CN1694895A - 被修饰的转铁蛋白抗体的融合蛋白 - Google Patents

被修饰的转铁蛋白抗体的融合蛋白 Download PDF

Info

Publication number
CN1694895A
CN1694895A CNA038247453A CN03824745A CN1694895A CN 1694895 A CN1694895 A CN 1694895A CN A038247453 A CNA038247453 A CN A038247453A CN 03824745 A CN03824745 A CN 03824745A CN 1694895 A CN1694895 A CN 1694895A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fusion rotein
variable region
antibody variable
cell
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA038247453A
Other languages
English (en)
Inventor
霍马扬·萨德吉
克里斯托弗·P·普里奥尔
安德鲁·特纳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biorexis Pharmaceutical Corp
Original Assignee
Biorexis Pharmaceutical Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biorexis Pharmaceutical Corp filed Critical Biorexis Pharmaceutical Corp
Publication of CN1694895A publication Critical patent/CN1694895A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/40—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/644—Transferrin, e.g. a lactoferrin or ovotransferrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/565—IFN-beta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70582—CD71
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)

Abstract

公开了转铁蛋白与治疗性蛋白或肽优选为抗体可变区的被修饰的融合蛋白，其血清半衰期或者血清稳定性被提高。优选的融合蛋白包括那些使转铁蛋白部分不发生或减少糖基化，结合铁离子和/或结合转铁蛋白受体的修饰。

