CN111825762A - 抗sars-cov-2病毒s蛋白rbd结构域的纳米抗体及其用途 - Google Patents

抗sars-cov-2病毒s蛋白rbd结构域的纳米抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗SARS‑COV‑2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体，所述纳米抗体能识别SARS‑COV‑2病毒S蛋白的RBD结构域，包括纳米抗体1‑纳米抗体19一种或多种；该纳米抗体能够与SARS‑COV‑2的S蛋白RBD区特异性结合，阻断病毒与细胞受体ACE2的结合，抗体与RBD结合的EC50为0.4212ng/ml～325.24ng/ml。所述纳米抗体与病毒受体ACE2蛋白竞争，IC50为2.433nM～100.02nM。本发明还提供所述纳米抗体及其重组抗体在制备抑制SARS‑COV‑2病毒感染的药物、制备SARS‑COV‑2病毒检测试试剂或试剂盒中的用途。

Description

抗SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体及其用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种抗SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体及其用途。
背景技术
SARS-CoV-2病毒是一种新型高致病性冠状病毒，从2019年12月以来肆掠全球。该病毒与2002年出现的SARS病毒有79.5％的序列相似性。在基因组水平上，SARS-CoV-2与蝙蝠冠状病毒的同源性为96％。SARS-CoV-2潜伏期较长，可达14天，也因此感染初期不明显，从而使该病毒更容易播散，造成蔓延、爆发态势。为抑制疫情的进一步蔓延，快速诊断试剂盒的开发，疫苗的研制和中和抗体的制备尤为重要。
冠状病毒由双层脂质的囊膜组成，包含刺突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白以及核衣壳蛋白。其中，膜蛋白介导病毒与宿主ACE2蛋白的相互作用，SARS-CoV-2与SARS-CoV使用相同的入侵受体。序列比对发现，SARS-CoV-2与SARS-CoV的氨基酸序列同源性为80％。S蛋白分为S1和S2两个亚基，其中S1的功能是与宿主受体结合，S2的主要功能是促进病毒和细胞膜融合。S1的RBD结构域与ACE2蛋白结合的高亲和力导致病毒能在人群中快速传播。S蛋白暴露于病毒表面，含有大量的抗原决定簇，可以产生针对病毒的保护性抗体。
纳米抗体(Nanobody)是由比利时科学家于1993年在自然杂志中首次报道，在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区。单独克隆和表达的VHH保留抗体的稳定性和抗原结合活性。纳米抗体分子量约为15KD，是目前发现的最小的抗原结合单位。
与传统的单克隆抗体相比，纳米抗体具有以下几个方面的优点：亲和力高，稳定性好，免疫原性低，渗透性更好，具有高水溶性、高耐性、易复性及高表达性。因此，纳米抗体在诊断是治疗方面具有较好的应用前景。
因此，亟需开发新的用于针对SARS-COV-2的纳米抗体。
发明内容
为了解决所述技术问题，本发明提供了一种抗SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体及其用途，可以特异性识别RBD蛋白，所述纳米抗体与RBD结合的EC50为0.4212ng/ml～325.24ng/ml。
第一方面，本发明提供了抗SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体，所述纳米抗体能识别SARS-COV-2病毒S蛋白的RBD结构域，包括如下的纳米抗体1-纳米抗体19一种或多种：
纳米抗体1：具有如SEQ ID NO：20-SEQ ID NO：22所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体2：具有如SEQ ID NO：23-SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体3：具有如SEQ ID NO：26-SEQ ID NO：28所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体4：具有如SEQ ID NO：29-SEQ ID NO：31所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体5：具有如SEQ ID NO：32-SEQ ID NO：34所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体6：具有如SEQ ID NO：35-SEQ ID NO：37所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体7：具有如SEQ ID NO：38-SEQ ID NO：40所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体8：具有如SEQ ID NO：41-SEQ ID NO：43所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体9：具有如SEQ ID NO：44-SEQ ID NO：46所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体10：具有如SEQ ID NO：47-SEQ ID NO：49所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体11：具有如SEQ ID NO：50-SEQ ID NO：52所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体12：具有如SEQ ID NO：53-SEQ ID NO：55所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体13：具有如SEQ ID NO：56-SEQ ID NO：58所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体14：具有如SEQ ID NO：59-SEQ ID NO：61所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体15：具有如SEQ ID NO：62-SEQ ID NO：64所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体16：具有如SEQ ID NO：65-SEQ ID NO：67所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体17：具有如SEQ ID NO：68-SEQ ID NO：70所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体18：具有如SEQ ID NO：71-SEQ ID NO：73所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体19：具有如SEQ ID NO：74-SEQ ID NO：76所示氨基酸序列的三个互补决定区。
进一步地，所述纳米抗体包括如下的一种或多种纳米抗体：
B4纳米抗体：具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；
B6纳米抗体：具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；
B9纳米抗体：具有如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列；
E3纳米抗体：具有如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列；
E6纳米抗体：具有如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列；
E7纳米抗体：具有如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列；
F4纳米抗体：具有如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列；
F5纳米抗体：具有如SEQ ID NO：8所示氨基酸序列；
F8纳米抗体：具有如SEQ ID NO：9所示氨基酸序列；
G2纳米抗体：具有如SEQ ID NO：10所示氨基酸序列；
G5纳米抗体：具有如SEQ ID NO：11所示氨基酸序列；
A1纳米抗体：具有如SEQ ID NO：12所示氨基酸序列；
F1纳米抗体：具有如SEQ ID NO：13所示氨基酸序列；
G3纳米抗体：具有如SEQ ID NO：14所示氨基酸序列；
C7纳米抗体：具有如SEQ ID NO：15所示氨基酸序列；
D4纳米抗体：具有如SEQ ID NO：16所示氨基酸序列；
H3纳米抗体：具有如SEQ ID NO：17所示氨基酸序列；
H4纳米抗体：具有如SEQ ID NO：18所示氨基酸序列；
H6纳米抗体：具有如SEQ ID NO：19所示氨基酸序列。
进一步地，所述抗SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体还包括：所述B4、B6、B9、E3、E6、E7、F4、F5、F8、G2、G5、A1、F1、G3、C7、D4、H3、H4、H6纳米抗体的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的抗体。
进一步地，所述抗SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体还包括：在所述B4、B6、B9、E3、E6、E7、F4、F5、F8、G2、G5、A1、F1、G3、C7、D4、H3、H4、H6纳米抗体的N端和/或C端连接标签得到的抗体。
第二方面，本发明提供了一种编码所述纳米抗体的核酸分子。
进一步地，所述核酸分子包括核酸分子1-核酸分子19中的一种或多种：
核酸分子1：编码所述B4纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：77所示；
核酸分子2：编码所述B6纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：78所示；
核酸分子3：编码所述B9纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：79所示；
核酸分子4：编码所述E3纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：80所示；
核酸分子5：编码所述E6纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：81所示；
核酸分子6：编码所述E7纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：82所示；
核酸分子7：编码所述F4纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：83所示；
核酸分子8：编码所述F5纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：84所示；
核酸分子9：编码所述F8纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：85所示；
核酸分子10：编码所述G2纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：86所示；
核酸分子11：编码所述G5纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：87所示；
核酸分子12：编码所述A1纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：88所示；
核酸分子13：编码所述F1纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：89所示；
核酸分子14：编码所述G3纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：90所示；
核酸分子15：编码所述C7纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：91所示；
