TW202112800A - 抗體純化方法及其組成物 - Google Patents

Abstract

本文描述純化哺乳動物細胞培養物中產生之人類化α4β7抗體，諸如維多珠單抗(vedolizumab)的方法，以及由该等純化方法得到的組成物。

Description

抗體純化方法及其組成物

本發明係關於用於純化抗α4β7抗體或其片段之方法。

大規模經濟地純化蛋白質已成為生物技術行業中越來越重要的問題。一般而言，生物藥物係使用工程改造成大量產生所關注之治療性蛋白質的原核(例如細菌)細胞株或真核(例如哺乳動物或真菌)細胞株，藉由細胞培養而產生。由於所用细胞株係活生物體，故必須對其飼餵包含糖、胺基酸及生長因子之復合細胞培養基，有時此係由動物血清製劑供应。將所需重組治療性蛋白質與製程相關雜質，包括例如細胞培養基組分、宿主細胞蛋白質(HCP)、宿主核酸及/或層析材料，以及產物相關雜質諸如聚集體、錯誤折疊之物質或所關注蛋白質之片段分離以實現足以用作人用治療劑的純度係一個巨大的挑戰。

產物相關雜質及製程相關雜質，包括聚集體在內，可能會干擾純化製程，在儲存期間影響蛋白質，及/或在將抗體作為醫藥投與個體後，可能會引起不良反應(Shukla等人,J. Chromatogr . B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 848(1), 28-39)。

因此，此項技術中仍然需要將治療性蛋白質，例如抗體純化至高純度，同時有效地移除雜質，提高蛋白質之回收率並維持治療需求的改進之方法。

本發明尤其提供用於例如自液體溶液純化抗α4β7抗體，諸如維多珠單抗(vedolizumab)之方法。

在一個態樣中，本發明之特徵在於一種用於自包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液獲得包含抗α4β7抗體之組成物的方法，該方法包括使包含蛋白質A之基質與該包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液接觸，由此使該抗α4β7抗體結合至該蛋白質A；用洗滌溶液洗滌該包含蛋白質A之基質；及藉由使該包含蛋白質A之基質與pH值為3.2至4之溶離溶液接觸，自該基質溶離該抗α4β7抗體，由此獲得包含該抗α4β7抗體之組成物，其中該抗α4β7抗體係人類化抗體，為IgG1抗體，包括含如SEQ ID NO: 4中所示之CDR3域、如SEQ ID NO: 3中所示之CDR2域及如SEQ ID NO: 2中所示之CDR1域的重鏈可變區；且包括含如SEQ ID NO: 8中所示之CDR3域、如SEQ ID NO: 7中所示之CDR2域及如SEQ ID NO: 6中所示之CDR1域的輕鏈可變區。

在一個實施例中，該方法係用於自包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液獲得包含低于1%之高分子量(HMW)聚集體的組成物，該方法包括使包含蛋白質A之基質與該包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液接觸，由此使該抗α4β7抗體結合至蛋白質A；該用洗滌溶液洗滌該包含蛋白質A之基質；及該藉由使該包含蛋白質A之基質與pH值為3.2至4之溶離溶液接觸，自該基質溶離該抗α4β7抗體，由此獲得包含低于1% HMW聚集體之組成物。

在一個實施例中，該蛋白質A係固定於固相上。在一個實施例中，該固相包含珠粒、凝膠及樹脂中之一或多種。

在一個實施例中，該洗滌溶液之pH值係約7。在一個實施例中，該溶離溶液包含檸檬酸。

在一個實施例中，該溶離溶液之pH值係3.2至3.7。

在另一個態樣中，本發明之特徵在於一種用於自包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液獲得包含抗α4β7抗體之組成物的方法，該方法包括使包含抗α4β7抗體及至少一種雜質之溶液與疏水相互作用層析(HIC)樹脂在允許該抗α4β7抗體流動通過該HIC樹脂之條件下接觸，由此獲得包含該抗α4β7抗體之組成物，其中該HIC樹脂係表徵為高疏水性HIC樹脂，其中該抗α4β7抗體係人類化抗體，為IgG1抗體，包括含如SEQ ID NO: 4中所示之CDR3域、如SEQ ID NO: 3中所示之CDR2域及如SEQ ID NO: 2中所示之CDR1域的重鏈可變區；且包括含如SEQ ID NO: 8中所示之CDR3域、如SEQ ID NO: 7中所示之CDR2域及如SEQ ID NO: 6中所示之CDR1域的輕鏈可變區。

在一個實施例中，該方法係用於自包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液獲得包含該抗α4β7抗體及低于0.6% HMW聚集體之組成物，該方法包括該使包含抗α4β7抗體及至少一種雜質之溶液與HIC樹脂在允許該抗α4β7抗體流動通過該HIC樹脂之條件下接觸，由此獲得包含該抗α4β7抗體及低于0.6% HMW聚集體之組成物，其中該抗α4β7抗體係人類化抗體，為IgG1抗體，包括含如SEQ ID NO: 4中所示之CDR3域、如SEQ ID NO: 3中所示之CDR2域及如SEQ ID NO: 2中所示之CDR1域的重鏈可變區；且包括含如SEQ ID NO: 8中所示之CDR3域、如SEQ ID NO: 7中所示之CDR2域及如SEQ ID NO: 6中所示之CDR1域的輕鏈可變區。

在一個實施例中，該HIC樹脂用pH值小於約7.2之磷酸鹽緩衝液平衡。在一個實施例中，該磷酸鹽緩衝液包含約0.35 mM至約0.15 mM之磷酸鉀。

在一個實施例中，樹脂裝載量係約55至75 mg/ml。

在一個實施例中，該組成物包含低于約0.22 ppm的殘留蛋白質A。

在一個實施例中，該組成物包含低于約0.3 ppm的宿主細胞蛋白質(HCP)。

在一個實施例中，該高疏水性HIC樹脂之平均孔徑係約50至150 μm。

在一個實施例中，該高疏水性HIC樹脂之平均孔徑係約100 nm及/或孔徑係約100 μm。

在另一個態樣中，本發明的特徵在於一種用於自包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液製造包含抗α4β7抗體之製劑的方法，該方法包括使該包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液與混合模式層析樹脂接觸，由此使該抗α4β7抗體結合至該樹脂；用洗滌溶液洗滌該混合模式層析樹脂；及藉由使該混合模式層析樹脂與pH值等於或高於pH 3.9之溶離溶液接觸，自該樹脂溶離該抗α4β7抗體，由此獲得包含純化之抗α4β7抗體的製劑，其中該抗α4β7抗體包含SEQ ID NO: 1中所示之重鏈可變區及SEQ ID NO: 2中所示的輕鏈可變區。

在前述態樣之一個實施例中，該方法係用於自包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液獲得包含低于1% HMW聚集體之製劑，該方法包括使該包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液與混合模式層析樹脂接觸，由此使該抗α4β7抗體結合至該樹脂；該用洗滌溶液洗滌該混合模式層析樹脂；及該藉由使該混合模式層析樹脂與pH值等於或高於pH 3.9之溶離溶液接觸，自該樹脂溶離該抗α4β7抗體，由此獲得包含低于1% HMW聚集體之製劑。

在一個實施例中，該溶離溶液之pH值等於或高於pH 4.1。在另一個實施例中，該溶離溶液之pH值係約pH 3.9至約pH 4.4。

在一些實施例中，該溶離溶液之電導率係30 mS/cm或更低。在某些實施例中，該溶離溶液之電導率係約20 mS/cm至約30 mS/cm。

在一些實施例中，該溶離溶液包含濃度為約160 mM至約240 mM的NaCl。

在某些實施例中，該混合模式層析樹脂係Capto Adhere ImpRes。

在上述態樣之一些實施例中，該方法進一步包括使用陽離子交換(CEX)樹脂純化該抗α4β7抗體。在一些此類實施例中，CEX樹脂係以結合/溶離模式操作。

在另一個態樣中，本發明的特徵在於一種用於自包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液製造包含抗α4β7抗體之製劑的方法，該方法包括使該包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液與混合模式層析樹脂接觸，由此使該抗α4β7抗體結合至該樹脂；用洗滌溶液洗滌該混合模式層析樹脂；及藉由使該混合模式層析樹脂與pH值等於或低於pH 4.2且電導率等於或低於28 mS/cm之溶離溶液接觸，自該樹脂溶離該抗α4β7抗體，由此獲得包含純化之抗α4β7抗體的製劑，其中該抗α4β7抗體包含SEQ ID NO: 1中所示之重鏈可變區及SEQ ID NO: 2中所示的輕鏈可變區。

在前述態樣之一些實施例中，該方法係用於自包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液獲得包含產率增加之抗α4β7抗體的製劑，該方法包括該使該包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液與混合模式層析樹脂接觸，由此使該抗α4β7抗體結合至該樹脂；該用洗滌溶液洗滌該混合模式層析樹脂；及該藉由使該混合模式層析樹脂與pH值等於或低於pH 4.2且電導率等於或低於28 mS/cm之溶離溶液接觸，自該樹脂溶離該抗α4β7抗體，由此獲得包含產率增加之抗α4β7抗體的製劑。

在一些實施例中，該溶離溶液之pH值等於或低於4.0。在其他實施例中，該溶離溶液之pH值係約pH 4.2至約pH 3.8。

在一些實施例中，該溶離溶液之電導率係約18 mS/cm至約28 mS/cm。

在一些實施例中，該溶離溶液包含濃度為約160 mM至約240 mM的NaCl。

在前述態樣之一些實施例中，該混合模式層析樹脂與每公升樹脂至少55 g之抗α4β7抗體接觸。在某些實施例中，該混合模式層析樹脂與每公升樹脂約55 g至約80 g之抗α4β7抗體接觸。

在前述態樣之一些實施例中，該混合模式層析樹脂係Capto Adhere ImpRes。

在上述態樣之一些實施例中，該方法進一步包括使用陽離子交換(CEX)樹脂純化該抗α4β7抗體。在一些此類實施例中，CEX樹脂係以結合/溶離模式操作。

在另一個態樣中，本發明的特徵在於一種用於自包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液製造包含抗α4β7抗體之製劑的方法，該方法包括使該包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液與陽離子交換(CEX)樹脂接觸，由此使該抗α4β7抗體結合至該樹脂；用洗滌溶液洗滌該CEX樹脂；及藉由使該CEX樹脂與電導率等於或低於16 mS/cm之溶離溶液接觸，自該樹脂溶離該抗α4β7抗體，由此獲得包含純化之抗α4β7抗體的製劑，其中該抗α4β7抗體包含SEQ ID NO: 1中所示之重鏈可變區及SEQ ID NO: 2中所示的輕鏈可變區。

在前述態樣之一些實施例中，該方法係用於自包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液獲得包含減少之量之HMW聚集體的製劑，該方法包括該使該包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液與CEX樹脂接觸，由此使該抗α4β7抗體結合至該樹脂；該用洗滌溶液洗滌該CEX樹脂；及該藉由使該CEX樹脂與電導率等於或低於16 mS/cm之溶離溶液接觸，自該樹脂溶離該抗α4β7抗體，由此獲得包含減少之量之HMW聚集體的製劑。

在上述態樣之一些實施例中，該溶離溶液之電導率係14 mS/cm或更低。在其他實施例中，該溶離溶液之電導率係約11-16 mS/cm。在又一些其他實施例中，該溶離溶液之電導率係約12-14 mS/cm。

在上述態樣之一些實施例中，該溶離溶液包含濃度為約70 mM至約110 mM的NaCl。

在上述態樣之一些實施例中，該溶離溶液之pH值係約pH 5至約pH 6。在某些實施例中，該溶離溶液之pH值係約pH 5.1至約pH 5.8。

在上述態樣之一些實施例中，抗α4β7抗體係以每公升樹脂約25-70 g抗體之濃度裝載於該CEX樹脂上。在某些實施例中，抗α4β7抗體係以每公升樹脂約30-60 g抗體之濃度裝載於該CEX樹脂上。

在上述態樣之一些實施例中，該CEX樹脂係Nuvia HR-S。

在上述態樣之一些實施例中，該方法進一步包括使用混合模式層析樹脂純化該抗α4β7抗體。在一些此類實施例中，該混合模式層析樹脂係以結合/溶離模式操作。

在另一個態樣中，本發明的特徵在於一種用於自包含抗α4β7抗體之主要同功型及一或多種鹼性同功型種類之液體溶液製造包含抗α4β7抗體之製劑的方法，該方法包括使該包含抗α4β7抗體及一或多種鹼性同功型種類之液體溶液與陽離子交換(CEX)樹脂接觸，由此使該抗α4β7抗體結合至該樹脂；用洗滌溶液洗滌該CEX樹脂；及藉由使該CEX樹脂與電導率等於或高於11 mS/cm之溶離溶液接觸，自該樹脂溶離該抗α4β7抗體，由此獲得包含純化之抗α4β7抗體的製劑，其中該抗α4β7抗體包含SEQ ID NO: 1中所示之重鏈可變區及SEQ ID NO: 2中所示之輕鏈可變區。

在前述態樣之一些實施例中，該方法係用於自包含抗α4β7抗體之主要同功型及一或多種鹼性同功型種類之液體溶液獲得包含減少之量的α4β7抗體之鹼性同功型種類的製劑，該方法包括該使該包含抗α4β7抗體及一或多種鹼性同功型種類之液體溶液與CEX樹脂接觸，由此使該抗α4β7抗體結合至該樹脂；該用洗滌溶液洗滌該CEX樹脂；及該藉由使該CEX樹脂與電導率等於或高於11 mS/cm之溶離溶液接觸，自該樹脂溶離該抗α4β7抗體，由此獲得包含減少之量之鹼性同功型種類的製劑。

在一個實施例中，純化之組成物包含約4%至約20%的鹼性同功型。

在上述態樣之一些實施例中，該溶離溶液之電導率係12 mS/cm或更高。在其他實施例中，該溶離溶液之電導率係約11-16 mS/cm。在又一些其他實施例中，該溶離溶液之電導率係約12-14 mS/cm。

在上述態樣之一些實施例中，該溶離溶液之pH值係約pH 5至約pH 6。在某些實施例中，該溶離溶液之pH值係約pH 5.1至約pH 5.8。

在上述態樣之一些實施例中，抗α4β7抗體係以每公升樹脂約25-70 g抗體之濃度裝載於該CEX樹脂上。在某些實施例中，抗α4β7抗體係以每公升樹脂約30-60 g抗體之濃度裝載於該CEX樹脂上。

在一些實施例中，該溶離溶液包含氯化鈉，例如70至110 mM的氯化鈉。

在上述態樣之一些實施例中，該CEX樹脂係Nuvia HR-S。

在上述態樣之一些實施例中，該方法進一步包括使用混合模式層析樹脂純化該抗α4β7抗體。在一些此類實施例中，該混合模式層析樹脂係以結合/溶離模式操作。

在任何上述態樣之一個實施例中，該抗體係在中國倉鼠卵巢(CHO)宿主細胞中產生。

在一個實施例中，該宿主細胞係GS-CHO細胞。

在任何上述態樣之一個實施例中，抗α4β7抗體包含如SEQ ID NO: 1中所示之重鏈可變區序列及如SEQ ID NO: 5中所示之輕鏈可變區序列。

在任何上述態樣之一個實施例中，抗α4β7抗體係維多珠單抗。

另外，本發明還包含以下實施例： 1.    一種用於自包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液獲得包含低于1% HMW聚集體之組成物的方法，該方法包括 使包含蛋白質A之基質與該包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液接觸，由此使該抗α4β7抗體結合至蛋白質A； 用洗滌溶液洗滌該包含蛋白質A之基質；及 藉由使該包含蛋白質A之基質與pH值為3.2至4之溶離溶液接觸，自該基質溶離該抗α4β7抗體，由此獲得包含低于1% HMW聚集體之組成物， 其中該抗α4β7抗體係人類化抗體，為IgG1抗體，包括含如SEQ ID NO: 4中所示之CDR3域、如SEQ ID NO: 3中所示之CDR2域及如SEQ ID NO: 2中所示之CDR1域的重鏈可變區；且包括含如SEQ ID NO: 8中所示之CDR3域、如SEQ ID NO: 7中所示之CDR2域及如SEQ ID NO: 6中所示之CDR1域的輕鏈可變區。 2.    如項目1之方法，其中該蛋白質A係固定於固相上。 3.    如項目2之方法，其中該固相包含珠粒、凝膠及樹脂中之一或多種。 4.    如項目1至3中任一項之方法，其中該洗滌溶液之pH值係約7。 5.    如項目1至4中任一項之方法，其中該溶離溶液包含檸檬酸。 6.    如項目1至5中任一項之方法，其中該溶離溶液之pH值係3.2至3.7。 7.    一種用於自包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液獲得包含抗α4β7抗體及低于0.6% HMW聚集體之組成物的方法，該方法包括 使包含抗α4β7抗體及至少一種雜質之溶液與疏水相互作用層析(HIC)樹脂在允許該抗α4β7抗體流動通過該HIC樹脂之條件下接觸，由此獲得包含該抗α4β7抗體及低于0.6% HMW聚集體之組成物， 其中該HIC樹脂係表徵為高疏水性HIC樹脂， 其中該抗α4β7抗體係人類化抗體，為IgG1抗體，包括含如SEQ ID NO: 4中所示之CDR3域、如SEQ ID NO: 3中所示之CDR2域及如SEQ ID NO: 2中所示之CDR1域的重鏈可變區；且包括含如SEQ ID NO: 8中所示之CDR3域、如SEQ ID NO: 7中所示之CDR2域及如SEQ ID NO: 6中所示之CDR1域的輕鏈可變區。 8.    如項目7之方法，其中該HIC樹脂用pH值小於約7.2之磷酸鹽緩衝液平衡。 9.    如項目8之方法，其中該磷酸鹽緩衝液包含約0.35 mM至約0.15 mM之磷酸鉀。 10.  如項目7至9中任一項之方法，其中該樹脂之裝載量係約55至75 mg/ml。 11.  如項目7至10中任一項之方法，其中該組成物包含低于約0.22 ppm的殘留蛋白質A。 12.  如項目7至11中任一項之方法，其中該組成物含有低于約0.3 ppm的宿主細胞蛋白質(HCP)。 13.  如項目7至12中任一項之方法，其中該高疏水性HIC樹脂之平均孔徑係約50至150 μm。 14.  如項目7至12中任一項之方法，其中該高疏水性HIC樹脂之平均孔徑係約100 nm及/或孔徑係約100 μm。 15.  如項目1至14中任一項之方法，其中該抗體係在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生。 16.  如項目15之方法，其中該宿主細胞係GS-CHO細胞。 17.  如項目1至16中任一項之方法，其中該抗α4β7抗體包含如SEQ ID NO: 1中所示之重鏈可變區序列及如SEQ ID NO: 5中所示之輕鏈可變區序列。 18.  如項目1至16中任一項之方法，其中該抗α4β7抗體係維多珠單抗。

