CN102307905A - 利用化学反应性非天然氨基酸产生载体-肽偶联物 - Google Patents

利用化学反应性非天然氨基酸产生载体-肽偶联物 Download PDF

Info

Publication number
CN102307905A
CN102307905A CN2009801567914A CN200980156791A CN102307905A CN 102307905 A CN102307905 A CN 102307905A CN 2009801567914 A CN2009801567914 A CN 2009801567914A CN 200980156791 A CN200980156791 A CN 200980156791A CN 102307905 A CN102307905 A CN 102307905A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
alpha
reaction
carrier
target polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2009801567914A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102307905B (zh
Inventor
T·杨
P·G·舒尔茨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Scripps Research Institute
Original Assignee
Scripps Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2008/013568 external-priority patent/WO2009075847A2/en
Priority claimed from US12/316,370 external-priority patent/US20090197339A1/en
Application filed by Scripps Research Institute filed Critical Scripps Research Institute
Publication of CN102307905A publication Critical patent/CN102307905A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102307905B publication Critical patent/CN102307905B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

提供制备载体多肽的方法，该方法包括将第一非天然氨基酸掺入载体多肽变体，将第二非天然氨基酸掺入靶多肽变体，使该第一和第二非天然氨基酸反应以产生偶联物。还提供了采用所提供方法产生的偶联物。此外，还提供了甲基营养酵母菌中的正交翻译系统和利用这些系统产生包含非天然氨基酸的载体和靶多肽变体的方法。

