CN113563463B - 一种抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体及其应用 - Google Patents

一种抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的中和纳米抗体及其应用，属于生物医药技术领域。所述中和纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；所述中和纳米抗体为(a1)‑(a6)中的任意一种。本发明提供的抗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的中和纳米抗体能够与RBD抗原有效结合，融合人IgGFc标签后能有效与人ACE2蛋白竞争结合RBD抗原，对SARS‑CoV‑2假型病毒中和活性高，对于新型冠状病毒SARS‑CoV‑2引起的疾病的预防、临床治疗和诊断试剂的研发均具有重要的科学意义和应用前景。

Description

一种抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及一种抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体及其应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
新型冠状病毒，被称为严重急性呼吸系统综合症(SARS)-冠状病毒-2(SARS-CoV-2)，是导致新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的病原体。SARS-CoV-2以血管紧张素转化酶2(Angiotensin converting enzyme 2，ACE-2)作为受体侵入细胞导致肺损伤，病情加重与继发引起的全身性炎症反应密切相关,重症患者会出现急性呼吸窘迫综合征(Acuterespiratory distress syndrome，ARDS)和感染性休克，最终出现多器官功能衰竭。疫情发生以来，世界各国科学家开始致力于疫苗、抗病毒药物和抗体药物等的开发。
抗体是B细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白，能与相应抗原特异性结合，发挥免疫功能。当病原微生物侵入机体时，其所携带的抗原物质可刺激机体产生抗体，中一些抗体其能够与病原微生物表面的抗原结合，从而阻止病原微生物黏附靶细胞受体，防止侵入细胞，即中和抗体。中和抗体是作为疫苗和化学治疗的补充，由抗体介导的预防和治疗病毒感染的措施已显现良好的效果，应用前景得到专家的认同。
重链抗体是骆驼科动物或软骨鱼类所具有的独特抗体类型，其抗体结构域只由两条重链组成。重链抗体的抗原识别功能主要由重链抗体的可变区(VHH)决定。单独的VHH即可以识别抗原，其分子量只有13-15KDa，直径约为2.5nm，长4nm，因此又被称为纳米抗体(nanobody)。纳米抗体具有低免疫原性、稳定性强和穿透能力高等特点。
目前，还没有关于抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体的报道。鉴于此，有必要提供一种抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体及其应用。
发明内容
本发明的目的之一，提供一种抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体，所述中和纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；所述中和纳米抗体为(a1)-(a6)中的任意一种：
(a1)包括SEQ ID No.1自N端第31-37位所示的CDR1、第56-62位所示的CDR2和第102-107位所示的CDR3的中和纳米抗体或其功能活性变体；
(a2)包括SEQ ID No.2自N端第31-37位所示的CDR1、第56-62位所示的CDR2和第102-117位所示的CDR3的中和纳米抗体或其功能活性变体；
(a3)包括SEQ ID No.3自N端第31-37位所示的CDR1、第56-62位所示的CDR2和第102-110位所示的CDR3的中和纳米抗体或其功能活性变体；
(a4)包括SEQ ID No.4自N端第31-37位所示的CDR1、第56-62位所示的CDR2和第102-110位所示的CDR3的中和纳米抗体或其功能活性变体；
(a5)包括SEQ ID No.5自N端第31-37位所示的CDR1、第56-62位所示的CDR2和第102-110位所示的CDR3的中和纳米抗体或其功能活性变体；
(a6)包括SEQ ID No.6自N端第31-37位所示的CDR1、第56-61位所示的CDR2和第101-109位所示的CDR3的中和纳米抗体或其功能活性变体。
SEQ ID No.1
QVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGGSEYATFRHYIGWFRQAPGQEREAVSAIAAANGEHSYADSVKGRFTISRDNSKNTVTLQMNNLRAEDTAIYYCAAIVDGWIWGQGTQVTVSS。
SEQ ID No.2
QVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGGSEYRYSDWTSGWFRQAPGQEREAVSAIAGYDNTPNYADSVKGRFTISRDNSKNTVTLQMNNLRAEDTAIYYCAAWYIKMNSDMHVQREWEWGQGTQVTVSS。
