MX2007007580A - Hormona del crecimiento humana modificada. - Google Patents

Hormona del crecimiento humana modificada.

Info

Publication number
MX2007007580A
MX2007007580A MX2007007580A MX2007007580A MX2007007580A MX 2007007580 A MX2007007580 A MX 2007007580A MX 2007007580 A MX2007007580 A MX 2007007580A MX 2007007580 A MX2007007580 A MX 2007007580A MX 2007007580 A MX2007007580 A MX 2007007580A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
peg
hgh
substituted
amino acid
hormonal composition
Prior art date
Application number
MX2007007580A
Other languages
English (en)
Inventor
David C Litzinger
Thomas O Daniel
Ho Sung Cho
Richard D Dimarchi
Putnam Anna-Maria A Hays
Troy E Wilson
Bee-Cheng Sim
Original Assignee
Ambrx Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ambrx Inc filed Critical Ambrx Inc
Publication of MX2007007580A publication Critical patent/MX2007007580A/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/33396—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen having oxygen in addition to nitrogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Se proporciona polipeptido de la hormona del crecimiento modificado y usos del mismo.

Description

HORMONA DEL CRECIMIENTO HUMANA MODIFICADA REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad para la solicitud provisional de patente de E.U. 60/638,616 presentada en Diciembre 22 de 2004, y para la solicitud provisional de patente de E.U. 60/727,996 presentada en Octubre 17 de 2005, cuyas especificaciones se incorporan en la presente en su totalidad. CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a polipéptidos de hormona del crecimiento modificados con al menos un aminoácido codificado de manera no natural. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La familia del supergén de la hormona del crecimiento (GH) (Bazan F., Immunology Today 11:350-354 (1990); Mott, H. R. y Campbell, I. D. Current Opinión in Structural Biology 5:114-121 (1995); Silvennoinen O. e Ihle, J. N. (1996) Signaling by the Hematopoietic Cytokine Receptors) representa un conjunto de proteínas con características estructurales similares. Cada miembro de esta familia de proteínas comprende un conjunto helicoidal de cuatro, cuya estructura general se muestra en la Figura 1.
Aunque existen más miembros de la familia aún por identificar, algunos miembros de la familia incluyen los siguientes: hormona del crecimiento, prolactina, lactógeno de placenta, eritropoyetina (EPO) , trombopoyetina (TPO) , interleucina-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (subunidad p35), IL-13, IL-15, oncostatina M, factor ciliar neurotrófico, factor inhibidor de leucemia, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, interferón omega, interferón tau, interferón épsilon, factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF) , factor estimulante de colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , factor estimulador de colonia de macrófagos (M-CSF) y cardiotrofina-1 (CT-1) ("la familia del supergén de GH") .
Los miembros de la familia del supergén de GH tienen estructuras secundarias y terciarias similares, a pesar del hecho que generalmente tienen una limitada identidad de aminoácidos o secuencia de ADN. Las características estructurales compartidas permiten identificar fácilmente o nuevos miembros de la familia del gen. Las estructuras generales de los miembros de la familia hGH, EPO, IFN -2, y G-CSF se muestran en las Figuras 2, 3, 4 y 5, respectivamente . Un miembro de la familia del supergén de GH es la hormona del crecimiento humano (hGH). la hormona del crecimiento humano participa en mucho de la regulación del crecimiento y desarrollo humano normal. Esta hormona pituitaria monocatenaria de origen natural consiste de 191 residuos de aminoácido y tiene un peso molecular de aproximadamente 22 kDa. La hGH exhibe una multitud de efectos biológicos, incluyendo el crecimiento lineal (somatogénesis ) , lactación, activación de macrófagos, y efectos similare a la insulina y diabetogénicos entre otros (Chawla, R., et al., Ann. Rev. Med. 34:519-547 (1983); Isaksson, 0., et al., Ann. Rev. Physiol., 47_483-499 (1985); Hughes, J., y Friesen, H., Ann. Rev. Physiol., 47:469-482 (1985) ) . La estructura de la hGH es muy conocida (Goeddel, D., et al., Nature 281:544-548 (1979)), y la estructura tridimensional de la hGH se ha resuelto mediante cristalografía de rayos X (de Vos, A., et al., Science 255:306-312 (1992)). La proteína tiene una estructura globular compacta, que comprende cuatro conjuntos helicoidales alfa anfipáticos, llamados A-D comenzando desde la terminación N que se unen por ciclos. La hGH contiene también cuatro residuos de cisteína, que participan en dos uniones intramoleculares de disulfuro: C53 forma par con C165 y C182 forma par con C189. La hormona no se encuentra glicosilada y se ha expresado en una forma secretada en E. coli (Chang, C, et al., Gene 55:189-196 (1987)). Se ha identificado un número de mutantes de origen natural de hGH. Estos incluyen hGH-V (Seeburg, DNA 1: 239 (1982); Patentes de E.U. Nos. 4,446,235, 4,670,393, y 4,665,180, que se incorporan mediante la referencia en la presente) y una hGH de 20 kDa que contiene una supresión de los residuos 32-46 de hGH (Kostyo et al., Biochem. Biophys. Acta 925: 314 (1987); Lewis U., et al., J. Biol. Chem., 253_2679-2687 (1978)). Además, se han reportado numerosas variantes de hGH que surgen del procesamiento post-transcripcional, post-traducción, secretorio, metabólico, y otros procesos fisiológicos (Baumann, G., Endocrine Reviews 12:424 (1991) ) . Los efectos biológicos de la hGH derivan de su interacción con receptores celulares específicos. la hormona es un miembro de la familia de las proteínas homologas que incluyen lactógenos de placenta y prolactinas. Sin embargo, la hGH es inusual entre los miembros de la familia dado que exhibe especificidad de amplia especie y se une ya sea al somatogénico clonado (Leung, D., et al., Nature 330:537-543 (1987)) o al receptor de prolactina (Boutin J., et al., Cell 53:69-77 (1988)). En base a estudios estructurales y bioquímicos, se han propuesto mapas funcionales para los dominios de unión lactogénicos y somatogénicos (Cunningham B., y Wells J., Proc. Nati. Acad. Sci., 88:3407 (1991)). El receptor de hGH es un miembro de la familia del receptor del factor hematopoyético/citosina/de crecimiento, que incluye varios otros receptores del factor de crecimiento, tales como los receptores de interleucina (IL)-3, -4 y -6, el receptor del factor estimulante de colonia de granulocito macrófago (GM-CSF) , el receptor de eritropoyetina (EPO) , así como el receptor G-CSF. Ver, Bazan, Proc. Nati. Acad. Sci., EUA 87: 6934-6938 (1990). Los miembros de la familia del receptor de citosina contienen cuatro residuos de cisteína conservados y un motivo de triptofán-serina-X-triptofán-serina colocado justo fuera de la región transmembrana. Se piensa que las secuencias conservadas se encuentran implicadas en interacciones de proteína-proteína. Ver e.g., Chiba et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 184:485-490 (1992). La interacción entre la hGH y el dominio extracelular de su receptor (hGHbp) se encuentra entre las mejor comprendidas interacciones de hormona-receptor. Los datos cristalográficos de rayos X de alta resolución (Cunningham, B., et al., Science, 254:821-825 (1991)) han mostrado que la hGH tiene dos sitios de unión del receptor y. se une a dos moléculas receptor secuencialmente utilizando distintos sitios en la molécula. Los dos sitios de unión del receptor se refieren como Sitio I y Sitio II. El Sitio I incluye la terminación de terminal carboxi de la hélice D y partes de la hélice A y el circuito A-B, mientras que el Sitio II abarca la región de terminal amino de la hélice A y una porción de la hélice C. La unión de la GH a su receptor se presenta secuencialmente uniéndose primero al Sitio I. el Sitio II se engrana entonces a un segundo receptor de GH, dando como resultado la dimerización del receptor y la activación de las rutas de señalización intracelular que conducen a las respuestas celulares a la hormona. Una muteína de hGH en la cual se ha introducido una sustitución G120R en el sitio II, es capaz de unirse a un solo receptor de hGH, pero es incapaz