相關申請案

本申請案主張2019年6月10日提出申請之美國臨時申請案62/859,580之優先權。前述申請案之全部內容以引用之方式併入本文。序列表

本申請案包含序列表，該序列表已經以ASCII格式以電子方式提交，且以全文引用之方式併入本文。該ASCII副本係於2020年6月5日創建，命名為T103022_1120WO_SL.txt且大小為10, 015位元組。

本發明尤其 係關於用於控制抗α4β7抗體或其抗原結合片段，例如維多珠單抗之純化製劑中存在的產物相關物質(例如聚集體，諸如高分子量(HMW)聚集體、錯誤折疊之物質或蛋白質片段)及/或製程相關雜質(例如宿主細胞蛋白質(HCP)、宿主細胞核酸、病毒、層析材料及/或培養基組分)之量的純化方法。I. 定義

為了能更容易地理解本發明，首先定義某些術語。

細胞表面分子「α4β7整合素」或「α4β7」(通篇可互換使用)係α4鏈(CD49D、ITGA4)與β7鏈(ITGB7)之異二聚體。人類α4整合素及β7整合素基因GenBank (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Md.) RefSeq登錄號分別為NM_000885及NM_000889，由B淋巴細胞及T淋巴細胞，特別是記憶性CD4+淋巴細胞表現。許多整合素之典型，即α4β7可以靜止或活化狀態存在。α4β7之配位體包括血管細胞黏附分子(VCAM)、纖連蛋白及黏膜位址素(MAdCAM (例如MAdCAM-1))。結合至α4β7整合素之抗體在本文中稱為「抗α4β7抗體」。

如本文所使用，「對α4β7複合物具有結合特異性」之抗體或其抗原結合片段結合至α4β7，但不結合至α4β1或α_E B7。維多珠單抗係對 α4β7複合物具有結合特異性之抗體的一個實例。

如本文所使用，術語「抗體」旨在指包含藉由二硫鍵相互連接之四條多肽鏈，即兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈的免疫球蛋白分子。每條重鏈包含重鏈可變區(本文縮寫為HCVR或VH)及重鏈恆定區(CH)。重鏈恆定區包含三個域，即CH1、CH2及CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(本文縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域，即CL。VH區及VL區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其間散佈有更為保守的區域，稱為構架區(FR)。VH及VL各自包含三個CDR及四個FR，自胺基末端至羧基末端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在一些實施例中，抗體具有可結晶片段(Fc)區。在某些實施例中，該抗體係IgG1同型並具有κ輕鏈。

「CDR」或「互補決定區」係間雜於稱為「構架區」(FR)的更為保守之區域內的高變區。

如本文所使用，術語抗體之「抗原結合片段」或「抗原結合部分」係指Fab、Fab'、F(ab')₂ 及Fv片段、單鏈抗體、功能性重鏈抗體(奈米抗體)，以及與完整抗體競爭特異性結合的抗體之對至少一個所需抗原決定基具有特異性的任何部分(例如 具有足夠構架序列以便特異性結合至抗原決定基的互補決定區之經分離部分)。抗原結合片段可藉由重組技術或藉由酶裂解或化學裂解抗體來產生。

非人類(例如囓齒動物)抗體之「人類化」形式係含有來源於非人類抗體之最小序列的嵌合抗體。在大多數情況下，人類化抗體係人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體高變區之殘基經具有所需特異性、親和力及能力的來自非人類物種(供體抗體)，諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物之高變區的殘基置換。在一些情況下，人類抗體之構架區(FR)殘基經相應的非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中未發現的殘基。進行此等修飾係為了進一步改善抗體性能。一般而言，人類化抗體將包含基本上全部的至少一個且典型地兩個可變域，其中全部或基本上全部之高變CDR環對應於非人類抗體之高變CDR環且全部或基本上全部之FR係人類抗體序列之FR。人類化抗體還視情況包含抗體恆定區(Fc)之至少一部分，典型地為人類抗體之一部分。有關更多詳情，請參見Jones等人, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等人, Nature 332:323-329 (1988)；及Presta,  Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。

如本文所使用，術語「重組抗體」係指由引入宿主細胞，例如 哺乳動物宿主細胞中的重組表現載體上攜帶之基因的轉錄及轉譯而產生的抗體。在某些實施例中，重組蛋白係選自由以下組成之群之同型的抗體：IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE。在某些實施例中，重組抗體係IgG1。

術語「重組宿主細胞」(在本文中與術語「宿主細胞」可互換使用)包括已引入重組表現載體之細胞。應理解，此類術語不僅旨在指特定個體細胞，而且亦指此類細胞之後代。因為某些修飾可能因突變或環境影響而在後代中出現，所以此類後代實際上可能與親本細胞不同，但仍包括在本文所使用之術語「宿主細胞」的範圍內。此外，應理解，除非另外說明，否則在使用術語「細胞」，例如宿主細胞或哺乳動物細胞或哺乳動物宿主細胞時，意圖包括細胞群。

如本文所使用，術語「載體」係指這樣一種核酸分子，該核酸分子能夠繁殖與其連接之另一核酸。該術語包括呈自我複制核酸結構之載體，以及併入宿主細胞基因組中之載體，該宿主細胞中已引入該載體。某些載體能夠引導與其可操作連接之核酸的表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。

如本文所使用，在蛋白質製劑，例如抗體製劑的情況下，術語「上游製程」係指涉及自宿主細胞產生及收集蛋白質(例如抗體)的活動(例如在細胞培養後產生所關注蛋白質，例如抗體)。

如本文所使用，術語「下游製程」係指在上游製程之後所使用的純化所關注蛋白質，例如抗體的一或多種技術。例如，下游製程技術包括使用例如親和層析法(包括蛋白質A親和層析法)、離子交換層析法(諸如陰離子或陽離子交換層析法)、尺寸排阻層析法、混合模式層析法、疏水相互作用層析法(HIC)或置換層析法純化蛋白質產物。

如本文所使用，術語「培養」和「細胞培養」一般係指使細胞在受控條件下生長的過程，一般指在其自然環境之外生長。「培養」細胞係指使細胞與細胞培養基在適合細胞存活及/或生長及/或增殖之條件下接觸。在某些實施例中，細胞培養係指用於產生及維持能夠產生所關注重組蛋白，例如抗α4β7抗體之宿主細胞群的方法，以及用於產生及收集所關注蛋白質之方法及技術。舉例而言，在將表現載體併入適當宿主，例如培養中的宿主細胞中後，就可將該宿主維持在適於表現相關核苷酸編碼序列以及收集及純化所需重組蛋白的條件下。「細胞培養物」亦可指含有細胞之溶液。

如本文所使用，術語「澄清之收集物」係指含有所關注蛋白質，例如含有抗α4β7抗體之液體材料，其係在經歷一或多個加工步驟以自該材料移除固體粒子，諸如細胞碎片及顆粒狀雜質後，自細胞培養物，例如發酵生物反應器提取。在細胞培養後，典型地使用分離技術，諸如離心及過濾來純化收集物，以移除細胞及細胞碎片。最初的澄清、顆粒移除步驟會產生「澄清之收集物」，其例如可用於後續的層析步驟(下游加工)中。澄清之收集物一般係用於下游加工的起始材料，諸如本文所描述之下游加工步驟。

如本文所使用，「層析載體」係指具有特定化學組成或特定三維結構之固體或多孔基質，或在其上可固定特定化學基團或大分子以便執行層析法，包括親和層析法、凝膠過濾(尺寸排阻層析法)或離子交換層析法。層析載體之實例包括但不限於樹脂(例如瓊脂糖)或膜。如本文所使用，「層析殼體」係指容納層析載體之結構。層析殼體之實例包括管柱或濾筒或其他容器。

如本文所使用，術語「緩衝液」係指藉由酸-鹼共軛物組分之作用來抵抗pH變化的水溶液。緩衝液係用於建立一組特定條件，以介導對加工步驟或層析載體，諸如層析樹脂或膜之控制。

如本文所使用，術語「平衡溶液」係指調配成用於建立用於加工步驟或層析載體，諸如層析操作之初始操作條件的水性液體。平衡溶液係用於製備例如供裝載所關注蛋白質，例如抗體之固相，例如層析載體，例如樹脂或膜。

如本文所使用，術語「洗滌液」或「洗滌溶液」係指調配用於自層析載體，諸如樹脂或膜置換未結合之污染物的水性液體。在一些實施例中，在裝載所關注蛋白質，例如抗體之後，且在溶離所關注蛋白質，例如抗體之前，使洗滌液通過固體載體，例如樹脂或膜。在一個實施例中，洗滌液具有類似於平衡溶液之生化特性。

如本文所使用，「流通操作」係指蛋白質基本上不結合至基質，例如疏水性層析樹脂，及/或在洗滌過程中溶離，而雜質仍與層析載體締合在一起的製程。

如本文所使用，術語「溶離溶液」或「溶離液」係指調配用於自層析載體，例如樹脂或膜置換所關注蛋白質，例如抗體的水性液體。在一個實施例中，溶離溶液具有不同於平衡溶液及/或洗滌溶液之生化特性，由此使所關注蛋白質，例如抗體更傾向於與溶離溶液締合，而不是與層析載體，例如與樹脂或膜締合。

如本文關於在包含待純化抗體之溶液中所含的雜質所使用，術語「雜質」包括製程相關雜質及產物相關雜質。

如本文所使用，術語「製程相關雜質」係指存在於包含蛋白質之組成物，例如溶液中但不來源於蛋白質本身的一或多種雜質。例如，製程相關雜質包括但不限於細胞培養基組分、宿主細胞組分(諸如蛋白質(HCP)、宿主細胞核酸或含脂質之亞細胞結構或其片段)、病毒、來自緩衝液之痕量金屬或離子、來自材料處理容器或層析載體之可浸出材料。在蛋白質，例如抗體之製備(上游及/或下游加工)期間可能形成製程相關雜質。

如本文所使用，術語「宿主細胞雜質」係指由宿主細胞株、細胞培養液或細胞培養物引入的任何蛋白質、核酸污染物、脂質污染物或副產物。雜質之實例包括但不限於中國倉鼠卵巢蛋白(CHOP)、大腸桿菌(E. coli )蛋白、酵母蛋白、猿猴COS蛋白或骨髓瘤細胞蛋白(例如NS0蛋白(來源於BALB/c小鼠之小鼠漿細胞瘤細胞))。

如本文所使用，術語「產物相關雜質」包括來源於所關注蛋白質，例如抗體本身的雜質。舉例而言，產物相關雜質包括但不限於所關注抗體之聚集體(例如HMW)、錯誤折疊之物質、氧化或去酰胺之物質或低分子量片段。

如本文所使用，術語「聚集體」係指兩個或更多個抗體或抗體片段之締合。舉例而言，聚集體可以為抗體及/或抗體片段之二聚體、三聚體、四聚體或大於四聚體之多聚體。抗體聚集體可為可溶或不可溶的。聚集分子之間之締合可為共價的或非共價的，而與其締合之機制無關。締合可為聚集分子之間之直接締合，或經由其他分子將該等聚集分子連接在一起之間接締合。後者之實例包括但不限於與其他蛋白質之二硫鍵、與脂質之疏水性締合、與DNA之電荷締合、與浸出之蛋白質A的親和締合、或與多種組分之混合模式締合。聚集體可在細胞培養中之蛋白質表現期間、下游加工中之蛋白質純化期間或藥物產品之儲存期間不可逆地形成。溶液中聚集體之存在可使用例如尺寸排阻層析法(SEC)(例如具有UV偵測之SEC、具有光散射偵測之SEC (SEC-LSD))、場流分級分離、分析型超速離心沈降速率或毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉(CE-SDS，還原型及非還原型)確定。

術語「高分子量」或「HMW」用於指示分子量大於單體抗體之抗體複合物。在一個實施例中，HMW聚集體之分子量大於約147 kDa。高分子量聚集體之存在可藉由此項技術中已知之標準方法，例如尺寸排阻層析法(SEC)確定。

關於所需蛋白質，「基本上純化」係指包含該蛋白質之純化樣品包含至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少97.5%、至少98%、至少98.5%、或至少99%的所需重組蛋白及低於3%、低於2.5%、低於2%、低於1.5%、低於1%、或低於0.5%的雜質。

術語「約」表示此後的值並非精確值，而是該值之+/-5%之范圍的中心點。如果該值係以百分比給出的相對值，則術語「約」亦表示此後的值並非精確值，而是該值之+/-5%之范圍的中心點，由此該範圍之上限不能超過100%的值。II. 與抗體純化相關之方法及組成物

本文提供用於例如自液體溶液，例如自哺乳動物細胞培養物之澄清收集物純化抗α4β7抗體，諸如維多珠單抗的方法。本發明至少部分係基於抗體純化製程之某些態樣，其減少抗體溶液中存在之雜質的量，包括例如製程相關雜質，諸如細胞培養基組分、宿主細胞蛋白質(HCP)、宿主細胞核酸、病毒及層析材料；以及產物相關雜質，諸如聚集體(包括HMW聚集體)、錯誤折疊之物質及所關注抗體之片段。本發明之方法可用於純化抗α4β7抗體，特別是維多珠單抗或具有維多珠單抗之結合區，亦即CDR或可變區之抗體，由此該抗體可調配用於人類患者。

具體言之，本文所揭示之方法可用於實現較低量之抗體聚集，例如 HMW抗體聚集體。在某些實施例中，本文所揭示之方法提供具有約0%至5.0% (例如0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、3.9%、4%、4.1%、4.2%、4.3%、4.4%、4.5%、4.6%、4.7%、4.8%、4.9%或5%)聚集體，例如HMW聚集體之組成物。在特定實施例中，本文所揭示之方法提供具有約0%至2%、≤2%、≤1.9%、≤1.8%、≤1.7%、≤1.6%、≤1.5%、≤1.4%、≤1.3%、≤1.2%、≤1.1%、≤1%、≤0.9%、≤0.8%、≤0.7%、≤0.6%或≤0.5%聚集體，例如HMW聚集體之組成物。本發明亦包括包含抗α4β7抗體及該較低量之HMW聚集體的組成物。

具體言之，本文所揭示之方法可用於製造抗α4β7抗體維多珠單抗或具有維多珠單抗之抗原結合區的抗體。維多珠單抗亦以其商品名ENTYVIO^® (Takeda Pharmaceuticals,  Inc.)為人所知。維多珠單抗係一種人類化抗體，其包含人類IgG1構架區及恆定區以及來自鼠類抗體Act-1之抗原結合CDR。維多珠單抗之CDR、可變區及突變之Fc區(突變成消除Fc效應物功能)描述於以引用方式併入本文中的美國專利第7,147,851號中。

維多珠單抗係一種人類化單株抗體，其特異性結合至α4β7整合素，例如α4β7複合物，並阻斷α4β7整合素與黏膜位址素細胞黏附分子-1 (MAdCAM-1)之相互作用，且抑制記憶性T淋巴細胞遷移穿過內皮進入發炎的胃腸實質組織中。維多珠單抗不結合α4β1及αEβ7整合素或抑制α4β1及αEβ7整合素之功能，且不拮抗α4整合素與血管細胞黏附分子-1 (VCAM-1)之相互作用。

α4β7整合素在一小組不同的記憶性T淋巴細胞之表面上表現，該等記憶性T淋巴細胞優先遷移至胃腸道中。MAdCAM-1主要在腸道內皮細胞上表現，並在T淋巴細胞歸巢至腸道淋巴組織中起關鍵作用。α4β7整合素與MAdCAM-1之相互作用已被認為是黏膜炎症，諸如作為潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病(Crohn’s disease)之標誌之慢性炎症的重要促成因素。維多珠單抗可用於治療炎症性腸病，包括克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎、結腸袋炎(包括慢性結腸袋炎)、移植物抗宿主病及HIV。