Description

利用化学反应性非天然氨基酸产生载体-肽偶联物
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年12月10日由Travis Young等提交的美国专利申请序列号12/316,370的优先权和权益，其名为“甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达(IN VIVO UNNATURAL AMINO ACIDEXPRES SION IN THE METHYLOTROPHIC YEAST PICHIA PASTORIS)”；2008年12月10日由Travis Young等提交的国际专利申请序列号PCT/US2008/013568的优先权和权益，其名为“甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达(IN VIVO UNNATURAL AMINO ACIDEXPRESSION IN THE METHYLOTROPHIC YEAST PICHIA PASTORIS)”；和2009年2月20日由Travis Young等提交的美国临时专利申请序列号61/208,141的优先权和权益，其名为“利用化学反应性非天然氨基酸产生载体-肽偶联物(Production of Carrier-Peptide Conjugates Using ChemicallyReactive Unnatural Amino Acids)”；这些申请的内容出于所有目的通过引用全文纳入本文。
对于联邦政府资助下研发作出发明的权利声明
本发明是在美国能源部材料科学部门的基金号DE-FG03-00ER46051的美国政府支持下作出。美国政府对本发明享有一定权利。
发明领域
本发明涉及蛋白质化学领域。本文描述了产生载体多肽-靶多肽偶联物的方法，其中掺入所述载体多肽变体的第一非天然氨基酸与掺入所述靶多肽变体的第二非天然氨基酸反应。还描述了这些方法产生的组合物。
发明背景
各种限制条件妨碍肽的开发以供治疗应用。例如，治疗性肽通常显示体内稳定性低，常在给予对象后通过化学或酶促降解而快速清除，例如在数分钟到数小时内，即，在达到任何疗效之前。因此，生物利用度低要求频繁给予肽，常通过相当高剂量的注射以维持活性。此类高剂量可导致不良副作用。此外，膜屏障(例如，肠和血脑屏障)的选择性透过限制了治疗性肽的递送。为促进递送入细胞、延长它们的半衰期和/或维持它们的活性，可将感兴趣的多肽，例如小的治疗性多肽共价偶联于载体多肽，例如对特定配体或配体的基团，如糖、核苷、盐、氨基酸、脂肪酸或其它分子具有高亲和力的各种多肽。载体多肽通常有助于此类配体的转运，例如转运入亚细胞隔室，胞外液体(例如，血液)或穿过细胞膜。因此，载体-靶多肽偶联物给予对象后，载体蛋白有利地促进将共价连接的靶多肽递送入细胞，降低它们的毒性和/或延长它们的稳定性和/或活性。
将小肽化学偶联于载体多肽的现有方法包括利用非特异性试剂，例如戊二醛或碳二亚胺活化的N-羟基琥珀酰亚胺酯和防止载体多肽-载体多肽或靶多肽-靶多肽偶联物形成的高特异性异双功能交联剂。然而，此类试剂仅可用于修饰有限数量的氨基酸残基(例如，包含胺、酮、硫醇、巯基或羧基的氨基酸)。利用此类交联剂将载体多肽偶联于靶多肽可扰乱载体多肽、靶多肽或得到的载体-靶多肽偶联物的构象，因而降低偶联物的稳定性、生物学活性、药代动力学活性等。利用这些交联剂的偶联反应可产生载体多肽-靶多肽偶联物的异质群体，从而降低生产效率并使质量控制复杂。
本领域需要能有效、成本节约地大规模产生载体多肽-靶多肽偶联物的均质群体的方法和组合物。纵览以下内容后会明白本发明提供了这些和其它需求。
发明概述
本发明提供制备载体多肽-靶多肽偶联物的方法和组合物，所述偶联物显示生物利用度提高、药理学活性增强、生物学活性升高、半衰期延长和/或免疫原性增加。本发明采用将第一和第二非天然氨基酸分别直接掺入载体多肽和靶多肽。然后存在于载体和靶多肽变体中的所述第一和第二非天然氨基酸反应以产生本发明的偶联物。此类偶联物可治疗性应用或药学应用，它们可有利地在低成本表达系统中产生，所述系统能产生包含复杂翻译后修饰的生物学活性异源蛋白质。
本发明一方面提供制备载体多肽-靶多肽偶联物的方法。该方法包括在载体多肽的合成或翻译期间将第一非天然氨基酸残基掺入载体多肽，在靶多肽的合成或翻译期间将第二非天然氨基酸残基掺入靶多肽，以及所述第一和第二残基反应以产生载体多肽-靶多肽偶联物。所述第一和第二非天然氨基酸可任选通过一种或多种以下机制反应：亲电-亲核反应、酮与亲核试剂反应、肟连接、醛与亲核试剂反应、羰基和亲核试剂之间的反应、磺酰基和亲核试剂之间的反应、酯化反应、位阻酯基和亲核试剂之间的反应、硫酯基团和亲核试剂之间的反应、稳定的亚胺基和亲核试剂之间的反应、环氧基团和亲核试剂之间的反应、氮丙啶基团和亲核试剂之间的反应、亲电试剂和脂族胺或芳族胺之间的反应、亲电试剂和酰肼之间的反应、亲电试剂和碳酰肼之间的反应、亲电试剂和氨基脲之间的反应、亲电试剂和氨基硫脲之间的反应、亲电试剂和羰基酰肼之间的反应、亲电试剂和硫代羰基酰肼之间的反应、亲电试剂和磺酰基酰肼之间的反应、亲电试剂和卡巴肼之间的反应、亲电试剂和硫卡巴肼之间的反应、亲电试剂和羟胺之间的反应、亲核试剂或亲核试剂，例如羟基或二醇和硼酸或酯之间的反应、过渡金属催化的反应、钯催化的反应、铜催化的杂原子烷化反应、环加成反应、1，3环加成反应、2，3环加成反应、炔-叠氮化物反应、狄尔斯-阿德尔(Diels-Alder)反应或铃木偶联反应。在优选的实施方式中，产生偶联物的反应的效率任选大于50％、大于70％或大于90％。
翻译期间将第一非天然氨基酸掺入载体多肽可任选包括提供翻译系统，该系统包含所述第一非天然氨基酸、正交tRNA-合成酶(O-RS)、被所述O-RS用所述第一非天然氨基酸特异性氨酰化的正交tRNA(O-tRNA)，和编码载体肽的核酸，其中所述核酸包含所述O-tRNA识别的选择者密码子；和翻译所述核酸，藉此在翻译期间将所述第一非天然氨基酸掺入所述载体多肽。任选可在甲基营养酵母细胞，例如假丝酵母(Candida)细胞、汉逊酵母(Hansenula)细胞、毕赤酵母(Pichia)细胞或球拟酵母菌(Torulopsis)细胞中，在翻译期间产生所述载体多肽(或靶多肽)。
在所述方法的具体实施方式中，将第一非天然氨基酸掺入载体多肽产生包含该第一非天然氨基酸的HSA变体，例如包含对乙酰基苯丙氨酸的HSA变体。可任选在翻译期间将第一非天然氨基酸掺入HSA变体。例如，可任选将第一非天然氨基酸掺入HSA变体的氨基酸37位，其中氨基酸位置的编号是依照SEQ ID NO：1的。然而，第一非天然氨基酸所掺入的载体多肽可任选对于各种多肽是同源的，所述多肽包括但不限于，例如抗体(例如，OKT3抗体、HER2抗体等)、抗体片段(例如，Fc、Fab、scFv等)、白蛋白、血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、c-反应性蛋白、伴白蛋白、乳清蛋白、匙孔
Figure BPA00001422440500041
血蓝蛋白(KLH)、离子载体蛋白、酰基载体蛋白、信号转导衔接蛋白、雄激素结合蛋白、钙结合蛋白、钙调蛋白结合蛋白、血浆铜蓝蛋白、胆固醇酯转移蛋白、f-盒蛋白、脂肪酸-结合蛋白、卵泡抑素、卵泡抑素-相关蛋白、GTP-结合蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白、铁-结合蛋白、潜在TGF-β结合蛋白、光-收集蛋白复合物、淋巴细胞抗原、膜转运蛋白、神经垂体素运载蛋白、周质结合蛋白、磷酸-结合蛋白、磷脂酰乙醇胺结合蛋白、磷脂转移蛋白、视黄醇-结合蛋白、RNA-结合蛋白、s-期激酶-相关蛋白、性激素-结合球蛋白、甲状腺素-结合蛋白、钴胺素传递蛋白、皮质激素传递蛋白、运铁蛋白-结合蛋白、和/或维生素D-结合蛋白。
在所述方法的某些实施方式中，将第二非天然氨基酸掺入靶多肽产生包含该第二非天然氨基酸的TSP-1变体，例如包含ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸的TSP-1变体。可任选将ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入TSP-1变体的氨基酸6位或氨基酸1位，其中氨基酸位置的编号是依照SEQ ID NO：2的。在所述方法的其它实施方式中，将第二非天然氨基酸掺入靶多肽产生包含该第二非天然氨基酸的ABT-510变体，例如包含ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸的ABT-510变体。可任选将ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入ABT-510变体的氨基酸6位或氨基酸1位，其中氨基酸位置的编号是依照SEQ ID NO：3的。ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸任选在合成期间掺入TSP-1变体或ABT-510变体。然而，掺入第二非天然氨基酸的靶多肽可任选对于以下是同源的，例如，TSP-1、ABT-510、胰高血糖素(glugacon)-样肽-1(GLP-1)、甲状旁腺激素(PTH)、核糖体灭活蛋白(RIP)、血管抑素、艾赛那肽(Exedin)-4、脱辅基蛋白、心房钠尿因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、PF4、MIG、降钙素、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-1β、RANTES、I309、R83915、R91733、T58847、D31065、T64262、CD40配体、补体抑制剂、细胞因子、上皮嗜中性粒细胞活化肽-78、GRO α、MGSA、GROβ、GROγ、MIP1-α、MIP1-β、MCP-1、上皮嗜中性粒细胞活化肽、促红细胞生成素(EPO)、剥落毒素(exfoliating toxin)、成纤维细胞生长因子(FGF)、FGF21、G-CSF、促性腺激素、生长因子、水蛭素、LFA-1、人胰岛素、人胰岛素样生长因子(hIGF)、hIGF-I、hIGF-II、人干扰素、IFN-α、IFN-、IFN-γ、白介素、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质形成细胞生长因子(KGF)、白血病抑制因子、神经生长因子(neurturin)、PDGF、肽激素、多效生长因子(pleiotropin)、热原性外毒素A、热原性外毒素B、热原性外毒素C、松弛素、促生长素抑制素、超氧化物歧化酶、胸腺素α1、人肿瘤坏死因子(hTNF)、人肿瘤坏死因子α、人肿瘤坏死因子β、Ras、Tat、炎性分子、信号转导分子、牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)和/或BP320抗原，其中所述靶多肽包含第二非天然氨基酸。应该知道以上清单不打算限制本文的实施方式。
例如，采用上述方法可在翻译期间将对-乙酰基苯丙氨酸掺入HSA变体的氨基酸37位，其中HSA中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO：1，可在合成期间将ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入TSP-1变体的氨基酸6位，其中TSP-1中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO：2，对-乙酰基苯丙氨酸与ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸通过肟连接反应以产生HSA-TSP-1偶联物。任选采用上述方法可在翻译期间将对-乙酰基苯丙氨酸掺入HSA变体的氨基酸37位，其中HSA中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO：1，可在合成期间将ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入ABT-510变体的氨基酸6位，其中ABT-510中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO：3，对-乙酰基苯丙氨酸与ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸通过肟连接反应以产生HSA-ABT-510偶联物。
在相关方面，本发明提供上述方法产生的载体多肽-靶多肽偶联物。本发明的载体多肽-靶多肽偶联物任选显示长于靶多肽的血清半衰期。本发明的偶联物可任选包含任何一个或多个上述载体多肽和任何一个或多个上述靶多肽。然而，应该知道本发明偶联物不限于包含所述载体和靶多肽的那些。
偶联物可任选包含载体多肽和靶多肽，所述载体多肽其是包含至少一个第一非天然氨基酸的HSA变体，所述靶多肽是包含第二非天然氨基酸的TSP-1变体或ABT-510变体。所述第一非天然氨基酸可任选是，例如在翻译期间掺入，例如HSA变体的氨基酸37位的对-乙酰基苯丙氨酸，其中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO：1的。所述第二非天然氨基酸可任选是，例如在合成期间掺入，例如TSP-1变体的氨基酸6位的ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸，其中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO：2的。所述第二非天然氨基酸可任选是，例如在合成期间掺入，例如ABT-510变体的氨基酸6位的ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸，其中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO：3的。
例如，本发明的偶联物可包含载体多肽和靶多肽，所述载体多肽是在氨基酸37位包含对-乙酰基苯丙氨酸的HSA变体，其中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO：1的，所述靶多肽是在氨基酸6位包含ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸的TSP-1变体，其中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO：2的。或者，本发明的偶联物可包含载体多肽和靶多肽，所述载体多肽是在氨基酸37位包含对-乙酰基苯丙氨酸的HSA变体，其中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO：1的，所述靶多肽是在氨基酸6位包含ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸的ABT-510变体，其中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO：3的。在这些实施方式中，对-乙酰基苯丙氨酸与ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸通过肟连接反应产生偶联物。
相关地，本发明提供包含载体多肽结构域和靶多肽结构域的载体多肽-靶多肽偶联物，所述载体多肽结构域包含第一非天然氨基酸残基，所述靶多肽结构域包含第二氨基酸残基，其中所述载体多肽结构域和所述靶多肽结构域通过第一和第二非天然氨基酸残基偶联在一起。所述偶联物的载体多肽结构域可任选包含本文所述的任何载体多肽，所述偶联物的靶多肽可任选包含任一(或多个)本文所述的靶多肽变体。
在具体的实施方式中，载体多肽-靶多肽偶联物的载体多肽结构域包含HSA，第一非天然氨基酸残基是对-乙酰基苯丙氨酸，靶多肽结构域包含TSP-1，第二非天然氨基酸残基是ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸。在其它实施方式中，载体多肽-靶多肽偶联物的载体多肽结构域包含HSA，第一非天然氨基酸残基是对-乙酰基苯丙氨酸，靶多肽结构域包含ABT-510，第二非天然氨基酸残基是ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸。任选可在甲基营养酵母细胞，例如假丝酵母细胞、汉逊酵母细胞、毕赤酵母细胞或球拟酵母菌细胞中，在翻译期间将第一非天然氨基酸残基掺入载体多肽结构域。可任选在本文所述任一或多个反应中，通过第一和第二非天然氨基酸的反应而共价偶联载体多肽和靶多肽。
本发明还提供包含本文所述载体多肽-靶多肽偶联物的细胞。例如，此类细胞可任选包含多肽-靶多肽偶联物，其中所述偶联物的载体多肽结构域包含HSA变体，其包含第一非天然氨基酸，例如对-乙酰基苯丙氨酸。本发明细胞可包含多肽-靶多肽偶联物，其中所述偶联物的靶多肽结构域包含TSP-1变体，其包含第二非天然氨基酸，例如ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸。在其它实施方式中，本发明细胞可包含多肽-靶多肽偶联物，其中所述偶联物的靶多肽结构域包含ABT-510变体，其包含第二非天然氨基酸，例如ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸。
试剂盒也是本发明的特征之一。例如，试剂盒可任选装有本文提供的任一或多种组合物。或者，试剂盒可装有合成载体多肽和/或靶多肽，例如治疗性小肽的试剂，所述载体多肽包含第一化学反应性非天然氨基酸，所述靶多肽包含第二化学反应性非天然氨基酸。此类试剂可包括，例如反应性非天然氨基酸，包含适合产生含非天然氨基酸的载体多肽和/或靶多肽的正交翻译系统组分的宿主细胞，例如甲基营养酵母细胞，进行连接反应产生本发明偶联物的溶液，产生包含一种或多种本发明偶联物的治疗性制剂的试剂、培养基等。本发明试剂盒可装有附加组分，例如使用说明书以构建能表达包含非天然氨基酸的载体多肽和/或靶多肽的甲基营养酵母菌株，进行化学连接反应从而产生载体多肽-靶多肽偶联物，等等。试剂盒装有容纳试剂盒组分的容器，实施本文的任何方法或任何方法组合的使用说明材料，利用试剂盒提供的细胞(例如，甲基营养酵母细胞)产生在所选氨基酸位置包含化学反应性非天然氨基酸的感兴趣载体和/或靶多肽的使用说明书。
本领域技术人员应知道可单用或联用本发明提供的方法、试剂盒和组合物。例如，可采用本发明方法产生本发明的载体多肽-靶多肽偶联物。技术人员应知道本文所述本发明特征的其它组合。
定义
在详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于具体的生物学系统，因为它们当然可能变化。还应理解本文所用的术语仅为了描述特定实施方式而非限制性的。在本说明书和随附权利要求书中所用的单数形式“一个”，“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中另有明确表示。因此，例如述及“氨酰tRNA合成酶(RS)”任选包括两个或更多个RS分子的组合；述及“载体多肽”或“甲基营养酵母细胞”实际上任选包括多个载体多肽或许多甲基营养酵母细胞。
除非另有限定，本文所用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域普通技术人员的通常理解一致。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但本文描述了优选的方法和材料。描述和要求保护本发明时，依据以下定义使用下列术语。
载体多肽：术语“载体多肽”指可采用，例如本文提供的方法偶联于靶多肽的各种多肽中的任何一种。利用载体多肽可有利于，例如在载体-靶标偶联物给予对象后促进共价连接的靶多肽递送入细胞，降低它们的毒性和/或延长它们的稳定性和/或活性。载体蛋白质的优选特征可包括溶解度高和半衰期长，然而，并不打算根据是否具有任何特定的生物学活性来限制载体多肽。常规使用的载体蛋白质包括人血清白蛋白(HSA；66kDa)、牛血清白蛋白(BSA；67kDa)、抗体片段，如Fc(45kDa)，和匙孔
Figure BPA00001422440500081
血蓝蛋白(KLH；4.5x105-1.3x107Da)。在下述一个有用的实例中，将治疗肽ABT-510共价连接于载体多肽HSA可增加肽的血清半衰期。
载体多肽可任选是此类多肽的修饰形式，例如通过包含非天然氨基酸作修饰。掺入非天然氨基酸的载体多肽在本文称为“载体多肽变体”。
相关：术语“相关”指共同起作用或彼此具有一定特异性的组分，例如正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)，其中该O-RS用非天然氨基酸特异性氨酰化该O-tRNA。
衍生自：本文所用术语“衍生自”指组分从特定分子或生物分离或制备、或者根据该特定分子或生物的序列信息分离或制备。例如，衍生自第二多肽的多肽可包含与该第二多肽的氨基酸序列相同或基本相似的氨基酸序列。以多肽为例，可通过例如天然产生的诱变、人工定点诱变或人工随机诱变获得衍生种类。用来衍生多肽的诱变可以是有意定点的或是有意随机的，或混用这两者。诱变多肽以产生衍生自第一多肽的不同多肽可以是随机事件，例如聚合酶失真(infidelity)所致，而鉴定衍生的多肽可通过例如本文引用的参考文献所述的合适筛选方法完成。多肽的诱变通常需要操作编码该多肽的多核苷酸。
编码：本文所用的术语“编码”指用多聚大分子或序列链中的信息来指导不同于该第一分子或序列链的第二分子或序列链产生的任何过程。本文所用的该术语应用广泛，可用于各领域。在一些方面，术语“编码”描述了半保留DNA复制的过程，其中双链DNA分子的一条链用作模板，借助依赖DNA的DNA合成酶来编码新合成的互补姊妹链。在另一方面，术语“编码”指用一种分子的信息来指导化学性质不同于该第一分子的第二分子产生的任何过程。例如，DNA分子可编码RNA分子，例如，通过包括依赖DNA的RNA聚合酶的转录过程。RNA分子也可编码多肽，例如在翻译过程中。当术语“编码”用于描述翻译过程时，其含义也延伸至编码氨基酸的三联密码子。在一些方面，RNA分子可编码DNA分子，例如通过包括依赖RNA的DNA合成酶的逆转录过程。在另一方面，DNA分子可编码多肽，应该知道该情况中用“编码”同时包括转录和翻译过程。
掺入非天然氨基酸：本文所用的“掺入非天然氨基酸”，例如掺入载体或靶多肽指在载体过靶多肽的一级构建中，例如通过翻译或化学合成将非天然氨基酸直接加入延伸中的多肽链。
起反应：本文所用的术语“起反应”指本发明的O-tRNA识别选择者密码子并介导与该tRNA偶联的非天然氨基酸掺入延伸中的多肽链的过程。
非-真核生物：本文所用的术语“非-真核生物”指属于原核生物界(也称为原核生物(Procarya))的生物。非-真核生物，例如原核生物通常因其以下特征而区别于真核生物：单细胞组织，通过出芽或分裂的无性生殖，缺乏膜结合的核与其它膜结合的细胞器，环状染色体，存在操纵子，不存在内含子、信使(RNA)加帽和聚-A mRNA，以及其它生物化学特征，如不同的核糖体结构。原核生物包括真细菌和古细菌(Archaea)(有时称为“古细菌(Archaebacteria)”)亚界。在原核生物界有时将蓝细菌(蓝绿藻)与支原体分为不同类别。然而，真细菌、古细菌、蓝细菌和支原体均理解为非-真核生物。
正交：本文所用的术语“正交”指与某细胞或翻译系统的内源性相应分子相比，某分子(例如，正交tRNA(O-tRNA)和/或正交氨酰tRNA合成酶(O-RS))与该细胞内源性组分起作用的效率降低，或不能与该细胞的内源性组分起作用。就tRNA和氨酰基-tRNA合成酶而言，正交指与和内源性tRNA合成酶起作用的内源性tRNA相比，正交tRNA不能与内源性tRNA合成酶起作用或起作用的效率降低；或者与和内源性tRNA起作用的内源性tRNA合成酶相比，正交氨酰tRNA合成酶与内源性tRNA不起作用或起作用的效率降低，所述效率降低例如，小于20％的效率，小于10％的效率，小于5％的效率，或小于1％的效率。正交分子缺乏细胞中功能正常的内源性互补分子。例如，与内源性RS氨酰化内源性tRNA相比，细胞的任何内源性RS氨酰化细胞中正交tRNA的效率降低或者甚至为0。在另一例子中，与内源性RS氨酰化内源性tRNA相比，正交RS氨酰化感兴趣细胞中任何内源性tRNA的效率降低或者甚至为0。可将第二正交分子引入与第一正交分子起作用的细胞。例如，正交tRNA/RS配对包括在细胞中共同起作用的所引入互补组分，且与对照相比，其效率是，例如45％效率、50％效率、60％效率、70％效率、75％效率、80％效率、90％效率、95％效率或99％效率，或更高，所述对照例如相应的tRNA/RS内源性配对或活性正交配对。
正交氨酰tRNA合成酶：本文所用的正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)是在感兴趣翻译系统内用氨基酸优先氨酰化O-tRNA的酶。O-RS加载到O-tRNA上的氨基酸可以是任何氨基酸，无论是天然、非天然或是人工的，并且不限于本文所述的。该合成酶任选与天然酪氨酰氨基酸合成酶相同或同源，或者与称为O-RS的合成酶相同或同源。
正交-tRNA：本文所用的正交tRNA(O-tRNA)是与感兴趣翻译系统正交的tRNA，其中所述tRNA是，例如：(1)与天然产生的tRNA相同或基本类似；(2)通过天然或人工诱变衍生自天然产生的tRNA；(3)由考虑了(1)或(2)的野生型或突变型tRNA序列的任何方法产生；(4)与野生型或突变型tRNA同源；(5)与称为正交tRNA合成酶底物的任何示例性tRNA同源；或(6)称为正交tRNA合成酶底物的任何示例性tRNA的保守变体。O-tRNA可加载有氨基酸，或处于非负载状态。还应知道“O-tRNA”任选被相关合成酶用非天然氨基酸加载(氨酰化)。应该知道，实际上优选利用本发明的O-tRNA在翻译期间对选择者密码子起反应而将基本上任何非天然氨基酸掺入延伸的多肽。
多肽：多肽是任何长度的氨基酸残基(天然或非天然的，或其组合)的任何寡聚物，通常但不绝对是由共价肽键连接在一起的。多肽可以是任何来源的，例如，天然多肽、通过重组分子基因技术制备的多肽、来自细胞和翻译系统的多肽、或者以无细胞合成方式制备的多肽。多肽的特征由其氨基酸序列决定，例如，其组成氨基酸残基的一级结构。在本文中，多肽的氨基酸序列不限于全长序列，也可能是部分序列或完整序列。另外，这并不意味着根据是否拥有任何特定生物活性来限制多肽。在本文中，术语“蛋白质”是多肽的同义词。术语“肽”是指小的多肽，例如但不限于长2-25个氨基酸的多肽。
优先氨酰化：对于本文所用正交翻译系统，当某表达系统中O-RS使O-tRNA加载氨基酸的效率高于其使任何内源性tRNA加载氨基酸的效率时，该O-RS“优先氨酰化”相关O-tRNA。即，当翻译系统中存在摩尔比大致相等的O-tRNA与任何给定的内源性tRNA时，O-RS加载O-tRNA的频率高于它加载内源性tRNA的频率。当翻译系统中存在等摩尔浓度的O-tRNA与内源性tRNA时，由O-RS加载的O-tRNA与由O-RS加载的内源性tRNA的相对比例优选较高，最好导致O-RS仅加载或几乎仅加载O-tRNA。当存在等摩尔浓度的O-tRNA与O-RS时，O-RS加载的O-tRNA与内源性tRNA的相对比例大于1∶1，优选至少约2∶1，更优选5∶1，更优选10∶1，更优选20∶1，更优选50∶1，更优选75∶1，更优选95∶1、98∶1、99∶1、100∶1、500∶1、1,000∶1、5,000∶1或更高。
当(a)与内源性tRNA相比，O-RS优先氨酰化O-tRNA，和(b)与O-RS用任何天然氨基酸氨酰化O-tRNA相比，氨酰化对非天然氨基酸特异时，称O-RS“优先用非天然氨基酸氨酰化O-tRNA”。即，当包含O-RS和O-tRNA的翻译系统中存在等摩尔量的非天然和天然氨基酸时，O-RS用非天然氨基酸加载O-tRNA的频率高于用天然氨基酸加载的频率。加载有非天然氨基酸的O-tRNA与加载有天然氨基酸的O-tRNA的相对比例优选较高。O-RS最好使O-tRNA仅加载，或者几乎仅加载有非天然氨基酸。当翻译系统中存在等摩尔浓度的天然和非天然氨基酸时，使O-tRNA加载非天然氨基酸与使O-tRNA加载天然氨基酸的相对比例大于1∶1，优选至少约2∶1，更优选5∶1，更优选10∶1，更优选20∶1，更优选50∶1，更优选75∶1，更优选95∶1、98∶1、99∶1、100∶1、500∶1、1,000∶1、5,000∶1或更高。
选择者密码子：术语“选择者密码子”指翻译过程中O-tRNA识别而内源性tRNA不识别的密码子。O-tRNA反密码子环识别mRNA上的选择者密码子并在多肽的此位置掺入其氨基酸，例如非天然氨基酸。选择者密码子可包括，例如无义密码子，如终止密码子(如，琥珀、赭石和乳白密码子)；四碱基或四碱基以上密码子；罕用密码子；衍生自天然或非天然碱基对的密码子，等等。
抑制活性：本文所用的术语“抑制活性”通常指tRNA(例如，抑制型tRNA)能翻译连读在其它情况中可导致翻译终止或错译(例如，移码)的密码子(例如，作为琥珀密码子或四个或以上个碱基密码子的选择者密码子)的能力。抑制型tRNA的抑制活性可表示为与第二抑制型tRNA，或与对照系统，例如缺乏O-RS的对照系统相比，观察到的翻译连读活性百分比。
可通过本领域已知的许多试验测定抑制效率。例如，可采用β-半乳糖苷酶报道试验，如可将衍生的lacZ质粒(该构建物在lacZ核酸序列中含有选择者密码子)连同含有本发明O-tRNA的质粒引入合适生物(例如，可利用正交组分的生物)的细胞。还可引入相关合成酶(可以是多肽或表达时能编码该相关合成酶的多核苷酸)。细胞在培养基中生长至所需密度，例如至OD600约为0.5，进行β-半乳糖苷酶试验，例如用诺瓦金公司(Novagen)的BetaFluorTM β-半乳糖苷酶试验试剂盒。可将抑制百分比计算为样品相对于可比较对照，例如，衍生的lacZ构建物的观察值的活性百分比，该构建物在所需位置具有相应的有义密码子而非选择者密码子。
抑制型tRNA：抑制型tRNA是在多肽翻译期间通常对终止密码子起反应而掺入氨基酸(即，“连读”)来改变给定翻译系统中信使RNA(mRNA)阅读的tRNA。在一些方面，本发明的选择者密码子是抑制型密码子，例如，终止密码子(如，琥珀、赭石和乳白密码子)、四碱基密码子、罕用密码子等。
靶多肽：术语“靶多肽”指感兴趣的任何多肽，在共价连接于载体多肽时，其生物利用度、药理学活性、生物学活性、半衰期、免疫原性等得到维持或提高。靶多肽可任选是治疗性小肽，例如TSP-1或ABT-510。或者，靶多肽可以是免疫原性的、衍生自外来生物的、自身蛋白质或合成多肽。并不打算根据是否具有任何特定生物学活性来限制靶多肽。本发明可用的治疗性小肽的例子包括，例如TSP-1多肽或其衍生物、ABT-510、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、甲状旁腺激素(PTH)、艾赛那肽-4和许多其它肽，例如本文所述的。
靶多肽可任选是此类多肽的修饰形式，例如通过插入非天然氨基酸作修饰。本文将掺入了非天然氨基酸的靶多肽称为“靶多肽变体”。
翻译系统：术语“翻译系统”指将氨基酸掺入延伸中的多肽链(蛋白质)的各组分。翻译系统的组分可包括，例如核糖体、tRNA、合成酶、mRNA、O-RS、O-tRNA等。
非天然氨基酸：本文所用的术语“非天然氨基酸”指不在20种常见天然氨基酸或罕见的天然氨基酸之列的任何氨基酸，修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物，例如硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸(pyrrolysine)。
变体：本文所用的术语“变体”指包含至少一个化学反应性非天然氨基酸的多肽，其通常衍生自不含非天然氨基酸的相应“天然”多肽。例如，载体多肽变体(或靶多肽变体)是“天然”载体多肽(或“天然”靶多肽)的突变体，该突变体包化学反应性非天然氨基酸。载体多肽变体和/或靶多肽变体中的化学反应性非天然氨基酸可任选替代载体和/或靶多肽的一级序列中的天然氨基酸。或者，可将一个(或多个)非天然氨基酸加入载体或靶多肽的一级序列。掺入载体或靶多肽变体的化学反应性非天然氨基酸可以是保守性或非保守性替代(与不含非天然氨基酸的“天然”载体或靶多肽中的相应天然氨基酸相比)。
附图简述
图1是本发明所用各种质粒的示意图。
图2显示为测定对选择者密码子起反应将非天然氨基酸对-乙酰基苯丙氨酸掺入HSA氨基酸37位的保真度和特异性而进行的实验结果。
图3显示为比较启动子以优化pApaRS表达和琥珀型抑制而进行的实验结果。
图4显示为测定PAOX2、PYPT1、PICL1、PFLD1、PGAP或PAOX1驱动的aaRS的琥珀型抑制水平而进行的实验结果，通过培养基中rHSAE37pApa水平检验。
图5a显示ABT-510肽肟连接于rHSAE37pApa的示意图。图5b显示为测定偶联程度而进行的MALDI质谱法的结果。
图6描述了为证明在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中，可利用本发明的正交翻译系统将除pApa以外的非天然氨基酸(例如，结构3-9)掺入rHSAE37X而进行的实验。
图7描述了为测定pPIC3.5k和pREAV盒(cassette)是否成功掺入GS200-rHSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS而对4个转化子进行PCR的结果。
图8描述了一次转化的GS200-rHSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS的四个不同克隆中pApaRS-His6x的蛋白质印迹。
图9描述了为测定rHSAE37X在巴斯德毕赤酵母Mut+突变株中是否更强效表达的实验结果。
图10描述了为扩增各种巴斯德毕赤酵母基因启动子而进行PCR的结果。
图11是图4结果的柱状图，显示rHSAE37pApa的琥珀型抑制与启动子驱动pApaRS产生的函数关系。
图12显示对25μl BSA标准品或测试蛋白质表达的未纯化rHSA野生型(WT)培养基作电泳的蛋白质凝胶。
图13显示图6f的泳道2的胰凝乳蛋白酶消化的rHSAE37DMNB-C蛋白的LC-MS/MS。
图14提供用于实施例1中菌株和质粒构建的寡核苷酸引物的序列。
发明详述
概要
本发明为利用目前可用的交联剂产生载体多肽-靶多肽偶联物提供有益的备选方案。本文提供的方法包括将已直接掺入载体多肽变体的第一化学反应性非天然氨基酸残基与已直接掺入靶多肽变体的第二化学反应性非天然氨基酸残基反应以产生稳定的充分确定的偶联物。此类偶联物可任选用作具有新颖或改善的生物学特性、毒性降低、活性增强和/或半衰期延长的治疗剂。这些方法通过持续产生均质偶联物群体(例如各偶联物包含相同的化学计量和连接位点)而有利于最大程度提高产率和降低成本。
从本说明书可知，本发明的各种实施方式可包括含有第一反应性非天然氨基酸的各种载体多肽变体和含有第二反应性非天然氨基酸的各种靶多肽，其中所述第一和第二非天然氨基酸经反应形成稳定的、共价连接的载体多肽-靶多肽偶联物。载体多肽和/或靶多肽可任选是治疗性的、免疫原性的、衍生自外来生物、自身蛋白质、合成的，等等。下文详述了感兴趣的特定载体多肽。本发明可用的靶多肽包括但不限于：治疗性小肽，如TSP-1、ABT-510、GLP-1、艾赛那肽-4、前述物质的肽衍生物和其它物质，本文它处将进一步描述。
在本文所述的某些实施方式中，可以在例如，甲基营养酵母菌，如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、甲醇毕赤酵母(P.methanolica)、安格斯毕赤酵母(P.angusta)(也称为多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha))、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)和球拟酵母菌(Torulopsis spp)中利用正交tRNA/氨酰基-tRNA合成酶配对将非天然氨基酸高效和高保真度地位点特异性地掺入载体或靶多肽变体。甲基营养酵母菌是用作异源、治疗上有用的蛋白质的重组表达系统的有吸引力的候选对象(Lin-Cereghino等，(2000)“在甲基营养巴斯德毕赤酵母中表达异源蛋白质(Heterologous protein expression in themethylotrophic yeast Pichia pastoris.)”FEMS Microbiol Rev 24：45-66；2008年12月10日提交的国际专利申请号PCT/US2008/013568，名为“甲基营养巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达(In Vivo Unnatural Amino AcidExpression in the Methylotrophic Yeast Pichia Pastoris)”；和2008年12月10日提交的美国专利申请公布2009/0197339，名为“甲基营养巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达(In Vivo Unnatural Amino Acid Expression in theMethylotrophic Yeast Pichia Pastoris)”)。甲基营养酵母菌的真核亚细胞组织使得它们能进行合成衍生自哺乳动物的生物学活性载体多肽和/或靶多肽所需的许多翻译后折叠、加工和修饰。与酿酒酵母(S.cerevisiae)表达的蛋白质不同，甲基营养酵母菌，例如巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母(也称为多形汉逊酵母)、博伊丁假丝酵母和球拟酵母菌产生的蛋白质不大可能含有能妨碍异源表达的糖蛋白下游加工的高甘露糖聚糖结构。此外，甲基营养酵母菌中合成的载体和/或靶多肽优选不含热原性和抗原性化合物，而这常是大肠杆菌中表达的蛋白质的特征。最有意义的是，甲基营养酵母菌表达系统尤其可用于大规模合成。例如，甲基营养酵母菌中的正交翻译系统表达的含非天然氨基酸的重组载体和/或靶多肽的水平比酿酒酵母、细菌、昆虫或哺乳动物系统中高10-100倍。此外，不难在简单的、成分明确的盐培养基中培养甲基营养酵母菌，从而无需杆状病毒表达系统所需的昂贵培养基添加剂和设备。在甲基营养酵母菌中利用正交翻译系统的进一步细节见2008年12月10日提交的国际专利申请号PCT/US2008/013568，名为“甲基营养巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达”和2008年12月10日提交的美国专利申请公布2009/0197339，名为“甲基营养巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达”。
可采用本领域已知的多种方法将第一和第二非天然氨基酸分别直接掺入载体和靶多肽。虽然许多实施方式利用，例如巴斯德毕赤酵母(见下文)或其它甲基营养酵母菌(例如，甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母(也称为多形汉逊酵母)、博伊丁假丝酵母和球拟酵母菌)中的正交翻译系统作为直接掺入非天然氨基酸的途径，但也任选采用其它直接掺入方法(例如，体外翻译系统、固相合成等)。应该知道在本文的典型实施方式中，非天然氨基酸在多肽的构建期间掺入载体和/或靶多肽，而不是通过翻译后化学衍生加入的。
在一个说明性实例中，本发明提供用于产生HSA-ABT-510偶联物的方法和组合物。ABT-510是衍生自人血小板反应蛋白的抗血管原性肽模拟物，其在人中显示强效的抗肿瘤活性，但在静脉内给予时其通过肾脏快速清除(Hoekstra等.，(2005)“血小板反应蛋白-1-模拟性抗血管原性抑制剂ABT-510在晚期癌症患者的I期安全性、药代动力学和药效学研究(Phase I safety，pharmacokinetic，and pharmacodynamic study of thethrombospondin-1-mimetic angiogenesis inhibitor ABT-510 in patients withadvanced cancer).”J Clin Oncol 23：5188-5197；Yang等.，(2007)“血小板反应蛋白-1肽ABT-510与丙戊酸的组合是成神经细胞瘤的有效抗血管原性方案(Thrombospondin-1 peptide ABT-510 combined with valproic acid is aneffective antiangiogenesis strategy in neuroblastoma).”Cancer Res 67：1716-1724；Reiher等.，(2002)“用血小板反应蛋白-1肽模拟物全身性治疗来抑制肿瘤生长(Inhibition of tumor growth by systemic treatment withthrombospondin-1 peptide mimetics).”Int J Cancer 98：682-689)。HSA是定性清楚的可溶性血清蛋白，半衰期为19天，其功能主要是作为类固醇、脂肪酸和甲状腺激素的载体蛋白。HSA在，例如在线孟德尔遗传人数据库(OnlineMendelian Inheritance in Man database)条目103600中有描述(也参见GenBank登录号AAA98797.1)。已掺入HSA变体氨基酸37位的对-乙酰基苯丙氨酸残基和已掺入ABT-510变体氨基酸6位的ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸残基通过选择性肟连接反应产生HSA-ABT-510偶联物。与HSA偶联可延长偶联肽的半衰期，因此增加其治疗应用。已掺入HSA变体氨基酸37位的对-乙酰基苯丙氨酸残基和已掺入ABT-510变体氨基酸1位的ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸残基也可通过选择性肟连接反应产生有用的偶联物。
详述的组成是首先阐明可利用本发明提供的方法和组合物化学连接的各种载体多肽和靶多肽。随后描述了产生分别包含第一和第二反应性非天然氨基酸的载体多肽变体和/或靶多肽变体的方法的细节。然后阐明了可用于偶联载体多肽变体与靶多肽变体的化学偶联反应。此后描述了包含本发明偶联物的药物组合物和它们的给药细节。最后，描述了包含本发明偶联物的试剂盒和/或它们的产生方法。
感兴趣的载体多肽和靶多肽
如上所述，本发明提供产生载体多肽-靶多肽偶联物的方法和组合物，其中分别直接掺入载体多肽和靶多肽的具有独特化学功能的第一和第二非天然氨基酸残基经反应产生指定偶联物的均质群体。载体和靶多肽变体的反应性非天然氨基酸可任选在多肽内的任何位置。载体和靶多肽变体中非天然氨基酸位置的选择任选根据，例如相对于衍生其的“天然”多肽，置于该位置是否会改变载体和/或靶多肽变体的，例如构象、生物学活性、药理学活性或其它相关特性。任意选择载体和靶多肽中化学反应性非天然氨基酸的位置的另一标准是位置是否使得反应性非天然氨基酸可接近(例如，两个非天然氨基酸能参与连接反应以产生稳定偶联物)，等等。
掺入载体和靶多肽变体的第一和第二氨基酸分别可以是保守性或非保守性替代(与不含非天然氨基酸的“天然”载体和靶多肽中的相应天然氨基酸相比)。载体多肽和/或靶多肽中的化学反应性非天然氨基酸可任选替代该载体多肽和/或靶多肽的一级序列中的天然氨基酸。或者，可将一个(或多个)反应性非天然氨基酸加入载体或靶多肽的一级序列。
可采用许多方法分别构建包含第一和第二反应性非天然氨基酸的载体和靶多肽，所述方法能将非天然氨基酸直接掺入延伸中的多肽链。虽然许多实施方式利用，例如巴斯德毕赤酵母(见下文)或其它甲基营养酵母菌(例如，甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母(也称为多形汉逊酵母)、博伊丁假丝酵母和球拟酵母菌)中的正交翻译系统作为直接掺入非天然氨基酸的途径，但也任选采用其它直接掺入方法(例如，体外翻译系统、固相合成等)，或可联用这些方法。然而，在甲基营养酵母菌中表达的优点包括它们便于遗传操作、它们对于重组蛋白质生产的经济性和它们能进行真核生物蛋白通常相关的复杂翻译后修饰。下文进一步解释在甲基营养酵母菌中重组蛋白表达的这些和其它优点。
在某些实施方式中，可采用本文所述的一种或多种连接化学反应将载体多肽偶联于多个靶多肽以产生，例如治疗上有用的载体-靶偶联物，例如多抗原肽(MAP)。相反，靶多肽可任选偶联于多个载体多肽。