de di erizar dos receptores. La muteína actúa como un antagonista de hGH in vitro, presumiblemente ocupando sitios del receptor sin activar las rutas de señalización intraceular (Fuh, G., et al., Science 256:1677-1680 (1992)). La hGH recombinante se utiliza como un terapéutico y se ha aprobado para el tratamiento de un número de indicaciones. La deficiencia de hGH conduce al enanismo, por ejemplo, que se ha tratado exitosamente por más de una década mediante la administración exógena de la hormona. Además de la deficiencia de hGH, la hGH también se ha aprobado para el tratamiento de falla renal (en niños), síndrome de Turner, y caquexia en pacientes de SIDA. Recientemente, la Food and Drug Administration (FDA) ha aprobado la hGH para el tratamiento de corta estatura no dependiente de GH . La hGH también se encuentra actualmente bajo investigación para el tratamiento del envejecimiento, fragilidad en ancianos, síndrome de intestino corto, y falla cardiaca congestiva. Las poblaciones objetivo para el tratamiento con hGH incluyen niños con corta estatura ídiopática (ISS) y adultos con síntomas de tipo GHD. La hGH recombinante se vende actualmente como un producto de inyección diaria, con cinco productos principales en el mercado: Humatrope™ (Eli Lilly & Co.), Nutropin™ (Genentech) , Norditropin™ (Novo-Nordisk) , Genotropin™ (Pfizer) y Saizen/Serostim™ (Serono). Sin embargo, un reto significativo en el uso de la hormona del crecimiento como terapéutico, es que la proteína tiene una corta vida media in vivo y, por consiguiente, debe administrarse mediante inyección subcutánea diaria para una máxima efectividad (MacGillivray, et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 81:1806-1809 (1996)). Un considerable esfuerzo se enfoca en medios para mejorar la administración de agonistas y antagonistas de hGH disminuyendo el costo de producción, haciendo la administración más fácil para el paciente, mejorando la eficacia y el perfil de seguridad y creando otras propiedades que proporcionen una ventaja competitiva. Por ejemplo, Genentech y Alkermes comercializaron con anterioridad Nutropin Depot™, una formulación de depósito de hGH, para la deficiencia pediátrica de la hormona del crecimiento. Aunque el depósito permite una administración menos frecuente (una vez cada 2-3 semanas en lugar de una vez diaria) , también se asocia con efectos indeseables tales como disminución en la biodisponibilidad y dolor en el sitio de inyección y se retiró del mercado en el 2004. Otro producto, Pegvisomant™ (Pfizer), también se ha aprobado recientemente por la FDA. Pegvisomant™ es un análogo genéticamente fabricado de hGH que funciona como un antagonista de la hormona del crecimiento altamente selectivo indicado para el tratamiento de acromegalia (van der Lely, et al., The Lancet 358:1754-1759 (2001) . Aunque varios de los residuos de aminoácidos de cadena lateral en Pegvisomant™ se derivatizan con polímeros de polietilen glicol (PEG), el producto se administra aún una vez diaria, indicando que las propiedades farmacéuticas no son óptimas. Además de las formulaciones de PEGilación y depósito, otras vías de administración, incluyendo formas de dosis inhaladas y orales de hGH se encuentran en etapa temprana de desarrollo pre-clínico y clínico y ninguna ha recibido aún la aprobación de la FDA. En consecuencia, existe la necesidad de un polipéptido que exhiba actividad de la hormona del crecimiento pero también que proporcione una vida media en suero más larga y, en consecuencia, niveles terapéuticos más óptimos de hGH y una vida media terapéutica incrementada . La unión covalente del polímero hidrófilo de poli (etilen glicol), abreviado PEG, es un método para aumentar la solubilidad en agua, la biodisponibilidad, para incrementar la vida media en suero, aumentar la vida media terapéutica, modular la inmunogenicidad, modular la actividad biológica o extender el tiempo de circulación de muchas moléculas biológicamente activas, incluyendo proteínas, péptidos y moléculas particularmente hidrófobas. PEG se ha utilizado extensamente en farmacéuticos, en implantes artificiales y en otras aplicaciones