Description

被修饰的转铁蛋白抗体的融合蛋白
相关申请
本申请要求享有2002年8月30日申请的美国在先临时专利申请60/406,977和2003年3月10日申请的美国专利申请10/384,060的优先权和利益，这两个申请在此完全引入作为参考。
技术领域
本发明涉及被融合或插入到转铁蛋白分子上的治疗性蛋白或肽，其血清稳定性或体内循环半衰期被提高，转铁蛋白分子被修饰以减少或抑制糖基化、和/或减少或抑制铁结合和/或转铁蛋白受体结合。特别地，本发明包括被融合到或插入到转铁蛋白分子或被修饰的转铁蛋白分子上的单链抗体。
背景技术
天然状态下的或者重组制备的治疗性蛋白或肽通常是不稳定的分子，具有短的血清稳定性周期或者短的体内循环半衰期。此外，当这些分子被配制特别是在水溶液中用于诊断和治疗目的时，通常是非常不稳定的。
只有极少数实用办法可以被用于延长或提高治疗性蛋白分子的体内或体外稳定性。聚乙二醇(PEG)是可以结合到蛋白质上的物质，从而使该蛋白质具有长期、持续的活性。如果蛋白质活性通过结合到PEG上被延长，那么就可以降低该蛋白质的施用频率。但是，PEG结合常常降低或破坏蛋白质的治疗活性。在有些情况下，PEG结合会降低蛋白质的免疫原性，而在其它情况下可能提高其免疫原性。
还可以通过融合到能够延长治疗性蛋白质的体内循环半衰期的蛋白质上来稳定治疗性蛋白质或肽。例如，与处于未被融合状态下的治疗性蛋白质相比，被融合到白蛋白或抗体片段上的治疗性蛋白质的体内循环半衰期被延长，参见美国专利5,876,969和5,766,883。
另一种血清蛋白，糖基化的人转铁蛋白(Tf)也已经被用于与治疗性蛋白质一起融合，靶向呈递到细胞内部，或用于携带试剂跨越血脑屏障。通过将全长Tf融合到因子上，这些包含被糖基化的人Tf的融合蛋白已经被用于靶向神经生长因子(NGF)或睫状神经营养因子(CNTF)跨越血脑屏障，参见美国专利5,672,683和5977,307。在这些融合蛋白中，该分子的Tf部分被糖基化并结合两个铁原子，铁原子是Tf结合到细胞上的受体所需的，并且如这些专利的发明人所述，Tf引导呈递NGF或CNTF部分跨越血脑屏障。已经通过将HIV-1蛋白酶靶向序列插入到糖基化转铁蛋白的外露表面环上，研究制备通过Tf受体靶向呈递到细胞内部的另一种形式的Tf融合物的可能性，已经制备了转铁蛋白融合蛋白(Ali等(1999)J.Biol.Chem.274(34)：24066-24073)。
血清转铁蛋白(Tf)是分子量为80,000道尔顿的单聚糖蛋白，其在循环中结合铁，并通过转铁蛋白受体(TfR)将铁转运到各种组织中(Aisen等(1980)Ann.Rev.Biochem.49：357-393；MacGillivray等(1981)J.Biol.Chem.258：3543-3553，美国专利5,026,651)。Tf是最常见的血清分子之一，包含多达约5-10％的总血清蛋白。在酗酒个体的血液中，存在高水平的缺乏糖的转铁蛋白，并且这种转铁蛋白的半衰期(约14-17天)比被糖基化的转铁蛋白(约7-10天)更长。参见van Eijk等(1983)Clin.Chim.Acta 132：167-171，Stibler(1991)Clin.Chem.37：2029-2037(1991)，Arndt(2001)Clin.Chem.47(1)：13-27和Stibler等″Carbohydrate-deficient consumption″，Advances in the Biosciences，(Nordmann等编辑)，Pergamon，1988，71，353-357)。
Tf的结构已经被充分表征，受体结合、铁结合及释放以及碳酸铁的结合的机制已经被阐述(美国专利5,026,651、5,986,067和MacGillivray等(1983)J.Biol.Chem.258(6)：3543-3546)。
转铁蛋白和结合转铁蛋白受体的抗体也已经被用于呈递或携带毒性试剂到肿瘤细胞中，作为癌症治疗的方法(Baselga和Mendelsohn，1994)，而且转铁蛋白也被用作非病毒性基因治疗载体，将DNA呈递细胞中(Frank等1994；Wagner等1992)。使用转铁蛋白受体作为进入点来将蛋白质呈递到中枢神经系统(CNS)中的能力也已经用数种蛋白质和肽证明，包括CD4(Walus等1996)、脑源神经营养因子(Pardridge等，1994)、神经胶质来源的神经营养因子(Albeck等)、肠道血管(vasointestinal)肽类似物(Bickel等，1993)、β-淀粉状蛋白肽(Saito等，1995)，以及反义寡核苷酸(Pardridge等1995)。
但是，还没有修饰或遗传工程化转铁蛋白融合蛋白来延长治疗性蛋白或肽的体内循环半衰期，或者通过减少或抑制Tf部分的糖基化或者减少或防止铁和/或Tf受体的结合来提高生物利用度。
抗体及其结构
在血液或其它体液中循环的抗体被称作体液抗体，区别于被结合到其亲本淋巴细胞上的“膜抗体”。术语免疫球蛋白通常用于指所有抗体。在人体中，所有的免疫球蛋白被分成五种，称作IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。每个免疫球蛋白分子由两对相同的多肽链组成，称作重链或轻链。“重链”被命名为gamma(γ)、alpha(α)、mu(μ)、delta(δ)和epsilon(ε)。“轻链”命名为lambda(λ)或kappa(κ)。
天然存在的抗体由四条多肽链组成：两条相同的重链和两条相同的轻链。每一条重链约50-70kDa，每一条轻链约25kDa。这些链通过二硫键连接在一起。抗体分子的基本结构具有字母Y的形状。Y的每一个臂由一条轻链和一条重链的部分组成，而Y茎部分由重链的剩余部分组成。Y的臂和茎通过铰链区连接在一起，铰链区使得臂能够活动。
抗体的茎和连接到茎的臂部分由免疫球蛋白的恒定区构成。这些区域具有保守的氨基酸序列，可变性低。臂的相反端是轻链的可变区和由100-110个氨基酸组成的重链，其中为三个小的非保守氨基酸序列区域或超变区。这些区域负责抗原识别和结合。
无论相连的重链的类型，所有轻链的区域结构是相同的。每条轻链具有两个区域，VL区和称作恒定轻链或CL的具有相对不变化的氨基酸序列的区域。相反，重链具有三个(IgG、IgA、IgD)或四个(IgM、IgE)恒定区或C区，称作CH1，CH2，CH3和CH4，以及一个可变区，称作VH。可替代地，C区可以按照重链类型来命名；因此，Cε4是指IgE(ε)重链的CH4区。
各个可变轻链(VL)和可变重链(VH)区含有三个称作互补决定区(CDR)的超变区。这些CDR组合在一起形成结合抗原的口袋。由于超变区中的氨基酸序列的可变性，结合位点的形状和特性是变化的，该位点结合抗原的特异性也是变化的。
通常，当抗原进入机体时，抗原的不同部分被不同的幼稚(naive)B细胞识别。各种B细胞产生具有略微区别的结合位点的抗体。结果，生成抗体混合物。1977年，George Kohler和Cesar Milstein发现了一种获得大量具有相同亲合性的单一类型抗体的方法。Kohler和Milstein用以制备单克隆抗体的方法包括将来自被免疫的动物的B细胞与骨髓瘤细胞融合，制备了大量无限增殖的杂交瘤，并选择生产期望抗体的杂交瘤。
单克隆抗体是重要的研究工具，被用作治疗剂。但是，单克隆抗体是昂贵的，并且难以制备。此外，单克隆抗体比较大，限制其到达靶向位点。
单链抗体
单链抗体(SCA)已经成为基础研究和应用研究的对象，在诊断和治疗应用中作为替代单克隆抗体的手段。SCA是遗传制备的蛋白质，具有单克隆抗体的结合特异性和亲合性，但是较小，使得具有更大的毛细血管渗透性。SCA优越于单克隆抗体的优点包括在诊断成像和治疗中具有更大的组织渗透性，免疫原性问题更少，在机体中更特异地定位于靶向位点，以及更容易和低成本的大量制备。
通常采用短肽接头连接抗体的VH和VL链的可变区来制备SCA。用于连接这些可变区的合适接头是使VH和VL区折叠成具有三维结构的单一多肽链的接头，该三维结构保持完整抗体的结合特异性。对于单链抗体结合蛋白的理论和制备方法的描述存在于Ladner等，美国专利4,946,778、5,260,203、5,455,030和5,518,889，以及Huston等，美国专利5,091,513(“生物合成抗体结合位点”″(BABS))，这些公开在此全部引入作为参考。根据上面的专利所采用的方法制备的单链抗原结合蛋白具有与相应的Fab片段基本上相似的结合特异性和亲合性。
Fc区
当抗体被暴露于蛋白质水解酶时，例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶，生成多种主要片段。保留抗原结合能力的片段由抗体的Y构象的两个“臂”构成，被称作Fab(抗原结合片段)或者Fab′2，Fab′2表示两个Fab臂通过二硫键连接。生成的其它主要片段组成Y的单个“尾部”或中心轴，由于其容易从溶液结晶，被称作Fc(结晶片段)。IgG、IgA、IgM和IgD的Fc片段由各种抗体的两个羧基末端区域的二聚体构成(即，IgG、IgA和IgD的CH2和CH3，以及IgM的CH3和CH4)。相反，IgE的Fc由其三个羧基末端的重链区构成(Cε2，Cε3和Cε4)。
Fc片段由抗体生物学“活性位点”构成，该活性位点使得抗体能够与其它的免疫系统分子或细胞联系，从而激活或调节免疫系统的防御功能。当抗体区域中的活性位点结合到称作Fc受体的分子上时，发生这种联系。
Fc受体是与具有免疫球蛋白Fc区的分子活性位点高亲合性和特异性结合的分子。Fc受体可能作为完整的膜蛋白存在于细胞外质膜中，或者作为游离的“可溶的”分子存在，在血浆或其它体液中自由地循环。
五种抗体种类中的每一种具有多种类型的Fc受体，该受体结合到特定类型的Fc区上，具有独特的功能。因此，IgE的Fc的受体仅与IgE Fc区或者分离的IgE Fc片段高亲合性地结合。已知存在特异于Fc受体的不同类型的种类，其识别和结合Fc区中的不同部位。例如，一些IgG Fc受体专一结合IgG的第二恒定区(CH2)，而介导其它免疫功能的Fc受体专一地结合IgG的第三恒定区(CH3)。其它IgG Fc受体结合位于CH2和CH3区的活性位点，不能结合单一的隔离的区域。
一旦被抗体Fc区活性位点激活，Fc受体介导各种主要的免疫杀伤和调节功能。某些IgG Fc受体，例如介导直接杀死抗体通过其Fab臂结合的细胞(抗体依赖的细胞调节细胞毒性--(ADCC))。当被IgG结合时，其它IgG Fc受体通过称作吞噬作用的过程，刺激一些白细胞参与和破坏细菌、病毒、癌细胞或其它实体。位于某些称作B淋巴细胞的白细胞上的Fc受体调节细胞的生长，发育成分泌抗体的血浆细胞。当被抗原连接的IgE结合时，位于一些称作嗜碱细胞和肥大细胞的白细胞上的Fc受体起动过敏反应，表现为枯草热和哮喘。
一些可溶的Fc受体作为血液补体系统的一部分，起动能够杀死细菌、病毒和癌症细胞的炎症反应。其它Fc受体刺激某些白血球细胞分泌强有力的调节的或细胞毒性的分子，在遗传学上称作淋巴因子，淋巴因子有助于免疫防御。这些仅仅是抗体Fc受体调节的免疫活动的少数代表性例子。
组成抗体功能的氨基酸的大部分是决定抗体结构的分子“支架”(scaffolding)，一种高度规则的三维形状。正是该支架具有正确暴露和空间朝向的抗体活性位点的重要功能，该位点由多个氨基酸簇构成。特定活性位点根据其功能，可能已经被暴露，因而能够结合分子受体。可替代地，特定的活性位点可能被隐藏，直到抗体结合到抗原上，而后支架改变其方向，并随即暴露抗体的活性位点。然后，被暴露的活性位点结合到细胞表面上或者作为可溶分子的部分(例如补体)的特异Fc受体上，接着起动特定免疫反应。
由于抗体支架的功能是保持和固定其活性位点，以结合到细胞或可溶分子上，当抗体活性位点作为肽被分离和合成时，具有完整的抗体分子的免疫调节功能。
取决于活性位点肽所结合的特定类型的Fc受体，该肽可能激活或抑制免疫功能。如果Fc受体为被结合到Fc区的作用激活的类型时，可选择地，如果Fc活性位点肽刺激受体时，发生激活。产生的刺激的类型包括，但是不限于，直接起作用或者间接地受抗体Fc区-Fc受体结合调节。这种功能的例子包括，但是不限于，由特定类型的白细胞(多核形嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞)的吞噬作用激活；巨噬细胞活化；抗体依赖的细胞调节的细胞毒性(ADCC)；天然杀伤(NK)细胞作用；B细胞和T淋巴细胞的生长和发育，以及淋巴细胞分泌淋巴因子(具有杀伤和免疫调节活性的分子)。
发明概述
如下文的更加详细的描述，本发明包括包含至少一种抗体或CDR片段，优选抗体可变区的被修饰的Tf融合蛋白，其中Tf部分被遗传工程改造来提高该分子的体内循环半衰期或生物利用度。本发明还包括包含融合蛋白的药物制剂和组合物，通过融合到被修饰的转铁蛋白上，提高抗体或CDR片段的体内循环半衰期和生物利用度的方法，编码被修饰的Tf融合蛋白的核酸分子等。本发明的另一个方面涉及用被修饰的Tf融合蛋白治疗患者的方法。
优选地，被修饰的Tf融合蛋白包含被修饰来减少或防止糖基化和/或铁和受体结合的人转铁蛋白Tf部分。
在一个方面，本发明提供包含被连接到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白上的SCA或CDR片段的“转移体”(“trans-bodies”)。该转移体可以采用不同的抗体可变区来构建，用于各种制药的和诊断的应用。
在另一个方面，本发明提供包含被融合到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白上的一种或多种抗原性肽和抗体可变区的转移体。这些转移体不仅具有结合抗原的能力，而且能够在宿主中诱导免疫反应。本发明还提供包含一种或多种抗原结合肽的转移体。
而且，本发明的转移体包含被融合到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白分子上的抗毒素的抗体。此外，本发明的转移体包含被融合到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白分子上的CDR。毒素的例子包括但是不限于肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、难辨梭菌(Clostridium difficile)和炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)。
附图简介
附图1显示人(Hu)转铁蛋白(Tf)的N末端结构域和C末端结构域(SEQ IDNO：3的氨基酸1-331和332-679)的比对，相似和相同部分用高亮显示。
附图2A-2B显示来自不同物种的转铁蛋白序列之间的比对(SEQ IDNO：81-87)。淡阴影：相似；浓阴影：相同。
附图3显示治疗性蛋白、多肽或肽的大量Tf外露表面插入位点的位置。
附图4A-4B显示用于制备被修饰的融合蛋白的大量优选抗-TNFα的抗体的VH(SEQ ID NO：88-93)和VL(SEQ ID NO：94-44)。
附图5显示在存在50U/ml TNFα时，用N末端结构域(N-domain)/TNFCDR以及仅N末端结构域处理WEHI-164细胞的吸收值。各个柱表示各个条件下的三个重复孔的平均值。较高的吸收值表示较高的代谢活性。
详细描述
总体描述
本发明部分地基于发明人发现可以通过将SCA遗传融合到转铁蛋白、被修饰的转铁蛋白，或转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白的足以延长分子的体内半衰期的部分上来稳定抗体、抗体片段、CDR区和SCA，以提高它们的体内血清半衰期和/或活性。被修饰的转铁蛋白融合蛋白包括被共价连接到SCA抗体或抗体片段上的转铁蛋白或其结构域，其中与野生型转铁蛋白序列相比，转铁蛋白被修饰以含有一个或多个氨基酸取代、插入或删除。在一个实施方案中，Tf融合蛋白被工程化来减少或防止Tf或Tf结构域中的糖基化。在另一个实施方案中，Tf蛋白或Tf结构域被修饰以显示减少或不结合铁或碳酸根离子，或者对Tf受体(TfR)的亲合性降低或不结合Tf受体。
在一个实施方案中，本发明提供包含被融合或插入到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白上的抗体可变区的融合蛋白。特别地，本发明部分地基于使用转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白来连接至少两个抗体的可变区，形成被修饰形式的SCA。以这种方式形成的SCA融合蛋白能够结合目标抗原，并且具有转铁蛋白的长的循环半衰期。
通常，用短肽连接两个可变区来制备SCA。这种肽可以具有任何序列，通常主要是由于其三维结构而被选择，而不是其序列同源或生物学功能。但是，由于这种肽不是天然产物，会导致免疫反应。与短肽不同，转铁蛋白是一种天然存在蛋白质，不具有抗原性。采用转铁蛋白作为接头形成的SCA是一种转移体，即具有抗体活性的转铁蛋白。转移体在药学上是有用的，并且容易在微生物系统例如酵母中制备。此外，大而可溶的转铁蛋白主链有助于溶解和稳定连接在其上的可变区。转移体可以采用各种可变区来制备，被用于各种药学和诊断的应用。
因此，本发明包括转移体，包含转移体的治疗性组合物，以及通过施用转移体来治疗、预防或缓解疾病或症状的方法。本发明的转移体包括至少一个抗体可变区和至少一个被修饰的转铁蛋白的片段或变体，它们相互结合在一起，优选通过遗传融合(即，通过核酸翻译来生成转移体，其中编码抗体可变区的全部或部分的多核苷酸在读框内与编码被修饰的转铁蛋白的全部或部分的多核苷酸相连接)。在优选实施方案中，本发明提供包含抗体可变区的转移体，抗体可变区选自VH、VL或者一个或多个CDR区。一旦抗体可变区和转铁蛋白是转铁蛋白融合蛋白的一部分时，可以被称作转铁蛋白融合蛋白的“部分”、“区域”或“部分(moiety)”(例如“SCA或抗体可变区部分”或者“转铁蛋白部分”)
在一个实施方案中，本发明提供转移体，其包含或者可替代地由抗体可变区和转铁蛋白或者被修饰的转铁蛋白组成。在其它实施方案中，本发明提供转移体，其包含或者可替代地由生物活性的抗体可变区和转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白组成。在其它实施方案中，本发明提供转移体，其包含或者可替代地由抗体可变区例如人源化抗体可变区的生物活性和/或治疗活性变体与转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白组成。在另一个实施方案中，本发明提供一种包含抗体可变区以及被修饰的转铁蛋白的生物活性和/或治疗活性片段的转移体。
此外，本发明公开包含至少一个抗原性肽或免疫调节肽的转移体。这种转移体不仅能够结合其抗原，而且能够在宿主中诱导免疫反应。
除非另外定义，在此所用的所有科学技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意义。虽然任何类似或等同于在此所描述的那些方法和材料的方法和材料可以被用于实施和验证本发明，优选的方法和材料被描述。
定义
如在此所用，术语“抗体可变区”包含一个或多个VH、VL或CDR区。
如在此所用，术语“转移体”是指具有抗体活性的转铁蛋白。优选地，转移体包含至少一个抗体可变区和转铁蛋白分子、被修饰的转铁蛋白或其片段。转移体还包含一种或多种能够在宿主中引起免疫反应的抗原性肽。
如在此所用，术语“抗体”是指由实质上由一种或多种由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括kappa、lambda、alpha、gamma、delta、epsilon和mu恒定区的基因，以及大量免疫球蛋白可变区基因。轻链被划分为kappa或lambda。重链分为gamma、mu、alpha、delta或epsilon，它们反过来定义免疫球蛋白的分类，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
抗体可能以完整的免疫球蛋白存在，或者以各种形式的修饰物存在，包括例如，仅含有轻链和重链可变区的Fv片段、含有可变区和部分恒定区的Fab或(Fab)′2片段、单链抗体(Bird等，Science 242：424-426(1988)；Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)都在此引入作为参考)，等等。抗体抗原可以是动物(特别是小鼠或大鼠)或者人类来源的，或者是嵌合的(Morrison等，Proc Natl.Acad.Sci.USA81，6851-6855(1984)在此引入作为参考)或者人源化的(Jones等，Nature 321，522-525(1986)，和公开的英国专利申请#8707252，都在此引入作为参考)。如在此所用，术语“抗体”包括这些不同形式。
术语“抗体的单链可变片段”(scFv)或者“单链抗体”(SCA)用于此是指含有通过肽接头(L)被连接到VH结构域上的VL结构域的多肽，用VL-L-VH表示。可以颠倒VL结构域和VH结构域的顺序来获得称作为VH-L-VL的多肽。“结构域”或者“区域”是推定具有分散功能的蛋白质区段，例如具有抗原结合或抗原识别功能。
如在此所用，术语“多价单链抗体”是指通过肽接头共价连接的两个或多个单链抗体片段。可连接抗体片段来形成二价单链抗体，具有如下的VL和VH结构域的顺序：VL-L-VH-L-VL-L-VH；VL-L-VH-L-VH-L-VL；VH-L-VL-L-VH-L-VL；或者VH-L-VL-L-VL-L-VH。单链多价抗体是三价或者更高价的，一个或多个抗体片段通过其它中间肽接头被连接到二价单链抗体上。在优选实施方案中，VL和VH结构域的数量是相同的。
如在此所用，“Fv”区是指含有可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体Fv区。重链和轻链可以来源于相同的抗体，或者不同抗体从而产生嵌合的Fv区。
如在此所用，术语“超变区”是指抗体上负责抗原结合的氨基酸残基。超变区包含来自“互补决定区”或者“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变区中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，和重链可变区的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat等，免疫学重要的蛋白质的序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest)，第5版.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991))和/或那些来自“超变环”的残基(即轻链可变区中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及重链可变区中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。“架构”(Framework)或“FR”残基是那些不同于在此定义的超变区残基的可变区的残基。
本领域熟知，抗体的互补决定区(CDRs)是主要决定抗体特异性的抗体部分。CDR直接与抗原表位相互作用(参见，Clark，1986；Roitt，1991)。在IgG免疫球蛋白的重链和轻链可变区中，存在由三个互补决定区(CDR1到CDR3)分开的四个架构区(FR1到FR4)。架构区(FRs)维持抗体结合部的三级结构，抗体结合部是抗体的一部分，参与与抗原的作用。CDRs，特别是CDR3区，更特别为重链的CDR3，使抗体产生特异性。由于这些CDR区特别是CDR3区使抗体具有抗原特异性，这些区域被插入到转移体上，使该单位具有相同的抗原特异性。
可以通过本领域已知的方法来确定用于合成本发明的转移体的CDR区的序列。重链可变区是通常长度为100-150个氨基酸范围的肽。轻链可变区是通常长度为80-130个氨基酸范围的肽。重链和轻链可变区中的CDR序列仅包括约3-25个氨基酸序列，容易由本领域技术人员测序确定。甚至可以通过商业来源合成这种肽，例如由Scripps Protein and Nucleic Acids CoreSequencing Facility合成(La Jolla Calif.)。
在其它实施方案中，CDR区或序列可以作为肽序列文库随机制备，用标准分析来筛选具有期望结合特性或功能特性的CDR区或序列。在一个物种中，不同轻链或重链的构架区的序列相对保守。如在此所用，“人架构区”是与天然的人免疫球蛋白的架构区实质上相同(约85％或更高，通常约90-95％或更高)的架构区。抗体的架构区是组成轻链和重链的组合架构区，起安置(position)和排列CDR作用。
如在此所用，术语“结合结构域”是指如下的一种或组合：(a)免疫球蛋白(IgG、IgM或其它免疫球蛋白)的VL区加VH区；(b)免疫球蛋白(IgG、IgM或其它免疫球蛋白)的VL区加VL区；(c)免疫球蛋白(IgG、IgM或其它免疫球蛋白)的VH区加VH区；(d)免疫球蛋白(IgG、IgM或其它免疫球蛋白)的单一VL区；(e)免疫球蛋白(IgG、IgM或其它免疫球蛋白)的单一VH区或者一个或多个CDR肽序列；或者(f)具有与CDR肽类似的抗原结合活性的肽。
如在此所用，术语“人源化的”是指非人的(例如鼠的)抗体的形式，是特异的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如抗体的Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或者其它抗原结合亚序列)，含有来源于非人的免疫球蛋白的最小序列。对于大部分，人源化的抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的超变区的残基被具有期望特异性、亲合性和性能的来自非人物种(供体抗体)的超变区的残基取代，非人物质例如小鼠、大鼠或兔子。在有些情形下，人免疫球蛋白的Fv架构区(FR)的残基被相应的非人的残基取代。而且，人源化的抗体可能包括存在于受体抗体或供体抗体的残基。进行这些修饰来进一步改进和优化抗体性能。总之，人源化抗体将包含实质上至少一个，和通常两个可变区的全部，其中全部或实质上全部超变区对应于非人类的免疫球蛋白的那些超变区，全部或者实质上全部FR区是人免疫球蛋白的一致序列的那些FR区。人源化的抗体最佳地还包含至少一部分免疫球蛋白的恒定区或者结构域(Fc)，通常为人免疫球蛋白的Fc区。
如在此所用，术语“生物活性”是指治疗性分子、蛋白或肽，优选抗体可变片段或CDR区，在生物学范围内(context)(在生物体中或其体外模拟物中)执行的功能或一整套的活性。生物活性可以包括但是不限于要求保护的融合蛋白的抗体部分的功能。如果本发明的融合蛋白或肽具有抗体的天然配对物(Counterpart)的一种或多种生物学活性，或者与被检测的转移体的体内或体外分析中具有可辨别的反应，则融合蛋白或肽被视为具有生物学活性。
如在此所用，转铁蛋白序列中的“相应氨基酸”或“等价氨基酸”是通过比对来最大化第一条转铁蛋白序列和至少第二条转铁蛋白序列之间的相同性和相似性而确定的。用于在第二条序列中确定相当的氨基酸的编号是基于用于在第一条序列中确定相应氨基酸的编号。在某些情况下，这些短语被用于描述与兔血清转铁蛋白或者来自其它物种的转铁蛋白的特定氨基酸相对的人转铁蛋白中的氨基酸残基。
如在此所用，术语“Tf蛋白片段”或“Tf蛋白”或“Tf蛋白部分”是指包含天然Tf蛋白或其天然突变体的至少约5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的氨基酸序列。
如在此所用，术语“基因”是指与生物学功能相关的DNA的任何区段。因此，基因包括，但是不限于，编码序列和/或其表达所需的调控序列。基因还可以包括未被表达的DNA片段，例如，构成其它蛋白的识别序列的DNA片段。基因可以从各种来源中获得，包括从目标来源中克隆得到，或从已知的或预测的序列信息中合成，而且包括具有期望参数的被设计的序列。
如在此所用，“异源多核苷酸”或“异源核酸”或“异源基因”或“异源序列”或“外源的DNA区段”是指从特定宿主细胞之外的来源获得的多核苷酸、核酸或DNA区段，或者，如果来自相同来源，则被修饰以区别于其原始形式。宿主细胞中的异源基因包括特定宿主细胞的内在的、但是被修饰的基因。因此，该术语是指细胞的外源或异源的、或者与细胞同源但是存在于该宿主细胞的核酸中的该元件通常不存在的位置上的DNA区段。作为例子，被连接到人Tf序列上的酵母细胞天然信号序列是异源的。
如在此所用，“被分离的”核酸序列是指基本上不含有其它核酸序列的核酸序列，例如通过琼脂糖凝胶电泳确定至少约20％纯度，优选至少约40％纯度，更加优选至少约60％纯度，甚至更加优选约80％纯度，最优选约90％纯度，和甚至最优选约95％纯度。例如，可以通过在遗传工程加工中将核酸序列从其天然位置重新定位到其将被复制的不同位置上的标准克隆操作来获得被分离的核酸序列。克隆操作可以包括切除和分离包含编码多肽的核酸序列的期望核酸片段，将该片段插入到载体分子上，和将重组载体插入到宿主细胞中，在宿主细胞中，核酸序列的多个拷贝或克隆被复制。核酸序列可以是基因组的、cDNA、RNA、半合成来源的或它们的任何组合。
如在此所用，当DNA编码序列被翻译成多肽时，由于DNA编码序列之间的读框内融合，两条或多条编码序列被认为“被连接”或“被融合”。
如在此所用，当涉及Tf融合时，术语“融合”包括，但是不限于，至少一种治疗性蛋白、多肽或肽，优选抗体可变区，被连接到Tf的N末端，被连接到Tf的C末端，被插入到Tf中的任何两个氨基酸之间，和/或替换一部分Tf序列，例如Tf环。
如在此所用，“被修饰的转铁蛋白”用于此来指与野生型转铁蛋白相比，氨基酸序列具有至少一种修饰的转铁蛋白分子。在优选实施方案中，“被修饰的转铁蛋白”是指被修饰的转铁蛋白，减少或无糖基化，降低或不结合铁或碳酸盐，以及降低或不结合转铁蛋白受体。
如在此所用，“被修饰的转铁蛋白融合蛋白”被用于此是指通过将至少一个被修饰的转铁蛋白分子(或其片段或变体)融合到至少一个治疗性蛋白分子(或其片段或变体)，优选抗体可变片段或CDR上形成的蛋白质。
如在此所用，术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸及其聚合物。除非特别限定，该术语包括含有与参比核酸具有类似结合特性的天然核苷酸的类似物的核酸，并且以与天然核苷酸相似的方式被代谢。除非另外指出，特定核酸序列还含蓄地包括其保守性修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及被明确指定的序列。特别地，简并密码子取代可以通过生成其中一个或多个所选择(或全部的)密码子的第三个位置用混合碱基和/或脱氧次黄苷残基取代的序列(Batzer等(1991)NucleicAcid Res.19：5081；Ohtsuka等(1985)J.Biol.Chem.260：2605-2608；Cassol等(1992)；Rossolini等(1994)Mol.Cell.Probes 8：91-98)。术语核酸与基因、cDNA和由基因编码的mRNA互换使用。
如在此所用，当DNA区段与另一种DNA区段处于功能性关联时，被称作是“被可操作地连接的”。例如，信号序列的DNA以参与融合蛋白分泌的前蛋白(preprotein)被表达时，则其被可操作地连接到编码本发明的融合蛋白的DNA上；如果启动子或增强子刺激序列的转录，则被可操作地连接到编码序列上。一般地，被可操作地连接的DNA序列是相邻的，并且在为信号序列或融合蛋白的情况下，为相邻的并在读框内。但是，增强子与转录被其所控制的编码序列可以不必是相邻的。在本文中，连接是通过在便利的限制性位点连接或在被插入到该位置上的连接物或接头上进行连接来完成。
如在此所用，术语“启动子”是指参与结合RNA聚合酶来起始转录的DNA的区域。
如在此所用，术语“重组体”是指已经用基因或DNA的新组合转化的细胞、组织或生物体。
如在此所用，靶向单位、蛋白质、多肽或肽是指特异地结合到特定细胞类型上[正常(例如，淋巴细胞)或异常例如(癌细胞)]的分子，因而可以被用于将转移体或化合物(药物或细胞毒性剂)特异地靶向该细胞。
如在此所用，“治疗性蛋白质”是指包括(induce)蛋白质、多肽、SCA、抗体可变片段、CDR或肽或其片段或变体，具有一种或多种治疗性和/或生物学活性。术语肽、蛋白质和多肽在此被相互交换使用。此外，术语“治疗性蛋白质”是指治疗性蛋白质的内在的或天然的相关物(correlate)。“治疗活性”的多肽或具有“治疗活性的”蛋白质是指具有一种或多种已知的与治疗性蛋白质相关的生物学的和/或治疗性活性的多肽，治疗性蛋白质例如在此公开或本领域另外知晓的一种或多种治疗性蛋白质。作为非限制性例子，“治疗性蛋白质”是用于治疗、预防或缓解疾病、症状或紊乱的蛋白质。这种疾病、症状或紊乱可以是人或非人类动物患有的，例如兽医用途。
如在此所用，术语“转化”是指核酸(即核酸聚合物)转移到细胞中。如在此所用，术语“遗传转化”是指DNA特别是重组DNA转移和结合到细胞中。
如在此所用，术语“转化体”是指已经转化的细胞、组织或生物体。
如在此所用，术语“转基因”是指以确保其功能的方式被插入到生物体、宿主细胞或载体中的核酸。
如在此所用，术语“转基因的”是指细胞、细胞培养物、生物体、细菌、真菌、动物、植物，它们的任何一种的后代，通过各种转化方法之一接受外源的或被修饰的基因，特别是编码被修饰的Tf融合蛋白质的基因，其中外源的或被修饰的基因来自与接受外源的或被修饰的基因的生物体种类相同或不同的种类。
“变体”(variants or variant)是指不同于参比核酸或多肽但保留其基本特性的多核苷酸或核酸。一般地，变体大体上是非常相似的，并且在许多区域与参比核酸或多肽相同。如在此所用，“变体”是指本发明的转铁蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分，其序列区别于天然治疗性蛋白质，但是保留至少其一种本文别处或本领域另外知晓的功能的和/或治疗的特性。
如在此所用，术语“载体”泛指任何编码外源核酸的质粒、噬菌粒或病毒。该术语还被解释为包括非质粒、非噬菌粒和非病毒的化合物，其方便将核酸转移到病毒子或细胞中，例如，多溶素化合物等。载体可以是适合作为将核酸或其突变体呈递给细胞的呈递媒介的病毒载体，或者该载体可以是适用于相同目的的非病毒载体。用于将DNA呈递给细胞和组织的病毒和非病毒载体的例子在本领域是熟知的，并且被描述在，例如Ma等(1997，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：12744-12746)中。病毒载体的例子包括，但是不限于，重组病毒载体、重组腺病毒、重组逆转录病毒、重组腺伴随病毒、重组鸟痘病毒等(Cranage等1986，EMBO J.5：3057-3063；1994年8月18日公开的国际专利申请WO 94/17810；1994年10月27日公开的国际专利申请WO94/23744)。非病毒载体的例子包括，但是不限于，脂质体、DNA的多胺衍生物等。
如在此所用，术语“野生型”是指天然存在的多核苷酸或多肽序列。
如在此所用，术语“毒素”是指生物学来源的有毒物质。
如在此所用，术语“免疫调节”是指在B细胞或T细胞水平上提高或降低抗原特异的免疫反应的能力。可以例如在T细胞增殖分析中，通过测定抗体生成、淋巴因子生成或T细胞响应来检测免疫调节活性。特别地，除了影响T细胞反应，本发明的免疫调节多肽可能结合到B细胞表面的免疫球蛋白(即抗体)分子上，影响B细胞反应。
如在此所用，术语“免疫调节肽”是影响免疫反应的肽。
如在此所用，术语“Fc区”是指由恒定区组成的抗体分子的茎部。Fc区也被称作效应区。Fc区与免疫系统的其它组分相互作用，将存在细菌的信号转换为细胞反应。抗体的Fc区是在免疫反应过程中产生不同读出(readout)的重要区域。该区域由重链组成，在免疫反应过程中改变读出的方式将会改变抗体的Fc区的结构。通过改变恒定区，将改变抗体的类型。该过程被称作类别转换(class switching)，发生在B淋巴细胞中。
单链抗体和转移体
与常规抗体相比，单链抗体较小，可以极低的成本制备。单链抗体小，可能降低机体的免疫反应，从而提高治疗应用的安全性和效率。而且，单链抗体可以被加工成具有高度抗原性。
各种单链抗体(SCA)最初被发明来简化抗体筛选和生产。但是，由于个体小，会发生自凝聚，并且体内半衰期短，单链抗体被证明具有有限的治疗价值或者无治疗价值。将转铁蛋白添加到SCA上，显著地提高SCA的体内半衰期、稳定性，并且容易制备。
因此，来自SCA的组分可以被融合到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白的N末端、C末端或者N末端和C末端上(VL、VH和/或一个或多个CDR区)。还可以采用转铁蛋白的不同部分或结构域来进行这种融合，例如N末端结构域或C末端结构域。这些蛋白可以被直接融合或者采用各种长度的接头肽来融合。还可能将活性SCA的全部或部分融合在转铁蛋白的支架中。在这种情况下，通过将SCA的cDNA插入到转铁蛋白的cDNA中，在细胞中生产融合蛋白。
在一个实施方案中，可以将两个VH区或两个VL区连接到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白的两端，或者插入转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白中。在另一个实施方案中，可以将一个VH区或一个VL区连接到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白的两端，或者插入转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白中。通过接头(L)将可变区相互连接，然后融合或插入到转铁蛋白中。接头是被共价地连接到可变结构域上的分子，使得容易连接或插入到Tf上。总的来说，接头和Tf在两个结构域之间产生足够大的空间和灵活性，使得结构域能够形成一种构象，在该构象中，结构域能够特异地结合其所定向的表位。此外，可以修饰转铁蛋白，使得连接到两个末端的可变区紧贴在一起。这种修饰包括，但是不限于，去除C末端脯氨酸和/或接近Tf的C末端的半胱氨酸环，产生更大的灵活性。
本发明还包括多价转移体。具有VH-L-VH顺序的抗体可变区可以被融合到转铁蛋白的一端，而具有VL-L-VL顺序的抗体可变区可以被融合到同一个转铁蛋白的另一端。本发明还包括形成多价SCA的可变区的其它序列。例子包括，但是不限于，VH-L-VL和VL-L-VH，以及具有更多可变区相互连接的那些序列。还可以将可变区和接头插入到转铁蛋白分子中。
可替代地，多价抗体的可变区可以通过将可变结构域插入到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白分子中来形成，而不使用任何非自然的肽接头。通过这种方式，转铁蛋白分子中作为接头的部分在可变结构域之间形成空间和灵活性。
在本发明的一个方面，可以将结合相同抗原的可变区融合到相同转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白的不同末端。在本发明的另一个方面，结合不同抗原的可变区被融合到相同的转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白的不同末端。这种转移体能够连接两种不同抗原或者结合和/或激活两种不同的细胞。因此，本发明提供被融合到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白上的嵌合抗体可变区。此外，该可变区可以被插入到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白分子中。
本发明包括特异地结合期望多肽、肽或表位的转移体。如果1)转移体具有结合活性的阈值，和/或2)不会显著地与无关的多肽分子发生交叉反应，则转移体被确定是特异地结合。在某些情况下，如果转移体结合期望多肽、肽或表位的亲合性超过结合对照多肽的亲合性至少10倍，则转移体发生特异性结合。优选地，转移体具有106M-1或更高的结合亲合性(Ka)，优选为107M-1或更高，更加优选为108M-1或更高，最优选为109M-1或更高。本发明的转移体的结合亲合性容易由本领域技术人员采用标准的抗体亲合性分析方法来确定，例如Scatchard分析(Scatchard，G.，Ann.NY Acad.Sci.51：660-672，1949)。
在另一个实施方案中，如果转移体未显著地与无关多肽发生交叉反应，则被确定发生特异性结合。如果采用标准的Western印迹分析检测到期望的多肽、肽或表位，但是未检测到无关多肽，则转移体未显著地与无关多肽分子发生交叉反应。在有些情况下，无关多肽是orthologs，来自相同物种的蛋白质，是蛋白质家族的成员。
制备转移体的抗体可变区
将来自许多抗体的可变区转化成适合插入转铁蛋白来制备转移体的形式。包括抗erbB2、B3、BR96、OVB3、抗转铁蛋白、Mik-β1和PR1(分别参见Batra等，Mol.Cell.Biol.，11：2200-2205(1991)；Batra等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5867-5871(1992)；Brinkmann等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8616-8620(1991)；Brinkmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：547-551(1993)；Chaudhary等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：1066-1070(1990)；Friedman等，Cancer Res.53：334-339(1993)；Kreitman等，J.Immunol.，149：2810-2815(1992)；Nicholls等，J.Biol.Chem.，268：5302-5308(1993)；和Wells等，CancerRes.，52：6310-6317(1992))。
典型地，Fv结构域选自本领域知晓的缩写为26-10、MOPC 315、741F8、520C9、McPC 603、D1.3、鼠phOx、人phOx、RFL3.8sTCR、1A6、Sel55-4、18-2-3、4-4-20、7A4-1、B6.2、CC49、3C2、2c、MA-15C5/K12Go、Ox等的单克隆抗体(参见，Huston，J.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)；Huston，J.S.等，SIM News 38(4)(副刊)：11(1988)；McCartney，J.等，ICSU Short Reports 10：114(1990)；Nedelman，M.A.等，J.Nuclear Med.32(副刊)：1005(1991)；Huston，J.S.等，分子设计与建模：概念和应用(Molecular Design and Modeling：Concepts and Applications)，B部，J.J.Langone编辑，Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Huston，J.S.等，单克隆抗体在临床肿瘤学中的应用的进展(Advances in the Applications ofMonoclonal Antibodies in Clinical Oncology)，Epenetos，A.A.(编辑)，伦敦，Chapman & Hall(1993)；Bird，R.E.等，Science 242：423-426(1988)；Bedzyk，W.D.等，J.Biol.Chem.265：18615-18620(1990)；Colcher，D.etal.，J.Nat.Cancer Inst.82：1191-1197(1990)；Gibbs，R.A.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4001-4004(1991)；Milenic，D.E.et al.，Cancer Research 51：6363-6371(1991)；Pantoliano，M.W.et al.，Biochemistry 30：10117-10125(1991)；Chaudhary，V.K.etal.，Nature 339：394-397(1989)；Chaudhary，V.K.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1066-1070(1990)；Batra，J.K.etal.，B iochem.Biophys.Res.Comm.171：1-6(1990)；Batra，J.K.etal.，J.Biol.Chem.265：15198-15202(1990)；Chaudhary，V.K.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：9491-9494(1990)；Batra，J.K.等，Mol.Cell.Biol.11：2200-2205(1991)；Brinkmann，U.等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 88：8616-8620(1991)；Seetharam，S.等，J.Biol.Chem.266：17376-17381(1991)；Brinkmann，U.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3075-3079(1992)；Glockshuber，R.等，Biochemistry 29：1362-1367(1990)；Skerra，A.等，Bio/Technol.9：273-278(1991)；Pack，P.等，Biochemistry 31：1579-1534(1992)；Clackson，T.等，Nature 352：624-628(1991)；Marks，J.D.等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)；Iverson，B.L.等，Science 249：659-662(1990)；Roberts，V.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6654-6658(1990)；Condra，J.H.等，J.Biol.Chem.265：2292-2295(1990)；  Laroche，Y.等，J.Biol.Chem.266：16343-16349(1991)；Holvoet，P.等，J.Biol.Chem.266：19717-19724(1991)；Anand，N.N.等，J.Biol.Chem.266：21874-21879(1991)；Fuchs，P.等，Bio/Technol.9：1369-1372(1991)；Breitling，F.等，Gene 104：104-153(1991)；Seehaus，T.等，Gene 114：235-237(1992)；Takkinen，K.等，Protein Engng.4：837-841(1991)；Dreher，M.L.等，J.Immunol.Methods 139：197-205(1991)；Mottez，E.等，Eur.J.Immunol.21：467-471(1991)；Traunecker，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：8646-8650(1991)；Traunecker，A.等，EMBO J.10：3655-3659(1991)；Hoo，W.F.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：4759-4763(1993))。
表1提供各种单克隆抗体，其可变区和CDR可以用于制备转移体。
表1单克隆抗体
  分类     亚分类     药名     品牌     征候     靶点
                                                               抑制B细胞和T细胞活化
    1 免疫学 抑制B细胞和T细胞活化     BMS-188667   关节炎，类风湿牛皮癣移植排斥，骨髓   CD-80
    2 免疫学 抑制B细胞和T细胞活化     抗B7MABs，Wyeth   移植排斥，一般性移植排斥，骨髓   α-4/β-7整联蛋白受体
    3 免疫学 抑制B细胞和T细胞活化     BlyS拮抗剂，CAT   狼疮红斑，系统性关节炎，类风湿   BLyS
    4 免疫学 抑制B细胞和T细胞活化     efalizumab   牛皮癣移植排斥，一般性关节炎，类风湿   CD11α(α整联蛋白)
    5 免疫学 抑制B细胞和T细胞活化     gavilimomab   移植排斥，一般性移植排斥，骨髓   CD147
    6 免疫学 抑制B细胞和T细胞活化     siplizumab   移植排斥，骨髓牛皮癣，关节炎，牛皮癣的   T细胞
    7 免疫学 抑制B细胞和T细胞活化     Basiliximab     Simulect   肾移植患者中的急性排斥的预防   IL2受体或CD25抗原
    8 免疫学 抑制B细胞和T细胞活化     Dacizumab     Zenapax   移植排斥，一般性各种癌症和自体免疫疾病   IL2的α亚基
    9 免疫学 抑制B细胞和T细胞活化     OKT3A     Orthoclone   移植排斥   CD3
  10   免疫学   抑制B细胞和T细胞活化   抗CD3H   移植排斥，一般性局部缺血，脑再灌注损伤梗塞，心肌炎，一般性   CD3H
  11   免疫学   抑制B细胞和T细胞活化   MuromonabCD3   移植排斥   CD3
  12   免疫学   抑制B细胞和T细胞活化   Visilizumab   移植排斥，骨髓癌，淋巴瘤，T细胞，结肠炎，溃疡，脊髓发育不良综合症，狼疮红斑，系统性   CD3
  13   免疫学   抑制B细胞和T细胞活化   clenoliximab   关节炎，类风湿哮喘牛皮癣   CD4
  14   免疫学   抑制B细胞和T细胞活化   HuMax-CD4   关节炎，类风湿，牛皮癣   T淋巴细胞上的CD4受体
  15   免疫学   抑制B细胞和T细胞活化   TNX-100   Crohn病   CD40
  16   免疫学   抑制B细胞和T细胞活化   5D12   Crohn病牛皮癣   CD40
  17   免疫学   抑制B细胞和T细胞活化   HuMax-IL-15   关节炎，类风湿   IL15
  18   免疫学   抑制B细胞和T细胞活化   inolimomab   移植排斥，骨髓移植排斥，一般性   IL2受体
  19   免疫学   抑制B细胞和T细胞活化   MRA，Chugai   关节炎，类风湿癌症，骨髓瘤，Crohn病，Castleman病，关节炎，一般性   IL6
  20   免疫学   抑制B细胞和T细胞活化   Pascolizumab   哮喘   IL4
  21   免疫学   抑制B细胞和T细胞活化   AGT1   关节炎，类风湿多发性硬化，一般性   α-干扰素，γ-干扰素，TNF
  22   免疫学   抑制B细胞和T细胞活化   Afelimomab   脓毒症移植排斥，一般性   TNFα
  23   免疫学   抑制B细胞和T细胞活化   Humicade   Crohn病关节炎，类风湿大肠炎，溃疡糖尿病，II型   TNF
  24   免疫学   抑制B细胞和T细胞活化   Adalimumab   关节炎，类风湿Crohn病   TNF
  25   免疫学   抑制B细胞和T细胞活化   Infliximab   Remicade   Crohn病关节炎，类风湿牛皮癣   TNFα
  26   免疫学   抑制B细胞和T细胞活化   Etanercept   Enbrel   关节炎，类风湿牛皮癣   TNF
  27   免疫学   抑制B细胞和T细胞活化     CDP870     关节炎，类风湿Crohn病     TNFα
                                     抑制补体路径
  28   免疫学     抑制补体路径     Pexelizumab     梗塞，心肌出血，一般性局部缺血，脑     C5
  29   免疫学     抑制补体路径     Eculizumab     肾炎，一般性关节炎，类风湿狼疮肾炎牛皮癣狼疮红斑，系统性炎症，肌肉     C5补体抑制剂
    抑制巨噬细胞和嗜中性粒细胞活化
  30   免疫学   抑制巨噬细胞和嗜中性粒细胞活化     IDEC-114     牛皮癣Crohn病     CD80
  31   其他   抑制巨噬细胞和嗜中性粒细胞活化     MDX-33     血小板减少紫癜贫血，一般性     FcR1受体
  32   其他   抑制巨噬细胞和嗜中性粒细胞活化     SMART抗IL-12Mab，PDL     未指明的     IL-12
  33   免疫学   抑制巨噬细胞和嗜中性粒细胞活化     J-695     关节炎，类风湿     IL-12
  34   免疫学   抑制巨噬细胞和嗜中性粒细胞活化     fontolizumab     Crohn病牛皮癣     IFN-γ
                                                嗜曙红细胞和/或IgE路径
  35   免疫学   嗜曙红细胞和/或IgE路径     IDEC-152     哮喘     CD23
  36   免疫学   嗜曙红细胞和/或IgE路径     CAT-213     鼻炎，过敏性     eotaxin
  37   免疫学   嗜曙红细胞和/或IgE路径     E-26     哮喘鼻炎，过敏性     bcl-2
  38   免疫学   嗜曙红细胞和/或IgE路径     Reslizumab     哮喘过敏，一般性炎症，一般性     IL-5
  39   免疫学   嗜曙红细胞和/或IgE路径     mepolizumab     哮喘     IL-5
                                          调节炎症细胞的血管附着
  40   免疫学   调节炎症细胞的血管附着     MLN-02     Crohn病结肠炎，溃疡  α-4/β-7整联蛋白受体
  41   免疫学   调节炎症细胞的血管附着     MLN-01     移植排斥，一般性局部缺血，脑     整联蛋白
  42   免疫学   调节炎症细胞的血管附着     HuDREG-55Mab，PDL     创伤休克  阻断人L-选择蛋白附着到淋巴细胞
  43   免疫学   调节炎症细胞的血管附着   人源化的VAP-1MAb，BioTie     炎症，一般性    人血管indothelium抗原VAP-1
  44   免疫学   调节炎症细胞的血管附着   vepalimomab     牛皮癣湿疹，过敏性，一般性结肠炎，溃疡再灌注损伤局部缺血，大脑呼吸窘迫综合症，成人     VAP-1鼠Mab
  45   免疫学   调节炎症细胞的血管附着   natalizumab     多发性硬化，复发缓和Crohn病结肠炎，溃疡关节炎，类风湿     α-4整联蛋白
    HIV
  46   传染病     HIV     TNX-355     传染病，HIV预防     CD4
  47   传染病     HIV     Cytolin     传染病，HIV/AIDS     LFH-1
                                                 呼吸道感染
  48   传染病     呼吸道感染     IC-14     脓毒症感染，呼吸道，下呼吸道     治疗脓毒症
    肝炎
  49   传染病     肝炎     XTL-002     感染，丙(C型)肝病毒     HCV
  50   传染病     肝炎     XTL-001     感染，乙(B型)肝病毒     HCV
                                                 各种传染病
  51   传染病     各种传染病   E coli O157抗verotoxin Mab     感染，胃肠道(GI tract)     E coli O157
  52   传染病     各种传染病   palivizumab     Synagis 免疫调节剂，抗感染，用于治疗和预防婴儿的RSV肺炎     RSV
  53   传染病     各种传染病   hsp90 MabNeuTec     念珠菌属(candida)感染，一般性     hsp90
  54   传染病     各种传染病   BSYX-A110     感染，预防葡萄球菌     磷脂壁酸
  55   传染病     各种传染病   抗MRSA Mab，NeuTec     感染，MRSA     MRSA
                                        生长因子受体/激素受体
  56   癌症   生长因子受体/激素受体   EMD-72000     癌症，胃癌症，子宫颈(cervical)癌症，肺，非小细胞癌症，头部和颈部癌症，卵巢     EGFR
  57   癌症   生长因子受体/激素受体   R3     癌症，头部和颈部诊断，癌症     EGFR
  58   癌症   生长因子受体/激素受体   Cetuximab   癌症，头部和颈部癌症，肺，非小细胞癌症，结肠直肠癌症，乳腺癌症，胰腺癌症，前列腺   EGFR
  59   癌症   生长因子受体/激素受体   ABX-EGF   癌症，肾脏癌症，肺，非小细胞癌症，结肠直肠癌症，前列腺癌症，胰腺癌症，食管   EGFR
  60   癌症   生长因子受体/激素受体   trastuzumab   Herceptin   乳腺癌(BreastCancer)   HER2
  61   癌症   生长因子受体/激素受体   2C4抗体，Genentech   癌症，乳腺   HER2
  62   癌症   生长因子受体/激素受体   MDX-210   癌症，卵巢癌症，前列腺癌症，结肠直肠癌症，肾脏癌症，乳腺   HER2
                                              血液肿瘤标记
  63   癌症   血液肿瘤标记   MT-103   癌症，淋巴瘤，B细胞癌症，淋巴瘤，非Hodgkin癌症，白血病，慢性骨髓性的癌症，白血病，急性骨髓性的   CD19
  64   癌症   血液肿瘤标记   Rituximab   Rituxan   非Hodgkin淋巴瘤   CD20
  65   癌症   血液肿瘤标记   SGN-30   癌症，淋巴瘤，Hodgkin癌症，淋巴瘤，一般性   CD30
  66   癌症   血液肿瘤标记   H22xKi-4   癌症，淋巴瘤，Hodgkin   CD64和CD30
  67   癌症   血液肿瘤标记   Alemtuzumab   Campath   CLL   CD52
  68   癌症   血液肿瘤标记   Ior-t1   癌症，淋巴瘤，T细胞牛皮癣关节炎，类风湿   CD6
  69   癌症   血液肿瘤标记   apolizumab   癌症，淋巴瘤，非Hodgkin癌症，白血病，慢性淋巴细胞的癌症，一般性   HLA-DR
  70   癌症   血液肿瘤标记   抗HMI.24抗体，Chugai   癌症，骨髓瘤   HMI.24抗原
                                                  凋亡
  71   癌症     凋亡   血管生成抑制(antiangiogenesis)Mab，AME     癌症，肉瘤，平滑肌的(leiomyo)诊断，癌症(cancer)癌症(Cancer)，结肠直肠关节炎，类风湿关节炎，牛皮癣的     血管发生
  72   癌症     凋亡     Onyvax-105     癌症，结肠直肠癌症，肉瘤，一般性     CD55
  73   癌症     凋亡     TRAIL-R1Mab，CAT     癌症，一般性     TRAIL受体
                                                上皮肿瘤标记
  74   癌症     上皮肿瘤标记     MDX-220     癌症，前列腺癌症，结肠直肠     TAG-72
  75   癌症     上皮肿瘤标记     KSB-303     诊断，癌症癌症，结肠直肠癌症，胰腺     CEA
  76   癌症     上皮肿瘤标记     CeaVac     癌症，结肠直肠癌症，肺，非小细胞癌症，乳腺癌症，肝脏     CEA
  77   癌症   上皮肿瘤标记   MT-201   癌症，前列腺癌症，结肠直肠癌症，胃癌症，肺，非小细胞   Ep-CAM
  78   癌症   上皮肿瘤标记   ING-1   癌症，乳腺癌症，肺，一般性癌症，卵巢癌症，前列腺   Ep-CAM
  79   癌症   上皮肿瘤标记   IGN-101   癌症，肺，非小细胞癌症，肝脏癌症，结肠直肠癌症，食管癌症，胃   Ep-CAM
  80   癌症   上皮肿瘤标记   BrevaRexMab   癌症，骨髓瘤癌症，乳腺   MUC1抗原
  81   癌症   上皮肿瘤标记   Imuteran   癌症，乳腺癌症，卵巢
  82   癌症   上皮肿瘤标记   ABX-MA1   癌症，黑素瘤癌症，乳腺   MUC1抗原
  83   癌症   上皮肿瘤标记   Therex   癌症，乳腺   MUC1
                                               抗血管发生
  84   癌症     抗血管发生   Bevacizumab     癌症，结肠直肠癌症，乳腺癌症，肺，非小细胞癌症，肾脏视网膜病，糖尿病     VEGF
                                              多种肿瘤标记
  85   癌症     多种肿瘤标记   CDP-860     癌症，一般性再狭窄     PDGF-β受体
  86   癌症     多种肿瘤标记   Oregovomab     癌症，卵巢     CA125
  87   癌症     多种肿瘤标记   MDX-010     癌症，前列腺癌症，黑素瘤感染，一般性     CTLA-4
  88   癌症     多种肿瘤标记   Ecromeximab     癌症，黑素瘤     GD3神经节苷脂
  89   癌症     多种肿瘤标记  HuJ591 Mab，BZL     癌症，前列腺癌症，一般性     PSMA
  90   癌症     多种肿瘤标记   抗-PTHrP抗体，Chugai     恶性高钙血癌症，骨     PTHrP
  91   癌症     多种肿瘤标记     AR54     癌症，卵巢     TAG72
  92   癌症   多种肿瘤标记   PharmaprojectsNo.5876   癌症，一般性
  93   癌症   多种肿瘤标记   前列腺癌Ab，Biovation   癌症，前列腺   前列腺癌细胞
  94   癌症   多种肿瘤标记   VB2-011   癌症，淋巴瘤，非Hodgkin癌症，黑素瘤   作用于人乳腺瘤模型的抗癌剂
  95   癌症   多种肿瘤标记   TriAb   癌症，乳腺癌症，肺，非小细胞癌症，结肠直肠   HMFG
  96   癌症   多种肿瘤标记   TriGem   癌症，黑素瘤癌症，肺，小细胞癌症，大脑   GD2神经节苷脂
  97   癌症   多种肿瘤标记   G-250，未被偶联的   癌症，肾脏   RCC
  98   癌症   多种肿瘤标记   ACA-125   癌症，卵巢   CA125
  99   癌症   多种肿瘤标记   Mitumomab   癌症，肺，非小细胞癌症，黑素瘤   GD3神经节苷脂
  100   癌症   多种肿瘤标记   Edrecolomab   癌症，结肠直肠癌症，乳腺   Ep-CAM
  101   其他   SB-249417   脓毒症局部缺血，大脑   因子IX
  102   其他   YM-337   手术附属物局部缺血性心肌症血栓症，一般性移植排斥，不稳定性局部缺血，大脑   GPIIb/IIIa
  103   其他   Abciximab   ReoPro   凝结相关的心血管疾病(高危血管成形术)，冠状血管病并发症   GPIIb/IIIa
  104   其他   TNX-901   过敏，食物   IgI
  105   其他   CAT-192   硬皮病   TGF-β1
  106   其他   Lerdelimumab   纤维化，一般性手术附属物   TGF-β2
  107   其他   PharmaprojectsNo.6256   未指明的
  108   其他   RhuFabV2   黄斑变性(Maculardegeneration)   VEGF
  109   其他   RN-2   伤口愈合
  110   其他   异聚物技术，(technol)EluSys   未指明的   炭疽毒素
  111   其他   PRIMATIZED抗体，IDEC   未指明的   CD23
  112   其他   DBI-5012   糖尿病，I型
  113   有效负载(payload)   Ibriumomabtiuxetan   zevalin   非hodgkin淋巴瘤   CD20
  114   有效负载   Epratuzumab   癌症，淋巴瘤，非hodgkin   CD22
  115   有效负载   Gemtuzumabozogamicin   mylotarg   AML(急性)骨髓的白血病   CD33
  116   有效负载   labetuzumab   癌症，乳腺癌症，肺，非小细胞癌症，卵巢   CEA
人源化的抗体可变区
本发明还包括用于制备转移体的人源化可变结构域的生产和用途。人源化抗体是非人类抗体，其中一些或全部氨基酸残基被存在于相似的人抗体中的相应氨基酸残基取代。例如，从人抗体开始，超变区以及可能FR中的残基被来自啮齿类抗体中的类似位点上的残基取代。人源化降低抗体的抗原性。
已经用各种方法人源化抗体的可变结构域，例如CDR移植(Riechmann等，Nature，332：323-327(1988))，替换被暴露的残基(Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991))以及再现可变结构域(Roguska等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：969-973(1994)。最低要求的再现方法特别适合抗体可变结构域，该可变结构域需要保留一些小鼠或其它物种的架构残基来保持最大的抗原结合亲合性。但是，CDR移植方法也已经被成功地用于一些抗体的人源化，其不需要保留任何小鼠的架构残基(Jones等Nature，321：522-525(1986)和Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))或者仅保留一个和两个小鼠的残基(Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：10029-10033(1989)。
还可以通过排列重链和轻链的可变结构域与最佳的人同系物来实现人源化，该同系物在序列数据库例如GENBANK或SWISS-PROT中采用标准的序列比较软件确定。序列分析以及与基于单克隆抗体McPC603的可变结构域的晶体结构的结构模型比较(Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：10029-10033(1989)和Satow等，J.Mol.Biol.190：593-604(1986))；蛋白质数据库登录IMCP)，使得可以确定在小鼠抗体与其人类配偶体之间相互区别的架构残基。
选择用于制备人源化的抗体的人可变结构域，包括轻链和重链，对于降低抗原性是重要的。根据所谓的“最适”(“best-fit”)方法，在已知的人可变结构域序列的完整文库中，对啮齿类抗体的可变结构域的序列进行检索。然后，与啮齿类的序列最接近的人序列作为人源化抗体的人架构区(FR)(Sims等，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。另一种方法采用来源于所有特定亚组的轻链或重链的人抗体的一致序列的特定架构区。相同的架构区可以被用于几种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等，J.Immnol.，151：2623(1993))。
制备抗原结合片段和CDRs
可以通过几种方法制备被融合或连接到转铁蛋白上的抗原结合片段和CDRs，包括但是不限于：从噬菌体文库中筛选，通过克隆抗体cDNA来克隆特定抗体的可变区，使用侧翼恒定区作为引物来克隆可变区，或者合成对应于任何特异性抗体的可变区的寡核苷酸。在5′和3′末端剪切cDNA，产生限制性位点，使得可以使用寡核苷酸接头，将该cDNA克隆到含有转铁蛋白的cDNA的载体中。这可以在N末端或C末端或者N末端和C末端，使用或不使用间隔序列。可以将融合分子cDNA克隆到载体中，然后从载体中切出完整的表达盒，并插入到表达载体中，在酵母中表达融合蛋白。然后从培养基中收集和纯化由酵母分泌的融合蛋白，并检测其活性。对于在哺乳动物细胞系中表达，可以采用类似的操作，但是，所用的表达盒使用哺乳动物启动子、前导序列和终止子。然后切出该表达盒，并插入到适合转染哺乳动物细胞系的质粒中。可以从培养基中纯化以这种方式制备的转移体，并采用标准的免疫化学方法检测其结合到抗原上。
特别地，可以采用噬菌体展示技术来制备大的抗原结合肽文库，通过噬菌体在其表面表达和展示生物学功能的蛋白质分子。在其它实施方案中，可以在被修饰的Tf中直接制备抗原结合肽文库，建立转移体文库。已经在噬菌体λ表达系统中产生抗原结合肽的组合文库，作为噬菌斑或作为溶原菌菌落被筛选(Huse等(1989)Science 246：1275；Caton和Koprowski(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)87：6450；Mullinax等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)87：8095；Persson等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88：2432)。各种噬菌体抗原结合肽展示文库和噬菌体表达文库的实施方案已经被描述(Kang等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88：4363；Clackson等(1991)Nature352：624；McCafferty等(1990)Nature 348：552；Burton等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88：10134；Hoogenboom等(1991)Nucleic Acids Res.19：4133；Chang等(1991)J.Immunol.147：3610；Breitling等(1991)Gene 104：147；Marks等(1991)J.Mol.Biol.222：581；Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)89：4457；Hawkins和Winter(1992)J.Immunol.22：867；Marks等(1992)Biotechnology 10：779；Marks等(1992)J.Biol.Chem.267：16007；Lowman等(1991)Biochemistry 30：10832；Lerner等(1992)Science 258：1313)。还可以参见Rader，C.和Barbas，C.F.(1997)“组合抗体文库的噬菌体展示”(“Phage displayofcombinatorial antibody libraries”)Curr.Opin.Biotechnol.8：503-508。展示在噬菌体外壳蛋白上的各种scFV文库已经被描述(Marks等(1992)Biotechnology10：779；Winter G and Milstein C(1991)Nature 349：293；Clackson等(1991)op.cit.；Marks等(1991)J.Mol.Biol.222：581；Chaudhary等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)87：1066；Chiswell等(1992)TIBTECH 10：80；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：5879)。
通常，将随机寡核苷酸文库或者编码抗体片段或肽例如VL和VH的cDNA文库插入到M13或fd噬菌体的基因3中来制备噬菌体文库。各个插入基因被表达在基因产物噬菌体的最小外壳蛋白的N末端。结果，构建了含有不同肽的肽文库。然后使用被固定的目标靶向分子，例如抗原，对噬菌体文库进行亲合筛选，回收被特异结合的噬菌体，并通过感染大肠杆菌宿主细胞来进行扩增。典型地，目标靶向分子例如受体(例如多肽、糖类、糖蛋白、核酸)通过共价连接到层析树脂上来固定，通过亲合层析来富集反应的噬菌体)和/或标记筛选空斑或菌落增加。最后，对被扩增的噬菌体进行测序，推定特异性肽序列。由于噬菌体展示的固有特性，展示在噬菌体表面上的抗体或肽在体外筛选条件下未呈现其在哺乳动物系统中的天然构象。此外，细菌不容易加工、组装、或表达/分泌功能性抗体。
作为本发明的一部分，可以将含有随机肽的转铁蛋白或转铁蛋白部分插入到噬菌体基因3中，替代VL和VH片段。在这种方式中，在文库中筛选含有抗原性肽的转铁蛋白。
采用由例如Abgenix，Inc.，Fremont，Calif.和Medarex，Inc.Annandale，N.J公司开发的XENOMOUSETM技术，使用转基因动物，例如小鼠，来生产全长的人抗体。通过抑制小鼠抗体基因表达，并功能性地替换为用人抗体基因进行表达，遗传加工小鼠。这种技术利用了小鼠免疫系统在监控和亲合成熟中的天然力量，制备高亲合性抗体的大量组成成分。
在本发明的还有一个方面，用于制备单链抗体文库的方法包括：在酵母细胞中表达酵母表达载体文库。各个酵母表达载体包括编码抗体重链可变区的第一核酸序列，编码抗体轻链可变区的第二核酸序列，连接抗体重链可变区和抗体轻链可变区的转铁蛋白序列。抗体重链可变区，抗体轻链可变区，以及转铁蛋白接头被表达成为单一的转移体融合蛋白。此外，第一和第二核苷酸序列在表达载体文库中各自独立地变化，产生基因至少约106多样性的转移体文库。
以相似的方式，文库能够表达含有用各种插入肽替代抗体片段的转铁蛋白。然后在该文库中筛选对特定抗原具有最佳结合活性的转移体。
根据实施方案，转移体文库的多样性优选在约106-1016之间，更加优选在约108-1016之间，最优选在约1010-1016之间。
治疗性转移体
本发明还包括制备和使用包含抗体可变区的转移体来治疗或预防疾病，该抗体可变区来自定向抵抗一种或多种不同抗原的抗体。优选地，至少一种抗原(和优选所有抗原)是生物学上重要的分子，给患有疾病或症状的哺乳动物施用抵抗抗原的转移体，能够在该哺乳动物中产生治疗益处。在本发明的优选实施方案中，抗原是蛋白质，但是，也可以使用其它的非多肽抗原(例如肿瘤相关的糖脂，参见美国专利5,091,178)。
示例性蛋白质抗原包括分子例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺素；促甲状腺素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体素(luteinizing hormone)；胰高血糖素；凝血因子例如因子VIIIC、因子IX、组织因子和von Willebrand因子；抗凝血因子例如蛋白C；心钠素因子；肺表面活性剂；血浆酶原激活物，例如尿激酶或人尿或组织性血浆酶原激活物(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(调节激活正常的T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白例如人血清白蛋白；Muellerian抑制物；  松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，例如β内酰胺酶；Dnase；IgE；细胞毒素T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，例如CTLA-4；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子受体；蛋白A或D；类风湿性因子；神经营养因子例如骨来源的神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或者神经生长因子例如NGF-β；血小板来源的生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子例如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白例如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促红细胞生成素；骨诱导因子(osteoinductive factor)；免疫毒素；骨形成蛋白(BMP)；干扰素例如干扰素-α、-β和-γ；菌落刺激因子(CSFs)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(ILs)，例如IL-1到IL-10；过氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子、病毒抗原例如AIDS衣壳的一部分；转运蛋白；归巢(homing)受体；地址素；调控蛋白；RSV衣壳(envelop)蛋白；HSV衣壳和外壳蛋白；流感病毒外壳蛋白；整联蛋白例如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原例如HER2、HER3或HER4受体；细菌及其毒素例如肉毒杆菌(botulinum)毒素、霍乱(cholera)毒素和炭疽热(anthrax)毒素；真菌，特别是病原性真菌；和任何上面所列的多肽的变体和/或片段。本发明的转移体结合的其它分子被列举在PCT/US02/27637中，其在此完全引入作为参考。
转铁蛋白和转铁蛋白修饰
本发明提供包含一个或多个抗体可变区以及转铁蛋白或被修饰的转移体。任何转铁蛋白可以被用于制备本发明的被修饰Tf融合蛋白。作为例子，野生型人Tf(Tf)是约75kDa的679个氨基酸蛋白质(未考虑糖基化)，具有两个主要的结构域，N(约330个氨基酸)和C(约340个氨基酸)，其似乎来源于基因复制。参见GenBank登录号NM 001063、XM 002793、M12530、XM 039845、XM 039847和S95936( www.ncbi.nlm.nih.gov/)，所有这些以及SEQ ID NO：1、2和3在此完全引入作为参考。这两个结构域持续偏离，但是保持较高程度的同一性/相似性(附图1)。
各个N末端结构域和C末端结构域进一步被分成两个亚结构域，N1和N2，C1和C2。Tf的功能是将铁转运到机体细胞内。该过程受Tf受体(TfR)的调节，Tf受体在所有细胞上被表达，特别是在活跃生长的细胞上。TfR识别铁结合形式的Tf(每个受体结合两分子Tf)，当TfR/Tf复合物被转运到内涵体中时，发生内吞作用，此时局部的pH下降导致被结合的铁的释放，以及TfR/Tf复合物再循环到细胞表面并释放Tf(未结合铁的形式称作为apoTf)。受体结合是通过Tf的C末端结构域实现。由于未糖基化的铁结合Tf也结合受体，C末端结构域的两个糖基化位点似乎不参与受体结合。
每个Tf分子能够携带两个铁离子(Fe3+)。它们在N1和N2，C1和C2亚结构域之间的空间内发生复合，导致分子的构象发生变化。Tf通过Tf受体跨越血脑屏障(BBB)。
在人的转铁蛋白中，铁结合位点包含至少SEQ ID NO：3的氨基酸Asp63(包括天然Tf信号序列的SEQ ID NO：2中的Asp 82)，Asp 392(SEQ ID NO：2的Asp 411)，Tyr 95(SEQ ID NO：2的Tyr 114)，Tyr 426(SEQ ID NO：2的Tyr445)，Tyr 188(SEQ ID NO：2的Tyr 207)，Tyr514或517(SEQ ID NO：2的Tyr533或Tyr 536)，His 249(SEQ ID NO：2的His 268)和His 585(SEQ ID NO：2的His 604)。铰链区包含至少SEQ ID NO：3的N结构域氨基酸残基94-96，245-247和/或316-318以及C结构域氨基酸残基425-427，581-582和/或652-658。碳酸盐结合位点包含至少SEQ ID NO：3的氨基酸Thr 120(SEQID NO：2的Thr 139)，Thr 452(SEQ ID NO：2的Thr)，Arg 124(SEQ ID NO：2的Arg 143)，Arg 456(SEQ ID NO：2的Arg 475)，Ala 126(SEQ ID NO：2的Ala145)，Ala 458(SEQ ID NO：2的Ala 477)，Gly 127(SEQ ID NO：2的Gly 146)和Gly 459(SEQ ID NO：2的Gly 478)。
在本发明的实施方案中，转移体包括被修饰的人转铁蛋白，而任何动物的Tf分子可能被用于制备本发明的转移体，包括人Tf变体，奶牛、猪、绵羊、狗、兔、大鼠、小鼠、仓鼠、echnida、鸭嘴兽、鸡、青蛙、天蛾幼虫、猴以及其它种类的牛、犬和鸟类(参见附图2中的一组示例性Tf序列)。所有这些Tf序列很容易从GenBank和其它公共数据库中获得。人Tf核苷酸序列是可获得的(参见SEQ ID NO：1，2和3以及上面描述的登录号，并且可以从www.ncbi.nlm.nih.gov/获得)，并用于制备Tf或Tf结构域与所选的治疗性分子的遗传融合物。还可以从相关分子例如乳铁传递蛋白(乳铁蛋白)GenBankAcc：NM002343)。
乳铁蛋白(Lf)是天然防御的铁结合蛋白，已经被发现具有抗菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤和抗炎症的活性。这些蛋白质以通常暴露于正常菌群中的外分泌物存在：乳汁、眼泪、鼻腔分泌物、唾液、支气管粘液、胃肠道液、子宫颈-阴道粘液和精液。此外，Lf是循环多形核粒细胞(PMNs)的次级特定颗粒的主要成分。脱辅基蛋白在腐烂(septic)区被释放到PMNs的脱粒上。Lf的基本功能是清除液体和发炎区域的游离铁，抑制游离自由基介导的破坏，并降低金属侵入微生物和赘生性细胞的效率。在成人中的检测125I Lf的转化率的试验中，结果表明Lf迅速被肝脏和脾脏吸收，肝脏和脾脏中持续存在数周放射性(Bennett等(1979)，Clin.Sci.(Lond.)57：453-460)。
在一个实施方案中，本发明的转移体的转铁蛋白部分包括转铁蛋白剪切变体。在一个实施方案中，转铁蛋白剪切变体可以是人转铁蛋白的剪切变体。在一个特定实施方案中，人转铁蛋白剪切变体可以是Genbank登录号AAA61140的蛋白。
在另一个实施方案中，本发明的转移体的转铁蛋白部分包括乳铁蛋白的剪切变体。在一个实施方案中，人血清乳铁蛋白剪切变体可以是嗜中性粒细胞乳铁蛋白的新剪切变体。在一个特定实施方案中，嗜中性粒细胞乳铁蛋白剪切变体可以是Genbank登录号AAA59479的蛋白。在另一个特定实施方案中，嗜中性粒细胞乳铁蛋白剪切变体可以包含如下氨基酸序列EDCIALKGEADA(SEQ ID NO：4)，其包括新的剪切变异区域。
还可以用黑素转铁蛋白(melanotransferrin)(GenBank Acc.NM 013900，鼠黑素转铁蛋白)来制备融合物。黑素转铁蛋白是以高含量存在于恶性黑素瘤细胞中的糖基化蛋白质，最早被命名为人黑素瘤抗体p97(Brown等1982，Nature，296：171-173)。其与人血清转铁蛋白、人乳铁蛋白和鸡转铁蛋白具有很高的序列同一性(Brown等1982，Nature，296：171-173；Rose等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，83：1261-1265)。但是，与这些蛋白不同，还没有确定黑素转铁蛋白的细胞受体。黑素转铁蛋白可逆地(reversibly)结合铁，并且以两种形式存在，其中之一是通过糖基磷脂酰肌糖锚结合到细胞表面上，而另一种形式是可溶的，并且被活跃地分泌(Baker等，1992，FEBS Lett，298：215-218；Alemany等，1993，J.Cell Sci.，104：1155-1162；Food等，1994，J.Biol.Chem.274：7011-7017)。
被修饰的Tf融合物可以用任何Tf蛋白、片段、结构域或遗传工程化结构域来制备。例如，融合蛋白可以用全长Tf序列来制备，含有或不含天然Tf信号序列。转移体还可以用单一的Tf结构域来制备，例如各个N或C结构域。还可以用双Tf结构域，例如双N末端结构域或双C末端结构域来制备转移体。在一些实施方案中，可以制备治疗性蛋白质融合到单一的C末端结构域上的融合物，其中C末端结构域被改变来减少、抑制或防止糖基化。在其它实施方案中，由于Tf糖基化位点存在于其本身的C末端结构域和N末端结构域上，采用单一的N末端结构域是有利的。优选实施方案是具有单一N末端结构域的Tf融合蛋白，以高水平被表达。
如在此所用，C末端结构域或被修饰来作为N末端样结构域的圆形突出部分被修饰，具有实质上类似于天然的或野生型的N末端结构域或圆形突出部分的糖基化模式或铁结合特性。在优选实施方案中，C末端结构域或圆形突出部分被修饰，使得其未被糖基化，并且通过相关C末端结构域或氨基酸取代存在于天然的或野生型的N末端结构域的相应区域或位点上的那些氨基酸，而不结合铁。
如在此所用，包含“两个N末端结构域或圆形突出部分的Tf部分包括Tf分子，Tf分子被修饰来用天然或野生型的N末端结构域或圆形突出部分或被修饰的N结构域或圆形突出部分来替换天然的C末端结构域或圆形突出部分，或者含有被修饰来实质上类似于野生型或被修饰的N结构域起作用的C末端结构域。参见美国在先专利申请60/406,977，在此完全引入作为参考。
通过重叠两个结构域(Swiss PDB Viewer 3.7b2，Iterative Magic Fit)或者通过直接氨基酸比对(ClustalW multiple alignment)来分析两个结构域，结果表明这两个结构域相互偏离。氨基酸比对表明两个结构域之间具有42％同一性和59％相似性。但是，由于结构相当，约80％的N末端结构域与C末端结构域匹配。与N末端结构域相比，C末端结构域还具有几个额外的二硫碱。
N末端和C末端结构域的分子模型比对显示如下结构等同物。
  N末端结构域(1-330)   4-24   36-7275-88   94-136   138-139   149-164   168-173   178-198200-214   219-255   259-260   263-268   271-275   279-280   283-288290-304   309-327
  C末端结构域(340-679)   340-361   365-415   425-437439-468   470-471   475-490   492-497   507-542   555-591   593-594   597-602   605-609   614-615   620-640   645-663
两个结构域的二硫键的排列如下：
  黑体   排列的二硫键
  斜体   桥连肽
  N   C
  C339-C506
  C9-C48   C345-C377
  C19-C39   C355-C368
  C402-C674
  C418-C637
  C118-C194   C450-C523
  C137-C331
  C474-C665
  C158-C174   C484-C498
  C161-C179
  C171-C177   C495-C506
  C227-C241   C563-C577
  C615-C620
在一个实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括至少两个转铁蛋白的N末端圆形突出部分。在还有一个实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括至少两个转铁蛋白的N末端圆形突出部分，该转铁蛋白来源于人血清转铁蛋白。
在另一个实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括、包含或由至少两个转铁蛋白的N末端圆形突出部分组成，该转铁蛋白在至少一个选自SEQ IDNO：3上的Asp63、Gly65、Tyr95、Tyr188和His249的氨基酸残基上具有突变。
在另一个实施方案中，被修饰的转移体的转铁蛋白部分包括在SEQ IDNO：3的Lys206或His207上具有突变的重组人血清转铁蛋白N末端圆形突出部分突变体。
在另一个实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括、包含或由至少两个转铁蛋白的C末端圆形突出部分组成。在另一个实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括至少两个来源于人血清转铁蛋白的C末端圆形突出部分。
在另一个实施方案中，C末端圆形突出部分在至少SEQ ID NO：3的Asn413和Asn611之一上还包括一个突变，使得不能糖基化。
在另一个实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括至少两个转铁蛋白的C末端圆形突出部分，该转铁蛋白在至少一个选自SEQ ID NO：3上的Asp392、Tyr426、Tyr514、Tyr517和His585的氨基酸残基上具有突变，其中该突变体保留结合金属的能力。在一个可选择的实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括至少两个转铁蛋白的C末端圆形突出部分，该转铁蛋白在至少一个选自SEQ ID NO：3上的Tyr426、Tyr514、Tyr517和His585的氨基酸残基上具有突变，其中该突变体保留结合金属的能力。在另一个实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括至少两个转铁蛋白的C末端圆形突出部分，该转铁蛋白在至少一个选自SEQ ID NO：3上的Asp392、Tyr426、Tyr517和His585的氨基酸残基上具有突变，其中该突变体不具有结合金属离子的能力，并且实质上如同N末端结构域那样起作用。