SEQ ID No.3
QVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGGSEYDFSWSYIGWFRQAPGQEREAVSAIADHWTQDDYADSVKGRFTISRDNSKNTVTLQMNNLRAEDTAIYYCAAMSIGWPELFWGQGTQVTVSS。
SEQ ID No.4
QVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGGSEYSTWRHYVGWFRQAPGQEREAVSAIASLDSSVAYADSVKGRFTISRDNSKNTVTLQMNNLRAEDTAIYYCAAIETVHGHMIWGQGTQVTVSS。
SEQ ID No.5
QVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGGSEYATFGHYAGWFRQAPGQEREAVSAIAGAGDRRAYADSVKGRFTISRDNSKNTVTLQMNNLRAEDTAIYYCAAIDTEYGQNIWGQGTQVTVSS。
SEQ ID No.6
QVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGGSEYTYSYIYAGWFRQAPGQEREAVSAIAGENYSYYADSVKGRFTISRDNSKNTVTLQMNNLRAEDTAIYYCAAWPTQDGYAAWGQGTQVTVSS。
本发明的抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体的有益效果是：
1、本发明提供的抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体能够与RBD抗原有效结合，融合人IgG Fc标签后能有效与人ACE2蛋白竞争结合RBD抗原，对SARS-CoV-2假型病毒中和活性高，对于新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的疾病的预防、临床治疗和诊断试剂的研发均具有重要的科学意义和应用前景。
2、本发明从全合成纳米抗体文库中筛选中和抗体，无需病人血清，没有感染性，筛选速度快，可规模化生产，且成本低廉，操作容易。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述中和纳米抗体或其功能活性变体还包括框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其中，所述FR1如SEQ ID No.1自N端第1-30位或SEQ ID No.2自N端第1-30位或SEQ ID No.3自N端第1-30位所示或SEQ ID No.4自N端第1-30位所示或SEQ ID No.5自N端第1-30位所示或SEQ ID No.6自N端第1-30位所示；
所述FR2如SEQ ID No.1自N端第38-55位或SEQ ID No.2自N端第38-55位或SEQ IDNo.3自N端第38-55位所示或SEQ ID No.4自N端第38-55位所示或SEQ ID No.5自N端第38-55位所示或SEQ ID No.6自N端第38-55位所示；
所述FR3如SEQ ID No.1自N端第63-101位或SEQ ID No.2自N端第63-101位或SEQID No.3自N端第63-101位所示或SEQ ID No.4自N端第63-101位所示或SEQ ID No.5自N端第63-101位所示或SEQ ID No.6自N端第62-100位所示；
所述FR4如SEQ ID No.1自N端第108-118位或SEQ ID No.2自N端第118-128位或SEQ ID No.3自N端第111-121位所示或SEQ ID No.4自N端第111-121位所示或SEQ ID No.5自N端第111-121位所示或SEQ ID No.6自N端第110-120位所示。
采用上述进一步的有益效果是：上述抗体可保留对抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和活性，或甚至具有更强的中和活性。
进一步，所述中和纳米抗体的序列为(b1)-(b6)中的任一种：
(b1)SEQ ID NO.1所示的中和纳米抗体或其功能活性变体；
(b2)SEQ ID NO.2所示的中和纳米抗体或其功能活性变体；
(b3)SEQ ID NO.3所示的中和纳米抗体或其功能活性变体；
(b4)SEQ ID NO.4所示的中和纳米抗体或其功能活性变体；
(b5)SEQ ID NO.5所示的中和纳米抗体或其功能活性变体；
(b6)SEQ ID NO.6所示的中和纳米抗体或其功能活性变体。
采用上述进一步的有益效果是：上述抗体可保留对抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和活性，或甚至具有更强的中和活性。
进一步，所述功能活性变体为(c1)-(c3)中的任一种：
(c1)将上述中和纳米抗体的氨基酸序列经过1个或2个或3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽；
(c2)与上述中和纳米抗体的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的多肽；
