CN105555310A - 一种提高蛋白血清半衰期的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

对特异性结合转铁蛋白的新抗体，如单域抗体(sdAbs)，或其片段进行了描述。对结合人转铁蛋白的抗体或片段用于增加靶蛋白在血清的半衰期的组合物，方法和系统进行描述。

Description

一种提高蛋白血清半衰期的组合物和方法
发明背景
候选药物的药代动力学是一个关键参数，经常在很大程度上决定是否候选药物将被进一步发展成药物，或用于治疗性应用。针对蛋白质类或多肽类药物，包括抗体的药代动力学研究已经表明，这样的治疗剂具有完全不同的血清半衰期。那些多肽类和蛋白质类药物一般具有短的血清半衰期，尽管可能具有治疗潜力，但往往不适合进一步的药物开发。例如，白蛋白和γ‐免疫球蛋白(IgG)已知具有的长达20天[1]的血清半衰期。此外，其他的IgG的Fc结构域可以被工程化以改变它们与新生儿Fc受体的结合相互作用，达到延长血清半衰期的方法[2]。然而，许多其他天然人蛋白质，如胰岛素，抗体片段，例如抗原结合片段(Fab的)或单链可变片段(scFv)，以及短肽通常具有更短的血清半衰期，从数分钟到大约只需1小时。因此，一种高效，低廉和安全的延长蛋白质和多肽这些分子血清半衰期的方法对于这类分子成为治疗性药物、诊断工具等是至关重要的。
目前已经有几种策略被开发用于延长蛋白质和其他肽分子较短的半衰期，以避免治疗或诊断的蛋白质因半衰期短被从体内清除。这几个用于促进蛋白质和多肽分子的血清半衰期延长的技术，包括化学修饰，如聚乙二醇(即PEG化)[3]，融合抗体Fc区[4]，或者是和天然具有长血清半衰期的蛋白质进行融合，如白蛋白[5]。不幸的是，这些技术遭受易引起并发症，复杂的制造和鉴定工艺，低表达水平，可能产生的不希望的分子功能等问题的困扰。
最近一种采用使用抗血清蛋白抗体片段延长蛋白质和其它肽分子的血清半衰期的方法被开发出来。白蛋白，主要是由于它的高血清浓度和长血清半衰期，一直是最适合选定用于此目的。抗人白蛋白单域抗体在和IFN‐α2b两个分子在基因水平融合，表达为融合蛋白后可延长血清半衰期。[6,7]。新生成的融合蛋白分子的血清半衰期是不仅长于IFN‐α2B，但即使长于白蛋白的融合蛋白和IFN‐α2B。
骆驼重链抗体(HCAbs)的重链可变结构域，也称为VHH或单域抗体(sdAb也被开发用于这一目的。例如，针对人白蛋白一个sdAb被证明将抗TNFα的sdAb片段的血清半衰期，从不到一小时延长至两天以上[8]。
另一种具有长半衰期的血清蛋白是转铁蛋白。转铁蛋白是血浆糖蛋白，其传送铁离子和具有约3克/升的血清浓度和7‐8天的血清半衰期。因此，转铁蛋白是一种理想的融合蛋白，用于延长药代动力学不令人满意的肽分子的血清半衰期。有研究表明，和转铁蛋白融合显著延长胰高血糖素样肽1(GLP1)[9]和乙酰胆碱受体[10]的血清半衰期。
然而，使用抗体和抗体片段，如抗转铁蛋白sdAbs，用于增加蛋白类分子的血清半衰期还未见报道。新的用于增加蛋白质的血清半寿期和用于生产具有改进的血清半衰期的蛋白质的方法，高效率，成本优越，高产率将有利于新的蛋白质为基础的药物或者诊断试剂的开发。本发明实例将涉及这样的方法。
发明简述
本发明涉及针对转铁蛋白抗体，并且特指针对转铁蛋白的单域抗体(sdAbs)。本发明还涉及使用特异性结合转铁蛋白的抗体，在转铁蛋白存在下增加靶蛋白的半衰期的方法；包含在转铁蛋白存在下增加半衰期的靶蛋白的新型融合蛋白；在特异性结合转铁蛋白的抗体或者融合蛋白的组合物。
在总的方面，本发明涉及一个分离的抗体或其片段特异性结合转铁蛋白，该抗体或片段，其包含一种或多种选自下组中选择：
(a)一种互补决定区(CDR)1，其包括下列之一的氨基酸序列GSGFGINGVI(SEQIDNO：1)；GSGFGVNGVI(SEQIDNO：2)；GNVFTIAAMG(SEQIDNO：3)；GNVFTIAAMA(SEQIDNO：4)；GNVFTIDAMG(SEQIDNO：5)；GSVFSIDAMG(SEQIDNO：6)；GNVFGIDAVG(SEQIDNO：7)；GSIFSIKVMG(SEQIDNO：8)；和GSIFPLNDMG(SEQIDNO：9)；
(b)一种互补决定区(CDR)2，其包括下列之一的氨基酸序列LIKSDGYTNYRESVKG(SEQIDNO：10)；LIKSDGYTNYRESVRG(SEQIDNO：11)；GITTGGSTNYADSVKG(SEQIDNO：12)；GMTNGGKTNYADSVKG(SEQIDNO：13)；AMTNAGSTNYADSVKG(SEQIDNO：14)；ATTTSGSSTNYADSVKG(SEQIDNO：15)；DITSGGSTDYSDSVKG(SEQIDNO：16)；和TITRGGTTNYADSVKG(SEQIDNO：17)；和
(c)一种互补决定区(CDR)3，其包括下列之一的氨基酸序列PGVP(SEQIDNO：18)；VTKWAARVGGSAEYE(SEQIDNO：19)；RSKLIATINNPYDY(SEQIDNO：20)；RSKLIARINNPYEY(SEQIDNO：21)；RPKQATLIRDDY(SEQIDNO：22)；DLGCSGAGSCPDY(SEQIDNO：23)；和DNRVGGSY(SEQIDNO：24)。
抗体或其片段最好是单域抗体，更好地是抗体或抗体片段，其是含sdAbA60219的：QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGSGFGINGVIWYRQAPGKQRELVALIKSDGYTNYRESVKGRFTISRDDAKNTVWLQMNALEPEDTGVYYCKTPGVPFGQGTQVTVSS(SEQIDNO：26)；A60401:QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCEASGNVFTIAAMGWFRQAPGKERELVAGITTGGSTNYADSVKGRFTISRDNAQNTMYLQMNSLRPEDTAAYSCNAVTKWAARVGGSAEYEYWGQGTQVTVSS(SEQIDNO：28)；A69449：QVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCVASGSVFSIDAMGWYRQAPGNQRELVAAMTNAGSTNYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNARSKLIARINNPYEYWGQGTQVTVSS(SEQIDNO：56)；A69433：QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGNVFGIDAVGWYRQAPGKQRELVAATTTSGSSTNYADSVKGRFTISRDIAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCYARPKQATLIRDDYWGQGTQVTVSS(SEQIDNO：58)；或A69447：QVKLEESGGGSVQAGGSLRLSCTGSGSIFPLNDMGWYRQAPGKQRELVATITRGGTTNYADSVKGRFTISRDSNAKNTVYLQMNSLKVEDTAVYYCNMDNRVGGSYWGQGTQVTVSS(SEQIDNO：62)的氨基酸序列。
本发明还涉及到一个融合蛋白包含本发明实施例的抗体或其片段，一个靶蛋白，和一个随意的linker，其中抗体或其片段可融合到目标蛋白质的羧基末端或氨基末端，linker也随意地分割抗体和靶蛋白。
本发明还涉及一种核酸分子，其包含本发明实施例抗体或其片段编码cDNA或合成的DNA，或者本发明实施例的融合蛋白的核酸编码序列，相关表达载体和宿主细胞。
在另一个方面，本发明涉及一种提高靶蛋白的半衰期的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
(1)获得融合蛋白，其中所述融合蛋白包含抗体或其片段特异性结合转铁蛋白，所述靶蛋白，和任选的linker，其中所述抗体或其片段融合于靶蛋白的羧基末端或氨基末端，并且任选的linker分离抗体和靶蛋白的羧基末端或氨基末端；和