在一些实施方案中，Tf或Tf部分将具有足够的长度，以相对于处于未被融合状态下的抗体可变区的体内循环半衰期、血清稳定性、体外溶解稳定性或生物利用度，提高抗体可变区的体内循环半衰期、血清稳定性、体外溶解稳定性或生物利用度。稳定性、血清半衰期或生物利用度方面的提高可以比未被融合的抗体可变区约高30％、50％、70％、80％、90％或更高。在某些情况下，包含被修饰的转铁蛋白的转移体具有约10-20天或更长，约12-18天或约14-17天的血清半衰期。
当Tf的C末端结构域是转移体的一部分时，两个对应于SEQ ID NO：3的N413和N611的氨基酸残基的N联糖基化位点被突变，在酵母系统中表达，以防止糖基化或超甘露糖基化，并延长融合蛋白和/或抗体可变区(用于制备唾液酸(asialo)-或有时为单唾液酸(monosialo)-Tf或双唾液酸(disialo)-Tf)的血清半衰期。除了对应于N413和N611的Tf氨基酸，突变可以在N-X-S/T糖基化位点内的邻近残基上，以防止或实质上减少糖基化。参见Funk等的美国专利5,986,067。已经报导，在Pichia pastoris中表达的Tf的N末端结构域与单一的己糖在S32上发生O-联糖基化，也在S32上进行突变或修饰来防止这种糖基化。此外，抗原采用在PMT基因在进行突变来降低或消除酵母宿主细胞中的O联糖基化。
因而，在本发明的一个实施方案中，转移体包括被修饰的转铁蛋白分子，其中该转铁蛋白的糖基化减少，包括但是不限于唾液酸-单唾液酸-和双唾液酸-形式的Tf。在另一个实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括重组的转铁蛋白突变体，其被突变来防止糖基化。在另一个实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括完全被糖基化的重组转铁蛋白突变体。在另一个实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括被突变来防止糖基化的重组人血清转铁蛋白，其中至少SEQ ID NO：3的Asn413和Asn611之一被突变成不能进行糖基化的氨基酸。在另一个实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括被突变来防止或实质上减少糖基化的重组人血清转铁蛋白，其中在N-X-S/T糖基化位点中的邻近残基进行突变。而且，可以通过突变丝氨酸或苏氨酸残基来减少或防止糖基化。此外，已知将X改变为脯氨酸可以抑制糖基化。
如下文更加详细的讨论，本发明的被修饰的Tf融合蛋白，优选转移体还可以被改造，以不结合铁和/或不结合Tf受体。在本发明的其它实施方案中，保留铁结合的能力，并且Tf结合铁的能力被用于将治疗性蛋白质或肽呈递到细胞的内部，跨越上皮或内皮细胞膜和/或跨越BBB。这些结合铁和/或Tf受体的转移体通常被改造来减少或防止糖基化，以延长治疗性蛋白质的血清半衰期。当携带铁时，单独的N末端结构域不会结合到TfR上，并且结合铁的C末端结构域将结合TfR，但是不与完整分子具有相同的亲合性。
在另一个实施方案中，转铁蛋白融合蛋白优选转移体的转铁蛋白部分包括具有突变的重组转铁蛋白突变体，其中该突变体未保留结合金属离子的能力。在一个可替代实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括具有突变的重组转铁蛋白突变体，其中该突变体对金属离子的结合亲合力比野生型血清转铁蛋白的低。在一个可替代的实施方案中，转铁蛋白融合蛋白的转铁蛋白部分包括具有突变的重组转铁蛋白突变体，其中该突变体具有比野生型血清转铁蛋白更强的对金属离子的结合亲合力。
在另一个实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括具有突变的重组转铁蛋白突变体，其中该突变体未保留结合转铁蛋白受体的能力。在一个可替代实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括具有突变的重组转铁蛋白突变体，其中该突变体对转铁蛋白受体的结合亲合力比野生型血清转铁蛋白的低。在一个可替代的实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括具有突变的重组转铁蛋白突变体，其中该突变体具有比野生型血清转铁蛋白更强的对转铁蛋白受体的结合亲合力。
在另一个实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括具有突变的重组转铁蛋白突变体，其中该突变体未保留结合碳酸盐离子的能力。在一个可替代实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括具有突变的重组转铁蛋白突变体，其中该突变体对碳酸盐离子的结合亲合力比野生型血清转铁蛋白的低。在一个可替代的实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括具有突变的重组转铁蛋白突变体，其中该突变体具有比野生型血清转铁蛋白更强的对碳酸盐离子的结合亲合力。
在另一个实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括重组人血清转铁蛋白突变体，该突变体在选自SEQ ID NO：3的Asp63、Gly65、Tyr95、Tyr188、His249、Asp392、Tyr426、Tyr514、Tyr517和His585的至少一个氨基酸残基上具有突变，其中该突变体保留结合金属离子的能力。在一个可替代实施方案中，重组人血清转铁蛋白突变体在选自SEQ ID NO：3的Asp63、Gly65、Tyr95、Tyr188、His249、Asp392、Tyr426、Tyr514、Tyr517和His585的至少一个氨基酸残基上具有突变，其中该突变体结合金属离子的能力降低。在另一个实施方案中，重组人血清转铁蛋白突变体在选自SEQ ID NO：3的Asp63、Gly65、Tyr95、Tyr188、His249、Asp392、Tyr426、Tyr517和His585的至少一个氨基酸残基上具有突变，其中该突变体未保留结合金属离子的能力。
在另一个实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括在SEQ ID NO：3的Lys206或His207上具有突变的重组人血清转铁蛋白突变体，其中该突变体对金属离子具有比野生型人血清转铁蛋白(参见美国专利5,986,067，其在此被全文引入作为参考)更强的结合亲合性。在可选择的实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括在SEQ ID NO：3的Lys206或His207上具有突变的重组人血清转铁蛋白突变体，其中该突变体对金属离子具有比野生型人血清转铁蛋白更弱的结合亲合性。在另一个实施方案中，转移体的转铁蛋白部分包括在SEQ ID NO：3的Lys206或His207上具有突变的重组人血清转铁蛋白突变体，其中该突变体不结合金属离子。
任何可获得的技术被用于制备本发明的转移体，包括但是不限于通常可以获得的分子技术，例如，那些公开在Sambrook等分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版，冷泉巷实验室出版社，1989中的技术。当采用本领域熟知的用于位点特异性诱变的技术进行核苷酸取代时，所编码的氨基酸的变化优选为次要性质(minor nature)，也就是说，保守性氨基酸取代，虽然也包括非保守性取代，特别是在转移体的被修饰的转铁蛋白部分时，例如具有糖基化减少、铁结合下降等的被修饰转移体。特别可以预期的是氨基酸取代、小片段缺失或插入，通常为1-约30个氨基酸；转铁蛋白结构域之间的插入；小的氨基或羧基末端的突出端(extension)，例如氨基末端的甲硫氨酸残基，或者在转铁蛋白结构域之间的或者连接转铁蛋白与治疗性蛋白或肽优选抗体可变区的少于50，40，30，20或10个残基的小接头肽；或者便于纯化的小突出端，例如多聚组氨酸序列、抗原性表位或结合结构域。
保守性氨基酸取代的例子为在相同组内进行的取代，例如在碱性氨基酸(例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)，酸性氨基酸(例如谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸(例如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸(例如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)，芳香氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的组内。
非保守性取代包括用一组氨基酸取代另一组氨基酸。例如，非保守性氨基酸取代将包括用极性氨基酸取代疏水性氨基酸。对于核苷酸取代的一般描述参见，例如Ford等(1991)，Prot.Exp.Pur.2：95-107。非保守性取代、缺失和插入对于制备本发明的Tf融合蛋白优选为转移体是特别有用的，该Tf融合蛋白不或减少与铁的结合，不或减少与Tf受体的结合和/或不或减少糖基化。
在本发明的多肽和蛋白质中，如下体系被用于命名按照如下的常规列表的氨基酸：
氨基酸列表
  氨基酸   单字母符号   三字母符号
  丙氨酸   A   Ala
  精氨酸   R   Arg
  天冬酰胺   N   Asn
  天冬氨酸   D   Asp
  半胱氨酸   C   Cys
  谷氨酰胺   Q   Gln
  谷氨酸   E   Glu
  甘氨酸   G   Gly
  组氨酸   H   His
  异亮氨酸   I   Ile
  亮氨酸   L   Leu
  赖氨酸   K   Lys
  甲硫氨酸   M   Met
  苯丙氨酸   F   Phe
  脯氨酸   P   Pro
  丝氨酸   S   Ser
  苏氨酸   T   Thr
  色氨酸   W   Trp
  酪氨酸   Y   Tyr
  缬氨酸   V   val
可以通过突变来减少或破坏铁结合和/或受体结合，包括缺失、取代或插入对应于Tf的N末端结构域残基Asp63、Tyr95、Tyr 188、His249和/或C末端结构域残基Asp 392、Tyr 426、Tyr 514和/或SEQ ID NO：3的His 585的一个或多个的氨基酸残基。铁结合还受到对氨基酸SEQ ID NO：3的Lys206、His207或Arg632进行突变的影响。碳酸盐结合可能通过突变而被减少或破坏，包括删除、取代或插入对应于Tf的N末端结构域残基Thr120、Arg 124、Ala 126、Gly 127和/或C末端结构域残基Thr 452、Arg 456、Ala 458和/或SEQ ID NO：3的Gly 459的一个或多个的氨基酸残基。碳酸盐结合的减少或破坏会对铁和/或受体的结合产生不利影响。
与Tf受体的结合可能通过突变被降低或破坏，包括删除、取代或插入对应于上述对于铁结合的Tf的N末端结构域残基的一个或多个的氨基酸残基。
如上所讨论，可以通过突变来减少或防止糖基化，包括对对应于围绕对应于C末端结构域残基N413和/或N611的N-X-S/T位点的Tf的C末端结构域残基的一个或多个的氨基酸残基(参见美国专利5,986,067)进行删除、取代或插入。例如，N413和/或N611被突变为Glu残基。
在未对本发明的Tf融合蛋白优选转移体进行被修饰来防止糖基化、铁结合、碳酸盐结合和/或受体结合的情况下，糖基化、铁和/或碳酸盐离子可能从融合蛋白上被剥离或裂解。例如，可获得的去糖基化酶被用于从融合蛋白上断裂糖基化残基，特别是附着到Tf部分上的糖残基，缺乏糖基化酶的酵母可以被用于防止糖基化和/或在存在能够防止糖基化的试剂例如衣霉素下培养重组细胞。
通过使用去糖基化酶处理融合蛋白，酶促减少或完全去除融合蛋白上的糖类。去糖基化酶在本领域是熟知的。去糖基化酶的例子包括但是不限于半乳糖苷酶、PNGase A、PNGase F、葡萄糖苷酶、甘露糖苷酶、岩藻糖苷酶和Endo H去糖基化酶。
可以对Tf进行其它突变来改变Tf的三维结构，例如修饰铰链区以防止铁结合和Tf受体识别所需的构象发生变化。例如，可以在N末端结构域的氨基酸残基94-96、245-247和/或316-318以及C末端结构域的氨基酸残基425-427、581-582和/或652-658上或者其周围进行突变。此外，可以在这些位点的侧翼区或其周围进行突变来改变Tf结构和功能。
在本发明的一个方面，转移体可以作为载体蛋白，以延长治疗性蛋白质的半衰期或生物利用度，以及在有些情况下，将抗体可变区呈递到细胞内部和/或跨过血脑屏障。在一个可替代的实施方案中，转移体包括被修饰的转铁蛋白分子，其中转铁蛋白未保留跨过血脑屏障的能力。
在另一个实施方案中，转移体包括被修饰的转铁蛋白分子，其中转铁蛋白分子保留结合转铁蛋白受体和将抗体可变区转运到细胞内部的能力。在可替代的实施方案中，转移体包括被修饰的转铁蛋白分子，其中转铁蛋白分子未保留结合转铁蛋白受体和将抗体可变区转运到细胞内部的能力。
在另一个实施方案中，转移体包括被修饰的转铁蛋白分子，其中该转铁蛋白分子保留结合转铁蛋白受体和将抗体可变区转运到细胞内部的能力，但不保留跨过血脑屏障的能力。在可替代的实施方案中，转移体包括被修饰的转铁蛋白分子，其中该转铁蛋白分子保留跨过血脑屏障的能力，但是未保留结合转铁蛋白受体和将抗体可变区转运到细胞内部的能力。
被修饰的基于转铁蛋白的转移体
本发明的转移体融合蛋白含有被连接到Tf蛋白质的N末端和/或C末端的一个或多个拷贝的抗体可变区。在一些实施方案中，抗体可变区被连接到Tf蛋白质的N末端和C末端，而且该融合蛋白可以在Tf的一端或两端含有抗体可变区的一个或多个等价物。在其它实施方案中，抗体可变区被插入到已知的Tf蛋白质结构域中，例如，插入到Tf的一个或多个环中(参见Ali等(1999)J.Biol.Chem.274(34)：24066-24073)。在其它实施方案中，抗体可变区被插入到Tf的N末端和C末端结构域之间。
一般地，本发明的转铁蛋白融合蛋白优选转移体，可以具有一个被修饰的转铁蛋白来源的区域和一个抗体可变区。但是，各个蛋白的多个区域可以被用于制备本发明的转铁蛋白融合蛋白。类似地，不只一种抗体可变区被用于制备本发明的转铁蛋白融合蛋白，从而生成多功能的被修饰Tf融合蛋白。
在一个实施方案中，本发明的转移体含有被融合到转铁蛋白分子或其部分上的抗体可变区或其部分。在另一个实施方案中，本发明的转移体含有被融合到转铁蛋白分子的N末端上的抗体可变区。在可替代的实施方案中，本发明的转移体含有被融合到转铁蛋白分子C末端上的抗体可变区。在另一个实施方案中，本发明的转移体含有被融合到抗体可变区的N末端上的转铁蛋白分子。在可替代的实施方案中，本发明的转移体含有被融合到抗体可变区的C末端上的转铁蛋白分子。
本发明还提供含有被融合到被修饰的转铁蛋白分子或其部分上的抗体可变区或其部分的转移体。
在其它实施方案中，本发明的转移体含有被融合到被修饰的转铁蛋白的N末端和C末端上的抗体可变区。在另一个实施方案中，被融合在N末端和C末端上的抗体可变区结合相同的抗原。此外，结合相同抗原的抗体可变区可以来源于不同抗体，从而结合相同靶点上的不同表位。在可替代实施方案中，被融合在N末端和C末端上的抗体可变区结合不同抗原。在另一个实施方案中，被融合在N和C末端上的抗体可变区结合不同抗原，被用于激活两种不同细胞，治疗或预防疾病、紊乱或症状。在另一个实施方案中，被融合到N末端和C末端上的抗体可变区结合不同抗原，用于连接两种不同抗原，治疗或预防本领域已知的通常在患者中共同发生的疾病、紊乱或症状。
此外，还可以通过将目标抗体可变区(例如结合治疗性蛋白质或肽，或其片段或变体的单链抗体)插入到被修饰的转铁蛋白的内部区域中来制备本发明的转铁蛋白融合蛋白。被修饰的转铁蛋白的内部区域包括，但是不限于，环区域铁结合位点、铰链区、碳酸氢盐结合位点或受体结合结构域。
在被修饰的转铁蛋白分子的蛋白质序列中，存在大量环或转角(turns)，它们通过二硫键来固定。这些环可用于插入或内部融合特别是那些需要二级结构来起作用的治疗活性肽优选为抗体可变区，或者治疗性蛋白质优选抗体可变区，生成具有特定生物学活性的被修饰的转铁蛋白分子。
当抗体可变区，优选CDRs被插入或置换Tf分子的至少一个环时，除了Tf的其它区域，可以在任何一个外露表面环区域内进行插入。例如，可以在包含Tf氨基酸32-33、74-75、  256-257、279-280和288-289的环内进行插入(Ali等，同上文)(参见附图3)。如先前所描述，还可以在Tf的其它区域进行插入，例如铁和碳酸盐结合的位点、铰链区和下文更详细描述的受体结合结构域。适合于修饰/替换来插入蛋白质或肽的Tf蛋白质序列中的环还可以被用于开发随机肽插入物的筛选库。在被克隆到Tf结构域和/或融合到Tf末端之前，任何方法可以被用于制备生成肽文库的核酸插入物，包括可以获得的噬菌体和细菌展示系统(display systems)。
Tf的N-末端是游离的，并且朝向分子本体的外方(away from)。因此，蛋白质或肽在N末端融合是优选的实施方案。这种融合可能包括接头区，例如但是不限于多聚甘氨酸序列，将Tf与抗体可变区分开。注意接头序列之间的连接、选择先导序列以及通过密码子加工/优化mRNA结构(主要的茎环不会抑制核糖体前进)，将会提高分泌，并且容易采用标准的重组蛋白质技术来实现。
Tf的C末端似乎被C末端的6个氨基酸的二硫键隐藏和保护。在人Tf中，C末端氨基酸是脯氨酸，按照其朝向方式，可以是朝向融合物之外或者朝向分子本体内。C末端的接头或间隔部分可以被用于本发明的一些实施方案中。N末端附近也有脯氨酸。在本发明的一个方面，N和/或C末端的脯氨酸可以被替换掉。在本发明的另一个方面，C末端的二硫键可以被去除来解放(untether)C末端。
在本发明的一个实施方案中，具有抗原结合特性的肽被插入到转铁蛋白中，生成转移体。在本发明的另一个实施方案中，任何转移体可以含有一种使转移体成为免疫反应靶的免疫原性肽。这种转移体与在结合抗原后起动免疫反应的常规抗体类似地起作用。
在还有其它的实施方案中，小分子的治疗剂与铁复合，并装载到被修饰的Tf蛋白质融合物，被呈递到细胞内以及跨过BBB。添加引导肽或者例如单链抗体(SCA)，用于将有效负载(payload)靶向特定细胞类型，例如癌细胞。
核酸
本发明还提供编码包含被共价地连接或结合到治疗性蛋白质，优选抗体可变区上的转铁蛋白或转铁蛋白部分的转移体的核酸分子。如下文更加详细的讨论，任何抗体可变区可以被使用。融合蛋白还可以包含接头区，例如少于约50个、40个、30个、20个或10个氨基酸残基的接头。该接头被共价地连接到转铁蛋白或其部分与治疗性蛋白质，优选抗体可变区之间。本发明的核酸分子被纯化或未被纯化。
用于复制核酸分子和表达被编码的转移体的宿主细胞和载体也被提供。任何载体或宿主细胞可以被使用，无论是原核或真核的细胞，但是真核表达系统，特别是酵母表达系统是优选的。许多用于该目的载体和宿主细胞在本领域是已知的。选择用于期望应用的恰当表达系统完全在本领域的能力内。
编码转铁蛋白、转铁蛋白部分和目标抗体可变区的DNA序列，可以从本领域知晓的各种基因组或cDNA文库中克隆得到。采用探针方法分离这种DNA序列的技术是常规技术，是本领域技术人员熟知的。用于分离这种DNA序列的探针可以基于公开的DNA或蛋白质序列(参见，例如，Baldwin，G.S.(1993)来自不同物种的转铁蛋白的比较.Comp.Biochem.Physiol.106B/1：203-218及其所引用的全部参考文献，在此全部引入作为参考)。可替代地，可以采用Mullis等(美国专利4,683,195)和Mullis(美国专利4,683,202)描述的聚合酶链式反应(PCR)方法，在此引入作为参考。用于分离这种DNA序列的文库的选择和探针的选择在本领域普通技术人员水平内。
如本领域所知，两条多核苷酸或多肽之间的“相似性”，是通过将一条多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列及其保守性核苷酸或氨基酸取代物与第二条多核苷酸或多肽的序列比较来确定。如本领域所知，“同一性”是指两条多肽或两条多核苷酸序列之间的序列相关程度，通过鉴定这种序列两条链之间的匹配程度来确定。同一性和相似性都很容易计算(ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.，编辑，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，编辑，AcademicPress，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，PartI，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，编辑，Humana Press，New Jersey，1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑，M Stockton Press，New York，1991)。
虽然存在大量测定两条多肽或多核苷酸序列之间的同一性和相似性的方法，术语“同一性”和“相似性”对于技术人员来说是熟知的(SequenceAnalysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，等，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)。通常用于确定两条序列之间的同一性或相似性的方法包括，但是不限于那些被公开在Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，编辑，Academic Press，San Diego，1994，和Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.48：1073(1988)的方法。
确定同一性的优选方法被设计来在两条被检测的序列之间产生最大匹配。确定同一性和相似性的方法被编写在计算机程序中。确定两条序列之间的同一性和相似性的优选的计算机程序方法包括，但是不限于，GCG程序软件包(Devereux，等，Nucl.Acid Res.12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，等，J.Mol.Biol.215：403(1990))。上面所提及的相似性或同一性的大小被确定为两条序列之间的相同程度，通常表示第一条序列衍生于第二条序列。两条核酸序列之间的相同程度可以通过本领域知晓的计算机程序来确定，例如在GCG程序软件包中提供的GAP(Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48：443-453(1970))。为了确定本发明的两条核酸序列之间的相同程度，使用GAP，具有如下设定：5.0的GAP产生(creation)罚分和0.3的GAP延长(extension)罚分。
密码子优化
遗传密码的简并性使得可以改变转铁蛋白和/或目标的治疗性蛋白质优选抗体可变区的核苷酸序列，而仍然生成具有与天然DNA序列编码的多肽相同的氨基酸序列的多肽。该操作称作“密码子优化”(被描述在美国专利5,547,871中，在此全文引入作为参考)，提供设计这种被改变的DNA序列的方法。密码子优化的基因的设计应当考虑各种因素，包括生物体中密码子利用的频率、最接近的邻近频率、RNA稳定性、二级结构形成的可能性、合成路径以及确定的将会对该基因进行的DNA操作。特别地，当采用酵母表达系统时，采用可获得的方法来用那些最容易被酵母识别的密码子替换编码特定融合蛋白的密码子。
遗传密码的简并性使得相同的氨基酸序列可以用多种不同方式来编码和翻译。例如，亮氨酸、丝氨酸和精氨酸分别由六种不同的密码子编码，而缬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丙氨酸和甘氨酸分别由四种不同密码子编码。但是，在真核细胞和原核细胞中，这种同义密码子的使用频率在基因组之间是不同的。例如，同义密码子的选择模式在哺乳动物中十分类似，而在进化距离远的生物体例如酵母(例如酿酒酵母)、细菌(例如E.coli)和昆虫(例如D.Melanogaster)中，则表现出明显不同的遗传密码利用频率模式(Grantham，R.，等，Nucl.Acid Res.，8，49-62(1980)；Grantham，R.，等，Nucl.Acid Res.，9，43-74(1981)；Maroyama，T.，等，Nucl.Acid Res.，14，151-197(1986)；Aota，S.等，Nucl.Acid Res.，16，315-402(1988)；Wada，K.等，Nucl.Acid Res.，19Supp.，1981-1985(1991)；Kurland，C.G.，FEBS Lett.，285，165-169(1991))。密码子选择模式的这些差别似乎通过调节肽伸长比例来影响各个基因的整体表达水平。(Kurland，C.G.，FEBS Lett.，285，165-169(1991)；Pedersen，S.，EMBO J.，3，2895-2898(1984)；Sorensen，M.A.，J.Mol.Biol.，207，365-377(1989)；Randall，L.L.等，Eur.J.Biochem.，107，375-379(1980)；Curran，J.F.和Yarus，M.，J.Mol.Biol.，209，65-77(1989)；Varenne，S.等，J.Mol.Biol.，180，549-576(1984)，Varenne，S.等，J.Mol，Biol.，180，549-576(1984)；Garel，J.-P.，J.Theor.Biol.，43，211-225(1974)；Ikemura，T.，J.Mol.Biol.，146，1-21(1981)；Ikemura，T.，J.Mol.Biol.，151，389-409(1981))。
合成基因的优选密码子利用频率应当反映来源于精确的(或者尽可能密切相关)细胞/生物体的基因组的核基因的密码子利用，该细胞/生物体将被用于重组蛋白的表达，特别是酵母属的细胞/生物体。如上所讨论，在一个优选实施方案中，在在此所描述的修饰之前或之后，人Tf序列被密码子优化以用于酵母表达，该序列可以是抗体可变区的核苷酸序列。
载体
用于本发明的表达单位通常包含如下元件，以5′到3′方向被可操作地连接：转录启动子、分泌信号序列、被连接到编码目标的治疗性蛋白质或肽优选抗体可变区的DNA序列上的编码包含转铁蛋白或转铁蛋白的部分的被修饰的Tf融合蛋白的DNA序列，以及转录终止子。如上所讨论，被融合到Tf部分上或者被融合在Tf部分中的治疗性蛋白质或肽的任何排列可以被用于本发明的载体中。合适的启动子、信号序列和终止子的选择，将通过所选择的宿主细胞来确定，对于本领域的技术人员来说是显然的，将在下文中被更加清楚地讨论。
用于本发明中的合适酵母载体被描述在美国专利6,291,212中，包括YRp7(Struhl等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：1035-1039，1978)、YEp13(Broach等，Gene 8：121-133，1979)、pJDB249和pJDB219(Beggs，Nature 275：104-108，1978)、pPPC0005、pSeCHSA、pScNHSA、pC4及其衍生物。有用的酵母质粒载体还包括pRS403-406、pRS413-416和得自Stratagene CloningSystems，La Jolla，CA 92037，USA的毕赤氏酵母(Pichia)载体。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406都是酵母整合型质粒(YIps)并且结合了酵母可选择标记HIS3、TRPI、LEU2和URA3。质粒pRS413-41.6是酵母中心粒质粒(YCps)。
这种载体通常包括可选择的标记，可以是任意大量具有显性表型的基因之一，由此，可以进行表型分析来选择转化体。优选的可选择标记是那些弥补宿主细胞营养缺陷的标记，产生抗生素抗性或使细胞能够利用特定的碳源，包括LEU2(Broach等ibid.)、URA3(Botstein等，Gene 8：17，1979)、HIS3(Struhl等，ibid.)或POTl(Kawasaki和Bell，EP171，142)。其它合适的选择性标记包括CAT基因，其赋予酵母细胞氯霉素抗性。用于酵母中的优选启动子包括来自酵母糖分解基因的启动子(Hitzeman等，J Biol.Chem.225：12073-12080，1980；Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Genet.1：419-434，1982；Kawasaki，美国专利4,599,311)或乙醇脱氢酶基因的启动子(Young等，载于Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals，Hollaender等，(编辑)，355，Plenum，纽约，1982；Ammerer，Meth.Enzymol.101：192-201，1983)。从这一点看，特别优选的启动子是TPI1启动子(Kawasaki，美国专利4,599,311)和ADH2-4C(美国专利6,291,212启动子(Russell等，Nature 304：652-654，1983)。表达单位可能还包括转录终止子。优选的转录终止子为TPI1终止子(Alber和Kawasaki，ibid.)。其它优选载体和优选组分例如酵母表达系统中的启动子和终止子被公开在欧洲专利EP 0258067、EP 0286424、EP0317254、EP0387319、EP 0386222、EP 0424117、EP 0431880和EP 1002095；欧洲专利申请公开EP 0828759、EP 0764209、EP 0749478和EP 0889949；PCT公开WO 00/44772和WO 94/04687；和美国专利5,739,007；5,637,504；5,302,697；5,260,202；5,667,986；5,728,553；5,783,423；5,965,386；6150,133；6,379,924和5,714,377中，在此完全引入作为参考。
除了酵母，本发明的被修饰的融合蛋白可以在丝状真菌中表达，例如，在曲霉菌菌株中。有用的启动子的例子包括那些来源于Aspergillus nidulans糖分解基因的启动子，例如adh3启动子(McKnight等，EMBO J.4：2093-2099，1985)和tpiA启动子。合适的终止子的例子为adh3终止子(McKnight等，ibid.)。利用这种元件的表达单位可以被克隆到能够插入到例如曲霉菌的染色体DNA中的载体中。
用于实现本发明的哺乳动物表达载体将包括能够引导被修饰的Tf融合蛋白，优选包含被修饰的Tf的转移体的转录的启动子。优选启动子包括病毒启动子和细胞启动子。优选的病毒启动子包括来自腺病毒2的主要晚期启动子(Kaufman和Sharp，Mol.Cell.Biol.2：1304-13199，1982)和SV40启动子(Subramani等，Mol.Cell.Biol.1：854-864，1981)。优选的细胞启动子包括小鼠金属硫蛋白-1启动子(Palmiter等，Science 222：809-814，1983)和小鼠Vκ(参见美国专利6,291,212)启动子(Grant等，Nuc.Acids Res.15：5496，1987)。特别优选的启动子是小鼠VH(参见美国专利6,291,212)启动子(Loh等，ibid.)。这种表达载体还可以含有位于启动子下游和编码转铁蛋白融合蛋白的DNA序列上游的一套RNA剪切位点。优选的RNA剪切位点可以从腺病毒和/或免疫球蛋白基因中获得。
在表达载体中还含有位于目标编码序列下游的聚腺苷酸信号。聚腺苷酸信号包括来自SV40的早期或晚期聚腺苷酸信号(Kaufman和Sharp，ibid.)，来自腺病毒5E1B区以及人生长基因终止子的聚腺苷酸信号(DeNoto等，Nucl.Acid Res.9：3719-3730，1981)。特别优选的聚腺苷酸信号为VH(参见美国专利6,291,212)基因终止子(Loh等，ibid.)。表达载体可以包括非编码的病毒前导序列，例如腺病毒2的三联前导序列，位于启动子和RNA剪切位点之间。优选的载体还可以包括增强子序列，例如SV40增强子和小鼠μ(参见美国专利6,291,212)增强子(Gillies，Cell 33：717-728，1983)。表达载体还可以包括编码腺病毒VA RNA的序列。
转化体
用于转化真菌的技术在本领域是已知的，被描述在例如Beggs(ibid.)、Hinnen等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：1929-1933，1978)、Yelton等，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1740-1747，1984)和Russell(Nature 301：167-169，1983)中。还可以使用将克隆DNA序列导入真菌细胞中的其它技术，例如电穿孔(Becker和Guarente，Methods in Enzymol.194：182-187，1991)。宿主细胞的基因型通常具有遗传缺陷，该缺陷由存在表达载体上的选择标记来弥补。选择特定宿主和可选择的标记在本领域普通技术人员的能力之内。
可以通过例如磷酸钙介导的转染，将包含本发明的被修饰的Tf融合蛋白的克隆DNA序列导入到被培养的哺乳动物细胞中(Wigler等，Cell 14：725，1978；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics 7：603，1981；Graham和Van der Eb，Virology 52：456，1973)。还可以采用将克隆DNA序列导入哺乳动物细胞中的其它技术，例如电穿孔(Neumann等，EMBO J.1：841-845，1982)或脂转染。为了鉴定已经整合了克隆DNA的细胞，通常将可选择标记以及目标基因或cDNA插入到细胞中。培养哺乳动物细胞的优选可选择标记包括赋予对药物的抗性的基因，这些药物例如新霉素、潮霉素和氨甲蝶呤。可选择标记可以是可扩增的选择标记。优选的可扩增的选择标记为DHFR基因。特别优选的可扩增标记为DHFRr(参见美国专利6,291,212)cDNA(Simonsen和Levinson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2495-2499，1983)。可选择标记在Thilly(Mammalian Cell Technology，Butterworth Publishers，Stoneham，Mass.)中被评述，并且选择可选择的标记在本领域普通技术人员的能力内。
宿主细胞
本发明还包括被转化来表达本发明的被修饰的转铁蛋白融合蛋白的细胞，优选为酵母细胞。除了被转化的宿主细胞本身，本发明还包括这些细胞在营养液中的培养物，优选单克隆(纯系同源的)培养物或者来源于单克隆培养物的培养物。如果多肽被分泌，则培养基中含有该多肽和细胞，或者细胞被过滤或离心掉，则不含细胞。
用于实现本发明的宿主细胞包括真核细胞，有时为原核细胞，能够用外源DNA转化或转染，并在培养基中生长，例如被培养的哺乳动物、昆虫、真菌、植物和细菌细胞。
真菌细胞，包括酵母类(例如酵母属(Saccharomyces spp.)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces spp.)，毕赤氏酵母属(Pichia spp.)可以被用作本发明中的宿主细胞。包括被期望用于实现本发明、作为表达本发明的转铁蛋白融合蛋白优选转移体的酵母的真菌的例子是毕氏酵母属(其中的某些种类以前被分类为汉逊酵母属(Hansenula))，酵母属，克鲁维酵母菌属(Kluyvercmyces)，曲霉菌属(Aspergillus)，念珠菌属(Candida)，球拟酵母属(Torulopsis)，孢圆酵母属(Torulaspora)，裂殖酵母，固囊酵母属(Citeromyces)，Pachysolen，接合酵母属(Zygosaccharomyces)，德巴利酵母属(Debaryomyces)，木霉属(Trichoderma)，头孢霉属(Cephalosporium)，腐质霉属(Humicola)，毛霉菌属(Mucor)，脉孢菌属(Neurospora)，耶氏酵母属(Yarrowia)，Metschunikowia，Rhodosporidium，担子菌白冬孢酵母属(Leucosporidium)，Botryoascus，锁掷孢酵母属(Sporidiobolus)，拟内孢霉(Endomycopsis)等。酵母菌属的例子为酿酒酵母、S.italicus和S.Rouxii。克鲁维酵母菌属的例子为K.fragilis、K.lactis和K.marxianus。合适的孢圆酵母属种类为T.delbrueckii。毕赤氏酵母菌属的例子为P.angusta(以前称作H.polymorpha)、P.anomala(以前称作H.anomala)和P.pastoris。
用于制备本发明的Tf融合蛋白优选转移体的特别有用的宿主细胞为甲基营养Pichiapastoris(Steinlein等(1995)Protein Express.Purif6：619-624)。自从Pichia pastoris的乙醇氧化酶启动子被分离和克隆以来，Pichia pastoris已经被开发作为制备外源蛋白的重要宿主；其转化体首次在1985年被报导。在缺乏葡萄糖时，P.pastoris能够利用甲醇作为碳源。P.pastoris表达系统能够利用甲醇诱导的乙醇氧化酶(AOX1)启动子，该启动子控制编码用于乙醇氧化酶的表达的基因，乙醇氧化酶催化甲醇代谢的第一个步骤。该启动子被表征，并且被插入到一系列P.pastoris表达载体中。由于在P.pastoris中生成的蛋白质通常能够正确地折叠，并被分泌到培养基中，遗传工程改造的P.pastoris的发酵提供一种作为大肠杆菌表达系统的优良替代。大量蛋白质已经采用这种系统进行制备，包括破伤风毒素片段、Bordatella pertussis粘着素(pertactin)、人血清白蛋白、溶菌酶、干扰素α，以及糖基化和未糖基化的转铁蛋白。
酿酒酵母菌株是另一种优选宿主。在一个优选实施方案中，使用酵母细胞，或者特别是在糖蛋白的天冬酰胺偶联的糖基化所需的基因中具有遗传缺陷的酿酒酵母宿主细胞。具有这种缺陷的酿酒酵母宿主细胞通过常规的突变和选择技术来制备，尽管许多可以获得的酵母菌株已经被修饰来防止或减少糖基化或超甘露糖基化。Ballou等(J.Biol.Chem.255：5986-5991，1980)已经描述了缺乏影响天冬酰胺偶联糖基化的基因的甘露糖蛋白生物合成突变体的分离。Gentzsch和Tanner(Glycobiology 7：481-486，1997)已经描述了一个至少6个基因(PMT1-6)的家族，这些基因编码负责酵母中的O-连糖基化的第一步的酶。缺乏这些基因中的一个或多个的突变体表现出O-连糖基化下降和/或O-连糖基化的特异性改变。
为了优化异源蛋白的制备，优选宿主菌株具有突变，例如酿酒酵母的pep4突变(Jones，Genetics 85：23-33，1977)，导致蛋白质水解活性下降。对于制备大量本发明的Tf融合蛋白来说，在其它蛋白酶编码区中具有突变的宿主菌株是特别有用的。
含有本发明的DNA构建体的宿主细胞在适当生长培养基中生长。如在此所用，术语“适当的生长培养基”是指含有细胞生长所需营养的培养基。细胞生长所需营养包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素、矿物质和生长因子。生长培养基通常用于筛选含有DNA构建体的细胞，通过例如药物选择或缺乏关键营养，营养缺乏通过DNA构建体上的可选择标记来弥补，或者用DNA构建体共转染。酵母细胞，例如，优选在化学成分确定的培养基中生长，培养基中含有碳源，例如蔗糖，非氨基酸的氮源，无机盐，维生素和必需氨基酸添加剂。培养基的pH优选维持在大于2并小于8的pH下，优选为pH5.5-6.5。维持稳定的pH的方法包括进行缓冲和持续的pH控制。优选的缓冲试剂包括琥珀酸和Bis-Tris(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)。缺失天冬酰胺偶联糖基化所需基因的酵母细胞优选在含有渗透稳定剂的培养基中生长。优选的渗透稳定剂是被添加到培养基中的山梨醇，其浓度在0.1M和1.5M之间，优选为0.5M或1.0M。
被培养的哺乳动物细胞一般在可以购买得到的含血清或无血清培养基中生长。选择适合于特定细胞系的培养基在本领域普通技术人员的能力内。被转染的哺乳动物细胞生长一段时间，通常为1-2天，并开始表达目标DNA序列。然后进行药物选择，选择以稳定的方式表达可选择标记的细胞的生长。对于已经用可扩增的选择标记转染的细胞来说，可以逐步提高药物浓度来选择拷贝数增加的克隆序列，从而提高表达水平。
杆状病毒/昆虫细胞表达系统也可以被用于制备本发明的被修饰Tf融合蛋白。BacPAKTM杆状表达表达系统(BD Biosciences(Clontech))在昆虫宿主细胞中高水平地表达重组蛋白。目标基因被插入到转化载体中，该载体与线性化的BacPAK6病毒DNA一起被共转染到昆虫宿主细胞中。BacPAK6DNA缺乏杆状病毒基因组的关键部分。当DNA与载体结合时，该关键元件被恢复，而目标基因被转移到杆状病毒的基因组中。重组后，少数病毒斑被挑取和纯化，验证重组表型。然后，新分离的重组病毒被扩增，并用于感染昆虫细胞培养物来制备大量的期望蛋白质。
本发明的Tf融合蛋白还可以用转基因植物和动物来制备。例如，绵羊和山羊在其乳汁中生成治疗性蛋白质。烟草植物在其叶片中包括该蛋白质。转基因植物和动物生产蛋白质，都包括将编码融合蛋白的新基因添加到生物体的基因组中。转基因生物体不仅能够生成新的蛋白质，而且能够将这种能力传递给其后代。
分泌信号序列
术语“分泌信号序列”或者“信号序列”或者“分泌前导序列”可以被相互交换使用，被描述在美国专利6,291,212和美国专利5,547,871中，这两个专利在此完全引入作为参考。分泌信号序列或信号序列或分泌前导序列编码分泌肽。分泌肽是引导成熟多肽或蛋白质从细胞中分泌出来的氨基酸序列。通常，分泌肽的特征在于疏水氨基酸核心，并且典型地(但是不是唯一地)存在于新合成的蛋白质的氨基末端。在分泌过程中，分泌肽通常从成熟蛋白质上被裂解下来。分泌肽可能含有加工位点，使得在经过分泌路径时，信号肽从产生蛋白质上裂解下来。加工位点被编码在信号肽中，或者例如通过诱变被添加到信号肽中。
分泌肽可以被用于引导本发明的被修饰Tf融合蛋白的分泌。可用于与其它分泌肽结合的一种这种分泌肽为α交配因子前导序列。分泌信号序列或信号序列或分泌前导序列是一系列复杂的翻译后加工步骤所需的，这些步骤导致蛋白质的分泌。如果存在完整的信号序列，被表达的蛋白质进入粗面内质网的内腔，然后通过高尔基体转运到分泌小泡中，最后被转运到细胞外。通常，信号序列紧跟在起始密码子后面，并且编码被分泌的蛋白质的氨基末端的信号肽。在大多数情况下，信号序列被称作信号肽酶的特定蛋白酶裂解掉。优选的信号序列提高由病毒、哺乳动物或酵母病毒载体表达的重组蛋白质的加工和外排效率。在有些情况下，天然的Tf信号序列被用于表达和分泌本发明的融合蛋白。
接头
本发明的被修饰转铁蛋白融合蛋白的Tf部分和抗体可变区可以直接融合或者采用各种长度的接头肽来融合，以在被融合的蛋白质之间产生更大的物理分离和更大的空间灵活性，从而最大化抗体可变区例如结合其关联受体的可达性。接头肽由柔韧的或刚性更大的氨基酸组成。例如，接头例如但是不限于多聚甘氨酸序列。接头可以少于约50个，40个，30个，20个或10个氨基酸残基。接头可以被共价地连接到转铁蛋白或其部分与抗体可变区之间。
接头还可以用于连接抗体可变区。用于连接抗体可变区的合适的接头是那些使抗体可变区折叠成三维结构的接头，使抗体可变区保持完整抗体的结合特异性。
转移体的检测
生物活性的被修饰的转铁蛋白转移体的检测分析包括Western转移、蛋白质印迹或菌落滤膜(colony filter)，以及检测包含转铁蛋白和抗体可变区的融合蛋白的活性分析。Western转移滤膜可以采用Towbin等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：4350-4354，1979)描述的方法来制备。简而言之，样本在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。将凝胶中的蛋白质通过电泳转移到硝化纤维纸上。蛋白质印迹滤膜通过用例如Minifold(Schleicher & Schuell，Keene，N.H.)将上清液样本或浓缩物过滤在硝化纤维滤纸上来制备。菌落滤膜通过在硝化纤维素滤膜培养菌落来制备，该滤膜被铺展在适当的生长培养基上。在这种方法中，固体培养基是优选的。细胞在滤膜上生长至少12小时。用不会去除结合到滤膜上的蛋白质的恰当缓冲液来冲洗滤膜，去除细胞。优选的缓冲液包含25mM Tris-碱，19mM甘氨酸，pH 8.3，20％甲醇。
本发明的转铁蛋白融合蛋白，优选转移体，用放射性同位素或者其它显像剂标记，用于体内诊断目的。优选的放射性同位素显像剂包括碘-125和锝-99，锝-99是特别优选的。用于制备蛋白质表位偶联物的方法在本领域是已知的，被描述在例如Eckelman等(美国专利4,652,440)，Parker等(WO 87/05030)和Wilber等(EP 203,764)中。可替代地，转移体被结合到自旋标记物增强剂上，用于磁共振(MR)显像。合适的自旋标记物增强剂包括稳定的、空间障碍的、自由基化合物，例如硝基氧。用于MR显像标记配体的方法被公开在，例如Coffman等(美国专利4,656,026)中。对于施用，被标记的转移体结合药学上可接受的载体或稀释剂，例如无菌生理盐水或无菌水。施用优选通过快速注射方式(blolus injection)，优选静脉注射。
通过偶联(即物理上连接)到可检测的物质上来方便本发明的转移体的检测。可检测的物质的例子包括各种酶，辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的例子包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或者乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的例子包括伞形酮(umbelliferone)、荧光素、荧光素异硫氰酸盐、若丹明、二氯三连氮基胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白(phycoerythrin)；发光材料的例子包括发光氨；生物发光材料的例子包括荧光素酶、虫荧光素和发光蛋白质，合适的放射性材料的例子包括125I、131I、35S或3H。
在一个实施方案中，分析本发明的转移体结合或与抗体竞争结合抗原的能力，可以采用本领域知晓的各种免疫测定方法，包括但是不限于，采用例如放射性免疫测定、ELISA(酶链式免疫吸收分析)、夹心式免疫测定、免疫放射分析、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散分析、原位免疫分析(例如采用胶体金、酶或放射性同位素标记)、western印迹、沉淀反应、凝集分析(例如凝胶凝集分析)、补体结合分析、荧光免疫分析、蛋白A分析和免疫电泳分析等的竞争性和非竞争性的分析体系。在一个实施方案中，通过检测转移体上的标记来检测转移体的结合。在另一个实施方案中，通过检测与转移体相互作用的第二抗体或试剂的结合来检测转移体。在另一个实施方案中，第二抗体或试剂被标记。已知在本领域有许多方法被用于检测免疫测定中的结合，这些方法在本发明的保护范围内。
转移体的制备
本发明还提供采用在此公开的核酸分子制备被修饰的融合蛋白，优选包含被修饰的Tf的转移体的方法。总的来说，重组形式的蛋白质的制备通常包括如下步骤。
首先获得编码本发明的转移体的核酸分子。然后优选将核酸分子以可操作的连接与合适的控制序列连接在一起，如上所述，形成含有蛋白质开放阅读框的表达单位。用表达单位来转化合适的宿主，在允许重组蛋白生成的条件下培养被转化的宿主。可选择地，从培养基或从细胞中分离重组蛋白质；在某些允许存在一些杂质的情况下，蛋白质的回收和纯化不是必需的。
前述的各个步骤可以各种方式来完成。例如，在各种宿主中，可操作的表达载体的构建采用如上列举的适当复制子和控制序列来实现。控制序列、表达载体和转化方法取决于表达基因的宿主细胞类型，先前已经被详细讨论过，同样是本领域技术人员知晓的。如果在正常情况下不能获得合适的限制性位点，可以被添加到编码序列的末端，产生可以被插入到这些载体中的可切割基因。技术人员能够容易地改进本领域熟知的任何宿主/表达系统，与本发明的核酸分子一起使用来制备期望的重组蛋白质。
如上所讨论，可以采用任何表达系统，包括酵母、细菌、动物、植物、真核和原核系统。在某些实施方案中，酵母、哺乳动物细胞培养物和转基因动物或植物生产系统是优选的。在其它实施方案中，采用被改进来降低天然酵母糖基化、超糖基化或蛋白质水解活性的酵母系统。
转移体的分离/纯化
宿主细胞在允许生物活性融合蛋白分泌的条件下生长，从宿主细胞培养基中分离被分泌的具有生物活性的被修饰转铁蛋白融合蛋白，优选包含被修饰的转铁蛋白的转移体。从培养基中去除细胞物质，采用本领域知晓的分离技术分离生物活性融合蛋白。合适的技术包括通过各种层析方法来进行沉淀和分馏，包括凝胶过滤、离子交换层析和亲合层析。
特别优选的纯化方法是在离子结合或金属螯合柱上进行亲合层析，或采用定向抗多肽融合物的抗体可变区的抗原进行免疫亲合层析。这些抗原优选被固定在或结合到固体支持物或基底上。特别优选的基底是CNBr-活化的琼脂糖(Pharmacia LKB Technologies，Inc.，Piscataway，N.J.)。通过这种方法，在允许结合发生的条件下，培养基与抗原/基底结合。洗涤复合物来去除未被结合的物质，采用不利复合物形成的条件来释放或洗脱转铁蛋白融合蛋白。特别有用的洗脱方法包括改变pH，其中在第一个pH下，被固定的抗原对转铁蛋白融合蛋白具有很高的亲合性，而在第二个(更高或更低)pH下，亲合性下降；改变某种离液剂的浓度；或者使用去垢剂。
将转移体呈递到细胞内部和/或跨越血脑屏障(BBB)
在本发明的保护范围内，被修饰的转移体可以被用作载体来将复合到转铁蛋白的铁离子上的分子或小分子治疗剂呈递到细胞的内部或者跨越血脑屏障。在这些实施方案中，转铁蛋白通常被改造或者被修饰来抑制、防止或去除糖基化，延长转移体和/或抗体可变区的血清半衰期。特别包括添加目标肽或者如单链抗体来进一步将转移体定向到特定细胞类型上，例如癌细胞。
在一个实施方案中，含铁的抗贫血药物，铁-山梨糖醇-柠檬酸盐复合物被添加到被本发明的修饰的Tf融合蛋白中。已经证明，铁-山梨糖醇-柠檬酸盐(FSC)在体外抑制各种鼠癌细胞的增殖，在体内致使肿瘤衰退，但是对非恶性细胞的增殖不产生任何作用(Poljak-Blazi等(June 2000)CancerBiotherapy and Radiopharmaceuticals(美国)，15/3：285-293)。
在另一个实施方案中，与铁离子都形成复合物的抗肿瘤药物阿霉素(doxorabicin)和/或化疗药物博来霉素(bleomycin)，被添加到本发明的转移体上。在其它实施方案中，制备药物的盐，例如，柠檬酸盐或碳酸盐，并与铁离子复合，然后结合到Tf上。由于肿瘤细胞常常具有较高的铁周转率(turnover rate)；转铁蛋白被修饰来携带至少一种抗肿瘤剂，提供一种提高试剂暴露于或加载到肿瘤细胞上的方法(Demant，E.J.，(1983)Eur.J.Biochem.137/(1-2)：113-118；Padbury等(1985)J.Biol.Chem.260/13：7820-7823)。
药物制剂与治疗方法
采用标准的施用操作，将本发明的被修饰的融合蛋白，优选包含被修饰的转铁蛋白的转移体施用给需要的患者。例如，本发明的被修饰的Tf转铁蛋白可以单独或结合或顺序结合其它调节特定病理过程的试剂来被提供。如在此所用，当两种试剂同时被施用或者以使得两种试剂同时或接近同时起作用的方式被独自施用时，这两种试剂被认为是被组合地施用。
本发明的融合蛋白可以通过胃肠外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、经皮和口腔的路径被施用。例如，一种试剂通过微灌注(microinfusion)被局部地施用到损伤部位。可替代地，或者同时地，施用可以是非侵入性的，通过口服、吸入、鼻腔或肺部路径。被施用的剂量将取决于受体的年龄、健康状况和体重，并行治疗法的类型，如果存在，治疗频率和期望的作用特点。
本发明还提供含有一种或多种本发明的转移体的组合物。虽然个体需要是不同的，确定各种组分的有效量的最佳范围属于本领域的技术。典型的剂量包含约1pg/kg到约100mg/kg体重。用于系统施用的优选剂量包含约100ng/kg到约100mg/kg体重。通过微灌注直接施用到部位的优选剂量包含约1ng/kg到约1mg/kg体重。当通过直接注射或微灌注施用时，本发明的被修饰融合蛋白可以被工程化来减少或不与铁结合，以部分地防止局部的铁毒性。
除了药学活性的转移体，本发明的组合物含有合适的药学上可接受的载体，包括方便将活性化合物加工成制备物的赋形剂和辅料，可以在药学上使用制备物来呈递到作用部位。用于胃肠外施用的合适制剂包括可溶于水形式的活性化合物的水溶液，例如，可溶于水的盐。此外，可以施用作为适当的油性注射悬浮液的活性化合物的悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括油脂，例如，芝麻油或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酸酯。水溶性注射悬浮液可以含有提高悬浮液的粘性的物质，包括，例如，羧甲基纤维素钠、山梨醇和葡聚糖。可选择地，该悬浮液还可以含有稳定剂。脂质体也可以被用于包囊被呈递到细胞中的试剂。
按照本发明的用于系统施用的药物制剂可以被配制成用于肠道的、胃肠外的或局部的施用。实际上，可以同时使用所有三种类型的制剂，达到系统施用活性成分的效果。用于口服施用的合适制剂包括硬的或软的明胶胶囊，药丸，片剂，包括糖衣片剂，药丹，悬浮液，糖浆或吸入剂及其控制释放形式。
在实施本发明的方法中，本发明的转移体可以单独地或组合地，或结合其它治疗性或诊断性试剂地被使用。在特定优选实施方案中，本发明的转移体可以与其它化合物共同施用，这些化合物按照通常可接受的医疗实践被开成处方用于这些症状。本发明的转移体可以在体内使用，通常在哺乳动物中，例如人、绵羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠和小鼠，离体或体外使用。
转基因动物
在本发明的一个实施方案中，包括制备转基因的非人类动物，该动物含有血清半衰期、血清稳定性或生物利用度升高的本发明的被修饰的转铁蛋白融合构建体，优选转移体。在一些实施方案中，乳铁蛋白可以被用作融合蛋白的Tf部分，使得在乳汁中产生和分泌融合蛋白。在其它实施方案中，本发明包括在乳汁中制备Tf融合蛋白。
在大量专利和出版物中描述了成功制备转基因的非人类动物，例如美国专利6,291,740(2001年9月18日授权)；美国专利6,281,408(2001年8月28日授权)；和美国专利6,271,436(2001年8月7日授权)，其内容在此完全引入作为参考。
改变动物的遗传组成，可以进行广泛的商业应用，这些动物例如家养动物，包括奶牛、猪、山羊、马、肉牛和绵羊。这些应用包括动物生产，这些动物表达大量容易回收形式的外源蛋白(例如，表达到乳汁或血液中)，体重增加、饲养效率、胴体组成、乳汁产量或含量升高、抗病性和对特定微生物感染的抵抗的动物生产，提高生长率或繁殖特性的动物生产。在其基因组中含有外源DNA序列的动物被称作为转基因动物。
最广泛用于生产转基因动物的方法是将DNA显微注射到受精胚的原核中(Wall等，J.Cell.Biochem.49：113[1992])。其它用于生产转基因动物的方法包括用逆转录病毒或逆转录病毒载体感染胚胎。用野生型或重组的逆转录病毒感染移植前或移植后的小鼠胚胎已经被报导(Janenich，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73：1260[1976]；Janenich等，Cell 24：519[1981]；Stuhlmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：7151[1984]；Jahner等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 82：6927[1985]；Van der Putten等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 82：6148-6152[1985]；Stewart等，EMBO J.6：383-388[1987])。
用逆转录病毒感染胚胎的可替代方法是将病毒或生产病毒的细胞注射到小鼠胚胎的囊胚腔中(Jahner，D.等，Nature 298：623[1982])。已经报导，采用子宫内逆转录病毒感染妊娠中期的小鼠胚胎，将转基因导入小鼠的幼殖体中(Jahner等，同上文[1982])。已经报导用逆转录病毒或逆转录病毒载体感染牛和绵羊的胚胎，来生产转基因动物。这些方案包括将逆转录病毒颗粒或者释放逆转录病毒颗粒的生长停滞(即，丝裂菌素C处理的)细胞微注射到受精卵或早期胚胎的卵周隙中(PCT国际专利申请WO 90/08832[1990]；和Haskell和Bowen，Mol.Reprod.Dev.，40：386[1995]。PCT国际专利申请WO 90/08832描述将野生型猫科(feline)白血病病毒B注射到2-8细胞阶段的绵羊胚胎的卵周隙中。由被注射胚胎发育得到胎儿被证明含有多个整合位点。
美国专利6,291,740(2001年9月18日授权)描述采用转导分化细胞(例如来源于鼠白血病病毒[MLV]的载体)的逆转录病毒载体，将外源DNA导入成熟前卵母细胞和成熟的未受精的卵母细胞(即，受精前的卵母细胞)中来生产转基因动物。该专利还描述了通过细胞巨化病毒启动子起始以及小鼠乳腺癌LTR来表达各种重组蛋白的方法和组合物。
美国专利6,281,408(2001年8月28日授权)描述采用胚胎干细胞生产转基因动物的方法。简而言之，胚胎干细胞与桑椹胚混合共培养来产生转基因动物。在共培养之前，通过例如电穿孔、微注射或逆转录呈递，将外源遗传物质导入导胚胎干细胞中。通过选择标记例如新霉素，选择以这种方式转染的ES细胞，其中发生基因整合。
美国专利6,271,436(2001年8月7日)描述转基因动物的生产，采用的方法包括分离原始生殖细胞，培养这些细胞以产生原始生殖细胞来源细胞系，转化原始生殖细胞和被培养的细胞系，使用这些被转化的细胞和细胞系来生产转基因动物。生产转基因动物的效率被极大地提高，因而，在生产转基因的非啮齿类动物物种中可以采用同源重组方法。
基因治疗
在本发明的一个实施方案中，包括被修饰的转铁蛋白融合构建体用于基因治疗的用途，其中被修饰的转铁蛋白或转铁蛋白结构域被连接到抗体可变区上。血清半衰期或血清稳定性提高的本发明的被修饰的转铁蛋白融合构建体特别适合于基因治疗。
成功使用基因治疗来表达可溶的融合蛋白已经被描述。简而言之，最近在Ijima等(June 10，2001)Human Gene Therapy(美国)12/9：1063-77中说明，通过注射含有编码可溶的融合蛋白的基因的腺病毒载体进行基因治疗，可溶的融合蛋白由细胞毒性淋巴细胞抗原4(CTLA4)和人免疫球蛋白G1的Fc部分组成。在该基因治疗应用中，通过关节内注射载体成功地治疗了II型胶原诱导的关节炎的鼠模型。
基因治疗还在大量美国专利中被描述，包括美国专利6,225,290(2001年5月1日授权)；美国专利6,187,305(2001年2月13日授权)和美国专利6,140,111(2000年10月31日)。
美国专利6,225,290提供方法和构建体，其中哺乳动物个体的肠上皮细胞被遗传改进，可操作地插入表达具有期望治疗作用的蛋白质的基因。通过施用主要由裸DNA组成的制剂，实现肠道细胞的转化，该DNA被口服施用。口服的或其它胃肠道内的施用路径提供了一种简单的施用方法，而采用裸核酸避免与使用病毒载体进行基因治疗相关的并发症。表达的蛋白质被直接分泌到胃肠道和/或血流中，获得治疗性血液水平的蛋白质，从而治疗需要该蛋白质的患者。被转化的肠道上皮细胞短期或长期地治疗与缺乏特定蛋白质相关的疾病，或者通过过度表达一种蛋白质进行治疗。
美国专利6,187,305提供在脊椎动物，特别是哺乳动物来源的细胞中进行基因或DNA靶向的方法。简而言之，通过DNA的同源重组或靶向，将DNA导入到脊椎动物来源的初级或次级细胞中，DNA被导入到初级或次级细胞的基因组DNA的预先选择的位点上。
美国专利6,140,111(2000年10月31日授权)描述逆转录病毒基因治疗的载体。所公开的逆转录病毒载体包括目标基因的插入位点，能够在广泛的各种转染细胞类型中表达高水平的蛋白质，该蛋白质来源于目标基因。还公开了缺乏可选择标记的逆转录病毒载体，从而使得它们适合于在各种疾病状态的治疗中进行人的基因治疗，而不会共表达标记产物，例如抗生素。这些逆转录病毒载体特别适合用于特定包装细胞系中。逆转录病毒载体能够插入到哺乳动物细胞的基因组中，使得它们成为人类和动物的遗传疾病的基因治疗中的特别有前景的候选。基因治疗典型地包括(1)在体内将新的遗传物质增加到患者细胞中，或者(2)从机体中取出患者细胞，将新的遗传物质添加到细胞中，并将细胞重新导入机体中，即，体外基因治疗。对于如何使用逆转录病毒载体在各种细胞中进行基因治疗的讨论，存在于例如1989年9月19日授权的美国专利4,868,116和1990年12月25日授权的美国专利4,980,286(上皮细胞)，1989年8月10日公开的WO 89/07136(肝细胞)，1990年7月25日公开的EP 378,576(成纤维细胞)和1989年6月15日公开的WO 89/05345和1990年6月28日公开的WO/90/06997(内皮细胞)中，这些专利的公开内容在此引入作为参考。
包含抗毒素的抗体可变区的转移体
本发明提供包含转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白以及抗毒素的抗体可变区的转移体。如在此所用术语“毒素”是指生物学来源的毒性物质。可以如上所讨论来获得包含期望毒素抗体的一个或多个抗体可变区以及转铁蛋白的转移体。包含抗毒素的抗体可变区的转移体可以被用于治疗患有与毒素相关的疾病的患者。包含抗毒素的抗体可变区以及转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白分子的转移体可以被用于诊断目的。
可以通过各种微生物和植物来制备毒素。这种微生物的例子包括但是不限于：白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、葡萄球菌(Staphylococci)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimruium)、志贺氏菌(Shigellae)、铜绿甲单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、韦氏梭菌(Clostridium welchii)、鼠疫杆菌(Yersinia pestis)、大肠杆菌(Escherichia coli)和炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)。由这些微生物和植物产生的毒素包括，但是不限于，假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、蓖麻(ricin)毒素、红豆(abrin)毒素、炭疽热毒素、志贺菌(shigol)毒素、肉毒杆菌(botulism)毒素、破伤风毒素、霍乱毒素、maitotoxin、岩沙海葵(palytoxin)毒素、ciguatoxin、textilotoxin、蟾毒素(batrachotoxin)、α芋螺毒素(conotoxin)、泰攀蛇毒素(taipoxin)、河豚毒素(tetrodo toxin)、αtityustoxin、蛤蚌毒素(saxitoxin)、类毒素(anatoxin)、微囊藻素(microcystin)、乌头碱(aconitine)、exfoliatin毒素A和B、肠毒素(enterotoxin)、毒性休克综合症毒素(TSST-1)、鼠疫杆菌(ripestis)毒素、气体坏疽(gas gangrene)毒素等。
毒素可以被分成各种组别，例如，但是不限于，ADP-核糖基化毒素、exfoliatin毒素、葡萄球菌肠毒素和金属蛋白酶。ADP-核糖基化毒素的例子包括假单胞菌毒素A、白喉毒素、百日咳(pertussis)毒素和霍乱毒素(choleratoxin)。
Exfoliatin毒素A和B、葡萄球菌肠毒素和毒性休克综合症毒素、TSST-1属于逐渐扩增的微生物超抗原家族，激活T细胞和单核细胞/巨噬细胞，导致生成细胞因子，根据形成毒素的含量、宿主的免疫状态和毒素进入循环的路径，细胞因子介导局部或系统性的作用。Exfoliatin毒素介导葡萄球菌感染皮肤综合症和大疱性脓疱病(bullous impetigo)的皮肤症状。这些毒素导致皮肤在颗粒层发生表皮层内断裂，形成大疱并脱落。由于金黄色葡萄球菌(S.aureus)，七种不同的肠毒素(A、B、C1、C2、C3、D和E)参与食物中毒。这些毒素增强肠道蠕动，通过直接作用于中枢神经系统，引起呕吐。毒素休克综合症(TTS)最常见是受TSST-1调节，TSST-1以5-25％的概率存在于金黄色葡萄球菌的临床分离物中。在更少的情况下，TSS受肠毒素B调节，几乎不受肠毒素C1调节。
金属蛋白酶的例子包括来源于梭菌属(clostridial)(肉毒杆菌(c.botulinum)和破伤风梭菌(c.tetani))和炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)(Herreros等，载于细菌蛋白毒素综合资料(The Comprehensive Sourcebook of Bacterial ProteinToxins).J.E.Alouf和J.H.Freer，编辑.第2版，San Diego，Academic Press，1999；202-228)的生物毒素。这些细菌表达和分泌锌金属蛋白酶，该酶进入真核细胞，并特异地断裂不同的目标蛋白。
梭菌属是由革兰氏阳性、厌氧的产生孢子的杆菌组成。这些生物体的天然生境是周围环境和人和其它动物的肠道。事实上，梭菌属是普遍存在的；它们通常存在于土壤、尘埃、污水、船舶沉积物、腐烂植物和泥浆中(参见，例如Sneath等，“梭菌属”，Bergey′s Manual.RTM.of SystematicBacteriology，2，1141-1200，Williams & Wilkins[1986])。尽管已经鉴定了将近100种梭菌，仅少数梭菌被认为是具有医学和兽医学意义的病原菌。尽管如此，这些菌种与非常严重的疾病相关，包括肉毒中毒(botulism)、破伤风(tetanus)、厌氧蜂窝织炎(awaerobic cellulitis)、气性坏疽(gangrene)、菌血症(bacteremia)、伪膜状结肠炎(psedomembranous colitis)和梭菌胃肠炎(gastroenteritis)。表2列举一些具有医学和兽医学意义的种类，以及与之相关的疾病。
如在表2中所显示，这些微生物的大部分与严重和/或致弱的疾病相关。在大多数情况下，这些微生物的致病性与释放强大的外毒素或高度破坏性的酶相关。实际上，多个梭菌属的种类产生具有重大的医学和兽医学意义的毒素和其它酶(C.L.Hatheway，Clin.Microbiol.Rev.3：66-98(1990))。
表2
具有医学和兽医学意义的梭菌
  种类   疾病
  氨基戊酸梭菌(C.aminovalericum)   细菌尿(怀孕妇女)
  阿根廷梭菌(C.argentinese)   感染创伤；菌血症(Bacteremia)；肉毒中毒；羊水感染
  巴氏梭菌(C.baratii)   感染的战争创伤；腹膜炎；眼、耳和前列腺的感染过程
  拜氏梭菌(C.beijerinckii)   感染创伤
  双酶梭菌(C.bifermentans)   感染创伤；脓肿；气性坏疽；菌血症
  肉毒杆菌(C.botulinum)   食物中毒；肉毒中毒(伤口、食物、婴儿)
  丁酸梭菌(C.butyricum)   尿路，下呼吸道，胸腔和腹部感染；感染创伤；脓肿；菌血症
  尸毒梭菌(C.cadaveris)   脓肿；感染创伤
  肉梭菌(C.carnis)   软组织感染；菌血症
  肖氏梭菌(C.chauvoei)   黑腿病(Blackleg)
  梭状梭菌(C.clostridioforme)   腹部、脑部、阴囊、胸膜等感染；败血病；腹膜炎；阑尾炎
  匙状梭菌(C.cochlearium)   从人疾病过程中分离的，在疾病中的作用未知
  艰难梭菌(C.difficile)   抗菌剂相关的腹泻；伪膜状结肠炎；菌血症；化脓感染
  谲诈梭菌(C.fallax)   软组织感染
  戈氏梭菌(C.ghnoii)   软组织感染
  乙二醇梭菌(C.glycolicum)   创伤感染；脓肿；腹膜炎
  矛形梭菌(C.hastiforme)   感染的战争创伤；菌血症；脓肿
  溶组织梭菌(C.histolyticum)   感染的战争创伤；气性坏疽；齿龈斑分离物
  吲哚梭菌(C.indolis)   胃肠道感染
  无害梭菌(C.innocuum)   胃肠道感染；积脓症
  不规则梭菌(C.irregulare)   阴茎损伤
  柔嫩梭菌(C.leptum)   从人疾病过程中分离的，在疾病中的作用未知
  泥渣梭菌(C.limosum)   细菌尿；腹膜炎；肺部感染
  坏名梭菌(C.malenominatum)   各种感染过程
  诺氏梭菌(C.novyi)   感染创伤；气性坏疽；黑腿病，Bighead(羊)，Redwater病(牛)
  乳清酸梭菌(C.oroticum)   尿路感染；直肠脓肿
  类腐败梭菌(C.paraputrificum)   细菌尿；腹膜炎；感染创伤；阑尾炎
  产气荚膜梭菌(C.perfringens)   气性坏疽；厌氧蜂窝织炎；腹腔内脓肿；软组织感染；食物中毒；坏死性肺炎；积脓症；脑膜炎；菌血症；子宫感染；坏死性肠炎；羔羊痢；Struck；绵羊肠毒血症
  腐化梭菌(C.putrefaciens)   细菌尿(患有细菌尿的怀孕妇女)
  腐败梭菌(C.putrificum)   脓肿；感染创伤；菌血症
  多枝梭菌(C.ramosum)   腹腔、生殖道、肺部和胆管感染；菌血症
  煎盘梭菌(C.sartagoforme)   从人疾病过程中分离的，在疾病中的作用未知
  败毒梭菌(C.septicum)   气性坏疽；菌血症；化脓性感染；坏死性结肠炎；Braxy
  索氏梭菌(C.sordellii)   气性坏疽；创伤感染；阴茎损伤；菌血症；脓肿；腹腔和阴道感染
  精子状梭菌(C.sphenoides)   阑尾炎；菌血症；骨和软组织感染；腹膜内感染；感染的战争创伤；内脏的气性坏疽；肾脏脓肿
  生孢梭菌(C.sporogenes)   气性坏疽；菌血症；心内膜炎；中枢神经系统和胸膜肺区感染；阴茎损伤；感染的战争创伤；其它化脓性感染
  近端梭菌(C.subterminale)   菌血症；积脓症；胆管、软组织和骨感染
  共生梭菌(C.symbiosum)   肝脏脓肿；菌血症；由肠道flora引起的感染
  第三梭菌(C.terbium)   气性坏疽；阑尾炎；脑脓肿；肠道和软组织感染；感染的战争创伤；牙周炎，菌血症
  破伤风梭菌(C.tetani)   破伤风；感染齿龈和牙齿；角膜溃疡；乳突和中耳感染；腹膜内感染；破伤风neonatorum；产后子宫感染；软组织感染；特别与损伤相关(包括擦伤和撕裂伤)；与使用被污染的针头相关的感染
 热腐梭菌(C.thermosaccharolyticum)   从人疾病过程中分离的，在疾病中的作用未知
*根据Engelkirk等“分类”(Classification)，Principles and Practice ofClinical Anaerobic Bacteriology，22-23，Star Publishing Co.，Belmont，CA(1992)；Stephen和Petrowski，“跨膜和去除对细胞的调控的毒素”(Toxins WhichTraverse Membranes and Deregulate Cells)，记载在Bacterial Toxins中，第2版，66-67，American Society for Microbiology(1986)；Berkow和Fletcher(编辑)，“细菌性疾病”(Bacterial Diseases)，Merck Manual ofDiagnosis and Therapy，第16版，116-126，Merck Research Laboratories，Rahway，N.J.(1992)；以及Siegmond和Fraser(编辑)，“梭菌感染”(Clostridial Infections)，Merck VeterinaryManual，第5版，396-409，Merck & Co.，Rahway，N.J.(1979)汇集。
由于这些毒素在人类医学和兽医学上具有重要意义，已经对它们进行了大量研究，特别是对肉毒杆菌(C.botulinum)、破伤风梭菌(C.tetani)和产气荚膜梭菌(C.perfingens)以及艰难梭菌(C.difficile)的毒素进行研究。
在神经元细胞中，梭菌神经毒素是钙依赖的神经传递素分泌的潜在抑制剂。目前，一般认为，梭菌神经毒素通过特异地内切蛋白酶解裂解至少三种囊泡或突触前膜相关蛋白VAMP、突触融合蛋白或SNAP-25之一来介导这种活性，这三种蛋白对于神经传递素分泌的囊泡停泊和膜融合事件来说是重要的。破伤风和肉毒杆菌神经毒素的神经元细胞靶向被认为是受体介导的事件，之后，毒素被内化并随即转运到适当的细胞内腔中，毒素在此影响肽链内切酶的活性。
肉毒杆菌(Clostridium Botulinum)毒素
厌氧的、革兰氏阳性细菌肉毒杆菌生成最毒的生物神经毒素，已知人类致死剂量为毫微克。毒素作用的范围从导致肠道破坏的腹泻疾病到能够导致死亡的瘫痪作用。肉毒梭杆菌的孢子存在于土壤中，在未被正确灭菌和密封的家用罐装的食物容器中生长，这就是许多肉毒杆菌中毒案例的病因。肉毒杆菌中毒的症状通常出现在食用被肉毒梭杆菌培养物或孢子感染的食物后的18-36小时。肉毒杆菌毒素显然能够穿过肠道的内膜而不被灭活，并攻击外周的运动神经元。肉毒杆菌毒素中毒的症状可以从行走、吞咽和言语困难到呼吸肌瘫痪和死亡。
根据毒素进入血流的方法，肉毒杆菌中毒疾病可以分为4类。由于摄食未正确保存和不完全加热的含有肉毒杆菌毒素的食物造成的食物携带肉毒杆菌中毒(即在摄食之前该毒素已经形成)。由于肉毒梭杆菌穿过受损组织并产生毒性，该毒素被吸收到血流中而造成的创伤诱导的肉毒杆菌中毒。自从1950年以来，有30个创伤诱导的肉毒杆菌中毒被报道(Swartz，“厌氧孢子形成杆菌：梭菌”(Anaerobic Spore-Forming Bacilli：The Clostridia)，633-646，载于Davis等，(编辑)，Microbiology，第4版，J.B.Lippincott Co.(1990))。当毒素被吸入时引起的吸入性肉毒杆菌中毒。已经报道，吸入性肉毒杆菌中毒是由于意外暴露于实验室的结果(Holzer，Med.Klin.，41：1735[1962])，并且如果该毒素被用作生物战争的试剂，是一种潜在危险(Franz等，载于肉毒杆菌和破伤风神经毒素(Botulinum and Tetanus Neurotoxins)，DasGupta(编辑)，PlenumPress，New York[1993]，473-476)。由于肉毒梭杆菌定居婴儿的肠道并产生毒素和吸收到血流中而引起的传染性婴儿肉毒杆菌中毒。
不同的肉毒梭杆菌菌株产生用字母A-G命名的抗原性上相互区别的毒素。血清型A毒素涉及26％食物肉毒杆菌中毒的病例，类型B、E和F也涉及较小比例的食物肉毒杆菌中毒的病例(Sugiyama，Microbiol.Rev.，44：419(1980))。已经报道，创伤性肉毒杆菌中毒仅由A或B型毒素引起(Sugiyama，同上文)。几乎所有的婴儿肉毒杆菌中毒的病例都是由产生类型A或类型B的毒素细菌引起(例外地，一个新墨西哥州的病例是由产生类型F的毒素的肉毒梭杆菌引起，另一个是由产生类型B型F杂合体的肉毒梭杆菌引起)(Arnon，Epidemiol.Rev.，3：45(1981))。类型C毒素作用水禽、牛、马和貂。类型D毒素作用于牛，而类型E毒素作用于人和鸟类。
各种抗肉毒杆菌毒素的抗毒素已经被使用。来源于马血清的三价抗毒素可以从Connaught Industries Ltd.购买得到，作为A、B和E毒素类型的治疗剂。七价的马肉毒杆菌抗毒素仅采用抗体分子的F(ab′)2部分，已经由美国军方进行试验(Balady，USAMRDC Newsletter，6(1991))。其生成来抵抗这种大型动物体内的类毒素，不是一种高滴度的制备物。从被免疫接种的个体中收集了五价的人抗毒素，用于治疗婴儿肉毒中毒。已经用毒素制备物免疫个体，来产生抵抗肉毒杆菌毒素的免疫性。含有化学灭活(即甲醛处理)的A、B、C、D和E型毒素的肉毒杆菌疫苗可以购买得到，应用于人。但是，这些抗毒素对于治疗肉毒中毒疾病来说是不安全和无效的。
破伤风梭菌毒素
虽然在远古时期就确定了破伤风(例如希波克拉底描述了这种疾病)，直到1867年，才确定其是由传染物引起的(参见，例如Hatheway，同上文，75)。由破伤风梭菌引起的严格的产生毒素的疾病通常是与似乎不严重的划破创伤相关的。可以很容易从各种来源分离到这种生物体，包括土壤和任何动物种属的肠道内容物(例如人、马等)。
疾病由损伤部位的生物体产生的毒素引起。毒素迅速结合到神经组织上，导致瘫痪和破伤风的痉挛特征。这主要是由于产生有效类毒素，目前，破伤风主要是未被免疫的动物，包括人的疾病。例如，由于截断脐带的污染引起的新生儿破伤风在全世界的某些地区非常盛行。新生儿破伤风几乎总是严重的，并且是高度致命的。全世界大约一半所报道的病例为新生儿破伤风。
破伤风是由潜在的神经毒素(破伤风痉挛毒素)作用产生的非常严重的疾病。在中枢神经系统中，该毒素结合到神经节苷脂上，阻断对运动神经元的抑制脉冲，导致屈肌和伸肌的肌肉痉挛延长。破伤风梭菌还产生“破伤风菌溶血素”，一种对氧敏感的溶血素，在功能上和血清学上与链球菌溶血素O相关，各种其它生物体的氧敏感的溶血素，包括至少六种梭菌属种羊(clostridium species)(参见，例如Hatheway，76)。这种毒素溶解各种细胞，包括红细胞、多形核白血胞、巨噬细胞、成纤维细胞、腹水肿瘤细胞、HeLa细胞和血小板。对胆固醇及相关固醇类具有亲合性。虽然在试验研究中，这种毒素被证明会导致小鼠肺水肿和死亡，导致兔子和猴子血管溶血，导致猴子心脏中毒，其在破伤风梭菌感染中的作用仍不清楚(参见，Hatheway，77)。
虽然在高级阶段(advanced case)诊断破伤风是相对容易的，但是成功治疗依赖于致死量的毒素固定到神经组织之前的早期诊断。因此，在得到实验室数据之前，通常根据经验来治疗患者。破伤风毒素被预防性地使用来防止这种疾病。由于免疫抑制的患者对毒素的预防注射不产生反应，采用肌肉内给予人破伤风免疫球蛋白。
被诊断为破伤风的治疗包括清除伤口以从创伤部位除去生物体。在用苯并二氮控制患者的痉挛后，再进行清除伤口。通常使用青霉素或灭滴灵(metronida zolel)来治疗患者。还肌肉内给予人破伤风免疫球蛋白。辅助治疗(例如帮助呼吸、供给营养和静脉内流动)对于患者存活是关键的。在伤口干净而且小的情况下，如果患者在过去10年中没有接受过加强剂量，则给患者施用破伤风类毒素，尽管创伤严重，如果患者在过去5年中没有接受过加强剂量，也施用类毒素。
产气荚膜梭菌毒素(Clostridium Perfringens Toxin)
产气荚膜梭菌被认为是最广泛存在的病原性细菌(参见Hatheway，同上文，77)。最早在1892年，Welch和Nuttall描述了这种生物体，称作荚膜产气芽孢杆菌，还通常被称作为魏氏梭状芽孢杆菌(C.welchii)。产气荚膜梭菌通常从土壤样本以及人和其它动物的肠道内容物中分离。虽然其它梭菌属也与气性坏疽相关(例如，诺氏梭菌(C.novyi)、败毒梭菌(C.septicum)、溶组织梭菌(C.histolyticum)、第三梭菌(C.tertium)、双酶梭菌(C.bifermentans)和生孢梭菌(C.sporogenes)，产气荚膜梭菌是最相关的种属。当被引入健康组织中时，这些生物体不是高度致病性的，但是当存在组织损伤(例如被损坏的肌肉组织)时导入，与迅速渐进性的破坏性感染相关，这种感染表现为气体积聚，大范围的肌肉和组织坏死。在活跃增殖时，侵入的梭菌菌株产生具有引起坏死(即溶解细胞)、溶血和/或致死特性的外毒素。此外，由该生物体产生的酶如胶原酶蛋白酶、脱氧核糖核酸酶以及透明质酸酶，导致在组织中积聚毒性降解产物。
产气荚膜梭菌生成四种主要的致死毒素(α、β、ε和iota)，物种的毒素类型基于此，以及九种小毒素(或可溶抗原)，它们可能参与或不参与与生物体相关的致病性(参见Hatheway，同上文，77)。这些小毒素是λ、θ、κ、μ、ν、γ、η和神经氨酸苷酶。此外，一些菌株产生导致产气荚膜梭菌食物引起的疾病的肠毒素。根据所产生的毒素，产气荚膜梭菌可以被分成称作为A、B、C、D和E的“毒素类型”。例如，大部分毒素类型A的菌株产生α毒素，而不产生其它主要的致死毒素(即β、ε和ι)；毒素类型B的生物体产生除了ι毒素之外的所有的主要致死毒素；毒素类型生物体产生α和β主要致死毒素，但是不生成ε和ι毒素；毒素类型D生物体生成α和ε毒素，但是不生成β和ι毒素；毒素类型E生物体生成α和ι毒素，但是不生成β和ε毒素。
α毒素是卵磷脂酶(磷脂酶C)，而β毒素是坏死性胰蛋白酶不稳定毒素；ε毒素是一种透性酶、胰蛋白酶活化毒素；ι毒素是一种引起皮肤坏死的、二元的、ADP-核糖基化、胰蛋白酶活化毒素。δ毒素是一种溶血素；θ毒素是一种氧不稳定溶血素，和溶细胞素；κ毒素是一种胶原酶和白明胶酶；λ毒素是一种蛋白酶；μ毒素是一种透明质酸酶；而ν毒素是一种DNA酶。γ和η毒素还未被充分地表征，是否存在仍值得怀疑(参见Hatheway，同上文，77)。神经氨酸苷酶是N-乙酰神经氨酸糖基水解酶，而肠毒素具有肠道内和细胞内毒性。
本发明的毒素通常与特定疾病相关。例如，毒素类型A的生物体与人的肌肉坏死(气性坏疽)、食物引起的疾病和感染性腹泻，羔羊、牛、山羊、马、狗、羊驼等动物的肠毒血症；禽类的坏死性肠炎；马的梭菌性疾病(clostridiosis)；非人类的灵长类和各种其它动物包括人中的急性胃扩张相关。毒素类型B的生物体与羔羊痢疾、绵羊和公山羊的肠毒血症(特别是在欧洲和中东)，豚鼠肠毒血症相关。毒素类型C的生物体与Darmbrand(德国)和坏死性肠炎(新几内亚)、绵羊猝疽(struck)、羔羊和猪的肠毒血症以及禽类的坏死性肠炎相关。毒素类型D的生物体与绵羊的肠毒血症、羔羊的肉质肾(pulpykidney)相关。毒素类型E的生物体与小牛肠毒血症、羔羊痢疾、豚鼠肠毒血症和兔子“ι”肠毒血症相关。产气荚膜梭菌类型A的菌株通常从土壤样本中分离，还常常存在于未患病的个体的肠道内容物中，类型B、C、D和E的菌株不能在土壤中存活(即这些菌株是专性寄生物)。
目前，对污染的创伤的处理包括及时对被污染的创伤进行手术清创，防止厌氧性蜂窝织炎。对于气性坏疽，仅采用抗菌剂治疗是不够的。一旦造成梭菌性创伤感染，及时进行手术清创是必需的。在发生厌氧性蜂窝织炎的情况下，需要大范围切除感染部位并清除创伤，而气性坏疽常常需要完全切除相关肌肉(即常常需要截肢)。
虽然出现青霉素抗性菌株，导致使用氯洁霉素(clindamycin)、氯霉素和灭滴灵(metronidazole)，但是大剂量的青霉素常常被使用。然而，出现了抗四环素、氯霉素、红霉素和氯洁霉素抗性的细菌。已经将制备来抵抗四种菌株(产气荚膜梭菌、诺氏梭菌、败毒梭菌和溶组织梭菌)的毒性滤过物的多价马抗毒素用于预防和治疗气性坏疽。但是，还没有确定其功效，并且不再被用于临床应用(Swartz，645，记载于Davis等(编辑)，Microbiology，第4版，J.B.Lippincott Co.(1990))。
艰难梭菌毒素
艰难梭菌(clostridium difficile)因为其难于分离而得名，最近被证实是引起腹泻的病原体(Sneath等，1165)。艰难梭菌是人和动物中的伪膜性大肠炎的病原体。艰难梭菌与各种腹泻疾病相关，从仅仅是腹泻到严重腹泻和集聚炎症性细胞和纤维蛋白的胃肠道粘膜坏死，在感染部位形成伪膜。
艰难梭菌的肠道毒素主要是由两种毒素作用产生，称作A和B，各自分子量约300,000。两者都是潜在的细胞毒素，毒素A具有直接的肠道毒性作用(Lyerly等，Infect.Immun.60：4633(1992))。产气荚膜梭菌与抗菌剂相关腹泻几乎不相关，不同于产气荚膜梭菌的毒素A，艰难梭菌的毒素不是孢子包被组成，不是在孢子形成过程中产生(Swartz，644)。艰难梭菌的毒素A在兔子回肠环中引起出血，体液集聚和粘膜损伤，可能提高肠道粘膜对毒素B的摄取。毒素B不会引起肠道液体集聚，但是对组织培养细胞的毒性比毒素A大1000倍，导致膜损伤。虽然这两种毒素产生相似的细胞作用，例如肌动蛋白分解，但是存在不同的细胞特异性。
这两种毒素在疾病中是重要的(Borriello等，Rev.Infect.Dis.，12(副刊2)：S185(1990)；Lyerly等，Infect.Immun.，47：349(1985)；以及Rolfe，Infect.Immun.，59：1223(1990))。一般认为，毒素A首先通过结合到刷状缘受体上来起作用，破坏外层粘膜层，然后使毒素B进入下面的组织。发病机理中的这些步骤表明，产生抗毒素A的中和抗体足以预防性地治疗CDAD。但是，抗毒素B的抗体是抗晚期肠道疾病的有效治疗剂的必要的额外补充。实际上，已经报导，动物需要这两种毒素的抗体，以彻底地防止该疾病(Kim和Rolfe，Abstr.Ann.Meet.Am.Soc.Microbiol.，69：62(1987))。美国专利5,071,759公开一种免疫性地结合艰难梭菌的毒素A和毒素B的单克隆抗体。美国专利6,365,158公开制备定向抵抗艰难梭菌的毒素B的中和抗体的方法。特别地，使用可溶的重组艰难梭菌的毒素B，在鸟类中制备定向抵抗这些毒素的抗体。这种鸟类抗毒素被设计成以治疗量用于口服施用，以及任何形式(即，作为一种固体或水溶液)。
炭疽杆菌(Bacillus Anthtracis)毒素
炭疽热毒素是熟知的来自炭疽杆菌的生物战争试剂。炭疽杆菌生成三种蛋白质，当被恰当地结合时形成两种可能的毒素，共同称作炭疽热毒素。保护性抗原(PA，82，684Da(道尔顿))和水肿因子(EF，89，840Da)结合形成水肿毒素(ET)，而PA和致死因子(LF，90，237Da)结合形成致死毒素(LT)(Leppla，S.H.Alouf，J.E.和Freer，J.H.，编辑Academic Press，London 277-302，1991)。ET和LT都遵照AB毒素模式，PA具有目标细胞结合(B)功能，EF或LF作为效应子或催化(A)部分。这些毒素的独特特征是在缺乏PA时，LF和EF无毒性，这显然是由于它们无法进入真核细胞的细胞质中。
PA能够结合到许多类型的细胞的表面上。在PA结合到易感细胞表面的特定受体上后(Leppla，同上文，1991)，其在单个位点上被细胞表面蛋白酶裂解，可能是费林蛋白酶(furin)，生成氨基末端的19-kDa的片段，该片段从受体/PA复合物上释放(Singh等，J.Biol.Chem.264：19103-19107，1989)。从PA上去除该片段，在结合受体的63-kDa的羧基末端片段(PA63)上暴露LF和EF的高亲合性结合位点。PA63和LF或EF的复合物进入细胞，并可能经过酸化的内涵体到达细胞溶胶。
最近，在细胞中确定致死因子(LF)的靶点中的两个。LF是一种金属蛋白酶，其特异性地裂解Mek1和Mek2蛋白激酶，它们是MAP-激酶信号路径中的组成。LF的蛋白质水解活性通过裂解激活促有丝分裂原的蛋白激酶激酶1或2(MEK1或MEK2)来灭活MAP-激酶信号级联。(Leppla，S.A.记载于细菌蛋白毒素的综合资料(The Comprehensive Sourcebook of Bacterial ProteinToxins).J.E.Alouf和J.H.Freer，编辑，第二版，San Diego，Academic Press，1999；243-263)。
PA是该毒素的无毒的、结合细胞组分，是目前可以获得的人疫苗的重要组成。该疫苗通常从炭疽杆菌的Sterne菌株的批量培养中制备，虽然是无毒性的，但是仍然被要求作为III级病原体来处理。除了PA，该疫苗含有少量炭疽热毒素部分、水肿因子和致死因子和一定范围的培养来源蛋白。所有这些因子在一些个体中产生所记载的该疫苗的反应遗传性(reactogenicity)。该疫苗是昂贵的，并且需要六个月进行四次接种。此外，目前的证据表明，这种疫苗对于抵抗某些菌株的吸入性攻击是无效的(M.G.Broster等，Proceedings of the International Workshop on Anthrax，11-13，1989年4月，Winchester UK.Salisbury med Bull Suppl No 68，(1990)91-92)。
美国专利6,267,966提供一种重组微生物，其能够表达炭疽杆菌保护性抗原及其能够在哺乳动物中产生免疫反应的变体或片段，所述微生物包括编码PA或其所述片段或片段的序列，其中(i)所述微生物中的一种编码分解代谢受体蛋白和/或AbrB的基因被灭活；和/或(ii)所述PA序列的一个能够作为分解代谢受体结合位点的区域被灭活；和/或(iii)所述PA序列的一个能够作为AbrB结合位点的区域被灭活。
抗毒素抗体
美国专利6,440,408提供与特异于活生物体(细菌或原生动物)的中和抗体复合的生物体的疫苗制备物。被复合的中和抗体的含量使得生物体仍能够诱导活性免疫反应，同时对病原体的有害作用产生一定程度的预防作用。
细菌或原生动物中和抗体是在体内抵抗细菌或原生动物的传染性的那些抗体，细菌或原生动物与这些抗体相互作用足够时间。细菌或原生动物中和抗体的来源是不重要的。可以来自任何动物，包括鸟类(例如，小鸡、火鸡)和哺乳动物(例如大鼠、兔子、山羊、马)。细菌或原生动物中和抗体实质上可以是多克隆的或单克隆的。参见，例如，D.Yelton和M.Scharff，68 AmericanScientist 510(1980)。该抗体可以是嵌合的。参见，例如，M.Walker等，26Molecular Immunology 403(1989)。