維多珠單抗之重鏈可變區在本文中以SEQ ID NO: 1提供，且維多珠單抗之輕鏈可變區在本文中以SEQ ID NO: 5提供。維多珠單抗包括含SEQ ID NO: 2之CDR1、SEQ ID NO: 3之CDR2及SEQ ID NO: 4之CDR3之重鏈可變區。維多珠單抗包括含SEQ ID NO: 6之CDR1、SEQ ID NO: 7之CDR2及SEQ ID NO: 8之CDR3之輕鏈可變區。在一個實施例中，該抗體包括含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的重鏈及含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的輕鏈。維多珠單抗及維多珠單抗之序列在美國專利公開案第2014/0341885號及美國專利公開案第2014-0377251號中亦有描述，各案之完整內容以全文引用之方式明確地併入本文中。本文所揭示之方法可使用包含上文及所附序列表中陳述之結合區，例如CDR或可變區之抗體來執行。

製造抗體之方法係此項領域中已知的。哺乳動物宿主細胞經工程改造成可穩定表現抗α4β7抗體(例如維多珠單抗)。用於製造單株抗體，諸如維多珠單抗之完整細胞培養方法及考慮描述於以引用方式併入本文中的Li等人 . (2010)mAbs 2:5, 466-477；以及Birch及Racher (2006)Adv. Drug Delivery Rev. 58:671-685中。

當使用細胞培養技術時，抗α4β7抗體可在細胞內產生，在週質空間中產生，或直接分泌至培養基中。在細胞內產生抗α4β7抗體之實施例中，宿主細胞或溶解細胞之顆粒狀碎片(例如由均質化產生)可藉由多種方式移除，包括但不限於離心或過濾。在將抗α4β7抗體分泌至培養基中的情況下，可首先使用市售蛋白質濃縮過濾器濃縮來自此類表現系統之上清液。

培養基或溶解產物可能會經歷一或多個加工步驟，諸如沈降、絮凝、離心及/或過濾，以移除顆粒狀細胞碎片，由此形成澄清的細胞培養物上清液，或澄清的收集物。隨後，如下文詳細描述，抗體，例如 抗α4β7抗體(例如維多珠單抗或具有對應於維多珠單抗之結合區的抗體)經純化，以移除雜質，例如 製程相關雜質，諸如細胞培養基組分、宿主細胞蛋白質(HCP)、宿主細胞核酸、病毒及層析材料，以及產物相關雜質，諸如聚集體(包括HMW聚集體)、錯誤折疊之物質及所關注抗體之片段。

純化製程可在使用上述上游製造方法及/或藉由此項技術中習知之替代性製造方法製造抗體後開始。在獲得了包含抗體之澄清溶液或混合物之後，就可將所關注抗體與製程相關雜質，諸如由細胞產生之其他蛋白質以及產物相關物質分離。在某些非限制性實施例中，此類分離係使用CEX、AEX及/或MM層析執行。在某些實施例中，亦可採用一或多種不同純化技術之組合，包括親和分離步驟、離子交換分離步驟、混合模式步驟及/或疏水相互作用分離步驟。此等額外純化步驟基於抗體之電荷、疏水程度及/或大小分離抗體混合物。在本發明之一個態樣中，此類額外分離步驟係使用層析法，包括疏水相互作用、陰離子相互作用或陽離子相互作用(或其組合)執行。對於此等技術中之每一種，許多層析樹脂均為市售的，由此允許針對所涉及之特定抗體準確地定製純化方案。每種分離方法允許抗體以不同速率橫過管柱，由此實現物理分離，該分離隨著抗體進一步穿過管柱而增加，或者選擇性地黏附至分離樹脂(或介質)。接著，使用不同溶離液差異地溶離抗體。在一些情況下，當雜質特異性黏附至管柱之樹脂上且所關注抗體未黏附至樹脂上，亦即所關注抗體包含在流通物中時，所關注抗體就會與雜質分離，而在其他情況下，所關注抗體將黏附至管柱之樹脂上，而雜質及/或產物相關物質在洗滌循環期間自管柱之樹脂擠出，之後，抗體因樹脂周圍液體之變化而釋放且所關注抗體自管柱溶離。

在某些實施例中，在「捕獲步驟」中，包含抗體之溶液經歷親和層析以純化抗體去除雜質。在某些實施例中，層析材料能夠選擇性或特異性結合至所關注抗體(「捕獲」)。此類層析材料之非限制性實例包括：蛋白質A、蛋白質G、包含例如所關注抗體所結合之抗原的層析材料、以及包含Fc結合蛋白之層析材料。

在具體實施例中，本文所述之親和層析步驟涉及使包含抗α4β7抗體之澄清收集物經歷 蛋白質A基質，例如包含蛋白質A樹脂之層析管柱。在某些實施例中，蛋白質A樹脂可用於多種抗體同型，特別是IgG1、IgG2及IgG4之親和純化及分離。蛋白質A係一種細菌細胞壁蛋白，主要經由其Fc區結合至哺乳動物IgG。在天然狀態下，蛋白質A具有五個IgG結合域以及其他功能未知的域。 使用蛋白質 A 樹脂純化抗 α4β7 抗體

在一個態樣中，本文所描述之方法包括使用蛋白質A自包含抗體及一或多種雜質之液體溶液，例如澄清收集物純化抗α4β7抗體(例如維多珠單抗)。該方法包括使抗α4β7抗體結合至親和層析基質，諸如蛋白質A。在某些實施例中，超過10 g/L，諸如10至50 g/L、20至45 g/L或30至40 g/L之抗體溶液可裝載至親和層析基質上。舉例而言，可將約10 g/L、11 g/L、12 g/L、13 g/L、14 g/L、15 g/L、16 g/L、17 g/L、18 g/L、19 g/L、20 g/L、21 g/L、22 g/L、23 g/L、24 g/L、25 g/L、26 g/L、27 g/L、28 g/L、29 g/L、30 g/L、31 g/L、32 g/L、33 g/L、34 g/L、35 g/L、36 g/L、37 g/L、38 g/L、39 g/L、40 g/L、41 g/L、42 g/L、43 g/L、44 g/L、45 g/L、46 g/L、47 g/L、48 g/L、49 g/L或50 g/L抗體溶液裝載至蛋白質A親和層析基質上。

蛋白質A樹脂存在若干商業來源。一種適合的樹脂係來自GE Healthcare之MabSelect™。適合的樹脂包括但不限於來自GE Healthcare之MabSelect SuRe™、MabSelect SuRe LX、MabSelect、MabSelect Xtra、rProtein A Sepharose；來自EMD Millipore之MabSelect ™ ProA樹脂、ProSep HC、ProSep Ultra及ProSep Ultra Plus；來自Life Technologies之MabCapture。

在裝載樣品之前，蛋白質A管柱可以用適合平衡溶液平衡。管柱裝載之後，可使用一組適合的溶液將管柱洗滌一次或多次，以減少一或多種雜質，其中抗α4β7抗體仍結合至蛋白質A。

在一些實施例中，將蛋白質A基質洗滌一次以上。在一些實施例中，將蛋白質A基質洗滌三次。在一個實施例中，一或多種洗滌液包含磷酸鹽。在一個實施例中，親和管柱可用包含PBS之初始洗滌溶液洗滌，隨後用包含NaCl及PBS之第二洗滌溶液洗滌，隨後用包含PBS之第三洗滌溶液洗滌。在一個實施例中，第一洗滌溶液與第三洗滌溶液係相同的。在一個實施例中，第二洗滌溶液包含NaCl (例如1M NaCl)及PBS，且pH值為7.2。在另一個實施例中，一或多種洗滌溶液之pH值為約7.0-7.4。在一個實施例中，一或多種洗滌溶液之pH值為約7.2。

在其他實施例中，親和管柱用包含PBS之初始洗滌溶液洗滌，隨後用包含緩衝液，諸如檸檬酸鹽、乙酸鹽或磷酸鹽之第二溶液及第三溶液洗滌。在一個實施例中，第二溶液及第三溶液包含檸檬酸鈉緩衝液。在一個實施例中，第二洗滌溶液及第三洗滌溶液中之檸檬酸鈉緩衝液係相同的。在另一個實施例中，第二洗滌溶液與第三洗滌溶液中之檸檬酸鈉緩衝液係不同的。在一個實施例中，第二洗滌溶液中檸檬酸鈉緩衝液之莫耳濃度高於第三洗滌溶液中檸檬酸鈉緩衝液之莫耳濃度。在一個實施例中，第二洗滌溶液中檸檬酸鈉緩衝液之莫耳濃度為75 mM至125 mM或100 mM且第三洗滌溶液中檸檬酸鈉緩衝液之莫耳濃度為15 mM至40 mM或25 mM。在一個實施例中，最後的洗滌液之pH值為5.6至6.2。在一個實施例中，溶離溶液具有與最後的洗滌液大致相同的電導率。

接著，可使用適當的溶離溶液溶離蛋白質A管柱。舉例而言，甘胺酸-HCl、乙酸或檸檬酸均可用作溶離溶液。在一個實施例中，溶離溶液係檸檬酸，例如檸檬酸鈉溶離溶液。在一些實施例中，溶離溶液之pH值可為約3.0至4.0 (例如約3.1至4.0、3.2至4.0、3.3至4.0、3.4至4.0、3.5至4.0、3.6至4.0、3.7至4.0、3.8至4.0、或3.9至4.0)。在某些實施例中，溶離溶液之pH值係約3.0至3.4。在一些實施例中，溶離溶液之pH值可為約3.0、約3.1、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9或約4.0。在一些實施例中，該溶離溶液之pH值等於或高於3.3。在一些實施例中，該溶離溶液之pH值等於或高於3.4。在一些實施例中，該溶離溶液之pH值等於或高於3.5。在一些實施例中，該溶離溶液之pH值等於或高於3.6。在一些實施例中，該溶離溶液之pH值等於或高於3.7。在一些實施例中，該溶離溶液之pH值等於或高於3.8。在一些實施例中，該溶離溶液之pH值等於或高於3.9。溶離液可使用熟習此項技術者熟知之技術監測。可收集所關注溶離液部分且接著製備用於進一步加工。

如實例中所示，與蛋白質A親和管柱溶離緩衝液pH具有較低pH值，例如2.9至3.3的實施例相比，蛋白質A親和管柱溶離緩衝液pH具有較高pH值，例如3.3至4.0的實施例，包含抗α4β7抗體之溶離液具有較少的雜質，諸如HMW聚集體。在一些實施例中，溶離液含有抗α4β7抗體且含有約0%至5.0% (例如 0-0.1%、0-0.2%、0-0.3%、0-0.4%、0-0.5%、0-0.6%、0-0.7%、0-0.8%、0-0.9%、0-1%、0-1.1%、0-1.2%、0-1.3%、0-1.4%、0-1.5%、0-1.6%、0-1.7%、0-1.8%、0-1.9%、0-2%、0-2.5%、0-3%、0-3.5%、0-4%、0-4.5%或0-5%)的HMW聚集體。在一些實施例中，溶離液含有抗α4β7抗體且含有約2%或更少(例如約1.9%或更少、1.8%或更少、1.7%或更少、1.6%或更少、1.5%或更少、1.4%或更少、1.3%或更少、1.2%或更少、1.1%或更少、1%或更少、0.9%或更少、0.8%或更少、0.7%或更少、0.6%或更少、0.5%或更少、0.4%或更少、0.3%或更少、0.2%或更少、或0.1%或更少)的HMW聚集體。在特定實施例中，蛋白質A樹脂溶離液含有抗α4β7抗體且含有約0%至2%、≤2%、≤1.9%、≤1.8%、≤1.7%、≤1.6%、≤1.5%、≤1.4%、≤1.3%、≤1.2%、≤1.1%、≤1%、≤0.9%、≤0.8%、≤0.7%、≤0.6%、≤0.5%、≤0.4%、≤0.3%、≤0.2%或≤0.1%的聚集體，例如HMW聚集體。在一個實施例中，溶離液含有抗α4β7抗體且含有約1.2%或更少的HMW聚集體。在一個實施例中，溶離液含有抗α4β7抗體且含有約1.1%或更少的HMW聚集體。在一個實施例中，溶離液含有抗α4β7抗體且含有約1%或更少 (例如約0.9%或更少、0.8%或更少、0.7%或更少、0.6%或更少、0.5%或更少、0.4%或更少、0.3%或更少、0.2%或更少、或0.1%或更少)的HMW聚集體。在一個實施例中，溶離液含有抗α4β7抗體且含有約0.9%或更少的HMW聚集體。

本文所述之緩衝液及方法可減少組成物，諸如含有自蛋白質A樹脂溶離之抗α4β7抗體的組成物中宿主細胞蛋白質(HCP)的量，此係相對於使用不具有本文所描述之一或多個參數的溶離緩衝液時的HCP量而言的。在一些實施例中，蛋白質A樹脂溶離液包括含抗α4β7抗體及小於約250 ppm (例如小於約240 ppm、230 ppm、220 ppm、210 ppm、200 ppm、190 ppm、180 ppm、170 ppm、160 ppm、150 ppm、140 ppm、130 ppm、120 ppm、100 ppm、90 ppm、80 ppm、70 ppm、60 ppm、50 ppm、40 ppm、30 ppm、20 ppm、10 ppm、9 ppm、8 ppm、7 ppm、6 ppm、5 ppm、4 ppm、3 ppm、2 ppm或1 ppm)之HCP的組成物。在一些實施例中，蛋白質A樹脂溶離液包括含抗α4β7抗體及約1-250 ppm (例如約1-240 ppm、1-230 ppm、1-220 ppm、1-210 ppm、1-200 ppm、1-190 ppm、1-180 ppm、1-170 ppm、1-160 ppm、1-150 ppm、1-140 ppm、1-130 ppm、1-120 ppm、1-100 ppm、1-90 ppm、1-80 ppm、1-70 ppm、1-60 ppm、1-50 ppm、1-40 ppm、1-30 ppm、1-20 ppm、1-10 ppm、1-9 ppm、1-8 ppm、1-7 ppm、1-6 ppm、1-5 ppm、1-4 ppm、1-3 ppm或1-2 ppm)之HCP的組成物。

在一個實施例中，用pH值大於3.3 (例如pH 3.3-4.0、pH 3.4-4.0、pH 3.5-4.0、pH 3.6-4.0、pH 3.7-4.0、pH 3.8-4.0或pH 3.9-4.0)之溶離緩衝液溶離結合至蛋白質A之抗α4β7抗體產生包含抗α4β7抗體及降低量之HMW聚集體的溶離液及/或包含抗α4β7抗體及降低量之HCP的溶離液。在一個實施例中，該溶離溶液之pH值係3.3至3.9。在一個實施例中，該溶離緩衝液之pH值係3.3至3.8。在一個實施例中，該溶離緩衝液之pH值係3.4至3.6。在一個實施例中，溶離緩衝液之pH值係3.4-4.0。在一個實施例中，溶離緩衝液包含檸檬酸，例如檸檬酸鈉，例如100 mM檸檬酸或25 mM檸檬酸。在一個實施例中，蛋白質A親和層析管柱係在包含25 mM檸檬酸鈉之緩衝液中洗滌及溶離，其中洗滌緩衝液之pH值係5.6至6.2、5.7至5.9或5.8，且溶離緩衝液之pH值係3.3至3.9、3.4至3.6或3.5。

在某些實施例中，裝載至蛋白質A樹脂上的材料係例如來自表現抗α4β7抗體之重組細胞株的澄清細胞培養物收集物。在一些實施例中，重組細胞株(亦即，宿主細胞株)可為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在一些實施例中，CHO細胞可為缺乏編碼麩醯胺酸合成酶之基因的GS-CHO細胞。在一些實施例中，CHO細胞可為缺乏編碼二氫葉酸還原酶之基因的DHFR-CHO細胞。

可調整蛋白質A溶離液之pH值及/或電導率，以用於後續純化步驟。蛋白質A溶離液亦可經由深層過濾器進行過濾以在額外層析精製步驟之前，自所關注抗體移除混濁及/或各種雜質。 使用 HIC 樹脂純化抗 α4β7 抗體

如下文所詳述且如實例2中所陳述，抗體，例如抗α4β7抗體(例如維多珠單抗或具有對應於維多珠單抗之結合區的抗體)，亦可在蛋白質A純化後使用下游製程技術進行純化。稍後在下游製程中之純化步驟通常稱為「精製」步驟，並提出一個獨特的挑戰，即雜質之量可能相對較低，但考慮到預定用於人類用途之抗體的性質，希望甚至更低之量。

在一個態樣中，本文所描述之方法包括使用疏水相互作用層析(HIC)樹脂自包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液，例如澄清收集物純化該抗體。

在一個實施例中，本發明提供減少抗α4β7抗體溶液中之高分子量(HMW)聚集體的方法，該等方法包括使該抗體溶液與疏水相互作用層析(HIC)樹脂接觸。疏水相互作用層析(HIC)藉由利用蛋白質與HIC樹脂(例如經疏水性配位體改質之聚合物基質)之疏水表面之間的可逆相互作用，根據蛋白質表面疏水性的差異分離此等蛋白質。鑑於抗α4β7抗體，如維多珠單抗之疏水性，在純化製程期間可使用高疏水性HIC樹脂移除雜質，包括HMW聚集體、殘留蛋白質A及/或宿主細胞蛋白質(HCP)污染物，其中該抗α4β7抗體流動通過HIC樹脂且並未結合。在一些實施例中，適用於本文所述之方法中的高疏水性HIC樹脂包含與C6基團鍵結之聚甲基丙烯酸酯基礎材料，諸如Toyopearl Hexyl-650C (Tosoh Biosciences)。