(2)使融合蛋白与转铁蛋白结合，从而相对于单独靶蛋白，增加靶蛋白的半衰期。
根据一个本发明的实施方案中，融合蛋白通过一如下方法获得：
(a)获得编码融合蛋白基因的表达载体；
(b)将表达载体导入宿主细胞以得到重组细胞；
(c)培养重组细胞，以允许融合蛋白的表达；和
(d)从重组细胞获得所述融合蛋白。
本发明的另一个一般性方面涉及一种组合物，其包含融合蛋白的有效量，其中所述融合蛋白包含抗体或其片段特异性结合转铁蛋白，靶蛋白，和任选的linker，其中所述抗体或其片段融合至靶蛋白的羧基末端或氨基末端，和任选的连接体分离抗体和靶蛋白的羧基末端或氨基末端。该组合物最好还包含转铁蛋白。
本发明还涉及一种方法，包括根据本发明实施例的组合物和转铁蛋白结合，从而增加融合蛋白中靶蛋白的半衰期在。
本发明的另一个方面涉及一种用于提高靶蛋白半衰期的系统，，该系统包括：
(1)一个表达载体，包含编码特异性结合转铁蛋白抗体或其片段的第一个核苷酸序列，和任选的编码linker的第二个核苷酸序列，其中第一和第二核苷酸序列连接在一起，
(2)宿主细胞，以及
(3)转铁蛋白
其它方面，特征和本发明的优点将从下面的公开内容可以看出，包括本发明的详细描述及其优选实施方案和所附的权利要求。
附图的简单说明
前面的概述，以及本发明的以下详细描述，结合附图来阅读时将更好地理解。附图中已经展示的实施例是目前首选用于说明本发明的，然而，应该被理解的是，本发明不限于所展示在附图中的实施例：
图1是人转铁蛋白免疫美洲驼后的免疫应答曲线。
图2是19个分离得到结合人转铁蛋白单域抗体(sdAbs)的氨基酸序列的比对；互补性决定区(CDR)和构架区(FR)之间用的空间；序列根据Kabat的编码方式编号；示出的sdAb序列包括A60219(SEQIDNO：26)，A13152(SEQIDNO：30)，A12722(SEQIDNO：34)，A12680(SEQIDNO：36)，A12690(SEQIDNO：38)，A13154(SEQIDNO：40)，A13146(SEQIDNO：42)，A13149(SEQIDNO：44)，A12666(SEQIDNO：46)，A12659(SEQIDNO：48)，A13355(SEQIDNO：50)，A12692(SEQIDNO：52)，A60401(SEQIDNO：28)，A13376(SEQIDNO：32)，A69476(SEQIDNO：54)，A69449(SEQIDNO：56)，A69433(SEQIDNO：58)，A69441(SEQIDNO：60)，和A69447(SEQIDNO：62)；
图3是从大肠杆菌表达纯化单域抗体A60219，A60401，A69433，A69447和A69449聚丙烯酰胺凝胶检查图像，这些抗体的氨基酸序列示于图2；
图4转铁蛋白sdAbs结合人转铁蛋白的表面等离子体共振(SPR)传感图；图4A示出A60401的在2nM,1nM,0.5nM,0.25nM,and0.125nM条件下SPR传感图变化的情节的底部结合；图4B示出A60219在不同浓度2nM,1nM,0.5nM,0.25nM,and0.125nM下SPR传感图。
图5是转铁蛋白sdAbsA60401和A60219尺寸排阻色谱法的色谱(SEC)数据；
图6示出了转铁蛋白sdAbs在202纳米，208纳米和217纳米由圆二色性(CD)的测得转热变性曲线图；图6A示出A60219的热变性曲线；图6B示出A60401的热变性曲线；图6C示出了A69433的热变性曲线；图6D显示A69447的热变性曲线；图6E显示A60449的热变性曲线；和
图7显示单独人转铁蛋白，sdAbA60219，sdAb‐A60219融合蛋白在Wistar大鼠补充人转铁蛋白后的血清清除时间,在指定的时间点取血液样本，酶联免疫吸附测定(ELISA)A60219和人类转铁蛋白在血液样本中的浓度。
发明详述
在背景中引用或描述的贯穿整个规范的各种出版物，这些都作为整体引用。关于文档、行为、材料、设备、物品的讨论或者本规范已包含的相关讨论的目的是为本发明提供背景信息。这样的讨论不是对部分或全部来自此前已经披露的发明的承认。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术人员通常理解普的相同的含义。否则，本文所用的某些术语具有如说明书中所阐述的含义。必须指出，如本文和所附权利要求中使用，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数引用，除非上下文另有明确说明。
本领域的普通技术人员都熟悉抗体的基本结构。每个轻链和重链各含有一个可变区负责结合靶抗原。可变区包含抗原结合分子的决定因素，从而决定抗体对其靶抗原的特异性。轻链和重链的可变区包括三个互补决定区(CDR)。
如本文使用的“互补决定区”或“CDR”是指重链或轻链可变区中，有助于特异性识别并结合抗原的氨基酸序列。CDR区包括CDR1，CDR2和CDR3。根据本发明的实施方案中，至少CDR1，CDR2和CDR3中一种序列有助于抗体或其片段特异性识别和结合转铁蛋白，特别是人转铁蛋白。
如本文所使用的“抗体片段”包括任何合适的抗原结合抗体片段。例如，抗体片段可包含一个单链可变区。根据本发明的实施方案中，抗体是指单域抗体sdAb。
如本文所用，“单域抗体”或“sdAb”是指骆驼科动物和鲨鱼重链抗体(HCAb)中天然缺乏轻链的抗原结合区域。骆驼科动物包括骆驼，美洲驼和羊驼。骆驼科动物的HCAb的抗原结合位点是由被称为VHH的一个可变结构域形成。sdAbs通常具有相对小的分子量，以单体形式存在。根据本发明，一个sdAb具有三个CDR(CDR1，CDR2和CDR3)。
如本文中“抗体或片段针对转铁蛋白，”“抗体或其片段特异性结合转铁蛋白，”和“转铁蛋白抗体”应全都具有相同的含义，并且是指一种抗体或其片段，其是能够特异性结合到转铁蛋白。
如本文所用，“sdAb针对转铁蛋白”，“sdAb特异性结合转铁蛋白，”和“转铁蛋白sdAb”应全都具有相同的含义，并且是指一个单域抗体，其能够特异性结合转铁蛋白。
如本文所用，“转铁蛋白”广义地是指结合铁的蛋白质。转铁蛋白，作为本发明中使用，可以是从任何机体能产生的转铁蛋白，最好是哺乳动物转铁蛋白，如人或猴转铁蛋白，最好是人转铁蛋白。
如本文所用，“特异性结合”或“抗”在与抗体或其片段与转铁蛋白结合使用时，指抗体和其片段，如sdAb，和转铁蛋白之间的结合或相互作用。抗体或其片段，如sdAb，根据本发明和转铁蛋白的结合解离常数(KD)在10‐6和10‐9M之间或更小，如解离常数在纳摩尔至皮摩尔范围内(10‐9到10‐12)。
任何本领域中已知可以用于测定特异性抗原‐抗体结合的方法，包括，例如表面等离子共振(SPR)，竞争性结合测定法，诸如放射免疫测定(RIA)，酶联免疫测定(EIA)，夹心竞争测定和这些方法不同的变化形式，以及其他本文中提及的技术。用于确定结合亲和力或解离常数方法是本领域技术人员所熟知。
任何本领域中已知可以用于表征本发明中抗体或sdAb的方法，如聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‐PAGE)，圆二色谱(CD)，分子体积排阻色谱法(SEC)等；用于鉴定蛋白质的方法，如测定分子状态，熔融温度，分子量，纯度等，都为本领域技术人员所熟知。
如本文所使用的蛋白或多肽“半衰期”，是指体内或体外试验时测定其浓度降低至50％的时间。蛋白或多肽分子浓度的降低可以通过降解，清除，或在测定中的多肽的螯合引起。多肽的半衰期可以通过本领域中已知的任何方式测定，如通过药物动力学分析来确定。例如，为了测量在生物体内的蛋白质或多肽的半衰期，给温血动物(即人或以其他合适的哺乳动物，例如小鼠，兔，大鼠，猪，狗或灵长类动物)施用合适的剂量的多肽；从动物收集血液样品或其他样品；确定样品中的蛋白或多肽的水平或浓度；和之前给药的初始水平多肽的水平或浓度相比时，基于测量数据计算已经减少了50％。见，Kenneth,Aetal.,ChemicalHalf‐lifeofPharmaceuticals:AHandbookforPharmacistsandPetersetal.,Pharmacokineticanalysis:APracticalApproach(1996).