可用于制备抗体的细菌包括，但是不限于，李氏放线杆菌(Actinobacillosis lignieresi)、牛型放线菌(Actinomyces bovis)、产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)、边缘无形体(Anaplasma marginale)、炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、鹅疏螺旋体(Borrelia anserina)、狗布鲁氏菌(Brucella canis)、肖氏梭菌(Clostridium chauvoei)、溶组织梭菌(C.hemolyticium)、诺氏梭菌(C.novyi)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、败毒梭菌(C.Septicum)、破伤风梭菌(C.tetani)、马棒杆菌(Corynebacterium equi)、化脓棒杆菌(C.pyogenes)、兔肾棒杆菌(C.renale)、反刍类考德里氏体(Cowdria ruminantium)、刚果嗜皮菌(Dermatophilus congolensis)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix insidiosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、坏死梭形菌(Fusiformis necrophorus)、犬血巴通氏体(Haemobartonella canis)、Hemophilus spp.H.suis、钩端螺旋体(Leptospria spp.)、牛莫拉氏菌(Moraxella bovis)、Mycoplasma spp.M.hyopneumoniae、Nanophyetus salmincola、鸭瘟巴斯德氏菌(Pasteurella anatipestifer)、溶血巴斯德氏菌(P.hemolytica)、多杀巴斯德氏菌(P.multocida)、绵羊流产沙门氏菌(Salmonella abortus-ovis)、马肾志贺氏菌(Shigella equirulis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、猪葡萄球菌Hyos亚种(S.Hyicus.S.Hyos)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、停乳链球菌(S.dysgalactiae)、马链球菌(S.equi)、乳房链球菌(S.uberis)和胎儿弧菌(Vibrio fetus)(对于相应疾病，参见VeterinaryPharmacology and Therapeutic第5版，746表50.2(N.Booth和L.McDonald编辑，1982)(Iowa State University Press)；和白喉杆菌(Corynebacteriumdiptheriae)、牛分枝杆菌(Mycobacteriufn bovis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(C.difficile)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、破伤风梭菌(C.tetani)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertusiss)、铜绿假单胞菌(Pseudomoyaas aeruginosa)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、布鲁氏菌属(Brucella spp.)、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularenssis)、侵肺军团菌(Legionella pneumophila)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、砂眼衣原体(C.trachomatis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenza)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟氏球菌(Neiseseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meninigitidis)、伯氏考克斯氏体(Coxiellaburneti)、穆氏立克次氏体(Rickettsia mooseria)、普氏立克次氏体(R.prowazekii)、立氏立克次氏体(R.rickettsii)、恙虫热立克次氏体(R.tsutsugamushi)、疏螺旋体属(Borrelia spp.)、问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)、彻白密螺旋体(Treponema pallidum)和单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)(对于相应疾病，参见R.Stanier等，The MicrobialWorld，637-38表32.3(第5版1986)。
美国专利4,689,299教导将免疫后的人外周血淋巴细胞与非分泌性小鼠骨髓瘤细胞融合，制备分泌抵抗细菌毒素的人单克隆抗体的稳定杂交瘤细胞系。本专利公开制备抵抗破伤风毒素和白喉毒素的保护性单克隆抗体的方法，这些抗体分别在体外结合破伤风毒素和白喉毒素，分别在动物体内预防破伤风和白喉。本发明的抗破伤风毒素和抗白喉毒素的人单克隆抗体，能够分别中和破伤风毒素和白喉毒素。能够预防破伤风和白喉疾病，从而提供用于预防和/或治疗毒素诱导的疾病的新化学治疗剂。
本发明提供包含被融合到Tf或mTf上的抗毒素的转移体。优选地，该转移体包含被融合到Tf或mTf上的抗肉毒杆菌神经毒素(BoNT)的抗毒素。该转移体可以被呈递给军队和重要的接受者以及在潜在的生物恐怖袭击之前呈递给普通群体，并以容易施用的形式保存备用。防止军事人员和广大民众受生物恐怖发生后的大量暴露的威胁，需要抗毒素在恶劣环境条件下保持稳定，每次施用后具有至少两个月保护期，单位成本低，广谱抵抗所有血清性A、B和E(可能C和D)，基于肉毒中毒的流行病学A、B和E是最优先的(作为导致肉毒中毒的食物中毒试剂，A、B和E是最流行的血清类型)。
在本发明中，可以通过噬菌体展示方法来确定对BoNTA的重链具有结合亲合性的肽，而将候选的肽工程化或者融合到未被糖基化形式的转铁蛋白(mTf)中。可以在面包酵母(bake’yeast)，酿酒酵母中表达和分泌生成的转移体。目的在于保留肽的毒素结合特性，显现长的mTf的循环半衰期。评价每个转移体对神经毒素A、B和E的非毒性重链部分的结合亲合性。
本发明提供针对所有血清型的广谱作用抗BoNT，由于生物利用度高、生物分布广，作用起始迅速，载体蛋白mTf赋予长的循环半衰期。可以采用工业上最廉价的生产体系酵母发酵来生产转移体。酵母能够生产g/l的产物，该产物被分泌到十分清楚的发酵培养基中，培养基主要由水、盐和碳源通常为糖组成。容易从培养基中纯化高纯度的转移体。一般认为，与哺乳动物细胞生产体系不同，酵母细胞对人是不致病的，不需要进行病毒灭活，相对地简化纯化操作，通过减少确认需求缩短开发时间。由于转移体本身无毒性，生产是安全的。这种中和毒素活性的可替代方法将会生成一种循环毒素结合物质，在毒素结合到靶点受体并产生神经毒性之前捕获毒素。
在一个实施方案中，转移体是被工程改造形式的mTf，其中结合到毒素的重链上的肽序列被工程改造到mTf表面环中。以这种方式，插入多种肽来生成能够结合A到G的所有血清型的多价结构。在另一个实施方案中，采用亲合成熟来提高通过噬菌体展示建立的随机肽序列的特异性结合亲合性。
包含抗原免疫调节区的转移体
在本发明的一个实施方案中，进一步修饰转移体来包括至少一种免疫原性的或免疫调节的肽。一种或多种这种肽被结合到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白中。包含一种或多种抗原性区域的转移体不仅能够结合其抗原，而且能够在宿主中诱导免疫反应。由于大部分宿主已经用被插入到转移体中的抗原决定区免疫并且对此具有记忆，由这些转移体诱导的细胞的和激素的反应比标准抗体强烈。
抗原性肽具有至少6个氨基酸的链长度，优选12个氨酸(假设在两端具有3个氨基酸)，可以含有无限长的氨基酸链或其补体，其特征在于存在相同或不同抗原或变态反应原的其它表位。当其不含有具有或不具有这种其它表位的额外链时，通常具有不超过50个氨基酸的氨基酸链。期望短链含有期望表位，优选其氨基酸链长度不超过40个，更加特别地不超过30个和更加特别地不超过20个氨基酸。最优选地，转移体具有15-30个氨基酸的肽。
优选地，往转移体中插入诱导免疫反应的抗原性区域。更加优选地，抗原性区是高度抗原性的肽，包括从被用作疫苗的蛋白质中选择的抗原性区域。在其它实施方案中，被插入到转移体上或中的肽能够调节免疫系统。例如，在本发明的转移体中包括抗体Fc区。
多肽的免疫原性可以被称作定向抵抗少数免疫原性决定区的免疫反应，仅限于多肽分子上的少数位点，(参见Crumpton，M.J.，记载于TheAntigens(Sela，M.编辑，Academic Press，New York，1974)中；Benjamini，E.等，Curr.Topics Microbiol.Immunol.5885-135(1972)；Atassi，M.Z.，Immunochemistry 12，423-438(1975))。制备抵抗对应于多肽序列的短线性序列的化学合成肽的抗血清，已经证明该血清能够很好地与完整的多肽反应，(参见Green，N.等，Cell 28，477-487(1982)；Bittle，J.L.等，Nature298，30-33(1982)；Dreesman等，Nature 295，158-160(1982)；Prince，A.M.，Ikram，H.，Hopp，T.P.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 79，579-582(1982)；Lerner，R.A.等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 78，3403-3407(1981)；Neurath，A.R.，Kent，S.B.H.，Strick，N.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 79，7871-7875(1982))。但是，甚至当相互作用位点与天然蛋白质的免疫原性决定区无关时，也会发生相互作用，(参见Green，N.，等，同上文)。相反，由于制备来抵抗天然蛋白质的抗体清楚地定向于免疫原性决定区，因此，与这些抗体相互作用的肽必需含有至少一部分免疫原性决定区。
在免疫原性决定区已经被清楚地作图的少数蛋白质的研究中，清楚表明决定区可以由单一序列构成，(连续的)，或者由多个序列构成，(不连续的)，通过如同多肽链的天然状态折叠多肽链来将多肽链的线性上有距离的区域结合在一起，(参见Atassi，M.Z.，Immunochemistry 15，909-936(1978))。在为溶解酶的情况下，数个元件由仅一个氨基酸组成，而起作用的元件的大小在一个到与抗体结合位点的维度一致氨基酸的最大数目之间变化，可能达到5-6个(参见Atassi，M.Z.，同上文)。
通过如下的一种或多种方法，已经在少数蛋白质的氨基酸序列中精确定位免疫原性决定区：(1)在特定位点上进行化学修饰之前和之后，对整个多肽或从中分离的肽片段进行抗原性测定；(2)定位取代物的多肽氨基酸序列中的位置，通过在存在单克隆抗体时培养表达蛋白质的病毒来选择；和(3)合成和检测与氨基酸序列同源的肽，怀疑具有免疫原性活性的区域。
美国专利4,554,101公开根据蛋白质抗原或变态反应原的最大局部平均亲水性的位置，来确定蛋白质抗原或变态反应原的抗原性或变态反应原性的决定区。此外，本专利教导制备对应于最大局部平均亲水性的位置的6个或更多个氨基酸的特定序列的合成肽。
采用技术人员已知的方法，例如在美国专利4,554,101中描述的那些方法，能够获得各种蛋白质抗原或变态反应原的抗原性肽，并插入到转移体中。例如，抗原肽可以得自乙肝表面抗原、组织相容性抗原、流感血凝素、鸡瘟病毒血凝素、rag weed变态反应原Ra3和Ra5，以及如下病毒的抗原：牛痘、EB病毒、polio、风疹病毒(rubella)、细胞巨化病毒(cytomegalovirus)、天花病毒(small pox)、疱疹病毒(herpes)、单纯I型和II型、黄热病病毒(yellow fever)和其它病毒。
另外，可从如下寄生物中获得抗原性肽：携带疟疾的生物体(P.Falciporum，P.Ovace，等)。血吸虫(schistosomiasis)、盘尾丝虫(Onchocerca Volvulus)以及其它线虫寄生虫，Tyrpanosomes、利什曼虫(leishmania)、Chagas病虫、阿米巴病虫(amoebiasis)、十二指肠虫(hookworm)等。此外，抗原性肽可以从如下细菌中获得：麻风病菌(leprosy)、肺结核菌、梅毒细菌(syphilis)和淋病细菌(gonorrhea)等。
此外，采用已知方法，可以从如下病毒中获得抗原性肽：感染性缺肢(ectromelia)病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、传染性牛鼻气管炎(rhinotracheitis)病毒、马病毒性流产(马流产)病毒、牛恶性卡他(catarrh)病毒、猫科鼻气管炎(rhinotracheitis)病毒、犬疱疹病毒、EB(Epstein Barr)病毒(伴随传染性单核细胞增多症和Burkitt淋巴瘤)、Marek病病毒、绵羊肺腺瘤病(Jaagziekle)病毒、细胞巨化病毒、腺病毒类、人乳头瘤(papilloma virus)、猫科panleucopaenia病毒、貂肠炎(Mink enteritis)病毒、非洲马瘟病毒(血清型9)、蓝舌病(Bluetongue)病毒(血清型12)、鲑鱼的传染性胰腺坏死病毒、禽肉瘤病毒(各种菌株)、禽类白血病病毒，visceral，鸟类内脏的白血球组织增生病毒、鸟类成红血球的白血球组织增生病毒，禽类白血病病毒erythroblastic，禽类白血病病毒，myeloblastic，成髓细胞骨骼石化症(Osteopetrosis)病毒、新城疫病毒、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒(Parainfluenza)3、副流感病毒4、腮腺炎(Mumps)病毒、火鸡(Turkey)病毒、CANADA/58、犬瘟热(canine distemper)病毒、麻疹(measle virus)病毒、呼吸道合胞(Respiratory syncytial)病毒、黏(myxouirus)病毒、A型病毒例如人流感病毒、例如Ao/PR8/34、Al/CAM/46和A2/Singapore/1/57；鸡瘟(Fowl plague)病毒；B型病毒例如B/Lee/40；狂犬病(Rabie)病毒；东方奎宁脑炎病毒(Eastern equinine encephalitis virus)；委内瑞拉奎宁脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)；西方奎宁脑炎病毒(Western equine encephalitis virus)；黄热病病毒；登革热1型病毒(类型6)；登革热2型病毒(类型5)；登革热3型病毒；登革热4型病毒；日本脑炎(encephalitis)病毒、科萨努尔森林(Kyasanur Forest)病毒；跳跃病病毒(Loupingill)、河谷(Murray Valley)脑炎病毒；鄂木斯克出血热(omsk haemorrhagic fevor)病毒(类型1和11)；圣路易斯(St.Louis)脑炎病毒；人鼻(rhinoviruses)病毒、口蹄疫(Foot-and-mouth)病毒；脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)1型；肠道病毒(Enterovirus)Polio 2；肠道病毒Polio 3；禽传染性支气管炎病毒；人呼吸道病毒；猪(swine)传染性胃肠炎病毒；淋巴细胞脉络丛脑膜炎(Choriomeningitis)病毒、拉沙热(Lassa)病毒；Machupo病毒；Pichinde病毒；Tacaribe病毒；乳头状瘤病毒(Papillomavirus)。
一方面，本发明的转移体包含选自已经被用作疫苗的蛋白质的抗原性肽，该蛋白质例如来自polio和风疹病毒。另一个方面，本发明的转移体包含已知适合用于免疫接种的抗原性肽。
美国专利4,694,071和4,857,634描述适合用于免疫接着来抵抗由肠道病毒引起的疾病的合成肽。这些肽来源于脊髓灰质炎病毒3型Sabin菌株的结构性衣壳蛋白VP1。
美国专利4,708,871公开具有口蹄疫病毒的VP1蛋白的抗原性的合成肽，特征在于至少该肽的一部分选自VP1蛋白的5个、6个或7个抗原活性氨基酸的序列。
美国专利4,769,237提供用于制备保护动物宿主免受小核糖核酸病毒的抗体的合成肽。特别地，该专利教导含有约20个氨基酸残基的抗原性肽，这些氨基酸对应于抗原性小核糖核酸病毒衣壳蛋白的特定区域，例如口蹄疫和脊髓灰质炎病毒(poliomyelitis)的VP1衣壳。
美国专利4,474,757教导用于制备抗各种流感病毒的疫苗的合成肽。抗原性片段来源于多种流感病毒的特异性决定区，在多种流感病毒的血凝素上。
美国专利5,427,792公开了风疹病毒的E1和E2糖蛋白的线性和环状肽，而美国专利5,164,481公开风疹病毒的E1和C蛋白的线性和环状肽。这些肽还可以用于生产抗风疹病毒感染的疫苗。美国专利6,180,758和6,037,44公开具有对应于风疹病毒(RV)的结构性蛋白特别是E1、E2或C蛋白的至少一个抗原决定区的氨基酸序列的合成肽，在抗风疹的疫苗中的用途。
美国专利5,866,694提供诱导抗体的肽，该抗体中和遗传分化的HIV-1分离物。这些肽的长度为6个氨基酸，来源于gp160。
美国专利4,777,239公开17种合成肽，能够诱导对某些期望的人乳头状瘤病毒(HPV)的抗体。这些肽是基于预测的二级结构以及由所选择的开放阅读框编码的蛋白质或肽的亲水性来选择的。二级结构和亲水性是根据Hopp，T.，等，Proc Natl Acad Sci(USA)(1981)78：3824；Levitt，M.，J MolBiol(1976)104：59；和Chou，P.，等，Biochem(1974)13：211公开的方法，从这些蛋白质的氨基酸序列推导得出的。这些推导结果使得可以构建诱导与完整蛋白质反应的抗体的肽。制备两种类型的这种抗原性肽。被确定为对HPV-16或者其它HPV类型特异的肽区域-特异决定区，通过缺乏与其它HPV类型的同源性来获得该肽，可以用于实质上产生抗HPV-16或者其它HPV类型病毒的抗体，用于诊断、预防和治疗目的。在目标的各种类型的HPV中同源的肽区域可以被用作广谱诊断剂和疫苗，产生作为广谱诊断剂的抗体。
美国专利6,410,720公开来源于Mycobacterium vaccae的肽抗原，用于治疗分枝杆菌感染，包括肺结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌。可溶性抗原在预先暴露于分枝杆菌的患者中诱导免疫反应。
美国专利6,488,931提供包含含有卵巢癌蛋白的免疫性部分及其肽变体的多肽的疫苗，变体与免疫性部分区别在于一个或多个取代、删除、添加和/或插入，使得实质上没有降低变体与卵巢癌蛋白特异性抗血清的反应能力。
美国专利6,489,101公开具有免疫原性的包含至少乳腺癌蛋白的一部分多肽或其变体的多肽，制备用于治疗和预防乳腺癌的疫苗。
美国专利6,447,778教导用于制备疫苗的肽偶联物，该疫苗通过刺激细胞毒性淋巴细胞的生成和增殖，诱导细胞介导的免疫反应。肽偶联物包含与HIV的gp120主要中和结构域(PND)gp41类似的氨基酸序列，和HIV的Nef(p27)以及增强免疫原性的载体。
美国专利6,419,931提供用于在哺乳动物中诱导对目标抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应的肽。典型地，CTL-诱导肽为7-15个残基，更通常为9-11个残基。CTL-诱导肽可用于本发明的组合物和方法中，从各种来源筛选，取决于被靶向的目标抗原。CTL-诱导肽通常是小肽，来源于对目标疾病的有效CTL反应相应的靶向抗原的所选择的表位区。
美国专利6,419,931还涉及包含CTL-诱导肽以及能够产生辅助T淋巴细胞(HTL)反应的肽的组合物。HTL-诱导表位可以通过肽提供，该肽实质上对应于由CTL-诱导肽靶向的抗原，或者为对应于被更广泛识别的抗原的肽，诱导HTL的表位对组织相容性抗原的限制不特异。无论个体的表型是否为MHC II型，被大部分个体识别的肽(“混杂的”)是特别优选的。HTL肽通常包含6-13个氨基酸，并且含有一个HTL-诱导表位。
CTL反应是大部分哺乳动物对大量各种病毒的免疫反应的重要组成。美国专利6,419,931专利提供有效刺激对病毒感染细胞的CTL反应的方法，以及在宿主哺乳动物中治疗或预防这种感染的方法。因此，本发明的组合物和方法可应用于任何呈递蛋白和/或肽抗原的病毒。这种病毒包括但是不限于如下，致病性病毒例如流感A和B病毒(FLU-A、FLU-B)、人免疫缺陷I型和II型病毒(HIV-I、HIV-II)、EB病毒(EBV)、嗜人T淋巴细胞的(或T-细胞白血病)病毒I型和II型病毒(HTLV-I、HTLV-II)、人乳头状瘤病毒1-18型(HPV-1到HPV-18)、风疹病毒(RV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、腺病毒(AV)和单纯疱疹病毒(HV)。此外，本专利可应用于细胞巨化病毒(CMV)、脊髓灰质炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、狂犬病病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒(rotavirus)和麻疹病毒的肽抗原。
以类似方式，美国专利6,419,931的组合物和方法可以被应用于肿瘤相关蛋白，肿瘤相关蛋白是CTL表位的来源。这种肿瘤蛋白和/或肽，包括但是不限于，MAGE-1、-2和-3基因的产物、c-ErbB2(HER-2/neu)原癌基因的产物、可以被突变或者过度表达的肿瘤抑制和调控基因的产物例如p53、ras、myc和RB 1。将CTL反应靶向肿瘤的组织特异性蛋白例如用于靶向前列腺癌的前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺烷酸磷酸化酶(PAP)，以及靶向黑素瘤的酪氨酸酶。除了与细胞转化到肿瘤细胞中相关的病毒相关蛋白例如EBNA-1外，HPV E6和E7也是可应用的。已经确定在来自一些上述蛋白质的大量肽中存在MHC-结合基序，能够高效地与被纯化的MHC分子结合。
US6,407,063公开MAGE-1和MAGE-4的特异性抗原性肽，可以被用于制备疫苗来诱导免疫反应，以治疗疾病。
美国专利5,462,871；5,558,995；5,554,724；5,585,461；5,591,430；5,554,506；5,487,974；5,530,096和5,519,117公开引起特异的T细胞反应(CD4+或CD8+T细胞)的肽，例如肿瘤相关抗原性肽(TAA，也称作肿瘤排斥抗原TRAS)。还可参见Van den Eynde和van der Bruggen(1997)以及Shawler等(1997)的评述。
美国专利6,368,852公开能够在体内或体外诱导CTL(细胞毒性T淋巴细胞)为人胃细胞的肽。更加特别地，该肽能够通过结合到HLA-A31抗原(人白细胞抗原)上将CTL呈递到人胃细胞中。该肽可以用于制备用于治疗和预防胃癌的疫苗。
来自Fc区的肽
免疫球蛋白(Igs)由B淋巴细胞产生，并分泌到血浆中。单体形式的Ig分子是基因约150kDa的糖蛋白，其多少有点象个Y。如较前面的讨论，Y形由两条重链和两条轻链组成。重链分成羧基末端的Fc部分(Y的基部)，和氨基末端的Fab部分(Y的臂)。糖链被连接到分子的Fc部分。Ig分子的Fc部分仅由重链组成。IgG和IgM的Fc部分能够结合到免疫调节细胞例如巨噬细胞的表面上的受体上，并刺激细胞因子释放，该因子调节免疫反应。Fc区含有与所有Igs相同的蛋白质序列以及各个类别的独特决定区。在相同种类中，这些区域在不同Ig分子中不会显著地变化，被称作恒定区。Fc片段的恒定区使分子具有生物学特性，例如结合受体和活化补体。
通过结合Fc区中的活性位点来活化Fc受体。因此，Fc受体是抗体之间的重要连接，是免疫系统的保留部分。因此，结合到抗体的Fc区的活性位点上的Fc受体被称作为“最后的共同路径”，通过此调节抗体功能。如果被抗原结合的抗体不结合到Fc受体上，抗体不能够激活免疫系统的其它部分，因此，仍然是无功能活性的。
任何能够具有结合免疫球蛋白Fc受体的肽具有作为免疫调节剂的治疗性用途，借助肽调节结合受体的能力。这种Fc受体“阻断剂(blocker)”占据Fc受体的免疫球蛋白结合位点，从而“短路(short circuits)”免疫球蛋白的活化能力。
本发明提供包含来源于免疫球蛋白的Fc区的肽的转移体，用于调节免疫反应。本发明包括这种转移体用于与调节免疫反应相关的治疗和诊断目的的用途。被插入到转移体中的肽能够通过结合到Fc受体上来刺激免疫反应或者通过阻断结合到Fc受体上来抑制免疫反应。
美国专利4,816,449公开新的有用肽的序列，该肽能够降低与自体免疫疾病、过敏和其它炎症症状例如那些受哺乳动物免疫系统调节的症状相关的炎症反应。特别地，要求保护的五肽可用于阻断受花生四烯酸/白三烯-前列腺素路径调节的炎症。因此，该肽可以有效用于替换已知的抗炎制剂，例如类固醇，大部分类固醇具有有害的或有毒的副作用。虽然这些肽具有与人IgE的Ce3氨基酸320-324部分相似的结构，被认为与IgE Fc受体结合相关，一般认为，该抗炎症活性的机制令人惊奇地不必包括阻断Fc受体结合。相反，本发明的肽被证明直接地作用于花生四烯酸介导的炎症路径，从而降低炎症。但是一般认为，本发明的肽与IgE分子之间的形态相似性使得要求保护的肽可用于调节免疫系统介导的反应，例如通过作为Fc受体位点阻断剂起作用。要求保护的肽具有氨基酸序列A-B-C-D-E(SEQ ID NO：5)，其中
A为Asp或Glu；
B为Ser、D-Ser、Thr、Ala、Gly或肌氨酸；
C为Asp、Glu、Asn或Gln；
D为Pro、Val、Ala、Leu或Ile；和
E为Arg、Lys或Orn。
美国专利4,753,927描述新的有用的肽的序列，肽阻断人IgG免疫复合物结合到人多形核嗜中性粒细胞(PMNs)上的IgG Fc受体上，阻断IgG和IgE免疫复合物结合到单核细胞和巨噬细胞(MMs)和其它白细胞上的IgG和IgEFc受体上。本专利提供通过阻断免疫复合物结合到免疫球蛋白Fc受体上，调节哺乳动物中的免疫反应的方法，包括施用包含选自氨基酸序列-Pro-Asp-Ala-Arg-His-Ser-Thr-Thr-Gln-Pro-Arg-(SEQ ID NO：6)部分的肽。本专利还教导这种肽用于降低人的过敏反应来减少免疫复合物介导的炎症和组织破坏的用途。
根据活性位点肽所结合的特定类型的Fc受体，该肽可能刺激或抑制免疫功能。如果Fc受体属于被结合到Fc区激活的类型，或者，可替代地，如果Fc活性位点肽刺激受体，则发生刺激。所产生的刺激的类型包括，但是不限于，由抗体Fc区-Fc受体结合直接或间接调节的功能。这种功能的例子包括，但是不限于，由某些类型的白细胞(多核形噬中性粒细胞)、单核细胞和巨噬细胞产生的噬菌作用的刺激；巨噬细胞活化、抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)；天然杀伤(NK)细胞活性；B和T淋巴细胞的生长和发育，淋巴细胞分泌淋巴细胞因子(具有杀死或免疫调节活性的分子)。
本发明包括包含与Fc受体相互作用并刺激免疫系统功能的肽的转移体的用途，包括上面所列举的那些肽。这些转移体在治疗疾病中具有治疗用途，疾病例如由细菌、病毒或真菌引起的传染性疾病，由于先天的或后天的条件导致的免疫系统缺陷的症状，癌症和人或动物的许多其它病痛。这种免疫刺激还可以用于加强机体对作为疫苗施用的特定注射的或口服施用的物质的保护性细胞的或抗体的反应。该列举仅仅提供免疫刺激具有确定的治疗有效性的疾病或症状的代表性例子。
如果活性位点肽结合到特定的Fc受体上，该受体不能够仅通过结合到Fc区上来激活，则可能发生抑制免疫系统功能。通常仅当抗原-抗体凝集物或免疫复合物的几个Fc区同时结合到几个Fc受体上使它们被“交联”时，这种Fc区被激活。这种通过几个Fc区交联的Fc受体似乎是激活特定类型Fc受体所需的重要信号。通过结合和阻断这种Fc受体，活性位点肽阻止免疫复合物或抗原-抗体凝集物中的Fc受体结合到受体上，从而阻断Fc受体活化。
本发明包括包含与Fc受体相互作用来抑制免疫系统功能的肽的转移体。这些转移体在治疗疾病中具有治疗用途，疾病例如过敏、包括类风湿关节炎和系统性狼疮红斑的自体免疫疾病、特定类型的肾病、免疫性肠道疾病例如溃疡性大肠炎和局部肠炎(Crohn病)、特定类型炎症性肺部疾病例如先天性肺纤维化和超敏性肺炎、特定类型脱髓鞘神经病例如多发性硬化、自体免疫溶血性贫血、后天(自体免疫)血小板生成紫癜、特定类型内分泌疾病例如Grave病或Hashimoto甲状腺炎和特定类型心脏病例如风湿热。免疫抑制在预防有害的免疫“排斥”反应中还具有治疗作用，在器官抑制或在用于治疗特定白血病或再生障碍性贫血的骨髓细胞移植中发生免疫“排斥”反应。该列举的仅仅提供已知免疫抑制具有治疗用途的疾病或症状的代表性例子。
Johnson和Thames(J.Immunol.，117，1491(1975))以及Boackle，Johnson和Caughman(Nature，282，742(1979))发现，当来源于人IgGl的aa(氨基酸)274-281(Lys-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly，SEQ ID NO：7)上的CH2的序列的肽被吸附到红血球上时，具有实质上互补的激活活性。特别地，具有aa(氨基酸)序列(Lys-Ala-Asp-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly，SEQ ID NO：8)的肽在激活Clq-介导的细胞溶解中，与由热聚集IgG形成的免疫复合物一样有效。前面提及的研究人员将这种活性归结为肽能够作为Clq Fc受体的活性结合位点。其它合成肽具有来源于IgG的该区域或IgM的CH4的aa487-491区(Glu-Trp-Met-Gln-Arg，SEQ ID NO：9)。
后来，Prystowsky，等(Biochemistry，20，6349(1981))以及Lukas，等(J.Immunol.，127，2555(1981))证明，来自aa281-292的紧邻CH2区的肽是C1-介导的溶血的抑制剂。特别地，与  IgG，CH2残基281-290(Gly-Val-Gln-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys，SEQ ID NO：10)和aa282-292(Val-Gln-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-OH，SEQ ID NO：11)相同的肽作为抑制剂与完整的单体IgG一样有活性。其它肽，例如aa275-290(Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Gln-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys，SEQ IDNO：12)，以及aa275-279(Ac-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val，SEQ ID NO：13)、aa289-292(Thr-Lys-Pro-Arg，SEQ ID NO：14)的活性较低。
吞噬作用激素(Tuftsin)是一种四肽，具有序列Thr-Lys-Pro-Arg(SEQ IDNO：14)，存在于所有人IgG亚类的第二恒定区中，在豚鼠IgG的aa289-292中。美国专利3,778,426证明，吞噬作用激素通过粒细胞、单核细胞和巨噬细胞体外刺激噬菌作用。此外，吞噬作用激素被证明能够刺激ADCC、天然杀伤(NK)细胞活性、巨噬细胞依赖的T细胞训导、体外和体内的T细胞依赖和独立的抗原的抗体合成。Ratcliffe和Stanworth(Immunol.Lett.，4，215(1982))的研究表明，吞噬作用激素竞争性地抑制人IgG结合到人单核细胞的IgG Fc受体上，吞噬作用激素结合到IgG Fc受体上。
Morgan等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，5388(1982))公开了与IgG aa335-358相同的24个残基的肽，能够非特异性地激活淋巴细胞。该肽被证明能够诱导多克隆B细胞增殖、抗原特异性抗体反应和天然杀伤(NK)细胞介导的溶解作用。该肽(Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Ser-Arg-Glu-Glu-Met，SEQ ID NO：15)和缺乏羧基端甲硫氨酸的23个残基的肽可能通过结合到IgG的淋巴细胞的Fc受体上来起作用。
Ciccimarra，等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72，2081(1975))报导来自人IgG的十肽的序列，其能够阻断IgG结合到人单核细胞IgG Fc受体上。该肽与IgGaa407-416(Tyr-Ser-Lys-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg，SEQ ID NO：16)相同。
Ratcliffe和Stanworth(Immunol.Lett.，4，215(1982))证明，与IgG aa295-301(Gln-Tyr-Asp-Ser-Thr-Tyr-Arg，SEQ ID NO：17)相同的肽能够微弱地阻断IgG结合到人单核细胞IgG Fc受体上。相反，IgG，CH2的相关肽，残基aa289-301不具有单核细胞IgG阻断活性。
Hamburger描述一种具有来源于人IgE C亚基ε3的320-324的五肽(Asp-Ser-Asp-Pro-Arg，SEQ ID NO：18)能够抑制约90％的局部皮肤过敏反应(Prausnitz-Kustner)(Hamburger，Science，189，389(1975)以及美国专利4,171,299和4,161,322)。后来证明，通过皮下路径注射这种肽后，抑制人中的系统性过敏疾病。研究表明，该肽对人嗜碱细胞的IgE Fc受体具有极高的亲合性，能够阻断人多达70％的IgE结合到嗜碱细胞的IgE Fc受体上(Plummer，等，Fed.Proc.，42，713(1983))。所观察到的这种肽在人体中阻断系统性过敏疾病的能力是由于该肽能够结合到细胞IgE Fc受体上(Hamburgr，AdV.Allergology Immunol.(Pergamon Press：New York，1980)，591-593)。
Hamburger报导，来源于C∈4的aa476-481的六肽(Pro-Asp-Ala-Arg-His-Ser，SEQ ID NO：19)能够阻断IgE结合到人类淋巴母细胞系(wil-2wt)上(Hamburger，Immunology，38，781(1979))。先前，这种肽被暗示用作用于阻断IgE结合到人嗜碱性细胞IgE Fc受体的试剂(美国专利4,161,522)。
Stanworth(Mol.Immunol.，19，1245(1982))描述一种具有与人IgE的Ce4的aa505-515上一部分相同的序列的十肽(Val-Phe-Ser-Arg-Leu-Glu-Val-Thr-Arg-Ala-Glu，SEQ ID NO：20)，导致125I-人IgG显著地结合到小鼠巨噬细胞上。
Stanworth，等证明，一些与人IgE的C∈4的部分相同的序列的肽，aa495-506(Pro-Arg-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe，SEQ ID NO：21)及其小的衍生物能够引起人和啮齿类肥大细胞发生脱粒，从而可以用于变应性脱敏治疗。(Biochem，J.，180，665(1979)；Biochem，J.，181，623(1979)；以及欧洲专利公开EP0000252)。
Sarmay等(Mol.Immunol.，1988，25(11)：1183-8)总结了由Cγ2或Cγ3结构域的表面暴露残基组成的合成肽对人B淋巴细胞活化周期的不同阶段作用的结果。CH2(289Thr-301Arg)和CH3(407Tyr-416Arg)肽以及完整的Fc片段增强PWM或PMA+CaI激活的淋巴细胞合成IgM。这种影响作用于早期阶段的B细胞活化。用Fc片段或CH2肽培养分离的静止B细胞，导致细胞体积变大和HLA-DR抗原的表达。另一方面，LIF生成受CH2和CH3肽的诱导。已经证明Fc肽诱导从单核细胞释放IL-1。这种结果表明，CH2和CH3结构域肽通过激活静止B细胞，使细胞对其它刺激更加敏感；此外，通过促使释放IL-1提高体液反应来部分地直接起作用。
Sheridan等(J Pept Sci1999，5(12)：555-62)教导固相合成大量来自IgG Fc的分支二硫基肽，Ac-F-C*-A-K-V-N-N-K-D-L-P-A-P-I-E-K(Ac-E-L-L-G-G-P-S-V-F)-C*-I-NH2。这些肽结合IgG的后端铰链区和最接近的β-发卡环，都可能结合到FcγRI上。环状铰链-环肽可用于从单核细胞系上表达的FcγRI上去除IgG2a，IC50为40mM，而线性形式的这种肽是无活性的。Fc铰链-环肽可能具有非mAb高亲合性，是FcγRI的免疫调节配基。
使用转铁蛋白/TNF-SCA转移体的方法
一个方面，本发明提供包含肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的一个或多个抗体可变区或CDRs以及转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白的转移体。本发明包括这种转移体用于治疗和诊断目的的用途。与产生TNF-α相关的严重疾病状态的例子包括，但是不限于，如下：脓毒性休克；内毒性休克；与细菌感染相关的恶病质综合症(例如肺结核、脑膜炎)、病毒性感染(例如AIDS)、寄生虫感染(例如疟疾)以及瘤形成疾病(neoplasmtic disease)；自体免疫性疾病，包括一些形式的关节炎(特别是类风湿和退行性的)；以及与用于防止移植排斥的处理相关的副作用。如下文所讨论，TNF-α与各种疾病状态或症状相关。本发明包括抗-TNF的转移体在治疗和诊断各种疾病中的用途。
TNF-α
TNF-α是一种多效的炎症细胞因子。机体中的大部分器官似乎都受TNF-α影响。该细胞因子具有生长刺激以及生长抑制的特性。该细胞因子似乎还具有自调控的特性。例如，在炎症过程中，TNF-α诱导嗜中性粒细胞增殖，但是还可能结合到TNF-R55受体上来诱导嗜中性粒细胞凋亡(Murray等，1997，Blood，90(7)：2772-2783)。这种细胞因子由多种类型的细胞产生，特别是巨噬细胞。虽然该细胞因子在病理状态下的作用还未被彻底阐明，TNF-α似乎是损伤和病态级联中的主要调节物。
虽然许多因子引起炎症反应，但是TNF-α在调节该过程中起主要作用。TNF-α的细胞作用包括生理的、细胞毒性的和炎症性的作用。在动态平衡中，TNF-α影响有丝分裂发生、分化和免疫调节，而在赘生性细胞系中引起凋亡性细胞死亡。TNF-α的细胞毒性独立于重新的转录和翻译而发生，并且包括由线粒体产生氧自由基，氧自由基主要在半泛醌部位上产生。
TNF-α的生物学作用取决于其浓度和产生部位：在低浓度下，TNF-α可能产生期望的稳定和预防性功能，而在高浓度下，系统性或在特定组织中，TNF-α与其它细胞因子，特别是白细胞介素-1(IL-1)产生增效作用，使多种炎症反应恶化。
已经证明，如下行为由TNF-α(以及IL-1)引起：发烧、深度睡眠、血液动力学的休克、急性期蛋白生成升高、白蛋白生成下降、血管内皮细胞活化、主要组织相容性复合物(MHC)分子表达增加、脂蛋白脂酶减少、细胞色素P450减少、血浆锌和铁减少、成纤维细胞增殖、滑液细胞胶原酶增加、环状加氧酶增加、T细胞和B细胞活化，诱导细胞因子分泌、TNF-α本身、IL-1、IL-6和IL-8。实际上，研究表明，这些细胞因子的生理学作用是相关联的(Philip等，Nature(1986)323(6083)：86-89；Wallach.，D.等，J.Immunol.(1988)140(9)：2994-2999)。虽然关于TNF-α如何产生作用的详细内容是未知的，一般认为多种作用与TNF-α能够刺激细胞由细胞膜的花生四烯酸生成前列腺素和白三烯相关。
作为多效作用的结果，TNF-α被暗示在机体的多个不同器官中参与各种病理状态。在血管中，TNF-α造成出血性休克、下调内皮细胞凝血调节蛋白并增强促凝血活性。导致白细胞以及可能血小板附着到血管壁上，从而促进导致动脉硬化症以及脉管炎的作用。
TNF-α激活血液细胞，引起嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、单核细胞/巨噬细胞以及T淋巴细胞和B淋巴细胞的粘附。通过诱导IL-6和IL-8，TNF-α提高炎症性细胞的化学趋向性，并增强它们渗透到组织中。因此，TNF-α在自体免疫性疾病、变应性反应和移植排斥中起组织破坏的作用。
TNF-α调节脂肪细胞的新陈代谢活性，并且引起消瘦和恶病质伴随的癌症、慢性感染、慢性心力衰竭和慢性炎症，也被称作恶液质素。恶病质是严重消瘦，与癌症和其它疾病相关(Kern，等J.Parent.Enter.Nutr.12：286-298(1988))。恶病质包括渐进性体重下降、食欲减退和对恶性肿瘤生长相应而持续体质受损。主要的生理紊乱与相对于能力消化的食物摄取下降相关。恶病质状态引起大部分的发病率和死亡率。TNF-α能够调节癌症、传染性病理和其它代谢分解状态中的恶病质。TNF-α还在神经性食欲缺乏中起作用，通过抑制食欲而提高脂肪组织的消耗。
TNF-α对骨骼肌和心肌产生代谢作用。还对肝脏产生显著作用：抑制白蛋白和细胞色素P450的代谢，提高纤维蛋白原、1-酸糖蛋白和其它急性期蛋白的生成。还会导致肠道坏死。
在中枢神经系统中，TNF-α跨越血脑屏障，引起发烧，延长睡眠和食欲减退。TNF-α浓度升高与多发性硬化相关。还会导致肾上腺出血，影响类固醇激素生成，增加皮肤中的胶原酶和PGE-2，并且通过激活破骨细胞而破坏骨和软骨。
已经证明，TNF-α在体外促进和增加人免疫缺陷病毒(HIV)的复制(Matsuyama，T.等，J.Virol.(1989)63(6)：2504-2509；Michihiko，S.等，Lancet(1989)1(8648)：1206-1207)，并刺激HIV-1基因表达，因而可能引起临床AIDS在后期感染HIV-1的个体中发展(Okamoto，T.等，AIDS Res.Hum.Retroviruses(1989)5(2)：131-138)。
还已经证明，TNF-α还参与对各种寄生虫的生长和分化的控制。感染宿主后，寄生虫能够诱导分泌不同细胞因子，例如TNF，可能影响疾病过程。例如，在为疟疾的情况下，TNF-α在某些情况下可以是具有保护性的，例如在啮齿类疟疾中抑制寄生虫存活(Clark等，1987，J Immunol 139：3493-3496.；Taverne等，1987，Clin Exp Immunol 67：1-4)。
TNF-α抗体
任何来自结合TNF抗体的CDR、VH或VL区可以被用于制备本发明的转移体。TNF的多克隆鼠抗体被公开在Cerami等(EPO专利申请公开0212489，1987年3月4日)中。这种抗体被认为可用于诊断免疫分析，以及用于治疗细菌感染中的休克。Rubin等(EPO专利申请公开0218868，1987年4月22日)公开人TNF的鼠单克隆抗体，分泌这种抗体的杂交瘤，制备这种鼠抗体的方法，以及这种鼠抗体在TNF免疫分析中的用途。
Yone等(EPO专利申请公开0288088，1988年10月26日)公开抗TNF的鼠抗体，包括mAbs，以及它们在病理学的免疫分析中的用途，特别是在Kawasaki病理学和细菌感染中。患有Kawasaki病理的患者的体液(婴儿急性发热粘膜与皮肤淋巴结综合症；Kawasaki，Allergy 16：178(1967)；Kawasaki，Shonica(Pediatrics)26：935(1985))被认为具有高水平的TNF，与病理学进展相关(Yone等，如下文)。
其它研究人员已经描述特异于重组人TNF的啮齿类或鼠的mAbs，在体外具有中和活性(Liang等，Biochem.Biophys.Res.Comm.137：847-854(1986)；Meager等，Hybridoma 6：305-311(1987)；Fendly等，Hybridoma 6：359-369(1987)；Bringman等，Hybridoma 6：489-507(1987)；Hirai等，J.Immunol.Meth.96：57-62(1987)；Moller等Cytokine 2：162-169(1990))。这些mAbs中部分被用于对人TNF的表位进行作图，开发酶免疫分析(Fendly等，见下文；Hirai等，见下文；Moller等，见下文)并用于辅助重组TNF的纯化(Bringman等，见下文)。
已经证明在非人的哺乳动物中，TNF的中和抗血清或mAbs消除不利的生理变化，并在实验性内毒血症和细菌尿中防止致死性攻击后的死亡。这种作用已经例如在啮齿类的致死性分析和在灵长类病理模型系统中被证明(Mathison等，J.Clin.Invest.81：1925-1937(1988)；Beutler等，Science 229：869-871(1985)；Tracey等，Nature 330：662-664(1987)；Shimamoto等，Immunol.Lett.17：311-318(1988)；Silva，等，J.Infect.Dis.162：421-427(1990)；Opal等，J.Infect.Dis.161：1148-1152(1990)；Hinshaw等，Circ.Shock 30：279-292(1990))。
Eck和Sprang公开可hTNF的假定受体结合座位(J.Biol.Chem.264(29)，17595-17605(1989)，他们确定TNF-α的受体结合座位由氨基酸11-13、37-42、49-57和155-157组成。
还报道了给患有严重的移植物抗宿主病理的患者施用鼠TNFmAb(Herve等，Lymphoma Res.9：591(1990))。
美国专利5,656,272公开了对人TNF-α特异的抗-TNF抗体及其片段和区域，可用于体内诊断和治疗大量TNF-α介导的病理和症状例如Crohn病。
美国专利6,420,346公开治疗个体的类风湿关节炎的方法，该方法包括肌肉内施用被可操作地连接到启动子上的编码细胞因子例如TNF-α的免疫原性部分的外源多核苷酸，其中免疫原性部分的表达诱导产生所述免疫原性部分的抗体，其中所述抗体降低所述细胞因子的内源细胞因子的体内活性，来治疗类风湿关节炎。
Maini等描述了一种嵌合的TNF-α单克隆抗体infliximab在治疗患有类风湿关节炎的患者的用途(Lancet，354(9194)：1932-9(1999))。
含有转移体的试剂盒
在另一个实施方案中，本发明提供含有转铁蛋白融合蛋白，特别是转移体的试剂盒，被修饰的转移体包括免疫调节肽，这些肽可以被用于例如治疗性、非治疗性或诊断性的应用。试剂盒包含具有标签的容器。合适的容器包括，例如瓶子、小瓶和试管。该容器可以用各种材料制备，例如玻璃或塑料。容器中装有组合物，组合物包括转铁蛋白融合蛋白，优选为转移体，可有效用于治疗性或非治疗性的应用，如上所述。组合物中的活性剂为抗体。容器上的标签指示该组合物用于特定的治疗或者非治疗性应用，可能还指示体内或体外使用的用法，如上所述的那些。
本发明的试剂盒通常包含上述的容器，以及一种或多种包含商业和使用者期望的物质的容器，包括缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器和具有使用说明的包装插入物。
无需进一步描述，通过利用前面的描述和如下的说明性实施例，相信本领域的普通技术人员能够执行和利用本发明并实施要求保护的方法。例如，当与未被融合状态的治疗性部分的可比较的活性相比时，技术人员能够容易地确定本发明的融合蛋白构建体的体外和体内的生物活性。类似地，本领域技术人员能够容易地确定按照本发明的构建体的血清半衰期和血清稳定性。因此，如下的工作实施例特别地指示本发明的优选实施方案，不被解释为以任何方式限制公开的其它权利。
实施例
如下实施例描述用于制备包含结合目标蛋白质的肽和转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白(mTf)的转移体的方法。在转铁蛋白的N末端或C末端融合治疗性肽(X或Y)例如单链抗体或抗体结合肽(X-Tf-Y)，使用或不使用接头(L)(X-Tf-L-X、X-L-Tf-X、X-L-Tf-L-X)，使得可以开发二价药物。可替代地，转铁蛋白的N末端或C末端的肽可以是不同的(X-Tf-L-Y、X-L-Tf-Y、X-L-Tf-L-Y)。
这方便了构建被靶向的分子，例如在转铁蛋白分子的任何一端融合单链抗体和毒性肽。典型的应用是靶向杀死癌症细胞。此外，在N末端和C末端的SCA提供双功能抗体，而转铁蛋白作为Fc铰链。这提供了一种用于替代(人源化)单克隆抗体技术的成本效益技术。
如较早时所讨论，在转铁蛋白结构中具有大量环，容易被修饰/替换来插入蛋白质或肽，开发随机肽插入物的可筛选文库。
实施例1
可以制备包含转铁蛋白分子和单链抗体的转移体。可以被融合到转铁蛋白的SCA的特别例子是抗TNF(肿瘤坏死因子)。抗TNF可以被用于治疗各种炎症性和自体免疫性疾病例如类风湿关节炎。可以将TNF-SCA融合到被修饰的转铁蛋白的N末端或C末端，通过这种方式，所编码的TNF-SCA的N末端直接连接到转铁蛋白的C末端氨基酸上，或者TNF-SCA的C末端直接连接到转铁蛋白的N末端氨基酸上。可替代地，可以插入肽接头来使转铁蛋白和TNF-SCA之间更加分离，使两个融合蛋白更具有空间灵活性。多个TNF-SCA例子被显示在附图4A-4B中。
通过将一个或多个拷贝的编码SCA的核苷酸序列融合到Tf核苷酸序列上，制备SCA融合到Tf的N末端或C末端的融合蛋白，来制备被修饰的Tf(mTf)和TNF-SCA之间的融合蛋白。含有编码mTf的载体，例如pREX0052被特别地设计来制备具有VH、VL或CDRs的mTf融合蛋白。特别地设计接头和引物来将编码VH、VL或CDRs的序列连接到含有mTf的载体上。
构建抗TNFαSCA的mTfN末端和C末端融合物
该方法的第一个步骤是在pREX0052的mTf的5′段或N末端的XbaI和KpnI位点之间插入接头，随后往载体中克隆VH和VL，生成pREX0066。在DNA接头的两端含有插入VH和VL的位点，DNA接头在本实施例中编码S(SGGG)3S(SEQ ID NO：32)接头肽。
XbaI/SacI-接头-EcoRV/KpnI插入
                         SacI
                        -----+
ctagataaaa gggaagtgaa actggagctc tggtggtggt tctggtggtg gttctggtgg
    tatttt cccttcactt tgacctcgag accaccacca agaccaccac caagaccacc
                              >>...............SG 接头  .........
  .  .  .   .   .  .   .  .  s   s  g  g  g   s  g  g   g  s  g
        EcoRV
       ----+--
tggttctgat atcaacctgg aagtgaaggt ac
accaagacta tagttggacc ttcacttc
.....>>
g  g  s  d   i  n  l   e  v  k   v
上一条链：SEQ ID NO：22
下一条链：SEQ ID NO：23
氨基酸序列：SEQ ID NO：24
然后，采用一系列重叠的合成寡核苷酸，分别生成VH和VL的DNA。VH被设计成具有5′XbaI位点和3′SacI位点，插入用XbaI/SacI剪切的pREX0066。确认正确插入以及目标DNA序列，生成的质粒命名为pREX0067。将VL设计成具有5′EcoRV位点和3′KpnI位点，并插入到用EcoRV/KpnI剪切的pREX0067。确认正确插入以及目标DNA序列，生成的质粒命名为pREX0068。
采用一对诱变PCR引物，然后修饰pREX0067中的完整SCA的5′和3′末端，使得生成的PCR产物可以通过SalI和HindIII位点被插入到mTf的C末端(pREX0052)中。确认正确插入以及目标DNA序列，生成的质粒命名为pREX0069。
正向：AGCCTGCACTTTCCGTCGACCTGAAGTGAAACTGGAAG(5′-3′)
反向：CAGTCATGTCTAAGCTTATTACTTCACTTCCAGGTTGG(5′-3′)
SEQ ID NO：25
SEQ ID NO：26
用NotI消化，从pREX0068和pREX0069回收表达盒，并被插入到用NotI剪切的酵母载体pSAC35中，制备REX0070和pREX0071。它们用于在酵母中转化和表达。
为了制备VH-mTf-VL融合构建体，在3′端对pREX0067中的VH进行修饰来插入KpnI位点。在5′端对pREX0068中的VL进行修饰来插入SalI位点。然后顺序将被修饰的VH和VL插入mTf(pREX0052)的5′和3′端，通过XbaI和KpnI位点在N末端插入VH(pREX0072)，通过SalI和HindIII在C末端插入VL(pREX0074)。然后通过NotI位点，将来自该载体的表达盒亚克隆到酵母载体中，例如pSAC35，生成pREX0077。
可替代地，VL可以在N末端而VH在C末端。可替代地，单一的VH或VL可以在N末端或者单一VH或VL的可以在C末端。对该方案的改变，包括在VH或VL以及N末端或C末端之间使用S(SGGG)3S(SEQ ID NO：24)接头。可以构建N末端和C末端都具有VH/VL的构建体，其中VH/VL可以是相同的或抵抗不同靶点。类似地，N末端和C末端的单一的VH或VL能够抵抗不同靶点。
抗TNFαVH    翻译产物     240个氨基酸
分子量       25964.1
等电点(pI)   5.77
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSI
NSATHYAESVKGRFTISRDDSKSAVYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWG
QGTTLTVSSSGGGSGGGSGGGSDILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSSIHW
YQQRTNGSPRLLIKYASESMSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINTVESEDIADYYCQQSHS
WPFTFGSGTNLEVK(SEQ ID NO：27)
VH DNA序列
1    gaagtgaaac tggaagaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcggcag catgaaactg
     cttcactttg accttctttc gccgccgccg gaccacgtcg gcccgccgtc gtactttgac
     >>......................  抗 TNFalpha VH........................>
       e  v  k   l  e  e   s  g  g  g   l  v  q   p  g  g   s  m  k  l
61   agctgcgtgg cgagcggctt tatttttagc aaccattgga tgaactgggt gcgtcagagc
     tcgacgcacc gctcgccgaa ataaaaatcg ttggtaacct acttgaccca cgcagtctcg
     >.......................  抗 TNFalpha VH........................>
       s  c  v   a  s  g   f  i  f  s   n  h  w   m  n  w   v  r  q  s
                                      >>....CDR1....>>
121  ccggaaaaag gcctggaatg ggtggcggaa attcgtagca aaagcattaa cagcgcgacc
     ggcctttttc cggaccttac ccaccgcctt taagcatcgt tttcgtaatt gtcgcgctgg
     >.......................  抗 TNFalpha VH........................>
       p  e  k   g  l  e   w  v  a  e   i  r  s   k  s  i   n  s  a  t
                                  >>..............CDR2...............>
181  cattatgcgg aaagcgtgaa aggccgtttt accattagcc gtgatgatag caaaagcgcg
     gtaatacgcc tttcgcactt tccggcaaaa tggtaatcgg cactactatc gttttcgcgc
     >.......................  抗 TNFalpha VH........................>
       h  y  a   e  s  v   k  g  r  f   t  i  s    r  d  d  s  k  s  a
     >..........CDR2.........>>
             PstI
           ------+
241  gtgtatctgc agatgaccga tctgcgtacc gaagataccg gcgtgtatta ttgcagccgt
     cacatagacg tctactggct agacgcatgg cttctatggc cgcacataat aacgtcggca
     >.......................  抗 TNFalpha VH........................>
       v  y  l   q  m  t   d  l  r  t   e  d  t   g  v  y   y  c  s  r
301  aactattatg gcagcaccta tgattattgg ggccagggca ccaccctgac cgtgagc
     ttgataatac cgtcgtggat actaataacc ccggtcccgt ggtgggactg gcactcg
     >......................  抗 TNFalpha VH.....................>>
       n  y  y   g  s  t   y  d  y  w   g  q  g    t  t  l  t  v  s
     >>..........CDR3...........>>
VH DNA序列＝SEQ ID NO：28
抗TNFαVH序列＝SEQ ID NO：29
VL DNA序列
1    gatattctgc tgacccagag cccggcgatt ctgagcgtga gcccgggcga acgtgtgagc
     ctataagacg actgggtctc gggccgctaa gactcgcact cgggcccgct tgcacactcg
     >>.......................  抗  TNFalpha.........................>
       d  i  l   l  t  q   s  p  a  i   l  s  v   s  p  g   e  r  v  s
61   tttagctgcc gtgcgagcca gtttgtgggc agcagcattc attggtatca gcagcgtacc
     aaatcgacgg cacgctcggt caaacacccg tcgtcgtaag taaccatagt cgtcgcatgg
     >........................  抗  TNFalpha.........................>
       f  s  c   r  a  s   q  f  v  g   s  s  i    h  w  y  q  q  r  t
              >>..............CDR1...............>>
121  aacggcagcc cgcgtctgct gattaaatat gcgagcgaaa gcatgagcgg cattccgagc
     ttgccgtcgg gcgcagacga ctaatttata cgctcgcttt cgtactcgcc gtaaggctcg
     >........................  抗  TNFalpha.........................>
       n  g  s   p  r  l   l  i  k  y   a  s  e   s  m  s   g  i  p  s
                               >>.........CDR2.........>>
181  cgttttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga gcattaacac cgtggaaagc
     gcaaaatcgc cgtcgccgtc gccgtggcta aaatgggact cgtaattgtg gcacctttcg
     >........................  抗  TNFalpha.........................>
       r  f  s   g  s  g   s  g  t  d   f  t  l   s  i  n   t  v  e  s
241  gaagatattg cggattatta ttgccagcag agccatagct ggccgtttac ctttggcagc
     cttctataac gcctaataat aacggtcgtc tcggtatcga ccggcaaatg gaaaccgtcg
     >........................  抗  TNFalpha.........................>
       e  d  i   a  d  y   y  c  q  q   s  h  s   w  p  f   t  f  g  s
                               >>...........CDR3...........>>
301  ggcaccaacc tggaagtgaa a
     ccgtggttgg accttcactt t
     >.... 抗  TNFalpha...>>
       g  t  n   l  e  v   k
V1DNA序列＝SEQ ID NO：30
抗TNFαV1序列＝SEQ ID NO：31
肽接头
Ser (Ser Gly Gly Gly)3Ser  (SEQ ID NO：32)
tct (tct ggt ggt ggt)3tct  (SEQ ID NO：33)
tcttctg gtggtgcttc tggtggtggt tctggtggtg gttct    (SEQ ID NO：33)
agaagac caccaccaag accaccacca agaccaccac caaga    (SEQ ID NO：34)
  s  s   g  g  g   s  g  g  g   s  g  g   g  s    (SEQ ID NO：32)
实施例2
制备包含转铁蛋白和CDRs的转移体。这些转移体由相对短的肽链组成。抗体在其重链中通常具有3个CDRs，在轻链中有3个CDRs。将一个或多个能够与抗原相互作用的抗体的CDRs融合到被修饰的转铁蛋白中，使转铁蛋白分子具有抗原结合活性。CDRs可以被融合到N末端、C末端、N末端和C末端上，或者被遗传改造到转铁蛋白的内部支架中。来自抗TNF抗体的CDR序列的例子显示在TNF-SCA中附图4A-4B。可以将对应于一个或多个CDRs的cDNA与被修饰的转铁蛋白融合，使转铁蛋白具有TNF结合活性。
CDR(s)的插入
检测人Tf的N末端结构域(PDB标识为1A8E)和全长Tf模型AAAaoTfwo，采用ExPasy Swiss Model Server以兔子模型1JNF作为模板来制备，显示存在大量用于插入肽的潜在位点，直接插入或者通过替换大量残基。这些位点重复在C末端结构域的相当位置上。
  N1   N2
  Asp33   Ser105
  Asn55   Glu141
  Asn75   Asp166
  Asp90   Gln184
  Gly257   Asp197
  Lys280   Lys217
  His289   Thr231
  Ser298   Cys241
这些环中的两个是插入CDR肽特别是CDR，H3的位点，N1His289(286-292)或N2Asp166(162-170)。由于N末端结构域和C末端结构域的结构相似性，C末端结构域上的等价插入位点(C1489-495，C2623-628)可以被用于制备多价化合分子。这采用上面指出的N末端结构域或C末端结构域上的潜在插入位点或者这两个结构域上的位点的组合来实现。
N2  140  PEPRKPLEKA VANFFSGSCA PC
Figure A0382474501121
CQLCP---- -GCGCSTLNQ
C1  472  NH------CR FDEFFSEGCA PG
Figure A0382474501122
CKLCMGSGL NLCEPNNKEG
N2  140  PEP
Figure A0382474501123
KPLEKA VAN
Figure A0382474501124
GS C
Figure A0382474501126
Q P
Figure A0382474501128
C   - --
Figure A0382474501129
STL --Q
C1  472  NHC  ------
Figure A03824745011212
FDE EG G E M S L NL EPN
Figure A03824745011220
KEG
N1  277  D-KSKE--FQ LF L LFKDSAHGFL KVPPRMDAKM YLGYEYVTAI
C2  611  NVTDCSGNFC LF
Figure A03824745011222
L LFRDDTVCLA KLHDRNTYEK YLGEEYVKAV
N1  277  --- K KE Q
Figure A03824745011226
K
Figure A03824745011228
SAHGFL
Figure A03824745011229
VPP MDAKM
Figure A03824745011231
Y
Figure A03824745011232
T
Figure A03824745011233
I
C2  611  NVT
Figure A03824745011234
C
Figure A03824745011235
GN
Figure A03824745011236
C R DTVCLA LHD NTYEK E K
Figure A03824745011243
V
N2：SEQ ID NO：35
C1：SEQ ID NO：36
N1：SEQ ID NO：37
C2：SEQ ID NO：38
检测得自Genbank的抗TNFα的多个SCA的序列，得到如下CDRs(表3)。这些肽中的任何一个可以被用作结合肽(参见例如，Misawa等，2002，FEBSLett.525：77；Steinbergs等，1996，Hum.Antibodies Hybridomas，7(3)：106；Jarrin等，1994，FEBS Lett.354：169)。但是，作为线性肽，结合亲合性通常低于产生它们的抗体。通过将肽插入到另一个蛋白质的支架中，能够恢复部分或全部的这种亲合性。以mTf作为支架，可能结合来自相同或其它来源的其它CDRs，存在在多个位点插入的可能性。
在缺乏任何其它数据时，对CDRs与遗传系序列(germline sequence)的分化程度的检测可以作为所结合的各个CDRs的相对重要性或作用的指示。
表3
关键词
VH    来自合成的ScFv登录号：AF288521的VH
PVH   来自美国专利5,698,195的VH
33    来自登录号：AB027433的VH
35    来自登录号：AB027435的VH
37    来自登录号：AB027437的VH
39    来自登录号：AB027439的VH
深色阴影＝相同
浅色阴影＝相似
作为例子，将上述来自P VH的CDR3插入到mTF的N末端结构域的Thr165和Asp 166之间。采用优化为酵母表达的密码子，将序列反译为DNA。
aat tat tat ggt tct act tat gat tat(SEQ ID NO：80)
N    Y    Y    G    S    T    Y    D    Y(SEQ ID NO：44)
以pREX0056作为模板，诱变引物P0109和引物P0025，诱变引物P0110和引物P0012，生成两种PCR产物。随后用外引物P0025和P0012将它们连接在一起。使得在Thr165和Asp166之间插入CDR H3。然后用BamHI和EcoRI消化来自该连接反应的PCR产物，再插入到也用BamHI和EcoRI消化的pREX0056中。然后通过NotI消化，取出来自生成的质粒pREX0079的表达盒，插入用NotI消化的酵母载体中，例如pSAC35，制备pREX0080，转化到酵母细胞中来进行蛋白质表达。
                                  BamHI
                                 -+----
541  agcctgtggt ggcagagttc tatgggtcaa aagaggatcc acagactttc tattatgctg
     tcggacacca ccgtctcaag atacccagtt ttctcctagg tgtctgaaag ataatacgac
     >..............................mTf..............................>
      k  p  v   v  a  e  f   y  g  s   k  e  d   p  q  t  f   y  y  a
601  ttgctgtggt gaagaaggat agtggcttcc agatgaacca gcttcgaggc aagaagtcct
     aacgacacca cttcttccta tcaccgaagg tctacttggt cgaagctccg ttcttcagga
     >..............................mTf..............................>
      v  a  v   v  k  k  d   s  g  f   q  m  n   q  l  r  g   k  k  s
661  gccacacggg tctaggcagg tccgctgggt ggaacatccc cataggctta ctttactgtg
     cggtgtgccc agatccgtcc aggcgaccca ccttgtaggg gtatccgaat gaaatgacac
     >..............................mTf..............................>
      c  h  t   g  l  g  r   s  a  g   w  n  i   p  i  g  l   l  y  c
721  acttacctga gccacgtaaa cctcttgaga aagcagtggc caatttcttc tcgggcagct
     tgaatggact cggtgcattt ggagaactct ttcgtcaccg gttaaagaag agcccgtcga
     >..............................mTf..............................>
      d  l  p   e  p  r  k   p  l  e   k  a  v   a  n  f  f   s  g  s
                             P0110
 781  gtgccccttg tgcggatggg acgaattatt atggttctac ttatgattat gacttccccc
      cacggggaac acgcctaccc tgcttaataa taccaagatg aatactaata ctgaaggggg
                                                       P0109
      >..............................mTf..............................>
       c  a  p   c  a  d  g   t  n  y   y  g  s   t  y  d  y   d  f  p
                  >>.....................162-170......................>
                    a  d  g   t  n  y   y  g  s   t  y  d  y   d  f  p
                               >>.........CDR H3..........>>
                                 n  y   y  g  s   t  y  d  y
 841  agctgtgtca actgtgtcca gggtgtggct gctccaccct taaccaatac ttcggctact
      tcgacacagt tgacacaggt cccacaccga cgaggtggga attggttatg aagccgatga
      >..............................mTf..............................>
       q  l  c   q  l  c  p   g  c  g   c  s  t   l  n  q  y   f  g  y
      >..>>162-170
       q  l
 901  cgggagcctt caagtgtctg aaggatggtg ctggggatgt ggcctttgtc aagcactcga
      gccctcggaa gttcacagac ttcctaccac gacccctaca ccggaaacag ttcgtgagct
      >..............................mTf..............................>
       s  g  a   f  k  c  l   k  d  g   a  g  d   v  a  f  v   k  h  s
 961  ctatatttga gaacttggca aacaaggctg acagggacca gtatgagctg ctttgcctgg
      gatataaact cttgaaccgt ttgttccgac tgtccctggt catactcgac gaaacggacc
      >..............................mTf..............................>
       t  i  f   e  n  l  a   n  k  a   d  r  d   q  y  e  l   l  c  l
1021  acaacacccg gaagccggta gatgaataca aggactgcca cttgccccag gtcccttctc
      tgttgtgggc cttcggccat ctacttatgt tcctgacggt gaaccgggtc cagggaagag
      >..............................mTf..............................>
       d  n  t   r  k  p  v   d  e  y   k  d  c   h  l  a  q   v  p  s
1081  ataccgtcgt ggcccgaagt atgggcggca aggaggactt gatctgggag cttctcaacc
      tatggcagca ccgggcttca tacccgccgt tcctcctgaa ctagaccctc gaagagttgg
      >..............................mTf..............................>
       h  t  v   v  a  r  s   m  g  g   k  e  d   l  i  w  e   l  l  n
                                           EcoRI
                                          -+-----
1141  aggcccagga acattttggc aaagacaaat caaaagaatt ccaactattc agctctcctc
      tccgggtcct tgtaaaaccg tttctgttta gttttcttaa ggttgataag tcgagaggag
      >..............................mTf..............................>
      q  a  q    e  h  f  g   k  d  k   s  k  e   f  q  l  f   s  s  p
上一条链：SEQ ID NO：75
肽链：SEQ ID NO：76
氨基酸162-170：SEQ ID NO：77
CDR H3：SEQ ID NO：44
P0109(SEQ ID NO：78)
ATAATCATAAGTAGAACCATAATAATTCGTCCCATCCGCACAAGGG
GCACAGCT GC
P0110(SEQ ID NO：79)GAATTATTATGGTTCTACTTATGATTATGAC
TTCCCCCAGCTGTGTCAACTG
为了产生具有CDR H3的全长mTf，将来自pREX0079的KpnI/EcoRI片段连接到用KpnI/EcoRI剪切的pREX0052中。然后通过NotI消化，取出来自生成质粒pREX0263的表达盒，并连接到用NotI剪切的酵母载体pSAC35中，生成pREX0268，转化到酵母中来进行蛋白质表达。
实施例3
还可以进一步修饰实施例1和2中的转移体来包括抗原性肽或免疫调节肽。期望的肽可被插入到转移体的转铁蛋白部分中。通过这种方式，被修饰的转移体不仅能够结合其抗原，而且能够在宿主中诱导免疫反应。
实施例4
本发明的转移体技术给常规的单克隆抗体方法提供一种有吸引力的替代。在该实施例中，生成了包含Tf和来源于抗TNFα单克隆抗体的九个氨基酸的CDR肽(SEQ ID NO：44)的转移体。CDR肽使Tf具有阻断TNFα的细胞毒性活性的能力。
aat tat tat ggt tct act tat gat tat(SEQ ID NO：80)
N    Y    Y    G    S    T    Y    D    Y(SEQ ID NO：44)
材料与方法
细胞：在处理的前一天，在96孔的组织培养平板的DMEM/10％FBS/10mM HEPES培养基中植入密度为3×104细胞/孔的WEHI-164细胞。次日，细胞以约70-80％的汇合度均匀地分布。
样本：
N末端结构域(TNF-CDR3)：
·pREX0080构建体-TNF CDR3被插入在Tf的N末端结构域的D166中
·在BXP10菌株中(YO150)
·样本以1/10稀释在RPMI/10％FBS培养基中，最终浓度为350μg/ml，用0.22μm的滤器过滤灭菌。
N末端结构域Tf：
·pREX0128构建体
·在BXP10菌株中培养(YO051)
·样本以1/10稀释在RPMI/10％FBS培养基中，最终浓度为350μg/ml，用0.22μm的滤器过滤灭菌。
TNFα母液：
·重组的人TNFα(Cell Sciences，产品目录号CRT100，lot121CY25)以25,000单位/ml溶解在dH20中。用0.22μm的滤器过滤灭菌。
制备稀释平板，使得可以用恒量TNFα滴定各个样本。在三个重复孔中放置各种样本，用DMEM/10％FBS/10mM HEPES进行稀释。
小心地从各个孔中取出种培养基(seed calture)，不弄乱附着的细胞层，将100μl检测样本转移到各个孔中。所有情形进行3个重复。在37℃、5％CO2下培养平板24-48小时。
在培养阶段之后，通过加入10μL MTS试剂(CellTiter960AQueous OneSolution Proliferation Assay，Promega，产品号G3582)来检测各个孔中的细胞的代谢活性。在具有代谢活性的细胞中，这种四唑化合物被脱氢酶还原成有色的水溶性formazan产物，可以通过分光光度方法量化该产物。在37℃下培养1-4小时后，在490nm下检测颜色变化量。
转移体制备：与治疗性TNFα的CDR3相当的9个氨基酸序列(SEQ IDNO：44)被工程改造到转铁蛋白的N末端结构域中，在酵母表达系统中制备，然后从5L发酵液中纯化。作为对照，在酵母中制备和纯化转铁蛋白的N末端结构域。
分析方法：简而言之，在用TNFα(50IU/ml)混合物处理和滴定纯化的N末端结构域(TNF-CDR3)(25-1.6μg/ml)后，所用方法测定细胞的代谢活性。功能性的TNF CDR转移体将结合到溶液中的游离TNFα上，并在WEHI-164细胞(粘附的鼠纤维肉瘤细胞系)中防止TNF-介导的细胞毒性。N末端结构域(TNF-CDR3)的细胞保护特异性通过用N末端结构域转铁蛋白(Tf)的平行处理来控制。参见上面的材料与方法。
结果
附图5显示来自两个独立试验的结果，表明25μg/ml剂量的N末端结构域(TNF-CDR3)阻断WEHI-164细胞中的TNF介导的细胞毒性。相同剂量的N末端结构域Tf不起保护作用，表明该活性受抗TNF CDR3调节。
以25μg/ml剂量使用N末端结构域(TNF-CDR3)使WEHI-164细胞具有抵抗TNFα介导的细胞毒性的保护作用。该活性似乎对该分子的TNF CDR部分是特异的，因为在任何试验中，单独的相同浓度的N末端结构域未显示具有任何保护作用。
第二个分析，使用中性红染料摄取作为确定细胞活性的方法，同样表明12.5μg/mL和25μg/mL的N末端结构域(TNF-CDR3)具有抵抗TNFα介导的细胞毒性的保护作用(数据未显示)。此外，单一的N末端结构域不具有保护作用。
虽然，参照上面的实施例详细地描述了本发明，应当理解，在不偏离本发明的精神的前提下，可以进行各种改进。因此，本发明仅由如下的权利要求书来限定。在该说明书中提及的所有被引用的专利、专利申请和公开物在此完全引入作为参考。
序列表
<110>SADEGHI，Homayoun
     PRIOR，Christopher P.
     TURNER，Andrew
<120>被修饰的转铁蛋白抗体的融合蛋白
<130>54710-5004-WO
<150>US 60/406,977
<151>2002-08-30
<150>US 10/384,060
<151>2003-03-10
<160>99
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>2318
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(51)..(2147)
<223>GenBank登录号NM_001063，转铁蛋白基因和蛋白
<220>
<221>sig_peptide
<222>(51)..(107)
<400>1
gcacagaagc gagtccgact gtgctcgctg ctcagcgccg cacccggaag atg agg    56
                                                       Met Arg
                                                       1
ctc gcc gtg gga gcc ctg ctg gtc tgc gcc gtc ctg ggg ctg tgt ctg    104
Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu Cys Leu
        5                   10                  15
gct gtc cct gat aaa act gtg aga tgg tgt gca gtg tcg gag cat gag    152
Ala Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu
    20                  25                  30
gcc act aag tgc cag agt ttc cgc gac cat atg aaa agc gtc att cca    200
Ala Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro
35                  40                  45                  50
tcc gat ggt ccc agt gtt gct tgt gtg aag aaa gcc tcc tac ctt gat    248
Ser Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp
                55                  60                  65
tgc atc agg gcc att gcg gca aac gaa gcg gat gct gtg aca ctg gat    296
Cys Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp
            70                  75                  80
gca ggt ttg gtg tat gat gct tac ctg gct ccc aat aac ctg aag cct    344
Ala Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro
        85                  90                  95
gtg gtg gca gag ttc tat ggg tca aaa gag gat cca cag act ttc tat    392
Val Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr
    100                 105                 110
tat gct gtt gct gtg gtg aag aag gat agt ggc ttc cag atg aac cag    440
Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln
115                 120                 125                 130
ctt cga ggc aag aag tcc tgc cac acg ggt cta ggc agg tcc gct ggg    488
Leu Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly
                135                 140                 145
tgg aac atc ccc ata ggc tta ctt tac tgt gac tta cct gag cca cgt    536
Trp Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg
            150                 155                 160
aaa cct ctt gag aaa gca gtg gcc aat ttc ttc tcg ggc agc tgt gcc    584
Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala
        165                 170                 175
cct tgt gcg gat ggg acg gac ttc ccc cag ctg tgt caa ctg tgt cca    632
Pro Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro
    180                 185                 190
ggg tgt ggc tgc tcc acc ctt aac caa tac ttc ggc tac tcg gga gcc    680
Gly Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala
195                 200                 205                 210