(c3)将上述中和纳米抗体的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白，所述标签为人IgG Fc标签、Flag标签、His标签、HA标签、myc标签、GST标签和SUMO标签中的任意一种。
采用上述进一步的有益效果是：上述抗体可保留对抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和活性，或甚至具有更强的中和活性。
本发明的目的之二，提供一种核酸分子。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：编码上述抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体的核酸分子。
本发明的核酸分子的有益效果是：
本发明的核酸分子能编码上述任一项所述的抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体。
本发明的目的之三，提供一种重组质粒。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种含有上述核酸分子的重组质粒。
本发明的重组质粒的有益效果是：
本发明的重组质粒含有上述核酸分子，能编码上述抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体。
本发明的目的之四，提供一种重组菌。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种含有上述核酸分子的重组菌。
本发明的重组菌的有益效果是：
本发明的重组菌含有上述核酸分子，可用于原核表达上述抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体。
本发明的目的之五，提供一种转基因细胞系。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种含有上述核酸分子的转基因细胞系。
本发明的转基因细胞系的有益效果是：
本发明的转基因细胞系含有上述核酸分子，可用于真核表达上述抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体。
本发明的目的之六，提供上述抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体、上述核酸分子、上述重组质粒、上述重组菌和上述转基因细胞系在制备预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2肺炎的药物中的应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体、上述核酸分子、上述重组质粒、上述重组菌和上述转基因细胞系在制备预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2肺炎的药物中的应用。
本发明的应用的有益效果是：
本发明的上述抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体、上述核酸分子、上述重组质粒、上述重组菌和上述转基因细胞系，可以抑制SARS-CoV-2对细胞的感染，用于制备预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2肺炎的药物。
本发明的目的之七，提供上述抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体、上述核酸分子、上述重组质粒、上述重组菌和上述转基因细胞系在制备新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体、上述核酸分子、上述重组质粒、上述重组菌和上述转基因细胞系在制备新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
本发明的应用的有益效果是：
上述抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体、上述核酸分子、上述重组质粒、上述重组菌和上述转基因细胞系，可以用于制备新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测试剂或检测试剂盒，可用于如下具体用途：结合新型冠状病毒SARS-CoV-2；检测结合新型冠状病毒SARS-CoV-2；结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白；检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白。
附图说明
图1为本发明的实施例3中，1-Fc中和纳米抗体的SARS-CoV-2假型病毒的中和实验结果图。
图2为本发明的实施例3中，2-Fc中和纳米抗体的SARS-CoV-2假型病毒的中和实验结果图。
图3为本发明的实施例3中，3-Fc中和纳米抗体的SARS-CoV-2假型病毒的中和实验结果图。
图4为本发明的实施例3中，4-Fc中和纳米抗体的SARS-CoV-2假型病毒的中和实验结果图。
图5为本发明的实施例3中，5-Fc中和纳米抗体的SARS-CoV-2假型病毒的中和实验结果图。
图6为本发明的实施例3中，6-Fc中和纳米抗体的SARS-CoV-2假型病毒的中和实验结果图。
具体实施方式
以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：识别SARS-CoV-2刺突蛋白RBD结构域纳米抗体的筛选
