CN115894710B

CN115894710B - 一种靶向SARS-CoV-2刺突蛋白的高亲和性纳米抗体三聚体

Info

Publication number: CN115894710B
Application number: CN202211075360.9A
Authority: CN
Inventors: 黄强; 姜欣怡; 秦琴; 朱海霞; 杜文豪
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2022-09-04
Filing date: 2022-09-04
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2042-09-04
Also published as: CN115894710A

Abstract

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体为一种靶向SARS‑CoV‑2刺突S蛋白的纳米抗体同源三聚体及其获得方法和应用。本发明设计的纳米抗体三聚体是将靶向SARS‑CoV‑2的S蛋白的纳米抗体Nb6用18个氨基酸长的肽段连接在具有自组装能力的15型胶原蛋白三聚化结构域上而得，称之为Tribody。用分子动力学模拟技术评估Tribody，表明其三聚化结构域异常稳定；用生物膜层干涉实验检测Tribody与S蛋白的结合亲和性，结果说明三聚体与S蛋白的结合亲和性很高；采用假病毒中和实验检测三聚体的SARS‑CoV‑2中和能力，结果表明Tribody具有很强的病毒中和能力。故本发明的高亲和性纳米抗体三聚体具有开发成抗SARS‑CoV‑2的中和抗体药物的巨大潜力和应用价值。

Description

一种靶向SARS-CoV-2刺突蛋白的高亲和性纳米抗体三聚体

技术领域

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种靶向SARS-CoV-2刺突蛋白的纳米抗体三聚体及其获得方法和应用。

背景技术

冠状病毒是一种由囊膜包被的单链正链RNA病毒，可在人类和其它脊椎动物中广泛传播，并引发呼吸道感染等疾病。迄今为止，已经出现了三种高致病性人类冠状病毒，分别是严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和新型冠状病毒(SARS-CoV-2)^[1]。其中SARS-CoV-2因其高致病性和传染性对全球公共卫生安全造成严重威胁^[2]。SARS-CoV-2表面的 (spike, S)刺突蛋白是介导病毒入侵人体的关键，也是病毒突变的高发区^[3]。S蛋白是一个同源三聚的跨膜糖蛋白，包含S1和S2两个亚基。S1亚基暴露在病毒表面，由N端结构域 (N-terminal domain, NTD) 和受体结合域 (Receptorbingding domain, RBD) 构成^[4]。RBD可以在向下或向上状态之间灵活转换，当处于向上状态时它能够特异性地结合人细胞上的受体蛋白—血管紧张素转化酶2 (Angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)^{[5, 6]}。随着病毒成功识别ACE2，被宿主蛋白酶水解的S2亚基发生构象变化并介导病毒与靶细胞发生膜融合，病毒将其基因组释放入靶细胞^{[7, 8]}。为了阻断SARS-CoV-2进入人体，人们开发出了多种不同类型的候选药物，而抗体因其靶向性强、副作用小和疗效显著等优点成为最热门的研究对象^[9-11]。其中，纳米抗体凭借其高亲和性、强稳定性、高表达等优点迅速成为治疗新冠的热门候选药物^{[12, 13]}。

纳米抗体又称单域抗体 (Single domain antibody, sdAb)，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位^[14]。1993年，比利时科学家首次报道在骆驼中发现了一种特殊的重链抗体。这种抗体只含有两条重链，其重链可变区 (Heavy variable domains, VHH) 负责进行抗原结合^[15]。截取重链可变区重组产生的蛋白被称为纳米抗体。纳米抗体包含三段氨基酸长度及序列高度变异的区域 (Complementarity determining region 1, 2, or 3 ,CDR1, CDR2, CDR3)，该区域表主要负责结合抗原，这三个区域被四个序列相对保守的框架区分隔开 (Framework region, FR1, FR2, FR3, FR4)。因为分子量小、结构简单，纳米抗体容易在大肠杆菌、酵母等微生物中表达，易于进行大规模生产和基因操作^[16-18]。Nb6是一种靶向SARS-CoV-2原始毒株（GenBank: MN908947.3）刺突(Spike, S)蛋白的纳米抗体，它能同时结合两个RBD并将S蛋白锁定在非活性构象状态下，使S蛋白无法与人受体结合，很好地抑制了病毒入侵人细胞^[19]。然而，Nb6与S蛋白的亲和性（K_D=220 nM）偏低，这极大地限制了其后续的应用。