如本文所用，“增加的半衰期”或“较长的半衰期”是指用于描述与对照相比，蛋白半衰期任何一个参数的增长，如t1/2α，t1/2‐β和曲线(AUC)下区域的面积，其中任何两个参数，或所有这些参数。
如本文所使用的，“融合标签”是连接到靶蛋白质或多肽以产生融合蛋白为了便于后续处理的多肽序列，如用于表达，纯化，体外和体内分析，蛋白质鉴定，或诊断或治疗应用等。融合标签可以表现出一种或多种性能。例如，融合标记可以选择性地结合纯化介质使得融合蛋白可以很容易地进行纯化的。融合标签可以是，谷胱甘肽S‐转移酶(GST)，麦芽糖结合蛋白，多组氨酸(His‐标签)，FLAG标签，抗生物素蛋白，生物素，链霉亲和素，几丁质结合结构域，抗体Fc区，绿色荧光蛋白等。
本发明包括针对转铁蛋白的抗体，以及利用抗转铁蛋白的抗体或片段以增加靶蛋白半衰期的方法。如体外或体内血清中通过将包含靶蛋白和转铁蛋白的抗体或其片段的融合蛋白暴露给铁蛋白。在一个具体的实施方案中，本发明也涉及新的转铁蛋白sdAb和它们的用途。
因此，总体来说，本发明提供了特异性结合转铁蛋白的抗体或其片段，该抗体或片段，其包含选自下组中一种或多种序列：
(a)一种互补决定区(CDR)1，其包括选自下列序列组的氨基酸序列GSGFGINGVI(SEQIDNO：1)；GSGFGVNGVI(SEQIDNO：2)；GNVFTIAAMG(SEQIDNO：3)；GNVFTIAAMA(SEQIDNO：4)；GNVFTIDAMG(SEQIDNO：5)；GSVFSIDAMG(SEQIDNO：6)；GNVFGIDAVG(SEQIDNO：7)；GSIFSIKVMG(SEQIDNO：8)；和GSIFPLNDMG(SEQIDNO：9)；
(b)一种互补决定区CDR2其包括下列序列组的中选出的氨基酸序列LIKSDGYTNYRESVKG(SEQIDNO：10)；LIKSDGYTNYRESVRG(SEQIDNO：11)；GITTGGSTNYADSVKG(SEQIDNO：12)；GMTNGGKTNYADSVKG(SEQIDNO：13)；AMTNAGSTNYADSVKG(SEQIDNO：14)；ATTTSGSSTNYADSVKG(SEQIDNO：15)；DITSGGSTDYSDSVKG(SEQIDNO：16)；和TITRGGTTNYADSVKG(SEQIDNO：17)；和
(c)一种互补决定区CDR3具有下列序列组的中选出的氨基酸序列PGVP(SEQIDNO：18)；VTKWAARVGGSAEYE(SEQIDNO：19)；RSKLIATINNPYDY(SEQIDNO：20)；RSKLIARINNPYEY(SEQIDNO：21)；RPKQATLIRDDY(SEQIDNO：22)；DLGCSGAGSCPDY(SEQIDNO：23)；和DNRVGGSY(SEQIDNO：24)。
根据本发明的实施例i，一个分离的抗体，最好是sdAb，或者抗体片段，包含选自由SEQIDNOs:1‐9组成序列组的CDR1，由SEQIDNOs:10‐17组成序列中的CDR2，和由SEQIDNOs：18‐24的CDR3。
根据本发明的实施例，分离的抗体或片段特异性结合转铁蛋白，且亲和力(KD)在10‐6和10‐9M之间或更小，最好具有的亲和力低于10‐9M。在一个最优选的实施方案中，根据本发明分离的抗体或片段和转铁蛋白具有亚纳摩尔级的亲和力，例如，在皮摩尔范围内，如1‐10pM，15pM,20pM,30pM,40pM,50pM,60pM,70pM,80pM,90pM,或者100pM.
在一个具体的实施方案中，根据本发明的实施例进行分离的抗体或其片段包含SEQIDNO1的CDR1氨基酸序列，SEQIDNO10的CDR2氨基酸序列，和的SEQIDNO18的CDR3氨基酸序；根据本发明又一具体实施方案中，分离的抗体或其片段包含SEQIDNO3的CDR1氨基酸序列，SEQIDNO12的CDR2氨基酸序列，和SEQIDNO19的CDR3氨基酸序列。在其它具体的实施方案中，根据本发明它们的分离的抗体或其片段包含SEQIDNO6的CDR1氨基酸序列，SEQIDNO14的CDR2氨基酸序列，和SEQIDNO21的CDR3氨基酸序列；或者SEQIDNO7的CDR1氨基酸序列，SEQIDNO15的CDR2氨基酸序列，和SEQIDNO22的CDR3氨基酸序列；或SEQIDNO9的CDR1氨基酸序列，SEQIDNO17的CDR2氨基酸序列，和SEQIDNO24的CDR3氨基酸序列。
根据本发明实施方案，抗体或其片段，如特异性结合转铁蛋白sdAb中，可以包括选自由SEDIDNOs：26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，和62组成的氨基酸序列。
根据本发明的优选实施例，特异性结合转铁蛋白抗体或其片段是一种sdAb。例如，一个根据本发明特异性结合转铁蛋白的sdAb可以是骆驼科动物的VHH抗体。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，一个特异性结合转铁蛋白的sdAb包括A60219的氨基酸序列：QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGSGFGINGVIWYRQAPGKQRELVALIKSDGYTNYRESVKGRFTISRDDAKNTVWLQMNALEPEDTGVYYCKTPGVPFGQGTQVTVSS(SEQIDNO：26)；A60401的氨基酸序列：QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCEASGNVFTIAAMGWFRQAPGKERELVAGITTGGSTNYADSVKGRFTISRDNAQNTMYLQMNSLRPEDTAAYSCNAVTKWAARVGGSAEYEYWGQGTQVTVSS(SEQIDNO：28)；A69449的氨基酸序列：QVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCVASGSVFSIDAMGWYRQAPGNQRELVAAMTNAGSTNYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNARSKLIARINNPYEYWGQGTQVTVSS(SEQIDNO：56)；A69433的氨基酸序列：QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGNVFGIDAVGWYRQAPGKQRELVAATTTSGSSTNYADSVKGRFTISRDIAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCYARPKQATLIRDDYWGQGTQVTVSS(SEQIDNO：58)；或A69447的氨基酸序列：QVKLEESGGGSVQAGGSLRLSCTGSGSIFPLNDMGWYRQAPGKQRELVATITRGGTTNYADSVKGRFTISRDSNAKNTVYLQMNSLKVEDTAVYYCNMDNRVGGSYWGQGTQVTVSS(SEQIDNO：62)。
本发明还包含一个实施例的抗体或其片段的互补DNA(cDNA)序列，还包含可随后用于下游应用如表达，纯化等的载体和宿主细胞。表达载体和重组宿主细胞可通过本领域中已知的方法获得。
本发明实施例中抗体或其片段,可以通过公开的方法从重组宿主细胞产生。重组产生的抗体或其片段和来自天然存在的抗体或其片段不同，例如存在氨基酸的翻译后修饰。“氨基酸的翻译后修饰”指的是氨基酸翻译后的任何修饰，如对一个或多个氨基酸独立地进行一种或多种官能团的改变(如乙酸盐，磷酸盐，各种脂质和碳水化合物)，改变的氨基酸的化学性质(瓜氨酸化)，或进行结构的变化(形成二硫键)。
根据本发明的实施方案中，核酸分子包括cDNA或合成的DNA序列，其编码选自SEQIDNOS：26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，和62的氨基酸序列。在本发明的具体实施方案中，核酸分子包括cDNA或合成DNA序列，其包含选自SEQIDNOS：25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59和61的序列。然而，本领域的技术人员可以认识到是列出的特定核苷酸序列并非唯一的，因为不同核苷酸序列可以编码相同的氨基酸序列。