核酸分子16：编码所述D4纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：92所示；
核酸分子17：编码所述H3纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：93所示；
核酸分子18：编码所述H4纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：94所示；
核酸分子19：编码所述H6纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：95所示。
第三方面，本发明提供了一种含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
第四方面，本发明提供了一种重组抗体，所述重组抗体由抗SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体和人源Fc片段组成，所述人源fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：39所示。
第五方面，本发明提供了所述的SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体以及所述的重组抗体在制备抑制SARS-COV-2病毒感染的药物、制备SARS-COV-2病毒试剂或试剂盒中的用途。
第六方面，本发明提供了一种SARS-COV-2病毒检测试剂或试剂盒，包括所述的SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体或者所述的重组抗体。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供的抗SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体，能够与新型冠状病毒SARS-COV-2的S蛋白RBD区特异性结合，阻断病毒与细胞受体ACE2的结合，抗体与RBD结合的EC50为0.4212ng/ml～325.24ng/ml；所述纳米抗体与病毒受体ACE2蛋白竞争，IC50为2.433nM～100.02nM，该抗体具有抑制病毒感染的能力。
本发明提供的一种SARS-COV-2病毒的检测试剂盒，包括本发明的纳米抗体或者包括由所述纳米抗体和人源fc片段组成的重组抗体，特异性强，灵敏度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是抗体与RBD蛋白结合曲线；
图2是F1纳米抗体对ACE2蛋白与RBD蛋白结合的抑制曲线图；
图3是纳米抗体应用于胶体金检测试剂盒时的灵敏度结果。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
S蛋白暴露于病毒表面，含有大量的抗原决定簇，可以产生针对病毒的保护性抗体，是疫苗研发和中和性抗体开发的主要抗原。同时，由于其免疫原性较强，可以在病毒体内产生大量抗体，也是开发诊断试剂盒的重要原料。
本发明利用噬菌体展示技术筛选纳米抗体，其主要原理是纳米抗体与噬菌体P3蛋白融合表达而展示到噬菌体表面，实现基因型和表现型的统一。利用纯化的RBD蛋白富集与之结合的抗体，洗去未结合的抗体。从而实现从大量克隆中筛选出与RBD蛋白结合的特定抗体。
本研究用纯化后的RBD蛋白筛选纳米抗体库，通过3轮筛选，获得了19株不同的纳米抗体，分别为：B4、B6、B9、E3、E6、E7、F4、F5、F8、G2、G5、A1、F1、G3、C7、D4、H3、H4、H6纳米抗体；
所述纳米抗体的CDR区的氨基酸序列如下表1所示：
表1
Figure BDA0002542578890000061
Figure BDA0002542578890000071
因此，具有B4、B6、B9、E3、E6、E7、F4、F5、F8、G2、G5、A1、F1、G3、C7、D4、H3、H4、H6纳米抗体的互补决定区CDR1-CDR3的纳米抗体，也在本发明的保护范围之内，即本发明的纳米抗体1-纳米抗体19。
这些纳米抗体，经实验验证，能够与新型冠状病毒SARS-COV-2的S蛋白RBD区特异性结合，阻断病毒与细胞受体ACE2的结合，抗体与RBD结合的EC50为0.4212ng/ml～325.24ng/ml。所述纳米抗体与病毒受体ACE2蛋白竞争，IC50为2.433nM～100.02nM，该抗体具有抑制病毒感染的能力。
此外，本发明还将所述纳米抗体重组后获得的重组抗体；
所述纳米抗体或者重组抗体用于SARS-COV-2病毒的胶体金检测试剂盒，特异性强、准确度高，灵敏度高。这些抗体进一步经过基因重组，加入人源抗体的重链恒定区基因，可以开发诊断试剂的质控抗体。由于羊驼的纳米抗体与人源抗体基因同源性很高，纳米抗体可以经过少数点突变，获得人源化后的纳米抗体，用于疾病治疗。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的效果进行详细说明。
实施例1纳米抗体的获得
1、纳米抗体库的构建
取一支15ml离心管，先加入与血液样本等量的分离液，小心吸取血液样本加于分离液之液面上，450-650g，离心20-30min；离心后，此时离心管中由上至下分为四层，依次为血浆层，环状乳白色淋巴细胞层，透明分离液层和红细胞层；用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中；向所得离心管中加入10ml清洗液，混匀细胞，250g，离心10min；离完心看上清液是否澄清，不够澄清加长离心时间；用1xPBS清洗细胞2次，加trizol裂解细胞-80℃保存。
取-80℃保存的外周淋巴细胞裂解液在室温中融化；加入0.2ml氯仿，盖上盖子，剧烈振荡15s，室温放置2min后，于12000g、4℃离心15min；将上清小心转至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10min；于12000g，4℃离心15min；离心后弃上清，沉淀用75％的酒精漂洗，再次于12000g，4℃离心5min；离心后弃上清，将离心管置于室温，待其干燥用无RNase的水溶解RNA；取少许溶解的RNA跑琼脂糖胶，并测定浓度，判断RNA是否降解。
从-80℃取出总RNA于冰上融化；PCR仪上65℃5min打开RNA的二级结构；依次加入buffer和逆转录酶及引物37℃30min，98℃5min；用内参引物验证得到的cDNA；-20℃保存(-80℃长期保存)。配制PCR反应体系，用羊驼抗体库引物，从cDNA中扩增出抗体基因(本次采用两对引物进行扩增，所用到的两对引物如表2所示)；将PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析，并切下约500bp左右的目的条带，用胶回收柱回收目的片段扩增产物。
表2
Figure BDA0002542578890000081
用SfiⅠ和NotⅠ双酶切pCANTAB5E载体和抗体基因。1.5％的琼脂糖胶切胶，用天根DNA回收试剂盒回收目的片段，分装后于-20℃冻存待用；配制反应体系，将抗体基因连入酶切后的pCANTAB5E载体。按下列体系配制连接体系：载体1.5ug，抗体0.5ug，T4连接酶2μL，10xbuffer 10μL，加水至100μL，在PCR仪上16℃连接过夜。
TG1划线接种到Minimal培养板37℃培养过夜；接种TG1单菌落至5mL2YT培养液中于37℃振荡培养过夜；次日将接种过夜培养的菌液5mL加至300mL的2YT培养液中，振荡培养至OD600达到0.4-0.5。将菌液冰浴30min后，在预冷的离心机中于4℃以4000g离心15min；用300mL预冷的灭菌去离子水于冰水中轻柔重悬沉淀，至沉淀细胞完全均匀地分散于水中；在预冷的离心机中于4℃以4000g离心15min；再依次用150mL预冷的灭菌去离子水和30mL预冷的10％的甘油(用灭菌去离子水配制)如上所述重悬细胞两次；最后将细胞重悬于1mL预冷的10％的甘油中，置于冰上立即使用或分装；冻存于-80℃中待用；向100uL感受态中加入5uL连接产物，放于冰上预冷，转入预冷后的电转杯中；调节电转仪电压2.5KV电击时间5ms，电击后，迅速加入0.9ml 2YT培养基，37℃振荡培养2小时；取10uL梯度稀释，涂布于SOBAG平板上，计算库容，剩余菌液涂布于10个SOBAG平板上，37℃培养过夜。
对梯度稀释的菌落计数，计算出本次建成的抗体库的库容；从SOBAG平板上随机挑取20个克隆，用菌落PCR检测抗体基因插入载体的效率；将随机挑选的20个克隆送测序分析，检测抗体库容，抗体基因的完整性及多样性。
2、拯救噬菌体表面展示纳米抗体库
将构建好的纳米抗体库以噬菌粒的形式保存在宿主菌中，在淘选过程开始前，应当先拯救文库，使其成为噬菌体展示的抗体库。具体方法如下：
将1.5mL带E-tag标签的抗体库接种到300mL 2YT-AG培养基中，至OD600nm约0.3-0.4；37℃振荡培养约1.5h至OD600nm＝0.5-0.6；按细菌：phage＝1:5加入helper phage辅助噬菌体(M13K07)，37℃振荡培养约1h；4000rpm 15℃离心15min，去除培养基；加入200mL2YT-AK(100μg/mL Amp，50μg/mL Kan)培养基重悬细菌，37℃培养2h；10000rpm离心20min去除沉淀；上清加入40mL PEG/NaCl沉淀phage，冰浴过夜；10000rpm离心20min，去掉上清；用0.6mL 2YT培养基重悬phage，4℃备用。若需要大量制备phage，更换kan抗性的培养基以后，培养时间从两小时延长至过夜培养。获得的噬菌体经过梯度稀释，感染TG1菌，涂布SOBAG平板，通过菌落计数计算噬菌体库滴度。
3、淘选单链抗体
本实验利用His Bind Resin结合抗原蛋白，从噬菌体展示的抗体库中淘选抗体，具体过程如下：活化His Bind Resin：取200μL His Bind Resin于1.5mL离心管中，1000g离心1min，去掉保存溶液；加入200μL的ddH2O清洗树脂一次，1000g离心1min，去掉上清，重复此步骤一次；加入200μL离子化缓冲液，重悬树脂，静置10min，离心去掉上清；加入200μL结合缓冲液，重悬树脂，静置10min；取40μL树脂加入1.5mL离心管中，离心去掉上清。
4、淘选识别目的蛋白的单链抗体
取纯化后的RBD蛋白35μL(约10μg)，加入165μL PBS中，混匀后加入装有活化后的树脂的EP管中，旋转混匀1h，1000g离心1min，去掉上清；加入200μL漂洗缓冲液，重悬树脂，1000g离心1min，去掉上清，此步骤重复一次。取拯救后的噬菌体展示抗体库溶液300μL，加入0.3μL Triton X-100，用微量移液器轻轻混匀；加入40μL未活化的树脂，轻微旋转反应1h；1000g离心1min，取上清加入40μL已包被抗原蛋白的树脂，轻微旋转反应2h；1000g离心1min，去掉上清；加入500μL漂洗缓冲液(含0.1％Triton X-100)，重悬树脂，轻微振荡漂洗5min，1000g离心1min，去掉上清，此步骤重复5次；
加入500μL漂洗缓冲液含(0.1％Tween-20)，重悬树脂，轻微振荡漂洗5min，1000g离心1min，去掉上清，此步骤重复5次；最后一次漂洗后，将树脂转移到新的EP管中，1000g离心1min，去掉上清；加入200μL洗脱缓冲液，轻微旋转洗脱20min；1000g离心1min，取上清，加入5mL TG1菌液中，37℃感染1h；将感染的菌液涂布SOBAG平板，30℃倒置培养过夜；次日，用2YT-AG培养基刮下平板上的菌落，并拯救成噬菌体进行下一轮淘选。
5、挑选识RBD蛋白的阳性克隆
从SOBAG平板上随机挑取单菌落接种到96孔细菌培养板中，每孔加入200μL 2YT-AG，37℃培养过夜；吸取25μL菌液到新的细菌培养板中，加入175μL 2YT-AG培养基，37℃培养3h；3500rpm离心10min，去上清，菌沉淀重悬于200μL 2YT-AI(100μg/mL Amp，1mM IPTG)培养基中，30℃诱导过夜；3500rpm离心10min，上清4℃保存备用；将纯化的的目的蛋白加入到ELISA板中，4℃包被过夜；倾掉包被液后，以PBS洗3次，4％PBSM(PBS含4％脱脂牛奶)封闭1h；以PBS洗1次后，每孔加入50μL以上制备好的单链抗体上清和50μL 4％PBSM，于37℃反应1h；用PBS和PBST各洗3次后，每孔加入100μL anti-E/HRP conjugation(以4％PBSM按1：5000稀释)，37℃保温1h；用PBST和PBS洗涤三次，加入100μL TMB底物溶液，避光反应15min，加入25μL 2mol/L H2SO4终止反应，用酶标仪测定OD450nm值判定目的蛋白的浓度。
6、阳性克隆测序和序列分析