分别选择HSA和ABT-510作为载体多肽和靶多肽以说明本发明的诸方面。HSA是定性清楚的血清蛋白，血清半衰期为19天，ABT-510是天然血管原性抑制剂血小板反应蛋白-1的衍生物，其在人中显示强效的抗肿瘤活性，但在静脉内给予时其通过肾脏快速清除(Hoekstra等.，(2005)“血小板反应蛋白-1-模拟性抗血管原性抑制剂ABT-510在晚期癌症患者的I期安全性、药代动力学和药效学研究”J Clin Oncol 23：5188-5197；Yang等.，(2007)“血小板反应蛋白-1肽ABT-510与丙戊酸的组合是成神经细胞瘤的有效抗血管原性方案”Cancer Res 67：1716-1724；Reiher等.，(2002)“用血小板反应蛋白-1肽模拟物全身性治疗来抑制肿瘤生长”Int J Cancer 98：682-689)。如以下实施例所述，已掺入HSA或HSA变体的对-乙酰基苯丙氨酸残基和已掺入ABT-510或ABT-510变体的ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸残基通过，例如肟连接反应。应该知道以下实施例并不是本发明仅有的实施方式。从本文的描述可以明白，本发明的各种实施方式可包括含有第一反应性非天然氨基酸的各种载体多肽变体和含有第二反应性非天然氨基酸的各种靶多肽变体，其中所述第一和第二非天然氨基酸经反应形成稳定的共价连接的载体多肽-靶多肽偶联物。因此，在各种实施方式中，所述载体多肽和/或靶多肽可任选是治疗性的、免疫原性的、衍生自外来生物、自身蛋白、合成的，等等。下文描述了感兴趣的具体载体和靶多肽。
感兴趣的载体多肽
如本文它处所述，可采用本发明提供的方法将载体蛋白有利地连接于靶多肽，例如治疗性肽，如ABT-510，以便例如在给予对象后促进靶多肽递送入细胞、增加其血清半衰期、维持稳定其活性、防止其聚集，等等。载体蛋白的优选特征可包括溶解度高和半衰期长；然而，并不打算根据是否具有任何特定生物学活性来限制靶多肽。
载体多肽可任选包含以下物质、是以下物质或与以下物质同源，例如抗体(例如，OKT3抗体、HER2抗体等)、抗体片段(例如，scFv、Fab、Fc等)、白蛋白、血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、c-反应性蛋白、伴白蛋白、乳清蛋白、匙孔
Figure BPA00001422440500191
血蓝蛋白(KLH)、离子载体蛋白、酰基载体蛋白、信号转导衔接蛋白、雄激素结合蛋白、钙结合蛋白、钙调蛋白结合蛋白、血浆铜蓝蛋白、胆固醇酯转移蛋白、f-盒蛋白、脂肪酸-结合蛋白、卵泡抑素、卵泡抑素-相关蛋白、GTP-结合蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白、铁-结合蛋白、潜在TGF-β结合蛋白、光-收集蛋白复合物、淋巴细胞抗原、膜转运蛋白、神经垂体素运载蛋白、周质结合蛋白、磷酸-结合蛋白、磷脂酰乙醇胺结合蛋白、磷脂转移蛋白、视黄醇-结合蛋白、RNA-结合蛋白、s-期激酶-相关蛋白、性激素-结合球蛋白、甲状腺素-结合蛋白、钴胺素传递蛋白、皮质激素传递蛋白、运铁蛋白-结合蛋白、和/或维生素D-结合蛋白。
然而，应该知道本发明方法和组合物不限于以上所列多肽。本发明的载体多肽-靶多肽偶联物可任选包含本领域熟知的任何载体多肽。
感兴趣的靶多肽
靶多肽可包含感兴趣的任何多肽，通过将靶多肽化学连接于载体蛋白可稳定或改善其半衰期、药理学活性、生物学活性、生物利用度。靶多肽可任选是治疗性的、免疫原性的、衍生自外来生物、自身蛋白、合成的，等等。在尤其有用的实施方式中，靶多肽可以是治疗性小肽(参见下文)。然而，并不打算根据是否具有任何特定生物学活性来限制靶多肽。在本文的实施方式中，靶多肽可包含以下物质、是以下物质的变体或与以下物质同源，例如TSP-1、ABT-510、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、甲状旁腺激素(PTH)、艾赛那肽-4、核糖体灭活蛋白(RIP)、血管抑素、脱辅基蛋白、心房钠尿因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、PF4、MIG、降钙素、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-1β、RANTES、I309、R83915、R91733、T58847、D31065、T64262、CD40配体、补体抑制剂、细胞因子、上皮嗜中性粒细胞活化肽-78、GROα、MGSA、GROβ、GROγ、MIP1-α、MIP1-β、MCP-1、上皮嗜中性粒细胞活化肽、促红细胞生成素(EPO)、剥落毒素(exfoliating toxin)、成纤维细胞生长因子(FGF)、FGF21、G-CSF、促性腺激素、生长因子、水蛭素、LFA-1、人胰岛素、人胰岛素样生长因子(hIGF)、hIGF-I、hIGF-II、人干扰素、IFN-α、IFN-、IFN-γ、白介素、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质形成细胞生长因子(KGF)、白血病抑制因子、神经生长因子、PDGF、肽激素、多效生长因子、热原性外毒素A、热原性外毒素B、热原性外毒素C、松弛素、促生长素抑制素、超氧化物歧化酶、胸腺素α1、人肿瘤坏死因子(hTNF)、人肿瘤坏死因子α、人肿瘤坏死因子β、Ras、Tat、炎性分子、信号转导分子、牛胰胰蛋白酶抑制剂(BPTI)或BP320抗原。应该知道本发明的方法和组合物也不限于以上所列的那些靶多肽。
产生载体多肽变体和/或靶多肽变体的方法
可采用能将非天然氨基酸直接掺入延伸中的多肽链的各种方法产生，例如经反应产生本发明偶联物的载体多肽变体和/或靶多肽变体。因此，虽然说明书和实施例主要集中在利用甲基营养酵母菌，例如巴斯德毕赤酵母(见下文)、甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母(也称为多形汉逊酵母)、博伊丁假丝酵母和球拟酵母菌中的正交翻译系统分别将化学反应性第一和第二非天然氨基酸掺入载体多肽变体和靶多肽变体，但可任选采用其它正交翻译系统和/或其它非正交直接掺入方法产生包含此类非天然氨基酸的靶和载体多肽变体。在几个实施方式中，可将化学反应性非天然氨基酸掺入载体多肽变体或靶多肽变体，例如治疗性小肽，而所述多肽在，例如利用O-tRNA/O-RS配对的翻译期间、利用化学合成方法等的体外合成期间产生。因此，虽然本文详述了构建包含非天然氨基酸的载体和/或靶多肽变体的具体方法，例如在甲基营养酵母菌中利用正交翻译系统，但不应将它们视作限制性的。本发明的许多实施方式还包括在一级装配期间将非天然氨基酸直接掺入载体和/或多肽的其它方法。
采用，例如下文所述的任何方法将反应性第一和第二非天然氨基酸分别掺入载体多肽和靶多肽之后，载体多肽变体中存在的第一非天然氨基酸可经，例如本文它处所述任一种连接化学反应与靶多肽变体中存在的第二非天然氨基酸反应形成稳定的指定偶联物。
应该知道，在一些实施方式中，先将非天然氨基酸遗传掺入载体多肽和靶多肽(例如，通过正交翻译系统，如本文所述和引用的那些)，再形成稳定的载体多肽-靶多肽偶联物优于采用目前可用的方法产生载体多肽-靶多肽偶联物。例如，目前将靶多肽偶联于载体HSA的一种方法包括通过马来酰亚胺连接键利用其单游离半胱氨酸(残基34)。该方案有数个缺点，包括马来酰亚胺的抗原性和内源性一氧化氮、游离半胱氨酸、谷胱甘肽或糖造成半胱氨酸34的频繁修饰，从而导致偶联效率不定。
利用体内正交翻译系统将非天然氨基酸遗传掺入载体多肽和/或靶多肽可产生生物学和/或药理学活性的载体多肽变体和/或靶多肽变体，但含有通过非天然氨基酸的直接掺入而添加的活性/官能基团，官能基团可反应以便产生稳定的载体-靶多肽偶联物。此外，利用体内掺入非天然氨基酸的新颖生物技术工具可有助于高收率、低成本地产生天然构象合适的包含非天然氨基酸的载体和/或靶多肽。此外，可根据，例如分子接头长度、反应条件、所得接头是否可切割等标准精心选择分别掺入载体和靶多肽变体的第一和第二非天然氨基酸的反应性。
相反，在一些实施方式中，采用例如固相肽合成等其它体外方法，全合成含非天然氨基酸的载体或靶多肽变体产生较短的分子(例如，约60-100个氨基酸)以及产生变性的蛋白质，产率较低。
在某些实施方式中，利用甲基营养酵母菌中的正交翻译系统产生包含非天然氨基酸，例如对-乙酰基苯丙氨酸的载体多肽变体，例如HSA，该非天然氨基酸可与靶多肽变体，例如TSP-1或ABT-510中的第二非天然氨基酸，例如ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸反应以形成稳定的载体多肽-靶多肽偶联物。对于产生此类蛋白质，利用甲基营养酵母菌，例如巴斯德毕赤酵母(见下文)、甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母(也称为多形汉逊酵母)、博伊丁假丝酵母和球拟酵母菌中的O-RS/O-tRNA配对的特征在于优于其它正交系统，例如大肠杆菌、酿酒酵母或哺乳动物细胞中那些系统的数个优点。如下文进一步描述的，它们便于遗传操作、它们对于重组蛋白质生产的经济性和它们能进行真核生物蛋白通常相关的翻译后修饰使得甲基营养酵母菌成为表达含非天然氨基酸的异源蛋白质，例如载体多肽变体和/或靶多肽变体的有利系统。
正交tRNA/正交氨酰t-RNA合成酶技术
在某些实施方式中，先将可参与化学连接反应的化学反应性第一和第二非天然氨基酸(例如本文它处所述那些)分别掺入载体多肽和/或靶多肽，再通过正交tRNA(O-tRNA)/氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)系统进行化学连接反应。因此，通过对O-tRNA/O-RS配对相关活性的理解，而进一步加深对本发明提供的组合物和方法的理解。通常，为在遗传编码中加入非天然氨基酸，需要包含氨酰基-tRNA合成酶和合适tRNA的新正交配对，该配对在宿主翻译机器中有效起作用，但与所述翻译系统“正交”。因此，正交部分起作用不依赖于翻译系统的内源性合成酶和tRNA。正交配对所需的特征包括，仅解码或识别特定密码子，例如选择者密码子，如琥珀终止密码子的tRNA，所述密码子不被任何内源性tRNA解码，以及氨酰基-tRNA合成酶，该合成酶仅用一种特定的非天然氨基酸优先氨酰化或“加载”其相关tRNA。O-tRNA通常不被或很少被内源性合成酶氨酰化，即，加载。
本领域已知适合产生包含一个或多个非天然氨基酸的本发明蛋白质的正交翻译系统的一般原理，它们是产生正交翻译系统的一般方法。例如参见名为“生产正交tRNA-酰胺-tRNA合成酶对的方法和组合物”(METHODSAND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONALtRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS)的国际公布号WO2002/086075；名为“体内掺入非天然氨基酸”(IN VIVO INCORPORATIONOF UNNATURAL AMINO ACIDS)的国际公布号WO 2002/085923；名为“扩展真核遗传编码”的国际公布号WO 2004/094593；2004年7月7日提交的WO 2005/019415；2004年7月7日提交的WO 2005/007870；2004年7月7日提交的WO 2005/007624；2005年10月27日提交的WO 2006/110182，名为“体内非天然氨基酸掺入所用正交翻译组分”(ORTHOGONALTRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OFUNNATURAL AMINO ACIDS)；以及2007年3月7日提交的WO2007/103490，名为“在真核宿主细胞中表达正交翻译组分的系统”(SYSTEMS FOR THE EXPRESSION OF ORTHOGONALTRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOST CELLS)；和2008年12月10日提交的国际专利申请号PCT/US2008/013568，名为“甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达(In Vivo UnnaturalAmino Acid Expression in the Methylotrophic Yeast Pichia Pastoris)”。还可参见如Liu等(2007)《在哺乳动物细胞中使用遗传学方法将非天然氨基酸掺入蛋白质》“Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins inmammalian cells”Nat Methods 4：239-244；2008年10月30日提交的国际申请号PCT/US2008/081868，名为“遗传学编码的硼酸氨基酸”(A GeneticallyEncoded Boronate Amino Acid)；2006年10月11日提交的WO2007/047301“对噬菌体展示多肽进行选择性翻译后修饰”(SelectivePosttranslational Modification of Phage-Displayed Polypeptides)；以及2005年10月27日提交的WO2006/110182，名为“体内非天然氨基酸掺入所用正交翻译组分”(Orthogonal Translation Components for the In vivo Incorporationof Unnatural Amino Acids)。这些前述申请各自通过引用全文纳入本文。为了讨论掺入非天然氨基酸的正交翻译系统，及其产生和使用方法，还可参见Wang和Schultz，(2005)“扩展遗传编码”(Expanding the Genetic Code)Angewandte Chemie Int Ed 44：34-66；Xie和Schultz，(2005)“扩展的遗传编码”(An Expanding Genetic Code)Methods 36：227-238；Xie和Schultz，(2005)“在遗传库中加入氨基酸”(Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire)Curr Opinion in Chemical Biology 9：548-554；Wang等(2006)“扩展遗传编码”(Expanding the Genetic Code)Annu Rev Biophys Biomol Struct35：225-249；Deiters等(2005)“在大肠杆菌体内将炔掺入蛋白质”(In vivoincorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli)Bioorganic &Medicinal Chemistry Letters 15：1521-1524；Chin等，(2002)“在大肠杆菌遗传编码中加入L-4-叠氮基苯丙氨酸”(Addition of p-Azido-L-phenylalanine tothe Genetic Code of Escherichia coli)J Am Chem Soc 124：9026-9027；以及2005年9月20日提交的国际公布号WO2006/034332。这些文件各自的内容通过引用全文纳入本文。正交翻译系统的其它细节参见美国专利号7,045,337；7,083,970；7,238,510；7,129,333；7,262,040；7,183,082；7,199,222和7,217,809。
本文所用的非天然氨基酸指除20种遗传编码的α氨基酸以外的任何氨基酸，修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物。本文所用的硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸可掺入载体多肽和/或靶多肽。参见例如，L.Stryer的《生物化学》，第三版，1988，纽约自由人公司(Freeman and Company，New York)中二十种天然氨基酸的结构。非天然氨基酸具有区别于天然氨基酸的侧链基团，虽然非天然氨基酸可以是除20种蛋白α-氨基酸外的天然产生的化合物。本发明所用的非天然氨基酸包括对-(炔丙基氧基)苯丙氨酸、对-甲氧基苯丙氨酸、丹酰基丙氨酸、DMNB-丝氨酸、邻-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、邻-4-烯丙基-L-酪氨酸、邻-炔丙基-L-酪氨酸、L-Dopa、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对-叠氮-L-苯丙氨酸、对-酰基-L-苯丙氨酸、对-苯甲酰-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰丝氨酸、膦酰酪氨酸、对-碘-苯丙氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-氨基-L-苯丙氨酸、酪氨酸的非天然类似物；谷氨酰胺的非天然类似物；苯丙氨酸的非天然类似物；丝氨酸的非天然类似物；苏氨酸的非天然类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤素、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基(alkynl)、醚、硫醇、磺酰基、磺基、硒代、酯、硫代酸、硼酸盐、硼化物(boronate)、磷、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、烷氧基胺、羟胺、酮或氨基取代的氨基酸、或其任何组合；带有光活化交联剂的氨基酸；自旋标记的氨基酸；荧光氨基酸；带有新型官能团的氨基酸；与另一分子共价或非共价相互作用的氨基酸；结合金属的氨基酸；含金属的氨基酸；放射性氨基酸；光束缚的和/或光敏异构化的氨基酸；含生物素或生物素类似物的氨基酸；糖基化或碳水化合物修饰的氨基酸；含酮氨基酸；包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化学切割或可光切割的氨基酸；带有延长侧链的氨基酸；含有毒性基团的氨基酸；糖取代的氨基酸，例如糖取代的丝氨酸等；含碳连接的糖的氨基酸；糖取代的半胱氨酸；氧化还原活性的氨基酸；含α-羟基的酸；含氨基硫代酸的氨基酸；α、α二取代氨基酸；β-氨基酸；磺基酪氨酸、4-硼(borono)苯丙氨酸、氨基氧基氨基酸、氨基氧基赖氨酸、氨基氧基鸟氨酸、氨基氧基酪氨酸，或脯氨酸之外的环状氨基酸。
可掺入，例如靶多肽和/或载体多肽的其它非天然氨基酸包括但不限于包含任一或多个以下官能团的非天然氨基酸：醛部分、酮部分、β-二酮部分、烷氧基胺部分、酰基酰肼部分、脱氢丙氨酸部分、硫酯部分、酯部分、硼酸酯部分、叠氮化物部分、炔部分、烯部分、邻位巯基胺部分等。存在于靶或载体多肽中包含此类官能团的非天然氨基酸可分别与，例如存在于载体或靶多肽中的第二非天然氨基酸反应，其包含反应性亲核和/或亲电部分，例如酮部分、醛部分、烷氧基胺部分、酰基酰肼部分、叠氮化物部分、炔部分、烯部分、氨基部分、巯基部分、氨基苯酚部分、碘代苯基部分，等等。
正交翻译系统
正交翻译系统通常包括细胞，例如原核细胞，如大肠杆菌；和真核细胞，如酿酒酵母、哺乳动物细胞和甲基营养酵母菌细胞(例如巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母(也称为多形汉逊酵母)、博伊丁假丝酵母和球拟酵母菌)等，所述细胞包含正交tRNA(O-tRNA)、正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)和非天然氨基酸，其中O-RS用非天然氨基酸氨酰化O-tRNA。正交配对可包括O-tRNA，如抑制型tRNA、移框tRNA等，以及相关O-RS。可用于产生本文的载体多肽和/或靶多肽变体的正交系统(通常包括O-tRNA/O-RS对)可包含细胞或无细胞环境。
通常，当正交配对识别选择者密码子并对该选择者密码子起反应而加载氨基酸时，该正交配对称为“抑制”该选择者密码子。即，翻译系统的内源性机器不识别的选择者密码子通常不加载，从而阻止了多肽的产生，否则多肽就可以从核酸上翻译出来。在正交配对系统中，O-RS用特定的非天然氨基酸，如本文实施例中所用的对乙酰基苯丙氨酸氨酰化O-tRNA。加载的O-tRNA识别选择者密码子，并且抑制该选择者密码子引起的翻译阻断，例如产生在氨基酸37位包含对-乙酰基苯丙氨酸的HSA变体。
翻译系统利用O-tRNA/O-RS配对将非天然氨基酸掺入延伸中的多肽链，如通过编码感兴趣多肽(例如载体多肽和/或靶多肽)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含被O-tRNA识别的选择者密码子。在某些系统中，细胞可包含一个或多个附加的O-tRNA/O-RS配对，其中附加的O-RS用不同的非天然氨基酸加载附加的O-tRNA。例如，一个O-tRNA可以识别4碱基密码子，其它O-tRNA可识别终止密码子。或者，多个不同的终止密码子，多个不同的四碱基密码子，多个不同的罕用密码子和/或多个不同的非编码密码子可用于同一编码核酸中。因此，单个多肽，如载体多肽和/或靶多肽变体可包含多个非天然氨基酸。或者，系统中产生不同的载体和/或靶多肽或多肽变体可包含不同的非天然氨基酸。关于可用的O-RS/O-tRNA相关配对及其应用的进一步细节可参见例如本文它处标注的参考文献。
因此，一些翻译系统可包含多个O-tRNA/O-RS配对，从而能将多于一种非天然氨基酸掺入载体变体和/或靶多肽变体。例如，翻译系统还可包含其它附加的不同O-tRNA/O-RS配对和第二种非天然氨基酸，其中该附加的O-tRNA识别第二选择者密码子，该附加的O-RS优选使用该第二非天然氨基酸氨酰化O-tRNA。例如，包含O-tRNA/O-RS配对的细胞(其中O-tRNA识别如琥珀选择者密码子)还可包含第二正交配对，其中第二O-tRNA识别不同的选择者密码子，如蛋白石密码子、赭石密码子、四碱基密码子、罕用密码子、非编码密码子等。在一些系统中，不同的正交配对衍生自不同来源，这有利于识别不同选择者密码子。
某些翻译系统可包含细胞，如大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞、酿酒酵母细胞或甲基营养酵母菌细胞(例如巴斯德毕赤酵母细胞、甲醇毕赤酵母细胞、安格斯毕赤酵母(或多形汉逊酵母)细胞、博伊丁假丝酵母细胞和球拟酵母菌细胞)，所述细胞包含正交tRNA(O-tRNA)、正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)、非天然氨基酸和包含编码感兴趣多肽，例如载体多肽变体和/或靶多肽变体的多核苷酸的核酸，其中所述多核苷酸包含被所述O-tRNA识别的选择者密码子。尽管正交翻译系统可使用培养细胞产生含有非天然氨基酸的蛋白质，这并不意味着本文所用的正交翻译系统需要完整的活细胞。例如，正交翻译系统可使用存在细胞提取物的无细胞系统。事实上，使用无细胞体外转录/翻译系统用于蛋白质的生产是一项成熟技术。改进这些体外系统使之利用本文所述正交翻译系统组分产生具有非天然氨基酸的蛋白质也属于本发明的范围内。
O-tRNA和/或O-RS可以是天然产生的或可通过天然产生的tRNA和/或RS的突变，如通过产生各种生物的tRNA文库和/或RS文库和/或使用多种可用的突变策略产生。例如，一种用于产生正交tRNA/氨酰基-tRNA合成酶配对的策略包括将异源tRNA/合成酶配对引入系统，其中所述配对作为一种来源或者多种来源，而非使用tRNA/合成酶配对的翻译系统。候选的异源合成酶的特征包括，如不加载任何宿主细胞tRNA，候选的异源tRNA的特征包括，如不被任何宿主细胞合成酶氨酰化。此外，异源tRNA对于所有宿主细胞合成酶是正交的。产生正交配对的第二个策略包括产生突变文库用于筛选和/或选择O-tRNA或O-RS。也可将这些策略组合。
正交tRNA(O-tRNA)
希望正交tRNA(O-tRNA)介导将非天然氨基酸掺入多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含O-tRNA在体内或体外识别的选择者密码子。
因此包含O-tRNA的组合物还包含正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)，其中O-RS优选用非天然氨基酸氨酰化O-tRNA。含有O-tRNA的此类组合物还可包含体外或体内翻译系统。细胞中还可存在包含编码感兴趣多肽的多核苷酸的核酸，其中所述多核苷酸包含被O-tRNA识别的选择者密码子，或一种或多种选择者密码子的组合。
产生重组正交tRNA并筛选其对选择者密码子起反应而将非天然氨基酸掺入多肽的效率的方法参见如，国际申请公布号WO 2002/086075，“产生正交tRNA酰胺基tRNA合成酶对的方法和组合物”(METHODS ANDCOMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNAAMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS”；WO 2004/094593，“扩展遗传编码”(EXPANDING EUKARYOTIC GENETIC CODE”；以及2004年7月7日提交的WO 2005/019415。参见Forster等，(2003)“通过全新设计的翻译遗传编码程序性肽模拟物合成酶”“Programming peptidomimetic synthetasesby translating genetic codes designed de novo”Proc Natl Acad Sci U S A100：6353-6357；和Feng等，(2003)“通过单一氨基酸变换扩展tRNA合成酶的tRNA识别”“Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by asingle amino acid change”Proc Natl Acad Sci USA 100：5676-5681。其它细节参见美国专利号7,045,337；7,083,970；7,238,510；7,129,333；7,262,040；7,183,082；7,199,222和7,217,809。
正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)
用于产生，例如包含非天然氨基酸的载体和/或靶多肽变体的O-RS系统优选在体外或体内用非天然氨基酸氨酰化O-tRNA。通过包含O-RS的多肽和/或通过编码O-RS或其部分的多核苷酸可将O-RS提供给翻译系统。
产生O-RS，测定其氨酰化效率，和/或改变其底物特异性的一般细节参见国际公布号WO 2002/086075，名为“产生正交tRNA氨酰基-tRNA合成酶对的方法和组合物”(METHODS AND COMPOSITIONS FOR THEPRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNASYNTHETASE PAIRS)；和WO 2004/094593，名为“扩展真核遗传编码”(EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE)。还参见，Wang和Schultz“扩展遗传编码”(Expanding the genetic Code)Angewandte ChemieInt Ed 44：34-66(2005)；及Hoben和Soll(1985)Methods Enzymol 113：55-59，它们的内容通过引用全文纳入本文。此类系统的其它细节参见美国专利号7,045,337；7,083,970；7,238,510；7,129,333；7,262,040；7,183,082；7,199,222和7,217,809。
来源和宿主生物体
可任选用于产生，例如包含非天然氨基酸的载体多肽变体和靶多肽变体的正交翻译组分(O-tRNA和O-RS)可衍生自任何生物或生物的组合，以便用于任何其它物种的宿主翻译系统，只要所述O-tRNA/O-RS组分与宿主系统能以正交方式起作用，所述非天然氨基酸经反应形成稳定的本发明载体-靶偶联物。正交配对中的O-tRNA和O-RS无需衍生自同一生物。例如，正交组分可衍生自用于真细菌宿主系统的古细菌基因。
另外，正交O-tRNA可衍生自古细菌，如詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)、嗜热碱甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)；嗜盐菌，如沃氏富盐菌(Haloferax volcanii)和盐细菌种NRC-1；闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、极端嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜热泉生古细菌(Aeuropyrum pernix)、海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)、甲烷嗜高热菌(Methanopyrus kandleri)、梅氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)(Mm)、耐超高温热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)、深海火球菌(Pyrococcus abyssi)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)(Ss)、超嗜热古菌(Sulfolobus tokodaii)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)、火山热原体(Thermoplasma volcanium)等；或真细菌，如大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermphilus)等；而正交O-RS可衍生自以下生物(或生物的组合)，例如古细菌，如詹氏甲烷球菌、嗜热碱甲烷杆菌；盐细菌，如沃氏富盐菌和盐细菌种NRC-1；闪烁古生球菌、激烈火球菌、极端嗜热古菌、嗜热泉生古细菌、海沼甲烷球菌、甲烷嗜高热菌、梅氏甲烷八叠球菌、耐超高温热棒菌、深海火球菌、硫磺矿硫化叶菌、超嗜热古菌、嗜酸热原体、火山热原体等；或真细菌，如大肠杆菌、嗜热栖热菌、枯草芽胞杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等。在其它系统中，真核生物来源，例如植物、藻类、原生动物、真菌、酵母菌、动物(例如哺乳动物、昆虫、节肢动)等也可用作O-tRNA和O-RS的来源。而且，O-tRNA/O-RS配对的各组分可衍生自同一生物或不同生物。
O-tRNA、O-RS或O-tRNA/O-RS配对可在体内或体外选择或筛选和/或可用于细胞，例如真细菌细胞，从而产生含有非天然氨基酸的多肽。所用的真细菌细胞可包括但不限于，例如，大肠杆菌、嗜热栖热菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等。
选择者密码子
各种选择者密码子均可扩增蛋白质生物合成机器的遗传密码子框架。例如，选择者密码子可包括，如独特的三碱基密码子、无义密码子(如终止密码子(如琥珀密码子(UAG)或乳白密码子(UGA)))、非天然密码子、至少四碱基的密码子、罕用密码子等。可将许多选择者密码子引入所需基因，例如一个或一个以上、两个或两个以上、三个以上等。可采用常规的定点诱变将选择者密码子引入编码感兴趣多肽(例如，对象的自身抗原等)的多核苷酸中感兴趣的位点。可参见，例如Sayers等(1988)，“硫代磷酸酯寡核苷酸定向诱变中的5’，3’核酸外切酶(5′，3′Exonuclease in phosphorothioate-basedoligonucleotide-directed mutagenesis)”，Nucleic Acids Res，16：791-802。利用不同的选择者密码子，可利用多对正交tRNA/合成酶配对，从而能利用这些不同的选择者密码子同时位点特异性地掺入多个非天然氨基酸，例如包含至少一个非天然氨基酸。
非天然氨基酸也可由罕用密码子编码。例如，当体外蛋白合成反应中的精氨酸浓度下降时，证实罕用的精氨酸密码子AGG可利用丙氨酸酰化的合成tRNA而有效插入Ala。参见例如，Ma等，(1993)“用具有不同反密码子的合成tRNAAla进行体外蛋白质工程改造”(In vitro protein engineeringusing synthetic tRNAAla with different anticodons)Biochemistry32：7939-7945。在这种情况下，合成tRNA与大肠杆菌中少量存在的天然tRNAArg竞争。此外，一些生物不能利用所有三联密码子。已可在体外转录/翻译提取物中利用藤黄微球菌(Micrococcus luteus)的未指定密码子AGA插入氨基酸。参见例如，Kowal和Oliver，(1997)“在藤黄微球菌中使用未指定的密码子进行基于tRNA的氨基酸诱变(Exploiting unassigned codons inMicrococcus luteus for tRNA-based amino acid mutagenesis)”Nucl Acid Res25：4685-4689。
选择者密码子也可包括延伸密码子，例如四个或四个以上碱基的密码子，如四个、五个、六个或更多碱基的密码子。四碱基密码子的例子包括，例如AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五碱基密码子的例子包括，例如AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。将非天然氨基酸掺入蛋白质，例如本文它处所述的载体多肽和/或靶多肽的具体方法可包括使用基于移框抑制的扩展密码子。四个或四个以上碱基的密码子可将例如一个或多个非天然氨基酸插入同一蛋白质。在其它例子中，反密码子环可解码，例如至少一种四碱基密码子、至少一种五碱基密码子或至少一种六碱基密码子或更多。由于可能的四碱基密码子有256种，所以同一细胞中可用四个或四个以上碱基的密码子编码多种非天然氨基酸。参见Anderson等，(2002)“探索密码子和反密码子大小的极限”(Exploring theLimits of Codon and Anticodon Size)Chemistry and Biology 9：237-244；Magliery等，(2001)“扩展遗传编码：选择有效的四碱基密码抑制子，以及在大肠杆菌中使用文库法鉴定“狡猾的”四碱基密码子”(Expanding theGenetic Code：Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons andIdentification of“Shifty”Four-base Codons with a Library Approach inEscherichia coli)J Mol Biol 307：755-769；Ma等，(1993)“体外使用具有不同反密码子的合成tRNAAla工程改造蛋白”(In vitro protein engineering usingsynthetic tRNAAla with different anticodons)Biochemistry 32：7939；Hohsaka等，(1999)“在体外蛋白合成系统中将含大芳族基团的非天然氨基酸有效掺入链霉亲合素”(Efficient Incorporation of Nonnatural Amino Acids with LargeAromatic Groups into Streptavidin in In Vitro Protein Synthesizing Systems)JAm Chem Soc 121：34-40；以及Moore等，(2000)“四联密码子：密码子扩增的启示，以及翻译步骤大小的说明”(Quadruplet Codons：Implications forCode Expansion and the Specification of Translation Step Size)J Mol Biol298：195-209。四碱基密码子已在各种正交系统中用作选择者密码子。可参见，例如，WO 2005/019415；WO 2005/007870和WO 2005/07624。还可参见Wang和Schultz，(2005)“扩展遗传编码”(Expanding the genetic Code)Angewandte Chemie Int Ed 44：34-66。
对于给定系统，选择者密码子还可包括天然三碱基密码子中内源性系统不用(或很少用)的那个天然碱基密码子。例如，这包括缺乏能识别该天然三碱基密码子的tRNA的系统，和/或该三碱基密码子是罕用密码子的系统。
选择者密码子任选包含非天然碱基对。适用于本文方法和组合物的非天然碱基对的描述包括：例如Hirao等，(2002)，“将氨基酸类似物掺入蛋白质的非天然碱基对(An unnatural base pair for incorporating amino acidanalogues into protein)”，Nature Biotechnology，20：177-182。还参见Wu等，(2002)“Enzymatic Phosphorylation of Unnatural Nucleosides”(非天然核苷的酶促磷酸化)J Am Chem Soc 124：14626-14630。
在甲基营养酵母菌中利用正交翻译系统表达和纯化包含非天然氨基酸 的载体多肽和/或靶多肽
在实施例所述的实施方式中，在巴斯德毕赤酵母中利用正交翻译系统产生包含第一非天然氨基酸，对-乙酰基苯丙氨酸的载体多肽HSA以便与包含第二非天然氨基酸的靶多肽偶联。巴斯德毕赤酵母中所用的正交组分包括衍生自大肠杆菌酪氨酰tRNA-合成酶的O-RS和O-tRNA，例如衍生自大肠杆菌的突变型酪氨酰tRNACUA琥珀型抑制因子，二者用作宿主巴斯德毕赤酵母细胞中的正交配对。
对于产生包含非天然氨基酸的载体多肽和/或靶多肽，在甲基营养酵母菌中利用O-RS/O-tRNA配对的特征在于，其具有优于其它正交系统，例如大肠杆菌、酿酒酵母或哺乳动物细胞的数个优点。首先，甲基营养酵母菌，例如巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母(多形汉逊酵母)、博伊丁假丝酵母细胞和球拟酵母菌的真核亚细胞结构能将UAA掺入要求复杂翻译后修饰的蛋白质，例如哺乳动物蛋白质，如人血清白蛋白(HSA)和人中性中性肽链内切酶(NEP)，所述翻译后修饰例如是为生物学活性进行的糖基化、二硫键形成、硫酸化、乙酰化、异戊烯化和蛋白水解加工。因此，在细菌系统中最终成为无活性包涵体的许多蛋白质在甲基营养酵母菌中成为生物学活性分子。第二，在甲基营养酵母菌中表达和制备的包含UAA的蛋白质不含可能妨碍蛋白质所专门设计的治疗应用效力的高浓度热原，例如脂多糖或抗原，如高甘露糖寡糖。第三，外来基因在甲基营养酵母菌中的遗传操作可采用许多良好建立的技术和方法，例如基因靶向、高频DNA转化、功能互补克隆(Lin-Cereghino等，(2002)“在巴斯德毕赤酵母的发酵培养物中产生重组蛋白”(Production of recombinant proteins in fermentercultures of the yeast Pichia pastoris.)”Curr Opin Biotechnol 13：329-332)。有内源性诱导型启动子和可选择标记物可用为由甲基营养酵母菌宿主产生各种含UAA蛋白质增加了灵活性。
除了这些优点，甲基营养酵母菌，例如巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母(多形汉逊酵母)、博伊丁假丝酵母细胞和球拟酵母菌也良好适用于低成本、大规模合成包含UAA的复杂蛋白质。不难在简单的、成分明确的盐培养基中培养甲基营养酵母菌，从而无需，例如杆状病毒表达系统或哺乳动物组织培养所需的昂贵培养基添加剂和高成本设备。通常，甲基营养菌可培养至极高细胞密度，在理想条件下甲基营养酵母菌可倍增至细胞悬液呈粘稠浆液。其快速的生长速度使得重组甲基营养酵母菌株能产生高水平(例如比酿酒酵母的水平高10-100倍)的包含UAA的载体和/或靶多肽。它们便于遗传操作、重组蛋白生产经济并且能进行真核生物蛋白质通常相关的翻译后修饰使得它们成为表达包含UAA的异源蛋白质的有利系统。
4种已知的甲基营养酵母菌属，例如汉森酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属和球拟酵母菌属具有共同的代谢途径从而能利用甲醇作为单一碳源。在对甲醇诱导的转录调控反应中，几种酶快速高水平合成。由于控制这些基因表达的启动予是最强且最严格调控的酵母菌启动子，甲基营养酵母菌成为大规模生产重组蛋白的最有吸引力的宿主。这些甲基营养酵母菌的细胞可以快速生长至高密度，可通过简单的培养基操作来调节产物表达水平。早已在巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母(或多形汉森酵母)和博伊丁假丝酵母中开发了表达系统，以下文献进一步描述了这些系统：Houard等，(2002)“工程改造非常规酵母菌以便有效合成大分子：甲基营养酵母菌属(Engineering of non-conventional yeasts for efficient synthesisof macromolecules：the methylotrophic genera.)”Biochimie 84：1089-1093；Gellison(2002)《多形汉森酵母：生物学和应用》(Hansenula Polymorpha：Biology and Applications)，第1版，W-V公司(Wiley-VCH)，纽约；美国专利号6,645,739；Gellisen(2000)“在甲基营养酵母菌中产生异源蛋白质(Heterologous protein production in methylotrophic yeasts.)”AppliedMicrobiology and Biotechnology 54：741-750。可商品化购得许多这些系统用于学术和工业实验室，例如阿特斯生物技术公司(Artes Biotecnology)的汉森酵母试剂盒和英杰公司(Invitrogen)的毕赤酵母试剂盒。
可从甲基营养酵母菌表达和纯化包含一个(或多个)非天然氨基酸的载体多肽变体和/或靶多肽变体。如本文它处所述，可在巴斯德毕赤酵母中从调节特征非常适合该目的的醇氧化酶1(AOX1)启动子表达外来基因。酵母菌在利用大多数碳源，例如甘油、葡萄糖或乙醇生长期间，AOX1启动子受到严格阻遏，但在用甲醇生长期间被高度诱导(Tschorp等.(1987)“在巴斯德毕赤酵母中从两个甲醇调节启动子表达lacZ基因(Expression of the lacZgene from two methanol-regulated promoters in Pichia pastoris.)”Nucl AcidsRes 15：3859-3876)。PAOX1调节的基因所编码蛋白质的表达，例如载体多肽变体和/或靶多肽变体，通常达到用甲醇培养的巴斯德毕赤酵母中可溶总蛋白的≥30％。为产生重组载体和/或靶多肽变体，首先用阻遏碳源培养PAOX1-控制的表达菌株以产生生物质，例如最大程度提高培养密度，然后换以含甲醇的培养基，例如BMGY、BMMY或BMM作为单一能源以诱导外来基因表达。
然而，甲醇不诱导的启动子也宜用于表达编码载体多肽或多肽变体和/或靶多肽或多肽变体的异源基因。该表达系统中AOX1启动子的备选启动子是巴斯德毕赤酵母GAP、FLD1、AOX2、ILC1和YPT1启动子。关于这些启动子的调控、可能最有利于从这些启动子表达外来基因的条件和巴斯德毕赤酵母中通过这些启动子表达外来蛋白质的其它细节描述于，例如Sears等，(1998)“巴斯德毕赤酵母中组成型和受调控基因表达的一套通用载体(A Versatile Set of Vectors for Constitutive and Regulated Gene Expressionin Pichia pastoris.)”Yeast 14：783-790；Vassileva等，(2001)“利用GAP启动子在甲基异源酵母菌巴斯德毕赤酵母中表达乙型肝炎表面抗原(Expressionof hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast Pichia pastoris usingthe GAP promoter.)”J Biotechnology 88：21-35；Shen等，(1998)“在巴斯德毕赤酵母中控制外来基因表达的氮源调控的强启动子(A strongnitrogen-source regulated promoter for controlled expression of foreign genesin the yeast Pichia pastoris.)”Gene 216：93-102；Lin-Cereghino等，“在巴斯德毕赤酵母中表达外来基因(Expression of foreign genes in the yeast Pichiapastoris.)”《遗传工程改造原理和方法》(Genetic Engineering Principles andMethods)，第23卷，第1版，Jane K.Setlow编，斯普林格公司(Springer)，纽约：(2005)。