在一些實施例中，HIC係以「流通模式」使用。因此，如本文所使用，「流通級分」係指移動相緩衝液中以級分收集的蛋白質，其已通過如本文所提供的含有樹脂之管柱。

在一些實施例中，包含抗α4β7抗體及至少一種雜質之溶液與疏水相互作用層析(HIC)樹脂在允許該抗α4β7抗體流動通過該HIC樹脂之條件下接觸。在一個實施例中，該HIC樹脂之平均孔徑係約100 nm及/或孔徑係約100 µm。在一個實施例中，該HIC樹脂用pH值小於約7.2之緩衝液平衡。在一個實施例中，該HIC樹脂用pH值為約5.5至約7.2之緩衝液平衡。在一個實施例中，該HIC樹脂用pH值為約5.5至約7之緩衝液平衡。在一個實施例中，該緩衝液係磷酸鹽緩衝液。在一個實施例中，該磷酸鹽緩衝液包含約0.35 M至約0.15 M磷酸鉀。在一個實施例中，樹脂裝載量係約55至75 mg/ml。

在一個實施例中，用HIC管柱純化抗α4β7抗體之方法包括使含抗α4β7抗體之溶液流動通過管柱，亦即，該純化包括將抗α4β7抗體收集於管柱流通物中且污染物仍結合至管柱，其中抗α4β7抗體及管柱係在包含150至300 mM、175至250 mM或約200 mM濃度之磷酸鹽，例如磷酸鉀且pH值為5.2至6.5、5.7至6.2或約5.9之溶液中。

在一些實施例中，此類使用高疏水性HIC樹脂之方法可用於獲得包含α4β7抗體及約0%至2.0% (例如低於0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、或低於2%)之HMW聚集體的組成物。在一些實施例中，此類使用高疏水性HIC樹脂之方法可用於獲得包含抗α4β7抗體及約2%或更低(例如約1.9%或更低、1.8%或更低、1.7%或更低、1.6%或更低、1.5%或更低、1.4%或更低、1.3%或更低、1.2%或更低、1.1%或更低、1%或更低、0.9%或更低、0.8%或更低、0.7%或更低、0.6%或更低、0.5%或更低、0.4%或更低、0.3%或更低、0.2%或更低、或0.1%或更低)之HMW聚集體的組成物。在特定實施例中，此類使用高疏水性HIC樹脂之方法可用於獲得包含抗α4β7抗體及約0%至2%、≤2%、≤1.9%、≤1.8%、≤1.7%、≤1.6%、≤1.5%、≤1.4%、≤1.3%、≤1.2%、≤1.1%、≤1%、≤0.9%、≤0.8%、≤0.7%、≤0.6%、≤0.5%、≤0.4%、≤0.3%、≤0.2%、或 ≤0.1%之HMW聚集體的組成物。在某些實施例中，此類使用高疏水性HIC樹脂之方法可用於獲得包含抗α4β7抗體及低於0.6%之HMW聚集體的組成物。在一個實施例中，獲得包含抗α4β7抗體及低於0.5%之HMW聚集體的組成物。在一個實施例中，獲得包含抗α4β7抗體及低於0.4%之HMW聚集體的組成物。此外，該組成物可含有低于約0.3 ppm之宿主細胞蛋白質(HCP)，其中該宿主細胞係中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，例如GS-CHO細胞。在一個實施例中，該組成物包含低于約0.22 ppm的殘留蛋白質A。 使用混合模式層析樹脂純化抗 α4β7 抗體

在一個態樣中，本文提供使用混合模式層析樹脂，以結合/溶離模式自包含抗α4β7抗體(例如維多珠單抗)及一或多種雜質之液體溶液，例如澄清的細胞培養物收集物純化該抗體的方法。在一些實施例中，混合模式層析樹脂具有適於高雜質去除及高容量之性質。在一個實施例中，用於純化抗α4β7抗體之混合模式層析樹脂包含強陰離子交換、氫鍵結及疏水鍵結能力。在另一個實施例中，用於純化抗α4β7抗體之混合模式層析樹脂包含在較小珠粒，例如約35-45 μm直徑之珠粒上發揮強陰離子交換、氫鍵結及疏水鍵結能力。在某些實施例中，本文所描述之方法及組成物中使用的混合模式層析樹脂係CAPTO™ Adhere ImpRes (GE Healthcare Life Sciences，現為Global Life Sciences Solutions, LLC)。在某些實施例中，本文所描述之方法及組成物中使用的混合模式層析樹脂係CAPTO™ Adhere (GE Healthcare Life Sciences，現為Global Life Sciences Solutions, LLC)。澄清的細胞培養物收集物可來源於重組表現抗α4β7抗體之宿主細胞。在某些實施例中，宿主細胞可為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，如GS-CHO細胞或DHFR-CHO細胞。

本文所提供的混合模式層析方法包括使抗α4β7抗體結合至混合模式層析樹脂。在本文所描述之混合模式層析方法之前及/或之後，可以使用額外純化步驟，包括但不限於親和層析(例如蛋白質A層析)、陰離子交換(AEX)層析、陽離子交換(CEX)層析及疏水相互作用層析(HIC)。因此，在一些實施例中，用於混合模式層析法之裝載材料可包含蛋白質A溶離液、AEX溶離液、CEX溶離液或HIC溶離液或收集的HIC流通材料。在一些實施例中，本文所提供之混合模式層析法可進一步包括用洗滌溶液洗滌混合模式樹脂，並自該樹脂溶離抗體。

在某些實施例中，可將至少25 g/L (例如至少25 g/L、30 g/L、35 g/L、40 g/L、45 g/L、50 g/L、55 g/L、60 g/L、65 g/L、70 g/L、75 g/L、80 g/L、85 g/L、90 g/L、95 g/L、或100 g/L)抗體溶液裝載至混合模式層析樹脂上。舉例而言，可將至少55 g/L抗體溶液裝載至混合模式層析樹脂上。在某些實施例中，可將約25 g/L至約100 g/L，諸如約25 g/L至約95 g/L、約25 g/L至約90 g/L、約25 g/L至約85 g/L、約25 g/L至約80 g/L (例如約30 g/L至約80 g/L、約35 g/L至約80 g/L、約40 g/L至約80 g/L、約45 g/L至約80 g/L、約50 g/L至約80 g/L、約55 g/L至約80 g/L、約60 g/L至約80 g/L、約65 g/L至約80 g/L、約70 g/L至約80 g/L、或約75 g/L至約80 g/L)抗體溶液裝載至混合模式層析樹脂上。舉例而言，可將約55 g/L至約80 g/L抗體溶液裝載至混合模式層析樹脂上。

樹脂可視情況用適合洗滌緩衝液洗滌，該緩衝液不會自樹脂溶離所結合的抗體。在一個實施例中，樹脂可視情況用磷酸鈉洗滌緩衝液洗滌。在一些實施例中，洗滌緩衝液可包含10 mM磷酸鈉、25 mM磷酸鈉、50 mM磷酸鈉或75 mM磷酸鈉，其pH為中性或接近中性(例如pH 6-8)。與混合模式層析法相容的其他適合洗滌緩衝液係廣泛可用的。

本文描述的緩衝液增加自混合模式層析樹脂溶離後抗α4β7抗體製劑中抗α4β7抗體之產率及/或減少其聚集體之量(例如HMW物質%)。為了增加抗α4β7抗體之產率及/或減少聚集體的量(例如HMW物質%)，可調節混合模式溶離緩衝液之pH值及/或電導率。與混合模式層析法相容的適合溶離溶液係廣泛可用的。在一些實施例中，混合模式層析法溶離溶液包含緩衝液，諸如檸檬酸鹽、乙酸鹽或磷酸鹽。

在一些實施例中，在本文所述之方法中與混合模式層析樹脂一起使用的溶離緩衝液之pH值等於或高於pH 3.5 (例如等於或高於pH 3.6、等於或高於pH 3.7、等於或高於pH 3.8、等於或高於pH 3.9、等於或高於pH 4.0、等於或高於pH 4.1、等於或高於pH 4.2、等於或高於pH 4.3、等於或高於pH 4.4、或等於或高於pH 4.5)。舉例而言，與混合模式層析樹脂一起使用的溶離緩衝液之pH值可等於或高於pH 3.9。在某些實施例中，在本文所述之方法中與混合模式層析樹脂一起使用的溶離緩衝液之pH值為約pH 3.9至約pH 4.5 (例如pH值為約pH 3.9至約pH 4.5、約pH 3.9至約pH 4.4、約pH 3.9至約pH 4.3、約pH 3.9至約pH 4.2、約pH 3.9至約pH 4.1或約pH 3.9至約pH 4.0)。在一些實施例中，用於本文所提供之混合模式層析法的溶離緩衝液之pH值可為約pH 3.9至約pH 4.4。

在另外的或替代性實施例中，在本文所述之方法中與混合模式層析樹脂一起使用的溶離緩衝液之pH值等於或低於pH 4.5 (例如等於或低於pH 4.4、等於或低於pH 4.3、等於或低於pH 4.2、等於或低於pH 4.1、等於或低於pH 4.0、等於或低於pH 3.9、等於或低於pH 3.8、等於或低於3.7、等於或低於pH 3.6、或等於或低於pH 3.5)。舉例而言，與混合模式層析樹脂一起使用之溶離緩衝液的pH值可等於或低於pH 4.2。在某些實施例中，在本文所述之方法中與混合模式層析樹脂一起使用的溶離緩衝液之pH值為約pH 4.2至約pH 3.5 (例如約pH 4.2至約pH 3.6、約pH 4.2至約pH 3.7、約pH 4.2至約pH 3.8、約pH 4.2至約pH 3.9、約pH 4.2至約pH 4.0、或約pH 4.2至約pH 4.1)。舉例而言，與混合模式層析樹脂一起使用之溶離緩衝液的pH值可為約pH 4.2至約pH 3.8。

在一些實施例中，在本文所述之方法中與混合模式層析樹脂一起使用的溶離緩衝液之電導率為約40 mS/cm或更低(例如約39 mS/cm、38 mS/cm、37 mS/cm、36 mS/cm、35 mS/cm、34 mS/cm、33 mS/cm、32 mS/cm、31 mS/cm、30 mS/cm、29 mS/cm、28 mS/cm、27 mS/cm、26 mS/cm、25 mS/cm、24 mS/cm、23 mS/cm、22 mS/cm、21 mS/cm、20 mS/cm、19 mS/cm、18 mS/cm、17 mS/cm、16 mS/cm、15 mS/cm、14 mS/cm、13 mS/cm、12 mS/cm、11 mS/cm、或10 mS/cm或更低)。舉例而言，與混合模式層析樹脂一起使用之溶離緩衝液的電導率可為約30 mS/cm或更低。在某些實施例中，在本文所述之方法中與混合模式層析樹脂一起使用的溶離緩衝液之電導率為約10 mS/cm至約40 mS/cm，例如約15 mS/cm至約35 mS/cm或約20 mS/cm 至約30 mS/cm。舉例而言，與混合模式層析樹脂一起使用之溶離緩衝液的電導率可為約20 mS/cm至約30 mS/cm。

在另外的或替代性實施例中，在本文所述之方法中與混合模式層析樹脂一起使用的溶離緩衝液之電導率等於或低於30 mS/cm (例如等於或低於29 mS/cm、28 mS/cm、27 mS/cm、26 mS/cm、25 mS/cm、24 mS/cm、23 mS/cm、22 mS/cm、21 mS/cm、20 mS/cm、19 mS/cm、18 mS/cm、17 mS/cm、16 mS/cm、15 mS/cm、14 mS/cm、13 mS/cm、12 mS/cm、11 mS/cm、或10 mS/cm)。舉例而言，與混合模式層析樹脂一起使用之溶離緩衝液的電導率可等於或低於28 mS/cm。在某些實施例中，在本文所述之方法中與混合模式層析樹脂一起使用的溶離緩衝液之電導率為約10 mS/cm至約40 mS/cm (例如約15 mS/cm至約35 mS/cm、約18 mS/cm至約35 mS/cm、約11 mS/cm至約30 mS/cm、約12 mS/cm至約30 mS/cm、約13 mS/cm至約30 mS/cm、約14 mS/cm至約30 mS/cm、約15 mS/cm至約30 mS/cm、約16 mS/cm至約30 mS/cm、約17 mS/cm至約30 mS/cm、約18 mS/cm至約30 mS/cm、約19 mS/cm至約30 mS/cm、約20 mS/cm至約30 mS/cm、約21 mS/cm至約30 mS/cm、約22 mS/cm至約30 mS/cm、約23 mS/cm至約30 mS/cm、約24 mS/cm至約30 mS/cm、約25 mS/cm至約30 mS/cm、約26 mS/cm至約30 mS/cm、或約27 mS/cm至約30 mS/cm)。舉例而言，在一些實施例中，與混合模式層析樹脂一起使用之溶離緩衝液的電導率可為約18 mS/cm至約28 mS/cm。

在一些實施例中，在本文所述之方法中與混合模式層析樹脂一起使用的溶離緩衝液可包含濃度為約100-300 mM (例如約110-290 mM、120-280 mM、130-270 mM、140-260 mM、150-250 mM、160-240 mM、170-230 mM、180-220 mM或190-210 mM)的離子鹽，例如NaCl。舉例而言，與混合模式層析樹脂一起使用之溶離緩衝液可具有濃度為約160 mM至約240 mM之NaCl。在某些實施例中，在本文所述之方法中與混合模式層析樹脂一起使用之溶離緩衝液具有濃度為約100 mM、110 mM、120 mM、130 mM、140 mM、150 mM、160 mM、170 mM、180 mM、190 mM、200 mM、210 mM、220 mM、230 mM、240 mM、250 mM、260 mM、270 mM、280 mM、290 mM或300 mM之NaCl。

在一些實施例中，使用混合模式層析樹脂自液體溶液，例如澄清的細胞培養物收集物純化抗α4β7抗體，例如維多珠單抗之方法包括將抗α4β7抗體以每公升樹脂40至90 g、50至80 g或約65 g蛋白質之濃度裝載至包含混合模式樹脂之管柱上，洗滌該管柱並用pH值為3.5至4.5、3.9至4.4或約4.1之溶離緩衝液，例如檸檬酸鈉緩衝液溶離該管柱。在一些實施例中，該方法進一步包括包含離子鹽，例如NaCl，因此溶離緩衝液之電導率為15至35 mS/cm、20至30 mS/cm或約24 mS/cm。在一些實施例中，該方法包括將抗體以每公升樹脂53-77 g蛋白質之濃度裝載至包含混合模式樹脂之管柱上。在一些實施例中，該方法包括使用pH值為約3.9-4.4且電導率為約20-28 mS/cm之溶離緩衝液自管柱溶離抗體。

在一些實施例中，抗α4β7抗體之純化可使用本文所述之混合模式層析法結合陽離子交換(CEX)層析法來實現。

在一些實施例中，相對於使用不具有本文所描述之一或多個參數之溶離緩衝液的適合對照製程的產率，例如相對於使用pH值為3.7或更低、3.6或更低、3.5或更低、3.3或更低、或3.0或更低之溶離緩衝液執行的製程，本文所述之方法可提高自混合模式層析管柱溶離之抗α4β7抗體的產率。在一些實施例中，產率增加至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或更高百分比。在一些實施例中，本文所述之緩衝液及方法可自混合模式層析管柱溶離之抗α4β7抗體之回收率為50%或更高(例如55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高百分比)。在某些實施例中，本文所述之緩衝液及方法可自混合模式層析管柱溶離之抗α4β7抗體之回收率為50-95% (例如55-95%、60-95%、65-95%、70-95%、75-95%、80-95%、85-95%、90-95%、或更高百分比)。

在一些實施例中，此類使用混合模式層析樹脂之組成物及方法可用於獲得包含抗α4β7抗體及約0%至2.0% (例如 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%或2%)之HMW聚集體的組成物。在一些實施例中，此類使用混合模式層析樹脂之方法可用於獲得包含抗α4β7抗體及約2%或更低(例如約1.9%或更低、1.8%或更低、1.7%或更低、1.6%或更低、1.5%或更低、1.4%或更低、1.3%或更低、1.2%或更低、1.1%或更低、1%或更低、0.9%或更低、0.8%或更低、0.7%或更低、0.6%或更低、0.5%或更低、0.4%或更低、0.3%或更低、0.2%或更低、或0.1%或更低)之HMW聚集體的組成物。在特定實施例中，此類使用混合模式層析樹脂之方法可用於獲得包含抗α4β7抗體及約0%至2%、≤2%、≤1.9%、≤1.8%、≤1.7%、≤1.6%、≤1.5%、≤1.4%、≤1.3%、≤1.2%、≤1.1%、≤1%、≤0.9%、≤0.8%、≤0.7%、≤0.6%、≤0.5%、≤0.4%、≤0.3%、≤0.2%或≤0.1%聚集體之組成物。在其他實施例中，相對於裝載材料中HMW聚集體之量，HMW聚集體之量減少至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高百分比。在一些實施例中，相對於自使用不具有本文所述之一或多個參數之溶離緩衝液的適合對照製程獲得的HMW聚集體之量，例如相對於使用pH值為3.7或更低、3.6或更低、3.5或更低、3.3或更低、或3.0或更低之溶離緩衝液執行之製程，本文所提供之混合模式層析方法可用於減少包含抗α4β7抗體之組成物中HMW聚集體之量。在一些實施例中，HMW聚集體之量相對於適合對照減少至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高百分比。 使用陽離子交換 (CEX) 樹脂純化抗 α4β7 抗體