将上述淘选得到的OD450nm值较大的目的蛋白经ELISA鉴定，将鉴定为阳性的单克隆送金开瑞测序，测序的通用引物为S1：5’-GACCATGATTACGCCAAGC-3’，用DNAstar和Clustalw1.8分析抗体的重链与轻链可变区序列。最终获得了19株不同的纳米抗体，分别为：B4、B6、B9、E3、E6、E7、F4、F5、F8、G2、G5、A1、F1、G3、C7、D4、H3、H4、H6纳米抗体，氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：19所示，核酸序列分别如SEQ ID NO：77-SEQ ID NO：95所示。
实施例2纳米抗体与RBD蛋白结合情况
将实施例1筛选获得的19株不同的纳米抗体分别与RBD结合，检测抗体与RBD结合的EC50值，RBD蛋白按照2μg/ml包被微孔板，19株纳米抗体的EC50值如表3所示。
表3
纳米抗体 EC50(ng/ml) 纳米抗体 EC50(ng/ml)
B4 91.69 G5 14.20
B6 325.24 A1 51.79
B9 153.27 F1 0.42
E3 254.45 G3 135.22
E6 5.54 C7 150.26
E7 3.26 D4 254.45
F4 50.14 H3 25.90
F5 25.33 H4 36.21
F8 76.25 H6 50.14
G2 52.19
由表1的数据可知，所述19株抗体与RBD结合的EC50的范围为0.42ng/ml～325.24ng/ml。
图1为F1抗体与RBD蛋白的结合曲线，由图1可知，RBD蛋白按照2μg/ml包被微孔板，梯度稀释F1抗体，检测信号随着抗体量增加而增加，说明抗体可以特异性识别RBD蛋白。
实施例3纳米抗体对ACE2蛋白与RBD蛋白结合的抑制情况
将RBD蛋白按照2μg/ml包被微孔板，将实施例1筛选获得的19株不同的纳米抗体分别与1ug/ml的藕连HRP的ACE2蛋白混合，测定OD450nm数值。19株纳米抗体采用的抗IC50值如表4所示。
表4
Figure BDA0002542578890000111
Figure BDA0002542578890000121
注：-表示抗体未测试
由表2的数据可知，所述19株抗体和ACE2蛋白均存在竞争关系，IC50的范围为2.433nM～100.02nM。
图2是F1纳米抗体对ACE2蛋白与RBD蛋白结合的抑制曲线图；OD450nm数值随着F1纳米抗体的浓度升高而降低，说明该纳米抗体和ACE2蛋白存在竞争关系。
实施例4重组抗体的构建与表达
1、重组表达载体的构建
根据测序结果，用引物(F:CGGCCCAGCCGGCCATGGCC如SEQ ID NO：102所示，R：GGACTAGTGCGGCC GCTGAGGAGACGGTGACCTG如SEQ ID NO：103所示)扩增抗体基因；抗体基因经sfiI和NotI双酶切，插入抗体表达载体pSecTag2A-fc，用质粒抽提试剂盒提取质粒。其中所述pSecTag2A-fc载体为用pSecTag2A载体(Thermo Fisher，V90020)改造，在pSecTag2A载体的hind III和BamH I酶切位点中插入了人源IgG1 Fc基因片段，所述人源fc基因片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：96所示，所述人源fc基因片段的核酸序列如SEQ ID NO：97所示。
2、融合蛋白的表达
转染前将所有试剂置于室温10分钟，以下操作使用6孔培养皿；将3μg质粒DNA稀释到250μL无血清的DMEM培养基，用移液枪吹吸3-4次；将5μLPEI试剂稀释到250μL无血清的DMEM培养基，用移液枪吹吸3-4次；注意：无血清的DMEM培养基是稀释液，不能使用含血清的培养基进行DNA和将稀释好的PEI转染试剂一次性全部加入到已稀释好的质粒DNA中，立即用移液枪吹吸3-4次；室温放置10-15分钟，以形成PEI-DNA复合物；转染前18-24小时进行细胞的计数并铺板，以便在转染时，使贴壁细胞的汇合度大约80％左右；弃去孔中原培养基，加入1ml新鲜的DMEM完全培养基；制备PEI-DNA复合物；将PEI-DNA混合液均匀滴入细胞培养基中，轻轻做十字运动，让PEI-DNA复合物分散均匀；培养皿放于5％CO2，37℃恒温培养箱中，72h后收集细胞，检测蛋白表达量。按照相同的比例转化100ml细胞，纯化重组表达的抗体。取上清进行亲和层析纯化和SDS-PAGE电泳分析，纯化的纳米抗体用间接竞争ELISA初步测定其活性。通过优化诱导表达条件(如宿主菌、表达载体、诱导培养时间、温度以及IPTG浓度等)，可以进一步提高目的蛋白表达量，为大量制备纳米抗体提供了途径。
实施例5纳米抗体用于SARS-COV-2病毒的检测
一、SARS-COV-2病毒的ELISA检测试剂盒，
1、SARS-COV-2病毒的ELISA检测试剂盒，包括：
包被有所述的抗SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体的ELISA酶标板；
阴性对照；
重组表达SARS-COV-2病毒S蛋白；
酶标记的酶标二抗；
样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液。
2、SARS-COV-2病毒的ELISA检测试剂盒的使用方法
(1)包被酶标板：取实施例4中纯化的重组抗体，用包被液稀释至适当的含量，96孔酶标板中每孔加100μL，置2-8℃吸附24小时。空去包被液，包被用洗液洗板3次。抗原蛋白包被浓度确定，先用包被液将纯化的重组PCV3 Cap蛋白稀释至蛋白含量为5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，30μg/ml，40μg/ml，加至96孔酶标板的微孔中，每孔加100μL，置2-8℃吸附24小时。从中选择一个优化的包被浓度，即10μg/ml。
包被液：
0.05M pH 9.5碳酸缓冲液
Na2CO3 1.50g
NaHCO3 2.94g
戊二醛 0.10ml
调pH至9.5，定容至1000ml。
包被用洗液：
0.01M pH7.2磷酸钾缓冲液
K2HPO4·3H2O 1.56g
KH2PO4 0.38g
调pH至7.2，定容至1000ml。
(2)封闭：空干包被洗液，加包被用封闭液150μL/孔，置2-8℃过夜。去除封闭液后自然干燥24小时。
包被用封闭液：
Figure BDA0002542578890000141
调pH至7.2，定容至1000ml。
(3)抗体的孵育
重组表达SARS-COV-2病毒S蛋白溶液，加入包被板孔中，100μL/孔。将酶标板置于37℃孵育30min。空净重组表达蛋白溶液后用洗涤液洗板5次。
洗涤液：(10倍浓度)
Figure BDA0002542578890000142
调pH至7.2，定容至1000ml。
4、酶标二抗的孵育：用磷酸缓冲液将辣根过氧化物酶标记的酶标二抗稀释至工作浓度，向酶标板孔中加入100μL/孔，置37℃，30min。
5、显色：加入50μL底物液A，50μL底物液B，轻摇混合，37℃反应10min。
底物溶液A：柠檬酸4.2g，醋酸钠13.6g，过氧化氢脲0.5g，调pH至5.0，定容至1000ml。
底物溶液B：四甲基联苯胺1.0g，甲醇100ml，二甲亚砜50ml，聚乙烯吡咯烷酮16.0g，调pH至5.0，定容至1000ml。
6、终止：显色结束后加终止液100μL/孔。终止液：2mol/LH2SO4。
7、读板：在450nm波长下，读取酶标板光吸收值。
8、该试剂盒的判定标准为：
试验有效性判定：阳性对照孔平均值≥0.506；阴性对照平均值≤0.254；
临界值(标准阳性样本阈值)＝阴性样本OD450平均值+3×标准差＝0.254+3×0.021＝0.317
阴性判定：样品OD值＜临界值者(0.317)为阴性；
阳性判定：样品OD值≥临界值者(0.317)为阳性。
9、该试剂盒的性能指标：
(1)特异性：除重组表达SARS-COV-2病毒S蛋白溶液外，其他检测样品均为阴性。这些数据表明，本发明提供的试剂盒与其他血清抗体之间不存在交叉反应。
(2)灵敏性：重组表达SARS-COV-2病毒S蛋白溶液稀释至0.0075ng/L时仍能检出。
(3)稳定性：将试剂盒置于37℃不少于2天与4℃存放的试剂盒同步检测20份样品，其符合率为100％。
(3)精密度：取浓度呈梯度的7种重组表达SARS-COV-2病毒S蛋白溶液标本，分别稀释，分别同批测定10次，批内变异系数为均低于4％；同样7份血清，隔天再测定10次，变异均低于5％；符合试剂盒精密度要求。
二、纳米抗体F1用做SARS-COV-2病毒抗体的胶体金检测试剂盒的质控
取448ng、112ng、28ng、7ng、3.5ng、1.85ng、0.875ng的F1抗体分别稀释于70μLPBS稀释液中，加入SARS-CoV-2成品检测卡检测。
图3是纳米抗体F1用作质控抗体应用于胶体金检测试剂盒时的灵敏度结果，由图3可知，所有检测卡C线正常，T线随抗体梯度稀释信号减弱，表明灵敏度高，抗体特异性良好。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 武汉华美生物工程有限公司
<120> 抗SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体及其用途
<160> 103
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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Gln Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ser Ser Gly Arg Ala Phe Thr Leu Asn
20 25 30
Glu Val Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Arg Gly Gly Asp Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Thr Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Pro Arg Asn Gly Ser Pro Ser Val Phe Glu Ile Leu Leu Val Ser Val
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Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Gly Gly Gly
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Ser Leu Arg Val Ser Cys Thr Tyr Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Asn
20 25 30
Ile Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Thr Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Trp Ser Arg Val Thr Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Ser Gly Ala Val Pro Ala His Gln Ile Gly Phe Arg Ser Thr Thr
100 105 110
Leu Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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Gln Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ile Phe Ser Leu Asn
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
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Ala Thr Ile Asn Arg Ser Gly Gly Ala Ser Tyr Gly Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Asn Val Ile Gly Thr Val Asn Ala Tyr Gly Ala Ala Ser Lys Pro Ala