虽然可用摇瓶培养在巴斯德毕赤酵母或其它甲基营养酵母菌中表达载体和/或靶多肽，但该系统中表达的蛋白质水平通常在发酵罐培养中更高，因为在发酵罐中可以控制诸如pH、通气和碳源加料速度等参数，从而达到超高细胞密度，例如＞100克/升干细胞重量；＞400克/升湿细胞重量；＞500OD600单位/毫升(参见，例如Lin-Cereghino等，(2002)“发酵罐培养巴斯德毕赤酵母来产生重组蛋白(Production of recombinant proteins in fermentercultures of the yeast Pichia pastoris.)”Curr Opin Biotechnol 13：329-332)。巴斯德毕赤酵母表达系统的特点是便于将表达菌株从摇瓶放大到高密度发酵罐培养。
通常采用三步方法在巴斯德毕赤酵母或其它甲基营养酵母菌的发酵罐培养中表达P-AOX1转录控制下的基因编码的载体和/或靶多肽变体。在第一步中，用简单的成分确定培养基培养工程改造的巴斯德毕赤酵母表达菌株，该培养基包含不可发酵的PAOX1-抑制型碳源以允许细胞生长。第二步包括过渡期，该期间以生长限制速度向培养物中加入甘油以进一步增加培养物的生物质并制备细胞以供诱导。在第三步中，向培养物中加入甲醇，其添加速度应使细胞在生理上适应代谢甲醇并合成重组蛋白。然后定期上调甲醇加料速度直至获得所需生长速度和蛋白质表达速度(Lin-Cereghino等，“在巴斯德毕赤酵母中表达外来基因(Expression of foreign genes in the yeastPichia pastoris.)”《遗传工程改造原理和方法》(Genetic EngineeringPrinciples and Methods)，第23卷，第1版，Jane K.Setlow编，斯普林格公司，纽约：(2005))。
培养甲基营养酵母的培养基廉价，成分确定，由诸如甘油和/或甲醇等碳源、生物素、盐、痕量元素和水构成。培养基不含热原和毒素，因此与人用药剂的制备相容。
可以在胞内或胞外制备在甲基营养酵母菌中表达的重组载体多肽变体和/或靶多肽变体。由于甲基营养酵母菌只分泌低水平的内源蛋白，分泌的重组蛋白可占培养基中蛋白的大部分。因此，将重组载体和/或靶多肽变体导入培养基可用作蛋白质纯化中的第一步，从而无需采用苛刻的酵母菌裂解方法并避免内源性酵母蛋白污染重组蛋白的可能性。然而由于蛋白质稳定性和折叠要求，将异源蛋白质分泌入培养基通常只针对正常情况下由它们的天然宿主细胞分泌的那些蛋白质。然而，可利用试剂盒，例如英杰公司的原创毕赤酵母表达试剂盒(Original Pichia Expression Kit，Invitrogen)、英杰公司的多拷贝毕赤酵母表达试剂盒(Multi-Copy Pichia Expression Kit，Invitrogen)、研发协作技术公司的毕赤酵母蛋白表达系统(Pichia ProteinExpression System，Research Corporation Technologies)，其中从业人员可用预先制备的表达盒将感兴趣基因与编码其天然分泌信号、酿酒酵母α-因子前肽原或巴斯德毕赤酵母酸性磷酸酶(PHO1)信号的序列克隆在框内，从而能分泌入培养基。现已开发了许多技术来回收甲基营养酵母的胞内重组蛋白(Shepard等，(2002)“通过细胞透化处理回收巴斯德毕赤酵母的胞内重组蛋白(Recovery of intracellular recombinant proteins from the yeast Pichiapastoris by cell permeabilization.)”J Biotechnology 99：149-160；美国专利号6,821,752)。
从甲基营养酵母菌纯化异源蛋白质的通用方法
各种蛋白质纯化方法是本领域熟知的，可用于纯化和分析在甲基营养酵母菌中表达的包含UAA的载体和/或靶多肽和多肽变体。这些技术以及分析多肽所需的其它技术包括下列文献所描述的那些：R.Scopes，《蛋白质纯化》(Protein Purification)，S-V公司(Springer-Verlag)，纽约(1982)；Deutscher，《酶学方法》(Methods in Enzymology)，182卷：蛋白质纯化指导(Guide to Protein Purification)，学术出版公司(Academic Press，Inc).纽约.(1990)；Sandana(1997)《蛋白质的生物分离》(Bioseparation of Proteins)，学术出版公司；Bollag等(1996)《蛋白质方法》(Protein Methods)，第2版，W-L公司(Wiley-Liss)，纽约；Walker(1996)《蛋白质方法手册》(TheProtein Protocols Handbook)休玛娜出版社(Humana Press)，新泽西州；Harris和Angal(1990)《蛋白质纯化应用：实用方法》(Protein PurificationApplications：A Practical Approach)牛津IRL出版社(IRL Press at Oxford)，牛津，英格兰；Harris和Angal《蛋白质纯化方法：使用方法》(ProteinPurification Methods：A Practical Approach)牛津IRL出版社，牛津，英格兰；Scopes(1993)《蛋白质纯化：原理和实践》(Protein Purification：Principles and Practice)，第3版，S-V公司，纽约；Janson和Ryden(1998)《蛋白质纯化：原则、高分辨率方法及应用》(Protein Purification：Principles，High Resolution Methods and Applications)，第2版，WV公司，纽约；以及Walker(1998)《蛋白质方法，光盘版》(Protein Protocols on CD-ROM)，休玛娜出版社，新泽西州；以及其中引用的参考文献。
构建甲基营养酵母菌菌株的方法和策略
通常利用适合在大肠杆菌中复制的穿梭载体工程改造将感兴趣基因，例如编码载体多肽和/或靶多肽或其变体并包含选择者密码子的基因置于高度诱导型甲基营养酵母菌启动子控制下的核酸构建物。由于质粒在甲基营养酵母菌中较不稳定，通常随后使表达构建物线性化，转化入，例如巴斯德毕赤酵母属细胞、汉森酵母属细胞、假丝酵母属细胞或球拟酵母属细胞，并整合入基因组。整合通常是位点特异性的；然而，在多形汉森酵母中观察到高频率的非同源整合(Agaphonov等，(2005)“空泡蛋白分选缺陷刺激多形汉森酵母中人尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂的蛋白水解加工(Defect of vacuolar proteinsorting stimulates proteolytic processing of human urokinase-type plasminogenactivator in the yeast Hansenula polymorpha.)”FEMS Yeast Reseach 5：1029-1035)。关于甲基营养酵母菌的通用分子操作，例如转化、基因靶向、通过功能互补克隆、利用可用的可选择标记等的其它细节可见，例如Peberdy编，(1991)《真菌的应用分子遗传学》(AppliedMolecular Geneticsof Fungi).剑桥大学出版社，英国；《多形汉森酵母：生物学和应用》(Hansenula Polymorpha：Biology and Applications)，第一版，W-V公司；Higgins和Cregg.《毕赤酵母方案(分子生物学方法)》(Pichia Protocols(Methods in Molecular Biology))，第一版.休玛娜出版社：新泽西州(1998)；和其中引用的参考文献。
在优选的实施方式中，在甲基营养巴斯德毕赤酵母中表达载体多肽变体和/或靶多肽变体，例如本文它处详述的那些。可通过以下三个基础步骤在巴斯德毕赤酵母中表达大多数外来基因：将编码载体或靶多肽的基因插入表达载体；将该表达载体引入巴斯德毕赤酵母基因组；和分析产生外来基因所表达的载体或靶多肽的推定表达菌株，该方法在上文描述。幸运的是，巴斯德毕赤酵母的分子遗传操作的技术，例如DNA-介导的转化、基因靶向、基因替代和通过功能互补克隆类似于酿酒酵母所述的那些。然而，与酿酒酵母相反，质粒在巴斯德毕赤酵母中不稳定，编码感兴趣蛋白质的表达构建物通过同源重组整合入巴斯德毕赤酵母基因组。巴斯德毕赤酵母的分子遗传操作方案详述于，例如Cregg等，(1985)“巴斯德毕赤酵母作为转化的宿主系统(Pichia pastoris as a hostsystem for transformations.)”Molec Cell Biol 5：3376-3385；Lin-Cereghino等，“在巴斯德毕赤酵母中表达外来基因(Expression of foreign genes in the yeastPichia pastoris.)”《遗传工程改造原理和方法》(Genetic EngineeringPrinciples and Methods)，第23卷，第1版，Jane K.Setlow编，斯普林格公司，纽约：(2005)；Higgins和Cregg.《毕赤酵母方案(分子生物学方法)》(Pichia Protocols(Methods in Molecular Biology))，第一版.休玛娜出版社：新泽西州(1998)；Lin-Cereghino等，(2000)“在甲基营养巴斯德毕赤酵母中表达异源蛋白质(Heterologous protein expression in the methylotrophic yeastPichia pastoris.)”FEMS Microbiol Rev 24：45-66，和其中引用的参考文献。
有各种巴斯德毕赤酵母宿主菌株和表达载体可用。实际上，所有巴斯德毕赤酵母表达菌株衍生自伊利诺斯州皮奥里亚市北区研究实验室(NorthernRegional Research Laboratories，Peoria，IL)的NRRL-Y 111430。大多数表达菌株具有能选择包含合适互补标记的表达载体的一个或多个营养缺陷型标记。宿主菌株因AOX1、AOX2或二者中有缺陷而具有不同的甲醇代谢能力。事实上，在AOX1和/或AOX2中有突变的菌株可能是比野生型菌株更好的外来蛋白质生产者(Cregg等.(1987)“在甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中乙型肝炎抗原的高水平表达和有效装配(High level expression andefficient assembly of hepatitis B antigen in the methylotrophic yeast，Pichiapastoris.)”Bio/Technology 5：479-485；Chiruvolu等，(1997)“采用分批补料发酵在巴斯德毕赤酵母的醇氧化酶缺陷型菌株中产生重组蛋白(Recombinant protein production in an alcohol oxidase-defective strain ofPichia pastoris in fed-batch fermentation.)”Enzyme Microb Technol 21：277-283)。然而，aox1-菌株甚至保留了高水平地诱导从AOX1启动子表达外来蛋白的能力。宿主菌株，包括某些重组蛋白表达可能更有利的蛋白酶缺陷型宿主菌株的更详细信息见，例如Brierley等，(1998)“重组胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的分泌(Secretion of recombinant insulin-like growth factor-1(IGF-1).)”Methods Mol Biol 103：149-177；White等，(1995)“大规模表达、纯化和鉴定血栓调节蛋白的小片段：第六结构域和甲硫氨酸388的作用(Large-scale expression，purification，and characterization of small fragmentsof thrombomodulin：the roles of the sixth domain and of methionine 388.)”Protein Eng 8：1177-1187。
大多数巴斯德毕赤酵母表达载体设计成大肠杆菌/巴斯德毕赤酵母穿梭载体，该载体含有复制起点以便维持在大肠杆菌中以及在一种或两种生物体中起作用的可选择标记，例如在巴斯德毕赤酵母中可选择的ARG4、HIS4、ADE1、URA3、TRP1和某些抗生素，例如ZeocinTM和Geneticin
Figure BPA00001422440500401
和/或可在大肠杆菌中选择的许多抗生素耐受标记中的任一种。表达载体通常包含5’AOX1启动子序列和用于转录终止的AOX1-衍生序列，二者之间有多克隆位点。虽然AOX1启动子已成功用于表达多种外来蛋白，但仍有可能不适用该启动子的情况，例如就生产食品而言。该表达系统中AOX1启动子之外的备选启动子是巴斯德毕赤酵母AOX2、ICL1、GAP、FLD1和YPT1启动子。包含任何上述启动子的通用表达载体图谱和可能的载体组分清单还可见，例如Lin-Cereghino等，“在巴斯德毕赤酵母中表达外来基因(Expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris.)”《遗传工程改造原理和方法》(Genetic Engineering Principles and Methods)，第23卷，第1版，Jane K.Setlow编，斯普林格公司，纽约：(2005)；和Lin-Cereghino等，(2000)“在甲基营养巴斯德毕赤酵母中表达异源蛋白质(Heterologousprotein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris.)”FEMSMicrobiol Rev 24：45-66。此外，许多载体的DNA序列可见英杰公司网站(www.invitrogen.com)，各自可从英杰公司单独购得和在巴斯德毕赤酵母表达试剂盒中购得。
通用分子克隆方法和技术
参考文献中描述了很多分离、克隆和扩增核酸的方法以便准备，例如将感兴趣基因，例如编码载体多肽变体或靶多肽变体的基因克隆入上述表达构建物，这些方法可用于本发明以便，例如在甲基营养酵母菌，如巴斯德毕赤酵母中提供感兴趣基因并表达。这些技术的进一步细节可见：Berger和Kimmel，《分子克隆技术指南—酶学方法》(Guide to Molecular CloningTechniques，Methods in Enzymology)第152卷，学术出版社公司，圣迭戈，加利福尼亚州(Berger)；Sambrook等，《分子克隆实验指南》(MolecularCloning-A Laboratory Manual)(第3版)，1-3卷，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，2000(“Sambrook”)；《核酸方法学手册》(The Nucleic Acid ProtocolsHandbook)Ralph Rapley(编)(2000)冷泉港，休玛娜出版社公司(Rapley)；《最新分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，F.M.Ausubel等编，《最新方法》(Current Protocols)，格林出版合伙公司(GreenePublishing Associates，Inc.)和约翰韦利父子公司(John Wiley & Sons，Inc.)的合作企业(增补2007)(“Ausubel”))；《PCR方法，方法和应用指南》(PCRProtocols A Guide to Methods and Applications)(Innis等编)学术出版公司.圣迭戈，加利福尼亚州(1990)(Innis)；Chen等(编)《PCR克隆方法》(PCRCloning Protocols)，第2版(《分子生物学方法》(Methods in MolecularBiology)，第192卷)休玛娜出版社；Viljoen等(2005)《分子诊断PCR手册》(Molecular Diagnostic PCR Handbook)斯普林格公司；Demidov和Broude(编)(2005)《DNA扩增：当代技术和应用》(DNA Amplification：Current Technologies and Applications)地平线生物科学公司(HorizonBioscience)，怀蒙特汉姆(Wymondham)，英国。其它有用的参考文献，例如，用于细胞分离和培养，例如，用于随后的核酸分离，包括Freshney(1994)《动物细胞培养，基本技术手册》(Culture of Animal Cells，a Manual ofBasic Technique)，第3版，W-L公司，纽约及其中引用的文献；Payne等(1992)《植物细胞和组织在液体系统中的培养》(Plant Cell and Tissue Culture inLiquid Systems)约翰韦利父子公司纽约，纽约州；Gamborg和Phillips(编)(1995)《植物细胞、组织和器官培养》(Plant Cell，Tissue and OrganCulture)；《基础方法斯普林格实验室手册》(Fundamental Methods SpringerLab Manual)，S-V公司(Springer-Verlag)(伯林、海德堡、纽约)以及Atlas和Parks(编)《微生物培养基手册》(The Handbook of Microbiological Media)(1993)CRC出版社(CRC Press)，伯克莱屯，佛罗里达州。
可商品化购得许多试剂盒用于从细胞纯化质粒或其它相关核酸(参见，例如，法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech)的EasyPrepTM和FlexiPrepTM；斯特拉塔基因公司(Stratagene)的StrataCleanTM；恰根公司(Qiagen)的QIAprepTM)。任何分离的和/或纯化的核酸都可以进一步操作以制备其它核酸，用于转染细胞、掺入相关载体以感染生物体以便表达等。典型的克隆载体包含转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列、以及用于调节特定靶核酸表达的启动子。载体任选包含基因表达盒，其含有至少一个独立终止子序列、使表达盒在真核细胞或原核细胞或者二者中复制的序列(例如，穿梭载体)以及用于原核和真核系统的选择标记。参见Sambrook，Ausubel和Berger。另外，基本上任何核酸都可以从任何商业来源定制或订购，例如阿拉巴马州亨茨维尔的操纵子技术公司(Operon Technologies Inc.，Huntsville，AL)。
应该知道，虽然本文详述了构建包含化学反应性非天然氨基酸的载体和/或靶多肽变体的特定方法，例如利用甲基营养酵母菌中正交翻译系统，但它们无需视作限制性的。可利用，例如大肠杆菌、酿酒酵母、哺乳动物细胞等中的正交翻译系统构建包含第一反应性氨基酸的载体多肽变体和/或包含第二反应性氨基酸的靶多肽变体。此外，构建具有非天然氨基酸的载体和/或靶多肽的其它，例如非正交方法也包括在本文的许多实施方式中。下文进一步详述此类方法。
将非天然氨基酸直接掺入载体多肽和/或靶多肽的非正交方法
如上所述，在本发明的不同实施方式中，可通过直接掺入方法，例如正交翻译系统构建载体多肽和靶多肽或载体多肽和靶多肽变体(各自包含反应性非天然氨基酸，当与另一个中的非天然氨基酸反应时，形成稳定的载体多肽-靶多肽偶联物)。由于正交系统能高产率地产生正确折叠和翻译后修饰并含位点特异性掺入的非天然氨基酸的多肽，这代表了优选的实施方式。然而，还可采用其它策略将非天然氨基酸直接掺入多肽链以便将第一和第二非天然氨基酸分别引入载体多肽变体和/或靶多肽变体。应该知道，在本文的典型实施方式中，非天然氨基酸在多肽构建期间掺入载体和/或靶多肽，而不通过翻译后化学衍生加入。
例如，在一级构建期间将非天然氨基酸掺入，例如载体和/或靶多肽的一种通用体外生物合成方法利用无义或移码抑制型tRNA，其用所需非天然氨基酸作化学酰化，然后加入能支持蛋白质生物合成的提取物中，该提取物包含含有所需琥珀无义突变的基因。该方法已用于将超过100种非天然氨基酸位点特异性地掺入任何大小的各种蛋白质，可用于本文产生包含非天然氨基酸的载体和/或靶多肽变体。参见，例如Cornish等.(1995)“用扩展的遗传密码探究蛋白质结构和功能”(Probing Protein Structure andFunction with an Expanded Genetic Code)Angew Chem Int Ed Engl 34：621-633；Noren等.(1989)“将非天然蛋白质位点特异性掺入蛋白质的通用方法(A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acidsinto proteins)”Science 244：182-188；和Bain等.(1989)“将非天然氨基酸生物合成性位点特异性地掺入多肽(Biosynthetic site-specific incorporation of anon-natural amino acid into a polypeptide.)”JACS 111：8013-8014。
在其它实施方式中，非天然氨基酸可经化学合成直接掺入较小的载体和/或靶多肽(60-100个氨基酸)。固相肽合成是广泛用于化学合成含非天然氨基酸的肽和小蛋白的方法(参见如Merrifield(1963)《固相肽合成I，四肽合成》(Solid Phase Peptide synthesis.I.The synthesis of a tetrapeptide)JACS85：2149-2154)，可改进该方法以产生包含非天然氨基酸的载体和/或靶多肽，其可反应以产生稳定的偶联物。该技术通常包括两阶段：第一阶段固相肽合成(SPPS)包括在聚合支持物上通过反复的偶联-去保护循环，用受保护的氨基酸衍生物组装肽链。固相连接肽的游离N末端胺可与一个N-保护的氨基酸单位，例如非天然氨基酸偶联。然后将该单位去保护，暴露下一氨基酸可连接的新N-末端胺。虽然通常是通过分步方法合成肽，但可在各偶联步骤结束时通过过滤除去和洗去肽-固体支持物基质的所有可溶性试剂。在SPPS第二阶段，将肽从支持物上切割，并移除侧链保护基团以产生肽，如包含一个或多个非天然氨基酸的载体或靶多肽。固相肽合成主要采用两种形式：Fmoc(Carpino等，(1972)《9-芴甲氧酰氨基保护基团》(9-Fluorenylmethoxycarhonyl amino-protecting group)J Org Chem 37：3404-3409)，其中使用了碱不稳定的α-氨基保护基，以及t-Boc，其中使用了酸不稳定的α-氨基保护基。各方法涉及不同的树脂和氨基酸侧链保护以及后续切割/去保护步骤。肽合成的其它细节可参见以下出版物和其中引用的参考文献：Crick等.(1961)“蛋白质的遗传密码的通用性质(Generalnature of the genetic code for proteins.)”Nature 192：1227-1232；Hofmann等.(1966)“多肽的研究.XXXVI.吡唑-咪唑替代对S-肽片段的S-蛋白活化效力的影响1-3(Studies on Polypeptides.XXXVI.The Effect ofPyrazole-Imidazole Replacements on the S-Protein Activating Potency of anS-Peptide Fragment1-3.)”JACS 88：5914-5919；Kaiser等.(1989)“包括酶在内的生物活性肽和蛋白质的合成方法(Synthetic approaches to biologicallyactive peptides and proteins including enzymes.)”Acc Chem Res 22：47-54；Nakatsuka等.(1987)“半合成酶巯基枯草杆菌蛋白酶催化的肽区段合成(Peptide segment synthesis catalyzed by the semisynthetic enzymethiolsubtilisin.)”JACS 109：3808-3810；Schnolzer等.(1992)“通过接合未保护的合成肽：主链-工程改造HIV蛋白酶来构建蛋白质(Constructing proteinsby dovetailing unprotected synthetic peptides：backbone-engineered HIVprotease.)”Science 5054：221-225；Chaiken等.(1981)“半合成肽和蛋白质(Semisynthetic peptides and proteins.)”CRC Crit Rev Biochem 11：255-301；Offord(1987)“通过化学方法工程改造蛋白质？(Protein engineering bychemical means？)”Protein Eng 1：151-157；和Jackson等.“设计肽连接酶以便全合成含非天然催化残基的核糖核酸酶A(A designed peptide ligase fortotal synthesis of ribonuclease A with unnatural catalytic residues.)”Science5184：243-247。
可用于偶联载体多肽和靶多肽变体的化学偶联反应
目前用于化学偶联靶多肽变体(例如，治疗性小肽变体)与载体多肽变体的方法包括利用非特异性试剂，例如戊二醛或碳二亚胺活化的N-羟基琥珀酰亚胺酯，和防止载体多肽-载体多肽或靶多肽-靶多肽偶联物形成的高特异性异双功能交联剂。然而，此类试剂仅可用于化学修饰有限数量的氨基酸残基(例如，包含胺、酮、硫醇、巯基或羧基的氨基酸)。利用这些交联剂将载体多肽偶联于靶多肽可扰乱载体多肽、靶多肽或得到的载体-靶多肽偶联物的构象，因而降低偶联物的稳定性、生物学活性、药代动力学活性等。利用此类交联剂常导致载体多肽-靶多肽复合物的异质群体产生，这些异质群体难以分离，从而降低生产效率并使质量控制复杂。
相反，本发明偶联物是在正交偶联反应，例如下述任一化学连接反应中通过掺入载体多肽变体的第一非天然氨基酸(例如，利用甲基营养酵母菌细胞中的正交翻译系统)与掺入靶多肽变体的第二非天然氨基酸反应而产生。这些反应可根据合适的反应条件在体外或体内进行。由于仅有载体和靶多肽变体上存在的非天然氨基酸参与连接反应，本发明方法能可靠地用于高效产生充分确定的载体多肽-靶多肽偶联物的均质群体(例如，包含相同的化学计量和确定的连接位点)。由于各种化学反应性第一和第二非天然氨基酸可任选分别掺入载体和靶多肽变体，载体-靶多肽偶联物的产生不仅限于进行具体化学连接反应的那些条件，例如靶多肽变体、载体多肽变体或得到的载体-靶偶联物可能不稳定的条件。此外，现有技术有利地将非天然氨基酸掺入多肽的任何氨基酸位置。因此，载体和靶多肽中的第一和第二化学反应性非天然氨基酸位置的选择可分别任选根据，例如载体和靶多肽变体中非天然氨基酸位置的选择任选根据，例如置于该位置是否会改变，如载体多肽、靶多肽或所得载体-靶多肽偶联物的构象、生物学活性、药理学活性、稳定性、生物利用度或其它特性。
在下文详述的一个示范性但非限制性实例中，掺入HSA的对-乙酰基苯丙氨酸可通过肟连接与掺入ABT-510的ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸反应以产生血清半衰期延长的HSA-ABT-510偶联物。应该知道以下实施例中说明的不是本发明唯一的实施方式。从本文描述应该知道各种化学连接反应可用于偶联包含第一反应性非天然氨基酸的载体多肽与包含第二反应性非天然氨基酸的靶多肽，其中所述偶联使第一和第二非天然氨基酸反应。
在本发明的各种实施方式中，第一和第二非天然氨基酸任选通过以下反应中的一个或多个反应：亲电-亲核反应、肟连接、酮与亲核试剂反应、醛与亲核试剂反应、羰基和亲核试剂之间的反应、磺酰基和亲核试剂之间的反应、酯化反应、位阻酯基和亲核试剂之间的反应、硫酯基团和亲核试剂之间的反应、稳定的亚胺基和亲核试剂之间的反应、环氧基团和亲核试剂之间的反应、氮丙啶基团和亲核试剂之间的反应、亲电试剂和脂族胺或芳族胺之间的反应、亲电试剂和酰肼之间的反应、亲电试剂和碳酰肼之间的反应、亲电试剂和氨基脲之间的反应、亲电试剂和氨基硫脲之间的反应、亲电试剂和羰基酰肼之间的反应、亲电试剂和硫代羰基酰肼之间的反应、亲电试剂和磺酰基酰肼之间的反应、亲电试剂和卡巴肼之间的反应、亲电试剂和硫卡巴肼之间的反应、亲电试剂和羟胺之间的反应、亲核试剂或亲核试剂，例如羟基或二醇和硼酸或酯之间的反应、过渡金属催化的反应、钯催化的反应、铜催化的杂原子烷化反应、环加成反应、1，3环加成反应、2，3环加成反应、炔-叠氮化物反应、狄尔斯-阿德尔反应或铃木偶联反应。下文进一步详述了这些反应中的一些。
肟连接
首先在未保护多肽的化学选择性连接中采用肟连接以图产生结构受控的分子量大于10kD的合成大分子(Rose(1994)“同源人工蛋白质的便利合成(Facile Synthesis of Homogenous Artifcial Proteins.)”JACS 116：30-33)。在第一步中，制备携带醛基的纯化多肽和携带氨基氧基的第二纯化多肽。在第二步中，该两种多肽在非常温和的条件下通过形成肟键而自发性地自我装配。室温下，得到的肟在pH 2-7的水中稳定。
如以下实施例所述，通过在pH＜5，ABT-510变体中ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸残基的氨基氧基与HSA变体中对-乙酰基苯丙氨酸残基的酮基反应产生HSA-ABT-510偶联物。氨基氧基与酮基经历选择性肟连接以便将ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸共价连接于对-乙酰基苯丙氨酸，因而将HSA共价偶联于ABT-510。
1，3-偶极环加成反应
1，3-偶极环加成也称为“克里克(click)”化学反应，其是1，3-偶极和亲偶极试剂，例如取代的烯烃以形成5-元环。1，3-偶极环加成的一个有用实例是叠氮化物-炔烃胡氏环加成(Azide-Alkyne Huisgen Cycloaddition)，例如叠氮化物和末端或内部炔烃之间的1，3-偶极环加成得到1，2，3-三唑。该铜(I)-催化的反应是温和而极其有效的，无需保护基团，在许多情况中无需纯化(Rostovtsev等.(2002)“分步胡氏环加成过程：铜(I)-催化的叠氮化物和末端炔烃的区域选择性连接(A Stepwise Huisgen Cycloaddition Process：Copper(I)-Catalyzed Regioselective Ligation of Azides and TerminalAlkynes)”Angew Chem Int Ed 41：2596-2599)。由于该反应涉及环加成而非亲核取代，蛋白质修饰的选择性极高。向反应混合物中加入催化量的Cu(I)盐，该反应可在室温，水性条件下进行，区域选择性优秀(1，4＞1，5)。参见，例如Tornoe等.(2002)“固相上的肽三唑：区域特异性铜(i)-催化末端炔烃与叠氮化物的1，3-偶极环加成得到[1，2，3]-三唑(Peptidotriazoles on solid phase：[1，2，3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1，3-dipolar cycloadditionsof terminal alkynes to azides.)”J Org Chem 67：3057-3064；和Rostovtsev等.(2002)“分步胡氏环加成过程：铜(I)-催化的叠氮化物和末端炔烃的区域选择性连接”Angew Chem Int Ed 41：2596-2599。叠氮化物和炔官能团对生物学分子和水性环境具有较大惰性，从而能在偶联，例如载体多肽与靶多肽时采用叠氮化物-炔烃胡氏环加成。三唑与自然界发现的常见酰胺部分具有相似性，但与酰胺不同，其对切割不敏感。此外，三唑几乎不能氧化或还原。
铃木偶联反应
包含表面暴露的含芳基碘的非天然氨基酸的靶多肽变体(或载体多肽变体)可通过钯催化的铃木偶联共价连接于包含表面暴露的硼非天然氨基酸残基，例如对-硼苯丙氨酸、间-硼苯丙氨酸或邻-硼苯丙氨酸的载体多肽变体(或靶多肽变体)。为描述该化学反应，参见，例如Miyaura和Suzuki(1995)“有机硼化合物的钯-催化交叉偶联反应(Palladium-CatalyzedCross-Coupling Reactions of Organoboron Compounds)”Chemical Reviews 95：2457和Suzuki(1999)“有机硼衍生物与有机亲电试剂的交叉偶联反应的最新进展，1995-1998(Recent advances in the cross-coupling reactions oforganoboron derivatives with organic electrophiles，1995-1998)”Journal of  Organometallic Chemistry 576：147。芳基碘是在有机金属化学中有各种应用的反应性基团，包括硅烷化、氨基羰基化、Heck芳基化、乙烯化、与芳基乙炔交叉偶联和许多其它应用。在铃木偶联反应中利用非天然氨基酸的其它细节见2008年10月30日提交的美国专利申请号12/262,025，名为“遗传编码的硼酸氨基酸(A Genetically Encoded Boronate Amino Acid)”和2008年10月30提交的国际申请PCT/US2008/081868，名为“遗传编码的硼酸氨基酸(A Genetically Encoded Boronate Amino Acid)”。
铜-催化的杂原子烷基化反应
包含非天然氨基酸残基的靶多肽变体或载体多肽变体可参与铜催化的杂原子烷化反应(Chan等.(2003)“铜促进C---N和C---O键与苯基和吡啶基硼酸交叉偶联(Copper promoted C---N and C---O bond cross-coupling withphenyl and pyridylboronates).”Tetrahedron Letters 44：3863)。不对称还原(Huang等(2000)“衍生自L-a-氨基酸的手性氧氮杂硼啉酮催化苯乙酮与硼烷的不对称还原(Asymmetric reduction of acetophenone with boranecatalyzed by chiral oxazaborolidinone derived from L-a-amino acids).”Synthetic Communications 30：2423)、狄尔斯-阿德尔反应(Ishihara和Yamamoto(1999)“芳基硼化合物在有机合成转化中作为酸催化剂(Arylboron Compounds as Acid Catalysts in Organic SyntheticTransformations).”European Journal of Organic Chemistry 3：527-538)以及各种其它转化，其中所述非天然氨基酸包含硼酸基团。
还可利用载体或靶多肽变体表面上存在的硼非天然氨基酸残基与包含醇基团、二醇基团、氨基-醇或含二胺部分的相应靶或载体多肽变体上的非天然氨基酸残基形成可逆硼酯。例如，硼酸与二醇形成可逆共价复合物。该化学反应的早期描述可参见Lorand和Edwards(1959)“苯硼酸离子的多元醇复合物和结构(Polyol Complexes and Structure of the BenzeneboronateIon).”Journal of Organic Chemistry 24：769-774。还可与氨基醇(Springsteen等.(2001)“硼酸的光度传感器的开发(The Development of PhotometricSensors for Boronic Acids).”Bioorganic Chemistry 29：259-270)、氨基酸(Mohler和Czarnik(1994)“芳基硼酸的α-氨基酸螯合络合(Alpha-AminoAcid Chelative Complexation by an Arylboronic Acid).[CA119(17)：181171a中引用文件的勘误].”JACS 116：2233；Mohler和Czarnik(1993)“芳基硼酸的α-氨基酸螯合络合(Alpha-Amino Acid Chelative Complexation by anArylboronic Acid)”JACS 115：7037-7038)、醇盐(Cammidge和Crépy(2004)“采用不对称铃木反应合成手性联二萘(Synthesis of chiral binaphthalenesusing the asymmetric Suzuki reaction).”Tetrahedron 60：4377-4386)和羟肟酸(hydroxamic acid)(Lamandé等.(1980)“带有硼原子和超价磷原子的组合物的结构和酸性(Structure et acidite de composes a atome de bore et dephosphore hypercoordonnes)”Journal of Organometallic Chemistry 329：1-29)形成可逆复合物。在化学连接反应中利用硼氨基酸的其它细节可见2008年10月30日提交的美国专利申请号12/262,025，名为“遗传编码的硼酸氨基酸”；2008年10月30提交的国际申请PCT/US2008/081868，名为“遗传编码的硼酸氨基酸”；和其中引用的参考文献。
[2+3]环加成反应
在某些实施方式中，包含第一非天然氨基酸的载体多肽变体可通过[2+3]环加成偶联于包含第二非天然氨基酸的靶多肽变体。在一个实施方式中，所述第一非天然氨基酸包含炔基或叠氮基部分，所述第二非天然氨基酸包含叠氮基或炔基部分。例如，所述第一非天然氨基酸包含炔基部分(例如，在非天然氨基酸对-炔丙基氧基苯丙氨酸)，所述第二非天然氨基酸包含叠氮基部分。在另一实例中，所述第一非天然氨基酸包含叠氮基部分(例如，在非天然氨基酸对-叠氮基-L-苯丙氨酸中)，所述第二非天然氨基酸包含炔基部分。在[2+3]环加成反应中利用非天然氨基酸描述于2004年4月4日提交的美国专利申请号10/826,919，名为“非天然反应性氨基酸遗传密码添加(Unnatural Reactive Amino Acid Genetic Code Additions)”。
亲电-亲核反应
在一些实施方式中，掺入载体多肽变体(或靶多肽变体)的非天然氨基酸中存在的一个反应性基团是亲电部分，掺入靶多肽变体(或载体多肽变体)的第二非天然氨基酸中存在的反应性基团是亲核部分。本领域技术人员已知与亲核部分反应形成共价键的合适亲电部分。此类亲电部分包括但不限于：例如，羰基、巯基、醛基、酮基、位阻酯基、硫酯基、稳定的亚胺基、环氧基团、氮丙啶基团等。
亲核和亲电试剂之间的反应产物通常包含原始存在于，例如亲核部分中的原子。在一些实施方式中，根据所用的亲核部分和与亲核部分反应的亲电部分(例如，醛、酮等)，亲电试剂是与亲核部分(反应)的醛或酮，包括反应产物，例如肟、酰胺、腙、还原的腙、碳腙(carbohydrazone)、硫代碳腙(thiocarbohydrazone)、磺酰基腙(sufonylhydrazone)、氨基脲、氨基硫脲或类似的官能团。与羧酸的连接通常称为碳酰肼或羟肟酸。与磺酸连接通常称为磺基酰肼或N-磺酰基羟胺。随后可通过化学还原稳定得到的连接键。
本领域技术人员已知可与醛和酮反应形成共价键的合适亲核部分。此类亲核部分包括但不限于：脂族胺或芳族胺，例如乙二胺。在其它实施方式中，非天然氨基酸可包含反应性基团，例如-NR1-NH2(酰肼)、-NR1(C＝O)NR2NH2(氨基脲)、-NR1(C＝S)NR2NH2(氨基硫脲)、-(C＝O)NR1NH2(羰基酰肼)、-(C＝S)NR1NH2(硫代羰基酰肼)、-(SO2)NR1NH2(磺酰基酰肼)、-NR1NR2(C＝O)NR3NH2(卡巴肼)、-NR1NR2(C＝S)NR3NH2(硫代卡巴肼)、或-O-NH2(羟胺)，其中R1、R2和R3各自独立为H或具有1-6个碳的烷基，优选H。在本发明的一方面，反应性基团是酰肼、羟胺、碳酰肼或磺酰基酰肼。
本发明还可采用其它反应性化学反应，包括但不限于：施陶丁格连接(Staudinger ligation)和烯烃复分解化学反应(参见，例如Mahal等.(1997)“通过寡糖生物合成工程改造细胞表面的化学反应性(Engineering ChemicalReactivity on Cell Surfaces Through Oligosaccharide Biosynthesis).”Science276：1125-1128)。许多其它偶联化学反应也适用，可根据待掺入载体和靶多肽的非天然氨基酸而采用。本领域技术人员熟知此类反应，进一步的细节描述于，例如Dawson等.(1994)“通过天然化学连接合成蛋白质(Synthesis ofProteins by Native Chemical Ligation).”Science 266：776-779；Lemieux等.(1998)“蛋白质、寡糖和细胞的化学选择性连接反应(Chemoselective ligationreactions with proteins，oligosaccharides and cells).”TIBS 16：506-513；Knipe，Chris.《有机反应机制，2004》(Organic Reaction Mechanisms，2004.)纽约：Wiley，2004；等等。
药物组合物及其给药
本发明的载体多肽-靶多肽偶联物任选用于治疗应用，例如与合适的药物载体组合。此类组合物包含，例如治疗有效量的偶联物和药学上可接受的载体或赋形剂。此类载体或赋形剂包括但不限于：盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或它们的组合。将制剂制备成适合给药方式。给予蛋白质的方法通常是本领域熟知的，可应用于本发明偶联物的给予。
可根据本领域熟知的方法，任选在一种或多种合适的体外和/或体内疾病动物模型中检验包含一种或多种本发明载体多肽-靶多肽偶联物的治疗性组合物以确认效力、组织代谢和/或预测剂量。具体地说，首先可通过(比较)本文非天然(蛋白)与未偶联靶蛋白的活性、稳定性或其它合适的手段(例如，比较载体多肽-靶多肽偶联物，如HSA-TSP-1偶联物(或HSA-ABT-510偶联物)与未偶联于HSA且不含任何非天然氨基酸的TSP(或ABT-510))来测定剂量，即，采用相关试验。
通过常规用于使分子最终接触血液或组织细胞的任何途径给药。可采用任何合适方式给予本发明的载体-肽/靶多肽偶联物，任选与一种或多种药学上可接受的载体一起。就本发明而言，有将此类偶联物给予患者的合适方法可用，虽然可利用多种途径给予具体的组合物，但某一特定途径提供的作用或反应常能比另一途径更快捷和有效。
药学上可接受的载体部分由所给予的具体组合物以及给予该组合物所采用的具体方法决定。因此，本发明药物组合物有各种合适的制剂。本领域熟知药学上可接受的载体和赋形剂，可通过熟知的方法将一种或多种本发明偶联物配制成药物组合物(参见，例如《雷明顿：药学科学和实践》(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，第21版，A.R.Gennaro编.，马克出版公司(Mack Publishing Company)(2005)；《肽和蛋白质的药物制剂开发》(Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins)，S.Frokjaer和L.Hovgaard编.，Taylor & Francis(2000)；和《药物赋形剂手册》(Handbook of Pharmaceutical Excipients)，第3版，A.Kibbe编.，药学出版社(Pharmaceutical Press)(2000))。
可通过各种途径给予本发明的载体多肽-靶多肽偶联物，包括但不限于：口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、经皮、皮下、局部、舌下或直肠方式。还可经脂质体给予载体多肽-靶多肽偶联物。本领域技术人员通常知晓此类给药途径和适当的制剂。
还可将单独的或与其它合适组分组合的本发明偶联物制成气溶胶制剂(即，它们可“喷雾”)以便经吸入给药。可将气溶胶制剂置于加压的可接受推进剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气，等等。
适合胃肠外，例如通过关节内(关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径给药的制剂包括水性和非水性、等渗无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得制剂与所需受者的血液等渗的溶质，还包括水性和非水性无菌悬液，其可含有悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。包装核酸的制剂可存在于单剂量或多剂量的密封容器中，例如安瓿和小瓶。