在一個態樣中，本文提供使用陽離子交換(CEX)樹脂，以結合/溶離模式自包含抗α4β7抗體，例如維多珠單抗及一或多種雜質之液體溶液，例如澄清的細胞培養物收集物純化該抗體的方法。在一些實施例中，用於純化抗α4β7抗體之CEX樹脂係強陽離子交換樹脂。在某些實施例中，適合用於本文所述之方法及組成物中之CEX樹脂包含-SO3^- 官能基。舉例而言，在一些實施例中，CEX樹脂係Nuvia HR-S。澄清的細胞培養物收集物可來源於重組表現抗α4β7抗體之宿主細胞。在某些實施例中，宿主細胞可為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，諸如GS-CHO細胞或DHFR-CHO細胞。

本文所提供之CEX法包括使抗α4β7抗體結合至陽離子交換層析樹脂。在本文所述之CEX法之前及/或之後，可使用額外純化步驟，包括但不限於親和層析(例如蛋白質A層析)、陰離子交換(AEX)層析、混合模式層析及疏水相互作用層析(HIC)。因此，在一些實施例中，用於CEX層析法之裝載材料可包含蛋白質A溶離液、AEX溶離液、混合模式溶離液或HIC溶離液。在一些實施例中，本文所提供之CEX法可進一步包括用洗滌溶液洗滌CEX樹脂，並自該樹脂溶離抗體。與CEX層析法相容的適於例如裝載、洗滌及溶離蛋白質，例如抗α4β7抗體之溶液 係廣泛可用的。在一些實施例中，CEX層析溶液包含緩衝液，諸如檸檬酸鹽、乙酸鹽或磷酸鹽。

在某些實施例中，可將至少20 g/L (例如至少20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L、40 g/L、45 g/L、50 g/L、55 g/L、60 g/L、65 g/L、70 g/L、75 g/L、80 g/L、85 g/L、90 g/L、95 g/L、或100 g/L)之抗體溶液裝載至CEX樹脂上。舉例而言，可將至少25 g/L抗體溶液裝載至CEX樹脂上。在某些實施例中，可將約25-100 g/L (例如約25-90 g/L、25-80 g/L、25-70 g/L、25-60 g/L、25-50 g/L、25-40 g/L、或25-30 g/L)之抗體溶液裝載至CEX樹脂上。在某些實施例中，可將約25-70 g/L (例如約25-65 g/L、30-60 g/L、35-55 g/L、或40-50 g/L)之抗體溶液裝載至CEX樹脂上。舉例而言，可將約30-60 g/L之抗體溶液裝載至CEX樹脂上。

樹脂可視情況用適合洗滌緩衝液洗滌，該緩衝液不會自樹脂溶離所結合的抗體。在一些實施例中，洗滌緩衝液具有與用於將抗體裝載至樹脂上之緩衝液相同的組成。在一個實施例中，樹脂可視情況用乙酸鈉緩衝液，例如25 mM乙酸鈉、50 mM乙酸鈉、75 mM乙酸鈉或100 mM乙酸鈉洗滌。在一些實施例中，洗滌緩衝液之pH值範圍係pH 5-7，例如pH 5-6、pH 5.5-6.5、pH 5.1-5.8、pH 5.3-5.6、pH 6-7或pH 5.4。與CEX層析法相容的其他適合洗滌緩衝液係廣泛可用的。

溶離緩衝液之pH值及/或電導率可經調整以調節自CEX樹脂溶離之抗α4β7抗體製劑中HMW聚集體之量、主要(主導)同功型種類之量、酸性同功型種類之量及/或鹼性同功型種類之量。在一些實施例中，在本文所述之方法中與CEX樹脂一起使用的溶離緩衝液之pH值等於或低於pH 6.0 (例如等於或低於pH 4.5、pH 4.6、pH 4.7、pH 4.8、pH 4.9、pH 5.0、pH 5.1、pH 5.2、pH 5.3、pH 5.4、pH 5.5、pH 5.6、pH 5.7、pH 5.8、pH 5.9或pH 6.0)。在某些實施例中，在本文所述之方法中與CEX樹脂一起使用的溶離緩衝液之pH值係約pH 4.5至約pH 6.0 (例如pH值係約pH 4.5至約pH 5.8、約pH 4.9至約pH 5.9、約pH 5.0至約pH 6.0、約pH 5.0至約pH 5.9、約pH 5.0至約pH 5.8、約pH 5.0至約pH 5.7、約pH 5.0至約pH 5.6、或約pH 5.0至約pH 5.5)。舉例而言，與CEX樹脂一起使用之溶離緩衝液的pH值可為約pH 5.1至約pH 5.8。在一些實施例中，CEX溶離緩衝液之pH值與洗滌緩衝液相同。

在另外的或替代性實施例中，在本文所述之方法中與CEX樹脂一起使用的溶離緩衝液之電導率等於或低於20 mS/cm (例如等於或低於19 mS/cm、18 mS/cm、17 mS/cm、16 mS/cm、15 mS/cm、14 mS/cm、13 mS/cm、12 mS/cm、11 mS/cm或10 mS/cm)。舉例而言，與CEX樹脂一起使用之溶離緩衝液的電導率可等於或低於16 mS/cm。在一些實施例中，在本文所述之方法中與CEX樹脂一起使用的溶離緩衝液之電導率為約10 mS/cm至約20 mS/cm (例如約10 mS/cm至約19 mS/cm、約10 mS/cm至約18 mS/cm、約10 mS/cm至約17 mS/cm、約10 mS/cm至約16 mS/cm、約10 mS/cm至約15 mS/cm、約10 mS/cm至約14 mS/cm、約10 mS/cm至約13 mS/cm、或約10 mS/cm至約12 mS/cm)。在一些實施例中，與CEX樹脂一起使用之溶離緩衝液的電導率可為約11 mS/cm至約16 mS/cm。另外或替代地，與CEX樹脂一起使用之溶離緩衝液的電導率可等於或低於14 mS/cm。在某些實施例中，在本文所述之方法中與CEX樹脂一起使用的溶離緩衝液之電導率為約11 mS/cm至約14 mS/cm，諸如為約12 mS/cm至約14 mS/cm或約13 mS/cm至約14 mS/cm。舉例而言，與CEX樹脂一起使用之溶離緩衝液的電導率可為約12 mS/cm至約14 mS/cm。另外或替代地，與CEX樹脂一起使用之溶離緩衝液的電導率可等於或高於11 mS/cm (例如等於或高於12 mS/cm、13 mS/cm、14 mS/cm、15 mS/cm、16 mS/cm、17 mS/cm、18 mS/cm、19 mS/cm或20 mS/cm)。舉例而言，在一些實施例中，與CEX樹脂一起使用之溶離緩衝液的電導率可等於或高於12 mS/cm。

在一些實施例中，在本文所述之方法中與CEX樹脂一起使用的溶離緩衝液可具有濃度為約50 mM、60 mM、70 mM、80 mM、90 mM、100 mM、110 mM、120 mM、130 mM、140 mM或150 mM之NaCl。舉例而言，與CEX樹脂一起使用之溶離緩衝液可具有濃度為約90-120 mM之NaCl。在某些實施例中，在本文所述之方法中與CEX樹脂一起使用的溶離緩衝液具有濃度為約50-150 mM (例如約50-140 mM、60-130 mM、70-120 mM、80-110 mM、或90-100 mM)之NaCl。在特定實施例中，在本文所述之方法中與CEX樹脂一起使用的溶離緩衝液具有濃度為約70-120 mM (例如約70-110 mM、70-100 mM、70-90 mM、或70-80 mM)之NaCl。舉例而言，與CEX樹脂一起使用之溶離緩衝液可具有濃度為約70-110 mM之NaCl。

在一些實施例中，使用CEX樹脂，例如強陽離子交換樹脂自液體溶液，例如澄清的細胞培養物收集物純化抗α4β7抗體，例如維多珠單抗之方法包括將抗α4β7抗體以每公升樹脂40至90 g、50至65 g或約57 g蛋白質之濃度裝載至包含CEX樹脂之管柱上，洗滌該管柱並用pH值為5至6、5.2至5.6或約5.4之緩衝液，例如乙酸鈉緩衝液溶離管柱。在一些實施例中，該方法進一步包括包含離子鹽，例如NaCl，因此溶離緩衝液之電導率為5至25 mS/cm、10至17 mS/cm或約13 mS/cm。在其他實施例中，使用CEX樹脂，例如強陽離子交換樹脂自液體溶液，例如澄清的細胞培養物收集物純化抗α4β7抗體，例如維多珠單抗之方法包括用pH值為5至6、5.2至5.6或約5.4且電導率為5至25 mS/cm、10至15 mS/cm或約13 mS/cm之緩衝液，例如乙酸鈉緩衝液溶離管柱。在一個實施例中，該方法包括用pH值為約5.4且電導率為約13 mS/cm之溶離緩衝液溶離管柱。在一些實施例中，CEX樹脂以每公升樹脂約57 g蛋白質裝載抗體。

在一些實施例中，抗α4β7抗體之純化可使用本文所述之CEX樹脂結合混合模式層析法來實現。

在一些實施例中，本文所述之CEX法可用於獲得包含抗α4β7抗體及約0%至2.0% (例如約0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%或2%)之HMW聚集體的組成物。在一些實施例中，此類使用CEX樹脂之方法可用於獲得包含抗α4β7抗體及約2%或更低 (例如約1.9%或更低、1.8%或更低、1.7%或更低、1.6%或更低、1.5%或更低、1.4%或更低、1.3%或更低、1.2%或更低、1.1%或更低、1%或更低、0.9%或更低、0.8%或更低、0.7%或更低、0.6%或更低、0.5%或更低、0.4%或更低、0.3%或更低、0.2%或更低、0.1%或更低、0.09%或更低、0.08%或更低、0.07%或更低、0.06%或更低、0.05%或更低、0.04%或更低、0.03%或更低、0.02%或更低、或0.01%或更低)之HMW聚集體的組成物。在特定實施例中，此類使用CEX樹脂之方法可用於獲得包含抗α4β7抗體及約0%至2%、≤2%、≤1.9%、≤1.8%、≤1.7%、≤1.6%、≤1.5%、≤1.4%、≤1.3%、≤1.2%、≤1.1%、≤1%、≤0.9%、≤0.8%、≤0.7%、≤0.6%、≤0.5%、≤0.4%、≤0.3%、≤0.2%、≤0.1%、≤0.09%、≤0.08%、≤0.07%、≤0.06%、≤0.05%、≤0.04%、≤0.03%、≤0.02%、或≤0.01%聚集體，例如HMW聚集體之組成物。在其他實施例中，HMW聚集體之量相對於裝載材料中HMW聚集體之量減少至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高百分比。在一些實施例中，相對於使用所用溶離緩衝液不具有本文所述之一或多個參數之適合對照CEX法獲得的抗α4β7抗體製劑中HMW聚集體之量，例如相對於使用pH值為6.3或更高、6.5或更高、6.7或更高、或6.9或更高及/或電導率為18 mS/cm或更高、19 mS/cm或更高、20 mS/cm或更高、22 mS/cm或更高、或24 mS/cm或更高之溶離緩衝液執行的方法，本文所提供之CEX法可用於降低包含抗α4β7抗體之組成物中HMW聚集體之量。在一些實施例中，HMW聚集體之量相對於適合對照減少至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高百分比。

在本文提供之方法的一些實施例中，用於自CEX樹脂溶離抗α4β7抗體之溶離緩衝液的pH值及/或電導率可用於調節溶離液中存在的抗α4β7抗體之同功型分佈。舉例而言，溶離緩衝液之pH值及/或電導率可用於增加主要(主導)抗體同功型之百分比，降低酸性同功型種類之百分比，及/或降低鹼性同功型種類之百分比。

在一些實施例中，選擇的溶離緩衝液之pH值可為6.0或更低，例如5.9或更低、5.8或更低、5.7或更低、5.6或更低、5.5或更低、5.4或更低、5.3或更低、或5.2或更低，例如pH 4.5-6.0、pH 4.5-5.5或pH 5.0-6.0。在一些實施例中，選擇的溶離緩衝液之電導率可為至少10 mS/cm，例如至少11 mS/cm、至少12 mS/cm、至少13 mS/cm、至少14 mS/cm、至少15 mS/cm、至少16 mS/cm或更高，例如10-17 mS/cm、12-17 mS/cm、13-17 mS/cm、14-17 mS/cm、15-17 mS/cm、16-17 mS/cm、10-16 mS/cm、12-16 mS/cm、13-16 mS/cm、14-16 mS/cm、或15-16 mS/cm。在一些實施例中，前述溶離緩衝液條件可用於獲得含有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%或更高百分比的抗α4β7抗體之主要同功型的組成物。在一些實施例中，前述溶離緩衝液條件可用於獲得含有20%或更低(例如約19%或更低、18%或更低、17%或更低、16%或更低、15%或更低、14%或更低、13%或更低、12%或更低、11%或更低、10%或更低、9%或更低、8%或更低、7%或更低、6%或更低、5%或更低、4%或更低、3%或更低、2%或更低、或1%或更低)之鹼性同功型種類之組成物。在特定實施例中，此類使用CEX樹脂之方法可用於獲得包含抗α4β7抗體之主要同功型及約≤20%、≤19%、≤18%、≤17%、≤16%、≤15%、≤14%、≤13%、≤12%、≤11%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%、≤5%、≤4%、≤3%、≤2%或≤1%鹼性同功型種類之組成物。在其他實施例中，鹼性同功型種類之量相對於裝載材料中鹼性同功型種類之量減少至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高百分比。III. 分析方法

在某些實施例中，對使用本文所描述之技術產生的層析樣品中聚集體、單體及片段之量進行分析。在某些實施例中，使用尺寸排阻層析法(SEC)針對每個分子量測聚集體、單體及片段。舉例而言但非限制，TSK-gel G3000SWxL，5 μm，125 Å，7.8 × 300 mm管柱(Tosoh Bioscience)可與某些實施例結合使用，而TSK-gel Super SW3000，4 μm，250 Å，4.6 × 300 mm管柱(Tosoh Bioscience)可用於替代性實施例中。在某些實施例中，前述管柱係與Agilent或Shimazhu HPLC系統一起使用。在某些實施例中，在等度溶離條件下，使用由例如pH 6.8的100 mM硫酸鈉及100 mM磷酸鈉組成之移動相進行樣品注射，並在214 nm下偵測UV吸光度。在某些實施例中，移動相將由pH 7.4的1X PBS組成，並用在280 nm下之UV吸收度偵測溶離曲線。在某些實施例中，定量係基於所偵測之峰的相對面積進行。

任何額外技術，諸如質譜法，均可用於檢定大小變異體。

本文所報告之抗體或其抗原結合部分的各種參數可使用標準分析方法及技術，諸如下文所述之分析方法及技術量測。

在本文所闡述之各種實施例中，可使用陽離子交換層析法(CEX)確定一組抗體或其抗原結合部分，例如維多珠單抗中存在之主要同功型、鹼性同功型及酸性同功型之相對量。CEX法根據總表面電荷對抗體種類進行分級分離。在使用移動相稀釋至低離子強度後，可將測試樣品注射至在適合緩衝液，例如pH 6.6的10 mM磷酸鈉中平衡之CEX管柱，諸如Dionex Pro-Pac^TM WCX-10管柱(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA (USA))上。抗體可在相同緩衝液中使用氯化鈉梯度溶離。可在280 nm下監測蛋白質溶離，並將峰指定為酸性種類、鹼性種類或主要同功型類別。自管柱溶離之酸性種類峰的滯留時間短於主要同功型峰，而自管柱溶離之鹼性種類峰的滯留時間長於主要同功型峰。主要同功型百分比、酸性種類百分比之總和及鹼性種類百分比之總和均有報告。將樣品主要同功型之滯留時間與參考標準品之滯留時間相比較以確定一致性。在一個實施例中，CEX檢定法包括將測試樣品稀釋至低離子強度，將其注射至用10 mM磷酸鈉pH 6.6平衡之CEX管柱上，在該緩衝液中用NaCl梯度溶離該管柱，在280 nm下監測峰並將峰指定為酸性種類峰、主要種類峰或鹼性種類峰，其中酸性種類峰首先以最短滯留時間溶離，主要種類峰第二溶離，且鹼性種類峰以最長滯留時間溶離，且對峰面積進行定量並以佔所有峰面積之百分比計算其量。

在本文所闡述之各種實施例中，尺寸排阻層析法(SEC)可用於確定一組抗體或其抗原結合部分，例如維多珠單抗中存在之單體、高分子量(HMW)聚集體及低分子量(LMW)降解產物的相對量。SEC方法基於尺寸將抗體單體與HMW物質及LMW降解產物分離。可使用市售SEC管柱，使用適當緩衝液分析測試樣品及參考標準品。舉例而言，在一些實施例中，SEC分析可使用一個G3000 SWxl管柱(Tosoh Bioscience, King of Prussia, PA (USA))或串聯連接的兩個G3000 SWxl管柱及pH 6.8的等度磷酸鹽-氯化鈉緩衝系統執行。在280 nm下監測蛋白質種類之溶離。評估主要種類峰(單體)及總峰面積以確定純度。樣品之純度(%) (以單體%計算)、HMW聚集體%及/或LMW降解產物%均有報告。

必要時，可使用標準技術，藉由酶聯免疫吸附檢定(ELISA)量測抗體製劑中存在的殘留CHO宿主細胞蛋白質(HCP)雜質。設計用於此目的的許多ELISA套組係市售的，諸如來自Cygnus Technologies (Southport, NC (USA))的CHO HCP ELISA套組3G。可使用固定化多株抗CHO HCP抗體捕獲測試樣品中的宿主細胞蛋白質。接著，可使用適合偵測劑，例如該抗體之辣根過氧化物酶標記形式偵測捕獲之蛋白質。在該示例性實施例中，可使用過氧化物酶受質3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)，在450 nm下以比色方式量測所捕獲之過氧化物酶之量，該過氧化物酶之量與CHO HCP之濃度呈正比。HCP濃度可藉由與CHO HCP標準曲線，諸如測試套組中包括的標準曲線相比較來確定，並以佔抗體製劑中總蛋白質之量之百分比報告。IV. 下游加工及調配