如本文所使用的，“cDNA或合成的DNA”指的是一个DNA分子，其是与天然存在的DNA分子相比至少有一个核苷酸序列的不同，分子的物理或化学性质也不同。例如，“cDNA或合成的DNA”，可以和天然的基因组DNA序列不同，不含有一个或多个存在的内含子。“cDNA或合成的DNA”也可以在一个或多个物理或化学性质上和天然存在的DNA不同，如具有不同的DNA修饰，即便都包括相同核苷酸序列。
如本文所使用的，“DNA修饰”是指对DNA任何的修饰，如通过独立地附着到DNA的一个或多个核苷酸的一个或多个生化官能基(如甲基，磷酸基等)。不同的宿主细胞可以具有不同的DNA修饰系统，从而产生不同的DNA分子，即使该DNA分子具有相同的核苷酸序列。
一个“cDNA或合成的DNA”，可以通过任何方法在体内或体外制备，只要所得到的“cDNA或合成的DNA”，和天然产生的DNA分子不同。例如，一个“cDNA”，可通过信使核糖核酸(mRNA)为模板在逆转录酶和DNA聚合酶，或RNA依赖性DNA聚合酶下产生。“cDNA”也可通过逆转录酶对所需mRNA模板进行反转录和通过DNA引物扩增的聚合酶链式反应(RT‐PCR)获得。“合成DNA”可以通过本领域很多已知的方法在体外获得。“合成的DNA”也可以在体内产生，宿主细胞产生的“合成DNA”也和天然产生的DNA有一个或多个物理或化学性质不同，如DNA甲基化。
本发明实施例还涉及特异性结合转铁蛋白的抗体或其片段重组表达和纯化的方，其包括如何获得含抗体或其片段编码序列的表达载体，表达载体如何导入宿主细胞，重组细胞抗体或其片段表达的条件，如何从重组细胞获得的抗体或其片段。所述特异性结合转铁蛋白的抗体或其片段可通过将裂解物，上清液，或重组细胞周质提取物，在亲和柱上进行分离。
在另一个实施例中，通过融合标签促进特异性结合转铁蛋白抗体或其片段从重组细胞中的纯化，例如，通过将裂解物，上清液，或重组细胞周质提取物，与融合标记结合配偶相偶联的亲和柱结合。作为说明性和非限制性的例子，融合标记可以是一个6×HIS标签，6×His标签的抗体或其片段可以通过重组细胞产生并偶联在镍柱上。
根据本发明的实施例，特异性结合转铁蛋白的抗体或其片段，特别是sdAbs，具有高亲和力(如皮摩尔级)，且在血清中补充转铁蛋白后有更长的半衰期。我们认为，所述抗体和其片段，如sdAb，和转铁蛋白之间的结合相互作用有助于抗体或片段在血清中的半衰期延长。因此，将此类抗体或其片段用于融合靶蛋白将可提高血清半衰期。
因此，总的来说，本发明涉及提高靶蛋白的血清半衰期的方法。所述方法包括：(1)获得的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含特异性结合转铁蛋白抗体或其片段，所述靶蛋白，和任选的连接体，其中所述抗体或其片段融合至羧基末端或氨基末端的靶蛋白，和连接体任选分离抗体和羧基末端或靶蛋白的氨基末端；和(2)相对于单独的靶蛋白，使融合蛋白暴露给的转铁蛋白，从而增加靶蛋白的半衰期。
根据本发明的实施方案，转铁蛋白可以任何形式存在于工序中，包括血清或体外制成的缓冲液。最好的是，所述融合蛋白通过向包含转铁蛋白的血清中注射。
根据本发明的实施例，当暴露于转铁蛋白，所述融合蛋白具有增加的半衰期，如通过测量相比于独自靶蛋白的半衰期。融合蛋白可任选地包含一个连接体，融合靶蛋白和抗体或其片段，并且还起到阻隔靶蛋白和抗体或其片段的作用。通过linker将两个蛋白质分子融合是本领域技术人员已知及公认的。
所述的抗体或其片段可通过本领域已知的任何方式融合到靶蛋白如如通过基因改造或共价偶联。该抗体或其片段可以融合到靶蛋白的氨基末端或羧基末端。
所述融合蛋白包含根据本发明的实施例的抗体或其片段。例如，该抗体或其片段包括以下氨基酸序列，CDR1的序列包含SEQIDNO：1，2，3，4，5，6，7，8，或9；CDR2的序列包含SEQIDNO：10，11，12，13，14，15，16，或17；和CDR3的序列包含SEQIDNO：18，19，20，21，22，23，或24。所述融合蛋白的抗体或其片段最好是一种sdAb并且更好的是含有A60219(SEQIDNO：26)，A60401(SEQIDNO：28)，A69449(SEQIDNO：56)，A69433(SEQIDNO：58)，或A69447(SEQIDNO：62)的氨基酸序列。
根据本发明的实施方案中，靶蛋白是一种多肽或蛋白，如治疗性多肽，用于诊断目的的多肽，或用于结构‐活性研究的多肽。靶蛋白也可以是抗体，多肽，或已被或将被开发，或用于治疗或诊断目的的任何其它多肽，或进行结构和/或功能分析的蛋白。所述靶蛋白最好地是在血清中不稳定的治疗性的蛋白或多肽，需要增加血清半衰期的才能用于治疗，诊断等目的。
根据本发明实施例的融合蛋白可被用于本开的本领域已知方法的各种用途。例如，融合蛋白可用于测定所述靶蛋白的亲和力的结合伴侣，用于药物筛选或靶点验证。它也可以在诊断方法中使用，尤其是当该方法需要将靶蛋白质注射至血清。它可以进一步用于治疗目的，特别是如果靶蛋白已知在血清是不稳定的。
本发明的另一个一般性方面涉及一种组合方法，其包含融合蛋白的有效量，其中所述融合蛋白包含特异性结合转铁蛋白抗体或其片段，靶蛋白，和任选的连接体，其中所述抗体或其片段融合至靶蛋白的羧基末端或氨基末端，和连接体任选分离抗体和靶蛋白的羧基末端或氨基末端该组合法最好还包含增加了融合蛋白半衰期的转铁蛋白。该组合法也可以进一步用于包含药学上可接受的载体，其可以包括适用于医药或诊断目的任何载体。
根据不同的用途，有效量是可有效地提供一种治疗或诊断用途的靶蛋白时融合蛋白的量。用于治疗应用时，有效量是，可治疗或预防疾病，失调等融合蛋白中靶蛋白的量；用于诊断应用序时，有效量是指可检测出标记物的靶蛋白的量
本发明实施例的组合物可用于体内或体外的任何目的。用于体内用途的组合物可以配制成用于递送给受试者各种方法，例如哺乳动物，如人，大鼠，小鼠，猴，或兔，不限于口服，局部，和注射的任何方法。用于体内使用的组合物最好是注射或静脉内给药。
本发明还涉及一种方法，包括将本发明实施例的组合物暴露给转铁蛋白，从而增加融合蛋白中靶蛋白的半衰期。
在一个实施方案中，本发明与，根据本发明实施例中组合物以融合蛋白形式暴露给转铁蛋白的方法相关，如实施到含有转铁蛋白的血清，或体外用于识别诊断或治疗试剂。
在另一个实施方案中，一个根据本发明的方法包括向需要目标蛋白治疗的的受试者实施根据本发明实施例的组合物，其中组合物包含特异性结合人转铁蛋白抗体或其片段和靶蛋白的融合蛋白的治疗有效量。
在又一个实施方案中，根据本发明的方法包括，将组合物给予需要由目标蛋白诊断的受试者，其中该组合物包括融合蛋白的诊断有效量。
本发明的实施例还涉及组合物，其包括根据本发明的融合蛋白和用其提高靶蛋白半衰期的方法。组合物中用于提高靶蛋的半衰期的方法包括获得融合蛋白，分离融合蛋白，包含针对转铁蛋白的抗体或其片段，所述靶蛋白和任选的连接体，其中所述抗体或其片段的方法融合至靶蛋白的羧基末端或氨基末端，和任选的连接体分隔抗体或其片段和靶蛋白的羧基末端或氨基末端，组合物中让融合蛋白暴露给转铁蛋白，其中所述融合蛋白比单独的靶蛋白在组合物中具有更长的半衰期。
不希望受到理论的束缚，信在特定的其中融合蛋白中的抗体或片段，和组合物或者血清中的转铁蛋白之间的特异性结合有助于提高靶蛋白的半衰期。
本发明实施例的还提供了用于获得具有增加的血清半衰期靶蛋白，和用于表达和纯化包含结合于转铁蛋白抗体或其片段和靶蛋白的融合蛋白的方法。
根据本发明的实施例，用于获得具有增加的血清半衰期靶蛋白的方法，包括：
(a)获得包含编码特异性结合转铁蛋白抗体或其片段，所述靶蛋白，和任选的连接体融合蛋白的表达载体，其中所述抗体或其片段融合至靶蛋白羧基末端或氨基末端，任选的连接体分隔开抗体和靶蛋白的羧基末端或氨基末端；
(b)将步骤(a)的表达载体导入细胞以得到重组细胞；
(c)重组细胞生长且允许融合蛋白表达的条件；
(d)从重组细胞获得所述融合蛋白。
编码融合蛋白的表达载体和表达融合蛋白的重组细胞可以通过本公开内容的本领域已知的方法构建。适于重组生产融合蛋白的任何宿主细胞都可以使用，如哺乳动物细胞，植物细胞，酵母细胞，或细菌细胞。宿主细胞最好是细菌细胞，并且更好地为大肠杆菌。任何考虑本发明的披露内容，从重组细胞获得融合蛋白的方法都可以使用，不限于柱层析，如亲和层析。
在一个实施方案中，融合蛋白可以从重组细胞获得，并利用该融合蛋白的一部分和转铁蛋白之间的特异性相互作用进行纯化，如通过将转铁蛋白偶联至亲和力柱用于纯化特异性结合转铁蛋白的抗体或其片段融合表达的蛋白。
在另一个实施方案中，融合蛋白可进一步在氨基末端或羧基末端包括融合标记，以促进从重组细胞中纯化融合蛋白。融合标签可被融合到转铁蛋白，或结合转铁蛋白的抗体或其片段其。例如，所述融合蛋白的裂解物，周质提取物，或上清液能够得到并用与融合标记适当结合伴侣相关联的亲和柱进行纯化。在一个特定的和非限制性实例中，融合蛋白可包括His标签，重组细胞裂解物，细胞周质提取物，包含融合蛋白的上清液可以得到并施加到镍柱，通过洗涤和适当的缓冲条件从柱上洗脱融合蛋白。
本发明的另一个一般性方面涉及一种系统，用于提高靶蛋白的半衰期，包括：
(1)一个包含编码特异性结合转铁蛋白抗体或其片段第一核苷酸序列，和编码任选的接头第二核苷酸序列，其中第一和第二核苷酸序列可操作地连接的表达载体；
(2)宿主细胞；和
(3)转铁蛋白
表达载体可以被用于构建表达载体的融合蛋白包含特异性结合转铁蛋白抗体或其片段，靶蛋白，和任选的连接体，其中所述抗体或其片段融合至靶蛋白的羧基末端或氨基末端，和任选的连接体分隔抗体和靶蛋白得羧基末端或氨基末端。因此，在本发明的某些实施方案中，表达载体包含编码抗体或片段的第一核苷酸序列，其特异性地结合一个转铁蛋白，任选的第二核苷酸序列，其编码连接体，和一个第三核苷酸序列编码靶蛋白，其中所述第一，第二和第三核苷酸序列可操作地连接，使得所述的抗体或其片段融合至靶蛋白的羧基末端或氨基末端，和任选连接体分离抗体和靶蛋白羧基末端或氨基末端。
宿主细胞可以为表达融合蛋白构建重组细胞，例如，通过转化的宿主细胞与融合蛋白的表达载体，使用在考虑到本发明的本领域已知的任何方法，包括但不限于电穿孔和氯化钙转化。
该转铁蛋白可用于稳定融合蛋白，也可用于通过亲和层析来分离融合蛋白。
根据一个本发明的实施例，该系统还可以包括一种经由融合蛋白的抗体或片段和与固体支持物相关联的转铁蛋白之间的特异性结合，或通过融合蛋白中的融合标签和与固体支持物偶联的融合标记的结合配偶之间的结合捕获融合蛋白的固体支持物。
该系统还包括一种或多种融合蛋白的表达和/或分离是有用的缓冲液。
以下具体实施例进一步说明本发明的内容，但需要理解的是，本发明不限于以下内容。
示例
实施例1：特异性结合转铁蛋白sdAbs生产和表征
材料与方法
从美洲驼免疫噬菌体抗体库分离转铁蛋白sdAbs
一种雄性美洲驼(大羊驼)在1，22，36，50和64天，皮下分别注射100微克，50微克，50微克，10微克，并10微克人转铁蛋白[11]。完全弗氏佐剂(Sigma公司，圣路易斯，密苏里州)用于初次免疫，不完全弗氏佐剂被用于随后的第2‐4免疫接种，最后一次免疫不用佐剂。美洲驼在每次免疫后取外周血并收集的外周血白细胞，然后将其贮存在80℃直至进一步使用。
使用QIAampRNA血液迷你试剂盒(Qiagen公司)从1×108白细胞分离总RNA。以566ng总RNA作为模板，使用随机(N)6作为引物合成cDNA。四个正向引物P441_VHHF1(GCCCAGCCGGCCATGGCCSMBGTRCAGCTGGTGGAKTCTGGGGGA；SEQIDNO：63)，P442_VHHF2(GCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTAAAGCTGGAGGAGTCTGGGGGA；SEQIDNO：64)，P759_VHHF3(GCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGGTGGAGTCT；SEQIDNO：65)和P444_VHHF4(GCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTGTGG；SEQIDNO：66)；和两个反向引物P445_CH2R(CGCCATCAAGGTACCAGTTGA；SEQIDNO：67)和P446_CH2b3R(GGGGTACCTGTCATCCACGGACCAGCTGASEQIDNO：68)用于扩增常规免疫球蛋白G抗体(IgG)VH‐CH1‐Hinge‐CH2或重链抗体的VHH‐Hinge‐CH2区。约600bp的以P445_CH2R与四个正向引物P441_VHHF1，P442_VHHF2，P759_VHHF3，和P444_VHHF4的引物组合扩增的VHH产品从1％琼脂糖凝胶中提取并用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化，引物P446_CH2RPCR产物也进行纯化。在第二轮PCR反应中，两个引物，P440_VHHF(CATGTGTAGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC；SEQIDNO：69)和P447_VHHR(CATGTGTAGATTCCTGGCCGGCCTGGCCTGAGGAGACGGTGACCTG；SEQIDNO：70)被用来引入SfiI限制性酶切位点，并且扩增从组合扩增产物的最终sdAb片段。最终的PCR产物用SfiI酶切并连接入在金斯瑞公司构建的噬菌粒载体，并通过电转化到大肠杆菌TG1中。通过辅助噬菌体M13KO7(NEB)对文库进行噬菌体拯救和扩增。
美洲驼免疫噬菌体展示文库通过转铁蛋白偶联M‐280磁珠(Invitrogen)进行液相淘选。约3×10^11的噬菌体加入到磁珠中在37℃孵育2小时进行抗原结合。除去处置未结合的噬菌体之后，将磁珠用含有0.05％吐温20磷酸盐缓冲盐缓冲液(PBST)洗涤六次，并且每轮增加一次洗涤。特异性结合的噬菌体被100μl的100mM三乙胺和洗脱液温育10分钟后洗脱，随后用200μl的1M的Tris‐HCl(pH7.5)中和。如上所述，经过两轮淘洗，洗脱的噬菌体用于感染指数生长期的大肠杆菌TG1。单菌落的噬菌体将通过酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测。
对于噬菌体ELISA，96孔微量滴定板中被以2微克/毫升的人转铁蛋白包被过夜，然后用4％改性的磷酸盐缓冲盐水(MPBS)进行封闭，37℃下2小时。从单个克隆的噬菌体分别用4％MPBS预封闭过夜，加入到预封闭的微孔板中，并温育1小时。噬菌体ELISA采用通用电气医疗检测模块的重组噬菌体抗体系统(GEHealthcare公司，乌普萨拉，瑞典)，阳性噬菌体将被克隆测序。
sdAbs的表达
编码各sdAb(A60401，A60219，A69433，A69447，或A69449)(图2)的DNA通过BbsIandBamHI位点被克隆到一个sdAbsC端会被添加了5×组氨酸纯化标记的分泌质表达载体pSJF2H[12]中。这些sdAbs在周质腔表达并通过固定化金属离子亲和层析(IMAC)[13]纯化。简言之，将阳性克隆接种在25mlLB‐氨苄青霉素中，在37℃温育用200rpm振摇过夜。第二天，将20ml培养物被用于接种1升M9培养基中(0.2％葡萄糖，0.6％磷酸氢二钠，0.3％磷酸二氢钾，0.1％氯化铵，0.05％氯化钠，1mM的氯化镁，0.1mM的氯化钙)，补充0.4％酪蛋白氨基酸，5毫克/升的维生素B1，和200微克/毫升的氨苄青霉素，并培养24小时。之后加入100毫升10×TB培养基(12％蛋白胨，24％酵母提取物和4％甘油)，2毫升100mg/ml的氨苄青霉素，1毫升1M异丙基‐β‐D‐硫代半乳糖苷(IPTG)，再继续孵育培养65‐70小时，在28℃，200rpm振荡。大肠杆菌细胞通过离心收集并用溶菌酶裂解。细胞裂解物离心，澄清的上清液装到High‐TrapTM螯合亲和柱(GEHealthcare)上，用His标签的蛋白质进行纯化。
表面等离子体共振(SPR)分析
使用BIAcoreT200光学传感器平台和研究级CM5传感器芯片(GEHealthcare)进行实验。人转铁蛋白通过标准胺偶联固定在传感器芯片表面。所有实验均在HEPES缓冲液[10mM的HEPES(pH7.4)中，150mM氯化钠，3.4毫摩尔EDTA，0.005％吐温20]中和25℃下进行。除非另有说明，抗体在浓度从0.25nM至16nM系列稀释，以30微升/分钟的流速注射。从结合的分析物的量减法空白对照表面被显示为相对响应单位(RU)。每次注射系列设双参考传感并使用BIA评估软件(GEHealthcare)对结合动力学进行分析。
尺寸排阻色谱
尺寸排阻色谱法(SEC)sdAbsA60401和A60219用Superdex200TM柱(GEHealthcare)，进行了分析(图5)。Superdex分离在PBS中进行。低分子量标记物核糖核酸酶A(13.7kDa)，胰凝乳蛋白酶A(25kDa)和卵清蛋白(43kDa)被用来计算sdAbs的MW。
圆二色谱法测量sdAbs熔融温度
蛋白质用Superdex75SEC柱分离至10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)。收集蛋白质的主要成分峰用于圆二色性(CD)分析使用。使用J‐815的CD光谱仪(JASCO)，蛋白浓度100微克/毫升，10毫米的石英比色皿中，收集在250至200纳米处的CD光谱。CD光谱测定以2℃的间隔从30℃扫描至90℃，以1℃/分钟的温度变化速度测定蛋白质的热变性。在202纳米，208纳米和217纳米处以椭圆率对温度作图，在三个波长下平均的Tm计算熔融温度(TMS)。
血清半衰期测定
一组三只雌性Wistar大鼠，每个重约250个克，在尾静脉注射30mg人转铁蛋白后，立即分别为静脉注射30毫克人转铁蛋白，和500微克sdAbA60219，A60401，A69433，A69447，或A69449。通过在指定的时间点的从眼睛玻璃毛细管收集血液。分离血清并储存在‐80℃直至进一步使用。上述收集样品中被注射的抗体分子的浓度将用ELISA测定。
对于转铁蛋白浓度测定，将抗转铁蛋白抗体[HTF‐14](Abcam公司，ab769)在微量滴定板(Costar，9018)中，以1μg/ml的浓度在4℃下过夜。用PBST洗涤三次后，以含1％BSA的PBST在37℃封闭平板两小时。。血清被稀释(在0.05％PBS‐T中1％BSA用作稀释剂)后加入到微孔板中，在37℃下2小时。用PBST洗涤四次，HRP标记的抗转铁蛋白抗体(0.1微克/毫升)(Abcam公司，ab9538)加入到孔中并温育1小时。该板用PBST洗涤后，加入TMB底物10分钟进行显色，通过加入1M盐酸停止反应。各孔使用分光计450纳米进行吸光度测定。以人转铁蛋白在1％BSA的PBST的系列稀梯度用于产生人转铁蛋白浓度分析的标准曲线。
同样的方法也用于sdAbs的检测中，除抗sdAb的兔多克隆抗体(金斯瑞)用作捕获抗体和HRP标记的抗sdAb兔多克隆抗体(0.1微克/毫升)(金斯瑞)为作为检测抗体。以1％BSAPBST的对sdAbs系列稀释，用于制作标准曲线的sdAbs的浓度。
结果
分离和鉴定sdAbs
通过使用人转铁蛋白免疫美洲驼，建立免疫噬菌体展示文库，淘选来实现特异性sdAbs的分离。
人转铁蛋白在美洲驼中引起了一定的免疫反应，约25000倍稀释的第五次免疫后血清仍然检测到阳性(图1)。
大约1×1^08美洲驼白细胞被用于mRNA分离，然后将其用于噬菌体文库的构建。所得到的文库的大小为2×10^8，正确插入率为92％。经过两轮固定人转铁蛋白的液相淘选，特异性噬菌体被富集(数据未显示)。噬菌体ELISA表明，所分析的克隆约88％结合到转铁蛋白。在噬菌体克隆显示的sdAbs的编码序列的分析结果显示19个不同的sdAb氨基酸序列(SEQ_ID号：26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60和62，和图2)。
A60219，A60401，A69433，A69447和A69449这5个sdAbs分别被亚克隆到C‐末端标记有一个6×组氨酸(His)标签的大肠杆菌周质表达载体pSJF2H[12]中。然后在大肠杆菌中表达，并通过IMAC(图3)进行纯化。A60219，A60401，A69433，A69447和A69449的sdAb每升TG1培养产率分别为8.4，8.5，12.5，17.2和7.8毫克。
基于SPR生物传感器结合分析，这五个转铁蛋白sdAbs，A60219，A60401，A69433，A69447和A69449，可以结合人转铁蛋白(图4)，其中，A69433，A69447和A69449，显示出与人类和猴子的转铁蛋白(表2)有的交叉结合活性。
结果详细呈现于表1和表2和图4中。例如，sdAbsA60401和A60219的结合率分别为9.27×10^5和5.14×10^7的M‐1S‐1，和解离速率6.22×10^‐5和6.74×10^‐4S‐1。sdAbs的解离常数(KDS)计算为A6040167.14pM为(图4A)和A6021913.1pM(图4B)。
表1SPR测定转铁蛋白sdAbs(A60219和A60401)结合人转铁蛋白
表2.SPR测量转铁蛋白sdAbs(A69433，A69447和A69449)结合人和猴转铁蛋白
sdAbs的鉴定
尺寸排阻色谱法(SEC)来评估两个sdAbsA60401和A60219是否作为单体存在(图5)。如同大多数骆驼科动物sdAbs，A60401是一个纯粹的单体，用Superdex75柱在14.28毫升洗脱体积处表现为一个单一的峰，，对应于10.6kDa的测量分子量，非常接近其计算的MW14,347Da。A60219也极有可能为纯单体，因为它有一个单一的洗脱峰在13.98毫升，相当于11.2kDa分子量。然而，其从比A60401洗脱略快表示A60219的单体和寡聚形式之间动态传输可能存在的，因为它分子量较小。
对A60219和A60401的圆二色谱测定，以估计其二级结构和热稳定性。这两种蛋白质的圆二色谱是典型的单域抗体(数据未示出)。热变性分析测定温度范围从30到90℃，以2℃为间隔。在202纳米，208纳米，和217纳米对温度绘制CD值，计算出A60219(图6A)和A60401(图6B)熔融温度(Tm)分别与69.8℃和58.7℃。
sdAbA60219的血清清除
A60219由于其高亲和力，纯单体状态，和高热稳定性，用于测试其血清半衰期。A60219被单独注射到大鼠或注射大鼠人转铁蛋白后后立即注射。人转铁蛋白也被注入到大鼠并测量其血清半衰期，模仿人转铁蛋白在血液中的环境。用ELISA用来测量A60219的在不同时间点注射后采取的大鼠血液中的浓度。
人转铁蛋白在Wistar大鼠血液中的清除首次被研究。注射30毫克人转铁蛋白至大鼠后，收集七天血样。观察转铁蛋白浓度的逐渐稳步下降，所计算出的t1/2β计算为22小时。这是比人转铁蛋白在人的血清中半衰期显著缩短。尽管如此，在大鼠输注人转铁蛋白提供了一个模型，用于评估A60219在人体内的血清半衰期。值得注意的是，所述抗人转铁蛋白抗体不结合大鼠转铁蛋白，这使得sdAb血清清除的分析交叉反应性更加简单。
对sdAbA60219的血清半衰期的研究，如许多其他动物模型中的sdAbs，A60219从大鼠血液中快速清除。在约8小时仅有微量可以在大鼠血液中检测到。
大鼠补充有人转铁蛋白时，A60219半衰期显著延长。它的血液清除率与人转铁蛋白非常相似的，计算得出的血清半衰期也是22小时。这表明，当注射入人体，A60219也会产生类似人转铁蛋白的血清半衰期。
从血清清除研究结果表明，将包含抗转铁蛋白抗体或其片段的多肽的在人转铁蛋白存在的情况下，显著增加体内分子的半衰期。
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Claims (33)

1.一种分离的特异性结合转铁蛋白抗体或其片段，其包含一种或多种选自下组中序列：
(a)一种互补决定区1(CDR1)，其氨基酸序列来自下列序列组成之一GSGFGINGVI(SEQIDNO：1)；GSGFGVNGVI(SEQIDNO：2)；GNVFTIAAMG(SEQIDNO：3)；GNVFTIAAMA(SEQIDNO：4)；GNVFTIDAMG(SEQIDNO：5)；GSVFSIDAMG(SEQIDNO：6)；GNVFGIDAVG(SEQIDNO：7)；GSIFSIKVMG(SEQIDNO：8)；和GSIFPLNDMG(SEQIDNO：9)；
(b)互补决定区2，其氨基酸序列来自下列序列组成之一，LIKSDGYTNYRESVKG(SEQIDNO：10)；LIKSDGYTNYRESVRG(SEQIDNO：11)；GITTGGSTNYADSVKG(SEQIDNO：12)；GMTNGGKTNYADSVKG(SEQIDNO：13)；AMTNAGSTNYADSVKG(SEQIDNO：14)；ATTTSGSSTNYADSVKG(SEQIDNO：15)；DITSGGSTDYSDSVKG(SEQIDNO：16)；和TITRGGTTNYADSVKG(SEQIDNO：17)；和
(c)互补决定区3，其氨基酸序列来自下列序列组成之一，PGVP(SEQIDNO：18)；VTKWAARVGGSAEYE(SEQIDNO：19)；RSKLIATINNPYDY(SEQIDNO：20)；RSKLIARINNPYEY(SEQIDNO：21)；RPKQATLIRDDY(SEQIDNO：22)；DLGCSGAGSCPDY(SEQIDNO：23)；和DNRVGGSY(SEQIDNO：24)。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体或其片段，包括CDR1，CDR的2和CDR3。
3.根据权利要求1所述的分离的抗体或其片段，其包含SEQIDNO：1,SEQIDNO：10和SEQIDNO：18的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的分离的抗体或其片段，其包含SEQIDNO：3，SEQIDNO：12和SEQIDNO：19的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的分离的抗体或其片段，其包含SEQIDNO：6，SEQIDNO：14和SEQIDNO：21的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的分离的抗体或其片段，其包含SEQIDNO：7，SEQIDNO：15和SEQIDNO：22的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的分离的抗体或其片段，其包含SEQIDNO：9，SEQIDNO：17和SEQIDNO：24的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的分离的抗体或片段，其包含以下选定序列号中的氨基酸序列：26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，和62。
9.根据权利要求1～8任何一项要求分离的抗体或其片段为一个单域抗体(sdAb)。
10.根据权利要求9所述的sdAb，包含选自下列序列组中的氨基酸序列：A60219QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGSGFGINGVIWYRQAPGKQRELVALIKSDGYTNYRESVKGRFTISRDDAKNTVWLQMNALEPEDTGVYYCKTPGVPFGQGTQVTVSS(SEQIDNO：26)；A60401:QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCEASGNVFTIAAMGWFRQAPGKERELVAGITTGGSTNYADSVKGRFTISRDNAQNTMYLQMNSLRPEDTAAYSCNAVTKWAARVGGSAEYEYWGQGTQVTVSS(SEQIDNO：28)；A69449:QVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCVASGSVFSIDAMGWYRQAPGNQRELVAAMTNAGSTNYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNARSKLIARINNPYEYWGQGTQVTVSS(SEQIDNO：56)；A69433：QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGNVFGIDAVGWYRQAPGKQRELVAATTTSGSSTNYADSVKGRFTISRDIAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCYARPKQATLIRDDYWGQGTQVTVSS(SEQIDNO：58)；和A69447：QVKLEESGGGSVQAGGSLRLSCTGSGSIFPLNDMGWYRQAPGKQRELVATITRGGTTNYADSVKGRFTISRDSNAKNTVYLQMNSLKVEDTAVYYCNMDNRVGGSYWGQGTQVTVSS(SEQIDNO：62)。
11.根据权利要求1至10中任一项中所述的和转铁蛋白具有10^‐9M或更好的解离常数(Kd)的抗体或其片段。
12.根据权利要求1至11中任一项中所述的分离的抗体的或其片段，其中所述转是人人转铁蛋白或猴转铁蛋白。
13.根据权利要求1至12中任一项中所述的分离的抗体的或其片段为重组产生。
14.一种编码权利要求1至13任一项中分离的抗体或其片段的核酸，其包含cDNA或合成的DNA。
15.一种包括权利要求14中核酸的表达载体。
16.一种包含权利要求15表达载体的重组宿主细胞。
17.一种融合蛋白，包含特异性结合转铁蛋白抗体或其片段，靶蛋白，和任选的连接体，其中所述抗体或其片段融合于靶蛋白的羧基末端或氨基末端，并且连接体可随意分隔抗体在靶蛋白的羧基末端或氨基末端。
18.根据权利要求17所述的融合蛋白，其中所述抗体或其片段是单域抗体(sdAb)，其包括一个CDR1，CDR2和的CDR3。
19.根据权利要求17所述的融合蛋白，其中所述抗体或其片段包含一种或选自下组中选择：
(a)一种互补决定区1(CDR1)，其氨基酸序列来自下列序列组成之一GSGFGINGVI(SEQIDNO：1)；GSGFGVNGVI(SEQIDNO：2)；GNVFTIAAMG(SEQIDNO：3)；GNVFTIAAMA(SEQIDNO：4)；GNVFTIDAMG(SEQIDNO：5)；GSVFSIDAMG(SEQIDNO：6)；GNVFGIDAVG(SEQIDNO：7)；GSIFSIKVMG(SEQIDNO：8)；和GSIFPLNDMG(SEQIDNO：9)；
(b)一种互补决定区2(CDR2)，其氨基酸序列来自下列序列组成之一LIKSDGYTNYRESVKG(SEQIDNO：10)；LIKSDGYTNYRESVRG(SEQIDNO：11)；GITTGGSTNYADSVKG(SEQIDNO：12)；GMTNGGKTNYADSVKG(SEQIDNO：13)；AMTNAGSTNYADSVKG(SEQIDNO：14)；ATTTSGSSTNYADSVKG(SEQIDNO：15)；DITSGGSTDYSDSVKG(SEQIDNO：16)；和TITRGGTTNYADSVKG(SEQIDNO：17)；和
(c)一种互补决定区3(CDR1)，其氨基酸序列来自下列序列组成之一包含选自的组中PGVP(SEQIDNO：18)的氨基酸序列的CDR3；VTKWAARVGGSAEYE(SEQIDNO：19)；RSKLIATINNPYDY(SEQIDNO：20)；RSKLIARINNPYEY(SEQIDNO：21)；RPKQATLIRDDY(SEQIDNO：22)；DLGCSGAGSCPDY(SEQIDNO：23)；和DNRVGGSY(SEQIDNO：24)。
20.根据权利要求19所述的融合蛋白，其中所述抗体或其片段是一种sdAb包含选自下列组中的氨基酸序列A60219：QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGSGFGINGVIWYRQAPGKQRELVALIKSDGYTNYRESVKGRFTISRDDAKNTVWLQMNALEPEDTGVYYCKTPGVPFGQGTQVTVSS(SEQIDNO：26)；A60401：QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCEASGNVFTIAAMGWFRQAPGKERELVAGITTGGSTNYADSVKGRFTISRDNAQNTMYLQMNSLRPEDTAAYSCNAVTKWAARVGGSAEYEYWGQGTQVTVSS(SEQIDNO：28)；A69449：QVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCVASGSVFSIDAMGWYRQAPGNQRELVAAMTNAGSTNYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNARSKLIARINNPYEYWGQGTQVTVSS(SEQIDNO：56)；A69433：QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGNVFGIDAVGWYRQAPGKQRELVAATTTSGSSTNYADSVKGRFTISRDIAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCYARPKQATLIRDDYWGQGTQVTVSS(SEQIDNO：58)；和A69447：QVKLEESGGGSVQAGGSLRLSCTGSGSIFPLNDMGWYRQAPGKQRELVATITRGGTTNYADSVKGRFTISRDSNAKNTVYLQMNSLKVEDTAVYYCNMDNRVGGSYWGQGTQVTVSS(SEQIDNO：62)。
21.一种包含编码权利要求17至20的融合蛋白的核酸序列的核酸。
22.一个包含权利要求21的核酸的表达载体。
23.一种包含权利要求22的表达载体的重组宿主细胞。
24.一种用于提高靶蛋白的半衰期的方法，该方法包括：
(1)产生的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含抗体或其片段特异性结合转铁蛋白，所述靶蛋白，和任选的连接体，其中所述抗体或其片段融合于靶蛋白的羧基末端或氨基末端，并且连接体任选分离抗体和或靶蛋白羧基末端的氨基末端；和
(2)向转铁蛋白暴露融合蛋白，相对于单独的靶蛋白，增加融合蛋白中靶蛋白的半衰期，在。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述暴露步骤包括在体内或体外将融合蛋白给予包含含转铁蛋白的血清。
26.根据权利要求24至25所述的方法，其中所述抗体或其片段包含一种或多种选自下组中选择：
(a)一种互补决定区1(CDR1)，其氨基酸序列来自下列序列组成之一GSGFGINGVI(SEQIDNO：1)；GSGFGVNGVI(SEQIDNO：2)；GNVFTIAAMG(SEQIDNO：3)；GNVFTIAAMA(SEQIDNO：4)；GNVFTIDAMG(SEQIDNO：5)；GSVFSIDAMG(SEQIDNO：6)；GNVFGIDAVG(SEQIDNO：7)；GSIFSIKVMG(SEQIDNO：8)；和GSIFPLNDMG(SEQIDNO：9)；
(b)一种互补决定区2(CDR2)，其氨基酸序列来自下列序列组成之一LIKSDGYTNYRESVKG(SEQIDNO：10)；LIKSDGYTNYRESVRG(SEQIDNO：11)；GITTGGSTNYADSVKG(SEQIDNO：12)；GMTNGGKTNYADSVKG(SEQIDNO：13)；AMTNAGSTNYADSVKG(SEQIDNO：14)；ATTTSGSSTNYADSVKG(SEQIDNO：15)；DITSGGSTDYSDSVKG(SEQIDNO：16)；和TITRGGTTNYADSVKG(SEQIDNO：17)；和
(c)一种互补决定区3(CDR1)，其氨基酸序列来自下列序列组成之一包含选自的组中PGVP(SEQIDNO：18)的氨基酸序列的CDR3；VTKWAARVGGSAEYE(SEQIDNO：19)；RSKLIATINNPYDY(SEQIDNO：20)；RSKLIARINNPYEY(SEQIDNO：21)；RPKQATLIRDDY(SEQIDNO：22)；DLGCSGAGSCPDY(SEQIDNO：23)；和DNRVGGSY(SEQIDNO：24)。
27.根据权利要求24至26所述的方法，其中所述抗体或其片段是单域抗体(sdAb)，包含CDR1，CDR2和CDR3。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述sdAb包括氨基酸序列，A60219：QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGSGFGINGVIWYRQAPGKQRELVALIKSDGYTNYRESVKGRFTISRDDAKNTVWLQMNALEPEDTGVYYCKTPGVPFGQGTQVTVSS(SEQIDNO：26)；A60401：QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCEASGNVFTIAAMGWFRQAPGKERELVAGITTGGSTNYADSVKGRFTISRDNAQNTMYLQMNSLRPEDTAAYSCNAVTKWAARVGGSAEYEYWGQGTQVTVSS(SEQIDNO：28)；A69449：QVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCVASGSVFSIDAMGWYRQAPGNQRELVAAMTNAGSTNYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNARSKLIARINNPYEYWGQGTQVTVSS(SEQIDNO：56)；A69433：QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGNVFGIDAVGWYRQAPGKQRELVAATTTSGSSTNYADSVKGRFTISRDIAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCYARPKQATLIRDDYWGQGTQVTVSS(SEQIDNO：58)；或A69447：QVKLEESGGGSVQAGGSLRLSCTGSGSIFPLNDMGWYRQAPGKQRELVATITRGGTTNYADSVKGRFTISRDSNAKNTVYLQMNSLKVEDTAVYYCNMDNRVGGSYWGQGTQVTVSS(SEQIDNO：62)。
29.根据权利要求24至28所述的方法，其中所述融合蛋白是通过以下方法产生：
(a)获得编码融合蛋白的表达载体；
(b)将表达载体导入细胞以得到重组细胞；
(c)在合适条件下生长重组细胞，表达融合蛋白；和
(d)从重组细胞或其上清液获取融合蛋白。
30.一种组合物，包括一种有效量的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含抗体或其片段特异性结合转铁蛋白，靶蛋白，和任选的连接体，其中所述抗体或其片段融合于靶蛋白羧基末端或的氨基末端，和连接体任选分离抗体和靶蛋白的羧基末端或氨基末端。
31.根据权利要求30所述的组合物，可进一步包含转铁蛋白。
32.一种增加靶蛋白半衰期的方法，该方法包括将权利要求30中的组合物暴露给转铁蛋白，从而增加融合蛋白中靶蛋白的半衰期。
33.一种系统，用于提高靶蛋白的半衰期，该系统包括：
(1)一个表达载体，包含编码特异性结合转铁蛋白抗体或其片段的第一个核苷酸序列，和任选的编码连接体的第二个核苷酸序列，其中第一和第二核苷酸序列连接在一起，
(2)宿主细胞；和
(3)转铁蛋白。
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