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Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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Gln Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Trp Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Asn Tyr Gly Gly His Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Ala Val Ala Met Leu Pro Phe Leu Thr Ala Val Thr Pro Arg Pro Gly
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Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Pro Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Lys Leu His Thr Gly Val Leu Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Gln Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Phe Gly Pro Ala Pro Lys Pro Gln Asn Val Leu Thr Thr Ala Leu
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Pro Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Gly Phe Asn Ile Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Phe Gly Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Pro Leu Leu Ala Ser Ala Phe Val Leu Met Tyr Gly Ser Arg His
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ala Ile His Ser Gly Gly Asp Asn Thr Asn Tyr Ala Glu Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Pro Gly Pro Gly Phe Thr Thr Met Asp Arg Ser Gln Ala Arg Ile
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Ala Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ser Ile Tyr Ser Tyr Ile Ser Asn Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Gly Ser Thr Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala His Arg Phe Gln Thr Arg Val Arg Thr Thr Asn Pro Ile Glu Ser
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Glu Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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Gln Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ser Thr Gly Ser Ile Phe Ser Gly Asp
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Val Asp Gly Val Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
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Leu Leu Ala Arg Ile Arg Asp Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Cys Ala Phe Gly His Thr His Met Val Arg Pro Gly Ser Thr Val Met
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Ser Val Ile Glu Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Tyr Val Val Pro Tyr Ala Ile Ala Ala Gly Ala Pro Asp Gln Ile Gly
100 105 110
Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 125
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Leu Ser Ser Asn
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Leu Ile Arg Pro Thr Asn Gly Asn Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Arg Val Arg Leu Lys Val Arg Phe Gln Asp Arg Val Met Val
100 105 110
Thr Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 12
<211> 124
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ser Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Leu Ala Ser Ser Gly Tyr Ser Arg Asp Tyr Gly Ala Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 120
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
35 40 45
Ala Ile Asn Trp Gly Ser Ser Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Tyr Leu Ser Ser Ser Arg Ser Gly Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 120
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 14
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Asn Ser Arg Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ala Ile Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ser Asp Arg Leu Ser Gly Leu Arg Ser Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 122
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Asn Ser Arg Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ala Ile Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Ser Ser Leu Ala Gly Leu Arg Gly Arg Leu Tyr Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 123
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Tyr Gly Tyr Leu Asp Leu Asp Leu Pro Ala Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 126
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Asp Phe Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Ala Asn Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Gly Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Val Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Thr Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Ser Glu Ala Arg Tyr Arg Gly Tyr Pro Arg Phe Arg Val
100 105 110
Met Phe Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 18
<211> 124
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 18
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Ser Ser Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Leu Thr Cys Ser Asp Ser Gly Gly Ser Ile Thr Thr Thr
20 25 30
His Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Ala Tyr Ile Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Ser Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Thr Ala Ile Ser Trp Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Thr Leu His Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Asp Arg Asn Arg Val Arg Gly Tyr Asp Pro Cys Leu His Gly
100 105 110
Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 19
<211> 124
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 19
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Thr Asp
20 25 30
Val Ala Tyr Trp Ser Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Met Gly Ala Ile Ala Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Asn Ser Pro Phe
50 55 60
Phe Gly Ser Arg Thr Phe Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe
65 70 75 80
Thr Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Ile Ala Val Arg Asp Pro His Tyr Val Gly Val Gly Gly
100 105 110
Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 20
Gly Arg Ala Phe Thr Leu Asn Glu
1 5
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 21
Ile Thr Arg Gly Gly Asp Ile
1 5