步骤1：拯救噬菌体表面展示纳米抗体库
全合成纳米抗体库以噬菌粒的形式保存在宿主菌中，在淘选过程开始前，先拯救文库，使其成为噬菌体展示的抗体库。具体方法如下：
取1mL(OD600＝100)抗体库甘油菌，接种至5瓶200mL 2TY-CARB培养基(OD600＝0.1)，37℃，250rpm摇菌至OD600＝0.5左右；每瓶菌液加入1.6×1012PFU的M13KO7，37℃静置30分钟，37℃，200rpm摇菌30分钟；菌液转移到离心瓶中，2200g离心15分钟，用400mL 2TY-CARB-KAN重悬菌体沉淀，30℃，250rpm摇菌14-16小时；菌液分装入离心瓶(每瓶200mL)，10000g，4℃离心30分钟，收集上清，加入50mL(1/4体积)PEG/NaCl，冰上静置1小时，7700g，4℃离心15分钟；用10mL PBS重悬沉淀，共收集100mL噬菌体，0.22μm滤器过滤，4℃保存。菌落法滴定噬菌体滴度，准备对数生长期TG1，感染上述噬菌体(10倍倍比稀释)，200μL菌液与200μL噬菌体混合，37℃静置30分钟，取100μL涂2TY-GLU-CARB琼脂板，10-10，10-11，10-12各涂2块，第二天计数。
步骤2：噬菌体淘选
取10μL Streptavidin T1磁珠(购自赛默飞世尔)，加至1mL PBS中，磁力架上静置1分钟，吸去上清，重复两次。磁珠中加入1013PFU/mL噬菌体1mL，室温颠倒旋转孵育2小时，磁力架上静置1分钟，保留上清。另取10μL Streptavidin T1磁珠加入生物素化的SASR-CoV刺突蛋白RBD抗原(购自北京义翘神州科技有限公司，货号：40592-V08H-B)，室温颠倒旋转孵育30分钟，用PBS(0.1％BSA)洗4-5遍；加入步骤1的上清，室温颠倒旋转孵育2小时，PBS+0.1％Tween-20洗10遍，PBS洗1遍；加1mL洗脱液(100mM三乙胺，70μL TEA+5mL H2O)室温洗脱10分钟，加1mL 1M Tris-HCl(pH值为7.5)中和；准备OD600＝0.4的TG115mL，1mL TG1加入洗脱后的磁珠，37℃静置30分钟，将1.5mL洗脱产物加入13.5mL TG1中，37℃静置30分钟；菌液4000g离心15分钟，重悬沉淀至15mL 2TY-GLU-CARB，37℃，200rpm摇菌过夜。
步骤3：淘选后噬菌体的扩增
步骤2的15mL菌液接入200mL 2TY-GLU-CARB，37℃，250rpm摇菌至OD600＝0.5左右；加入1.6×1012PFU的M13KO7，37℃静置30分钟，37℃，200rpm摇菌30分钟；菌液转移到离心瓶中，2200g离心15分钟，用400mL 2TY-CARB-KAN重悬菌体沉淀，30℃，250rpm摇菌14-16小时；菌液分装入离心瓶(每瓶200mL)，4℃，10000g离心15分钟，取上清，加入50mL(1/4体积)PEG/NaCl，冰上静置1小时，4℃，5000g离心15分钟；每200mL对应沉淀物用2mL PBS重悬沉淀，4℃，4000rpm离心5分钟收集上清，用0.22μm滤器过滤，菌落法滴定噬菌体滴度。
步骤4：噬菌体酶联免疫吸附实验(Phage ELISA)鉴定阳性克隆
准备圆底深孔96孔板，每孔600μL 2TY-CARB培养基，从第4轮淘选后的菌板上挑单菌落至96孔板中，37℃，150rpm摇菌过夜；准备新的圆底96孔板，每孔90μL 2TY-CARB培养基，从过夜培养的96孔板中取10μL菌液至新96孔板中，37℃，150rpm摇菌1小时；加入25μLM13KO7(提前稀释至109PFU/mL)，37℃静置30分钟，37℃，200rpm摇菌30分钟，4000rpm离心15分钟，弃上清，用100μL 2TY-CARB-KAN重悬后转移至新的深孔96孔板中，每孔另加900μL2TY-CARB-KAN，30℃，250rpm摇菌过夜；ELISA板用1μg/mL RBD抗原包被，每孔100μL，4℃过夜；ELISA板每孔200μL PBS+0.1％Tween-20洗一遍，后每孔200μL PBS+0.1％Tween-20+5％BSA室温封闭1小时；200μL PBS+0.1％Tween-20洗5遍，每孔加入40μL PBS+5％BSA；96孔深孔板在4℃，4000rpm离心15分钟，取160μL phage加入到ELISA板中，与PBS+5％BSA混合，振荡器混匀后，室温静置1小时；200μLPBS+0.1％Tween-20洗5遍，每孔加入100μL HRP-anti-M13 antibody(购自北京义翘神州科技有限公司，货号：11973-MM05T-H)(PBS+0.1％Tween-20+5％BSA稀释)，室温静置1小时；200μL PBS+0.1％Tween-20洗3遍，200μL PBS洗3遍，每孔加入100μL TMB，室温避光，显色到合适程度，每孔加50μL 0.5M H2SO4终止反应，测OD450的吸光度值。实验组读数与阴性对照读数比值大于5的噬菌体鉴定为阳性克隆。阳性克隆用SEQID No.7所示的引物测序。
SEQ ID No.7：5′-acgacaggtttcccgactg-3′。
测序后分析显示，所有阳性克隆可总结为16种不同序列的克隆,编号A-P，以备后续构建重组表达载体。
实施例2：纳米抗体与Fc蛋白融合表达
步骤1：重组表达载体构建
采用SEQ ID No.8所示的上游引物和SEQ ID No.9所示的下游引物来扩增阳性克隆基因。
SEQ ID No.8：5′-ggcgctagccaagttcaattggttgaat-3′