ttc aag tgt ctg aag gat ggt gct ggg gat gtg gcc ttt gtc aag cac    728
Phe Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His
                215                 220                 225
tcg act ata ttt gag aac ttg gca aac aag gct gac agg gac cag tat    776
Ser Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr
            230                 235                 240
gag ctg ctt tgc ctg gac aac acc cgg aag ccg gta gat gaa tac aag    824
Glu Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys
        245                 250                 255
gac tgc cac ttg gcc cag gtc cct tct cat acc gtc gtg gcc cga agt    872
Asp Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser
    260                 265                 270
atg ggc ggc aag gag gac ttg atc tgg gag ctt ctc aac cag gcc cag    920
Met Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln
275                 280                 285                 290
gaa cat ttt ggc aaa gac aaa tca aaa gaa ttc caa cta ttc agc tct    968
Glu His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser
                295                 300                 305
cct cat ggg aag gac ctg ctg ttt aag gac tct gcc cac ggg ttt tta    1016
Pro His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu
            310                 315                 320
aaa gtc ccc ccc agg atg gat gcc aag atg tac ctg ggc tat gag tat    1064
Lys Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr
        325                 330                 335
gtc act gcc atc cgg aat cta cgg gaa ggc aca tgc cca gaa gcc cca    1112
Val Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro
    340                 345                 350
aca gat gaa tgc aag cct gtg aag tgg tgt gcg ctg agc cac cac gag    1160
Thr Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu
355                 360                 365                 370
agg ctc aag tgt gat gag tgg agt gtt aac agt gta ggg aaa ata gag    1208
Arg Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu
                375                 380                 385
tgt gta tca gca gag acc acc gaa gac tgc atc gcc aag atc atg aat    1256
Cys Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn
            390                 395                 400
gga gaa gct gat gcc atg agc ttg gat gga ggg ttt gtc tac ata gcg    1304
Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala
        405                 410                 415
ggc aag tgt ggt ctg gtg cct gtc ttg gca gaa aac tac aat aag agc    1352
Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ser
    420                 425                 430
gat aat tgt gag gat aca cca gag gca ggg tat ttt gct gta gca gtg    1400
Asp Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val
435                 440                 445                 450
gtg aag aaa tca gct tct gac ctc acc tgg gac aat ctg aaa ggc aag    1448
Val Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys
                455                 460                 465
aag tcc tgc cat acg gca gtt ggc aga acc gct ggc tgg aac atc ccc    1496
Lys Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro
            470                 475                 480
atg ggc ctg ctc tac aat aag atc aac cac tgc aga ttt gat gaa ttt    1544
Met Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe
        485                 490                 495
ttc agt gaa ggt tgt gcc cct ggg tct aag aaa gac tcc agt ctc tgt    1592
Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys
    500                 505                 510
aag ctg tgt atg ggc tca ggc cta aac ctg tgt gaa ccc aac aac aaa    1640
Lys Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys
515                 520                 525                 530
gag gga tac tac ggc tac aca ggc gct ttc agg tgt ctg gtt gag aag    1688
Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys
                535                 540                 545
gga gat gtg gcc ttt gtg aaa cac cag act gtc cca cag aac act ggg    1736
Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn Thr Gly
            550                 555                 560
gga aaa aac cct gat cca tgg gct aag aat ctg aat gaa aaa gac tat    1784
Gly Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys Asp Tyr
        565                 570                 575
gag ttg ctg tgc ctt gat ggt acc agg aaa cct gtg gag gag tat gcg    1832
Glu Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala
    580                 585                 590
aac tgc cac ctg gcc aga gcc ccg aat cac gct gtg gtc aca cgg aaa    1880
Asn Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg Lys
595                 600                 605                 610
gat aag gaa gct tgc gtc cac aag ata tta cgt caa cag cag cac cta    1928
Asp Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln His Leu
                615                 620                 625
ttt gga agc aac gta act gac tgc tcg ggc aac ttt tgt ttg ttc cgg    1976
Phe Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg
            630                 635                 640
tcg gaa acc aag gac ctt ctg ttc aga gat gac aca gta tgt ttg gcc    2024
Ser Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala
        645                 650                 655
aaa ctt cat gac aga aac aca tat gaa aaa tac tta gga gaa gaa tat    2072
Lys Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr
    660                 665                 670
gtc aag gct gtt ggt aac ctg aga aaa tgc tcc acc tca tca ctc ctg    2120
Val Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu
675                 680                 685                 690
gaa gcc tgc act ttc cgt aga cct taa aatctcagag g tagggctgc         2167
Glu Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro
                695
caccaaggtg aagatgggaa cgcagatgat ccatgagttt gccctggttt cactggccca  2227
agtggtttgt gctaaccacg tctgtcttca cagctctgtg ttgccatgtg tgctgaacaa  2287
aaaataaaaa ttattattga ttttatattt c                                 2318
<210>2
<211>698
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu
1               5                   10                  15
Cys Leu Ala Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu
            20                  25                  30
His Glu Ala Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val
        35                  40                  45
Ile Pro Ser Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr
    50                  55                  60
Leu Asp Cys Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Asp Ala Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu
                85                  90                  95
Lys Pro Val Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr
            100                 105                 110
Phe Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met
        115                 120                 125
Asn Gln Leu Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser
    130                 135                 140
Ala Gly Trp Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu
145                 150                 155                 160
Pro Arg Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser
                165                 170                 175
Cys Ala Pro Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu
            180                 185                 190
Cys Pro Gly Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser
        195                 200                 205
Gly Ala Phe Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val
    210                 215                 220
Lys His Ser Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp
225                 230                 235                 240
Gln Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu
                245                 250                 255
Tyr Lys Asp Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala
            260                 265                 270
Arg Ser Met Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln
        275                 280                 285
Ala Gln Glu His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe
    290                 295                 300
Ser Ser Pro His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly
305                 310                 315                 320
Phe Leu Lys Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr
                325                 330                 335
Glu Tyr Val Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu
            340                 345                 350
Ala Pro Thr Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His
        355                 360                 365
His Glu Arg Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys
    370                 375                 380
Ile Glu Cys Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile
385                 390                 395                 400
Met Asn Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr
                405                 410                 415
Ile Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn
            420                 425                 430
Lys Ser Asp Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val
        435                 440                 445
Ala Val Val Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys
    450                 455                 460
Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn
465                 470                 475                 480
Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp
                485                 490                 495
Glu Phe Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser
            500                 505                 510
Leu Cys Lys Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn
        515                 520                 525
Asn Lys Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val
    530                 535                 540
Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn
545                 550                 555                 560
Thr Gly Gly Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys
                565                 570                 575
Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu
            580                 585                 590
Tyr Ala Asn Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr
        595                 600                 605
Arg Lys Asp Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln
    610                 615                 620
His Leu Phe Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu
625                 630                 635                 640
Phe Arg Ser Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys
                645                 650                 655
Leu Ala Lys Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu
            660                 665                 670
Glu Tyr Val Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser
        675                 680                 685
Leu Leu Glu Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro
    690                 695
<210>3
<211>679
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>成熟的转铁蛋白
<400>3
Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala
1               5                   10                  15
Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro Ser
            20                  25                  30
Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys
        35                  40                  45
Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala
    50                  55                  60
Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val
65                  70                  75                  80
Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr
                85                  90                  95
Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu
            100                 105                 110
Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp
        115                 120                 125
Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys
    130                 135                 140
Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala Pro
145                 150                 155                 160
Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly
                165                 170                 175
Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe
            180                 185                 190
Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser
        195                 200                 205
Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu
    210                 215                 220
Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp
225                 230                 235                 240
Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met
                245                 250                 255
Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu
            260                 265                 270
His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro
        275                 280                 285
His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys
    290                 295                 300
Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val
305                 310                 315                 320
Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro Thr
                325                 330                 335
Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg
            340                 345                 350
Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu Cys
        355                 360                 365
Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly
    370                 375                 380
Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala Gly
385                 390                 395                 400
Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ser Asp
                405                 410                 415
Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val Val
            420                 425                 430
Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys Lys
        435                 440                 445
Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met
    450                 455                 460
Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe
465                 470                 475                 480
Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys
                485                 490                 495
Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu
            500                 505                 510
Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly
        515                 520                 525
Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn Thr Gly Gly
    530                 535                 540
Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys Asp Tyr Glu
545                 550                 555                 560
Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala Asn
                565                 570                 575
Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg Lys Asp
            580                 585                 590
Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln His Leu Phe
        595                 600                 605
Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser
    610                 615                 620
Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala Lys
625                 630                 635                 640
Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val
                645                 650                 655
Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu Glu
            660                 665                 670
Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro
        675
<210>4
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嗜中性粒细胞剪切变体序列
<400>4
Glu Asp Cys Ile Ala Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala
1               5                   10
<210>5
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能够降低炎症反应的五肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>Xaa可以是Asp或Glu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa可以是Ser，D-Ser，Thr，Ala，Gly或肌氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa可以是Asp，Glu，Asn或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa可以是Pro，Val，Ala，Leu或Ile
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa可以是Arg，Lys或Orn
<400>5
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5
<210>6
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能够阻断免疫复合物结合的肽
<400>6
Pro Asp Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg
1               5                   10
<210>7
<211>8
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>来源于IgG1的肽
<400>7
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
1               5
<210>8
<211>8
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>来源于IgG1的肽
<400>8
Lys Ala Asp Trp Tyr Val Asp Gly
1               5
<210>9
<211>5
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>来源于IgM的肽
<400>9
Glu Trp Met Gln Arg
1               5
<210>10
<211>10
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>来源于IgG的肽
<400>10
Gly Val Gln Val His Asn Ala Lys Thr Lys
1               5                   10
<210>11
<211>11
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>来源于IgG的肽
<400>11
Val Gln Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
1               5                   10
<210>12
<211>16
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>来源于IgG的肽
<400>12
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Gln Val His Asn Ala Lys Thr Lys
1               5                   10                  15
<210>13
<211>5
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>来源于IgG的肽
<400>13
Phe Asn Trp Tyr Val
1               5
<210>14
<211>4
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>来源于IgG的肽
<400>14
Thr Lys Pro Arg
1
<210>15
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能够非特异性地激活淋巴细胞的肽
<400>15
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
1               5                   10                  15
Leu Pro Ser Arg Glu Glu Met
            20
<210>16
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>来源于IgG的肽
<400>16
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
1               5                   10
<210>17
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>来源于IgG的肽
<400>17
Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg
1               5
<210>18
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>来源于IgE的肽
<400>18
Asp Ser Asp Pro Arg
1               5
<210>19
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能够阻断IgE结合到IgE Fc受体的肽
<400>19
Pro Asp Ala Arg His Ser
1               5
<210>20
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>与人IgE部分相同的序列
<400>20
Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu
1               5                   10
<210>21
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>与人IgE部分相同的肽
<400>21
Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe
1               5                   10
<210>22
<211>92
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pREX0004中含有接头的序列
<400>22
ctagataaaa gggaagtgaa actggagctc tggtggtggt tctggtggtg gttctggtgg    60
tggttctgat atcaacctgg aagtgaaggt ac                                  92
<210>23
<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pREX0004中含有接头的序列
<400>23
cttcacttcc aggttgatat cagaaccacc accagaacca ccaccagaac caccaccaga    60
gctccagttt cacttccctt ttat                                           84
<210>24
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头肽
<400>24
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile Asn
1               5                   10                  15
Leu Glu Val Lys Val
            20
<210>25
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>诱变PCR引物
<400>25
agcctgcact ttccgtcgac ctgaagtgaa actggaag                            38
<210>26
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>诱变PCR引物
<400>26
cagtcatgtc taagcttatt acttcacttc caggttgg                            38
<210>27
<211>240
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗-TNFα多肽
<400>27
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His
            20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala
65                  70                  75                  80
Val Tyr Leu Gln Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu
    130                 135                 140
Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln
145                 150                 155                 160
Phe Val Gly Ser Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser
                165                 170                 175
Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro
            180                 185                 190
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile
        195                 200                 205
Asn Thr Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
    210                 215                 220
His Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys
225                 230                 235                 240
<210>28
<211>357
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Vh DNA序列
<400>28
gaagtgaaac tggaagaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcggcag catgaaactg    60
agctgcgtgg cgagcggctt tatttttagc aaccattgga tgaactgggt gcgtcagagc    120
ccggaaaaag gcctggaatg ggtggcggaa attcgtagca aaagcattaa cagcgcgacc    180
cattatgcgg aaagcgtgaa aggccgtttt accattagcc gtgatgatag caaaagcgcg    240
gtgtatctgc agatgaccga tctgcgtacc gaagataccg gcgtgtatta ttgcagccgt    300
aactattatg gcagcaccta tgattattgg ggccagggca ccaccctgac cgtgagc       357
<210>29
<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗TNF-αVH
<400>29
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His
            20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala
65                  70                  75                  80
Val Tyr Leu Gln Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
       115
<210>30
<211>321
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Vh DNA序列
<400>30
gatattctgc tgacccagag cccggcgatt ctgagcgtga gcccgggcga acgtgtgagc  60
tttagctgcc gtgcgagcca gtttgtgggc agcagcattc attggtatca gcagcgtacc  120
aacggcagcc cgcgtctgct gattaaatat gcgagcgaaa gcatgagcgg cattccgagc  180
cgttttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga gcattaacac cgtggaaagc  240
gaagatattg cggattatta ttgccagcag agccatagct ggccgtttac ctttggcagc  300
ggcaccaacc tggaagtgaa a                                            321
<210>31
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗TNFα序列
<400>31
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Ser Ser
            20                  25                  30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Thr Val Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys
            100                 105
<210>32
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>32
Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1               5                   10
<210>33
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>33
tcttctggtg gtggttctgg tggtggttct ggtggtggtt ct                        42
<210>34
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头(反义)
<400>34
agaaccacca ccagaaccac caccagaacc accaccagaa ga                        42
<210>35
<211>45
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人Tf的N2结构域
<400>35
Pro Glu Pro Arg Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser
1               5                   10                  15
Gly Ser Cys Ala Pro Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys
            20                  25                  30
Gln Leu Cys Pro Gly Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln
        35                  40                  45
<210>36
<211>42
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人Tf的C1结构域
<400>36
Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly
1               5                   10                  15
Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu
            20                  25                  30
Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu Gly
        35                  40
<210>37
<211>47
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人Tf的N1结构域
<400>37
Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro His Gly Lys Asp
1               5                   10                  15
Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys Val Pro Pro Arg
            20                  25                  30
Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val Thr Ala Ile
        35                  40                  45
<210>38
<211>49
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人Tf的C2结构域
<400>38
Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser Glu Thr
1               5                   10                  15
Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala Lys Leu His
            20                  25                  30
Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val Lys Ala
        35                  40                  45
Val
<210>39
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR1序列
<400>39
Ser Tyr Trp Ile Gly
1               5
<210>40
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR2序列
<400>40
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>41
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR3序列
<400>41
His Gly Trp Gly Met Asp Val
1               5
<210>42
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>P VH CDR1序列
<400>42
Asn His Trp Met Asn
1               5
<210>43
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>P VH CDR2序列
<400>43
Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser
1               5                   10                  15
Val Lys Gly
<210>44
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>P VH CDR3序列
<400>44
Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr
1               5
<210>45
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>33 CDR1序列
<400>45
Ser Tyr Gly Met His
1               5
<210>46
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>33 CDR2序列
<400>46
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>47
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>33 CDR3序列
<400>47
Asp Ser Gly Asp Leu Ala Phe Asp Ile
1               5
<210>48
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>35 CDR1序列
<400>48
Ser Phe Pro Ile Asn
1               5
<210>49
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>35 CDR2序列
<400>49
Arg Ile Ile Pro Ile Ile Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Gln Glu Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>50
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>35 CDR3序列
<400>50
Pro Glu Ala Val Thr Val Pro Ala Pro Leu Asp Tyr
1               5                   10
<210>51
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>37 CDR1序列
<400>51
Ser Tyr Ala Ile Ser
1               5
<210>52
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>37 CDR2序列
<400>52
Gly Thr Ser Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly
1               5                   10
<210>53
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>37 CDR3序列
<400>53
Glu Val Gln Phe Tyr His Asp Ser Ser Gly Tyr Leu Asp Ala Leu Asp
1               5                   10                  15
Ile
<210>54
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>39 CDR1序列
<400>54
Thr Tyr Val Met Asn
1               5
<210>55
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>39 CDR2序列
<400>55
Gly Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>56
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>39 CDR3序列
<400>56
Asp Leu Ser Asn Arg Leu Ser Gly Gly Gly Thr Phe Asp Ile
1               5                   10
<210>57
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR1序列
<400>57
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
1               5                   10
<210>58
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR2序列
<400>58
Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro
1               5
<210>59
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL CDR3序列
<400>59
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val
1               5                   10
<210>60
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>P VL CDR1序列
<400>60
Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Ser Ser Ile His
1               5                   10
<210>61
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>P VL CDR3序列
<400>61
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met
1               5
<210>62
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>P VL CDR3序列
<400>62
Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe Thr
1               5
<210>63
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>33 CDR1序列
<400>63
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>64
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>33 CDR2序列
<400>64
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala
1               5
<210>65
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>33 CDR3序列
<400>65
Leu Gln Arg Asp Asn Trp Pro Trp Thr
1               5
<210>66
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>35 CDR1序列
<400>66
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1               5                   10
<210>67
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>35 CDR2序列
<400>67
Tyr Lys Ala Ser Gly Leu Glu
1               5
<210>68
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>35 CDR3序列
<400>68
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Trp Thr
1               5
<210>69
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>37 CDR1序列
<400>69
Arg Ala Ser Gln Ser Leu Asn Asn Trp Leu Ala
1               5                   10
<210>70
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>37 CDR2序列
<400>70
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu
1               5
<210>71
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>37 CDR3序列
<400>71
Gln Gln Tyr Asn Ser Pro Trp Thr
1               5
<210>72
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>39 CDR1序列
<400>72
Arg Ala Ser Gln Ser Val  Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                    10
<210>73
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>39 CDR2序列
<400>73
Asn Asp Ala Ser Asn Arg Ala
1               5
<210>74
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>39 CDR3序列
<400>74
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr
1               5
<210>75
<211>660
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pREX0080中的mTf序列
<400>75
agcctgtggt ggcagagttc tatgggtcaa aagaggatcc acagactttc tattatgctg    60
ttgctgtggt gaagaaggat agtggcttcc agatgaacca gcttcgaggc aagaagtcct    120
gccacacggg tctaggcagg tccgctgggt ggaacatccc cataggctta ctttactgtg    180
acttacctga gccacgtaaa cctcttgaga aagcagtggc caatttcttc tcgggcagct    240
gtgccccttg tgcggatggg acgaattatt atggttctac ttatgattat gacttccccc    300
agctgtgtca actgtgtcca gggtgtggct gctccaccct taaccaatac ttcggctact    360
cgggagcctt caagtgtctg aaggatggtg ctggggatgt ggcctttgtc aagcactcga    420
ctatatttga gaacttggca aacaaggctg acagggacca gtatgagctg ctttgcctgg    480
acaacacccg gaagccggta gatgaataca aggactgcca cttggcccag gtcccttctc    540
ataccgtcgt ggcccgaagt atgggcggca aggaggactt gatctgggag cttctcaacc    600
aggcccagga acattttggc aaagacaaat caaaagaatt ccaactattc agctctcctc    660
<210>76
<211>220
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>pREX0080中的mTf序列
<400>76
Lys Pro Val Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr
1               5                   10                  15
Phe Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met
            20                  25                  30
Asn Gln Leu Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser
        35                  40                  45
Ala Gly Trp Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu
    50                  55                  60
Pro Arg Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser
65                  70                  75                  80
Cys Ala Pro Cys Ala Asp Gly Thr Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp
                85                  90                  95
Tyr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly Cys Gly Cys Ser
            100                 105                 110
Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Lys
        115                 120                 125
Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser Thr Ile Phe Glu
    130                 135                 140
Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu Leu Leu Cys Leu
145                 150                 155                 160
Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp Cys His Leu Ala
                165                 170                 175
Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met Gly Gly Lys Glu
            180                 185                 190
Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu His Phe Gly Lys
        195                 200                 205
Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro
    210                 215                 220
<210>77
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mTf的氨基酸162-170
<400>77
Ala Asp Gly Thr Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Asp Phe Pro
1               5                   10                  15
Gln Leu
<210>78
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物P0109
<400>78
ataatcataa gtagaaccat aataattcgt cccatccgca caaggggcac agctgc         56
<210>79
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物P0110
<400>79
gaattattat ggttctactt atgattatga cttcccccag ctgtgtcaac tg             52
<210>80
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P VH中的CDR3
<400>80
aattattatg gttctactta tgattat                                         27
<210>81
<211>676
<212>PRT
<213>Oryctolagus cuniculus
<400>81
Val Thr Glu Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Asn Asp His Glu Ala
1               5                   10                  15
Ser Lys Cys Ala Asn Phe Arg Asp Ser Met Lys Lys Val Leu Pro Glu
            20                  25                  30
Asp Gly Pro Arg Ile Ile Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys
        35                  40                  45
Ile Lys Ala Ile Ala Ala His Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala
    50                  55                  60
Gly Leu Val His Glu Ala Gly Leu Thr Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val
65                  70                  75                  80
Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asn Pro Lys Thr Phe Tyr Tyr
                85                  90                  95
Ala Val Ala Leu Val Lys Lys Gly Ser Asn Phe Gln Leu Asn Glu Leu
            100                 105                 110
Gln Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp
        115                 120                 125
Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys
    130                 135                 140
Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Ser Phe Phe Ser Gly Ser Cys Val Pro
145                 150                 155                 160
Cys Ala Asp Gly Ala Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly
                165                 170                 175
Cys Gly Cys Ser Ser Val Gln Pro Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe
            180                 185                 190
Lys Cys Leu Lys Asp Gly Leu Gly Asp Val Ala Phe Val Lys Gln Glu
        195                 200                 205
Thr Ile Phe Glu Asn Leu Pro Ser Lys Asp Glu Arg Asp Gln Tyr Glu
    210                 215                 220
Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Glu Gln
225                 230                 235                 240
Cys His Leu Ala Arg Val Pro Ser His Ala Val Val Ala Arg Ser Val
                245                 250                 255
Asp Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu
            260                 265                 270
His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Gly Asp Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro
        275                 280                 285
His Gly Lys Asn Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala Tyr Gly Phe Phe Lys
    290                 295                 300
Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Asn Leu Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val
305                 310                 315                 320
Thr Ala Val Arg Asn Leu Arg Glu Gly Ile Cys Pro Asp Pro Leu Gln
                325                 330                 335
Asp Glu Cys Lys Ala Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg
            340                 345                 350
Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Thr Ser Gly Gly Leu Ile Glu Cys
        355                 360                 365
Glu Ser Ala Glu Thr Pro Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly
    370                 375                 380
Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Tyr Val Tyr Ile Ala Gly
385                 390                 395                 400
Gln Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Glu Ser Thr Asp
                405                 410                 415
Cys Lys Lys Ala Pro Glu Glu Gly Tyr Leu Ser Val Ala Val Val Lys
            420                 425                 430
Lys Ser Asn Pro Asp Ile Asn Trp Asn Asn Leu Glu Gly Lys Lys Ser
        435                 440                 445
Cys His Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly
    450                 455                 460
Leu Leu Tyr Asn Arg Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe Arg
465                 470                 475                 480
Gln Gly Cys Ala Pro Gly Ser Gln Lys Asn Ser Ser Leu Cys Glu Leu
                485                 490                 495
Cys Ile Gly Pro Ser Val Cys Ala Pro Asn Asn Arg Glu Gly Tyr Tyr
            500                 505                 510
Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala
        515                 520                 525
Phe Val Lys Ser Gln Thr Val Leu Gln Asn Thr Gly Gly Arg Asn Ser
    530                 535                 540
Glu Pro Trp Ala Lys Asp Leu Lys Glu Glu Asp Phe Glu Leu Leu Cys
545                 550                 555                 560
Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Ser Glu Ala His Asn Cys His Leu
                565                 570                 575
Ala Lys Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Lys Asp Lys Ala Ala
            580                 585                 590
Cys Val Lys Gln Lys Leu Leu Asp Leu Gln Val Glu Tyr Gly Asn Thr
        595                 600                 605
Val Ala Asp Cys Ser Ser Lys Phe Cys Met Phe His Ser Lys Thr Lys
    610                 615                 620
Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Lys Cys Leu Val Asp Leu Arg Gly
625                 630                 635                 640
Lys Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Asp Tyr Ile Lys Ala Val
                645                 650                 655
Ser Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Arg Leu Leu Glu Ala Cys Thr
            660                 665                 670
Phe His Lys His