胃肠外给药和静脉内给药是优选的给药方法。具体地说，早已用于载体多肽-靶多肽偶联物治疗剂的给药途径以及目前使用的制剂为本发明偶联物提供优选的给药途径和制剂。
就本发明而言，根据具体应用，给予患者的剂量足以在一段时间内在患者中实现有益的治疗反应，或者，例如抑制病原体的感染、降低或阻止疾病状态的症状，或其它合适的活性。剂量取决于具体组合物/制剂的效力和所用载体多肽-靶多肽偶联物的活性、稳定性或血清半衰期和患者的情况以及待治疗患者的体重或表面积。剂量的大小还取决于特定患者中给予具体组合物/制剂相伴的任何不利副作用是否存在、其性质和程度，等等。
确定待给予组合物/制剂的疾病(例如，癌症、遗传疾病、糖尿病、AIDS等)治疗或预防有效量时，医师评估循环血浆水平、制剂毒性、疾病的进展和/或抗非天然氨基酸多肽抗体的产生，如果相关的话。
给予，例如70公斤患者的剂量范围通常与目前采用的治疗性蛋白质的剂量相等，并为相关载体多肽-靶多肽偶联物的改变活性或血清半衰期作调整。本发明的组合物/制剂可通过任何已知的常规治疗补充治疗条件，包括给予抗体、给予疫苗、给予细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物学应答修饰剂等。
对于给药，本发明偶联物制剂的给药速度由相关制剂的LD-50和/或观察到在各种浓度下(例如适用于患者的体重和总体健康)载体多肽-靶多肽偶联物的任何副作用决定。可通过一次剂量或分份剂量实现给药。制备可给予组合物的通用方法是本领域技术人员已知的，详述于，例如《雷明顿：药学科学和实践》，第21版，A.R.Gennaro编.，马克出版公司(2005)。
如果输注包含本发明一种或多种偶联物的制剂的患者产生发热、寒颤或肌肉疼痛，他/她接受合适剂量的阿司匹林、布洛芬、对乙酰氨基酚或其它镇痛/退烧药物。经历输注反应，例如发热、肌肉疼痛和寒颤的患者在将来的输注之前30分钟用阿司匹林、对乙酰氨基酚，或者，例如苯海拉明预先给药。哌替啶用于对退热药和抗组胺不快速起反应的更严重寒颤和肌肉疼痛。根据反应的严重程度减缓或停止治疗。
各种对象受益于本发明提供的载体多肽-靶多肽偶联物所提供的治疗性治疗和/或预防性治疗。可给予人和此类动物，包括但不限于：家畜，如牛、猪、山羊、绵羊、鸡和/或其它一般农业动物包含本文所述偶联物的组合物和制剂。一般的家养宠物，如猫、狗、鹦鹉、长尾鹦鹉也受益于给予治疗性或预防性载体多肽-靶多肽偶联物。
关于生物医学测试和兽医治疗中应用动物模型和动物对象的更多细节见，例如Ng，Chow和Ogden编《在生物医学研究中使用动物：研究者入门》(Using Animal Models in Biomedical Research：A Primer for theInvestigator)，第一版，新加坡，世界科学出版公司，2008(Singapore：WorldScientific Publishing Company，2008)；Conn编《生物医学研究模型原始资料》(Sourcebook of Models for Biomedical Research.)斯普林格出版公司，新泽西州托托瓦(Totowa，NJ：Springer)，2008；Woodhead编，《生物医学研究中的非哺乳动物模型(第一卷)》(Nonmammalian Animal Models forBiomedical Research (Vol 1))，纽约：科学出版社，1990(New York：AcademicPress，1990)。还参见Adams等，《兽医药理学和治疗，第八版》(VeterinaryPharmacology and Therapeutics.Eighth Edition)，美国：韦理-布莱克维尔(USA：Wiley-Blackwell)，2001；Kahn和Line编.《默克兽医手册：第九版》(Merck Veterinary Manual.Ninth Edition)，美国：默克(USA：Merck)，2005；及其所引文献。
本发明提供的载体多肽-靶多肽偶联物不仅可给予以治疗对象，如人中的疾病状态，还可以进行疗效测试，以及代谢测试，毒理学测试和具体测试以确定载体肽-靶多肽偶联物对生殖功能的影响或胚胎毒性，或确定其致癌潜能。进行这些观察性研究能将本发明偶联物给予各种动物对象。本领域技术人员非常熟悉多种医学测试和测量，从而有助于选择给予包含本发明偶联物的组合物/制剂的动物对象。此类动物对象包括但不限于；如哺乳动物，如山羊、绵羊、骆驼、牛、猪、兔、马、仓鼠、非人灵长类(猴，包括猕猴、狒狒、旧大陆猴和黑猩猩)、豚鼠、大鼠、小鼠和/或猫。鸟类，如家禽(鸡、火鸡)、澳洲鹦鹉、鹦鹉目的鸟和笼养鸟和/或鸟舍鸟，以及鸟类胚胎，也可用于本发明提供的载体多肽-靶多肽偶联物的研究和开发，生产，质控或安全性测试。
鱼类，如斑马鱼、新月鱼和剑尾鱼；两栖类，包括如青蛙、蝾螈；和爬行类(蛇，蜥蜴和龟)也可以用于各种测试以确定本文所述组合物和/或其给药方法的安全性，有效剂量和/或毒理学特性。参见，例如Barry等(2002)，《爬行动物、两栖动物、鱼类和头足类生物医学研究的应用的信息资源》(Information Resources for Reptiles，Amphibians，Fish，and Cephalopods Usedin Biomedical Research)，美国农业部国家农业图书馆动物福利信息中心(United States Department of Agriculture National Agricultural Library AnimalWelfare Information Center)，及其所引文献。
试剂盒和厂商文件
试剂盒也是本发明的一个特征。例如，试剂盒可任选装有本发明提供的任一或多种载体多肽-靶多肽偶联物。或者，试剂盒可装有合成包含第一化学反应性非天然氨基酸的载体多肽变体和/或包含第二化学反应性非天然氨基酸的靶多肽变体，例如治疗性小肽的试剂。此类试剂可包括，例如反应性非天然氨基酸，包含适合产生含非天然氨基酸的载体多肽和/或靶多肽变体的正交翻译系统组分的宿主细胞，例如甲基营养酵母菌细胞，进行连接反应以产生本发明偶联物的溶液，产生包含一种或多种本发明偶联物的治疗制剂的试剂，培养基，等等。本发明试剂盒可装有其它组分，例如指导以下应用的使用说明书，构建表达包含非天然氨基酸的载体多肽和/或靶多肽的甲基营养酵母菌株，进行化学连接反应以产生载体多肽-靶多肽偶联物，等等。试剂盒可装有容纳试剂盒组分的容器，实施本文的任何方法或任何方法组合的使用说明材料，利用试剂盒提供的细胞(例如，甲基营养酵母细胞)产生在所选氨基酸位置包含化学反应性非天然氨基酸的感兴趣载体和/或靶多肽的使用说明书。
实施例
提供以下实施例是为说明而非限制本发明。应理解，本文所述的实施方式只是为了说明，本领域技术人员应了解据此作出的各种改进或改变，它们包括在本申请的构思和范围以及所附权利要求书的范围内。
扩展甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母的遗传库
为增加含非天然氨基酸的蛋白质诱变的应用，在甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中开发了重组表达系统。将以前在酿酒酵母中开发的非天然氨基酸特异性氨酰基-tRNA合成酶/抑制型tRNA(aaRS/tRNACUA)配对插入真核转录控制元件之间并稳定地掺入巴斯德毕赤酵母基因组。大肠杆菌酪氨酰-和亮氨酰-RS/tRNACUA配对均显示在巴斯德毕赤酵母中正交，二者用于对琥珀密码子起反应而高产率和保真度地掺入8种非天然氨基酸。一个实例显示包含酮氨基酸(对-乙酰基苯丙氨酸)(图6b，结构1)的重组人血清白蛋白突变体可在该系统内有效表达，并通过肟连接选择性偶联于含ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸残基的治疗性肽模拟物。此外，通过调控aaRS水平系统性优化甲基营养酵母菌中的非天然氨基酸表达，从而在摇瓶中表达突变型人血清白蛋白超过150mg/L，比酿酒酵母中报道的高一个数量级。该方法应能高产率地产生含非天然氨基酸的复杂蛋白质，其表达在现有系统中不现实。
最近开发的方法能在原核和真核生物中遗传编码具有新特性的各种非天然氨基酸(包括荧光团、金属离子螯合剂、光束缚和光交联基团、NMR、结晶和IR探针及翻译后修饰的氨基酸)(Xie和Schultz(2006)“蛋白质的化学工具包—扩展的遗传密码(A chemical toolkit for proteins--an expandedgenetic code).”Nat Rev Mol Cell Biol 7：775-782；Chin等.(2003)“扩展的真核遗传密码(An expanded eukaryotic genetic code).”Science 301：964-967；Wang等.(2006)“扩展遗传密码(Expanding the genetic code).”Annu RevBiophys Biomol Struct 35：225-249)。通过开发正交氨酰基-tRNA合成酶/抑制型tRNA(aaRS/tRNACUA)配对实现这点，该配对设计成对无义或移框密码子起反应而选择性插入所需非天然氨基酸。迄今为止，该方法已用于将超过40种非天然氨基酸加入大肠杆菌、酿酒酵母和几种哺乳动物细胞谱系的遗传库(Chin等.(2003)“扩展的真核遗传密码”Science 301：964-967；Wang等.(2006)“扩展遗传密码”Annu Rev Biophys Biomol Struct 35：225-249；Liu等.(2007)“在哺乳动物细胞中将非天然氨基酸遗传掺入的蛋白质(Geneticincorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells).”NatMethods 4：239-244)。通过将正交aaRS/tRNACUA配对及不同tRNA身份元件移植入宿主生物体来实现这些系统的正交性，从而宿主氨酰化机器与植入的aaRS/tRNA配对之间不发生交叉氨酰化(但仍维持翻译功能)。在目前的系统中，已经证明在大肠杆菌中利用衍生自詹氏甲烷球菌酪氨酰-RS/tRNACUA配对的aaRS/tRNACUA配对(Wang等.(2001)“产生正交tRNA的通用方法(A general approach for the generation of orthogonal tRNAs).”Chem Biol 8：883-890)和在酿酒酵母(Chin等.(2003)“扩展的真核遗传密码(An expanded eukaryotic genetic code).”Science 301：964-967；Chin等.(2003)“扩展的真核遗传密码的进展(Progress toward an expanded eukaryotic geneticcode.)”Chem Biol 10：511-519)或哺乳动物细胞(Liu等.(2007)“在哺乳动物细胞中将非天然氨基酸遗传掺入的蛋白质.”Nat Methods 4：239-244)中的大肠杆菌酪氨酰-或亮氨酰-RS/tRNACUA配对最成功。然后采用定向进化改变正交aaRS的特异性，从而其能识别感兴趣的非天然氨基酸而非内源性氨基酸。
为将该方法应用于产生细菌宿主中不易表达的大量蛋白质，需要成本低、可扩展并能产生复杂的、翻译后修饰蛋白质的重组系统。一种此类宿主是巴斯德毕赤酵母，其能产生哺乳动物蛋白，而其产率与大肠杆菌的相当(Cereghino等.(2000)“甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的异源蛋白质表达(Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichiapastoris).”FEMS Microbiol Rev 24：45-66)。治疗性蛋白，例如肿瘤坏死因子(TNF)、破伤风毒素片段C(TTC)和人血清白蛋白(HSA)在高密度发酵中的表达水平＞10g L-1(Shekhar(2008)“毕赤酵母的能力：印度生物技术工业让非常规的酵母菌工作(Pichia power：India’s biotech industry putsunconventional yeast to work).”Chem Biol 15：201-202；Clare等.(1991)“在含有多个串联整合基因的巴斯德毕赤酵母菌株中高水平表达破伤风毒素片段C(High-level expression of tetanus toxin fragment C in Pichia pastorisstrains containing multiple tandem integrations of the gene).”Biotechnology(纽约)9：455-460；Ohya等.(2005)“通过反复分批补料发酵在甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母中优化人血清白蛋白产生(Optimization of human serumalbumin production in methylotrophic yeast Pichia pastoris by repeatedfed-batch fermentation).”Biotechnol Bioeng 90：876-887；Sreekrishna等.(1989)“在甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母中合成的重组人肿瘤坏死因子的高水平表达、纯化和表征(High-level expression，purification，andcharacterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized in themethylotrophic yeast Pichia pastoris).”Biochemistry 28：4117-4125)。巴斯德毕赤酵母以此类产率产生蛋白质的能力归因于其醇氧化酶1启动子(PAOX1)，其是已知最高度调节和最强的启动子(Cos等.(2006)“不同启动子下在甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中异源蛋白质产生的操控策略、监测和控制：综述(Operational strategies，monitoring and control of heterologousprotein production in the methylotrophic yeast Pichia pastoris under differentpromoters：a review).”Microb Cell Fact 5：17)。此外，巴斯德毕赤酵母缺乏可污染大肠杆菌中表达的治疗性蛋白的内毒素，还不会像酿酒酵母那样产生抗原性α1，3聚糖连接键(Cregg等.(1993)“在巴斯德毕赤酵母中表达外来基因的最新进展(Recent advances in the expression of foreign genes inPichia pastoris).”Biotechnology(纽约)11：905-910)。另外，现在能调节巴斯德毕赤酵母中的糖基化模式，包括控制唾液酸化(Li等.(2006)“在糖基工程改造巴斯德毕赤酵母中优化人源化IgG(Optimization of humanized IgGsin glycoengineered Pichia pastoris).”Nat Biotechnol 24：210-215)。出于这些原因，我们开发了在巴斯德毕赤酵母中遗传编码非天然氨基酸的方法。我们在此报道了八种非天然氨基酸位点特异性地引入在该宿主中高产率和保真度地表达的重组人血清白蛋白(rHSA)。
材料
用于进行本文所述实验的DNA引物(例如，表1和下文所列那些)购自加利福尼亚州圣迭戈的整合DNA技术公司(Integrated DNA Technology，SanDiego，CA)。用于制备下述构建物的限制性酶购自马萨诸塞州贝弗利的新英格兰实验室(New England Biolabs，Beverly，MA)。pPIC3.5k载体(其图谱见http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/ppic3.5kpao_man.pdf)和酵母菌感受态、转化方案和培养基处方购自加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA)。多拷贝毕赤酵母表达试剂盒F型手册(Invitrogen Life，T.，Vol.K1750-01，Edn.F 85(英杰生命技术公司(InvitrogenLife Technologies)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州92008；2005))见http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/pichmulti_man.pdf。DNA在大肠杆菌DH10B(英杰公司)中扩增或者利用铂pfx(英杰公司)通过PCR扩增。rHSA基因(登录号BC034023)获自马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院的哺乳动物基因保藏所(Mammalian Gene Collection，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD)。DNA测序确认所有DNA构建物(诺华研究基金会基因组研究院(Genomics Institute of the Novartis Research Foundation)，拉霍亚，加利福尼亚州)。双重营养缺陷型巴斯德毕赤酵母菌株，GS200(his4，arg4)和pBLARG载体由加利福尼亚州克莱尔蒙特科克研究院的詹姆斯克莱格实验室(James Cregg laboratory at the Keck Graduate Institute，Claremont，CA)馈赠。利用纽约州罗切斯特费氏科学公司(Fisher Scientific，Rochester，NY)的2和1mm电穿孔小杯对加利福尼亚州赫拉克勒斯BR公司(Bio-Rad，Hercules，CA)的GenePulser Xcell进行巴斯德毕赤酵母和大肠杆菌的转化。用于蛋白质分析的Tris-甘氨酸(4-20％)SDS-PAGE凝胶购自英杰公司。通过英杰公司的Purelink miRNA分离试剂盒或得克萨斯州奥斯汀安比昂公司(Ambion，Austin，TX)的Ribo-纯-酵母试剂盒随附的技术方案和试剂收集RNA。利用加利福尼亚州圣何塞Adobe公司(Adobe，San Jose，CA)的Photoshop CS2测定所有反应性凝胶条带密度。
设计两种基因盒表达系统
由于自主复制质粒在巴斯德毕赤酵母中相对不稳定(Higgins等.(1998)“巴斯德毕赤酵母介绍(Introduction to Pichia pastoris.)”Methods Mol Biol103：1-15)，设计了一种系统，其中感兴趣的靶基因(例如，rHSA)和aaRS/tRNACUA配对在两个不同质粒的盒中编码并稳定整合入基因组。图1提供用于构建巴斯德毕赤酵母中琥珀型抑制的盒的载体。白色箭头标明各质粒的可选择标记物。黑色箭头标明复制起点。竖直条纹箭头标明启动子和转录终止元件。双重营养缺陷型巴斯德毕赤酵母菌株GS200(arg4，his4)用作蛋白质表达的宿主菌株，感兴趣的基因，例如HSA掺入商品化购得的pPIC3.5k质粒(HIS4，GenR)(图1a)(Invitrogen Life，T.，Vol.K1750-01，Edn.F 85(英杰生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州92008；2005))。
rHSA因其在产生增强短命治疗性多肽的血清半衰期的融合蛋白或肽生物偶联物中的应用而用作模型蛋白(Kim等.(2003)“胰高血糖素-样肽1-白蛋白偶联物的开发和表征：体内活化胰高血糖素-样肽1受体的能力(Development and characterization of a glucagon-like peptide 1-albuminconjugate：the ability to activate the glucagon-like peptide 1 receptor in vivo).”Diabetes 52：751-759；Huang等.(2008)“巴斯德毕赤酵母中表达的新型艾赛那肽-4人血清白蛋白融合蛋白的制备和表征(Preparation andcharacterization of a novel exendin-4 human serum albumin fusion proteinexpressed in Pichia pastoris).”J Pept Sci 14：588-595；Chuang等.(2002)“利用重组人血清白蛋白的药学方案(Pharmaceutical strategies utilizingrecombinant human serum albumin).”Pharm Res 19：569-577)。rHSA因为复杂的蛋白质二硫键而不能在大肠杆菌和酿酒酵母中表达。然而，能在巴斯德毕赤酵母中进行此类翻译后修饰。此外，HSA的24氨基酸的哺乳动物“前-原(pre-pro)”前导序列(图1e)与在巴斯德毕赤酵母中表达完全相容并能将成熟的蛋白质运送入培养基(Kobayashi(2006)“重组人血清白蛋白开发综述(Summary of recombinant human serum albumin development).”Biologicals34：55-59)。前-原前导肽在运输期间切割以产生成熟的蛋白质(例如，rHSAE37X)。相对于SEQ ID NO：1，rHSA中第37个残基表示对琥珀密码子起反应而掺入的非天然氨基酸。
首先制备编码能用于转化GS200的rHSA野生型和rHSAE37X的序列组件。制备以下pPIC3.5K-rHSA(野生型rHSA)构建物：野生型rHSA基因得自哺乳动物基因保藏所(NIH)，基因登录号BC034023。为与pPIC3.5k线性化(Invitrogen Life，T.，Vol.K1750-01，Edn.F 85(英杰生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州92008；2005))相容，通过改进的斯特拉塔基因公司快变诱变(Quik Change mutagenesis，Stratagene)方案(Zheng等.(2004)“有效的一步位点定向和位点饱和诱变方案(An efficient one-step site-directed andsite-saturation mutagenesis protocol).”Nucleic Acids Res 32：e115)，利用以下引物(IDT)除去rHSA的BglII位点以产生rHSA野生型：用于BglII781的-BglII 1F，5’-GAC AGA CCT TAC CAA AGT CCA CAC GGA ATG CTG CCA TG-3’和-BglII 1R，5’-GGT AAG GTC TGT CAC TAA CTT GGA AAC TTC TGCAAA CTC AGC TTT GGG-3’，和用于BglII817的BglII 2F，5’-CAT GGA GACCTG CTT GAA TGT GCT GAT GAC AGG GCG G-3’和-BglII 2R，5’-CAAGCA GGT CTC CAT GGC AGC ATT CCG TGT GGA C-3’。利用以下引物扩增rHSA野生型：HSA正向，5’-ATC CGA GGA TCC AAA CGA TGA AGT GGGTAA CCT TTA TTT CCC TTC TTT TTC-3’和HSA反向，5’-GCT AAC GAATTC ATT ATA AGC CTA AGG CAG CTT GAC TTG CAG C-3’，用EcoRI和BamHI(NEB)消化，连接入类似消化的pPIC3.5k载体(英杰公司，载体图谱见http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/ppic3.5kpao_man.pdf)以产生pPIC3.5k-rHSA野生型(或pPIC3.5k-rHSAE37X，如下所述)。通过DNA测序验证构建物，在大肠杆菌DH10B(英杰公司)中扩增。
通过PCR诱变产生Glu37TAG突变型rHSA(rHSAE37X)构建物。采用改进的快变诱变方案和以下引物用琥珀型密码子TAG替代Glu37密码子：Glu37F’，5’-GAT TGC CTT TGC TCA GTA TCT TCA GCA GTG TCC ATTTTA GGA TCA T-3’和Glu37 R’，5’-GTT TTT GCA AAT TCA GTT ACTTCA TTC ACT AAT TTT ACA TGA TCC TAA AAT GG-3’。Glu37处于溶液可接近的螺旋中，如此应有助于肽与引入该位点的化学反应性非天然氨基酸(即，对-乙酰基苯丙氨酸，图6b，结构1)偶联，并确保较大基团的掺入对天然蛋白质结构和折叠的破坏尽量低。然后利用以下引物扩增rHSAE37X：HSA正向，5’-ATC CGA GGA TCC AAA CGA TGA AGT GGG TAA CCTTTA TTT CCC TTC TTT TTC-3’和HSA反向，5’-GCT AAC GAA TTC ATTATA AGC CTA AGG CAG CTT GAC TTG CAG C-3’，用EcoRI和BamHI(NEB)消化并连接入类似消化的pPIC3.5k载体，如以上HSA野生型所述，从而将HSAE37X置于AOX1启动子和终止子的转录控制下。如上所述，通过DNA测序验证rHSAE37X构建物，pPIC3.5k-rHSAE37X。
在5’AOX1启动子线性化pPIC3.5k-rHSAE37X或pPIC3.5k-rHSA野生型能基因组整合一个或多个拷贝的转化盒；通常多个拷贝导致靶蛋白的总产率较高(Buckholz等.(1991)“商品化生产异源蛋白的酵母系统(Yeast systemsfor the commercial production of heterologous proteins).”Biotechnology(N Y)9：1067-1072)。以此方式整合使得AOX1完整，从而保留酵母快速利用甲醇的能力(Mut+表型)。或者，可对AOX1基因任一侧作线性化进行基因替代，从而由pPIC3.5k载体(Invitrogen Life，T.，Vol.K1750-01，Edn.F 85(英杰生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州92008；2005))替代AOX1基因。缺乏AOX1的酵母利用甲醇依赖较弱的AOX2基因，它们的表型是muts。由于通常利用muts酵母进行rHSA表达(Kupcsulik等.(2005)“通过产生HSA的巴斯德毕赤酵母Mut(S)菌株的统计学和正常动力学模型描述来优化特定产物形成速率(Optimization of specific product formation rate by statisticaland formal kinetic model descriptions of an HSA producing Pichia pastorisMut(S)strain).”Chem Biochem Eng Q 19：99-108)，pPIC3.5k HSAE37X和pPIC3.5k-rHSA野生型经线性化并用于替代AOX1基因以产生GS200-rHSAE37X或GS200-rHSA野生型(两种菌株均是HIS4，arg4，GenR，muts)。成功的转化体在缺乏组氨酸的极限培养基平板和含有最多0.25mg/ml氨基糖苷类抗生素Geneticin
Figure BPA00001422440500611
的富集培养基平板上正常生长。
为用pPIC3.5k HSAE37X或pPIC3.5k-rHSA野生型序列组件转化GS200，用BglII(NEB)线性化20μg pPIC3.5k-rHSAE37X或pPIC3.5k-rHSA野生型，通过乙醇沉淀浓缩至10μl，在2mm电穿孔小杯(费氏公司(Fisher))中加入80μl新鲜的感受态GS200，用GenePulser Xcell(BR公司)以巴斯德毕赤酵母设置(2000V，25μF，200Ω)作电穿孔。用1ml冷的1M山梨醇回收细胞。将250μl回收的细胞接种在补加了4mg ml-1L-精氨酸(arg)的再生右旋糖Bacto琼脂(RDB)平板(15cm)上，30℃温育。3天后，将菌落挑入含1ml酵母蛋白胨右旋糖(YPD)培养基的96孔2ml板块(Nunc)，生长过夜(29.2℃，300r.p.m.)。培养液作1∶1000稀释，将1-2μl等份试样接种于含有0.25mg ml-1 Geneticin
Figure BPA00001422440500612
(英杰公司)的YPD琼脂板，30℃温育。4天后，GS200-rHSAE37X转化体G3显示生长良好，挑取并制成感受态。还挑取显示生长良好的GS200-rHSA野生型克隆。
为将正交aaRS/tRNACUA配对是否整合入基因组，改进以前为优化酿酒酵母中琥珀型抑制和重组过表达而开发的
Figure BPA00001422440500613
载体(Chen等.(2007)“在酿酒酵母中产生和分析含非天然氨基酸的突变型蛋白质的改进系统(An improved system for the generation and analysis ofmutant proteins containing unnatural amino acids in Saccharomycescerevisiae).”J Mol Biol 371：112-122)(图1b)。将以前在酿酒酵母中开发的对-乙酰基苯丙氨酸-(pApa，图6b，结构1)特异性氨酰基-tRNA合成酶(pApaRS)(Zhang等.(2003)“蛋白质的体内位点特异性修饰的新方案(A newstrategy for the site-specific modification of proteins in vivo).”Biochemistry42，6735-6746)插入醇脱氢酶1启动子(PADH1)和含His6-标签的终止子(TADH1)之间以检验其表达。
为制备aaRS/tRNACUA配对以供整合入巴斯德毕赤酵母基因组，用以下引物通过PCR扩增含有pApaRS的载体(Chen等.(2007)“在酿酒酵母中产生和分析含非天然氨基酸的突变型蛋白质的改进系统”J Mol Biol 371：112-122)，从而排除了TRP和2μ起点区，加入限制性位点KpnI和HindIII：pESC F，5’-TAC CAC TAG AAG CTT GGA GAAAAT ACC GCA TCA GGA AAT TGT AAA CGT-3’和pESC R，5’-GTG AGGGCA GGT ACC GTT CTG TAA AAA TGC AGC TCA GAT TCT TTG TTTG-3’，用HindIII和KpnI(NEB)消化。用以下引物扩增pBLARG(加利福尼亚州克莱尔蒙特科克研究院的詹姆斯克莱格实验室馈赠)的ARG4编码区：ARG4F新，5’-AAA TAT GGT ACC TGC CCT CAC GGT GGT TACGGT-3’和ARG4 R新，5’-CAT TTC AAG CTT CTA GTG GTA GGA ATTCTG TAC CGG TTT AC-3’，用KpnI和HindIII消化，连接入类似消化的
Figure BPA00001422440500622
PCR产物以产生重组真核ARG4载体，pREAV-PADH1-pApaRS。利用以下引物通过PCR扩增pREAV-PADH1-pApaRS，从而排除了PADH1-pApaRS-TADH1区域，加入限制性位点AscI和AflII：pESC-AOX-KETO(酮)F，5’-ATC GTA CTT AAG GAA AGC GTA CTCAAA CAG ACA ACC ATT TCC-3’和pESC-AOX-KETO R，5’-TTC TCAGGC GCG CCA TCG CCC TTC CCA ACA GTT GCG-3’。通过尺寸作图和测序验证构建物。
将缺乏5’CCA的相关大肠杆菌
Figure BPA00001422440500623
作为三串联重复插入磷酸甘油酸酯激酶1启动子(PPGK1)之后。如前所述(Chen等.(2007)“在酿酒酵母中产生和分析含非天然氨基酸的突变型蛋白质的改进系统”J Mol Biol 371：112-122)，为促进转录后加工，tRNA侧接酵母抑制型tRNA基因，SUP4的区域。真核下游加工加入tRNA功能所需的5’CCA。精氨基琥珀酸裂合酶(ARG4)编码区替代
Figure BPA00001422440500631
的2μ起点和磷酸核糖基邻氨基苯甲酸异构酶(TRP)标记得到重组真核ARG4载体(pREAV-PADH1-pApaRS)(图1c)。该盒的扩增仅在基因组掺入下可能，因为其缺乏复制的真核起点。采用上述方案，利用感受态G3(例如，感受态GS200-rHSAE37X转化体)作转化以产生GS200-rHSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS，除了将回收的细胞接种在缺乏L-组氨酸和精氨酸的RDB平板上。3天后，将菌落挑入96孔2ml板块，如上所述再筛选对0.25mg ml-1Geneticin
Figure BPA00001422440500632
的耐受性。以相同方式产生GS200-rHSA野生型/pREAVPADH1-pApaRS(HIS4，ARG4，GenR，muts)以分离菌落F2。因此，在ARG4编码区线性化pREAV-PADH1-pApaRS，随后转化入GS200-HSAE37X和GS200-HSA野生型分别得到完全原养型巴斯德毕赤酵母GS200-HSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS和GS200-HSA野生型/pREAV-PADH1-pApaRS菌株。(两种菌株均是HIS4，ARG4，GenR，muts)。
巴斯德毕赤酵母的琥珀型抑制
所有蛋白质表达实验遵循多拷贝毕赤酵母表达试剂盒(Invitrogen Life，T.，Vol.K1750-01，Edn.F 85(英杰生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州92008；2005))中的muts方案。从含有0.25mg ml-1 Geneticin
Figure BPA00001422440500633
的平板挑取GS200-rHSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS或GS200-rHSA野生型/pREAV-PADH1-pApaRS的14个克隆，在10ml缓冲甘油复合培养基(BMGY)(29.2℃，300r.p.m.)中生长至接近饱和(OD600≈12-18)。1500g(10分钟)离心培养液，重悬在含2mM pApa氨基酸的2ml缓冲甲醇复合培养基(BMMY)(伊利诺斯州德斯·普雷恩城SC公司(SynChem，Des Plaines，IL))。继续生长6天，每24小时补充甲醇至0.5％。每24小时加入200μl(10％培养体积)培养基或无菌水以弥补蒸发。每24小时取出50μl培养基，通过3000g离心(5分钟)沉淀细胞。将25μl澄清的培养基加入12.5μl SDS加样缓冲液，95℃加热1分钟，用SDS-PAGE凝胶(英杰公司)作电泳(150V 1小时)。
琥珀型抑制仅发生在用甲醇和pApa氨基酸(pApa AA)培养的含载体酵母中。在甲醇诱导条件下生长2-3天后，通过考马斯染色(40％甲醇，10％乙酸，50％水，0.1％(w/v)考马斯亮蓝R250(SA公司(Sigma-Aldrich)))在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)凝胶上观察到从GS200-HSA野生型/pREAV-PADH1-pApaRS分离的克隆产生全长rHSAWT(66.5kDa)。6天后rHSA野生型的表达出现峰值。GS200-rHSA野生型/pREAV-PADH1-pApaRS的克隆F2-wt显示表达最高，其用于进一步比较。相反，当用甲醇作为主要碳源并添加了pApa氨基酸培养6天后，GS200-HSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS的克隆未能产生全长rHSAE37pApa。参见，例如图2b；泳道2是GS200；泳道3是GS200-HSAE37X；泳道4是GS200-pREAV-PAOX1-pApaRS；泳道5-7是GS200-HSAE37X/pREAV-PAOX1-pApaRS；和泳道8是GS200-HSA野生型/pREAV-PADH1-pApaRS。
通过基因组PCR验证所有构建物的基因组整合(图7；从一次转化选择4个克隆并标记为1-4)。预计的PCR产物是rHSA(1851bp)、pApaRS(1317bp)和tRNA盒(1100bp)。克隆2中缺乏pApaRA扩增可能是技术假象。图2a的下部凝胶描述了为检验酿酒酵母+pPR1-PPGK1-3SUP4-tRNA(泳道1)和巴斯德毕赤酵母+pREAV-PADH1-pApaRS(泳道2)中tRNACUA表达而进行的northern印迹结果。对于阴性对照，泳道3和4是分别是缺乏载体的酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母菌株。图2a的上部凝胶显示了内源性丝氨酸tRNA的northern印迹，说明所有样品中相等的miRNA制备。
简言之，如下所示进行northern印迹以验证tRNACUA的转录：在各自的表达条件下培养两个巴斯德毕赤酵母克隆，G3-2和GS200及两个酿酒酵母克隆，SCY4-pPR1-PPGK1+2SUP4-tRNA和SCY4，收获微小RNA(miRNA)。将各样品的2μg RNA加载到两份6％Novex TBE-尿素凝胶(英杰公司)上，180V下电泳1小时。利用XCell surelock mini-cell(英杰公司)、0.5x TBE缓冲液(英杰公司)和随附的方案将RNA转移至Biodyne B尼龙膜(帕尔生命科学公司(Pall Life Science))。膜与UV Stratalinker 2400(加利福尼亚州拉霍亚斯特拉塔基因公司)自发交联。用伊利诺斯州洛克福特皮尔斯公司(Pierce，Rockford，IL)的North2South化学发光杂交和检测试剂盒的方案和试剂进行杂交和检测。一条印迹与tRNAser的特异性生物素化探针温育；tRNAser cere 1，5’-/5Biosg/CAT TTC AAG ACT GTC GCC TTA ACC ACTCGG CCA T-3’，tRNAser cere 2，5’-/5Biosg/GAA CCA GCG CGG GCA GAGCCC AAC ACA TTT CAA G-3’，tRNAser pich 1，5’-/5Biosg/CTG CAT CCTTCG CCT TAA CCA CTC GGC CAT CGT A-3’，tRNAser pich 2，5’-/5Biosg/ACA CGA GCA GGG TTC GAA CCT GCG CGG GCA GAGC-3’，第二条印迹与
Figure BPA00001422440500651
的特异性生物素化探针温育：tRNA 5’biot，5’-/5Biosg/GGA AGG ATT CGA ACC TTC GAA GTC GAT GAC GG-3’ andtRNA 3’biot，5’-/5Biosg/TCT GCT CCC TTT GGC CGC TCG GGA ACCCCA CC-3’。探针在55℃温育过夜，与链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)偶联物结合，用鲁米诺/增强剂-稳定的过氧化物溶液(皮尔斯公司)检测(图2a)。通过条带密度测定tRNA相对量。通过northern印迹分析，图2的结果表明巴斯德毕赤酵母+pREAV-PADH1-pApaRS中tRNACUA的转录是酿酒酵母中同一盒的约1.5倍(图2a)。
虽然有这些结果，GS200-HSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS菌株中His6x-标签的蛋白质印迹未检测到pApaRS(图8)。一次转化检验4个不同的克隆。这些结果表明缺乏琥珀型抑制与pApaRS掺入水平低相关。(如本文它处所述进行蛋白质印迹)。
为解决pApaRS表达低，修饰pREAV以便用强效PAOX1启动子驱动pApaRS表达，通过给pApaRS基因的5’端加入Kozak共有序列(ACCATGG)进一步增强pApaRS表达(Kozak(1990)“下游二级结构有助于真核核糖体识别起始密码子(Downstream secondary structure facilitates recognition ofinitiator codons by eukaryotic ribosomes).”Proc Natl Acad Sci U S A 87：8301-8305)。最终构建物pREAV-PAOX1-pApaRS中，ADH1终止子(TADH1)也被AOX1终止子(TAOX1)替代(图1d)。为产生pREAV-PAOX1-pApaRS，从pPIC3.5k获得AOX1启动子和终止子序列。用以下引物扩增pApaRS：KETO-Koz-F，5’-TTC TGA GAA TTC ACC ATG GCA AGC AGT AAC TTGATT AAA CAA TTG C-3’和KetoRS R 6xHis，5’-TAG GCT CGG CCG CTTAGT GGT GGT GGT GGT GGT GTT TCC AGC AAA TCA GAC AGT AATTCT TTT TAC-3’，用EcoRI和NotI(NEB)消化，连接入类似消化的pPIC3.5k以产生pPIC3.5k-pApaRS。用以下引物从pPIC3.5k-pApaRS扩增PAOX1-pApaRS-TAOX1编码区：pPIC-keto AOX5 F，5’-ATC GTA CTT AAGAGA TCT AAC ATC CAA AGA CGA AAG GTT GAA TGA AAC-3’和pPIC-keto AOXTT R，5’-TGC ACA GGC GCG CCA AGC TTG CAC AAACGA ACT TCT CAC TTA ATC TTC-3’，用AscI和AflII(NEB)消化，连接入类似消化的pREAV-PADH1-pApaRS PCR产物以产生pREAV-PAOX1-pApaRS。如上所述，通过尺寸作图和测序验证构建物。
通过将pREAV-PAOX1-pApaRS转化入GS200来构建GS200-pREAV-PAOX1-pApaRS(his4，ARG4，GenR，muts)菌株，但接种在补充了4mg ml-1组氨酸的RDB平板上，不进一步筛选Geneticin
Figure BPA00001422440500661
耐受性。采用上述方案，用感受态G3(例如，GS200-rHSAE37X)转化以产生GS200-rHSAE37X/pREAV-PAOX1-pApaRS(HIS4，ARG4，GenR，muts)，除了将回收的细胞接种在缺乏L-组氨酸(His)和Arg的RDB平板上。该转化的克隆仅在甲醇和pApa氨基酸存在下产生全长rHSAE37pApa，其水平约为10-20％相同克隆含有rHSA野生型。甲醇诱导后2-3天，通过SDS-PAGE观察蛋白质，每24小时补充甲醇至0.5％，表达6天后达到峰值(图2b)。缺乏pREAV盒、pPIC3.5k盒、甲醇补充或pApa氨基酸的酵母未能产生可由考马斯染色检测的蛋白质。没有pApa氨基酸存在下蛋白质不表达表明
Figure BPA00001422440500662
配对与内源性氨酰化元件之间不发生交叉氨酰化。胰蛋白酶消化物，LC-MS/MS证实pApa位点特异性地掺入rHSAE37X(图2c)。pApa(图2c中以E*表示)掺入成熟rHSAE37pApa的残基37处。观察到的片段离子系列无疑支持这一取代。