SEQ ID No.9：
5′-tgagcctccactgaattcagaagaaacagtaacttgagtacct-3′。
获得编码抗RBD纳米抗体的核酸分子。抗体基因经NheI和EcoRI双酶切后插入抗体表达载体pCDNA4-Fc，转化DH5a大肠杆菌感受态细胞(购自全式金公司)得到重组菌。将重组菌接种于液体LB-Amp培养基，37℃过夜培养，用质粒抽提试剂盒提取质粒。获得16个纳米抗体重组质粒。pCDNA4-Fc由pCDNA4/myc-HisA(购自赛默飞世尔)改造而成，在载体的HindIII和AgeI酶切位点插入干扰素分泌信号肽和人IgG1 Fc基因。
步骤2：融合蛋白的表达
2×107个HEK293T细胞(来源自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)接种于15cm培养皿中，培养基使用含10％胎牛血清(购买自赛默飞世尔)的DMEM高糖培养基(购买自赛默飞世尔)，12小时后，转染36μg重组质粒，转染后12小时，换无血清培养基(购买自赛默飞世尔)，72小时候收集培养上清。通过Protein A-agarose(购自北京义翘神州科技有限公司)进行蛋白纯化。上清用0.45μm滤器过滤细胞碎片后过柱，流速控制在1mL/分钟；用5倍柱体积的结合缓冲液(50mM Tirs，100mM NaCl，pH值为8.0)洗柱；加入2倍柱床体积的洗脱缓冲液(100mM甘氨酸，10mM NaCl，pH值为3.0)洗脱，收集洗脱液，加入1/5柱床体积的中和液(1M Tirs，pH值为9.4)。最后利用分子筛进行进一步纯化。
实施例3：纳米抗体的SARS-CoV-2假型病毒中和活性测定
步骤1：SARS-CoV-2假型病毒包装
6×106个HEK293T细胞(来源自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)接种于10cm培养皿中，培养基使用含10％胎牛血清(购买自赛默飞世尔)的DMEM高糖培养基(购买自赛默飞世尔)，12小时后，转染10μg S基因表达质粒(金唯智)与10μg pNL4.3-Luc-R-E-质粒(BioVectorNTCC)，转染后12小时更换含2％胎牛血清的DMEM高糖培养基，继续培养48小时并收获含有SARS-CoV-2假型病毒的培养上清，分装并冻存于-80℃。
步骤2：SARS-CoV-2假型病毒入侵抑制实验
104个Calu-3细胞(来源自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)接种于96孔板，SARS-CoV-2假型病毒分别与不同稀释度的中和纳米抗体混合后，室温孵育30分钟，加入细胞中，培养6小时后更换新鲜培养基，继续培养48小时。SARS-CoV-2假型病毒含有荧光素酶报告基因，使用荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega，货号：E4550)检测细胞内荧光素酶活性，从而计算中和纳米抗体对假型病毒入侵的抑制率。16种纳米抗体中有中和活性的有6种，编号为1-6，中和纳米抗体依次由框架区FR1、互补决定区CDR1、框架区FR2、互补决定区CDR2、框架区FR3、互补决定区CDR3和框架区FR4组成，具体信息如下：
中和纳米抗体1-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。FR1为SEQ ID No.1自N端第1-30位，CDR1为第31-37位，FR2为第38-55位，CDR2为第56-62位，FR3为第63-101位，CDR3为第102-107位，FR4为第108-118位。
中和纳米抗体2-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。FR1为SEQ ID No.2自N端第1-30位，CDR1为第31-37位，FR2为第38-55位，CDR2为第56-62位，FR3为第63-101位，CDR3为第102-117位，FR4为第118-128位。
中和纳米抗体3-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。FR1为SEQ ID No.3自N端第1-30位，CDR1为第31-37位，FR2为第38-55位，CDR2为第56-62位，FR3为第63-101位，CDR3为第102-110位，FR4为第111-121位。
中和纳米抗体4-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。FR1为SEQ ID No.1自N端第1-30位，CDR1为第31-37位，FR2为第38-55位，CDR2为第56-62位，FR3为第63-101位，CDR3为第102-110位，FR4为第111-121位。
中和纳米抗体5-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。FR1为SEQ ID No.1自N端第1-30位，CDR1为第31-37位，FR2为第38-55位，CDR2为第56-62位，FR3为第63-101位，CDR3为第102-110位，FR4为第111-121位。
中和纳米抗体6-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。FR1为SEQ ID No.1自N端第1-30位，CDR1为第31-37位，FR2为第38-55位，CDR2为第56-61位，FR3为第62-100位，CDR3为第101-109位，FR4为第110-120位。