抗α4β7抗體(例如維多珠單抗或具有對應於維多珠單抗之結合區的抗體)可自污染物可溶性蛋白質及多肽進一步純化，且以下程序係適合純化程序之示例，其可視情況單獨使用或與本文所提供之一或多種方法結合使用：親和層析，例如使用結合抗體Fc區之樹脂，諸如蛋白質A的親和層析；在離子交換管柱或樹脂，諸如陽離子交換層析(CEX)，例如SP-Sepharose^TM 或CM-Sepharose^TM 羥基磷灰石上進行之分級分離；陰離子交換層析(AEX)；疏水相互作用層析(HIC)；混合模式層析；乙醇沈澱；層析聚焦；硫酸銨沈澱；使用例如Sephadex G-75^TM 進行之凝膠過濾；超濾及/或滲濾，或前述的組合。純化方法之實例描述於Liu等人, mAbs, 2:480-499 (2010)中。在純化過程結束時，重組蛋白具有高純度，且適於人類治療用途，例如用於下文所述之醫藥抗體調配物中。純化後，高純度重組蛋白可經超濾/滲濾(UF/DF)製成適於人類投與之醫藥調配物。

滲濾及超濾後，抗體調配物可保留液體形式或凍乾成乾燥的抗體調配物。在一個態樣中，乾燥的凍乾抗體調配物係提供於單劑量小瓶中，其包含180 mg、240 mg、300 mg、360 mg、450 mg或600 mg抗α4β7抗體，且可用液體，諸如無菌水復原以供投與。在另一個態樣中，抗α4β7抗體，例如維多珠單抗，係呈在約2-8℃下儲存於容器，例如小瓶、注射器或藥筒中的穩定的液體醫藥組成物形式，直至將其投與有需要之個體。在一些實施例中，抗α4β7抗體的復原之凍乾調配物或穩定的液體醫藥組成物包含約0%至5.0%、0%至2%、≤2%、≤1%、≤0.6%或≤0.5%聚集體。

因此，在一些實施例中，本文提供一種復原的凍乾抗體調配物或穩定的液體醫藥組成物，其包含人類化抗α4β7抗體或其抗原結合部分。包含抗α4β7抗體，例如維多珠單抗之凍乾調配物的實例描述於美國專利第9,764,033號中，該案內容以引用之方式併入本文中。包含抗α4β7抗體，例如維多珠單抗之液體調配物的實例描述於美國專利第10,040,855號中，該案內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，抗α4β7抗體的復原之凍乾調配物或穩定的液體醫藥組成物包含約11%至16%、12%至15%、＜ 14%、＜ 13%、＜ 12%、或＜ 11%的鹼性同功型種類。在一些實施例中，抗α4β7抗體的復原之凍乾調配物或穩定的液體醫藥組成物包含65%至75%、66%至74%、67%至73%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、或至少70%的主要同功型。

純化的抗體，例如抗α4β7抗體(例如維多珠單抗或具有對應於維多珠單抗之結合區的抗體)可經濃縮以提供濃縮的蛋白質組成物，例如抗體濃度為至少100 mg/mL或125 mg/mL或150 mg/mL或濃度為約100 mg/mL或125 mg/mL或150 mg/mL之組成物。應當理解，濃縮的抗體產物可濃縮至濃縮條件下容許之水準，例如濃縮至多肽不再溶於溶液中之濃度。

在一些實施例中，本文獲得的組成物包含純化的抗α4β7抗體，例如維多珠單抗，且隨後經調配成供人類使用。在一個實施例中，將純化的抗體調配成乾燥的凍乾調配物，其可用液體，諸如無菌水復原以供投與。復原之調配物可藉由上述途徑之一，經非經腸注射投與。靜脈內注射可藉由輸注，諸如藉由用無菌等張鹽水、緩衝液如磷酸鹽緩衝鹽水或林格氏(乳酸或葡萄糖)溶液進一步稀釋來進行。在一些實施例中，將純化的抗體調配成液體調配物，由此藉由皮下注射投與例如約54 mg、108 mg或約165 mg或約216 mg劑量的抗α4β7抗體。

可用於儲存及冷凍本文所述之純化組成物的容器包括聚碳酸酯瓶(用於IV調配物)或PETG瓶(用於皮下調配物)。將該等調配物等分至瓶中後，可進行冷凍(例如 在-60℃或更低溫度下)。

以下實例舉例說明用於純化抗體的改進方法及組成物。以下實例1-5描述可用於獲得抗α4β7抗體，特別是維多珠單抗之純化組成物的各種方法及組成物。本文包括以下實例中所描述之方法，包括其中所述之各種參數。實例

以下實例描述了在使用CHO細胞作為表現系統之細胞培養物中產生的維多珠單抗之純化方法。實例 1 ：溶離緩衝液對使用蛋白質 A 樹脂純化維多珠單抗之影響

本實例展示使用蛋白質A樹脂之抗體純化方法，該等方法可用於製造治療性抗α4β7抗體，例如維多珠單抗。如本文所述，調節蛋白質A樹脂之溶離pH值使得純化的維多珠單抗組成物中聚集體之量減少。

藉由對基因工程改造成表現抗體之重組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(GS-CHO)進行細胞培養，產生維多珠單抗(關於一般細胞培養方法，參見Li等人(2010)mAbs , 2:5, 466-477)。

在CHO細胞中進行細胞培養後，使用蛋白質A親和管柱初步回收後，對維多珠單抗進行選擇性捕獲。使用重組蛋白質A樹脂進行親和層析，以自來源於上游初步回收程序的澄清收集物中選擇性移出抗體。該步驟亦移除製程相關雜質，諸如宿主細胞蛋白質(HCP)。

首先，用PBS平衡溶液(pH 7.2)平衡蛋白質A樹脂。接著，裝載澄清的收集物。進行三次洗滌。第1次洗滌係用與平衡溶液相同之PBS洗滌溶液(pH 7.2)進行；第2次洗滌係用含1M NaCl之PBS洗滌溶液(pH 7.2)進行；並且第3次洗滌係用與第1次洗滌(PBS)及用於平衡之溶液相同的洗滌溶液進行。洗滌用於自抗體洗去雜質，此時抗體仍結合至樹脂。接著，使用pH值在一定範圍內之溶離緩衝液自樹脂溶離抗體。如圖1中所述，測試pH值為3至3.5的溶離緩衝液。圖1中提供的結果顯示，隨著pH值增加，聚集體%降低。如圖1中所述，在pH 3下，自蛋白質A溶離維多珠單抗得到具有較高量之聚集體，亦即具有約1-1.2%聚集體之溶離液，而使用pH值較高，例如pH值為約3.5之溶離緩衝液，藉由溶離抗體而獲得的溶離液具有約0.6-0.85%的聚集體。

執行另一項研究，以鑑別與蛋白質A純化相關之製程參數，該等參數對維多珠單抗之產物品質具有重大影響。將來自重組表現維多珠單抗之GS-CHO細胞的澄清收集物裝載於MabSelect SuReLX樹脂(GE Healthcare, Pittsburgh, PA)上。將結合之抗體用PBS及檸檬酸鈉緩衝液洗滌，然後進行溶離。評價之溶離pH值在pH 3.3至pH 3.9的範圍內。使用檸檬酸鈉緩衝液進行溶離。溶離緩衝液pH值對純化的維多珠單抗組成物中聚集體量(HMW物質%)及HCP量之影響描述於表1及圖2中。

如表1中所述，線性回歸模型顯示，溶離pH值對所有檢定結果皆有顯著影響(p ＜ 0.05)。儘管關於LMW%和HCP之資料變化略大，但裝載量影響HCP清除率。裝載量及裝載流量之組合對LMW%具有較小影響。 ●單體 % ： 溶離pH值對單體%具有顯著影響(p ＜ 0.05)。並無其他輸入參數與單體%顯示出相關性。隨著溶離pH值升高，單體%增加。 ●HMW% ： 溶離pH值對HMW%具有顯著影響(p ＜ 0.05)。並無其他輸入參數與HMW%顯示出相關性。隨著溶離pH值升高，HMW%降低。 ●LMW% ： 溶離pH值、以及裝載量與裝載流量之組合會影響LMW% (p ＜ 0.05)，然而，輸入參數對LMW%之影響被認為是極小的。 ●HCP ： 溶離pH值及裝載量對HCP具有顯著影響，且二者以ppm及降低因子之對數表示(p ＜ 0.05)。表 1. 使用蛋白質A親和層析純化維多珠單抗–輸入參數評價

溶離 pH 值	單體 (%)	HMW (%)	LMW (%)	HCP (ppm)	HCP LRF
裝載材料	-	-	-	152590	-
3.34	97.55	1.61	0.84	113	3.13
3.34	97.38	1.76	0.86	88	3.24
3.34	97.35	1.81	0.84	101	3.18
3.34	97.26	1.93	0.81	179	2.93
3.34	97.36	1.83	0.80	85	3.25
3.34	97.38	1.81	0.82	94	3.21
3.34	97.27	1.88	0.85	139	3.04
3.34	97.22	1.95	0.83	108	3.15
3.60	97.65	1.57	0.78	105	3.16
3.60	97.31	1.88	0.81	122	3.10
3.95	98.67	0.62	0.72	168	2.96
3.95	98.78	0.42	0.79	115	3.12
3.95	98.74	0.47	0.79	157	2.99
3.95	98.92	0.38	0.71	217	2.85
3.95	98.60	0.60	0.80	185	2.92
3.95	98.60	0.62	0.78	116	3.12
3.95	98.45	0.71	0.84	123	3.09
3.95	98.55	0.66	0.79	207	2.87

維多珠單抗具有使其不同於其他IgG抗體之特有特性，例如高疏水性。圖3提供維多珠單抗與其他三種IgG抗體之比較，並提供當使用pH值遞增(pH值自左至右增加)之溶離緩衝液自陽離子交換管柱(Nuvia S; Bio Rad)溶離各抗體(維多珠單抗(MLN0002)、IgG A、IgG B或IgG C)時溶離液中所發現之聚集體的量(HMW%)。維多珠單抗清除聚集體之效能變化要高於其他三種測試IgG各自在最佳條件下之效能變化。因此，如在圖3中所觀察到的，在維多珠單抗之純化期間，pH值可影響聚集量。實例 2 ：使用疏水性 HIC 樹脂純化維多珠單抗

鑑於維多珠單抗具有疏水性，在下游純化期間減少HMW聚集體可具有挑戰性。此外，當在哺乳動物，例如CHO細胞中產生維多珠單抗時，最大程度地減少宿主細胞蛋白質(HCP)之量亦很重要。使用高通量方法，針對效能篩選HIC、混合模式以及陰離子交換樹脂及膜。隨後，在各種平衡、裝載及溶離條件下測試八種HIC樹脂各自在維多珠單抗純化中減少聚集及使HCP減至最少的能力。Toyopearl Hexyl-650C (Tosoh Biosciences)疏水性HIC樹脂係能夠展示可接受之聚集體清除率以及使HCP減至最少的唯一樹脂。更具體言之，在適合的結合條件(例如0.5 M(NH₄ )₂ SO₄ ，pH 6.7)下，Hexyl-650C使聚集量自約1.5% HMW聚集體降低至0.35%。測試的其他樹脂包括butyl-650M、butyl-600M、super butyl-55C、Phenyl-650M、phenyl-600M、PPG-600M及ether-650M，且無法達到如此低的聚集體量。

相較於測試的其他樹脂，包括ether、PPG、phenyl及butyl，Hexyl-650C係疏水性最強之樹脂。Hexyl-650C具有約1,000 A之平均孔徑及約100 µm之平均粒度。

利用Hexyl-650C，以結合/溶離及流通模式執行進一步實驗。對於結合/溶離實驗，Hexyl-650C能夠將聚集體減少至約0.30% HMW，但結合能力較低(約20 mg/ml樹脂)。相比之下，使用Hexyl-650C及維多珠單抗之流通模式既減少聚集體，又增加裝載能力。流通實驗係用108 mg/ml之初始未調整裝載量及含0.2M氯化鈉之10 mM磷酸鈉pH 6.7執行。流通實驗中之此等條件使HMW自1.39%減少至0.71%。增加鹽，包括用磷酸鉀代替氯化鈉，甚至進一步改善聚集體之減少。使用250 mM磷酸鉀、50 mM氯化鉀(用於平衡及裝載調整)以及67.5 mg/ml樹脂的減少之裝載量使聚集體自約0.72% HMW減少至約0.3% (且回收率為95.5%)。

執行基於管柱之實驗設計(DOE)研究，以進一步評價Hexyl-650C在流通模式下減少聚集體量以純化維多珠單抗的能力。如表2中所述，低HMW%及低HCP量(ppm)係使用低pH值及增加之磷酸鹽裝載/平衡條件獲得。表2中之實驗係使用60 mg/ml樹脂裝載量執行。低pH值條件均使HMW自1.0% HMW減少至小於或等於0.34%之值。抗體之平均回收率為約91.5%。高pH值加上高磷酸鉀看來會增加維多珠單抗主要種類與樹脂之親和力，使得回收率降低。相比之下，較高的磷酸鹽量及低pH值使得HMW清除率增加。在低磷酸鹽及低pH值下觀察到低HMW、低HCP及低殘留蛋白質A浸出(例如參見以下第12行)。因此，高疏水性HIC樹脂能夠成功地清除聚集體(HMW)維多珠單抗，達到低於0.5%之量。表 2. DOE設計與資料

操作 #	磷酸鉀 (M)	pH 值	回收率 (%)	HMW (%)	HCP (ppm)	殘留蛋白質 A (ppm)
1	0.30	5.9	99.11	0.33	0.178	0.135
2	0.30	7.2	68.13	0.44	0.199	0.157
3	0.30	6.7	103.52	0.45	0.299	0.185
4	0.30	6.7	103.64	0.41	0.297	0.171
5	0.25	6.7	93.41	0.44	0.299	0.171
6	0.20	5.9	93.08	0.33	0.289	0.105
7	0.25	6.7	96.34	0.43	0.300	0.178
8	0.20	6.7	93.97	0.52	0.267	0.195
9	0.20	6.7	83.05	0.53	0.269	0.191
10	0.20	7.2	102.80	0.51	0.291	0.182
11	0.30	5.9	91.25	0.31	0.094	0.135
12	0.20	5.9	91.05	0.34	0.081	0.085
13	0.20	7.2	96.85	0.56	0.263	0.218
14	0.30	7.2	73.86	0.38	0.093	0.149

實例 3 ：管柱裝載量、溶離緩衝液 pH 值及電導率對使用混合模式層析樹脂純化維多珠單抗的影響

產生表現高維多珠單抗抗體效價(≥ 5.0 g/L)之生產性CHO細胞株，由此需要開發一種純化方法，該方法係設計成適應大量此類高疏水性抗體。

Capto Adhere ImpRes係一種混合模式(MXM)層析樹脂，該樹脂在較小的珠粒尺寸上具有強陰離子交換、氫鍵結及疏水相互作用功能，從而允許改善雜質移除且提高容量。

以流通模式操作的Capto Adhere ImpRes混合模式樹脂能夠純化維多珠單抗，但產率及雜質移除量低於所希望的。使用Capto Adhere ImpRes以結合-溶離模式進行的預表徵實驗表明，步驟產率及/或雜質移除能力之顯著降低與以下三個製程輸入參數相關：樹脂裝載容量、溶離緩衝液pH值及溶離緩衝液電導率。本實例描述一項研究，該研究係設計用於進一步檢查此等參數之變化對用於純化維多珠單抗之Capto Adhere ImpRes之效能的影響及其對各種產物品質屬性之影響。材料與方法

經蛋白質A純化後，將澄清的細胞培養物收集物裝載至Capto Adhere ImpRes (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)層析管柱上。使用pH 7.8的磷酸鈉緩衝液洗滌混合模式樹脂，並如下文所述，在不同條件下自該管柱溶離抗體。

樣品立即提交SEC進行分析，在2-8℃下儲存，並在1週內加工。其餘檢定(CEX、CHO HCP ELISA)係使用冷凍保留液(-80℃)進行。分析方法列於下表3中，並在以下詳細描述。對在一系列操作後取樣之裝載材料進行分析，以確定該裝載材料之品質屬性未發生實質性變化。表 3. 分析方法

描述	所關注品質
藉由在280 nm下之UV吸光度(Solo VPE)測定之濃度	蛋白質濃度
尺寸排阻層析法	聚集體、片段
陽離子交換層析法	電荷變異體
CHO HCP ELISA	殘留的CHO HCP含量
pH量測值	裝載物或溶離液pH值
電導率量測值	裝載物或溶離液電導率

實驗設計

針對樹脂裝載量、溶離緩衝液pH值及溶離緩衝液電導率，在三個層面上利用全因子設計。在此等實驗中使用檸檬酸鈉溶離緩衝液。所得的實驗設計包括在三個中心點條件下進行之三十次操作。附加的中心點條件係表5中指明為DOE模式222的實驗設計之一部分。所有其他製程輸入參數均保持中心點條件。使用溶離緩衝液氯化鈉濃度設計實驗，且溶離緩衝液電導率量測值用作統計分析之輸入參數值。表4及表5分別描述該設計所研究之參數範圍及設計概述。表 4. 評價之參數範圍