        675
<210>82
<211>676
<212>PRT
<213>Rattus norvegicus
<400>82
Val Pro Asp Lys Thr Val Lys Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Asn
1               5                   10                  15
Thr Lys Cys Ile Ser Phe Arg Asp His Met Lys Thr Val Leu Pro Ala
            20                  25                  30
Asp Gly Pro Arg Leu Pro Cys Val Lys Lys Thr Ser Tyr Gln Asp Cys
        35                  40                  45
Ile Lys Ala Ile Ser Gly Gly Glu Ala Asp Ala Ile Thr Leu Asp Gly
    50                  55                  60
Gly Trp Val Tyr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Leu Glu His Arg Gln Thr His Tyr Leu
                85                  90                  95
Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Thr Asp Phe Gln Leu Asn Gln Leu
            100                 105                 110
Gln Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp
        115                 120                 125
Ile Ile Pro Ile Gly Leu Leu Phe Cys Asn Leu Pro Glu Pro Arg Lys
    130                 135                 140
Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Ser Phe Phe Ser Gly Ser Cys Val Pro
145                 150                 155                 160
Cys Ala Asp Pro Val Ala Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly
                165                 170                 175
Cys Gly Cys Ser Pro Thr Gln Pro Phe Phe Gly Tyr Val Gly Ala Phe
            180                 185                 190
Lys Cys Leu Arg Asp Gly Gly Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Thr
        195                 200                 205
Thr Ile Phe Glu Val Leu Pro Gln Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu
    210                 215                 220
Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Gln Tyr Glu Asp
225                 230                 235                 240
Cys Tyr Leu Ala Arg Ile Pro Ser His Ala Val Val Ala Arg Asn Gly
                245                 250                 255
Asp Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Ile Leu Lys Val Ala Gln Glu
            260                 265                 270
His Phe Gly Lys Gly Lys Ser Lys Asp Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro
        275                 280                 285
Leu Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Arg Phe Gly Leu Leu Arg
    290                 295                 300
Ala Pro Lys Asp Gly Leu Gln Ala Val Pro Arg Pro Gln Leu Cys His
305                 310                 315                 320
Cys His Ser Lys Ser Ala Gly Ser Cys Pro Asp Ala Ile Asp Ser Ala
                325                 330                 335
Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His Gln Glu Arg Ala Lys Cys Asp
            340                 345                 350
Glu Trp Ser Val Thr Gly Asn Gly Gln Ile Glu Cys Glu Ser Ala Glu
        355                 360                 365
Ser Thr Glu Asp Cys Ile Asp Lys Ile Val Asn Gly Glu Ala Asp Ala
    370                 375                 380
Met Ser Leu Asp Gly Gly His Ala Tyr Ile Ala Gly Gln Cys Gly Leu
385                 390                 395                 400
Val Pro Val Met Ala Glu Asn Tyr Asp Ile Ser Ser Cys Thr Asn Pro
                405                 410                 415
Gln Ser Asp Val Phe Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys
            420                 425                 430
Ala Ser Asp Ser Ser Ile Asn Trp Asn Asn Leu Lys Gly Lys Lys Ser
        435                 440                 445
Cys His Thr Gly Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly
    450                 455                 460
Leu Leu Phe Ser Arg Ile Asn His Cys Lys Phe Asp Glu Phe Phe Ser
465                 470                 475                 480
Gln Gly Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Lys Asn Ser Thr Leu Cys Asp Leu
                485                 490                 495
Cys Ile Gly Pro Ala Lys Cys Ala Pro Asn Asn Arg Glu Gly Tyr Asn
            500                 505                 510
Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Gln Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala
        515                 520                 525
Phe Val Lys His Gln Thr Val Leu Glu Asn Thr Asn Gly Lys Asn Thr
    530                 535                 540
Ala Ala Trp Ala Lys Asp Leu Lys Gln Glu Asp Phe Gln Leu Leu Cys
545                 550                 555                 560
Pro Asp Gly Thr Lys Lys Pro Val Thr Glu Phe Ala Thr Cys His Leu
                565                 570                 575
Ala Gln Ala Pro Asn His Val Val Val Ser Arg Lys Glu Lys Ala Ala
            580                 585                 590
Arg Val Ser Thr Val Leu Thr Ala Gln Lys Asp Leu Phe Trp Lys Gly
        595                 600                 605
Asp Lys Asp Cys Thr Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser Ser Thr Lys
    610                 615                 620
Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Lys Cys Leu Thr Lys Leu Pro Glu
625                 630                 635                 640
Gly Thr Thr Tyr Glu Glu Tyr Leu Gly Ala Glu Tyr Leu Gln Ala Val
                645                 650                 655
Gly Asn Ile Arg Lys Cys Ser Thr Ser Arg Leu Leu Glu Ala Cys Thr
            660                 665                 670
Phe His Lys Ser
        675
<210>83
<211>677
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>83
Val Pro Asp Lys Thr Val Lys Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Asn
1               5                   10                  15
Thr Lys Cys Ile Ser Phe Arg Asp His Met Lys Thr Val Leu Pro Pro
            20                  25                  30
Asp Gly Pro Arg Leu Ala Cys Val Lys Lys Thr Ser Tyr Pro Asp Cys
        35                  40                  45
Ile Lys Ala Ile Ser Ala Ser Glu Ala Asp Ala Met Thr Leu Asp Gly
    50                  55                  60
Gly Trp Val Tyr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Val Glu His Pro Gln Thr Tyr Tyr Tyr
                85                  90                  95
Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Thr Asp Phe Gln Leu Asn Gln Leu
            100                 105                 110
Glu Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp
        115                 120                 125
Val Ile Pro Ile Gly Leu Leu Phe Cys Lys Leu Ser Glu Pro Arg Ser
    130                 135                 140
Pro Leu Glu Lys Ala Val Ser Ser Phe Phe Ser Gly Ser Cys Val Pro
145                 150                 155                 160
Cys Ala Asp Pro Val Ala Phe Pro Lys Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly
                165                 170                 175
Cys Gly Cys Ser Ser Thr Gln Pro Phe Phe Gly Tyr Val Gly Ala Phe
            180                 185                 190
Lys Cys Leu Lys Asp Gly Gly Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Thr
        195                 200                 205
Thr Ile Phe Glu Val Leu Pro Glu Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu
    210                 215                 220
Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Gln Tyr Glu Asp
225                 230                 235                 240
Cys Tyr Leu Ala Arg Ile Pro Ser His Ala Val Val Ala Arg Lys Asn
                245                 250                 255
Asn Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Ile Leu Lys Val Ala Gln Glu
            260                 265                 270
His Phe Gly Lys Gly Lys Ser Lys Asp Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro
        275                 280                 285
Leu Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala Phe Gly Leu Leu Arg
    290                 295                 300
Val Pro Pro Arg Met Asp Tyr Arg Leu Tyr Leu Gly His Asn Tyr Val
305                 310                 315                 320
Thr Ala Ile Arg Asn Gln Gln Glu Gly Val Cys Pro Glu Gly Ser Ile
                325                 330                 335
Asp Asn Ser Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His Leu Glu Arg Thr
            340                 345                 350
Lys Cys Asp Glu Trp Ser Ile Ile Ser Glu Gly Lys Ile Glu Cys Glu
        355                 360                 365
Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Glu Lys Ile Val Asn Gly Glu
    370                 375                 380
Ala Asp Ala Met Thr Leu Asp Gly Gly His Ala Tyr Ile Ala Gly Gln
385                 390                 395                 400
Cys Gly Leu Val Pro Val Met Ala Glu Tyr Tyr Glu Ser Ser Asn Cys
                405                 410                 415
Ala Ile Pro Ser Gln Gln Gly Ile Phe Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Val
            420                 425                 430
Ala Val Val Lys Ala Ser Asp Thr Ser Ile Thr Trp Asn Asn Leu Lys
        435                 440                 445
Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn
    450                 455                 460
Ile Pro Met Gly Met Leu Tyr Asn Arg Ile Asn His Cys Lys Phe Asp
465                 470                 475                 480
Glu Phe Phe Ser Gln Gly Cys Ala Pro Gly Tyr Glu Lys Asn Ser Thr
                485                 490                 495
Leu Cys Asp Leu Cys Ile Gly Pro Leu Lys Cys Ala Pro Asn Asn Lys
            500                 505                 510
Glu Glu Tyr Asn Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys
        515                 520                 525
Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Leu Asp Asn Thr Glu
    530                 535                 540
Gly Lys Asn Pro Ala Glu Trp Ala Lys Asn Leu Lys Gln Glu Asp Phe
545                 550                 555                 560
Glu Leu Leu Cys Pro Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Lys Asp Phe Ala
                565                 570                 575
Ser Cys His Leu Ala Gln Ala Pro Asn His Val Val Val Ser Arg Lys
            580                 585                 590
Glu Lys Ala Ala Arg Val Lys Ala Val Leu Thr Ser Gln Glu Thr Leu
        595                 600                 605
Phe Gly Gly Ser Asp Cys Thr Gly Asn Phe Cys Leu Phe Lys Ser Thr
    610                 615                 620
Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Lys Cys Phe Val Lys Leu
625                 630                 635                 640
Pro Glu Gly Thr Thr Pro Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Glu Tyr Met Gln
                645                 650                 655
Ser Val Gly Asn Met Arg Lys Cys Ser Thr Ser Arg Leu Leu Glu Ala
            660                 665                 670
Cys Thr Phe His Lys
        675
<210>84
<211>688
<212>PRT
<213>Equus caballus
<400>84
Ala Glu Gln Thr Val Arg Trp Cys Thr Val Ser Asn His Glu Val Ser
1               5                   10                  15
Lys Cys Ala Ser Phe Arg Asp Ser Met Lys Ser Ile Val Pro Ala Pro
            20                  25                  30
Pro Leu Val Ala Cys Val Lys Arg Thr Ser Tyr Leu Glu Cys Ile Lys
        35                  40                  45
Ala Ile Ala Asp Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala Gly Leu
    50                  55                  60
Val Phe Glu Ala Gly Leu Ser Pro Tyr Asn Leu Lys Pro Val Val Ala
65                  70                  75                  80
Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Thr Glu Pro Gln Thr His Tyr Tyr Ala Val
                85                  90                  95
Ala Val Val Lys Lys Asn Ser Asn Phe Gln Leu Asn Gln Leu Gln Gly
            100                 105                 110
Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp Asn Ile
        115                 120                 125
Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Trp Gln Leu Pro Glu Pro Arg Glu Ser Leu
    130                 135                 140
Gln Lys Ala Val Ser Asn Phe Phe Ala Gly Ser Cys Val Pro Cys Ala
145                 150                 155                 160
Asp Arg Thr Ala Val Pro Asn Leu Cys Gln Leu Cys Val Gly Lys Gly
                165                 170                 175
Thr Asp Lys Cys Ala Cys Ser Asn His Glu Pro Tyr Phe Gly Tyr Ser
            180                 185                 190
Gly Ala Phe Lys Cys Leu Ala Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val
        195                 200                 205
Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Leu Pro Gln Glu Ala Asp Arg Asp
    210                 215                 220
Glu Tyr Gln Leu Leu Cys Arg Asp Asn Thr Arg Lys Ser Val Asp Glu
225                 230                 235                 240
Tyr Lys Asp Cys Tyr Leu Ala Ser Ile Pro Ser His Ala Val Val Ala
                245                 250                 255
Arg Ser Val Asp Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Gly Leu Leu Asn Gln
            260                 265                 270
Ala Gln Glu His Phe Gly Thr Glu Lys Ser Lys Asp Phe His Leu Phe
        275                 280                 285
Ser Ser Pro His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala Leu Gly
    290                 295                 300
Phe Leu Arg Ile Pro Pro Ala Met Asp Thr Trp Leu Tyr Leu Gly Tyr
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Val Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Asp Ile Arg Pro Glu
                325                 330                 335
Val Pro Lys Asp Glu Cys Lys Lys Val Lys Trp Cys Ala Ile Gly His
            340                 345                 350
His Glu Lys Val Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Gly Gly Asn
        355                 360                 365
Ile Glu Cys Glu Ser Ala Gln Ser Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile
    370                 375                 380
Val Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Ile Tyr
385                 390                 395                 400
Ile Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Glu
                405                 410                 415
Thr Arg Ser Gly Ser Ala Cys Val Asp Thr Pro Glu Glu Gly Tyr His
            420                 425                 430
Ala Val Ala Val Val Lys Ser Ser Ser Asp Pro Asp Leu Thr Trp Asn
        435                 440                 445
Ser Leu Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Val Asp Arg Thr Ala
    450                 455                 460
Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Ser Glu Ile Lys His Cys
465                 470                 475                 480
Glu Phe Asp Lys Phe Phe Arg Glu Gly Cys Ala Pro Gly Tyr Arg Arg
                485                 490                 495
Asn Ser Thr Leu Cys Asn Leu Cys Ile Gly Ser Ala Ser Gly Pro Gly
            500                 505                 510
Arg Glu Cys Glu Pro Asn Asn His Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly
        515                 520                 525
Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His
    530                 535                 540
Gln Thr Val Glu Gln Asn Thr Asp Gly Arg Asn Pro Asp Asp Trp Ala
545                 550                 555                 560
Lys Asp Leu Lys Ser Glu Asn Phe Lys Leu Leu Cys Pro Asp Gly Thr
                565                 570                 575
Arg Lys Ser Val Thr Glu Phe Lys Ser Cys Tyr Leu Ala Arg Ala Pro
            580                 585                 590
Asn His Ala Val Val Ser Arg Lys Glu Lys Ala Ala Cys Val Cys Gln
        595                 600                 605
Glu Leu His Asn Gln Gln Ala Ser Tyr Gly Lys Asn Gly Ser His Cys
    610                 615                 620
Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Gln Ser Ala Thr Lys Asp Leu Leu Phe
625                 630                 635                 640
Arg Asp Asp Thr Gln Cys Leu Ala Asn Leu Gln Pro Thr Thr Thr Tyr
                645                 650                 655
Lys Thr Tyr Leu Gly Glu Lys Tyr Leu Thr Ala Val Ala Asn Leu Arg
            660                 665                 670
Gln Cys Ser Thr Ser Arg Leu Leu Glu Ala Cys Thr Phe His Arg Val
        675                 680                 685
<210>85
<211>685
<212>PRT
<213>Bos taurus
<400>85
Asp Pro Glu Arg Thr Val Arg Trp Cys Thr Ile Ser Thr His Glu Ala
1               5                   10                  15
Asn Lys Cys Ala Ser Phe Arg Glu Asn Val Leu Arg Ile Leu Glu Ser
            20                  25                  30
Gly Pro Phe Val Ser Cys Val Lys Lys Thr Ser His Met Asp Cys Ile
        35                  40                  45
Lys Ala Ile Ser Asn Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Gly Gly
    50                  55                  60
Leu Val Tyr Glu Ala Gly Leu Lys Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val Val
65                  70                  75                  80
Ala Glu Phe His Gly Thr Lys Asp Asn Pro Gln Thr His Tyr Tyr Ala
                85                  90                  95
Val Ala Val Val Lys Lys Asp Thr Asp Phe Lys Leu Asn Glu Leu Arg
            100                 105                 110
Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp Asn
        115                 120                 125
Ile Pro Met Ala Lys Leu Tyr Lys Glu Leu Pro Asp Pro Gln Glu Ser
    130                 135                 140
Ile Gln Arg Ala Ala Ala Asn Phe Phe Ser Ala Ser Cys Val Pro Cys
145                 150                 155                 160
Ala Asp Gln Ser Ser Phe Pro Lys Leu Cys Gln Leu Cys Ala Gly Lys
                165                 170                 175
Gly Thr Asp Lys Cys Ala Cys Ser Asn His Glu Pro Tyr Phe Gly Tyr
            180                 185                 190
Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Met Glu Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe
        195                 200                 205
Val Lys His Ser Thr Val Phe Asp Asn Leu Pro Asn Pro Glu Asp Arg
    210                 215                 220
Lys Asn Tyr Glu Leu Leu Cys Gly Asp Asn Thr Arg Lys Ser Val Asp
225                 230                 235                 240
Asp Tyr Gln Glu Cys Tyr Leu Ala Met Val Pro Ser His Ala Val Val
                245                 250                 255
Ala Arg Thr Val Gly Gly Lys Glu Asp Val Ile Trp Glu Leu Leu Asn
            260                 265                 270
His Ala Gln Glu His Phe Gly Lys Asp Lys Pro Asp Asn Phe Gln Leu
        275                 280                 285
Phe Gln Ser Pro His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala Asp
    290                 295                 300
Gly Phe Leu Lys Ile Pro Ser Lys Met Asp Phe Glu Leu Tyr Leu Gly
305                 310                 315                 320
Tyr Glu Tyr Val Thr Ala Leu Gln Asn Leu Arg Glu Ser Lys Pro Pro
                325                 330                 335
Asp Ser Ser Lys Asp Glu Cys Met Val Lys Trp Cys Ala Ile Gly His
            340                 345                 350
Gln Glu Arg Thr Lys Cys Asp Arg Trp Ser Gly Phe Ser Gly Gly Ala
        355                 360                 365
Ile Glu Cys Glu Thr Ala Glu Asn Thr Glu Glu Cys Ile Ala Lys Ile
    370                 375                 380
Met Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Tyr Leu Tyr
385                 390                 395                 400
Ile Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Lys
                405                 410                 415
Thr Glu Gly Glu Ser Cys Lys Asn Thr Pro Glu Lys Gly Tyr Leu Ala
            420                 425                 430
Val Ala Val Val Lys Thr Ser Asp Ala Asn Ile Asn Trp Asn Asn Leu
        435                 440                 445
Lys Asp Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp
    450                 455                 460
Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Ser Lys Ile Asn Asn Cys Lys Phe
465                 470                 475                 480
Asp Glu Phe Phe Ser Ala Gly Cys Ala Pro Gly Ser Pro Arg Asn Ser
                485                 490                 495
Ser Leu Cys Ala Leu Cys Ile Gly Ser Glu Lys Gly Thr Gly Lys Glu
            500                 505                 510
Cys Val Pro Asn Ser Asn Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe
        515                 520                 525
Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Val Lys Asp Gln Thr
    530                 535                 540
Val Ile Gln Asn Thr Asp Gly Asn Asn Asn Glu Ala Trp Ala Lys Asn
545                 550                 555                 560
Leu Lys Lys Glu Asn Phe Glu Val Leu Cys Lys Asp Gly Thr Arg Lys
                565                 570                 575
Pro Val Thr Asp Ala Glu Asn Cys His Leu Ala Arg Gly Pro Asn His
            580                 585                 590
Ala Val Val Ser Arg Lys Asp Lys Ala Thr Cys Val Glu Lys Ile Leu
        595                 600                 605
Asn Lys Gln Gln Asp Asp Phe Gly Lys Ser Val Thr Asp Cys Thr Ser
    610                 615                 620
Asn Phe Cys Leu Phe Gln Ser Asn Ser Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp
625                 630                 635                 640
Asp Thr Lys Cys Leu Ala Ser Ile Ala Lys Lys Thr Tyr Asp Ser Tyr
                645                 650                 655
Leu Gly Asp Asp Tyr Val Arg Ala Met Thr Asn Leu Arg Gln Cys Ser
            660                 665                 670
Thr Ser Lys Leu Leu Glu Ala Cys Thr Phe His Lys Pro
        675                 680                 685
<210>86
<211>696
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(308)..(308)
<223>Xaa可以是任何天然氨基酸
<400>86
Val Ala Gln Lys Thr Val Arg Trp Cys Thr Ile Ser Asn Gln Glu Ala
1               5                   10                  15
Asn Lys Cys Ser Ser Phe Arg Glu Asn Met Ser Lys Ala Val Lys Asn
            20                  25                  30
Gly Pro Leu Val Ser Cys Val Lys Lys Ser Ser Tyr Leu Asp Cys Ile
        35                  40                  45
Lys Ala Ile Arg Asp Lys Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala Gly
    50                  55                  60
Leu Val Phe Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Asn Leu Lys Pro Val Val
65                  70                  75                  80
Ala Glu Phe Tyr Gly Gln Lys Asp Asn Pro Gln Thr His Tyr Tyr Ala
                85                  90                  95
Val Ala Val Val Lys Lys Gly Ser Asn Phe Gln Trp Asn Gln Leu Gln
            100                 105                 110
Gly Lys Arg Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp Ile
        115                 120                 125
Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Asp Gln Leu Pro Glu Pro Arg Lys Pro
    130                 135                 140
Ile Glu Lys Ala Val Ala Ser Phe Phe Ser Ser Ser Cys Val Pro Cys
145                 150                 155                 160
Ala Asp Pro Val Asn Phe Pro Lys Leu Cys Gln Gln Cys Ala Gly Lys
                165                 170                 175
Gly Ala Glu Lys Cys Ala Cys Ser Asn His Glu Pro Tyr Phe Gly Tyr
            180                 185                 190
Ala Gly Ala Phe Asn Cys Leu Lys Glu Asp Ala Gly Asp Val Ala Phe
        195                 200                 205
Val Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Leu Pro Asp Lys Ala Asp Arg
    210                 215                 220
Asp Gln Tyr Glu Leu Leu Cys Arg Asp Asn Thr Arg Arg Pro Val Asp
225                 230                 235                 240
Asp Tyr Glu Asn Cys Tyr Leu Ala Gln Val Pro Ser His Ala Val Val
                245                 250                 255
Ala Arg Ser Val Asp Gly Gln Glu Asp Ser Ile Trp Glu Leu Leu Asn
            260                 265                 270
Gln Ala Gln Glu His Phe Gly Arg Asp Lys Ser Pro Asp Phe Gln Leu
        275                 280                 285
Phe Ser Ser Ser His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala Asn
    290                 295                 300
Gly Phe Leu Xaa Ile Pro Ser Lys Met Asp Ser Ser Leu Tyr Leu Gly
305                 310                 315                 320
Tyr Gln Tyr Val Thr Ala Leu Arg Asn Leu Arg Glu Glu Ile Ser Pro
                325                 330                 335
Asp Ser Ser Lys Asn Glu Cys Lys Lys Val Arg Trp Cys Ala Ile Gly
            340                 345                 350
His Glu Glu Thr Gln Lys Cys Asp Ala Trp Ser Ile Asn Ser Gly Gly
        355                 360                 365
Lys Ile Glu Cys Val Ser Ala Glu Asn Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys
    370                 375                 380
Ile Val Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Tyr Ile
385                 390                 395                 400
Tyr Ile Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr
                405                 410                 415
Lys Thr Glu Gly Glu Asn Cys Val Asn Thr Pro Glu Lys Gly Tyr Leu
            420                 425                 430
Ala Val Ala Val Val Lys Lys Ser Ser Gly Pro Asp Leu Asn Trp Asn
        435                 440                 445
Asn Leu Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala
    450                 455                 460
Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn Ser Cys
465                 470                 475                 480
Lys Phe Asp Gln Phe Phe Gly Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Gln Arg
                485                 490                 495
Asn Ser Ser Leu Cys Ala Leu Cys Ile Gly Ser Glu Arg Ala Pro Gly
            500                 505                 510
Arg Glu Cys Leu Ala Asn Asn His Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly
        515                 520                 525
Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Val Lys Asp
    530                 535                 540
Gln Val Val Gln Gln Asn Thr Asp Gly Lys Asn Lys Asp Asp Trp Ala
545                 550                 555                 560
Lys Asp Leu Lys Gln Met Asp Phe Glu Leu Leu Cys Gln Asn Gly Ala
                565                 570                 575
Arg Glu Pro Val Asp Asn Ala Glu Asn Cys His Leu Ala Arg Ala Pro
            580                 585                 590
Asn His Ala Val Val Ala Arg Asp Asp Lys Val Thr Cys Val Ala Glu
        595                 600                 605
Glu Leu Leu Lys Gln Gln Ala Gln Phe Gly Arg His Val Thr Asp Cys
    610                 615                 620
Ser Ser Ser Phe Cys Met Phe Lys Ser Asn Thr Lys Asp Leu Leu Phe
625                 630                 635                 640
Arg Asp Asp Thr Gln Cys Leu Ala Arg Val Gly Lys Thr Thr Tyr Glu
                645                 650                 655
Ser Tyr Leu Gly Ala Asp Tyr Ile Thr Ala Val Ala Asn Leu Arg Lys
            660                 665                 670
Cys Ser Thr Ser Lys Leu Leu Glu Ala Cys Thr Phe His Ser Ala Lys
        675                 680                 685
Asn Pro Arg Val Glu Thr Thr Thr
    690                 695
<210>87
<211>686
<212>PRT
<213>Gallus gallus
<400>87
Ala Pro Pro Lys Ser Val Ile Arg Trp Cys Thr Ile Ser Ser Pro Glu
1               5                   10                  15
Glu Lys Lys Cys Asn Asn Leu Arg Asp Leu Thr Gln Gln Glu Arg Ile
            20                  25                  30
Ser Leu Thr Cys Val Gln Lys Ala Thr Tyr Leu Asp Cys Ile Lys Ala
        35                  40                  45
Ile Ala Asn Asn Glu Ala Asp Ala Ile Ser Leu Asp Gly Gly Gln Ala
    50                  55                  60
Phe Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Lys Pro Ile Ala Ala Glu
65                  70                  75                  80
Val Tyr Glu His Thr Glu Gly Ser Thr Thr Ser Tyr Tyr Ala Val Ala
                85                  90                  95
Val Val Lys Lys Gly Thr Glu Phe Thr Val Asn Asp Leu Gln Gly Lys
            100                 105                 110
Thr Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp Asn Ile Pro
        115                 120                 125
Ile Gly Thr Leu Leu His Arg Gly Ala Ile Glu Trp Glu Gly Ile Glu
    130                 135                 140
Ser Gly Ser Val Glu Gln Ala Val Ala Lys Phe Phe Ser Ala Ser Cys
145                 150                 155                 160
Val Pro Gly Ala Thr Ile Glu Gln Lys Leu Cys Arg Gln Cys Lys Gly
                165                 170                 175
Asp Pro Lys Thr Lys Cys Ala Arg Asn Ala Pro Tyr Ser Gly Tyr Ser
            180                 185                 190
Gly Ala Phe His Cys Leu Lys Asp Gly Lys Gly Asp Val Ala Phe Val
        195                 200                 205
Lys His Thr Thr Val Asn Glu Asn Ala Pro Asp Gln Lys Asp Glu Tyr
    210                 215                 220
Glu Leu Leu Cys Leu Asp Gly Ser Arg Gln Pro Val Asp Asn Tyr Lys
225                 230                 235                 240
Thr Cys Asn Trp Ala Arg Val Ala Ala His Ala Val Val Ala Arg Asp
                245                 250                 255
Asp Asn Lys Val Glu Asp Ile Trp Ser Phe Leu Ser Lys Ala Gln Ser
            260                 265                 270
Asp Phe Gly Val Asp Thr Lys Ser Asp Phe His Leu Phe Gly Pro Pro
        275                 280                 285
Gly Lys Lys Asp Pro Val Leu Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala
    290                 295                 300
Ile Met Leu Lys Arg Val Pro Ser Leu Met Asp Ser Gln Leu Tyr Leu
305                 310                 315                 320
Gly Phe Glu Tyr Tyr Ser Ala Ile Gln Ser Met Arg Lys Asp Gln Leu
                325                 330                 335
Thr Pro Ser Pro Arg Glu Asn Arg Ile Gln Trp Cys Ala Val Gly Lys
            340                 345                 350
Asp Glu Lys Ser Lys Cys Asp Arg Trp Ser Val Val Ser Asn Gly Asp
        355                 360                 365
Val Glu Cys Thr Val Val Asp Glu Thr Lys Asp Cys Ile Ile Lys Ile
    370                 375                 380
Met Lys Gly Glu Ala Asp Ala Val Ala Leu Asp Gly Gly Leu Val Tyr
385                 390                 395                 400
Thr Ala Gly Val Cys Gly Leu Val Pro Val Met Ala Glu Arg Tyr Asp
                405                 410                 415
Asp Glu Ser Gln Cys Ser Lys Thr Asp Glu Arg Pro Ala Ser Tyr Phe
            420                 425                 430
Ala Val Ala Val Ala Arg Lys Asp Ser Asn Val Asn Trp Asn Asn Leu
        435                 440                 445
Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp
    450                 455                 460
Val Ile Pro Met Gly Leu Ile His Asn Arg Thr Gly Thr Cys Asn Phe
465                 470                 475                 480
Asp Glu Tyr Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Pro Pro Asn Ser
                485                 490                 495
Arg Leu Cys Gln Leu Cys Gln Gly Ser Gly Gly Ile Pro Pro Glu Lys
            500                 505                 510
Cys Val Ala Ser Ser His Glu Lys Tyr Phe Gly Tyr Thr Gly Ala Leu
        515                 520                 525
Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Ile Gln His Ser Thr
    530                 535                 540
Val Glu Glu Asn Thr Gly Gly Lys Asn Lys Ala Asp Trp Ala Lys Asn
545                 550                 555                 560
Leu Gln Met Asp Asp Phe Glu Leu Leu Cys Thr Asp Gly Arg Arg Ala
                565                 570                 575
Asn Val Met Asp Tyr Arg Glu Cys Asn Leu Ala Glu Val Pro Thr His
            580                 585                 590
Ala Val Val Val Arg Pro Glu Lys Ala Asn Lys Ile Arg Asp Leu Leu
        595                 600                 605
Glu Arg Gln Glu Lys Arg Phe Gly Val Asn Gly Ser Glu Lys Ser Lys
    610                 615                 620
Phe Met Met Phe Glu Ser Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Leu
625                 630                 635                 640
Thr Lys Cys Leu Phe Lys Val Arg Glu Gly Thr Thr Tyr Lys Glu Phe
                645                 650                 655
Leu Gly Asp Lys Phe Tyr Thr Val Ile Ser Ser Leu Lys Thr Cys Asn
            660                 665                 670
Pro Ser Asp Ile Leu Gln Met Cys Ser Phe Leu Glu Gly Lys
        675                 680                 685
<210>88
<211>117
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗-TNF-α/ScFv抗体的VH区
<400>88
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Gly Trp Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Phe Ile Gly
        115
<210>89
<211>119
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>SEQ ID NO：5的VH区，US 5,698,195
<400>89
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His
            20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala
65                  70                  75                  80
Val Tyr Leu Gln Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
        115
<210>90
<211>223
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>抗-TNF-α抗体的VH区，Gen Bank No.BAB18250
<400>90
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Asp Ser Gly Asp Leu Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro
        115                 120                 125
Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Pro Asp Ser Ile Ile Phe Ser Trp
145                 150                 155                 160
Lys Tyr Lys Asn Asn Ser Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser
                165                 170                 175
Val Leu Arg Gly Gly Lys Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro
            180                 185                 190
Ser Lys Asp Val Met Gln Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val
        195                 200                 205
Gln His Pro Asn Gly Asn Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val
    210                 215                 220
<210>91
<211>222
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>抗-TNF-α抗体的VH区，Gen Bank No.BAB18252
<400>91
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Ser Phe
            20                  25                  30
Pro Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Ile Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Gln Glu Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Ile Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Pro Glu Ala Val Thr Val Pro Ala Pro Leu Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
        115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
        195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys
    210                 215                 220
<210>92
<211>221
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>抗-TNF-α抗体的VH区，Gen Bank No.BAB18254
<400>92
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Met Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Thr Ser Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile
    50                  55                  60
Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Gln Phe
                85                  90                  95
Tyr His Asp Ser Ser Gly Tyr Leu Asp Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
           180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
        195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys
    210                 215                 220
<210>93
<211>228
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC FEATURE
<223>抗-TNF-α抗体的VH区，Gen Bank No.BAB18256
<400>93
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
            20                  25                  30
Val Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Met Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Asp Leu Ser Asn Arg Leu Ser Gly Gly Gly Thr Phe Asp Ile
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala
        115                 120                 125
Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr
    130                 135                 140
Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Pro Asp Ser
145                 150                 155                 160
Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser Asp Ile Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys Tyr Ala Ala Thr Ser
            180                 185                 190
Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln Gly Thr Asp Glu His
        195                 200                 205
Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn Lys Glu Lys Asn Val
    210                 215                 220
Pro Leu Pro Val
225
<210>94
<211>111
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>抗-TNF-α/ScFv抗体的VL区
<400>94
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
            20                  25                  30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
                85                  90                  95
Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>95
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>VL区，US 5,698,195的SEQ ID NO：3
<400>95
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Ser Ser
            20                  25                  30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Thr Val Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys
            100                 105
<210>96
<211>214
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC FEATURE
<223>抗-TNF-α抗体的VL区，Gen Bank No.BAB18251
<400>96
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Pro Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Arg Asp Asn Trp Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>97
<211>213
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC FEATURE
<223>抗-TNF-α抗体的VL区，Gen Bank No.BAB18253
<400>97
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Lys Ala Ser Gly Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Trp Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
            100                 105                 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
        115                 120                 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
    130                 135                 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
                165                 170                 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala
            180                 185                 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
        195                 200                 205
Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>98
<211>213
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC FEATURE
<223>抗-TNF-α抗体的VL区，Gen Bank No.BAB18255
<400>98
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Asn Asn Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Ala Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Pro Trp Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
            100                 105                 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
        115                 120                 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
    130                 135                 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
                165                 170                 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala
            180                 185                 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
        195                 200                 205
Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>99
<211>214
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC FEATURE
<223>抗-TNF-α抗体的VL区，Gen Bank No.BAB18257
<400>99
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Asn Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Val Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210