以上6种中和纳米抗体抑制SARS-CoV-2假型病毒入侵的实验结果如表1所示：6种中和纳米抗体抑制SARS-CoV-2假型病毒入侵的IC50分别为：1-FC：IC50＝6.858nM；2-FC：IC50＝0.9589nM；3-FC：IC50＝17.83nM；4-FC：IC50＝2.228nM；5-FC：IC50＝10.49nM；6-FC：IC50＝0.3046nM。
表1中和纳米抗体对SARS-CoV-2假型病毒入侵的抑制率
抗体编号 IC<sub>50</sub>(nM)
1-FC 6.858
2-FC 0.9589
3-FC 17.83
4-FC 2.228
5-FC 10.49
6-FC 0.3046
由此可见，本发明提供的抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体能够与RBD抗原有效结合，融合人IgG Fc标签后能有效与人ACE2蛋白竞争结合RBD抗原，对SARS-CoV-2假型病毒中和活性高，对于新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的疾病的预防、临床治疗和诊断试剂的研发均具有重要的科学意义和应用前景。
除此之外，本发明还提供编码上述抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体的核酸分子。
本发明还提供含有上述核酸分子的重组质粒。
本发明还提供含有上述核酸分子的重组菌。
本发明还提供含有上述核酸分子的转基因细胞系。
本发明还提供上述的抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体、上述的核酸分子、上述的重组质粒、上述的重组菌和上述的转基因细胞系在制备预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2肺炎的药物中的应用。
本发明还提供上述的抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体、上述的核酸分子、上述的重组质粒、上述的重组菌和上述的转基因细胞系在制备新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国医学科学院病原生物学研究所
<120> 一种抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gly Ser Glu Tyr Ala Thr
20 25 30
Phe Arg His Tyr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg
35 40 45
Glu Ala Val Ser Ala Ile Ala Ala Ala Asn Gly Glu His Ser Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
65 70 75 80
Thr Val Thr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ile Val Asp Gly Trp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gly Ser Glu Tyr Arg Tyr
20 25 30
Ser Asp Trp Thr Ser Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg
35 40 45
Glu Ala Val Ser Ala Ile Ala Gly Tyr Asp Asn Thr Pro Asn Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
65 70 75 80
Thr Val Thr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Tyr Ile Lys Met Asn Ser Asp Met His Val
100 105 110
Gln Arg Glu Trp Glu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 3
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gly Ser Glu Tyr Asp Phe
20 25 30
Ser Trp Ser Tyr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg
35 40 45
Glu Ala Val Ser Ala Ile Ala Asp His Trp Thr Gln Asp Asp Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
65 70 75 80
Thr Val Thr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Met Ser Ile Gly Trp Pro Glu Leu Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gly Ser Glu Tyr Ser Thr
20 25 30
Trp Arg His Tyr Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg
35 40 45
Glu Ala Val Ser Ala Ile Ala Ser Leu Asp Ser Ser Val Ala Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
65 70 75 80
Thr Val Thr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ile Glu Thr Val His Gly His Met Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gly Ser Glu Tyr Ala Thr
20 25 30
Phe Gly His Tyr Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg
35 40 45
Glu Ala Val Ser Ala Ile Ala Gly Ala Gly Asp Arg Arg Ala Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
65 70 75 80
Thr Val Thr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ile Asp Thr Glu Tyr Gly Gln Asn Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gly Ser Glu Tyr Thr Tyr
20 25 30
Ser Tyr Ile Tyr Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg
35 40 45
Glu Ala Val Ser Ala Ile Ala Gly Glu Asn Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Thr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Trp Pro Thr Gln Asp Gly Tyr Ala Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgacaggtt tcccgactg 19
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggcgctagcc aagttcaatt ggttgaat 28
<210> 9
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgagcctcca ctgaattcag aagaaacagt aacttgagta cct 43

Claims (9)

1.一种抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体，其特征在于，所述中和纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；所述中和纳米抗体包括SEQ ID No.1自N端第31-37位所示的CDR1、第56-62位所示的CDR2和第102-107位所示的CDR3的中和纳米抗体。
2.根据权利要求1所述的抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体，其特征在于，所述中和纳米抗体还包括框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其中，所述FR1如SEQ ID No.1自N端第1-30位所示；
所述FR2如SEQ ID No.1自N端第38-55位所示；
所述FR3如SEQ ID No.1自N端第63-101位所示；
所述FR4如SEQ ID No.1自N端第108-118位所示。
3.根据权利要求1所述的抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体，其特征在于，所述中和纳米抗体的序列为SEQ ID NO.1所示。
4.编码权利要求1-3任一项所述的抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体的核酸分子。
5.一种含有权利要求4所述核酸分子的重组质粒。
6.一种含有权利要求4所述核酸分子的重组菌。
7.一种含有权利要求4所述核酸分子的转基因细胞系。
8.权利要求1-3任一项所述的抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的重组质粒、权利要求6所述的重组菌和权利要求7所述的转基因细胞系在制备预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的肺炎的药物中的应用。
9.权利要求1-3任一项所述的抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的中和纳米抗体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的重组质粒、权利要求6所述的重组菌和权利要求7所述的转基因细胞系在制备新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
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