纳米抗体的高亲和性对于后续的治疗应用十分重要，提高纳米抗体的亲和性能减少纳米抗体的给药剂量和提高药物疗效。目前，人们通常采用多价化的策略来提高纳米抗体的亲和性。常见的多价化策略有利用肽段接头进行简单的串联^[20]或利用其它蛋白驱动聚集，比如Foldon蛋白^[21]，IgG Fc构域^[22]，胶原蛋白三聚化结构域^[23]等。此外有研究表明多价化能抑制病毒的突变逃逸，还能延长纳米抗体在人体内的半衰期，使多价抗体有更多的时间到靶位点发挥作用^[24]。

然而，多价化并不是一个简单的问题，需要选择合适的连接肽和多价化结构域。因为S蛋白是一个同源三聚体蛋白，所以三聚化能让纳米抗体最大限度地占据S蛋白上的结合位点。基于此，兼顾免疫原性和三聚化效率，本发明选择15型胶原蛋白的三聚化结构域作为多价化的驱动模块^{[25, 26]}。之后根据Nb6与S蛋白的结合模式，计算了Nb6到支架的连接氨基酸的最短距离，选择了长度合适的连接肽段。选择完毕后，对三聚体结构进行了建模，并用分子动力学模拟的方法对其进行了评估。评估较好的三聚体进入后续的实验验证环节。生物膜层干涉实验显示Tribody与S蛋白的解离平衡常数K_D值小于1 pM，远低于Nb6单体的220nM。假病毒结果显示，Tribody中和SARS-CoV-2的IC50值为141.6 ng/mL（2.1 nM），远低于单体的18235 ng/mL（1.4 μM）。因此该高亲和性三聚体在SARS-CoV-2治疗方面具有潜在的应用价值。本发明所采用的基于结构的三聚体计算设计方法也可为纳米抗体的多价化设计提供新思路。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向SARS-CoV-2蛋白的高亲和性纳米抗体三聚体及其获得方法和应用。

本发明提供的靶向SARS-CoV-2的S蛋白的纳米抗体三聚体，是将靶向SARS-CoV-2的S蛋白的纳米抗体Nb6用一段18个氨基酸的柔性linker连接在15型胶原蛋白的三聚化结构域所得，记为Tribody；其氨基酸序列为SEQ ID NO.1，核苷酸序列为SEQ ID NO.2，柔性linker序列为SEQ ID NO.5。

其中，所述Nb6单体的氨基酸序列和核苷酸序列分别为SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示。

实验表明，Tribody与S蛋白的亲和性、中和SARS-CoV-2的能力都远高于Nb6单体。

本发明还提供一种表达载体，其含有上述多核苷酸序列SEQ ID NO.2。

本发明还提供一种宿主细胞，可以用于转化上述表达载体。

本发明提供的能够靶向SARS-CoV-2的S蛋白的高亲和性纳米抗体三聚体的获得方法，基本步骤为：首先查阅文献选择合适的三聚体支架；其次根据支架和纳米抗体连接处的最短距离，选择合适的连接肽段；选择完毕后，利用同源建模的方法构建三聚体的结构模型；模型构建完毕后利用分子动力学模拟的方法对所构建的三聚体进行评估；评估结果较好的三聚体可以进行后续的实验验证。

本发明提供的能够靶向SARS-CoV-2的S蛋白的高亲和性纳米抗体三聚体的获得方法，具体步骤如下。

第一步：选择合适的三聚化结构域

选择三聚化结构域，又称支架，要考虑以下几个条件：一是免疫原性低；二是相对分子质量尽量小，但是同时要使三聚体的整体相对分子质量大于第一次肾清除的阈值，从而延长三聚体在体内的半衰期；第三，没有糖基化修饰，易于在大肠杆菌或酵母中大量表达；第四，拥有较高的三聚化效率且比较稳定^[23]；综合上述条件本发明选择了15型胶原蛋白的三聚化结构域；它具有免疫原性低，生产便利等优点；且该支架与纳米抗体融合后形成的同源三聚体的分子量大于第一次肾清除的阈值。

第二步：选择合适的肽段接头 (linker)

为了选择到长度合适的linker，首先，计算纳米抗体与支架之间连接氨基酸的最短距离，具体地，分别计算出纳米抗体与支架的质心位置，并将支架的质心移动到原点，随后不断改变纳米抗体的质心位置，同时求取纳米抗体与支架之间连接氨基酸的距离平均值；当该值最小值时，纳米抗体与支架之间连接氨基酸的距离即为最短距离；该计算可通过编写一小程序实现；

然后，根据单个残基的平均骨架长度，计算最短距离下至少需要的氨基酸数量；具体地，Nb6与支架在最短距离下至少需要10个全反式氨基酸或13个全顺式氨基酸；

最后，根据查阅文献，选择一条18个氨基酸长度的柔性linker，为Nb6灵活运动结合S蛋白提供了更大的空间^[25]；柔性linker 序列为SEQ ID NO.5。

第三步：构建三聚体结构模型并评估

已知纳米抗体和支架的结构，本发明采用Swiss-Model对linker部分进行建模；得到三聚体的其中一条链的结构后，其余两条链的结构由重复上述结构所得；结构建模完成后，通过软件GROMACS对该三聚体蛋白进行分子动力学模拟；溶剂可及表面积 (SASA，Solvent-accessible surface area) 可用来衡量生物分子暴露在溶剂中的面积大小；初始结构中，纳米抗体的CDR暴露在溶剂里，因此可以通过计算模拟过程中纳米抗体CDR的SASA变化来判断其CDR是否始终暴露在溶剂里；均方根偏差 (RMSD, Root mean squaredeviation) 用于描述某个时刻相对于参考构象的结构偏差，RMSD值波动越小，说明结构变化越小；因此，我们通过计算三聚体和支架的骨架均方根偏差来判断模拟过程中三聚体和支架的结构是否稳定。

第四步：实验验证

首先，在大肠杆菌中表达该三聚体蛋白，并用镍亲和柱层析对其进行纯化；通过变性凝胶电泳，判断上清中三聚体蛋白的表达情况；

接着，将镍亲和层析纯化后的蛋白进行凝胶过滤柱层析，以此判断纯化所得蛋白的聚集情况；

最后，收集凝胶过滤柱层析纯化分离所得的三聚体蛋白进行进一步检测：用生物膜层干涉技术对三聚体进行体外亲和力检测；具体地，将带6个组氨酸标签的S蛋白固定在HIS2传感器上，以三聚体为流动相，利用Octet RED 96e仪器检测三聚体结合前后干涉光信号变化，从而计算拟合得到三聚体与S蛋白的K_D值；并采用假病毒中和检测实验对三聚体中和原始株SARS-CoV-2的能力进行了检测。

本发明提供的能够靶向SARS-CoV-2的S蛋白的高亲和性纳米抗体三聚体Tribody，能在大肠杆菌中可溶表达，且表达量较高。凝胶过滤柱层析结果显示，Tribody确实自组装成了三聚体的形式。

本发明用分子动力学模拟技术评估Tribody，表明其三聚化结构域异常稳定，且Nb6上的S蛋白结合位点完全暴露在蛋白质复合物表面，没有被三聚体其它部位遮蔽。用生物膜层干涉（Biolayer interferometry, BLI）实验检测了Tribody与S蛋白的结合亲和性，结果显示解离平衡常数K_D值小于1 pM，远低于Nb6单体的220 nM，说明三聚体与S蛋白的结合亲和性很高。采用假病毒中和实验检测了三聚体的SARS-CoV-2中和能力，结果显示Tribody中和SARS-CoV-2的IC₅₀值为141.6 ng/mL（2.1 nM），远低于Nb6单体的值18235 ng/mL（1.4 μM），表明Tribody具有很强的病毒中和能力。

因此，本发明提供的高亲和性三聚体在抗体药物领域具有潜在的应用价值。包括将所述的靶向SARS-CoV-2的S蛋白的纳米抗体同源三聚体，或者所述的表达载体，用于制备作为中和抗体的药物。

本发明所采用的基于结构三聚体计算设计方法也可为纳米抗体的多价化设计提供新思路。

附图说明

图1为纳米抗体三聚体设计流程。

图2为 Tribody 结构示意图。

图3为纳米抗体抗原结合区的溶剂可及表面积变化图。

图4为三聚体和支架的均方根偏差图。

图5为镍亲和柱层析收集蛋白的SDS-PAGE电泳结果图。

图6为凝胶过滤柱层析紫外吸收峰图。

图7为 BLI结合曲线图。

图8为假病毒中和实验结果图。

实施方式

下面通过具体实施例进一步描述本发明。

下述实施例中所用的实验方法，如无特定说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特定说明，均为从商业途径获得。

一、确定纳米抗体三聚体的三个组成部分

确定要进行三聚化的纳米抗体后，首先要选择合适的三聚化结构域，又称支架。支架的选择主要考虑以下几点：一是免疫原性低；二是相对分子质量尽量小，但是同时要使三聚体的整体相对分子质量大于第一次肾清除的阈值，从而延长三聚体在体内的半衰期；第三，没有糖基化修饰，易于在大肠杆菌或酵母中大量表达；第四，拥有较高的三聚化效率且比较稳定。综合上述条件本发明选择了15型胶原蛋白的三聚化结构域。它具有免疫原性低，生产便利等优点。且该支架与纳米抗体融合后形成的同源三聚体的分子量大于第一次肾清除的阈值。

之后为了选择到长度合适的linker，编写了一个Python程序。该程序能分别计算出纳米抗体与支架的质心位置，并将支架的质心移动到原点，随后不断改变纳米抗体的质心位置，同时求取纳米抗体与支架连接氨基酸C_α之间的距离均值。当该值最小值时，纳米抗体与支架之间连接氨基酸的距离即为最短距离。根据单个残基的平均骨架长度，本发明计算了最短距离下至少需要的氨基酸数量。Nb6与支架在最短距离下至少需要10（全反式氨基酸）-13（全顺式氨基酸）个氨基酸。因此，本发明查阅文献最终选择了一条18个氨基酸长度的柔性linker，为Nb6灵活运动结合S蛋白提供了更大的空间。

二、对三聚体进行结构建模与计算评估

已知纳米抗体和支架的结构，采用SWISS-MODEL对linker部分进行建模。得到三聚体的其中一条链的结构后，其余两条链的结构由重复上述结构所得。结构建模完成后，本发明通过软件GROMACS-5.1.4对该三聚体蛋白进行分子动力学模拟。模拟所用力场为AMBER99SB-ILDN protein, nucleic AMBER94，所用水模型为TIP3P。模拟的盒子为立方体，三聚体位于盒子的中心位置，且到盒子边缘的距离至少为15 Å。为了与溶液环境保持一致，插入钠离子和氯离子使溶液环境保持中性，离子浓度为0.15 M。用最速下降法对模拟体系进行能量最小化后，为了使体系温度稳定在300 K、压力稳定在1 bar，本发明进行了100 ps的NVT平衡，随后又进行了500 ps的NPT平衡。待温度和压力都稳定后，进行100 ns的成品模拟。模拟时采用周期性边界条件，静电和范德华相互作用分别采用PME和Cut-off方法计算，截断距离均为14 Å。模拟步长为2 fs并配合LINCS算法约束氢键。体系的温度和压强通过V-rescale和Parrinello-Rahman耦合维持。获得模拟轨迹后，通过观察三聚体的运动轨迹来判断纳米抗体的抗原结合区是否始终暴露在溶剂中。此外，通过计算三聚体和支架的骨架均方根偏差来判断模拟过程中三聚体和支架的结构是否稳定。

实验验证

1. 质粒构建与转化

本发明所用质粒均由苏州金唯智生物科技有限公司提供。将质粒转化至Rosetta(DE3)细胞，挑取单克隆送至上海杰李生物技术有限公司进行测序。测序成功后将菌种保存到-80℃的冰箱。

2. 蛋白表达与纯化

2.1蛋白表达

（1）摇菌：于-80℃冰箱取10 μL保存的菌种，加到10 mL含卡那霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37℃、200 r/min培养约20-24 h；

（2）扩大培养：取4 mL菌液转入400 mL培养液中，分别加入400 μL（1:1000）的氯霉素和卡那霉素，继续以37℃、200 r/min培养至OD值为0.6-0.8时即可；

（3）诱导表达：将摇床预先降温到20℃，加入200μL（1:2000） IPTG（1 M）使其终浓度为0.5 mM，继续低温培养12 h；

（4）收集菌液，5000 r/min离心5min使菌体沉淀，弃上清将菌体保存到-80℃的冰箱。

2.2破菌、获得蛋白上清液

（1）预冷离心机

（2）取出保存的菌（每管对应400 mL菌量），加入15 mL的Buffer A，涡旋吹吸，然后加入150μL PMSF，用超声破碎仪破碎3次，每次2 min，停歇冰浴2 min（超声3s，停顿5s，功率20%）

（3）将破碎后的菌液放在预冷到4℃的离心机中，11000 rpm离心30 min收集上清，上清过0.45 μm滤膜。

2.3镍亲和柱层析

（1）填料预处理：3g菌准备1 mL左右的镍柱填料；

（2）装柱&平衡：向重力柱中加入无菌水冲洗，排除滤网上的气泡（不能让水流干）；气泡排除完毕后，关闭出水阀，继续补充无菌水至超过柱床；加入处理后的填料悬液（沿着管壁加入避免产生气泡），填料自然沉降到底部后，打开出水阀，使液体自然流出（当液体低于库容时，及时补满无菌水）直至柱床稳定；柱床稳定后加入10 mL Buffer A，待到液面接近柱床前关闭出水阀，平衡结束；

（3）上样：加入破菌上清液（沿管壁加入，不扰动柱床），打开出水阀，开始收集流出液；

（4）洗涤未结合杂质：待到样品快要加载完毕后加入10 ml Buffer A，继续收集流出液；取20μL流出液留作后面的SDS-PAGE检测；

（5）洗脱：待到液面接近柱床前，加入5 mL的Buffer B，收集洗脱液；取20μL洗脱液留作后面的SDS-PAGE检测；

（6）柱重生：待到液面接近柱床前，停止收集洗脱液并关闭出水阀；加入10 mLBuffer B，打开出水阀，待到液面接近柱床前，加入20 mL抽滤水，最后用适量抽滤水重悬填料并合并到离心管中；

镍亲和柱层析结果如图5所示，三聚体在大肠杆菌中可溶表达并具有较高的表达量。

2.4分子筛

凝胶柱：Superdex 200 Increase 10/300 GL;

柱体积：24 mL;

样品准备：将过完镍柱的样品浓缩至500μL，随后12000 rpm离心5min吸取上清（或者过0.22 μm滤膜）。

（1）仪器准备：

拉开收集器抽屉，将96深孔板放入，注意收集器的齿轮边必须朝外。将溶液入口阀A所连接的A1线路的铁块放入分子筛缓冲液，B1放在水中。将500μL上样环连接到LoopE和LoopF两端。将上样环调到inject模式，将systemflow流速设置为10 mL/min，冲洗一段时间直到所有参数走为直线。将systemflow流速调回 0.5 mL/min（流速最好不超过0.75 mL/min），把柱位调到position 3。将柱子接到柱位阀3A和3B之间。

（3）设置程序：打开设置好的程序并点击运行。

（4）上样：将500 μL样品倒入1mL注射器，排出注射器的气泡，然后通过鲁尔接口接上注射器，将样品推入，直到实验结束前都不可拔出注射器。

（5）收尾工作：将缓冲液中的A1铁块冲洗并放回水中，取下注射器，拆下柱子并将线上的两个连接口对接好，拿出96深孔板，退出个人账号;

（6）数据处理：用软件上的Evaluation模块分析数据。

凝胶过滤柱层析的结果如图6所示，以官方所给的标准蛋白出峰位置为参考，目的蛋白最高紫外吸收峰的出峰位置分子量大约为60 kDa，而三聚体的分子量为66 kDa，这说明本发明所设计的蛋白大部分都自组装成了三聚体。

2.5 酶切

（1）酶切

以TEV酶：目的蛋白=1:2的比例进行混合，4℃酶切16 h-20 h；

（2）反挂柱

装柱&平衡：向重力柱中加入5 mL无菌抽滤水冲洗，排除滤网上的气泡；气泡排出后，继续加水超过柱床并关闭出水阀；加入处理后的填料悬液（沿着管壁加入避免产生气泡），待到填料自然沉降到底部后打开出水阀，使液体自然流出，直至柱床稳定；柱床稳定后加入10 mLPBS溶液，待到液面接近柱床前关闭出水阀，平衡结束；

上样：加入酶切溶液（沿管壁加入，不扰动柱床），打开出水阀，开始收集流出液；

收集流出液：待到样品快要加载完毕后加入10 mL PBS缓冲液，继续收集流出液；取20μL流出液留作后面的SDS-PAGE检测；剩下的流出液用超滤管进行浓缩，浓缩到200 μL左右即可；

洗脱：待到液面接近柱床前，加入10 mL的Buffer B，收集洗脱液；取20μL洗脱液留作后面的SDS-PAGE检测；

柱重生：待到液面接近柱床前，停止收集洗脱液并关闭出水阀；加入10 mL BufferB，打开出水阀，待到液面接近柱床前，加入20 mL抽滤水，最后用适量抽滤水重悬填料并合并到离心管中，去除上清并将其保存在20%的乙醇溶液中。

3. BLI检测

Tribody和Nb6与S蛋白的亲和性检测采用生物膜层干涉技术 (BiolayerInterferometry, BLI)，实验委托上海近岸科技有限公司完成。检测所用仪器为Octet RED96e，所用传感器为HIS2传感器，所用S蛋白在上海近岸科技有限公司购买，货号为DRA49。

Nb6和Tribody作为流动相，Nb6浓度3uM减半稀释6个梯度，Tribody浓度100nM减半稀释5个梯度。用固化了DRA49的HIS2传感器分别捕获Nb6和Tribody，根据干涉光的信号变化，拟合得出亲和性数据。

BLI结果如图7所示，Nb6的结合方式属于快结合快解离，采用了稳态分析的拟合方式，最终得到的K_D值为220 nM。Tribody的结合方式属于慢结合慢解离，采用了1:1结合的拟合方式，最终得到的K_D值小于1 pM，超出了仪器的检测下限。

4. 假病毒中和实验

SARS-CoV-2的假病毒中和实验委托北京百普赛斯生物科技股份有限公司完成。所用假病毒毒株为SARS-CoV-2 Spike (WT) Fluc-GFP Pseudovirus ，货号CMO-PAN001-C01；

（1）将89% DMEM培养基、10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素混合以制备完整的DMEM培养基；

（2）向培养基中加入HEK293/人ACE2过表达稳定细胞系，并置于CO₂培养箱中（37℃，5% CO₂）培养；

（3）在96孔板上准备一系列的抗体稀释液：Nb6共8个浓度梯度（1500000，1000000，400000 ng/mL 5倍稀释6个梯度），Tribody共8个浓度梯度（10000ng/mL 5倍稀释8个梯度），总体积为300 μL；

（4）将病毒与抗体进行孵育：将样品（每孔80 μL）添加到96孔白色平底板中；在室温下解冻假病毒；用DMEM完全培养基将假病毒稀释100倍后，添加到96孔板中（每孔20 μL）；对于细胞对照组，添加完整的DMEM培养基（每孔20 μL）；轻轻混合均匀后，将96孔板置于CO₂培养箱中（37℃，5% CO₂）孵育1 h；

（5）用DEME完全培养基将HEK293细胞重悬（5×10⁵ cells per mL），并取100 μL细胞悬液加入含病毒抗体混合液的96孔板中；轻轻混合均匀后，将96孔板置于CO₂培养箱中（37℃，5% CO₂）培养48 h；

（6）取出96孔板，每孔弃去100 μL培养基，将板平衡至室温10分钟；加入100 μL检测试剂（britelite plus Reporter Gene Assay System）并用迷你摇床充分混合2分钟；最后用发光计（酶标仪）读取板的发光值；检测时间为0.1 s/孔；

假病毒中和实验结果显示，如图8，Tribody中和SARS-CoV-2的IC50值为141.6 ng/mL（2.1 nM），远低于Nb6单体的18235 ng/mL（1.4 μM）。

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Claims

1. 一种靶向SARS-CoV-2的S蛋白的纳米抗体同源三聚体，其特征在于，所述同源三聚体的单体是将靶向SARS-CoV-2的S蛋白的纳米抗体Nb6用一段18个氨基酸的柔性linker连接在15型胶原蛋白的三聚化结构域所得；所述单体氨基酸序列为SEQ ID NO.1，核苷酸序列为SEQ ID NO.2，柔性linker序列为SEQ ID NO.5。

2.一种表达载体，其含有如权利要求1所述的靶向SARS-CoV-2的S蛋白的纳米抗体同源三聚体的单体的多核苷酸序列。

3.一种宿主细胞，用于转化如权利要求2所述的表达载体。

4.一种如权利要求1所述的靶向SARS-CoV-2的S蛋白的纳米抗体同源三聚体或者如权利要求3所述的表达载体在制备作为SARS-CoV-2中和抗体药物中的应用。