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 22
Ala Pro Arg Asn Gly Ser Pro Ser Val Phe Glu Ile Leu Leu Val Ser
1 5 10 15
Val
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 23
Gly Arg Thr Phe Ser Arg Asn Ile
1 5
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 24
Ile Gly Trp Ser Arg Val Thr Thr
1 5
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 25
Ala Ser Gly Ala Val Pro Ala His Gln Ile Gly Phe Arg Ser Thr Thr
1 5 10 15
Leu
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 26
Gly Val Ile Phe Ser Leu Asn Tyr
1 5
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 27
Ile Asn Arg Ser Gly Gly Ala
1 5
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 28
Ala Asn Val Ile Gly Thr Val Asn Ala Tyr Gly Ala Ala Ser Lys Pro
1 5 10 15
Ala
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 29
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 30
Ile Asn Tyr Gly Gly His Thr
1 5
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 31
Ala Ala Val Ala Met Leu Pro Phe Leu Thr Ala Val Thr Pro Arg Pro
1 5 10 15
Gly
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 32
Gly Phe Ile Phe Asp Asn Tyr Ala
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 33
Leu His Thr Gly Val Leu Asn Thr
1 5
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 34
Ala Phe Gly Pro Ala Pro Lys Pro Gln Asn Val Leu Thr Thr Ala Leu
1 5 10 15
Pro
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 35
Arg Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Trp
1 5
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 36
Phe Asn Ile Gly Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 37
Ala Pro Leu Leu Ala Ser Ala Phe Val Leu Met Tyr Gly Ser Arg His
1 5 10 15
Leu
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 38
Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr Ala
1 5
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 39
Ile His Ser Gly Gly Asp Asn Thr
1 5
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 40
Ala Pro Gly Pro Gly Phe Thr Thr Met Asp Arg Ser Gln Ala Arg Ile
1 5 10 15
Ala
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 41
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 42
Ile Tyr Ser Tyr Ile Ser Asn Ser
1 5
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 43
Ala His Arg Phe Gln Thr Arg Val Arg Thr Thr Asn Pro Ile Glu Ser
1 5 10 15
Glu
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 44
Ile Phe Ser Gly Asp Val Asp Gly
1 5
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 45
Ile Arg Asp Gly Gly Thr Thr
1 5
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 46
Ala Phe Gly His Thr His Met Val Arg Pro Gly Ser Thr Val Met Ile
1 5 10 15
Met
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 47
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ala Asp
1 5
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 48
Ile Glu Ser Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 49
Ala Tyr Val Val Pro Tyr Ala Ile Ala Ala Gly Ala Pro Asp Gln Ile
1 5 10 15
Gly
<210> 50
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 50
Gly Phe Ala Leu Ser Ser Asn Trp
1 5
<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 51
Ile Arg Pro Thr Asn Gly Asn Lys
1 5
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 52
Ala Pro Arg Val Arg Leu Lys Val Arg Phe Gln Asp Arg Val Met Val
1 5 10 15
Thr
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 53
Gly Ser Thr Ser Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 54
Ile Ser Ser Gly Gly Ser Arg Thr
1 5
<210> 55
<211> 16
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 55
Ala Ala Leu Ala Ser Ser Gly Tyr Ser Arg Asp Tyr Gly Ala Tyr Asp
1 5 10 15
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 56
Ser Gly Ser Thr Phe Ser Ser Asn Ala
1 5
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 57
Ile Asn Trp Gly Ser Ser Ser Thr
1 5
<210> 58
<211> 13
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 58
Ala Ala Tyr Leu Ser Ser Ser Arg Ser Gly Asp Tyr Asp
1 5 10
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 59
Ser Gly Tyr Thr Asn Ser Arg Tyr Tyr
1 5
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 60
Ser Ala Ile Gly Arg Thr Tyr
1 5
<210> 61
<211> 13
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 61
Ala Ala Ser Asp Arg Leu Ser Gly Leu Arg Ser Tyr Gly
1 5 10
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 62
Ser Gly Tyr Thr Asn Ser Arg Tyr Tyr
1 5
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 63
Ser Ala Ile Gly Arg Thr Tyr Tyr
1 5
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 64
Ala Ala Asp Ser Ser Leu Ala Gly Leu Arg Gly Arg Leu Tyr Asp
1 5 10 15
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 65
Gly Ser Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 66
Ser Trp Gly Gly Gly Ser Thr Tyr
1 5
<210> 67
<211> 15
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 67
Ala Ala Ser Tyr Gly Tyr Leu Asp Leu Asp Leu Pro Ala Tyr Asp
1 5 10 15
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 68
Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr Asp
1 5
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 69
Thr Ala Asn Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 70
<211> 18
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 70
Ala Arg Thr Ser Glu Ala Arg Tyr Arg Gly Tyr Pro Arg Phe Arg Val
1 5 10 15
Met Phe
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 71
Gly Ser Ile Thr Thr Thr His Tyr Tyr
1 5
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 72
Ile Ala Tyr Ile Gly Asp Thr
1 5
<210> 73
<211> 15
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 73
Ala Asp Arg Asn Arg Val Arg Gly Tyr Asp Pro Cys Leu His Gly
1 5 10 15
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 74
