacccaa 360
gtaacagtta gcagt 375
<210> 9
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caggttcagc tggtggaaag cggtggtgga ttagtgcaac caggtggaag cctccgcctg 60
agctgcgccg cgtcaggtaa catcgactct actcgttacc atgggtggtt ccgtcaggct 120
ccgggcaaag gcctggaagc agttgcggcc attaaaggtg tttggccgga agactattac 180
gcggattccg ttaagggccg ttttacgatc agccgtgata attcaaagaa cacgctttat 240
ctgcagatga acagcctgcg cgctgaagat actgcggtct actattgcgc ggcagaccag 300
tacgaatggt gggttccggg tgaagttggt ccgtacctgt attggggcca ggggacccaa 360
gtaacagtta gcagt 375
<210> 10
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caggttcagc tggtggaaag cggtggtgga ttagtgcaac caggtggaag cctccgcctg 60
agctgcgccg cgtcaggtcg tcaggctgtt gttttcgggt ggttccgtca ggctccgggc 120
aaaggcctgg aagcagttgc ggccattcat gttccggcta aaaaccgtta ttacgcggat 180
tccgttaagg gccgttttac gatcagccgt gataattcaa agaacacgct ttatctgcag 240
atgaacagcc tgcgcgctga agatactgcg gtctactatt gcgcggcaca ttacgaattc 300
aacgacttcg tttggcaggg ttactcttct gactattggg gccaggggac ccaagtaaca 360
gttagcagt 369

Claims (10)

1.单域抗体，包括互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；
所述单域抗体为如下(a1)-(a5)中的任一种：
(a1)包括SEQ ID No.1自N端第26～34位所示的CDR1、第51～58位所示的CDR2和第97～114位所示的CDR3的单域抗体或其功能活性变体；
(a2)包括SEQ ID No.2自N端第26～34位所示的CDR1、第51～58位所示的CDR2和第97～114位所示的CDR3的单域抗体或其功能活性变体；
(a3)包括SEQ ID No.3自N端第26～34位所示的CDR1、第51～58位所示的CDR2和第97～114位所示的CDR3的单域抗体或其功能活性变体；
(a4)包括SEQ ID No.4自N端第26～34位所示的CDR1、第51～58位所示的CDR2和第97～114位所示的CDR3的单域抗体或其功能活性变体；
(a5)包括SEQ ID No.5自N端第26～32位所示的CDR1、第49～56位所示的CDR2和第95～112位所示的CDR3的单域抗体或其功能活性变体。
2.如权利要求1所述的单域抗体，其特征在于：
所述单域抗体还包括框架区FR1、FR2、FR3和FR4；
所述FR1如SEQ ID No.1自N端第1～25位或SEQ ID No.2自N端第1～25位或SEQ IDNo.3自N端第1～25位或SEQ ID No.4自N端第1～25位或SEQ ID No.5自N端第1～25位所示；
所述FR2如SEQ ID No.1自N端第35～50位或SEQ ID No.2自N端第35～50位或SEQ IDNo.3自N端第35～50位或SEQ ID No.4自N端第35～50位或SEQ ID No.5自N端第33～48位所示；
所述FR3如SEQ ID No.1自N端第59～96位或SEQ ID No.2自N端第59～96位或SEQ IDNo.3自N端第59～96位或SEQ ID No.4自N端第59～96位或SEQ ID No.5自N端第57～94位所示；
所述FR4如SEQ ID No.1自N端第115～125位或SEQ ID No.2自N端第115～125位或SEQID No.3自N端第115～125位或SEQ ID No.4自N端第115～125位或SEQ ID No.5自N端第113～123位所示。
3.如权利要求1或2所述的单域抗体，其特征在于：
所述单域抗体为如下(b1)-(b5)中的任一种：
(b1)SEQ ID No.1所示的单域抗体或其功能活性变体；
(b2)SEQ ID No.2所示的单域抗体或其功能活性变体；
(b3)SEQ ID No.3所示的单域抗体或其功能活性变体；
(b4)SEQ ID No.4所示的单域抗体或其功能活性变体；
(b5)SEQ ID No.5所示的单域抗体或其功能活性变体。
4.编码权利要求1至3任一所述单域抗体的核酸分子。
5.含有权利要求4所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
6.权利要求1至3任一所述单域抗体或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(c1)和/或(c2)：
(c1)预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染引起的疾病；
(c2)抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2感染。
7.权利要求1至3任一所述单域抗体或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(d1)-(d4)中的任一种：
(d1)结合新型冠状病毒SARS-CoV-2；
(d2)检测结合新型冠状病毒SARS-CoV-2；
(d3)结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白；
(d4)检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白。
8.产品，包括权利要求1至3任一所述单域抗体；所述产品的用途为如下(c1)和/或(c2)：
(c1)预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染引起的疾病；
(c2)抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2感染。
9.产品，包括权利要求1至3任一所述单域抗体；所述产品的用途为如下(d1)-(d4)中的任一种：
(d1)结合新型冠状病毒SARS-CoV-2；
(d2)检测结合新型冠状病毒SARS-CoV-2；
(d3)结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白；
(d4)检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白。
10.药物组合物，包括权利要求1至3任一所述单域抗体和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
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