为表达足够的rHSAE37pApa蛋白以便进行LC-MS/MS分析，改进上述蛋白质表达分析条件。简言之，将1L BMGY接种于YPD配制的20ml饱和的G3-2培养液，培养至(约24小时，29.2℃，300r.p.m.)至OD600≈12-18。以1500g离心培养液，重悬在补加了10％BMMY和2mM pApa的200ml缓冲极限甲醇(BMM)。培养6天后(29.2℃，300r.p.m.甲醇和体积补加)，以3000g离心培养液，弃去细胞，将上清液流过马萨诸塞州比尔里卡密理博公司(Milipore，Billerica，MA)的0.22μm滤器。4℃加入NH4SO4并缓慢搅拌至50％饱和(58.2g)进行硫酸铵(NH4SO)沉淀上清液，20,000g离心20分钟，再加入NH4SO4至75％饱和(31.8g)，20,000g离心20分钟。第二次沉淀中含有rHSAE37pApa，将其重悬在FPLC缓冲液A(25mM Tris-HCl，25mM氯化钠，1mM EDTA，1x蛋白酶抑制剂混合物(瑞士巴塞尔的罗氏公司((Roche，Basel，CH)))，pH＝8.5)中。利用AKTA纯化仪FPLC(AB公司(Amersham Biosciences)，皮斯卡塔韦，新泽西州)，MonoQ 5/5柱(GE保健公司(GE Healthcare))纯化(20-35％缓冲液B(缓冲液A+1M NaCl)洗脱)重新溶解的蛋白质。用SDS-PAGE凝胶分析诸馏分，合并，用30MWCO透析盒(皮尔斯公司)以PBS透析，利用AKTA纯化仪FPLC，Superdex 20010/300GL(GE保健公司)纯化(14分钟后洗脱，PBS，0.5毫升/分钟)。SDS-PAGE凝胶分析诸馏分，合并，用Dynamax HPLC(蓝尼公司(Rainin)，奥克兰)，C8Vydac HPLC柱(300mm，
Figure BPA00001422440500671
5μm，格雷丝公司(Grace))纯化(水配制的40-46％MeCN，0.1％TFA洗脱)。SDS-PAGE凝胶分析诸馏分，含rHSAE37pApa的组分快速冷冻并冻干成白色粉末。以相似方式纯化F2-野生型(wt)的rHSA野生型。
还原条件下(10mM TCEP，1M盐酸胍，100mM盐酸三乙醇胺，pH＝7.8)，用胰蛋白酶消化纯化的rHSAE37X过夜，以便进行胰蛋白酶消化和纳米-RP LC-MS/MS。利用Sep-Pak，C18(沃特斯公司(Waters)，米尔福德，马萨诸塞州)，通过反相固相提取来纯化消化物并冻干。冻干的肽与过氧甲酸(9份浓甲酸+1份30％H2O2)在冰上温育1小时将半胱氨酸氧化成磺基丙氨酸，将甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸砜(Matthiesen等.(2004)“利用过氧甲酸氧化扩大胰蛋白酶肽的质量分布(Use of performic acid oxidation to expand themass distribution of tryptic peptides).”Analytical chemistry 76，6848-6852)。加入过量的巯基乙醇并用水作20倍稀释来猝灭反应。用装配了纽约州罗彻斯特热电公司的LTQ Orbitrap杂交质谱仪(LTQ Orbitrap hybrid massspectrometer，ThermoElectron，Rochester，NY)的加利福尼亚州圣克拉拉安捷仑技术公司(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)的HPLC系统进行纳米-RP LC-MS/MS。将胰蛋白酶消化物以约2微升/分钟的流速加载到通气柱设置的预柱上(4cm，100μm i.d.，5μm，Monitor C18，伊利诺斯州芝加哥柱工程公司(Column Engineering))(Licklider等.(2002)“具有通气柱的纳米级毛细管液相色谱-串联质谱法的自动化(Automation of nanoscalemicrocapillary liquid chromatography-tandem mass spectrometry with a ventedcolumn).”Analytical chemistry 74：3076-3083)。10分钟的加载/洗涤期间后，将预柱在线切换为分析柱(10cm，75μm i.d.，5μm C18)开始梯度洗脱。层析曲线是100％溶剂A(0.1％水性乙酸)到50％溶剂B(乙腈配制的0.1％乙酸)，40分钟，约100纳升/分钟。按照前10方案(top 10scheme)进行数据依赖性MS/MS采集，其中质谱仪编程为首先记录高分辨率Orbitrap扫描(m/z500-2,000)，然后是10次数据-依赖性MS/MS扫描(相对碰撞能量＝35％；3Da分离窗)。利用MASCOT(矩阵科学公司(Matrixscience)，伦敦，英国)检索SwissProt 51.6数据库的原始数据进行蛋白质鉴定，其中pApa作为变量修饰(variable modification)。
优化表达
为优化rHSAE37pApa表达，通过将pPIC3.5k-rHSAE37X插入AOX1基因座的5’区(这样保留了AOX1基因的完整性)来产生GS200-rHSAE37X/pREAV-PAOX1-pApaRS(HIS4，ARG4，GenR)快速甲醇利用(Mut+)突变株。以此方式插入基因组可导致多聚化，从而产生Gen
Figure BPA00001422440500681
耐受性标记和感兴趣基因的串联拷贝(Cereghino等.(2000)“甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的异源蛋白质表达(Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichiapastoris).”FEMS Microbiol Rev 24：45-66)。为产生GS200-rHSAE37X/pREAV-PAOX1-pApaRS(HIS4，ARG4，GenR，Mut+)，用SacI或SalI(NEB)线性化20μgpPIC3.5k-rHSAE37X并转化入新鲜的感受态GS200，如前所述。用1ml冷的1M山梨醇回收细胞，接种在补加了0.4mg ml-1精氨酸的RDB平板上。将菌落挑入含1ml YPD的2ml 96孔板块，培养至饱和(29.2℃，300r.p.m.)，作1∶100稀释，将等份试样接种于含有0-3.0mg ml-1 Geneticin
Figure BPA00001422440500682
的平板上。将在最高1.0mg ml-1 Geneticin
Figure BPA00001422440500683
下存活的克隆1D12制成感受态，如前所述用pREAV-PAOX1-pApaRS转化，接种在缺乏Arg和His的RDB平板上。将菌落挑入含1ml 96孔板块，培养至饱和，作1∶100稀释，在Geneticin
Figure BPA00001422440500691
1.0mg ml-1平板上再筛选。挑取14个存活的克隆，检验有pApa氨基酸和甲醇存在下的rHSAE37pApa表达。采用上述muts方案。克隆K5显示蛋白质表达最高，将其在测试表达中与G3-2比较(图9)。用SDS-PAGE凝胶分析GS200-rHSAE37X/pREAV-PAOX1-pApaRS(mut+)培养液(图9，泳道1)和GS200-rHSAE37X/pREAV-PAOX1-pApaRS(mutS)培养液(图9，泳道2)的25μl澄清培养液，作考马斯染色。得到的K5克隆显示耐受最高1.0mg/ml的Geneticin
Figure BPA00001422440500692
，而上述muts克隆G3-2在0.25mg/ml Geneticin
Figure BPA00001422440500693
以上死亡，这与多拷贝表达盒的掺入一致(Cereghino等.(2000)“甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的异源蛋白质表达(Heterologous protein expression in themethylotrophic yeast Pichia pastoris).”FEMS Microbiol Rev 24：45-66；英杰生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州92008；2005)。分析有甲醇和pApa氨基酸存在下分离克隆的全长rHSAE37pApa表达显示产生的蛋白质是相应muts同等物的约1.5-2.0倍(图9)。通过条带密度测定蛋白质的相对量。
为进一步增加rHSAE37pApa的产量，比较6个不同启动子(包括PAOX1)驱动pREAV载体中pApaRS转录的能力。检验转录物mRNA水平、pApaRS蛋白质水平和rHSAE37pApa总产量。根据与甲醇诱导的相容性选择衍生自酵母菌，GTP结合蛋白I(YPT1)(Sears等.(1998)“巴斯德毕赤酵母中组成型和调控基因表达的一套通用载体(A versatile set of vectors for constitutiveand regulated gene expression in Pichia pastoris).”Yeast 14：783-790；Segev等.(1988)“酵母菌GTP-结合YPT1蛋白和哺乳动物对等物与分泌机制相关(Theyeast GTP-binding YPT1 protein and a mammalian counterpart are associatedwith the secretion machinery).”Cell 52：915-924)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)(Cos等.(2006)“甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中在不同启动子控制下异源蛋白产生的操作策略、监测和控制：综述(Operational strategies，monitoring and control of heterologous protein production in themethylotrophic yeast Pichia pastoris under different promoters：a review).”Microb Cell Fact 5：17；Waterham等.(1997)“巴斯德毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的分离及其启动子的调节和使用(Isolation of the Pichia pastorisglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and use of itspromoter).”Gene 186：37-44)的两种组成型启动子；衍生自醇氧化酶II(AOX2)(Ohi等.(1994)“巴斯德毕赤酵母AOX2基因中甲醇调节的正和负顺式作用元件(The positive and negative cis-acting elements for methanolregulation in the Pichia pastoris AOX2 gene).”Mol Gen Genet 243：489-499)、甲醛脱氢酶I(FLD1)(Cos等.(2006)“甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中在不同启动子控制下异源蛋白产生的操作策略、监测和控制：综述”MicrobCell Fact 5：17)和异柠檬酸裂合酶I(ICL1)(Cos等.(2006)“甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中在不同启动子控制下异源蛋白产生的操作策略、监测和控制：综述”Microb Cell Fact 5：17)的三种甲醇诱导型启动子。利用截短的PAOX2，其通过删除两个阻遏结合序列之一而增强该启动子(Ohi等.(1994)“巴斯德毕赤酵母AOX2基因中甲醇调节的正和负顺式作用元件.”Mol GenGenet 243：489-499)。在合成酶的过度产生对于酵母菌有毒性，或者隔离细胞能量使之不能产生rHSAE37X的情况中可利用较弱的PYPT1和PGAP启动子(Sears等.(1998)“巴斯德毕赤酵母中组成型和调控基因表达的一套通用载体.”Yeast 14：783-790)。
通过PCR扩增巴斯德毕赤酵母基因组DNA的所有启动子连同它们的5’非翻译区(图10)。分别利用以下引物，通过PCR扩增基因组DNA(巴斯德毕赤酵母GS200)的PAOX2、PYPT1、PICL1、PFLD1和PGAP：PAOX2 F，5’-GTATCG CTT AAG TCC AAG ATA GGC TAT TTT TGT CGC ATA AAT TTTTGT C-3’和PAOX2 R，5’-CGT TAG CCA TGG TTT TCT CAG TTG ATTTGT TTG TGG GGA TTT AGT AAG TCG-3’；PYPT1 F，5’-GTA TCG CTTAAG CAT ATG ATG AGT CAC AAT CTG CTT CCA CAG ACG AG-3’和PYPT1 R，5’-CGT TAG CCA TGG GAC TGC TAT TAT CTC TGT GTG TATGTG TGT ATT GGG C-3’；PICL1 F，5’-GTA TCG CTT AAG GAA TTC GGACAA ATG TGC TGT TCC GGT AGC TTG-3’和PICL1 R，5’-CGT TAG CCATGG TCT TGA TAT ACT TGA TAC TGT GTT CTT TGA ATT GAA AG-3’；PFLD1 F，5’-GTA TCG CTT AAG GCA TGC AGG AAT CTC TGG CACGGT GCT AAT GG-3’和PFLD1 R，5’-CGT TAG CCA TGG TGT GAA TATCAA GAA TTG TAT GAA CAA GCA AAG TTG G-3’；PGAP1 F，5’-GTATCG CTT AAG GGA TCC TTT TTT GTA GAA ATG TCT TGG TGT CCTCGT C-3’和PGAP1 R，5’-CGT TAG CCA TGG TGT GTT TTG ATA GTTGTT CAA TTG ATT GAA ATA GGG AC-3’。图10显示溴化乙锭染色的凝胶与1kb+标准样侧接PCR产物。PCR产物的预计长度为：PAOX2 342bp，PYPT1 508bp，PICL1 683bp，PFLD1 597bp和PGAP 493bp。用AflII和NcoI(NEB)消化PCR扩增片段，并连接入类似消化的pREAV-PAOX1-pApaRS(通过琼脂糖凝胶纯化除去P-AOX2编码区后)以产生pREAV-P启动子-pApaRS。
序列证实后，将各启动子克隆入pApaRS的pREAV载体5’(端)以替代PAOX1，并将其转化入以前产生的Mut+GS200-HSAE37X。终止子保留TAOX1。图3a提供pREAV-PPromoter-pApaRS的线性图谱，说明启动子区域可变。PCR扩增基因组DNA的启动子(如结果示于图7的实验)。用AatII线性化质粒(如同以前描述的构建物pREAV-PAOX1-pApaRS)，转化入新鲜的感受态GS200-rHSAE37X(克隆1D12)，接种于如前所述缺乏Arg和His的RDB平板以产生GS200-rHSAE37X/pREAV-PPromoter-pApaRS(HIS4，ARG4，GenR，Mut+)。在0.75和1.0mg ml-1下筛选存活克隆的Geneticin耐受性。将对应于各启动子的48个克隆挑取入含BMGY的1ml 96孔板块，培养至饱和(29.2℃，24小时，300r.p.m.)。1500g离心饱和培养液10分钟，将细胞重悬在200μL BMMY+2mM pApa氨基酸。6天后(29.2℃，300r.p.m.，含补样)，3000g离心澄清培养液10分钟，利用96孔点样工具将1-2μL澄清的培养液点样在0.45微米硝酸纤维素膜(BR公司)。采用标准蛋白质印迹技术(Burnette(1981)“蛋白质印迹：将蛋白质从十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶转移至未修饰的硝酸纤维素并用抗体和放射性碘标记的A蛋白的X射线照相检测(Western blotting：electrophoretic transfer of proteins from sodiumdodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose andradiographic detection with antibody and radioiodinated protein A).”AnalBiochem 112：195-203)，用HSA抗体[1A9]HRP偶联物(阿比康公司(Abcam))探测膜，用ECL HRP化学发光检测试剂和方案(GE保健公司)检测。选择对应于各启动子的两个表达最高的克隆(AOX2：A6和B7；YPT1：D11和B7；ICL1：E5和H3；FLD1：E11和F3；GAP：B7和B10；和AOX1：E3和E7)作平行测试表达(图3和4)。
甲醇诱导6天后，通过northern和蛋白质印迹监测P-启动子-pApaRS表达水平并与PAOX1-pApaRS比较(图3b)。由于巴斯德毕赤酵母固有的表达差异，选择两个克隆作蛋白质印迹分析。用甲醇作为主要碳源培养pREAV-P启动子-pApaRS每次转化GS200-rHSAE37X的两个克隆6天，裂解，用SDS-PAGE凝胶分离(图3b，上部凝胶)。考马斯染色凝胶以验证等量加载。通过蛋白质印迹分析裂解物的pApaRs-His6x(图3b，下部凝胶)。
为进行蛋白质印迹，在测试表达条件下培养克隆AOX2：A6和B7；YPT1：D11和B7；ICL1：E5和H3；FLD1：E11和F3；GAP：B7和B10；和AOX1：E3和E7，沉淀(3000g，10分钟)，用2ml YeastBuster(新泽西州吉布斯城的诺瓦金公司(Novagen，Gibbstown，NJ))+10mM β-巯基乙醇和完全蛋白酶抑制剂混合片剂(罗氏)裂解。以20,000g澄清样品，将15μl裂解液在4-20％SDS-PAGE凝胶上电泳(1∶15小时，150V)。利用转印迹SD半干转移室(BR公司)，在Tobin转移缓冲液(24mM tris碱，192mM甘氨酸，20％乙醇)(2小时，20V，100mAmp)中将蛋白质转移至0.45微米硝酸纤维素膜(BR公司)。考马斯染色凝胶上残留的蛋白质(图3b，上图)以确保等量加载。采用标准蛋白质印迹技术(Burnette(1981)“蛋白质印迹：将蛋白质从十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶转移至未修饰的硝酸纤维素并用抗体和放射性碘标记的A蛋白的X射线照相检测.”Anal Biochem 112：195-203)，用抗His6x-HRP偶联抗体(SA公司)印迹膜，用ECL(GE保健公司)HRP化学发光检测试剂和方案检测(图3b，下图)。通过条带密度测定相对表达率。
在mRNA水平，PFLD1驱动pApaRS转录比PAOX1高4倍，产生的pApaRS蛋白多5倍。PGAP、PYPT1、PICL1和PAOX2均显示pApaRS表达低于PFLD1。与该结果一致的是，PFLD1-pApa的总琥珀型抑制最高，其中通过检测进入培养基的rHSAE37pApa表达(图4)。如图4所示，各启动子系统的两个克隆用甲醇作为主要碳源和pApa氨基酸独立培养6天。用变性SDS-PAGE凝胶对25μl澄清的培养液作电泳，考马斯染色。通过条带密度和BSA对照计算rHSA野生型(泳道15)为351.6mg 1-1。根据密度，PFLD1(取泳道9和10的平均值)表达最多43％的蛋白质或151.2mg l-1。最高产量是＞150mg/l或rHSA野生型的约43％(352mg/l)(图11)。图11是图4的柱状图，显示rHSAE37pApa中琥珀型抑制与启动子驱动pApaRS产生的函数关系。根据图4所示SDS-PAGE凝胶上考马斯条带密度测定蛋白质产量。如下所述定量测定图4中的rHSA野生型蛋白：对25μl BSA标准品或测试蛋白质表达的未纯化rHSA野生型培养液进行SDS-PAGE凝胶电泳(参见图12)。泳道7是rHSA野生 型测试蛋白质表达培养液的1∶1稀释液。对BSA标准品条带密度(泳道2-5)作图，并作线性拟合。rHSA野生型条带(2x泳道7和泳道8)的密度平均为83.33或351.55mg/ml。非天然蛋白质的产量(其它图中的rHSAE37X)测定为相同rHSA野生型样品的百分比。
通过northern印迹分析在图3b中产生最多蛋白质的克隆的pApaRSmRNA转录(图3c，下部凝胶)。为进行northern印迹，在测试表达条件下培养表达最高的克隆AOX2，B7；YPT1，D11；ICL1，H3；FLD1，E11；GAP，B7；和AOX1，E36天。收集3x 108个细胞(2.5ml，OD600＝1.0)，通过RiboPure-酵母试剂盒(安变公司(Ambion))试剂和方法分离总RNA。将13μg各RNA样品加载到2％甲醛凝胶(2％琼脂糖，20mM MOPS，8mM乙酸钠，2.2mM甲醛，pH＝7.0)上。加载前，将3体积的NorthernMax甲醛加载染料(安变公司)与1体积RNA混合，加热至65℃，15分钟，先在冰上冷却5分钟，再上样。对凝胶进行电泳(50V，2小时)，通过18S和28SrRNA的溴化乙啶染色证实等量加载和RNA完整性(图3c，上图)。通过标准印迹设备，在10x SSC缓冲液(1.5M氯化钠，0.15M柠檬酸钠pH＝7.0)中将RNA吸到Biodyne B尼龙膜(帕尔生命科学公司)上。用2x SSC缓冲液清洗膜两次，干燥并用斯特拉塔基因公司的UV Stratalinker 2400自交联。采用皮尔斯公司的North2South化学发光杂交和检测试剂盒的方案和试剂进行杂交和检测。简言之，55℃，温育400-500μg生物素化探针过夜：ketoRS3生物素5’/5Biosg/TGA GAC GCT GCT TAA CCG CTT C-3’和ketoRS4生物素5’/5Biosg/TAA AGA AGT ATT CAG GAT CGG ACT G-3’，结合链霉亲和素-HRP偶联物，用鲁米诺/增强剂-稳定的过氧化物溶液(皮尔斯公司)检测(图3c，下图)。通过条带密度测定mRNA相对滴度。
肟连接于rHSA E37pApa
为证明这种修饰的rHSA能用作生物活性肽的载体，在rHSAE37pApa的唯一酮侧链和抗血管生成性肽ABT-510之间进行肟连接(图5)。该连接反应的示意图见图5a。ABT-510肽具有ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸作为第六残基。如下文进一步描述的，37℃下温育75μM rHSAE37pApa(图5a，上部反应)与2.25mM肽过夜形成肟连接键。相同条件下用rHSA野生型(图5a，下部反应)没有反应发生。该血小板反应蛋白-1(TSP-1)裂解素1型重复模拟物在人中显示强效的抗肿瘤活性，但通过静脉内给予时会被肾脏快速清除(Hoekstra等.(2005)“晚期癌症患者中血小板反应蛋白-1-模拟血管生成抑制剂ABT-510的I期安全、药代动力学和药效学研究(Phase I safety，pharmacokinetic，and pharmacodynamic study of thethrombospondin-1-mimetic angiogenesis inhibitor ABT-510 in patients withadvanced cancer).”J Clin Oncol 23：5188-5197；Yang等.(2007)“联用血小板反应蛋白-1肽ABT-510与丙戊酸是成神经细胞瘤的有效抗血管生成策略(Thrombospondin-1 peptide ABT-510 combined with valproic acid is aneffective anti-angiogenesis strategy in neuroblastoma).”Cancer Res 67：1716-1724；Reiher等.(2002)“血小板反应蛋白-1肽模拟物的全身性处理抑制肿瘤生长(Inhibition of tumor growth by systemic treatment withthrombospondin-1 peptide mimetics).”Int J Cancer 98：682-689)。合成以独特ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸UAA替代第6L-正缬氨酸残基的9氨基酸肽模拟物(安娜斯派克公司(Anaspec)，圣何塞，加利福尼亚州)。该肽的序列为：Ac-Sar-Gly-Val-D-aloIle-Thr-Lys(Aoa)-Ile-Arg-Pro-NEt MW＝1097.3Da)。根据TSP-1的已知结构-活性关系，在该位置进行修饰估计不会显著改变生物学活性(Haviv等.(2005)“血管生成和肿瘤生长的血小板反应蛋白-1模拟肽抑制剂：药代动力学和生物学活性的设计、合成和优化(Thrombospondin-1 mimetic peptide inhibitors of angiogenesis and tumorgrowth：design，synthesis，and optimization of pharmacokinetics and biologicalactivities).”J Med Chem 48：2838-2846)。为进行肟连接，将2.25mM(0.5mg)肽加入200μl肟连接缓冲液(1.5M氯化钠，500mM乙酸钠，pH＝4.4)中的75μM rHSAE37pApa或rHSA野生型(1.0mg)，37℃温育过夜。pH＜5时，氨基氧基与pApa的酮基经历选择性肟连接从而将ABT-510肽共价连接于rHSAE37pApa的残基37(图5a，上部反应)。用Dynamax HPLC(蓝尼公司)，C8 Vydac HPLC柱(300mm，
Figure BPA00001422440500751
5μm，格雷丝公司)纯化(水配制的40-46％乙腈洗脱，0.1％)反应体系。收集诸馏分，合并，通过考马斯染色SDS-PAGE凝胶分析。利用装有芥子酸基质的线性MALDI-TOF MS BiflexIII(马萨诸塞州比尔里卡BD公司(Burker Daltonics))仪器进行基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱法来检测完整蛋白质的质量和验证该肽衍生rHSAE37pApa的程度(图5b)。用该蛋白质处理前后rHSA野生型的质量改变可忽略，表明在相同条件下用氨基-氧基修饰的ABT-510肽处理rHSA野生型(残基37处的谷氨酸)时，MALDI质谱法未观察到偶联。
利用rHSA野生型+肽和rHSAE37pApa+肽之间的质量差异由于E37pApa突变而低60Da(905Da减去60Da＝845Da))测定连接效率(约77％)。以前的偶联方案利用苯胺催化剂进行有效连接(Dirksen等.(2006)“肟连接的亲核催化(Nucleophilic catalysis of oxime ligation).”Angew Chem Int Ed Engl45：7581-7584；Dirksen等.(2006)“腙形成和转移的亲核催化：涉及动态共价化学反应(Nucleophilic catalysis of hydrazone formation and transimination：implications for dynamic covalent chemistry).”J Am Chem Soc 128：15602-15603)；然而，在不利用苯胺而利用75μM rHSAE37pApa和三倍过量肽的过夜反应中，肟偶联于rHSAE37pApa的产率约为77％。
将8种UAA加入遗传库
为说明该新产生的重组表达系统的通用性，将酿酒酵母方法开发的非天然aaRS插入pREAV-PFLD1。图6a提供含大肠杆菌酪氨酰-RS基因(aaRS)和酪氨酰抑制型tRNA盒(tRNACUA)的优化pREAV-PFLD1载体的示意图。将对-苯甲酰苯丙氨酸(pBpa，光交联剂，图6b，结构3，Chin等.(2003)“扩增的真核遗传密码(An expanded eukaryotic genetic code).“Science 301：964-967)、对-叠氮基苯丙氨酸(pAzapa，光交联剂，化学反应性，图6b，结构4，Deiters等.(2003)“将具有新型反应性的氨基酸加入酿酒酵母的遗传密码(Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code ofSaccharomyces cerevisiae).”J Am Chem Soc 125：11782-11783)、对-(炔丙基氧基)苯丙氨酸(pPpa，化学反应性，图6b，结构5，Deiters等.(2003)“将具有新型反应性的氨基酸加入酿酒酵母的遗传密码”J Am Chem Soc 125：11782-11783)、对-甲氧基苯丙氨酸(pMpa，结构/功能探针，图6b，结构6，Chin等.(2003)“扩增的真核遗传密码.“Science 301：964-967)和对-碘代苯丙氨酸(pIpa，重原子，图6b，结构7，Chin等.(2003)“扩增的真核遗传密码.“Science 301：964-967))的特异性aaRS均插入优化的pREAV-PFLD1载体中PFLD1之后(图6a和6b)。为比较，野生型大肠杆菌酪氨酰-RS(wt，图6b，结构2)也插入新的表达载体。利用以下引物，通过PCR扩增酪氨酸(wt)、pBpa、pAzapa、pPpa、pMpa和pIpa的特异性非天然aaRS：KETO-Koz-F和KetoRS R 6xHis(上述的)，用NcoI和EagI(NEB)消化，连接入类似消化的pREAV-PFLD1-pApaRS(通过琼脂糖凝胶纯化除去pApaRS区域后)。序列验证后，将质粒转化入前述GS200-rHSAE37X克隆1D12以产生GS200-rHSAE37X/pREAV-PFLD1-(合成酶tyr)(HIS4，ARG4，GenR，Mut+)。每次转化选择12个克隆，通过前述96孔形式的斑点印迹筛选。选择每次的最佳生产克隆(tyr，A9；pBpa，B7；pAzapa C9；pPpa，D6；pMpa，E6；和pIpa，F6)，并在上述rHSA表达实验中与FLD1(即，具有pREAV-PFLD1-pApaRS的菌株)E11比较以测定在有(+)和没有(-)非天然氨基酸1，3-7及其相应aaRS存在下它们抑制rHSAE37X中37位的琥珀型突变的能力，其中X指定为非天然氨基酸。这些实验的结果见图6c。25μl未纯化的澄清培养液作SDS-PAGE凝胶电泳，用考马斯染色。泳道2是用野生型(wt)酪氨酰-RS的rHSAE37Y表达。泳道15是rHSA野生型的表达。pApa和pAzapa突变体的抑制率相似(rHSA野生型产率的40-45％)；除pIpa外，所有其它突变体表达>20％的rHSA野生型产率(图6c)。通过条带密度测定相对蛋白质产量。没有相关氨基酸存在下未观察到蛋白质表达，证明该新系统的高度正交性。
最近，制备了第二正交大肠杆菌亮氨酰-衍生RS/tRNACUA配对(称为LeuRS的aaRS)以便在酿酒酵母中将其它非天然氨基酸掺入蛋白质(Lemke等.(2007)“遗传编码的光束缚氨基酸控制蛋白质磷酸化(Control of proteinphosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid).”NatChem Biol 3：769-772；Summerer等.(2006)“遗传编码的荧光氨基酸(Agenetically encoded fluorescent amino acid).”Proc Natl Acad Sci U S A 103：9785-9789)。为在新巴斯德毕赤酵母表达系统中容纳衍生自该正交配对的非天然LeuRS，修饰pREAV-PFLD1质粒的tRNA区域。如前所述，切除PPGK1下游已有的
Figure BPA00001422440500771
盒，替换以对应于缺乏5’CCA并由SUP4区段隔开的
Figure BPA00001422440500772
三串联重复的编码区，从而产生pREAVleu-PFLD1。将4，5-二甲氧基-2-硝基苄基丝氨酸(DMNB-S，光束缚丝氨酸，图6e，结构8，Lemke等.(2007)“遗传编码的光束缚氨基酸控制蛋白质磷酸化.”Nat Chem Biol 3：769-772)和2-氨基-3-(5-(二甲基氨基)萘-1磺酰胺)丙酸(丹酰基丙氨酸，丹酰基荧光团，图6e，结构9，Summerer等.(2006)“遗传编码的荧光氨基酸.”Proc Natl Acad Sci U S A 103：9785-9789)的特异性LeuRS突变体插入PFLD1后产生pREAVleu-PFLD1-LeuRS(图6d和6f)。
图6d提供含大肠杆菌亮氨酰-RS基因和亮氨酰抑制型tRNA序列组件(leu-tRNA(CUA))的优化pREAVleu-PFLD1载体的示意图。为产生pREAVleu-PFLD1，合成(DNA 2.0，门洛帕克，加利福尼亚州)对应于缺乏5’CCA并由SUP4区段隔开的
Figure BPA00001422440500773
三串联重复的片段，并利用以下引物作PCR扩增：Leu tRNA F，5’-AAG GAA GCT AGC CTC TTT TTC AATTGT ATA TGT G-3’和Leu tRNA R，5’-CGT ACA CGC GTC TGT ACA GAAAAA AAA GAA AAA TTT G-3’。用NheI和MluI(NEB)消化得到的643bp产物，连接入类似消化的pREAV-PFLD1-pApaRS(通过琼脂糖凝胶纯化除去酪氨酰tRNA后)以产生pREAVleu-PFLD1-pApaRS。利用以下引物扩增DMNB-S和丹酰基非天然氨基酸的特异性aaRS：LeuRS F，5’-ATT CACACC ATG GAA GAG CAA TAC CGC CCG GAA GAG-3’和LeuRS R，5’-TTA ATT CGC GGC CGC TTA GCC AAC GAC CAG ATT GAG GAGTTT ACC TG-3’，用NcoI和NotI(NEB)消化，连接入类似消化的pREAVleu-PFLD1-pApaRS(通过琼脂糖凝胶纯化除去pApaRS编码区后)以产生pREAVleu-PFLD1-DMNB-S或pREAVleu-PFLD1-丹酰基(图6d)。序列证实后，将质粒转化入GS200-rHSAE37X(克隆1D12)并以所述的96孔斑点印迹形式筛选。克隆A：A5(DMNB-S)和B：G12(丹酰基)鉴定为缓冲液极限甲醇(BMM)培养基中诱导后，在测试表达条件下生长3天的成功生产克隆。为进行比较，rHSA野生型在BMMY中表达3天(图6f)。图6f提供为检验有(+)和没有(-)非天然氨基酸存在下rHSAE37X的表达所进行的实验结果。用SDS-PAGE凝胶分析25μl未纯化的澄清培养液中的各蛋白质表达，作考马斯染色。泳道4也是3天后rHSA野生型的表达。
最近证明DMNB-S的特异性LeuRS突变体接受DMNB-S的半胱氨酸类似物(DMNB-C)，该类似物因易于合成而用于这些实验。虽然没有相关氨基酸存在下产生少量的全长蛋白质(对于DMNB-S，背景是35％rHSAE37DMNB-S，对于丹酰基是6％rHSAE37丹酰基)，胰蛋白酶消化物的LC-MS/MS证实有相应非天然氨基酸存在下该系统的高保真度(图13)。如图13所示，图6f的泳道2的rHSAE37DMNB-C蛋白进行胰蛋白酶消化，然后进行上述LC-MS/MS，除了消化物中胰凝乳蛋白酶替代胰蛋白酶。上幅色谱图(黑色)显示24.45-60.05分钟之间LC-MS/MS运行的总离子计数(TIC)。第三和第四色谱图分别是2+和3+荷电物质的离子提取，对应于胰凝乳蛋白酶肽，XDHVKLVNEVTEF，其中X(rHSA的第37位残基)是DMNB-C(峰下总面积，“MA”＝224582204)。第五和第六色谱图分别是2+和3+荷电物质的离子提取，对应于胰凝乳蛋白酶肽，XDHVKLVNEVTEF，其中X是亮氨酸的异亮氨酸(峰下总面积“MA”＝20029397)。如下所示进行计算：E37DMNB-C百分比＝224582204/(224582204+20029397)*100＝91.8％和E37L百分比＝20029397/(224582204+20029397)*100＝8.2％。未检测到可察觉量的对应于X处其它天然氨基酸掺入的离子种类。
实际上，存在氨酰化抑制型tRNA常抑制无义密码子的非特异性连读。表达3天后，rHSAE37DMNB-C的抑制率是rHSA野生型产率的约37％，rHSAE37 丹酰基的抑制率是rHSA野生型产率的23％。
在酿酒酵母中优化含有非天然氨基酸蛋白质表达的早先尝试在模型系统中获得的最高产量是8-15mg/l，比本发明开发的巴斯德毕赤酵母中显示的产量低多于一个的数量级。Wang实验室的工作最近证明酵母菌中无义介导mRNA降解(NMD)途径的敲减可将蛋白质表达最高增加2倍(Wang和Wang(2008)“酵母菌中非天然氨基酸有效掺入的新方法(New methods enabling efficientincorporation of unnatural amino acids in yeast).”J Am Chem Soc 130：6066-6067)。联用衍生自SNR52的启动子来驱动tRNACUA转录，它们能达到的突变型蛋白质产量比以前在酿酒酵母中产生的(约为15mg/l)高300-倍(Wang和Wang(2008)“酵母菌中非天然氨基酸有效掺入的新方法.”J Am ChemSoc 130：6066-6067)。因此，敲除NMD途径的UPF1基因和利用SNR52-tRNACUA启动子系统还可增加巴斯德毕赤酵母中的产量。此外，Kobayashi实验室的工作证明，当以分批补料发酵而非标准摇瓶表达时，巴斯德毕赤酵母的rHSA野生型产量要高多于一个数量级(＞10g l-1)(Ohya(2005)“通过反复分批补料发酵优化甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的人血清白蛋白产生(Optimization of human serum albumin production inmethylotrophic yeast Pichia pastoris by repeated fed-batch fermentation).”Biotechnol Bioeng 90：876-887)。
总之，我们将生物合成掺入非天然氨基酸的方法拓展至甲基营养酵母菌。两种aaRS/tRNACUA配对显示在巴斯德毕赤酵母中是正交的，它们用于对rHSAE37X的残基37处的琥珀密码子起反应而表达含8种不同非天然氨基酸的突变型蛋白。突变型蛋白在摇瓶中的表达水平高，保真度优秀。这些结果提示该表达系统适用于许多其它非天然氨基酸及目前在酿酒酵母中开发的合成酶，不限于本文讨论的非天然氨基酸或aaRS/tRNACUA配对。该新系统的高产量和保真度使其能获得有用量的具有独特生物学和药学特性的治疗性蛋白质。例如，可采用化学方法，如肟连接或铜催化1，3-环化加成反应(克里克化学反应)位点特异性地PEG化或交联蛋白质，可掺入金属离子结合氨基酸以结合放射性同位素，可分别从例如HSA或靶向蛋白等载体蛋白制备肽、毒素或siRNA偶联物，所述靶向蛋白例如抗体。此外，在体外抗血管生成试验中检验了前述rHSAE37pApa-ABT-510偶联物。拓展rHSA-E37pApa用作内源性、非-免疫原性运载体的尝试目前应用于其它快速清除的肽，包括胰高血糖素-样肽1模拟物(GLP-1)和甲状旁腺激素(PTH)肽。
尽管已经出于清楚和理解的目的在某种程度上详细地描述了本发明，但是本领域技术人员通过阅读本说明书可清楚地了解，可在不背离本发明真实范围的情况下对形式和细节作出各种改变。例如，上述所有技术和设备都可用于各种组合。如同各出版物、专利、专利申请和/或本文引用的其它文献专门表明出于所有目的通过引用纳入本文的程度一样，本申请中提到的所有出版物、专利、专利申请和/或文献都通过引用全文纳入本文。
成熟HSA的氨基酸序列(不包括信号序列或前肽序列)SEQ ID NO：1
    DAHKSE   VAHRFKDLGE   ENFKALVLIA   FAQYLQQCPF   EDHVKLVNEV   TEFAKTCVAD
ESAENCDKSL   HTLFGDKLCT   VATLRETYGE   MADCCAKQEP   ERNECFLQHK   DDNPNLPRLV
RPEVDVMCTA   FHDNEETFLK   KYLYEIARRH   PYFYAPELLF   FAKRYKAAFT   ECCQAADKAA
CLLPKLDELR   DEGKASSAKQ   RLKCASLQKF   GERAFKAWAV   ARLSQRFPKA   EFAEVSKLVT
DLTKVHTECC   HGDLLECADD   RADLAKYICE   NQDSISSKLK   ECCEKPLLEK   SHCIAEVEND
EMPADLPSLA   ADFVESKDVC   KNYAEAKDVF   LGMFLYEYAR   RHPDYSVVLL   LRLAKTYETT
LEKCCAAADP   HECYAKVFDE   FKPLVEEPQN   LIKQNCELFE   QLGEYKFQNA   LLVRYTKKVP
QVSTPTLVEV   SRNLGKVGSK   CCKHPEAKRM   PCAEDYLSVV   LNQLCVLHEK   TPVSDRVTKC
CTESLVNRRP   CFSALEVDET   YVPKEFNAET   FTFHADICTL   SEKERQIKKQ   TALVELVKHK
PKATKEQLKA   VMDDFAAFVE   KCCKADDKET   CFAEEGKKLV   AASQAALGL
成熟TSP-1的氨基酸序列(不包括信号序列)SEQ ID NO：2
NR IPESGGDNSV FDIFELTGAA RKGSGRRLVK GPDPSSPAFR IEDANLIPPV
     PDDKFQDLVD   AVRAEKGFLL   LASLRQMKKT   RGTLLALERK   DHSGQVFSVV   SNGKAGTLDL
SLTVQGKQHV    VSVEEALLAT    GQWKSITLFV    QEDRAQLYID    CEKMENAELD    VPIQSVFTRD
LASIARLRIA    KGGVNDNFQG    VLQNVRFVFG    TTPEDILRNK    GCSSSTSVLL    TLDNNVVNGS
SPAIRTNYIG    HKTKDLQAIC    GISCDELSSM    VLELRGLRTI    VTTLQDSIRK    VTEENKELAN
ELRRPPLCYH    NGVQYRNNEE    WTVDSCTECH    CQNSVTICKK    VSCPIMPCSN    ATVPDGECCP
RCWPSDSADD    GWSPWSEWTS    CSTSCGNGIQ    QRGRSCDSLN    NRCEGSSVQT    RTCHIQECDK
RFKQDGGWSH    WSPWSSCSVT    CGDGVITRIR    LCNSPSPQMN    GKPCEGEARE    TKACKKDACP
INGGWGPWSP    WDICSVTCGG    GVQKRSRLCN    NPTPQFGGKD    CVGDVTENQI    CNKQDCPIDG
CLSNPCFAGV    KCTSYPDGSW    KCGACPPGYS    GNGIQCTDVD    ECKEVPDACF    NHNGEHRCEN
TDPGYNCLPC    PPRFTGSQPF    GQGVEHATAN    KQVCKPRNPC    TDGTHDCNKN    AKCNYLGHYS
DPMYRCECKP    GYAGNGIICG    EDTDLDGWPN    ENLVCVANAT    YHCKKDNCPN    LPNSGQEDYD
KDGIGDACDD    DDDNDKIPDD    RDNCPFHYNP    AQYDYDRDDV    GDRCDNCPYN    HNPDQADTDN
NGEGDACAAD    IDGDGILNER    DNCQYVYNVD    QRDTDMDGVG    DQCDNCPLEH    NPDQLDSDSD
RIGDTCDNNQ    DIDEDGHQNN    LDNCPYVPNA    NQADHDKDGK    GDACDHDDDN    DGIPDDKDNC
RLVPNPDQKD    SDGDGRGDAC    KDDFDHDSVP    DIDDICPENV    DISETDFRRF    QMIPLDPKGT
SQNDPNWVVR    HQGKELVQTV    NCDPGLAVGY    DEFNAVDFSG    TFFINTERDD    DYAGFVFGYQ
SSSRFYVVMW    KQVTQSYWDT    NPTRAQGYSG    LSVKVVNSTT    GPGEHLRNAL    WHTGNTPGQV
RTLWHDPRHI    GWKDFTAYRW    RLSHRPKTGF    IRVVMYEGKK    IMADSGPIYD    KTYAGGRLGL
FVFSQEMVFF    SDLKYECRDP
ABT-510肽的氨基酸序列SEQ ID NO：3
(N-Ac-Sar)-Gly-Val-(D-alloIle)-Thr-Nva-Ile-Arg-(Pro-NHEt)