Claims (107)

1.包含被融合到至少一个抗体可变区上的转铁蛋白(Tf)的融合蛋白，其中相对于野生型Tf蛋白，该Tf蛋白的糖基化减少。
2.权利要求1的融合蛋白，其中抗体可变区包含VH、VL或CDR区。
3.权利要求1的融合蛋白，包含至少两个抗体可变区。
4.权利要求3的融合蛋白，包含至少VH和VL区域、VH和VH区或VL和VL区。
5.权利要求1的融合蛋白，包含至少两个不同的抗体可变区。
6.权利要求5的融合蛋白，其中不同的抗体可变区特异地结合不同抗原。
7.权利要求3的融合蛋白，其中融合蛋白被改造，使得抗体可变区非常接近。
8.权利要求7的融合蛋白，其中抗体可变区被插入到两个邻近Tf环中。
9.权利要求8的融合蛋白，其中一个抗体可变区被融合到Tf的C末端，而一个抗体可变区被插入到邻近的Tf环中。
10.权利要求8的融合蛋白，其中一个抗体可变区被融合到Tf的N末端，而一个抗体可变区被插入到邻近的Tf环中。
11.权利要求9的融合蛋白，其中Tf的C末端的脯氨酸残基被缺失或者用其它氨基酸取代。
12.权利要求9的融合蛋白，其中Tf的C末端的半胱氨酸环被删除。
13.权利要求8的融合蛋白，其中抗体可变区被融合到Tf的N末端和C末端。
14.权利要求1的融合蛋白，其中抗体可变区包含至少一个CDR肽。
15.权利要求14的融合蛋白，其中CDR肽特异地结合抗原。
16.权利要求14的融合蛋白，其中CDR肽来源于抗体。
17.权利要求14的融合蛋白，其中CDR肽来源于肽文库。
18.权利要求1的融合蛋白，其中抗体可变区特异地结合肿瘤坏死因子α(TNFα)。
19.权利要求14的融合蛋白，其中CDR特异地结合TNF。
20.权利要求1的融合蛋白，其中至少一个抗体可变区包含抗体的VH或VL区的氨基末端结构域。
21.权利要求20的融合蛋白，其中氨基末端结构域包含至少一个CDR。
22.权利要求21的融合蛋白，其中氨基末端结构域包含3个CDRs。
23.权利要求1的融合蛋白，其中抗体可变区被融合到Tf的C末端。
24.权利要求1的融合蛋白，其中抗体可变区被融合到Tf的N末端。
25.权利要求1的融合蛋白，其中抗体可变区被插入到Tf的至少一个环中。
26.权利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白对转铁蛋白受体(TfR)的亲合性降低。
27.权利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白是乳运铁蛋白(乳铁蛋白)。
28.权利要求26的融合蛋白，其中Tf蛋白不结合TfR。
29.权利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白对铁离子的亲合性降低。
30.权利要求29的融合蛋白，其中Tf蛋白不结合铁离子。
31.权利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白包含至少一个防止糖基化的突变。
32.权利要求31的融合蛋白，其中Tf蛋白是乳运铁蛋白(乳铁蛋白)。
33.权利要求1的融合蛋白，在存在抑制糖基化的化合物时被表达。
34.权利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白包含Tf蛋白的N末端结构域的一部分、桥连肽和Tf蛋白的C末端结构域的一部分。
35.权利要求34的融合蛋白，其中桥连肽将抗体可变区连接到Tf上。
36.权利要求34的融合蛋白，其中抗体可变区被插入到Tf蛋白的N和C结构域之间。
37.权利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白在Tf铰链区包含至少一个氨基酸取代、缺失或添加。
38.权利要求37的融合蛋白，其中所述铰链区选自SEQ ID NO：3的约残基94到约残基96、SEQ ID NO：3的约残基245到约残基247、SEQ IDNO：3的约残基316到约残基318、SEQ ID NO：3的约残基425到约残基427、SEQ ID NO：3的约残基581到约残基582，以及SEQ ID NO：3的约残基652到约残基658。
39.权利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白基因在SEQ ID NO：3中的选自Asp 63、Gly 65、Tyr 95、Tyr 188、Lys 206、His 207、His 249、Asp392、Tyr 426、Tyr 514、Tyr 517、His 585、Thr 120、Arg 124、Ala 126、Gly127、Thr 452、Arg 456、Ala 458和Gly 459的位置上具有至少一个氨基酸取代、缺失或添加。
40.权利要求25的融合蛋白，其中抗体可变区取代至少一个Tf环。
41.权利要求31的融合蛋白，其中糖基化位点选自对应于氨基酸N413、N611的氨基酸残基。
42.权利要求26或28的融合蛋白，其中Tf在SEQ ID NO：3中的对应于Asp 63、Gly 65、Tyr 95、Tyr188、Lys 206、His 207、His 249、Asp 392、Tyr 426、Tyr 514、Tyr 517、His 585、Thr 120、Arg 124、Ala 126、Gly 127、Thr 452、Arg 456、Ala 458和Gly 459的氨基酸残基上包含至少一个氨基酸取代、删除或添加。
43.包含被融合到至少一个抗体可变区上的对转铁蛋白受体(TfR)的亲合性降低的转铁蛋白(Tf)的融合蛋白。
44.权利要求43的融合蛋白，包含至少两个抗体可变区。
45.权利要求44的融合蛋白，包含至少VH和VL区域、VH和VH区或VL和VL区。
46.权利要求43的融合蛋白，包含至少两个不同的抗体可变区。
47.权利要求46的融合蛋白，其中不同的抗体可变区特异地结合不同抗原。
48.权利要求44的融合蛋白，其中融合蛋白被改造，使得抗体可变区十分接近。
49.权利要求48的融合蛋白，其中抗体可变区被插入到两个邻近的Tf环中。
50.权利要求49的融合蛋白，其中一个抗体可变区被融合到Tf的C末端，而一个抗体可变区被插入到邻近的Tf环中。
51.权利要求49的融合蛋白，其中一个抗体可变区被融合到Tf的N末端，而一个抗体可变区被插入到邻近的Tf环中。
52.权利要求50的融合蛋白，其中TfC末端的脯氨酸残基被缺失。
53.权利要求50的融合蛋白，其中TfC末端的半胱氨酸环被缺失。
54.权利要求49的融合蛋白，其中抗体可变区被融合到Tf的N末端和C末端。
55.权利要求43的融合蛋白，其中抗体可变区包含至少一个CDR肽。
56.权利要求55的融合蛋白，其中CDR肽特异地结合抗原。
57.权利要求55的融合蛋白，其中CDR肽来源于抗体。
58.权利要求55的融合蛋白，其中CDR肽来源于肽文库。
59.权利要求43的融合蛋白，其中抗体可变区特异地结合肿瘤坏死因子(TNF)。
60.权利要求55的融合蛋白，其中CDR特异地结合TNFα。
61.权利要求43的融合蛋白，其中抗体可变区包含抗体的VH或VL区的氨基末端结构域。
62.权利要求61的融合蛋白，其中氨基末端结构域包含至少一个CDR。
63.权利要求62的融合蛋白，其中氨基末端结构域包含3个CDR。
64.权利要求1或43的融合蛋白，其中抗体可变区的血清半衰期被延长，超过未被融合状态下的抗体可变区的血清半衰期。
65.权利要求43的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽被融合到Tf的C末端。
66.权利要求43的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽被融合到Tf的N末端。
67.权利要求43的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽被插入到Tf的至少一个环中。
68.权利要求43的融合蛋白，其中Tf蛋白不结合TfR。
69.权利要求43的融合蛋白，其中Tf蛋白对铁离子的亲合性降低。
70.权利要求69的融合蛋白，其中Tf蛋白不结合铁离子。
71.权利要求43的融合蛋白，其中所述Tf蛋白的糖基化减少或未糖基化。
72.权利要求71的融合蛋白，包含至少一个防止糖基化的突变。
73.权利要求43的融合蛋白，其中所述Tf蛋白包含Tf蛋白的N末端结构域的一部分、桥连肽和Tf蛋白的C末端结构域的一部分。
74.权利要求73的融合蛋白，其中桥连肽将治疗性蛋白质或肽连接到Tf上。
75.权利要求73的融合蛋白，其中治疗性蛋白质、肽或多肽插入到Tf蛋白的N末端结构域和C末端结构域之间。
76.权利要求73的融合蛋白，其中Tf蛋白在Tf铰链区具有至少一个氨基酸取代、删除或添加。
77.权利要求76的融合蛋白，其中所述铰链区选自约残基94到约残基96、约残基245到约残基247、约残基316到约残基318、约残基425到约残基427、约残基581到约残基582，以及约残基652到约残基658。
78.权利要求43的融合蛋白，其中Tf蛋白选自Asp 63、Gly 65、Tyr 95、Tyr188、Lys 206、His 207、His 249、Asp 392、Tyr 426、Tyr 514、Tyr 517、His 585、Thr 120、Arg 124、Ala 126、Gly 127、Thr 452、Arg 456、Ala 458和Gly 459的位置上具有至少一个氨基酸取代、删除或添加。
79.权利要求67的融合蛋白，其中治疗性蛋白或肽取代至少一个环。
80.权利要求71的融合蛋白，其中糖基化位点选自对应于氨基酸N413、N611的氨基酸残基。
81.编码权利要求1或43的融合蛋白的核酸分子。
82.包含权利要求81的核酸分子的载体。
83.包含权利要求82的载体的宿主细胞。
84.包含权利要求81的核酸分子的宿主细胞。
85.表达Tf融合蛋白的方法，包括在表达被编码的融合蛋白的条件下培养权利要求83的宿主细胞。
86.表达Tf融合蛋白的方法，包括在表达被编码的融合蛋白的条件下培养权利要求84的宿主细胞。
87.权利要求83的宿主细胞，其中该细胞是原核细胞或真核细胞。
88.权利要求84的宿主细胞，其中该细胞是原核细胞或真核细胞。
89.权利要求87的宿主细胞，其中该细胞是酵母细胞。
90.权利要求88的宿主细胞，其中该细胞是酵母细胞。
91.包含81的核酸分子的转基因动物。
92.制备Tf融合蛋白的方法，包括从权利要求91的转基因动物中分离融合蛋白。
93.权利要求92的方法，其中Tf融合蛋白包含乳铁蛋白。
94.权利要求93的方法，其中融合蛋白从来自转基因动物的生物液体中分离。
95.权利要求93的方法，其中液体是血清或乳汁。
96.治疗患者中的疾病或疾病症状的方法，包括施用权利要求1或权利要求43的融合蛋白的步骤。
97.权利要求1或权利要求43的融合蛋白，其中Tf蛋白在蛋白质的各端具有N末端结构域。
98.权利要求97的融合蛋白，其中抗体可变区被融合到Tf蛋白的各个N末端结构域中。
99.权利要求1或权利要求43的融合蛋白，其中抗体可变区特异性地结合毒素。
100.权利要求96的方法，其中抗体可变区结合TNF。
101.权利要求100的方法，其中该疾病选自脓毒性休克；内毒素性休克；与细菌感染、病毒感染、寄生虫感染、瘤形成疾病相关的恶病质综合症；自体免疫性疾病、炎症性疾病、关节炎，以及与防止移植排斥的处理相关的副作用。
102.权利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白包含单一的N末端结构域。
103.权利要求9的融合蛋白，其中Tf中的一个或多个半胱氨酸被取代。
104.权利要求12a的融合蛋白，其中一个或多个半胱氨酸被丝氨酸取代。
105.权利要求33的融合蛋白，其中化合物是衣霉素。
106.权利要求1的融合蛋白，其中融合蛋白已经用酶处理来将部分或全部的糖类去糖。
107.权利要求25的融合蛋白，其中抗体可变区取代Tf环的一部分以及邻近Tf环的一部分。
CNA038247453A 2002-08-30 2003-08-28 被修饰的转铁蛋白抗体的融合蛋白 Pending CN1694895A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40697702P 2002-08-30 2002-08-30
US60/406,977 2002-08-30
US10/384,060 2003-03-10

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201110175090A Division CN102268094A (zh) 2002-08-30 2003-08-28 被修饰的转铁蛋白抗体的融合蛋白

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1694895A true CN1694895A (zh) 2005-11-09

Family

ID=31978395

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA038247399A Pending CN1713920A (zh) 2002-08-30 2003-08-28 被修饰的转铁蛋白融合蛋白
CN201110175090A Pending CN102268094A (zh) 2002-08-30 2003-08-28 被修饰的转铁蛋白抗体的融合蛋白
CNA038247453A Pending CN1694895A (zh) 2002-08-30 2003-08-28 被修饰的转铁蛋白抗体的融合蛋白

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA038247399A Pending CN1713920A (zh) 2002-08-30 2003-08-28 被修饰的转铁蛋白融合蛋白
CN201110175090A Pending CN102268094A (zh) 2002-08-30 2003-08-28 被修饰的转铁蛋白抗体的融合蛋白

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20060130158A1 (zh)
EP (1) EP1545595B1 (zh)
JP (1) JP4873860B2 (zh)
CN (3) CN1713920A (zh)
AT (1) ATE473011T1 (zh)
AU (2) AU2003262886A1 (zh)
DE (1) DE60333306D1 (zh)
ES (1) ES2347144T3 (zh)
WO (1) WO2004020454A2 (zh)

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105358578A (zh) * 2013-05-20 2016-02-24 豪夫迈·罗氏有限公司 运铁蛋白受体的抗体及其使用方法
CN105555310A (zh) * 2013-07-08 2016-05-04 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种提高蛋白血清半衰期的组合物和方法
CN107010616A (zh) * 2017-04-13 2017-08-04 浙江理工大学 一种具有靶向传递功能的纳米药物载体的制备方法
CN108273040A (zh) * 2006-05-22 2018-07-13 加利福尼亚大学董事会 用于氧输送的组合物及方法
CN110100000A (zh) * 2016-12-26 2019-08-06 Jcr制药股份有限公司 含有bdnf的融合蛋白
CN110167585A (zh) * 2016-09-02 2019-08-23 美国卫生与公众服务部 稳定化的第2组流感血凝素茎区三聚体及其用途
CN110506055A (zh) * 2017-02-17 2019-11-26 戴纳立制药公司 工程改造的转铁蛋白受体结合多肽
CN111057147A (zh) * 2014-01-06 2020-04-24 豪夫迈·罗氏有限公司 单价血脑屏障穿梭模块
CN111526887A (zh) * 2017-10-11 2020-08-11 南京传奇生物科技有限公司 用于使血清中的蛋白质半衰期增加的组合物和方法
CN111741977A (zh) * 2018-01-10 2020-10-02 戴纳立制药公司 转铁蛋白受体结合性多肽和其用途
CN114014936A (zh) * 2015-10-02 2022-02-08 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗人cd20/人转铁蛋白受体抗体及使用方法
US11958905B2 (en) 2015-06-24 2024-04-16 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Fusion proteins containing a BDNF and an anti-human transferrin receptor antibody
US12030952B2 (en) 2015-10-02 2024-07-09 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-human CD20/human transferrin receptor antibodies and methods of use

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030226155A1 (en) * 2001-08-30 2003-12-04 Biorexis Pharmaceutical Corporation Modified transferrin-antibody fusion proteins
IL160289A0 (en) * 2001-08-30 2004-07-25 Biorexis Pharmaceutical Corp Modified transferrin fusion proteins
US20070031440A1 (en) * 2001-08-30 2007-02-08 Prior Christopher P Modified transferin-antibody fusion proteins
US8129504B2 (en) 2001-08-30 2012-03-06 Biorexis Technology, Inc. Oral delivery of modified transferrin fusion proteins
US7176278B2 (en) * 2001-08-30 2007-02-13 Biorexis Technology, Inc. Modified transferrin fusion proteins
US7772188B2 (en) 2003-01-28 2010-08-10 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
US20060205037A1 (en) * 2003-08-28 2006-09-14 Homayoun Sadeghi Modified transferrin fusion proteins
JP2007512001A (ja) * 2003-08-28 2007-05-17 バイオレクシス ファーマシューティカル コーポレイション Ｅｐｏミメティックペプチドおよび融合タンパク質
EA200700391A1 (ru) * 2004-08-03 2007-10-26 Байорексис Текнолоджи, Инк. Комбинированное лечение с применением слитых белков трансферрина, содержащих glp-1
JP2008546392A (ja) * 2005-06-17 2008-12-25 バイオレクシス ファーマシューティカル コーポレーション 固定されたトランスフェリン融合タンパク質ライブラリー
US8841255B2 (en) 2005-12-20 2014-09-23 Duke University Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides
US20130172274A1 (en) 2005-12-20 2013-07-04 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
CN101088502B (zh) * 2006-06-16 2012-11-21 中国科学院化学研究所 一种含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液及其用途
WO2008007146A1 (en) 2006-07-13 2008-01-17 Upperton Limited Process for preparing particles of proteinaceous material
ATE524493T1 (de) * 2006-07-24 2011-09-15 Biorexis Pharmaceutical Corp Exendin-fusionsproteine
AU2007292295B2 (en) * 2006-09-06 2013-06-06 Immunoforge Co., Ltd. Fusion peptide therapeutic compositions
AU2007331195A1 (en) 2006-12-12 2008-06-19 Biorexis Pharmaceutical Corporation Transferrin fusion protein libraries
EP2307038A4 (en) 2008-06-27 2013-03-27 Univ Duke THERAPEUTIC AGENTS COMPRISING ELASTINE-LIKE PEPTIDES
KR20110139292A (ko) * 2009-04-20 2011-12-28 화이자 인코포레이티드 단백질 글리코실화의 제어 및 그와 관련된 조성물 및 방법
EP4089169A1 (en) 2009-10-12 2022-11-16 Larry J. Smith Methods and compositions for modulating gene expression using oligonucleotide based drugs administered in vivo or in vitro
BR112012030941A2 (pt) * 2010-06-04 2017-06-06 Sk Chemicals Co Ltd proteína de fusão tendo atividade de fator vii
TWI689314B (zh) 2010-11-30 2020-04-01 建南德克公司 低親和力血腦障壁受體抗體及其用途
WO2013138338A2 (en) 2012-03-12 2013-09-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods for treating tissue damage associated with ischemia with apoliporotein d
CN104797933A (zh) 2012-09-07 2015-07-22 阿尔伯达大学董事会 用于诊断发炎性肝病的方法和组合物
EP3033056B1 (en) * 2013-08-12 2020-01-15 3M Innovative Properties Company Peptides for enhancing transdermal delivery
KR102058864B1 (ko) * 2013-12-16 2019-12-24 주식회사 티움바이오 인자 vii의 융합 단백질을 포함하는 안정성이 개선된 약학적 조성물
JP2015224327A (ja) * 2014-05-29 2015-12-14 花王株式会社 繊維製品用洗浄剤組成物
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
CN106967171B (zh) * 2017-02-23 2021-04-27 郑州大学 一种全人源重组CD40L单抗Fab片段及其制备方法
WO2019055841A1 (en) * 2017-09-14 2019-03-21 Denali Therapeutics Inc. ANTI-TREM2 ANTIBODIES AND METHODS OF USE
ES2929416T3 (es) 2018-06-21 2022-11-29 Novo Nordisk As Nuevos compuestos para el tratamiento de la obesidad
CN109180819A (zh) * 2018-09-14 2019-01-11 苏州康宇生物科技有限公司 一种胰岛素衍生物的制备方法
WO2020102437A1 (en) * 2018-11-13 2020-05-22 Tocagen Inc. Recombinant vectors comprising genes for binding domains and secretable peptides
CN111948388B (zh) * 2020-08-18 2022-03-22 山东农业大学 一种检测腐败梭菌的胶体金试纸条及其制备方法和应用
CN112661862B (zh) * 2020-12-25 2023-03-31 深圳大学 一种融合蛋白及其制备方法和应用
CN113267631A (zh) * 2021-05-17 2021-08-17 江苏普若维生物技术有限责任公司 一种检测TNF-α的电化学试剂盒制备方法
WO2023142109A1 (zh) * 2022-01-30 2023-08-03 领诺(上海)医药科技有限公司 一种长效重组人生长激素及其应用
WO2024114687A1 (en) * 2022-12-02 2024-06-06 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Anti-tfr1 antibodies and uses thereof

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4289689A (en) * 1980-03-14 1981-09-15 Hoffmann-La Roche Inc. Preparation of homogeneous human fibroblast interferon
WO1982002715A1 (fr) * 1981-02-04 1982-08-19 Sugano Haruo Gene d'interferon (beta)humain
US4816449A (en) * 1984-08-09 1989-03-28 Immunetech Pharmaceuticals Immunotherapeutic anti-inflammatory peptide agents
US5026651A (en) * 1985-04-25 1991-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the production of human transferrin
US5262177A (en) * 1986-02-07 1993-11-16 Oncogen Recombinant viruses encoding the human melanoma-associated antigen
US5260203A (en) * 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5091513A (en) * 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
GB8901778D0 (en) 1989-01-27 1989-03-15 Univ Court Of The University O Manipulatory technique
US5571691A (en) * 1989-05-05 1996-11-05 Baylor College Of Medicine Production of recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptides using CDNA sequences in various organisms
US5977307A (en) * 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
US5672683A (en) * 1989-09-07 1997-09-30 Alkermes, Inc. Transferrin neuropharmaceutical agent fusion protein
US6066469A (en) * 1990-03-08 2000-05-23 Ferro Dynamics, Inc. Cloning, expression, and uses of human lactoferrin
US5723286A (en) * 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
US5986067A (en) * 1991-02-08 1999-11-16 The University Of Vermont And State Agricultural College Recombinant transferrins, transferrin half-molecules and mutants thereof
US5656272A (en) * 1991-03-18 1997-08-12 New York University Medical Center Methods of treating TNF-α-mediated Crohn's disease using chimeric anti-TNF antibodies
AU2029192A (en) * 1991-05-31 1993-01-08 United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The Human lactoferrin
FR2686899B1 (fr) * 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
ZA932568B (en) * 1992-04-24 1993-11-12 Baylor College Midecine A Non Production of recombinant human lactoferrin
EP0599303A3 (en) * 1992-11-27 1998-07-29 Takeda Chemical Industries, Ltd. Peptide conjugate
CA2160583A1 (en) 1993-04-16 1994-10-27 Stanley A. Plotkin Recombinant cytomegalovirus vaccine
US5455933A (en) * 1993-07-14 1995-10-03 Dell Usa, L.P. Circuit and method for remote diagnosis of personal computers
US5843882A (en) * 1995-04-27 1998-12-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Antiviral proteins and peptides
US5817789A (en) * 1995-06-06 1998-10-06 Transkaryotic Therapies, Inc. Chimeric proteins for use in transport of a selected substance into cells
US5849293A (en) * 1996-01-11 1998-12-15 Cornell Research Foundation, Inc. Use of human transferrin in controlling insulin levels
US6458924B2 (en) * 1996-08-30 2002-10-01 Novo Nordisk A/S Derivatives of GLP-1 analogs
US7235627B2 (en) * 1996-08-30 2007-06-26 Novo Nordisk A/S Derivatives of GLP-1 analogs
FR2762843B1 (fr) * 1997-04-30 1999-12-10 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux derives de cyclosporine, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
US6258782B1 (en) * 1998-05-20 2001-07-10 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
SI1180121T1 (en) * 1999-05-17 2004-04-30 Conjuchem, Inc. Long lasting insulinotropic peptides
US6380362B1 (en) * 1999-12-23 2002-04-30 Genesis Research & Development Corporation Ltd. Polynucleotides, polypeptides expressed by the polynucleotides and methods for their use
US6420346B1 (en) * 2000-02-07 2002-07-16 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Polynucleotides encoding MIP-1α, MCP-1, MIP-1β, Rantes and TNF-α, and methods for treating rheumatoid arthritis
ES2311560T3 (es) * 2000-12-07 2009-02-16 Eli Lilly And Company Proteinas de fusion glp-1.
JP2002247847A (ja) * 2001-02-20 2002-08-30 Internatl Business Mach Corp <Ibm> Ａｃアダプタ、電源供給装置、電気機器、および電源供給装置の制御方法
US20030226155A1 (en) * 2001-08-30 2003-12-04 Biorexis Pharmaceutical Corporation Modified transferrin-antibody fusion proteins
IL160289A0 (en) * 2001-08-30 2004-07-25 Biorexis Pharmaceutical Corp Modified transferrin fusion proteins
US7176278B2 (en) * 2001-08-30 2007-02-13 Biorexis Technology, Inc. Modified transferrin fusion proteins
US20060105387A1 (en) * 2002-08-30 2006-05-18 Prior Christopher P Transferrin fusion proteins libraries
DK1407985T3 (da) * 2002-10-11 2006-03-06 Habasit Ag Transportbåndsmodul med en höjfriktionsoverflade
US20060205037A1 (en) * 2003-08-28 2006-09-14 Homayoun Sadeghi Modified transferrin fusion proteins

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108273040A (zh) * 2006-05-22 2018-07-13 加利福尼亚大学董事会 用于氧输送的组合物及方法
CN105358578A (zh) * 2013-05-20 2016-02-24 豪夫迈·罗氏有限公司 运铁蛋白受体的抗体及其使用方法
CN105555310A (zh) * 2013-07-08 2016-05-04 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种提高蛋白血清半衰期的组合物和方法
CN111057147B (zh) * 2014-01-06 2023-11-10 豪夫迈·罗氏有限公司 单价血脑屏障穿梭模块
CN111057147A (zh) * 2014-01-06 2020-04-24 豪夫迈·罗氏有限公司 单价血脑屏障穿梭模块
US11958905B2 (en) 2015-06-24 2024-04-16 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Fusion proteins containing a BDNF and an anti-human transferrin receptor antibody
CN114014936A (zh) * 2015-10-02 2022-02-08 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗人cd20/人转铁蛋白受体抗体及使用方法
US12030952B2 (en) 2015-10-02 2024-07-09 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-human CD20/human transferrin receptor antibodies and methods of use
CN110167585B (zh) * 2016-09-02 2024-03-08 美国卫生与公众服务部 稳定化的第2组流感血凝素茎区三聚体及其用途
CN110167585A (zh) * 2016-09-02 2019-08-23 美国卫生与公众服务部 稳定化的第2组流感血凝素茎区三聚体及其用途
US11793871B2 (en) 2016-09-02 2023-10-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Stabilized group 2 influenza hemagglutinin stem region trimers and uses thereof
CN110100000B (zh) * 2016-12-26 2023-06-20 Jcr制药股份有限公司 含有bdnf的融合蛋白
CN110100000A (zh) * 2016-12-26 2019-08-06 Jcr制药股份有限公司 含有bdnf的融合蛋白
CN110506055A (zh) * 2017-02-17 2019-11-26 戴纳立制药公司 工程改造的转铁蛋白受体结合多肽
CN107010616B (zh) * 2017-04-13 2019-04-02 浙江理工大学 一种具有靶向传递功能的纳米药物载体的制备方法
CN107010616A (zh) * 2017-04-13 2017-08-04 浙江理工大学 一种具有靶向传递功能的纳米药物载体的制备方法
CN111526887A (zh) * 2017-10-11 2020-08-11 南京传奇生物科技有限公司 用于使血清中的蛋白质半衰期增加的组合物和方法
CN111526887B (zh) * 2017-10-11 2023-12-01 南京传奇生物科技有限公司 用于使血清中的蛋白质半衰期增加的组合物和方法
CN111741977A (zh) * 2018-01-10 2020-10-02 戴纳立制药公司 转铁蛋白受体结合性多肽和其用途

Also Published As

Publication number Publication date
DE60333306D1 (de) 2010-08-19
WO2004020454A2 (en) 2004-03-11
EP1545595A4 (en) 2006-05-31
ES2347144T3 (es) 2010-10-26
ATE473011T1 (de) 2010-07-15
AU2009202932A1 (en) 2009-08-06
AU2009202932B2 (en) 2011-08-04
CN102268094A (zh) 2011-12-07
WO2004020454A3 (en) 2004-11-04
AU2003262886A1 (en) 2004-03-19
CN1713920A (zh) 2005-12-28
JP4873860B2 (ja) 2012-02-08
US20060130158A1 (en) 2006-06-15
AU2003262886A8 (en) 2004-03-19
JP2006503588A (ja) 2006-02-02
EP1545595B1 (en) 2010-07-07
EP1545595A2 (en) 2005-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1694895A (zh) 被修饰的转铁蛋白抗体的融合蛋白
AU2003272241B2 (en) Modified transferin-antibody fusion proteins
Kesik‐Brodacka Progress in biopharmaceutical development
CN101835803B (zh) 半胱氨酸改造的抗tenb2抗体和抗体药物偶联物
CN102428103A (zh) 抗light的人源化抗体及其使用
CN101263158B (zh) 表达人源化免疫球蛋白的转基因动物中b细胞凋亡的抑制
US20100063258A1 (en) Fusion protein constructs
CN1468250A (zh) 在转基因动物中产生人源化抗体
CN101827863A (zh) 与il-4和/或il-13结合的抗体及其用途
CN1922210A (zh) 可用作治疗剂的单价抗体片段
CN103764665A (zh) 使用分选酶安装用于蛋白质连接的点击化学柄
CN1585822A (zh) 抗体的多顺反子表达
CN1602317A (zh) 血管生成素－2的特异结合剂
CN1628126A (zh) 经修饰的运铁蛋白融合蛋白
CN1836048A (zh) 可转导的dna结合蛋白
CN1461344A (zh) 多价靶结合蛋白
CN1420893A (zh) 产生人单克隆抗体的方法及组合物
CN1464908A (zh) 多价抗体及其应用
CN1406249A (zh) 增加基于抗体的融合蛋白的循环半衰期
CN1186517A (zh) 具有更长半衰期的变异多肽
CN102307905A (zh) 利用化学反应性非天然氨基酸产生载体-肽偶联物
CN105814074A (zh) 具有超长互补决定区的人源化抗体
CN101622274A (zh) 转铁蛋白融合蛋白库
CN107810197A (zh) 鉴定包含结合多肽的细菌的方法
CN101035810A (zh) 肝细胞生长因子激活剂的调控物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Open date: 20051109