Gly Gly Ser Ile Thr Thr Asp Val Ala
1 5
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 75
Ile Ala Ser Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 76
<211> 15
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 76
Ala Ala Ile Ala Val Arg Asp Pro His Tyr Val Gly Val Gly Gly
1 5 10 15
<210> 77
<211> 372
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 77
caggtgcagc tgcaggcgtc tggaggaggc ttagtgcaaa ctggggggtc tctaagactc 60
tcctgtgcat cctctgggcg cgccttcact ctcaatgaag tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgagtt ggtcgcaact attacccgtg gtggtgatat aaactatgca 180
gactccgtga aggaccgatt caccatcacc agagacaacg ccaggaacac gctgtatctg 240
caaatgacca atctgaaatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcacc tcggaatggg 300
tctccgtctg tgtttgagat tctgcttgtg tctgtgtact ggggcaaagg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 78
<211> 375
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 78
gatgtgcagc tgcaggcgtc tgggggagga ttggtgcagg gtgggggctc tctgagagtc 60
tcctgtacat actctggacg caccttcagt cgcaacatta tgggctggtt ccgccagtct 120
ccagggaaga cgcgtgagtt tgtcgcagcg attgggtgga gtcgcgttac cacactctat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacaatgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgtgt attactgtgc atctggggct 300
gtgcctgcgc atcagattgg gtttaggtct acgactctgt actggggcaa agggacccag 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 79
<211> 372
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 79
caggtgcagc tgcaggcgtc tgggggaggc ctggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggagt catcttcagt ctcaattaca tgggctggta ccgccaggct 120
gcagggaagg ggcgcgagtt ggttgcaact attaatagga gtggtggggc aagctatgga 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac ggtagacctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaaa tgtgattggg 300
actgtgaatg cgtatggggc tgcgtctaag cctgcgtact ggggcaaagg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 80
<211> 372
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 80
caggtccagc tgcaggcgtc tggaggaggc tgggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcca tgacctgggt ccgccaggct 120
ctaggaaagg ggctcgaatg ggtctcagat attaattatg gtggtcatac atcgtatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac gctatatctg 240
caaatgaaca gtctgaaacc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcagc tgtggctatg 300
cttccgtttc tgactgcggt tacgcctagg cctgggtact ggggcaaagg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 81
<211> 375
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 81
gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcaac ctggggggtc tctgccgctc 60
tcctgtgcag cctctggatt catttttgac aattatgcta tgagctgggt ccgacaggct 120
ccaggaaagg ggctggagtg ggtgtccaag cttcatactg gcgttcttaa cacatactac 180
gcaaactccg tgaagggccg attcaccatc tccacagaca acgccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctcca atctgaggac acggccgtgt attactgtgc atttgggcct 300
gcgcctaagc ctcagaatgt gcttacgact gcgcttccgt actggggcaa agggacccag 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 82
<211> 375
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 82
gatgtccagc tgcaggcgtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctagatt caccttcagt acctactgga tgtattgggt ccgtcaggct 120
ccagggaagg ggctcgagtg ggtctcaggt tttaatattg gtggtggtag cacctactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc ttcggagaca acgccaagaa cacgctgtac 240
ctgcaaatga acaacctgaa acctgaggac acggccgtgt attactgtgc acctctgctt 300
gcgtctgcgt ttgtgcttat gtatgggtct aggcatctgt actggggcaa agggacccag 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 83
<211> 375
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 83
caggtccagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gcctacgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg ggctcgagtg ggtctcagct attcatagtg gtggtgataa cacaaactat 180
gcagagtccg taaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagccttaa acctgaggac acggccgtgt attactgtgc acctgggcct 300
gggtttacga ctatggatcg gtctcaggct aggattgcgt actggggcaa agggacccag 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 84
<211> 375
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 84
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgcgactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacttttgat gattatggca tgagctgggt ccgacaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtgtccagt atttatagtt acattagtaa ttcatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccggc tccacagaca acgccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa atctgaggac acggccgtgt attactgtgc acatcggttt 300
cagactaggg ttaggactac gaatccgatt gagtctgagt actggggcaa agggacccag 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 85
<211> 378
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 85
caggtccagc tgcaggcgtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcgt ccactggaag catttttagt ggcgatgtcg atggcgtggg ctggttccgc 120
cgggctccag ggaaggagcg cgagttgctt gcccgcattc gtgacggtgg taccacatat 180
tatgcggact ccgtgaaggg ccggttcacc atctccggag acgacgccat gaacacggtg 240
tatctgcaaa tgaacagtct gaaacctgag gacacggccg tgtattactg tgcatttggg 300
catacgcata tggttcggcc tgggtctacg gttatgatta tgtactggga caaagggacc 360
caggtcaccg tctcctca 378
<210> 86
<211> 372
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 86
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctgggggttc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggctt caccttcagc agcgcagaca tgagttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggcccgagtg ggtctcagtt attgagagta gtgggagcac atactatgca 180
gagtccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaatac ggtatatcta 240