Claims (52)

1.一种制备共价偶联的载体多肽-靶多肽偶联物的方法，该方法包括：
在载体多肽合成或翻译期间将第一非天然氨基酸残基掺入该载体多肽；
在靶多肽合成或翻译期间将第二非天然氨基酸残基掺入该靶多肽；和
使该第一和第二非天然氨基酸残基反应以产生所述共价偶联的载体多肽-靶多肽偶联物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在翻译期间将所述第一非天然氨基酸掺入所述载体多肽包括：
(a)提供翻译系统，其包含
(i)所述第一非天然氨基酸，
(ii)正交tRNA-合成酶(O-RS)，
(iii)被所述O-RS用所述第一非天然氨基酸特异性氨酰化的正交tRNA(O-tRNA)，和
(iv)编码所述载体肽的核酸，其中所述核酸包含所述O-tRNA识别的选择者密码子；和
(b)翻译所述核酸，藉此在翻译期间将所述第一非天然氨基酸掺入所述载体多肽。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体或靶多肽在甲基营养酵母菌细胞中产生。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体或靶多肽在假丝酵母(Candida)细胞、汉逊酵母(Hansenula)细胞、毕赤酵母(Pichia)细胞或球拟酵母菌(Torulopsis)细胞中产生。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体多肽与人血清白蛋白(HSA)同源。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体多肽是以下物质或与以下物质同源：抗体，HER2抗体和OKT3抗体，抗体片段，Fab，Fc，scFv，白蛋白，血清白蛋白，牛血清白蛋白，卵白蛋白，c-反应性蛋白，伴白蛋白，乳清蛋白，匙孔
Figure FPA00001422440400011
血蓝蛋白(KLH)，离子载体蛋白，酰基载体蛋白，信号转导衔接蛋白，雄激素结合蛋白，钙结合蛋白，钙调蛋白结合蛋白，血浆铜蓝蛋白，胆固醇酯转移蛋白，f-盒蛋白，脂肪酸-结合蛋白，卵泡抑素，卵泡抑素-相关蛋白，GTP-结合蛋白，胰岛素样生长因子结合蛋白，铁-结合蛋白，潜在TGF-β结合蛋白，光-收集蛋白复合物，淋巴细胞抗原，膜转运蛋白，神经垂体素运载蛋白，周质结合蛋白，磷酸-结合蛋白，磷脂酰乙醇胺结合蛋白，磷脂转移蛋白，视黄醇-结合蛋白，RNA-结合蛋白，s-期激酶-相关蛋白，性激素-结合球蛋白，甲状腺素-结合蛋白，钴胺素传递蛋白，皮质激素传递蛋白，运铁蛋白-结合蛋白或维生素D-结合蛋白。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶多肽是以下物质或与以下物质同源：TSP-1、ABT-510、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、甲状旁腺激素(PTH)、核糖体灭活蛋白(RIP)、血管抑素、艾赛那肽-4、脱辅基蛋白、心房钠尿因子、心房利纳多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、PF4、MIG、降钙素、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-1β、RANTES、I309、R83915、R91733、T58847、D31065、T64262、CD40配体、补体抑制剂、细胞因子、上皮嗜中性粒细胞活化肽-78、GROα、MGSA、GROβ、GROγ、MIP1-α、MIP1-β、MCP-1、上皮嗜中性粒细胞活化肽、促红细胞生成素(EPO)、剥落毒素、成纤维细胞生长因子(FGF)、FGF21、G-CSF、促性腺激素、生长因子、水蛭素、LFA-1、人胰岛素、人胰岛素样生长因子(hIGF)、hIGF-I、hIGF-II、人干扰素、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白介素、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质形成细胞生长因子(KGF)、白血病抑制因子、神经生长因子、PDGF、肽激素、多效生长因子、热原性外毒素A、热原性外毒素B、热原性外毒素C、松弛素、促生长素抑制素、超氧化物歧化酶、胸腺素α1、人肿瘤坏死因子(hTNF)、人肿瘤坏死因子α、人肿瘤坏死因子β、Ras、Tat、炎性分子、信号转导分子、牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)或BP320抗原。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述第一非天然氨基酸掺入所述载体多肽产生包含所述第一非天然氨基酸的HSA变体。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一非天然氨基酸是对-乙酰基苯丙氨酸。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一非天然氨基酸掺入所述HSA变体的氨基酸37位，其中氨基酸位置的编号根据SEQ ID NO：1的。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一非天然氨基酸在翻译期间掺入所述HSA变体。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述第二非天然氨基酸掺入所述靶多肽产生包含所述第二非天然氨基酸的TSP-1变体。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述第二非天然氨基酸掺入所述靶多肽产生包含所述第二非天然氨基酸的ABT-510变体。
14.如权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述第二非天然氨基酸是ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入所述TSP-1变体的氨基酸6位，其中氨基酸位置的编号是依照SEQ ID NO：2的。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入所述TSP-1变体的氨基酸1位，其中氨基酸位置的编号是依照SEQ ID NO：2的。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸在合成期间掺入所述TSP-1变体。
18.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入所述ABT-510变体的氨基酸6位，其中氨基酸位置的编号是依照SEQ ID NO：3的。
19.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入所述ABT-510变体的氨基酸1位，其中氨基酸位置的编号是依照SEQ ID NO：3的。
20.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸在合成期间掺入所述ABT-510变体。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体多肽是HSA变体，其中所述第一非天然氨基酸是对-乙酰基苯丙氨酸，其中所述对乙酰基苯丙氨酸在翻译期间掺入所述HSA变体的氨基酸37位，其中所述HSA变体中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO：1，其中所述靶多肽是TSP-1变体，其中所述第二非天然氨基酸是ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸，其中所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸在合成期间掺入所述TSP-1变体的氨基酸6位，其中所述TSP-1变体中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO：2，其中所述对-乙酰基苯丙氨酸和ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸通过肟连接反应以产生HSA-TSP-1偶联物。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体多肽是HSA变体，其中所述第一非天然氨基酸是对-乙酰基苯丙氨酸，其中所述对乙酰基苯丙氨酸在翻译期间掺入所述HSA变体的氨基酸37位，其中所述HSA变体中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO：1，其中所述靶多肽是ABT-510变体，其中所述第二非天然氨基酸是ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸，其中所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸在合成期间掺入所述ABT-510变体的氨基酸6位，其中所述ABT-510变体中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO：3，其中所述对-乙酰基苯丙氨酸和ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸通过肟连接反应以产生HSA-ABT-510偶联物。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一和第二非天然氨基酸通过一种或多种以下机制反应：亲电-亲核反应、酮与亲核试剂反应、肟连接、醛与亲核试剂反应、羰基和亲核试剂之间的反应、磺酰基和亲核试剂之间的反应、酯化反应、位阻酯基和亲核试剂之间的反应、硫酯基团和亲核试剂之间的反应、稳定的亚胺基和亲核试剂之间的反应、环氧基团和亲核试剂之间的反应、氮丙啶基团和亲核试剂之间的反应、亲电试剂和脂族胺或芳族胺之间的反应、亲电试剂和酰肼之间的反应、亲电试剂和碳酰肼之间的反应、亲电试剂和氨基脲之间的反应、亲电试剂和氨基硫脲之间的反应、亲电试剂和羰基酰肼之间的反应、亲电试剂和硫代羰基酰肼之间的反应、亲电试剂和磺酰基酰肼之间的反应、亲电试剂和卡巴肼之间的反应、亲电试剂和硫卡巴肼之间的反应、亲电试剂和羟胺之间的反应、亲核试剂或亲核试剂，例如羟基或二醇和硼酸或酯之间的反应、过渡金属催化的反应、钯催化的反应、铜催化的杂原子烷化反应、环加成反应、1，3环加成反应、2，3环加成反应、炔-叠氮化物反应、狄尔斯-阿德尔反应或铃木偶联反应。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述反应的效率大于50％、大于70％或大于90％。
25.一种通过权利要求1所述方法产生的载体多肽-靶多肽偶联物。
26.如权利要求25所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述载体多肽是包含至少一个所述第一非天然氨基酸的HSA变体，且所述靶多肽是包含所述第二非天然氨基酸的TSP-1变体。
27.如权利要求25所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述载体多肽是包含至少一个所述第一非天然氨基酸的HSA变体，所述靶多肽是包含所述第二非天然氨基酸的ABT-510变体。
28.如权利要求26或27所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述第一非天然氨基酸是对-乙酰基苯丙氨酸。
29.如权利要求28所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述第一氨基酸掺入所述HSA变体的氨基酸37位，其中氨基酸位置的编号根据SEQID NO：1的。
30.如权利要求29所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述第一氨基酸在翻译期间掺入所述HSA变体。
31.如权利要求26或27所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述第二氨基酸是ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸。
32.如权利要求31所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入所述TSP-1变体的氨基酸6位，其中氨基酸位置的编号是依照SEQ ID NO：2的。
33.如权利要求31所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入所述TSP-1变体的氨基酸1位，其中氨基酸位置的编号是依照SEQ ID NO：2的。
34.如权利要求32或33所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述第二非天然氨基酸在合成期间掺入所述TSP-1变体。
35.如权利要求31所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入所述ABT-510变体的氨基酸6位，其中氨基酸位置的编号是依照SEQ ID NO：3的。
36.如权利要求31所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入所述ABT-510变体的氨基酸1位，其中氨基酸位置的编号是依照SEQ ID NO：3的。
37.如权利要求35或36所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述第二非天然氨基酸在合成期间掺入所述TSP-1变体。
38.如权利要求26所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述载体多肽是在氨基酸37位包含对乙酰基苯丙氨酸的HSA变体，其中所述靶多肽是在氨基酸6位包含ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸的TSP-1变体，其中所述对-乙酰基苯丙氨酸和ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸通过肟连接反应以产生所述载体多肽-靶多肽偶联物。
39.如权利要求26所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述载体多肽是在氨基酸37位包含对乙酰基苯丙氨酸的HSA变体，其中所述靶多肽是在氨基酸6位包含ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸的ABT-510变体，其中所述对-乙酰基苯丙氨酸和ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸通过肟连接反应以产生所述载体多肽-靶多肽偶联物。
40.如权利要求25所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述载体多肽-靶多肽偶联物的血清半衰期长于所述靶多肽。
41.一种载体多肽-靶多肽偶联物，其包含：
包含第一非天然氨基酸残基的载体多肽结构域；和
包含第二非天然氨基酸残基的靶多肽结构域，其中所述载体多肽结构域和靶多肽结构域通过所述第一和第二非天然氨基酸残基偶联在一起。
42.如权利要求41所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述载体多肽结构域包含抗体、抗体片段、白蛋白、血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、c-反应性蛋白、伴白蛋白、乳清蛋白、匙孔
Figure FPA00001422440400061
血蓝蛋白(KLH)、离子载体蛋白、酰基载体蛋白、信号转导衔接蛋白、雄激素结合蛋白、钙结合蛋白、钙调蛋白结合蛋白、血浆铜蓝蛋白、胆固醇酯转移蛋白、f-盒蛋白、脂肪酸-结合蛋白、卵泡抑素、卵泡抑素-相关蛋白、GTP-结合蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白、铁-结合蛋白、潜在TGF-β结合蛋白、光-收集蛋白复合物、淋巴细胞抗原、膜转运蛋白、神经垂体素运载蛋白、周质结合蛋白、磷酸-结合蛋白、磷脂酰乙醇胺结合蛋白、磷脂转移蛋白、视黄醇-结合蛋白、RNA-结合蛋白、s-期激酶-相关蛋白、性激素-结合球蛋白、甲状腺素-结合蛋白、钴胺素传递蛋白、皮质激素传递蛋白、运铁蛋白-结合蛋白或维生素D-结合蛋白。
43.如权利要求41所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述靶多肽结构域包含以下一种或多种：TSP-1、ABT-510、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、甲状旁腺激素(PTH)、核糖体灭活蛋白(RIP)、血管抑素、艾赛那肽-4、脱辅基蛋白、心房钠尿因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、PF4、MIG、降钙素、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-1β、RANTES、I309、R83915、R91733、T58847、D31065、T64262、CD40配体、补体抑制剂、细胞因子、上皮嗜中性粒细胞活化肽-78、GROα、MGSA、GROβ、GROγ、MIP1-α、MIP1-β、MCP-1、上皮嗜中性粒细胞活化肽、促红细胞生成素(EPO)、剥落毒素、成纤维细胞生长因子(FGF)、FGF21、G-CSF、促性腺激素、生长因子、水蛭素、LFA-1、人胰岛素、人胰岛素样生长因子(hIGF)、hIGF-I、hIGF-II、人干扰素、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白介素、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质形成细胞生长因子(KGF)、白血病抑制因子、神经生长因子、PDGF、肽激素、多效生长因子、热原性外毒素A、热原性外毒素B、热原性外毒素C、松弛素、促生长素抑制素、超氧化物歧化酶、胸腺素α1、人肿瘤坏死因子(hTNF)、人肿瘤坏死因子α、人肿瘤坏死因子β、Ras、Tat、炎性分子、信号转导分子、牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)或BP320抗原。
44.如权利要求41所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述载体多肽结构域包含HSA，其中所述第一非天然氨基酸残基是对乙酰基苯丙氨酸，其中所述靶多肽结构域包含TSP-1，其中所述第二非天然氨基酸残基是ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸。
45.如权利要求41所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述载体多肽结构域包含HSA，其中所述第一非天然氨基酸残基是对乙酰基苯丙氨酸，其中所述靶多肽结构域包含ABT-510，其中所述第二非天然氨基酸残基是ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸。
46.如权利要求41所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述第一和第二非天然氨基酸通过一种或多种以下机制共价偶联：亲电-亲核反应、酮与亲核试剂反应、肟连接、醛与亲核试剂反应、羰基和亲核试剂之间的反应、磺酰基和亲核试剂之间的反应、酯化反应、位阻酯基和亲核试剂之间的反应、硫酯基团和亲核试剂之间的反应、稳定的亚胺基和亲核试剂之间的反应、环氧基团和亲核试剂之间的反应、氮丙啶基团和亲核试剂之间的反应、亲电试剂和脂族胺或芳族胺之间的反应、亲电试剂和酰肼之间的反应、亲电试剂和碳酰肼之间的反应、亲电试剂和氨基脲之间的反应、亲电试剂和氨基硫脲之间的反应、亲电试剂和羰基酰肼之间的反应、亲电试剂和硫代羰基酰肼之间的反应、亲电试剂和磺酰基酰肼之间的反应、亲电试剂和卡巴肼之间的反应、亲电试剂和硫卡巴肼之间的反应、亲电试剂和羟胺之间的反应、亲核试剂或亲核试剂，例如羟基或二醇和硼酸或酯之间的反应、过渡金属催化的反应、钯催化的反应、铜催化的杂原子烷化反应、环加成反应、1，3环加成反应、2，3环加成反应、炔-叠氮化物反应、狄尔斯-阿德尔反应或铃木偶联反应。
47.一种细胞，其包含权利要求31所述的载体多肽-靶多肽偶联物。
48.如权利要求47所述的细胞，其特征在于，所述载体多肽-靶多肽偶联物的载体多肽结构域包含含有所述第一非天然氨基酸的HSA变体。
49.如权利要求48所述的细胞，其特征在于，所述第一非天然氨基酸是对-乙酰基苯丙氨酸。
50.如权利要求47所述的细胞，其特征在于，所述载体多肽-靶多肽偶联物的靶多肽结构域包含含有所述第二非天然氨基酸的TSP-1变体。
51.如权利要求47所述的细胞，其特征在于，所述载体多肽-靶多肽偶联物的靶多肽结构域包含含有所述第二非天然氨基酸的ABT-510变体。
52.如权利要求50或51所述的细胞，其特征在于，所述第二非天然氨基酸是ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸。
CN200980156791.4A 2008-12-10 2009-12-09 利用化学反应性非天然氨基酸产生载体-肽偶联物 Active CN102307905B (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US2008/013568 WO2009075847A2 (en) 2007-12-11 2008-12-10 In vivo unnatural amino acid expression in the methylotrophic yeast pichia pastoris
USPCT/US2008/013568 2008-12-10
US12/316,370 2008-12-10
US12/316,370 US20090197339A1 (en) 2008-12-10 2008-12-10 In vivo unnatural amino acid expression in the methylotrophic yeast pichia pastoris
US20814109P 2009-02-20 2009-02-20
US61/208,141 2009-02-20
PCT/US2009/006500 WO2010068278A2 (en) 2008-12-10 2009-12-09 Production of carrier-peptide conjugates using chemically reactive unnatural amino acids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102307905A true CN102307905A (zh) 2012-01-04
CN102307905B CN102307905B (zh) 2015-11-25