參數	單位	評價之範圍	備註
蛋白質裝載量/樹脂體積	g/L	53 - 77	-
溶離緩衝液pH值	pH	3.8 - 4.4	-
溶離緩衝液電導率	mS/cm	19.7 – 28.9	NaCl濃度範圍160-240 mM

表 5 . 實驗設計

操作 #	DOE 模式	溶離緩衝液 pH 值	溶離緩衝液 [NaCl] (mM)	蛋白質裝載量 / 樹脂體積 (g/L)
1	311	4.4	160	53
2	112	3.8	160	65
3	223	4.1	200	77
4	313	4.4	160	77
5	122	3.8	200	65
6	222	4.1	200	65
7	113	3.8	160	77
8	232	4.1	240	65
9	131	3.8	240	53
10	212	4.1	160	65
11	332	4.4	240	65
12	323	4.4	200	77
13	331	4.4	240	53
14	312	4.4	160	65
15	000	4.1	200	65
16	333	4.4	240	77
17	121	3.8	200	53
18	000	4.1	200	65
19	322	4.4	200	65
20	231	4.1	240	53
21	000	4.1	200	65
22	111	3.8	160	53
23	221	4.1	200	53
24	123	3.8	200	77
25	211	4.1	160	53
26	133	3.8	240	77
27	321	4.4	200	53
28	213	4.1	160	77
29	132	3.8	240	65
30	233	4.1	240	77

DOE 模式 (3) ：高水準； (2) ：中等水準； (1) ：低水準； (0) ：每個輸入參數範圍之中心點。使用 NaCl 濃度作為輸入參數設計實驗，並使用實際電導率量測值進行統計分析。 計算 HMW清除率%  = (1-(溶離液HMW/裝載物HMW))*100

對數降低因子(LRF)如下確定：

[ 殘留_溶離液 ] 係溶離液中CHO HCP或蛋白質A之濃度，[ 殘留_裝載物 ] 係在相同操作之裝載物中CHO HCP或蛋白質A之濃度，兩種濃度均相對於相應的MLN0002濃度以ppm為單位。 統計分析

使用JMP 11統計軟體(SAS Institute, Cary, NC)分析該設計中指示所有實驗之檢定結果及KPI的產物品質。經由擬合至線性模型來分析每個反應，如等式1所示： 等式1   通用線性回歸模型

其中y_u 係在第 u次觀測時的反應， x _iu 係獨立變量，且各種β 項係模型係數估計。

在統計分析及建模中，將相對較小的數據集擬合至含有相對較大量潛在輸入的模型通常會導致過擬合。過擬合之標誌係具有高R² 值，而且具有幾個無科學意義(且不具統計顯著性)項的模型。為了確定最佳的統計顯著模型，同時避免過擬合，使用輸入參數及所關注反應之前向回歸來研發每個模型。回歸之停止規則係p值臨限值，其中若該模型之p值＜ 0.05，則將輸入參數併入該模型中。該分析算法生成之模型(i)達到可能的最高R² 值，(ii)包括盡可能少的輸入參數，並且(iii)描述經歷多峰層析加工之抗體在物理上可能的行為(即使該等發現看來與最初的技術期望不一致)。結果與討論

實驗結果描述於表6及7中，其中含有經由統計分析確定的每個反應之模型的參數估計值、相應p值及R² 值。表 6. 統計模型、預測表達式係數及p值之概述–過程效能

參數	回收率%	溶離液CV	溶離液pH 值	溶離液電導率(mS/cm)	溶離液濃度(g/L)
截距	210.3775 (p ＜ 0.0001)	-20.0321 (p ＜ 0.0001)	4.3495 (p ＜ 0.0001)	-21.1738 (p ＜ 0.0001)	117.7005 (p ＜ 0.0001)
溶離pH值	-29.6435 (p ＜ 0.0001)	5.3704(p ＜ 0.0001)	0.1184 (p=0.0278)	4.6490 (p ＜ 0.0001)	-25.4174 (p ＜ 0.0001)
溶離電導率(mS/cm)	-0.3489 (p=0.0189)	0.0992 (p ＜ 0.0001)	-0.0169 (p=0.0003)	1.0025 (p ＜ 0.0001)	-0.5757 (p ＜ 0.0001)
裝載量(g/L樹脂)	0.1528 (p=0.0021)	-	0.0027 (p=0.0462)	-	0.2422 (p＜0.0001)
(溶離pH值- 4.0998) * (裝載量，g/L樹脂-65)	0.4539 (p=0.0170)	-	-	-	-0.3724 (p=0.0112)
(溶離pH值-4.0998)*(溶離電導率，mS/cm-24.216)	-	-0.1184 (p=0.0098)	0.0711 (p=0.0001)	-	1.8872 (p=0.0001)
R2	0.930	0.986	0.642	0.973	0.955

表 7 . 統計模型、預測表達式係數及p值之概述—產物品質(SEC及CEX)

參數	SEC	CEX
HMW 清除率 %	HMW%	LMW%	單體 %	酸性種類 %	鹼性種類 %	主要種類 %
截距	-258.6155 (p ＜ 0.0001)	5.0702 (p ＜ 0.0001)	0.3877 (p=0.0055)	94.5375 (p ＜ 0.0001)	18.1046 (p ＜ 0.0001)	6.8334 (p ＜ 0.0001)	73.4677 (p ＜ 0.0001)
溶離pH值	72.4266 (p ＜ 0.0001)	-1.0151 (p ＜ 0.0001)	0.1533 (p ＜ 0.0001)	0.8675 (p ＜ 0.0001)	-1.1010 (p=0.0020)	1.3884 (p ＜ 0.0001)	-
溶離電導率(mS/cm)	0.9806 (p=0.0003)	-0.0163 (p ＜ 0.0001)	-	0.0145 (p=0.0005)	-	0.0758 (p=0.0012)	-0.0586 (p=0.0465)
裝載量(g/L樹脂)	-0.2668 (p=0.0016)	0.0039 (p=0.0015)	-0.0036 (p＜0.0001)	-	-	-	-
(溶離pH值- 4.0998) * (裝載量，g/L樹脂-65)	-	-	-0.0065 (p=0.0354)	-	-	-0.0671 (p=0.0182)	-
(溶離pH值-4.0998)*(溶離電導率，mS/cm-24.216)	-	0.0286 (p=0.0462)	-	-0.0323 (p=0.0341)	-	-	-
R2	0.962	0.962	0.684	0.940	0.293	0.680	0.134

溶離緩衝液的 pH 值及電導率對抗體產率之影響

溶離緩衝液pH值及溶離緩衝液電導率對維多珠單抗步驟回收率或產率之影響描述於圖4及圖5中。如圖4及圖5中所描述，觀察到的步驟回收率數據亦很好地擬合至線性回歸模型，如R² 值為0.930所指示。

圖4及圖5顯示Capto Adhere ImpRes步驟回收率與溶離緩衝液pH值及電導率或裝載量之關係圖。回收率明顯受溶離緩衝液pH值(p ＜ 0.0001)及樹脂裝載量(p=0.0021)影響且受溶離緩衝液電導率之影響較小(p=0.0189)。在任何水準之溶離緩衝液電導率及裝載量下，溶離緩衝液pH值為約4.40產生之步驟產率≤83.91% (操作1、4、11-14、16、19及27)。較低樹脂裝載量對回收率有負面影響。在樣品裝載後的洗滌步驟期間，在裝載量為77 g/L樹脂之所有操作中均觀察到突破(breakthrough)。裝載量之影響取決於溶離緩衝液pH值(p=0.0170)。在低溶離緩衝液pH值(亦即，pH 3.8)下，裝載量對回收率沒有實際影響，而隨著溶離緩衝液pH值升高，樹脂裝載量減少使得回收率降低(當溶離緩衝液pH值為約4.4時，在53 g/L樹脂下回收率為73.36-78.84%對比在77 g/L樹脂裝載量下回收率為81.94-83.91%)。根據實驗結果及模型預測，溶離緩衝液電導率對回收率的影響很小。當溶離緩衝液pH值為4.40，溶離緩衝液電導率為28.89 mS/cm及裝載量為53 g/L樹脂時，觀察到最低回收率為73.36% (操作13，該模型預測之回收率為76.22%)。

因此，如圖4及圖5中所描述，當混合模式層析樹脂與具有最佳pH值及電導率之溶離緩衝液一起使用時，維多珠單抗之產率增加。 溶離緩衝液 pH 值及電導率對 HMW 聚集體之影響

溶離緩衝液pH值及電導率對聚集體量之影響描述於圖6及圖7中，圖中顯示出輸入參數對HMW量之影響。

根據線性回歸模型(R² =0.962)，溶離液中HMW物質之量受溶離緩衝液pH值(p ＜ 0.0001)、溶離緩衝液電導率(p ＜ 0.0001)及裝載量(p=0.0015)影響。溶離pH值及電導率增加使溶離液中HMW物質之量減少，而裝載量增加使其量變高。該模型亦預測在溶離緩衝液pH值與電導率之間具有統計顯著(p=0.0462)的相互作用。

如下圖6及圖7中所述，在溶離緩衝液pH值為約3.80時觀察到約1%或更高的HMW物質含量。溶離pH值為3.80、溶離電導率為19.67 mS/cm (160 mM NaCl)及裝載量為65 g/L樹脂(操作2)產生1.23%之最高HMW含量(該模型預測含量為1.19%)。在相同溶離緩衝液條件下，在77 g/L下預測的最壞情況HMW含量為1.24%。

根據線性回歸模型，溶離緩衝液pH值(p ＜ 0.0001)、溶離緩衝液電導率(p=0.0003)及裝載量(p=0.0016)各自對HMW清除能力具有統計顯著影響。在本研究中評價之任何條件下，均達到一定程度之清除率(12.50-72.79%)。在該等輸入中，溶離pH值影響最大。溶離緩衝液pH值增加使HMW清除率改善，與其對回收率之影響相反。根據該模型，溶離緩衝液電導率增加及裝載量減少使HMW清除率增加。

因此，如圖6及圖7中所述，純化的維多珠單抗組成物中聚集體之量(HMW物質%)可藉由選擇用於自混合模式層析樹脂溶離抗體的溶離緩衝液pH值及溶離緩衝液電導率進行調節。此外，當混合模式層析樹脂與具有較高pH值及/或較高電導率之溶離緩衝液一起使用時，可降低聚集體之量。實例 4 ：溶離緩衝液對使用陽離子交換 (CEX) 樹脂純化維多珠單抗之影響

陽離子交換(CEX)層析法亦被開發作為進一步降低維多珠單抗製劑中聚集體之量的手段。本文描述的研究致力於將使用Nuvia HR-S樹脂(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)之CEX層析法適於純化維多珠單抗，特別是旨在降低該疏水性抗體中之聚集體量。對以結合/溶離模式操作之CEX程序的溶離條件進行評估。採用實驗設計(DoE)方法評價包括溶離緩衝液pH值及溶離緩衝液電導率在內之若干參數對製程輸出之影響。材料與方法

本研究中使用的裝載材料及分析方法與以上實例3中所描述的類似。 實驗設計

初始篩選研究及初步風險評估確定，當樹脂以結合/溶離模式操作時，溶離緩衝液pH值及溶離緩衝液電導率對Nuvia HR-S製程效能輸出(PPO)具有已知或潛在影響。本研究旨在表徵該等製程參數之影響。研究參數範圍及實驗設計分別列於表8及表9中。藉由調節氯化鈉(NaCl)之濃度來改變溶離緩衝液之電導率，且所評價之NaCl範圍提供於表8中。表 8 . 研究製程參數

參數	評價之範圍
裝載量	30 – 65 g mAb/L樹脂
溶離緩衝液pH值	5.1 – 5.7
溶離緩衝液電導率	10.59 –16.08 mS/cm
溶離緩衝液[NaCl]	70 – 110 mM

表 9 . 實驗設計

操作 #	溶離緩衝液 pH 值	溶離緩衝液 [NaCl] (mM)	裝載量 (g mAb/L 樹脂 )
1	5.1	90	65
2	5.4	90	47.5
3	5.4	90	47.5
4	5.1	70	47.5
5	5.1	110	47.5
6	5.4	110	65
7	5.4	90	47.5
8	5.4	90	65
9	5.7	110	30
10	5.1	70	30
11	5.4	70	47.5
12	5.4	90	30
13	5.4	70	30
14	5.7	70	65
15	5.7	90	65
16	5.1	90	30
17	5.7	70	47.5
18	5.4	70	65
19	5.1	70	65
20	5.7	110	65
21	5.7	90	47.5
22	5.7	90	30
23	5.7	70	30
24	5.7	110	47.5
25	5.1	90	47.5
26	5.4	110	30
27	5.1	110	65
28	5.4	110	47.5
29	5.1	110	30
30	5.2	90	30
31	5.2	70	47.5
32	5.2	70	30
33	5.2	90	65
34	5.2	70	65
35	5.2	90	47.5
36	5.6	80	38.75
37	5.6	80	56.25
38	5.6	100	38.75
39	5.6	100	56.25
40	5.54	92	65
41	5.5	92	65
42	5.6	92	65

結果與討論

溶離緩衝液pH值及溶離緩衝液電導率對Nuvia HR-S製程效能輸出(PPO)之影響描述於圖8-13中。 溶離緩衝液 pH 值及電導率對 HMW 聚集體之影響

溶離緩衝液pH值及電導率對聚集體量之影響描述於圖8-10中，圖中顯示出輸入參數對HMW量之影響。

如圖8-10中所述，溶離液HMW、單體及LMW之變化分別為0.01%至0.88%、98.33%至99.27%及0.62%至1.35%。HMW模型除含有溶離緩衝液pH值及電導率之相互作用項外，還對兩個參數具有較強的線性依賴性。模型表面(如圖8中所示)表明，在溶離緩衝液pH值及電導率值極低的情況下，HMW最低，而在溶離緩衝液pH值及電導率值極高的情況下，HMW最高。

確定每次操作之HMW清除率，以說明在整個研究中裝載材料HMW含量之變化。與溶離液HMW一樣，在整個研究中HMW清除率差異很大(-30.65%至98.61%)，且HMW清除率模型含有溶離緩衝液pH值及電導率之線性項及相互作用項。圖9顯示出模型表現：雖然在降低之溶離緩衝液pH值及電導率條件下獲得最高的HMW清除率值，但許多測試條件展示 ＞70%之HMW清除率。然而，所報告之操作9、20及24之負HMW清除率值(分別為-1.18%、-20.55%及-30.65%)指示，在所評價的多種條件下觀察到聚集體移除量之顯著變化，且有一些條件可能會產生而不是移除聚集體物質。

操作40至42採用Capto Adhere ImpRes溶離液作為裝載材料，其聚集體含量高於在中心點條件下CEX加工期間裝載材料中典型地使用的聚集體含量。HMW及HMW清除率模型表明，增加溶離緩衝液pH值及電導率產生HMW含量增加之溶離液。選擇用於操作40至42之條件旨在使用CEX裝載材料之「最壞情況」聚集體量探測可能的溶離條件。對於溶離緩衝液pH值為5.50及5.54且溶離緩衝液電導率為13.40 mS/cm而言，所得溶離液之HMW係0.31%至 0.34%。然而，當採用pH 5.60之溶離緩衝液(而電導率保持不變)時，溶離液HMW增加至0.59%。在該聚集體量下，進一步加工將有不滿足維多珠單抗關於HMW之接受標準的風險。

已發現，LMW隨著溶離緩衝液pH值或溶離緩衝液電導率增加而線性地降低。該模型亦含有溶離緩衝液pH值/溶離緩衝液電導率、溶離緩衝液pH值/裝載量及溶離緩衝液電導率/裝載量之相互作用項。與關於HMW之模型中相同，單體模型對呈線性項及相互作用項形式之溶離緩衝液pH值及電導率有很強的依賴性。模型表面(在圖10中顯示為鞍型函數)表明，在溶離緩衝液pH值與電導率之組合極高條件下，獲得最少的單體。

因此，如圖8-10中所述，溶離緩衝液pH值及電導率可用於調節使用CEX樹脂純化的包含維多珠單抗之組成物中聚集體之量(HMW物質%)。此外，如圖8-10中所示，當CEX樹脂與pH值較低及/或電導率較低之溶離緩衝液一起使用時，可減少純化的維多珠單抗組成物中聚集體之量。 溶離緩衝液 pH 值及電導率對鹼性同功型種類之影響

溶離緩衝液pH值及電導率對鹼性同功型種類之量的影響描述於圖11-13中，圖中顯示輸入參數對酸性、主要及鹼性同功型種類之含量的影響。

如圖11-13中所述，酸性、主要及鹼性含量結果之範圍分別自12.49%至30.27%、64.32%至73.82%及5.42%至18.04%。除全部三個參數之相互作用項外，酸性含量模型亦含有溶離緩衝液pH值、溶離緩衝液電導率及裝載量之線性項。溶離緩衝液pH值及溶離緩衝液電導率對酸性含量之影響最大。在圖11中之模型表面可看出，在溶離緩衝液pH值及電導率之極低值組合下操作時，酸性含量最高。

所開發的關於主要同功型含量之模型含有溶離緩衝液pH值、溶離緩衝液電導率與裝載量之間的相互作用項，其中溶離緩衝液pH值/溶離緩衝液電導率相互作用對模型表現的影響最大。如圖12中所示，在最高溶離緩衝液電導率及最低溶離緩衝液pH值相結合之條件下，獲得最高主要同功型含量；在極低溶離緩衝液pH值及電導率值相結合下，預測到最低的主要同功型含量。

溶離緩衝液pH值、溶離緩衝液電導率及裝載量之線性項對溶離液鹼性同功型含量的影響最大；相互作用項顯示出極小的貢獻。在圖13中之模型表面可看出，鹼性同功型含量因應於溶離緩衝液pH值及溶離緩衝液電導率之增加而增加。

因此，如圖11-13中所述，溶離緩衝液pH值及電導率可用於調節使用CEX樹脂純化的包含維多珠單抗之組成物中帶電荷同功型之分佈。如圖11中所示，當CEX樹脂與pH值增加及/或電導率增加之溶離緩衝液一起使用時，可減少純化的維多珠單抗組成物中酸性同功型種類之量。此外，如圖13中所示，當CEX樹脂與pH值減小及/或電導率減小之溶離緩衝液一起使用時，可減少純化的維多珠單抗組成物中鹼性同功型種類之量。實例 5 ：產物品質屬性之確定

以下分析檢定及方法用於前述實例中以確定維多珠單抗之產物品質屬性。

陽離子交換層析法(CEX)根據總表面電荷對維多珠單抗抗體種類(主要同功型、鹼性種類及酸性種類)進行分級分離。在使用移動相稀釋至低離子強度後，將測試樣品注射至在10 mM磷酸鈉pH 6.6中平衡之Dionex Pro-Pac^TM WCX-10管柱(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA (USA))上，並在相同緩衝液中使用氯化鈉梯度進行溶離。在280 nm下監測蛋白質溶離，並將各峰指定為酸性種類、鹼性種類或主要同功型類別。主要同功型百分比、酸性種類百分比之總和及鹼性種類百分比之總和均有報告。將樣品主要同功型之滯留時間與參考標準品之滯留時間相比較以確定一致性。

使用尺寸排阻層析法(SEC)確定維多珠單抗之純度。使用串聯連接的兩個G3000 SWxl管柱(Tosoh Bioscience, King of Prussia, PA (USA))及pH 6.8的等度磷酸鹽-氯化鈉緩衝系統分析參考標準品及測試樣品(75 µg)。該方法使得抗體單體與高分子量(HMW)物質以及低分子量(LMW)降解產物得以分離。在280 nm下監測蛋白質種類之溶離。評估主要種類峰(單體)及總峰面積以確定純度。樣品之純度(%) (以單體%計算)及聚集體%均有報告。 序列表

SEQ ID NO ：	描述	序列
1	重鏈(HC)可變區(胺基酸)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKGSGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEIDPSESNTNYNQKFKGRVTLTVDISASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYDGWDYAIDYWGQGTLVTVSS
2	HC CDR1 (胺基酸)	SYWMH
3	HC CDR2 (胺基酸)	EIDPSESNTNYNQKFKG
4	HC CDR3 (胺基酸)	GGYDGWDYAIDY
5	輕鏈(LC)可變區(胺基酸)	DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLAKSYGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHQPYTFGQGTKVEIK
6	LC CDR1 (胺基酸)	RSSQSLAKSYGNTYLS
7	LC CDR2 (胺基酸)	GISNRFS
8	LC CDR3 (胺基酸)	LQGTHQPYT
9	重鏈胺基酸序列	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKGSGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEIDPSESNTNYNQKFKGRVTLTVDISASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYDGWDYAIDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
10	輕鏈胺基酸序列	DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLAKSYGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHQPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

圖 1 描繪聚集體隨蛋白質A溶離液pH值之變化。圖 2 係描繪預測剖析圖檢定之結果，針對效能輸出進行篩選的圖。圖 3 以圖形方式描繪維多珠單抗與三種其他IgG抗體之比較以及用於自陽離子交換管柱溶離每種抗體的pH特性。圖 4 係描繪Capto Adhere ImpRes步驟回收率隨溶離緩衝液pH值及電導率變化的線性回歸模型表面圖。圖 5 係描繪Capto Adhere ImpRes步驟回收率隨溶離緩衝液pH值及裝載量變化的線性回歸模型表面圖。圖 6 係描繪Capto Adhere ImpRes之HMW物質%隨溶離緩衝液pH值及電導率變化的線性回歸模型表面圖。圖 7 係描繪Capto Adhere ImpRes之HMW物質%隨溶離緩衝液pH值及裝載量變化的線性回歸模型表面圖。圖 8 係描繪溶離緩衝液pH值及溶離緩衝液電導率對HMW物質%之影響的HMW表面圖。圖 9 係描繪溶離緩衝液pH值及溶離緩衝液電導率對HMW清除率之影響的HMW清除率表面圖。圖 10 係描繪溶離緩衝液pH值及溶離緩衝液電導率對單體物質%之影響的單體表面圖。圖 11 係描繪溶離緩衝液pH值及溶離緩衝液電導率對酸性同功型種類%之影響的酸性種類表面圖。圖 12 係描繪溶離緩衝液pH值及溶離緩衝液電導率對主要同功型種類%之影響的主要表面圖。圖 13 係描繪溶離緩衝液pH值及溶離緩衝液電導率對鹼性同功型種類%之影響的鹼性種類表面圖。

Claims (71)

1. 一種用於自包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液獲得包含該抗α4β7抗體之組成物的方法，該方法包括 使包含蛋白質A之基質與該包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液接觸，由此使該抗α4β7抗體結合至該蛋白質A； 用洗滌溶液洗滌該包含蛋白質A之基質；及 藉由使該包含蛋白質A之基質與pH值為3.2至4之溶離溶液接觸，自該基質溶離該抗α4β7抗體，由此獲得包含該抗α4β7抗體之組成物， 其中該抗α4β7抗體係人類化抗體，為IgG1抗體，包括含如SEQ ID NO: 4中所示之CDR3域、如SEQ ID NO: 3中所示之CDR2域及如SEQ ID NO: 2中所示之CDR1域的重鏈可變區；且包括含如SEQ ID NO: 8中所示之CDR3域、如SEQ ID NO: 7中所示之CDR2域及如SEQ ID NO: 6中所示之CDR1域的輕鏈可變區。
2. 如請求項1之方法，其中該包含該抗α4β7抗體之組成物包含小於1%之高分子量(HMW)聚集體。
3. 如請求項1或2之方法，其中該蛋白質A係固定於固相上。
4. 如請求項3之方法，其中該固相包含珠粒、凝膠及樹脂中之一或多種。
5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該洗滌溶液之pH值係约7。
6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該溶離溶液包含檸檬酸。
7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該溶離溶液之pH值係3.2至3.7或3.3至3.8。
8. 一種用於自包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液獲得包含抗α4β7抗體之組成物的方法，該方法包括 使包含抗α4β7抗體及至少一種雜質之溶液與疏水相互作用層析(HIC)樹脂在允許該抗α4β7抗體流動通過該HIC樹脂之條件下接觸，由此獲得包含該抗α4β7抗體之組成物， 其中該HIC樹脂係表徵為高疏水性HIC樹脂， 其中該抗α4β7抗體係人類化抗體，為IgG1抗體，包括含如SEQ ID NO: 4中所示之CDR3域、如SEQ ID NO: 3中所示之CDR2域及如SEQ ID NO: 2中所示之CDR1域的重鏈可變區；且包括含如SEQ ID NO: 8中所示之CDR3域、如SEQ ID NO: 7中所示之CDR2域及如SEQ ID NO: 6中所示之CDR1域的輕鏈可變區。
9. 如請求項8之方法，其中該包含該抗α4β7抗體之組成物包含小於0.6%之HMW聚集體。
10. 如請求項8或9之方法，其中該HIC樹脂用pH值小於約7.2之磷酸鹽緩衝液平衡。
11. 如請求項10之方法，其中該磷酸鹽緩衝液包含約0.35 M至約0.15 M磷酸鉀。
12. 如請求項8至11中任一項之方法，其中該樹脂之裝載量係約55至75 mg/ml。
13. 如請求項8至12中任一項之方法，其中該組成物包含小於約0.22 ppm之殘留蛋白質A。
14. 如請求項8至13中任一項之方法，其中該組成物含有小於約0.3 ppm之宿主細胞蛋白質(HCP)。
15. 如請求項8至14中任一項之方法，其中該高疏水性HIC樹脂的平均孔徑為約50至150 µm。
16. 如請求項8至14中任一項之方法，其中該高疏水性HIC樹脂的平均孔徑為約100 nm及/或孔徑為約100 µm。
17. 一種用於自包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液製造包含該抗α4β7抗體之組成物的方法，該方法包括 使該包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液與混合模式層析樹脂接觸，由此使該抗α4β7抗體結合至該樹脂； 用洗滌溶液洗滌該混合模式層析樹脂；及 藉由使該混合模式層析樹脂與pH值等於或高於pH 3.9之溶離溶液接觸，自該樹脂溶離該抗α4β7抗體，由此獲得包含該抗α4β7抗體之組成物， 其中該抗α4β7抗體包含SEQ ID NO:1中所示之重鏈可變區及SEQ ID NO:2中所示之輕鏈可變區。
18. 如請求項17之方法，其中該包含該抗α4β7抗體之組成物包含小於1%之HMW聚集體。
19. 如請求項17或18之方法，其中該溶離溶液之pH值等於或高於pH 4.1。
20. 如請求項17至19中任一項之方法，其中該溶離溶液之pH值為約pH 3.9至約pH 4.4。
21. 如請求項17至20中任一項之方法，其中該溶離溶液之電導率為30 mS/cm或更低。
22. 如請求項21之方法，其中該溶離溶液之電導率為約20 mS/cm至約30 mS/cm。
23. 如請求項17至22中任一項之方法，其中該溶離溶液包含濃度為約160 mM至約240 mM之NaCl。
24. 如請求項17至23中任一項之方法，其中該混合模式層析樹脂係Capto Adhere ImpRes。
25. 如請求項17至24中任一項之方法，其中該方法進一步包括使用陽離子交換(CEX)樹脂純化該抗α4β7抗體。
26. 如請求項25之方法，其中該CEX樹脂係以結合/溶離模式操作。
27. 一種用於自包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液製造包含抗α4β7抗體之組成物的方法，該方法包括 使該包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液與混合模式層析樹脂接觸，由此使該抗α4β7抗體結合至該樹脂； 用洗滌溶液洗滌該混合模式層析樹脂；及 藉由使該混合模式層析樹脂與pH值等於或低於pH 4.2且電導率等於或低於28 mS/cm之溶離溶液接觸，自該樹脂溶離該抗α4β7抗體，由此獲得包含該抗α4β7抗體之組成物， 其中該抗α4β7抗體包含SEQ ID NO:1中所示之重鏈可變區及SEQ ID NO:2中所示之輕鏈可變區。
28. 如請求項27之方法，其中相對於使用pH值高於pH 4.2及/或對照電導率高於28 mS/cm之對照溶離溶液以類似方式獲得的包含抗α4β7抗體之對照組成物，該組成物包含產率增加之該抗α4β7抗體。
29. 如請求項27或28之方法，其中該溶離溶液之pH值等於或低於4.0。
30. 如請求項27或28之方法，其中該溶離溶液之pH值為約pH 4.2至約pH 3.8。
31. 如請求項27至30中任一項之方法，其中該溶離溶液之電導率為約18 mS/cm至約28 mS/cm。
32. 如請求項27至31中任一項之方法，其中該溶離溶液包含濃度為約160 mM至約240 mM之NaCl。
33. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該混合模式層析樹脂與每公升樹脂至少55 g該抗α4β7抗體接觸。
34. 如請求項33之方法，其中該混合模式層析樹脂與每公升樹脂約55 g至約80 g該抗α4β7抗體接觸。
35. 如請求項27至34中任一項之方法，其中該混合模式層析樹脂在較小的珠粒尺寸上具有強陰離子交換、氫鍵結及疏水相互作用功能，視情況其中該混合模式層析樹脂係Capto Adhere ImpRes。
36. 如請求項27至35中任一項之方法，其中該方法進一步包括使用陽離子交換(CEX)樹脂純化該抗α4β7抗體。
37. 如請求項36之方法，其中該CEX樹脂係以結合/溶離模式操作。
38. 一種用於自包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液製造包含抗α4β7抗體之組成物的方法，該方法包括 使該包含抗α4β7抗體及一或多種雜質之液體溶液與陽離子交換(CEX)樹脂接觸，由此使該抗α4β7抗體結合至該樹脂； 用洗滌溶液洗滌該CEX樹脂；及 藉由使該CEX樹脂與電導率等於或低於16 mS/cm之溶離溶液接觸，自該樹脂溶離該抗α4β7抗體，由此獲得包含該抗α4β7抗體之組成物， 其中該抗α4β7抗體包含SEQ ID NO:1中所示之重鏈可變區及SEQ ID NO:2中所示之輕鏈可變區。
39. 如請求項38之方法，其中該包含該抗α4β7抗體之組成物包含約1%或更低之HMW聚集體。
40. 如請求項38或39之方法，其中該溶離溶液之電導率等於或低於14 mS/cm。
41. 如請求項38或39之方法，其中該溶離溶液之電導率為約11-16 mS/cm。
42. 如請求項38或39之方法，其中該溶離溶液之電導率為約12-14 mS/cm。
43. 如請求項38至42中任一項之方法，其中該溶離溶液包含濃度為約70 mM至約110 mM之NaCl。
44. 如請求項38至43中任一項之方法，其中該溶離溶液之pH值為約pH 5至約pH 6。
45. 如請求項44之方法，其中該溶離溶液之pH值為約pH 5.1至約pH 5.8。
46. 如請求項38至45中任一項之方法，其中該抗α4β7抗體係以每公升樹脂約25-70 g抗體之濃度裝載於該CEX樹脂上。
47. 如請求項38至46中任一項之方法，其中該抗α4β7抗體係以每公升樹脂約30-60 g抗體之濃度裝載於該CEX樹脂上。
48. 如請求項38至47中任一項之方法，其中該CEX树脂係強CEX樹脂，視情況其中該CEX樹脂係Nuvia HR-S。
49. 如請求項38至48中任一項之方法，其中該方法進一步包括使用混合模式層析樹脂純化該抗α4β7抗體。
50. 如請求項49之方法，其中該混合模式層析樹脂係以結合/溶離模式操作。
51. 一種用於自包含抗α4β7抗體之主要同功型及一或多種鹼性同功型種類之液體溶液製造包含抗α4β7抗體之組成物的方法，該方法包括 使該包含抗α4β7抗體及一或多種鹼性同功型種類之液體溶液與陽離子交換(CEX)樹脂接觸，由此使該抗α4β7抗體結合至該樹脂； 用洗滌溶液洗滌該CEX樹脂；及 藉由使該CEX樹脂與電導率等於或高於11 mS/cm之溶離溶液接觸，自該樹脂溶離該抗α4β7抗體，由此獲得包含該抗α4β7抗體之組成物， 其中該抗α4β7抗體包含SEQ ID NO:1中所示之重鏈可變區及SEQ ID NO:2中所示之輕鏈可變區。
52. 如請求項51之方法，其中該包含該抗α4β7抗體之組成物包含約4%至約20%之鹼性同功型。
53. 如請求項51或52之方法，其中該溶離溶液之電導率等於或高於12 mS/cm。
54. 如請求項51或52之方法，其中該溶離溶液之電導率為約11-16 mS/cm。
55. 如請求項51或52之方法，其中該溶離溶液之電導率為約12-14 mS/cm。
56. 如請求項51至55中任一項之方法，其中該溶離溶液之pH值為約pH 5至約pH 6。
57. 如請求項56之方法，其中該溶離溶液之pH值為約pH 5.1至約pH 5.8。
58. 如請求項51至57中任一項之方法，其中該抗α4β7抗體係以每公升樹脂約25-70 g抗體之濃度裝載於該CEX樹脂上。
59. 如請求項58之方法，其中該抗α4β7抗體係以每公升樹脂約30-60 g抗體之濃度裝載於該CEX樹脂上。
60. 如請求項51至59中任一項之方法，其中該CEX樹脂係Nuvia HR-S。
61. 如請求項51至60中任一項之方法，其中該方法進一步包括使用混合模式層析樹脂純化該抗α4β7抗體。
62. 如請求項61之方法，其中該混合模式層析樹脂係以結合/溶離模式操作。
63. 如請求項1至62中任一項之方法，其中該抗體係在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生。
64. 如請求項63之方法，其中該宿主細胞係GS-CHO細胞。
65. 如請求項1至64中任一項之方法，其中所獲得的組成物包含純化之抗α4β7抗體，且其中該方法進一步包括將該抗α4β7抗體調配成適於人類使用之調配物的後續步驟。
66. 如請求項1至65中任一項之方法，其中該方法包括將該純化之抗α4β7抗體調配成乾燥、凍乾之調配物。
67. 如請求項66之方法，其中該方法進一步包括用液體使該乾燥、凍乾之調配物復原，由此使其適於投與。
68. 如請求項1至65中任一項之方法，其中該方法包括將純化之抗α4β7抗體調配成液體調配物，由此使該抗α4β7抗體適於藉由皮下注射投與。
69. 如請求項1至68中任一項之方法，其中該抗α4β7抗體包含如SEQ ID NO: 1中所示之重鏈可變區序列及如SEQ ID NO: 5中所示之輕鏈可變區序列。
70. 如請求項1至68中任一項之方法，其中該抗α4β7抗體係維多珠單抗(vedolizumab)。
71. 一種組成物，其包含抗α4β7抗體，其中該組成物可藉由如請求項1至70中任一項之方法獲得。

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