caaatgaaca acctgaaacc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcata tgtggttccg 300
tatgcgattg cggctggggc tccggatcag attgggtact ggggcaaagg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 87
<211> 375
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 87
caggtgcagc tggcggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctgggggttc tctgagactc 60
tcctgcgcag cctctggatt cgccctcagt tccaactgga tgtattgggt ccgtcaggct 120
ccagggaagg ggctcgagtg ggtcacactt attcgaccta ctaatggtaa caaagactat 180
gtagattccg tgaagggccg attcaccatc tccagagacg acgccaagaa tacgttgtat 240
ctgcaaatga acagtctgaa atccgaggac acggccgtgt attactgtgc acctcgggtt 300
cggcttaagg ttcggtttca ggatagggtt atggttacgt actggggcaa agggacccag 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 88
<211> 372
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 88
gaggtgcagc tgctggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcggcag caccagcagc agctacgcca tgagctgggt gcgccaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcgcc atcagcagcg gcggcagccg cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg cttcaccatc agccgcgaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc cgccctggcc 300
agctccggct acagccgcga ctacggcgcc tacgactact ggggccaggg caccctggtg 360
accgtgagca gc 372
<210> 89
<211> 360
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 89
gaggtgcagc tgctggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcggcag caccttcagc agcaacgcca tgagctgggt gcgccaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcgcc atcaactggg gcagcagcag caccaactac 180
gccgacagcg tgaagggccg cttcaccatc agccgcgaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc cgcctacctg 300
agcagcagcc gctccggcga ctactactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360
<210> 90
<211> 360
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 90
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc ttggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcttgtgccg ccagcggata caccaacagt cgctactaca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtt cgtagcagcg atttctgcta ttggtcgcac atactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac ggtgtatctt 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtttatt actgtgcagc ctctgaccgt 300
ctgtctggtc tgcgttctta cggttactgg ggtcagggta ctcaggtcac cgtctcctca 360
<210> 91
<211> 360
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 91
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc ttggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcttgtgccg ccagcggata caccaacagt cgctactaca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtt cgtagcagcg atttctgcta ttggtcgcac atactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac ggtgtatctt 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtttatt actgtgcagc ctctgaccgt 300
ctgtctggtc tgcgttctta cggttactgg ggtcagggta ctcaggtcac cgtctcctca 360
<210> 92
<211> 360
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 92
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc ttggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcttgtgccg ccagcggata caccaacagt cgctactaca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtt cgtagcagcg atttctgcta ttggtcgcac atactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac ggtgtatctt 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtttatt actgtgcagc ctctgaccgt 300
ctgtctggtc tgcgttctta cggttactgg ggtcagggta ctcaggtcac cgtctcctca 360
<210> 93
<211> 378
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 93
catgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctgggggttc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt caccttcaat agctatgact tcacgtgggt ccgtcaggct 120
ccagggaagg ggctcgagtg ggtctcagcg atcactgcaa atggtggtag cacattctat 180
gcaggctccg tgaaggggcg attcaccgtc tccagagaca acgccaagaa tgtcgtgtca 240
ctgcaaatga gcagcctgac actcgaagac acggccgtgt attactgtgc acgtacgtct 300
gaggctcggt ataggggtta ccctcggttt cgggttatgt tttactgggg caaagggacc 360
caggtcaccg tctcctca 378
<210> 94
<211> 372
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 94
catgtgcagc tgcaggagtc aggcccaggc ctggtgaagt cctcgcagac agtctccctc 60
acctgcagtg actctggtgg ctccatcaca acaactcatt actactggag ctggatccgc 120
cagcccccag ggaagggact ggagtggatt ggatacatag cttatattgg tgacactttc 180
tacaattcat ccctcaagag ccgcaccgcc atctcctggg acacgtccaa gaaccagttc 240
accctgcacc tgaattctgt gacccctgaa gacacagccg tgtattactg tgcagatagg 300
aatcgggtta ggggttacga tccgtgtctg catgggtact ggggcaaagg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 95
<211> 372
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 95
catgtgcagc tgctggagtc gggcccaggc ctggtgaaac cctcgcagac actctccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcaca acggacgttg cctactggag ctggctccgc 120
cagcccccag ggaagggact ggagtggatg ggagccatag cttccagcgg cagcacttac 180
aacagcccat tcttcgggag ccgcaccttc atctccagag acacatccaa gtctcagttc 240
accctgcagc tgagctctgt gactcctgaa gacacagccg tgtattactg tgcagcgatt 300
gcggttcggg atccgcatta cgttggggtt gggggttact ggggcaaagg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 96
<211> 232
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 96
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 97
<211> 696
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 97
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420
gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 600
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660
tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggtaaa 696
<210> 98
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 98
gatgtgcagc tgcaggcgtc tggrggagg 29
<210> 99
<211> 21
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 99
cgccatcaag gtaccagttg a 21
<210> 100
<211> 37
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 100
gactcgcggc ccagccggcc atggcggakg tscagct 37
<210> 101
<211> 32
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 101
actagtgcgg ccgctgagga gacggtgacc tg 32
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 102
cggcccagcc ggccatggcc 20
<210> 103
<211> 34
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 103
ggactagtgc ggccgctgag gagacggtga cctg 34

Claims (10)

1.一种抗SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体能识别SARS-COV-2病毒S蛋白的RBD结构域，包括如下的纳米抗体1-纳米抗体19中的一种或多种：
纳米抗体1：具有如SEQ ID NO：20-SEQ ID NO：22所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体2：具有如SEQ ID NO：23-SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体3：具有如SEQ ID NO：26-SEQ ID NO：28所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体4：具有如SEQ ID NO：29-SEQ ID NO：31所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体5：具有如SEQ ID NO：32-SEQ ID NO：34所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体6：具有如SEQ ID NO：35-SEQ ID NO：37所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体7：具有如SEQ ID NO：38-SEQ ID NO：40所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体8：具有如SEQ ID NO：41-SEQ ID NO：43所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体9：具有如SEQ ID NO：44-SEQ ID NO：46所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体10：具有如SEQ ID NO：47-SEQ ID NO：49所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体11：具有如SEQ ID NO：50-SEQ ID NO：52所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体12：具有如SEQ ID NO：53-SEQ ID NO：55所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体13：具有如SEQ ID NO：56-SEQ ID NO：58所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体14：具有如SEQ ID NO：59-SEQ ID NO：61所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体15：具有如SEQ ID NO：62-SEQ ID NO：64所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体16：具有如SEQ ID NO：65-SEQ ID NO：67所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体17：具有如SEQ ID NO：68-SEQ ID NO：70所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体18：具有如SEQ ID NO：71-SEQ ID NO：73所示氨基酸序列的三个互补决定区；
纳米抗体19：具有如SEQ ID NO：74-SEQ ID NO：76所示氨基酸序列的三个互补决定区。
2.根据权利要求1所述的一种抗SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括如下的一种或多种纳米抗体：
B4纳米抗体：具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；
B6纳米抗体：具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；
B9纳米抗体：具有如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列；
E3纳米抗体：具有如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列；
E6纳米抗体：具有如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列；
E7纳米抗体：具有如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列；
F4纳米抗体：具有如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列；
F5纳米抗体：具有如SEQ ID NO：8所示氨基酸序列；
F8纳米抗体：具有如SEQ ID NO：9所示氨基酸序列；
G2纳米抗体：具有如SEQ ID NO：10所示氨基酸序列；
G5纳米抗体：具有如SEQ ID NO：11所示氨基酸序列；
A1纳米抗体：具有如SEQ ID NO：12所示氨基酸序列；
F1纳米抗体：具有如SEQ ID NO：13所示氨基酸序列；
G3纳米抗体：具有如SEQ ID NO：14所示氨基酸序列；
C7纳米抗体：具有如SEQ ID NO：15所示氨基酸序列；
D4纳米抗体：具有如SEQ ID NO：16所示氨基酸序列；
H3纳米抗体：具有如SEQ ID NO：17所示氨基酸序列；
H4纳米抗体：具有如SEQ ID NO：18所示氨基酸序列；
H6纳米抗体：具有如SEQ ID NO：19所示氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的一种抗SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体，其特征在于，所述抗SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体还包括：所述B4、B6、B9、E3、E6、E7、F4、F5、F8、G2、G5、A1、F1、G3、C7、D4、H3、H4、H6纳米抗体的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的抗体。
4.根据权利要求2或3所述的一种抗SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体，其特征在于，所述抗SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体还包括：在所述B4、B6、B9、E3、E6、E7、F4、F5、F8、G2、G5、A1、F1、G3、C7、D4、H3、H4、H6纳米抗体的N端和/或C端连接标签得到的抗体。
5.一种编码权利要求1-4任一所述纳米抗体的核酸分子。
6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括核酸分子1-核酸分子19中的一种或多种：
核酸分子1：编码所述B4纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：77所示；
核酸分子2：编码所述B6纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：78所示；
核酸分子3：编码所述B9纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：79所示；
核酸分子4：编码所述E3纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：80所示；
核酸分子5：编码所述E6纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：81所示；
核酸分子6：编码所述E7纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：82所示；
核酸分子7：编码所述F4纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：83所示；
核酸分子8：编码所述F5纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：84所示；
核酸分子9：编码所述F8纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：85所示；
核酸分子10：编码所述G2纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：86所示；
核酸分子11：编码所述G5纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：87所示；
核酸分子12：编码所述A1纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：88所示；
核酸分子13：编码所述F1纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：89所示；
核酸分子14：编码所述G3纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：90所示；
核酸分子15：编码所述C7纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：91所示；
核酸分子16：编码所述D4纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：92所示；
核酸分子17：编码所述H3纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：93所示；
核酸分子18：编码所述H4纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：94所示；
核酸分子19：编码所述H6纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：95所示。
7.一种含有权利要求5-6任一所述核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括重组DNA、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
8.一种重组抗体，其特征在于，所述重组抗体由权利要求1-4任一所述的抗SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体和人源fc片段组成，所述人源fc片段的氨基酸序列如SEQID NO：96所示。
9.权利要求1-4任一所述的SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体以及权利要求8所述的重组抗体在制备抑制SARS-COV-2病毒感染的药物、制备SARS-COV-2病毒检测试试剂或试剂盒中的用途。
10.一种SARS-COV-2病毒检测试剂或试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一所述的SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体或者权利要求8所述的重组抗体。
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