Family

ID=42243259

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980156791.4A Active CN102307905B (zh) 2008-12-10 2009-12-09 利用化学反应性非天然氨基酸产生载体-肽偶联物

Country Status (5)

Country Link
US (3) US8609383B2 (zh)
EP (1) EP2370473B1 (zh)
JP (3) JP5959201B2 (zh)
CN (1) CN102307905B (zh)
WO (1) WO2010068278A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106749654A (zh) * 2016-11-15 2017-05-31 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 制备木薯钙调蛋白单克隆抗体的方法及该方法制备的抗体
CN107098978A (zh) * 2017-05-05 2017-08-29 中国药科大学 一种抗肿瘤和免疫增强双重功效融合蛋白

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2444098C (en) 2001-04-19 2016-06-21 The Scripps Research Institute Methods and composition for the production of orthogonal trna-aminoacyltrna synthetase pairs
JP5642916B2 (ja) 2003-04-17 2014-12-17 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 真核遺伝コードの拡張
CN101939410A (zh) * 2007-12-11 2011-01-05 斯克利普斯研究院 甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达
US20090197339A1 (en) * 2008-12-10 2009-08-06 The Scripps Research Institute In vivo unnatural amino acid expression in the methylotrophic yeast pichia pastoris
US8609383B2 (en) 2008-12-10 2013-12-17 The Scripps Research Institute Production of carrier-peptide conjugates using chemically reactive unnatural amino acids
EP2396347B1 (en) 2009-02-11 2017-04-12 Albumedix A/S Albumin variants and conjugates
AU2010311332B2 (en) 2009-10-30 2015-04-23 Albumedix Ltd. Albumin variants
US20110250215A1 (en) * 2010-04-02 2011-10-13 Athena Discovery, Inc. Structurally-related relaxin-fusion proteins with extended in vivo half-lives
JP5969458B2 (ja) 2010-04-09 2016-08-17 アルブミディクス アクティーゼルスカブ アルブミン誘導体及び変異体
EP2655395B1 (en) 2010-12-23 2018-03-07 Universiteit Gent Method for cross-linking peptides
WO2012150319A1 (en) 2011-05-05 2012-11-08 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
BR112014000522B1 (pt) 2011-07-12 2021-03-23 Foodchek Systems, Inc. Meio de cultura e método para cultivar salmonella e e. coli
WO2013075066A2 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Eleven Biotherapeutics, Inc. Proteins with improved half-life and other properties
EP2820033A4 (en) * 2012-02-29 2015-01-07 Ambrx Inc INTERLEUKIN 10 POLYPEPTIDE CONJUGATES AND ITS USES
MX2014010278A (es) 2012-03-16 2015-03-05 Novozymes Biopharma Dk As Variantes de albumina.
KR20220051197A (ko) 2012-05-17 2022-04-26 익스텐드 바이오사이언시즈, 인크. 개선된 약물 전달용 캐리어
MX2015005363A (es) 2012-11-08 2015-11-06 Novozymes Biopharma Dk As Variantes de albumina.
WO2014160183A1 (en) * 2013-03-13 2014-10-02 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services Methods for modulating chemotherapeutic cytotoxicity
DK3094977T3 (en) 2014-01-14 2018-12-10 European Molecular Biology Laboratory Multiple cycloaddition reactions to select molecules
WO2015137883A1 (en) * 2014-03-10 2015-09-17 Nanyang Technological University Method for protein conjugation
WO2015164213A1 (en) 2014-04-23 2015-10-29 The Research Foundation For The State University Of New York A rapid and efficient bioorthogonal ligation reaction and boron-containing heterocycles useful in conjuction therewith
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
US9616109B2 (en) 2014-10-22 2017-04-11 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin D conjugates
EP3220961B1 (en) 2014-10-22 2023-07-05 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
WO2017029407A1 (en) 2015-08-20 2017-02-23 Albumedix A/S Albumin variants and conjugates
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
CA3063325A1 (en) 2017-06-21 2018-12-27 Glykos Finland Oy Hydrophilic linkers and conjugates thereof
WO2019014267A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Synthorx, Inc. INCORPORATION OF NON-NATURAL NUCLEOTIDES AND ASSOCIATED METHODS
AU2018309172B2 (en) 2017-08-03 2022-12-15 Synthorx, Inc. Cytokine conjugates for the treatment of autoimmune diseases
BR112020026899A2 (pt) * 2018-07-04 2021-03-30 Vaxcyte, Inc. Melhorias em conjugados imunogênicos
EP3923974A4 (en) 2019-02-06 2023-02-08 Synthorx, Inc. IL-2 CONJUGATES AND METHODS OF USE THEREOF
CN111909256A (zh) * 2019-05-10 2020-11-10 宁波鲲鹏生物科技有限公司 多肽衍生物及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101087875A (zh) * 2004-12-22 2007-12-12 Ambrx公司 氨酰基－tRNA合成酶的组合物及其用途
CN101160525A (zh) * 2003-06-18 2008-04-09 斯克利普斯研究院 非天然活性氨基酸遗传密码增加
WO2008066583A2 (en) * 2006-06-29 2008-06-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cell-free synthesis of proteins containing unnatural amino acids

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2444098C (en) 2001-04-19 2016-06-21 The Scripps Research Institute Methods and composition for the production of orthogonal trna-aminoacyltrna synthetase pairs
WO2004035605A2 (en) 2002-10-16 2004-04-29 The Scripps Research Institute Glycoprotein synthesis
CA2508939A1 (en) 2002-12-22 2004-07-15 The Scripps Research Institute Protein arrays
US7527870B2 (en) 2003-04-03 2009-05-05 Dow Corning Corporation Organosiloxane compositions
JP5642916B2 (ja) * 2003-04-17 2014-12-17 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 真核遺伝コードの拡張
EP2392923B1 (en) 2003-06-18 2014-05-21 The Scripps Research Institute Method of producing proteins comprising unnatural amino acid
ES2301099T3 (es) 2003-07-07 2008-06-16 The Scripps Research Institute Composiciones de parejas ortogonales lisil-arnt y aminoacil-arnt sintetasa y usos de las mismas.
EP1658366A4 (en) 2003-07-07 2006-08-09 Scripps Research Inst COMPOSITIONS OF ORTHOGONAL GLUTAMYL-TRNA AND AMINOACYL-TRNA-SYNTHETASEPAARES AND THEIR USES
WO2005007870A2 (en) 2003-07-07 2005-01-27 The Scripps Research Institute COMPOSITIONS OF ORTHOGONAL LEUCYL-tRNA AND AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS AND USES THEREOF
PT1687401E (pt) 2003-10-14 2013-02-26 Scripps Research Inst Incorporação de aminoácidos activos em oxidação-redução específica do local em proteínas
US7709604B2 (en) 2003-12-18 2010-05-04 The Scripps Research Institute Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells
MXPA06013586A (es) 2004-05-25 2007-11-09 Scripss Res Inst Incorporacion especifica del sitio de aminoacidos no naturales que contienen atomos pesados en proteinas para la determinacion de la estructura cristalina.
US20090181858A1 (en) 2004-09-21 2009-07-16 The Scripps Research Institute Adding photoregulated amino acids to the genetic code
EP2770053B1 (en) 2004-09-21 2018-02-21 The Scripps Research Institute In vivo incorporation of alkynyl amino acids into proteins in eubacteria
EP1794312A4 (en) 2004-09-22 2009-08-12 Scripps Research Inst LOCAL LABELING OF PROTEINS FOR NMR STUDIES
JP2008516637A (ja) 2004-10-20 2008-05-22 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート 真正細菌へのｎ−アセチルガラクトサミンアミノ酸のインビボ部位特異的組込み
MX2007004892A (es) 2004-10-27 2007-08-16 Scripps Research Inst Componentes de traduccion ortogonales para la incorporacion in vivo de aminoacidos no naturales.
MX2007007580A (es) * 2004-12-22 2007-12-11 Ambrx Inc Hormona del crecimiento humana modificada.
US7385028B2 (en) 2004-12-22 2008-06-10 Ambrx, Inc Derivatization of non-natural amino acids and polypeptides
US8586340B2 (en) 2005-10-12 2013-11-19 The Scripps Research Institute Selective posttranslational modification of phage-displayed polypeptides
EP2465870A1 (en) 2005-11-07 2012-06-20 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences
KR101434682B1 (ko) 2005-12-02 2014-08-27 제넨테크, 인크. 결합 폴리펩티드 및 이들의 용도
US7960141B2 (en) 2006-03-09 2011-06-14 The Scripps Research Institute Systems for the expression of orthogonal translation components in eubacterial host cells
JP5249194B2 (ja) 2006-03-16 2013-07-31 ザ スクリプス リサーチ インスティチュート 非天然アミノ酸フェニルセレノシステインを含有するタンパク質の遺伝的にプログラムされた発現
AU2007248680C1 (en) * 2006-05-02 2014-01-23 Allozyne, Inc. Non-natural amino acid substituted polypeptides
WO2007136778A2 (en) * 2006-05-19 2007-11-29 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Fusion proteins, uses thereof and processes for producing same
CN101578264A (zh) * 2006-12-18 2009-11-11 Ambrx公司 含有非天然氨基酸和多肽的组合物、涉及非天然氨基酸和多肽的方法以及非天然氨基酸和多肽的用途
WO2008137471A2 (en) * 2007-05-02 2008-11-13 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
CN101939410A (zh) * 2007-12-11 2011-01-05 斯克利普斯研究院 甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达
US8609383B2 (en) 2008-12-10 2013-12-17 The Scripps Research Institute Production of carrier-peptide conjugates using chemically reactive unnatural amino acids
US20090197339A1 (en) 2008-12-10 2009-08-06 The Scripps Research Institute In vivo unnatural amino acid expression in the methylotrophic yeast pichia pastoris

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101160525A (zh) * 2003-06-18 2008-04-09 斯克利普斯研究院 非天然活性氨基酸遗传密码增加
CN101087875A (zh) * 2004-12-22 2007-12-12 Ambrx公司 氨酰基－tRNA合成酶的组合物及其用途
WO2008066583A2 (en) * 2006-06-29 2008-06-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cell-free synthesis of proteins containing unnatural amino acids

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ERICA STRABLE ET AL: "Unnatural Amino Acid Incorporation into Virus-Like Particles", 《BIOCONJUG CHEM》 *
JUNG-GUK KIM ET AL: "Development and characterization of a glucagon-like Peptide 1-albumin conjugate the ability to activate the glucagon-like Peptide 1 receptor in vivo", 《DIABETES》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106749654A (zh) * 2016-11-15 2017-05-31 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 制备木薯钙调蛋白单克隆抗体的方法及该方法制备的抗体
CN106749654B (zh) * 2016-11-15 2019-01-22 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 制备木薯钙调蛋白单克隆抗体的方法及该方法制备的抗体
CN107098978A (zh) * 2017-05-05 2017-08-29 中国药科大学 一种抗肿瘤和免疫增强双重功效融合蛋白

Also Published As

Publication number Publication date
JP2016155835A (ja) 2016-09-01
CN102307905B (zh) 2015-11-25
US8609383B2 (en) 2013-12-17
US9109022B2 (en) 2015-08-18
JP2012511326A (ja) 2012-05-24
EP2370473B1 (en) 2016-05-11
US20110312027A1 (en) 2011-12-22
JP5959201B2 (ja) 2016-08-02
WO2010068278A2 (en) 2010-06-17
US20100297693A1 (en) 2010-11-25
EP2370473A2 (en) 2011-10-05
WO2010068278A3 (en) 2010-12-29
US20140170704A1 (en) 2014-06-19
JP2018115172A (ja) 2018-07-26
EP2370473A4 (en) 2013-03-06
JP6359046B2 (ja) 2018-07-18
US8637306B2 (en) 2014-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102307905B (zh) 利用化学反应性非天然氨基酸产生载体-肽偶联物
JP6073205B2 (ja) メタノール資化性酵母ピキア・パストリスにおけるインビボ非天然アミノ酸発現
JP5631533B2 (ja) 遺伝子発現技術
JP5052899B2 (ja) 遺伝子発現法
US20090148887A1 (en) Genetically encoded boronate amino acid
JPH05501360A (ja) ＩｇＡプロテアーゼによる組み換えタンパク質の酵素的切断法
JPH07503137A (ja) 血清ヒトアルブミン，製剤及び利用
Young et al. Expanding the genetic repertoire of the methylotrophic yeast Pichia pastoris
TW201313899A (zh) 在經轉形的微生物如巴斯德畢赤氏酵母中的多－複製策略用於多－次級單元的蛋白質如抗體之高效價且高純度生產技術
CN112313336A (zh) 一种用于优化抗体表达的方法
US20090197339A1 (en) In vivo unnatural amino acid expression in the methylotrophic yeast pichia pastoris
EA020118B1 (ru) Молекула нуклеиновой кислоты биосинтетического кластера, кодирующая нерибосомальные пептидсинтазы, и ее применение
CN105377882A (zh) 宿主细胞和使用方法
AU2014200726A1 (en) In vivo unnatural amino acid expression in the methylotrophic yeast pichia pastoris
Melmer et al. Production of Antibodies in Hansenula polymorpha
Oosting to Therapeutic Protein
JP2009539401A (ja) 小胞体ストレス反応を調節するハンセヌラポリモルファの新規遺伝子、およびこれを用いて分泌効果を増加させる方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant