CN112626030A - 外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体用于中和新冠病毒的生产方法 - Google Patents

外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体用于中和新冠病毒的生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112626030A
CN112626030A CN202011616251.4A CN202011616251A CN112626030A CN 112626030 A CN112626030 A CN 112626030A CN 202011616251 A CN202011616251 A CN 202011616251A CN 112626030 A CN112626030 A CN 112626030A
Authority
CN
China
Prior art keywords
spike
exosome
supernatant
nanobody
displaying
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011616251.4A
Other languages
English (en)
Inventor
段莉
梁宇杰
徐晓
徐丽梅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Second Peoples Hospital
Original Assignee
Shenzhen Second Peoples Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Second Peoples Hospital filed Critical Shenzhen Second Peoples Hospital
Priority to CN202011616251.4A priority Critical patent/CN112626030A/zh
Publication of CN112626030A publication Critical patent/CN112626030A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体用于中和新冠病毒的生产方法，该外泌体的表面展示有Spike纳米抗体，本发明还公开了表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体的外泌体的制备方法，包括以下制作步骤：步骤一：Expi293FTM细胞利用SMM 293TII培养基培养至4×106活细胞/mL；步骤二：准备1000ml细胞量，需要准备pdisplay‑spike‑nanobody 500μg质粒，用10mL Opti‑MEM培养基稀释质粒，混匀后静置5分钟；与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明技术方案通过外泌体的结构形式实现药用，相比单克隆抗体具有价格低廉，制作容易并且具有很好的组织渗透性，利于市场推广。

Description

外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体用于中和新冠病 毒的生产方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体为外泌体表面展示棘突蛋白 Spike的纳米抗体用于中和新冠病毒的生产方法。
背景技术
已知SARS-CoV-2病毒的感染过程是通过其突刺蛋白(Spike)与宿主细胞受体ACE2之间的相互作用而进入宿主细胞。因此阻Spike 与ACE2的结合可以抑制病毒的感染。本专利方法开发出一种外泌体可破坏突刺蛋白与血管紧张素转化酶2(ACE2)之间相互作用的外泌体纳米抗体。我们的研究结果证明外泌体上展示Spike纳米抗体与突刺蛋白紧密结合，从而阻断新冠病毒与ACE2之间的结合，最终能抑制其感染靶细胞。
发明内容
本发明的目的在于提供外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体用于中和新冠病毒的生产方法，以解决背景技术中提到的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：表面展示棘突蛋白 Spike的纳米抗体的外泌体，该外泌体的表面展示有Spike纳米抗体。
优选的，Spike纳米抗体通过喷雾方式直接通过气溶胶介导递送至气道上皮。
优选的，Spike纳米抗体在雾化、冻干和常温条件下仍保持活性。
优选的，Spike纳米抗体与新冠病毒上突刺蛋白紧密结合。
表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体的外泌体的制备方法，包括以下制作步骤：
步骤一：Expi293FTM细胞利用SMM 293TII培养基培养至4×106 活细胞/mL；
步骤二：准备1000ml细胞量，需要准备pdisplay-spike-nanobody 500μg质粒，用10mL Opti-MEM培养基稀释质粒，混匀后静置5分钟；
步骤三：准备1000μL PEI试剂，用10mL Opti-MEM培养基稀释，混匀后静置5分钟；
步骤四：将步骤二、步骤三中稀释后的质粒及转染试剂混匀静置 30分钟；
步骤五：将试剂加入细胞中，混匀，放置于培养箱内进行培养；
步骤六：转染8小时后，离心(800rpm,10min),去掉上清，细胞沉淀转移到新的摇瓶中，重新加入1000ml SMM 293TII培养基；
步骤七：培养72h后，离心(800rpm,10min)，收集第一次的上清；
步骤八：离心后的细胞沉淀继续加培养基1000ml,再培养72h后，离心(800rpm,10min)，收集第二次的上清；
步骤九：二次上清合并一起进行差速离心富集法，具体为：
1)、离心去细胞及碎片：将上清至离心管中，于4℃以3000g离心10min，去除细胞碎片；离心后上清液转移到新的离心管中；
2)、离心去杂质：转移后的上清液于4℃以10000g离心30min，去除样品中杂质，将离心后的上清液转移至新的离心管中；
3)、离心收集外泌体：转移后的上清液于4℃以200000g离心60 min，将离心后的沉淀用PBS溶解制作出外泌体纳米抗体。
优选的，步骤一中的培养条件是用培养悬浮细胞的一次性无菌通气摇瓶。轨道摇床置于≥80％相对湿度和8％CO2的37℃培养箱。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明技术方案通过外泌体的结构形式实现药用，相比单克隆抗体具有价格低廉，制作容易并且具有很好的组织渗透性，利于市场推广；
2、外泌体展示的中和纳米抗体的发现其能破坏Spike的功能，抗Spike纳米抗体的结合的稳定性，效力和多种表位结合提供了独特的潜在预防和治疗策略，将在限制病毒大流行的持续增长中起着很好的作用，具有广泛的市场应用前景。
附图说明
图1为本发明的外泌体结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体用于中和新冠病毒的生产方法，该外泌体的表面展示有Spike纳米抗体。
Spike纳米抗体通过喷雾方式直接通过气溶胶介导递送至气道上皮。
Spike纳米抗体在雾化、冻干和常温条件下仍保持活性。
Spike纳米抗体与新冠病毒上突刺蛋白紧密结合。
表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体的外泌体的制备方法，包括以下制作步骤：
步骤一：Expi293FTM细胞利用SMM 293TII培养基培养至4×106 活细胞/mL；
步骤二：准备1000ml细胞量，需要准备pdisplay-spike-nanobody 500μg质粒，用10mL Opti-MEM培养基稀释质粒，混匀后静置5分钟；
步骤三：准备1000μL PEI试剂，用10mL Opti-MEM培养基稀释，混匀后静置5分钟；
步骤四：将步骤二、步骤三中稀释后的质粒及转染试剂混匀静置 30分钟；
步骤五：将试剂加入细胞中，混匀，放置于培养箱内进行培养；
步骤六：转染8小时后，离心(800rpm,10min),去掉上清，细胞沉淀转移到新的摇瓶中，重新加入1000ml SMM 293TII培养基；
步骤七：培养72h后，离心(800rpm,10min)，收集第一次的上清；
步骤八：离心后的细胞沉淀继续加培养基1000ml,再培养72h后，离心(800rpm,10min)，收集第二次的上清；
步骤九：二次上清合并一起进行差速离心富集法，具体为：
1)、离心去细胞及碎片：将上清至离心管中，于4℃以3000g离心10min，去除细胞碎片；离心后上清液转移到新的离心管中；
2)、离心去杂质：转移后的上清液于4℃以10000g离心30min，去除样品中杂质，将离心后的上清液转移至新的离心管中；
3)、离心收集外泌体：转移后的上清液于4℃以200000g离心60 min，将离心后的沉淀用PBS溶解制作出外泌体纳米抗体。
步骤一中的培养条件是用培养悬浮细胞的一次性无菌通气摇瓶。轨道摇床置于≥80％相对湿度和8％CO2的37℃培养箱。
Spike nanobody蛋白质序列如下：
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKERELVAGITRRG SITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQ VTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH；
Spike nanobody编码碱基序列如下：
CAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGGCCGGCGGCAGCCTGC GCCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTACATCTTCGGCCGCAACGCCATGGGCTGGTACCGC CAGGCCCCCGGCAAGGAGCGCGAGCTGGTGGCCGGCATCACCCGCCGCGGCAGCATCAC CTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAACGCCAAGAACA CCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCGCCGACCCCGCCAGCCCCGCCTACGGCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACCGT GAGCAGCGCCGCCGCCTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGGCAGCCACCACCACCACC ACCAC；
本发明所设计的外泌体的纳米抗体能在雾化、冻干和常温条件下后仍能保持一定的功能，而且可以通过喷雾方式直接通过气溶胶介导递送至气道上皮。
本发明开发出一种外泌体可破坏突刺蛋白与血管紧张素转化酶2 (ACE2)之间相互作用的外泌体纳米抗体。外泌体上展示Spike纳米抗体与突刺蛋白紧密结合，从而阻断新冠病毒与ACE2之间的结合，最终能抑制其感染靶细胞。
阻止SARS-CoV-2进入宿主细胞的策略主要是干扰ACE2-RBD相互作用。现有技术下尽管高亲和力单克隆抗体正在作为潜在的治疗方法，但是通过哺乳动物细胞表达生产它们的价格昂贵，并且需要由医疗专业人员进行静脉内给药。而预防性使用需要大剂量，因为只有一小部分抗体会经全身给药后穿过气道上皮细胞层。相反，外泌体可以在细胞培养的上清中大量的廉价地生产。外泌体上展示的纳米抗体具有很好的组织渗透性，生物相容性使其能够直接通过雾化方式输送至鼻和肺上皮。
本发明所设计的外泌体展示的中和纳米抗体的发现其能破坏 Spike功能，抗Spike纳米抗体的结合的稳定性，效力和多种表位结合提供了独特的潜在预防和治疗策略，将在限制病毒大流行的持续增长中起着很好的作用。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体，其特征在于：该外泌体的表面展示有Spike纳米抗体。
2.根据权利要求1所述的外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体，其特征在于：Spike纳米抗体通过喷雾方式直接通过气溶胶介导递送至气道上皮。
3.根据权利要求1所述的外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体，其特征在于：Spike纳米抗体在雾化、冻干和常温条件下仍保持活性。
4.根据权利要求1所述的外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体，其特征在于：Spike纳米抗体与新冠病毒上突刺蛋白紧密结合。
5.如根据权利要求1-4任意一项所述的外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下制作步骤：
步骤一：Expi293FTM细胞利用SMM 293TII培养基培养至4×106活细胞/mL；
步骤二：准备1000ml细胞量，需要准备pdisplay-spike-nanobody 500μg质粒，用10mLOpti-MEM培养基稀释质粒，混匀后静置5分钟；
步骤三：准备1000μL PEI试剂，用10mL Opti-MEM培养基稀释，混匀后静置5分钟；
步骤四：将步骤二、步骤三中稀释后的质粒及转染试剂混匀静置30分钟；
步骤五：将试剂加入细胞中，混匀，放置于培养箱内进行培养；
步骤六：转染8小时后，离心(800rpm,10min),去掉上清，细胞沉淀转移到新的摇瓶中，重新加入1000ml SMM 293TII培养基；
步骤七：培养72h后，离心(800rpm,10min)，收集第一次的上清；
步骤八：离心后的细胞沉淀继续加培养基1000ml,再培养72h后，离心(800rpm,10min)，收集第二次的上清；
步骤九：二次上清合并一起进行差速离心富集法，具体为：
1)、离心去细胞及碎片：将上清至离心管中，于4℃以3000g离心10min，去除细胞碎片；离心后上清液转移到新的离心管中；
2)、离心去杂质：转移后的上清液于4℃以10000g离心30min，去除样品中杂质，将离心后的上清液转移至新的离心管中；
3)、离心收集外泌体：转移后的上清液于4℃以200000g离心60min，将离心后的沉淀用PBS溶解制作出外泌体纳米抗体。
6.根据权利要求5所述的外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体的制备方法，其特征在于：步骤一中的培养条件是用培养悬浮细胞的一次性无菌通气摇瓶，轨道摇床置于≥80％相对湿度和8％CO2的37℃培养箱。
CN202011616251.4A 2020-12-31 2020-12-31 外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体用于中和新冠病毒的生产方法 Pending CN112626030A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011616251.4A CN112626030A (zh) 2020-12-31 2020-12-31 外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体用于中和新冠病毒的生产方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011616251.4A CN112626030A (zh) 2020-12-31 2020-12-31 外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体用于中和新冠病毒的生产方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112626030A true CN112626030A (zh) 2021-04-09

Family

ID=75287121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011616251.4A Pending CN112626030A (zh) 2020-12-31 2020-12-31 外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体用于中和新冠病毒的生产方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112626030A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115894710A (zh) * 2022-09-04 2023-04-04 复旦大学 一种靶向新冠病毒刺突蛋白的高亲和性纳米抗体三聚体
US11732030B2 (en) 2020-04-02 2023-08-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111375055A (zh) * 2020-02-20 2020-07-07 陈宛莎 一种2019-nCoV亚单位疫苗组合物及其免疫方法
CN111647557A (zh) * 2020-05-18 2020-09-11 中国人民解放军第四军医大学 一种表面偶联s蛋白的外泌体及其制备方法和应用
CN111825762A (zh) * 2020-06-17 2020-10-27 武汉华美生物工程有限公司 抗sars-cov-2病毒s蛋白rbd结构域的纳米抗体及其用途
CN112062840A (zh) * 2020-09-22 2020-12-11 石河子大学 一种基于新型冠状病毒s蛋白的纳米抗体及其应用
CN112062839A (zh) * 2020-09-22 2020-12-11 石河子大学 一种基于新型冠状病毒s蛋白s1亚基的纳米抗体及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111375055A (zh) * 2020-02-20 2020-07-07 陈宛莎 一种2019-nCoV亚单位疫苗组合物及其免疫方法
CN111647557A (zh) * 2020-05-18 2020-09-11 中国人民解放军第四军医大学 一种表面偶联s蛋白的外泌体及其制备方法和应用
CN111825762A (zh) * 2020-06-17 2020-10-27 武汉华美生物工程有限公司 抗sars-cov-2病毒s蛋白rbd结构域的纳米抗体及其用途
CN112062840A (zh) * 2020-09-22 2020-12-11 石河子大学 一种基于新型冠状病毒s蛋白的纳米抗体及其应用
CN112062839A (zh) * 2020-09-22 2020-12-11 石河子大学 一种基于新型冠状病毒s蛋白s1亚基的纳米抗体及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SERAPHIN KUATE等: "Exosomal vaccines containing the S protein of the SARS coronavirus induce high levels of neutralizing antibodies", 《VIROLOGY》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11732030B2 (en) 2020-04-02 2023-08-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
CN115894710A (zh) * 2022-09-04 2023-04-04 复旦大学 一种靶向新冠病毒刺突蛋白的高亲和性纳米抗体三聚体
CN115894710B (zh) * 2022-09-04 2023-09-15 复旦大学 一种靶向SARS-CoV-2刺突蛋白的高亲和性纳米抗体三聚体

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Popowski et al. Inhalable dry powder mRNA vaccines based on extracellular vesicles
Zhang et al. Nanobiotechnology: cell membrane-based delivery systems
Zhen et al. Targeted delivery of CRISPR/Cas9 to prostate cancer by modified gRNA using a flexible aptamer-cationic liposome
CN112626030A (zh) 外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体用于中和新冠病毒的生产方法
Cucchiarini Human gene therapy: novel approaches to improve the current gene delivery systems
US20180078508A1 (en) Oncolytic virus formulation and preparation method thereof
JP2023516458A (ja) ヒト細胞由来細胞外小胞を含有する噴霧吸入製剤、その調製方法及び使用
CN110124058B (zh) 一种来源于骨髓间充质干细胞外泌体-阿霉素纳米靶向药物的制备及体外抗骨肉瘤的研究
US20230157966A1 (en) Compositions and methods related to megakaryocyte-derived extracellular vesicles
CN101448939A (zh) 用于导入核酸、寡核酸或其衍生物的冷冻干燥体
Yan et al. The potential role of extracellular vesicles in COVID-19 treatment: opportunity and challenge
WO2022217966A1 (zh) 一种抑制SARS-CoV-2的纳米捕集剂
CN110215522A (zh) 一种CRISPR/Cas9递送系统及其制备方法和应用
CN109528653A (zh) 具有基因编辑功能的膜性囊泡及其制备方法、药物组合物和用途
CN113058042B (zh) 一种可鼻喷的稳定递载rna分子的脂质纳米颗粒制备方法
JP2022512752A (ja) 肺炎症治療用のナノキャリア
JP2021522278A (ja) ライソゾーム病を改善するための、レンチウイルスベクターが形質導入されたｔ−ｒａｐａ細胞の使用
CN108685850A (zh) 模块化组装的组合生物药物联合递送系统及应用
CN114652703A (zh) 雾化吸入功能性细胞外囊泡在改善急性肺损伤中的应用
CN116218787B (zh) 一种永生化人肺泡ⅱ型上皮细胞系及其构建方法和用途
WO2021031409A1 (zh) 铜绿假单胞菌疫苗在呼吸系统疾病中的应用
Zhang et al. A Trojan horse biomimetic delivery system using mesenchymal stem cells for HIF-1α siRNA-loaded nanoparticles on retinal pigment epithelial cells under hypoxia environment
CN110859806B (zh) 用于递送具有特异性剪切hbv基因功能的核酸类药物的系统及其应用
CN113995845B (zh) 一种伊维菌素制剂及其制备方法和应用
Gómez-Vargas et al. Nonviral gene therapy approaches to hemophilia

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210409

RJ01 Rejection of invention patent application after publication