en donde la biocompatibilidad, la carencia de toxicidad y la carencia de inmunogenicidad son importantes. A fin de maximizar las propiedades deseadas de PEG, el peso molecular total y el estado de hidratación del polímero o polímeros de PEG unidos a la molécula biológicamente activa deben ser suficientemente altos para impartir las ventajosas características típicamente asociadas con la unión del polímero de PEG, tales como una aumentada solubilidad en agua y vida media en circulación, mientras que no impactan adversamente la bioactividad de la molécula de origen. Los derivados de PEG se encuentran frecuentemente enlazados a moléculas biológicamente activas a través de funcionalidades químicas reactivas, tales como residuos lisina, cisteína e histidina, los residuos de terminación N y de carbohidratos. Las proteínas y otras moléculas tienen frecuentemente un número limitado de sitios reactivos disponibles para la unión del polímero. Frecuentemente, los sitios más adecuados para la modificación a través de unión de polímero juegan un papel significativo en la unión del receptor, y son necesarios para la retención de la actividad biológica de la molécula. Como resultado, la unión indiscriminada de las cadenas de polímero a tales sitios reactivos en una molécula biológicamente activa, conduce frecuentemente a una reducción significativa o incluso una pérdida total de la actividad biológica de la molécula modificada por el polímero. R. Clark et al., (1996), J. Biol. Chem., 271:21969-21977. Para la formación de conjugados que tienen un peso molecular de polímero suficiente para impartir las ventajas deseadas a una molécula objetivo, los procedimientos de la técnica anterior han implicado típicamente la unión aleatoria de numerosos brazos del polímero a la molécula, incrementando así el riesgo de una reducción o incluso de la pérdida total de la molécula de origen . Los sitios reactivos que forman el sitio para la unión de derivados de PEG a proteínas se dictan por la estructura de la proteína. Las proteínas, incluyendo las enzimas, se encuentran compuestas de varias secuencias de aminoácidos alfa, que tienen la estructura general H2N—CHR— COOH. El residuo amino alfa (H2N--) de un aminoácido se une al residuo carboxilo (--COOH) de un aminoácido adyacente para formar enlaces amido, que pueden representarse como - (NH—CHR— CO)n--, en donde el subíndice "n" puede igualar cientos o miles. El fragmento representado por R puede contener sitios reactivos para la actividad biológica de la proteína y para la unión de derivados de PEG. Por ejemplo, en el caso de la lisina de aminoácido, existe un residuo -NH2 en la posición épsilon así como en la posición alfa. El -NH2 épsilon se encuentra libre para la reacción bajo condiciones de pH básico. Mucho de la técnica en el campo de la derivatización de proteína con PEG se ha dirigido a desarrollar derivados de PEG para su unión al residuo -NH2 épsilon de los residuos lisina presentes en proteínas. "Polyethilene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation" Nektar Molecular Engmeenng Catalog, 2003, pp . 1-17. Sin embargo, estos derivados de PEG tienen todos la limitación común de que no pueden instalarse selectivamente entre los residuos lisma frecuentemente numerosos presentes en las superficies de las proteína. Esta puede ser una limitación significativa en instancias en donde es importante un residuo lisina para la actividad de la proteína que existe en un sitio activo de enzima, por ejemplo, o en casos en donde un residuo lisina juega un papel en la mediación de la interacción de la proteína con otras moléculas biológicas, como en el caso de sitios de unión del receptor. Una segunda e igualmente importante complicación de los métodos existentes para la pegilación de proteína es que los derivados de PEG pueden experimentar reacciones secundarias indeseables con residuos diferentes a los deseados. La histidma contiene un residuo imino reactivo, representado estructuralmente como —N(H)--, pero muchas especies químicamente reactivas que reaccionan con -NH2 épsilon también pueden reaccionar con -N(H)--. De manera similar, la cadena lateral de la cisteína de aminoácido contiene un grupo sulfhidrilo libre representado estructuralmente como -SH. En algunas instancias, los derivados de PEG dirigidos en el grupo -NH2 épsilon de lisina también reaccionan con cisteína, histidina u otros residuos. Esto puede crear complejas mezclas heterogéneas de moléculas bioactivas derivatizadas con PEG y riesgos que destruyen la actividad de la molécula bioactiva objetivo. Sería deseable desarrollar derivados de PEG que permitan la introducción de un grupo funcional químico en un solo sitio dentro de la proteína que permitiría entonces el acoplamiento selectivo de uno o más polímeros de PEG a la molécula bioactiva en sitios específicos en la superficie de la proteína que son tanto muy definidos como predecibles. Además de los residuos lisina, se ha dirigido un esfuerzo considerable en la técnica hacia el desarrollo de reactivos de PEG activados que se dirigen a otras cadenas laterales de aminoácidos, incluyendo cisteína, histidina y la terminación N. Ver, e.g., Patente de E.U. No. 6,610,281 que se incorpora por la referencia en la presente y "Polyethilene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp . 1-17. Un residuo cisteína puede introducirse de manera selectiva al sitio en la estructura de proteínas utilizando mutagénesis dirigida al sitio y otras técnicas conocidas en la técnica, y el residuo sulfhidrilo libre resultante puede reactivarse con derivados de PEG que contienen grupos funcionales tiol-reactivos . Sin embargo, este procedimiento es complicado dado que la introducción de un grupo sulfhidrilo libre puede complicar la expresión, doblamiento y estabilidad de la proteína resultante. Por consiguiente, sería deseable tener un medio para introducir un grupo funcional químico en moléculas bioactivas, que permita el acoplamiento selectivo de uno o más polímeros de PEG a la proteína, mientras que simultáneamente es compatible con (i.e., no se involucra en reacciones secundarias indeseables con) sulfhidrilos y otros grupos funcionales químicos típicamente encontrados en proteínas . Como puede observarse a partir de una muestra de la técnica, muchos de estos derivados que se han desarrollado para la unión a las cadenas laterales de proteína, en particular, el residuo -NH2 en la cadena lateral de aminoácidos de lisina y en el residuo -SH en la cadena lateral cisteína, han probado ser problemático en su síntesis y uso. Algunos forman enlaces inestables con la proteína que se someten a hidrólisis y en consecuencia se descomponen, se degradan, o son de otra manera inestables en ambientes acuosos, tal como en la corriente sanguínea. Algunos forman enlaces estables, pero se someten a hidrólisis antes de formar el enlace, lo que significa que el grupo reactivo en el derivado de PEG puede inactivarse antes de poder unir la proteína. Algunos son algo tóxicos y en consecuencia menos adecuados para su uso in vivo. Algunos son demasiado lentos para reaccionar para su uso práctico. Algunos dan como resultado una pérdida de la actividad de la proteína uniéndose a sitios responsables de la actividad de la proteína. Algunos son no específicos en los sitios a los cuales se unirán, lo cual también puede dar como resultado una pérdida de la actividad deseada y la carencia de reproductividad de resultados. A fin de superar los retos asociados con la modificación de proteínas con residuos de poli (etilen glicol), se han desarrollado derivados de PEG más estables (e.g., Patente de E.U. 6,602,498, que se incorpora por la referencia en la presente) o que reaccionan selectivamente con residuos tiol en moléculas y superficies (e.g., Patente de E.U. 6,610,281, que se incorpora por la referencia en la presente) . Claramente existe la necesidad en la técnica de derivados de PEG que sean químicamente inertes en ambientes fisiológicos hasta que se requiera que reaccionen selectivamente para formar uniones químicas estables . Recientemente, se ha reportado una tecnología completamente nueva en las ciencias de proteínas, que promete superar muchas de las limitaciones asociadas con modificaciones específicas del sitio de las proteínas.
Específicamente, se han agregado nuevos componentes a la maquinaria biosintética de las proteínas procariotas de Escherichia coli (E coli) (e.g., L. Wang et al., (2001), Science 292:498-500) y el eucarioto Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) (e.g., J. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)), que ha permitido la incorporación de aminoácidos no genéticamente codificados a proteínas in vivo. Un número de nuevos aminoácidos con nuevas propiedades químicas, físicas o biológicas, incluyendo marcas de fotoafinidad y aminoácidos fotoisomerizables, aminoácidos de fotorreticulación (ver, e.g., Chin, J. W., et al., (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 99:11020-11024; y Chin, J. W. Et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027), aminoácidos ceto, aminoácidos que contienen átomo pesado, y aminoácidos glicosilados se han incorporado eficientemente y con alta fidelidad en proteínas en E. coli y levadura en respuesta al codón ámbar, TAG, utilizando esta metodología. Ver, e.g., J.W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz (2002), ChemBioChem 3(11) :1135-1137; J. W. Chin et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024; y L. Wang, & P. G. Schultz (2002), Chem. Comm., 1:1-11. Todas la referencias se incorporan por la referencia en su totalidad. Estos estudios han demostrado que es posible introducir selectiva y rutinariamente grupos funcionales químicos, tales como grupos cetona, grupos alquino y residuos azida que no se encuentran en proteínas, que son químicamente inertes a todos los grupos funcionales encontrados en los 20 aminoácidos comunes genéticamente codificados y que pueden utilizarse para reaccionar eficiente y selectivamente para formar enlaces covalentes estables. La capacidad para incorporar aminoácidos no genéticamente codificados en proteínas permite la introducción de grupos funcionales químicos que podrían proporcionar valiosas alternativas a los grupos funcionales de origen natural, tales como -NH2 épsilon de lisina, el sulfhidrilo -SH de cisteína el grupo imino de histidina, etc. Se sabe que ciertos grupos funcionales químicos son inertes a los grupos funcionales encontrados en los 20 aminoácidos comunes genéticamente codificados, pero reaccionan limpia y eficientemente para formar enlaces estables. Los grupos azida y acetileno, por ejemplo, se conocen en la técnica por experimentar una reacción Huisgen [3+3] de cicloadición en condiciones acuosas en presencia de una cantidad catalítica de cobre. Ver e.g., Tornoe et al., (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064; y Rostovtsev et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599. Al introducir un residuo azida en una estructura de proteína, por ejemplo, se es capaz de incorporar un grupo funcional químicamente inerte a aminas, sulfhidrilos, ácidos carboxílicos, grupos hidroxilo encontrados en proteínas, pero también reacciona suave y eficientemente con un residuo acetileno para formar un producto de cicloadición. De manera importante, en ausencia del residuo acetileno, la azida permanece químicamente inerte y sin reaccionar en presencia de otras cadenas laterales de proteína y bajo condiciones fisiológicas. La presente invención se dirige, entre otras cosas, a problemas asociados con la actividad y producción de polipéptidos de GH, y se dirige también a la producción de un polipéptido de hGH con propiedades biológicas o farmacológicas aumentadas, tales como un aumento en la vida media terapéutica. BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona miembros de la familia del supergén de GH incluyendo GH, e.g., polipéptidos de hGH que comprenden uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals . En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., de hGH comprende una o más modificaciones post-traducciónes . En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., de hGH se encuentra enlazado a un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa. En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., de hGH se encuentra enlazado a un polímero bifuncional, o a al menos un polipéptido de GH adicional, e.g., de hGH.
En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende un residuo de pol?(et?len glicol). En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural se encuentra enlazado al polímero soluble en agua con un enlazador o se encuentra unido al polímero soluble en agua. En algunas modalidades, la molécula de pol?(et?len glicol) es un polímero bifuncional. En algunas modalidades, el polímero bifuncional se encuentra enlazado a un segundo polipéptido. En algunas modalidades, el segundo polipéptido es un polipéptido de GH, e.g., de hGH. En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., de hGH comprende al menos dos aminoácidos enlazados a un polímero soluble en agua que comprende un residuo de pol?(et?len glicol). En algunas modalidades, al menos un aminoácido es un aminoácido codificado de manera no natural. Las regiones de GH, e.g., hGH pueden ilustrarse como sigue, en donde las posiciones de aminoácido en la hGH se indican en la fila intermedia: Hélice A Hélice B Hélice C Hélice D [1-5] -[6-33] -[34-74] -[75-96] -[97-105] -[106-129] -[130-153] -[154-183] -[184-191] terminación N circuito A-B circuito B-C circuito C-D terminación C En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals se encuentran incorporados en cualquier posición en una o más de las siguientes regiones correspondientes a las estructuras secundarias en la hGH como sigue: 1-5 (terminación N) , 6-33 (hélice A), 34-74 (región entre la hélice A y la hélice B, el circuito A-B) , 75-96 (hélice B) , 97-105 (región entre la hélice B y la hélice C, el circuito B-C), 106-129 (hélice C) , 130-153 (región entre la hélice C y la hélice D, el circuito C-D) , 154-183 (hélice D) , 184-191 (terminación C) de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. En otras modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural se sustituye en una posición seleccionada del grupo que consiste de los residuos 1-5, 32-46, 97-105, 132-149 y 184-191 de la hGH de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals se incorporan en una o más de las siguientes posiciones en la GH, e.g., hGH: antes de la posición 1 (i.e., en la terminación N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (i.e., en la terminación carboxilo de la proteína) (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals se sustituyen en una o más de las siguientes posiciones: 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186 y 187 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals se sustituyen en una o más de las siguientes posiciones: 29, 33, 35, 37, 39, 49, 57, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 186 y 187 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3). En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals se sustituyen en una o más de las siguientes posiciones: 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145 y 155 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) .
En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals se sustituyen en una o más de las siguientes posiciones: 30, 74, 103 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals se sustituyen en una o más de las siguientes posiciones: 35, 92, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural en una o más de estas posiciones se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua, incluyendo, pero sin limitarse a las posiciones: antes de la posición 1 (i.e., en la terminación N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (i.e., en la terminación carboxilo de la proteína) (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural en una o más de estas posiciones se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua: 30, 35, 74, 92, 103, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural en una o más de estas posiciones se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua: 35, 92, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . Los antagonistas de GH humana incluyen, pero no se limitan a, aquellos con sustituciones en: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, . 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123 y 127 o una adición en la posición 1 (i.e., en la terminación N) , o cualquier combinación de las mismas (SEQ ID NO: 2, o el aminoácido correspondiente en la SEQ ID NO: 1, 3 o cualquier otra secuencia de GH) . En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., de hGH comprende una sustitución, adición o supresión que modula la afinidad del polipéptido de GH, e.g., de hGH para un receptor del polipéptido de GH, e.g., de hGH, al compararse con la afinidad de la GH correspondiente, e.g., hGH sin la sustitución, adición o supresión. En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., de hGH comprende una sustitución, adición o supresión que aumenta la estabilidad del polipéptido de GH, e.g., de hGH, al compararse con la estabilidad de la GH correspondiente, e.g., hGH sin la sustitución, adición o supresión. En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., de hGH comprende una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de F10A, F10H, F10I; M14W, M14Q, M14G; H18D; H21N; G120A; R167N; D171S; E174S; F176Y, I179T o cualquier combinación de los mismos en la SEQ ID NO: 2 de hGH. En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., de hGH comprende una sustitución, adición o supresión que modula la inmunogenicidad del polipéptido de GH, e.g., de hGH, al compararse con la inmunogenicidad de la GH correspondiente, e.g., hGH sin la sustitución, adición o supresión. En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., de hGH, comprende una sustitución, adición o supresión que modula la vida media en suero o el tiempo de circulación del polipéptido de GH, e.g., de hGH, al compararse con la vida media en suero o el tiempo de circulación de la GH correspondiente, e.g., hGH sin la sustitución, adición o supresión. En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., de hGH comprende una sustitución, adición o supresión que aumenta la solubilidad acuosa del polipéptido de GH, e.g., de hGH, al compararse con la solubilidad acuosa de la GH correspondiente, e.g., hGH sin la sustitución, adición o supresión. En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., de hGH comprende una sustitución, adición o supresión que aumenta la solubilidad del polipéptido de GH, e.g., de hGH producido en una célula huésped, al compararse con la solubilidad de la GH correspondiente, e.g., hGH sin la sustitución, adición o supresión. En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., de hGH comprende una sustitución, adición o supresión que aumenta la expresión del polipéptido de GH, e.g., de hGH en una célula huésped, o aumenta la síntesis ín vitro al compararse con la expresión o la síntesis de la GH correspondiente, e.g., hGH sin la sustitución, adición o supresión. En algunas modalidades, el polipeptido de hGH comprende una sustitución de aminoácido G120A. El polipéptido de hGH que comprende esta sustitución retiene la actividad de agonista y retiene o mejora los niveles de expresión en una célula huésped. En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., de hGH comprende una sustitución, adición o supresión que aumenta la resistencia a proteasa del polipeptido de GH, e.g., de hGH, al compararse con la resistencia a proteasa de la GH correspondiente, e.g., hGH sin la sustitución, adición o supresión. En algunas modalidades, las sustituciones de aminoácidos en el polipéptido de GH, de hGH, pueden ser con aminoácidos de origen natural o de origen no natural, siempre que al menos una sustitución sea con un aminoácido codificado de manera no natural. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural comprende un grupo carboxilo, un grupo acetllo, un grupo ammooxi, un grupo hidrazino, un grupo hidrazida, un grupo semicarbazida, un grupo azida o un grupo alquino. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural comprende un grupo carbonilo. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural tiene la estructura: en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido; R2 es H, un alquilo, arilo, alquilo sustituido y arilo sustituido; y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de la terminación amino, y R4 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de la terminación carboxi. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural comprende un grupo aminooxi. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural comprende un grupo hidrazida. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural comprende un grupo hidrazino. En algunas modalidades, el residuo del aminoácido codificado de manera no natural comprende un grupo semicarbazida . En algunas modalidades, el residuo del aminoácido codificado de manera no natural comprende un grupo azida. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural tiene la estructura : en donde n es 0-10; Ri es un alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido o no se encuentra presente; X es O, N, S o no se encuentra presente; m es 0-10; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de la terminación amino, y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de la terminación carboxi. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural comprende un grupo alquino. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural tiene la estructura: en donde n es 0-10; Ri es un alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido; X es O, N, S o no se encuentra presente; m es 0-10; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de la terminación amino, y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de la terminación carboxi. En algunas modalidades, el polipéptido es un polipéptido de GH, e.g., agonista, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial o agonista inverso del polipéptido de hGH. En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., agonista, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial o agonista inverso del polipéptido de hGH comprende un aminoácido codificado de manera no natural enlazado a un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende un residuo de pol?(et?len glicol). En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., agonista, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial o agonista inverso del polipéptido de hGH comprende un aminoácido codificado de manera no natural y una o más modificadores post-traducciónes, enlazadores, polímeros o moléculas biológicamente activas. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural enlazado a un polímero soluble en agua se encuentra presente dentro de la región del Sitio II (la región de la proteína que abarca el área helicoidal AC-conjunto, la región de terminación ammo de la hélice A y una porción de la hélice C) , del polipéptido de GH, e.g., de hGH. En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural enlazado a un polímero soluble en agua evita la dimepzación del receptor del polipéptido de GH, e.g., de hGH, evitando que el antagonista del polipéptido de GH, e.g., de hGH, se una a una segunda molécula del receptor del polipéptido de GH, e.g., hGH . En algunas modalidades, un aminoácido diferente a glicina se sustituye por G120 en la SEQ ID NO: 2 (hGH) . En algunas modalidades, arginina se sustituye por G120 en la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, un aminoácido codificado de manera no natural se sustituye por G120 en la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades el aminoácido codificado de manera no natural enlazado a un polímero soluble en agua, se encuentra presente dentro de la región de unión de receptor del polipéptido de GH, e.g., de hGH, o interfiere con la unión de receptor del polipéptido de GH, e.g., de hGH. La presente invención proporciona también ácidos nucleicos aislados que comprenden un polinucleótido que se hibrida bajo condiciones estrictas a la SEQ ID NO: 21 o 22 en donde el polinucleótido comprende al menos un codón de selección. En algunas modalidades, el codón de selección se selecciona del grupo que consiste de un codón ámbar, codón ocre, codón opalino, un codón único, un codón raro, un codón de cinco bases, y un codón de cuatro bases. La presente invención proporciona también métodos para producir un Polipéptido de GH, e.g., de hGH enlazado a un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el método comprende poner en contacto un polipéptido de GH aislado, e.g., de hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural, con un polímero soluble en agua que comprende un residuo que reacciona con el aminoácido codificado de manera no natural. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural incorporado en el polipéptido de GH, e.g., de hGH, es reactivo hacia el polímero soluble en agua que por el contrario es no reactivo hacia cualquiera de los 20 aminoácidos comunes. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural se incorpora en el polipéptido de GH, e.g., de hGH, es reactivo hacia un enlazador, polímero, o molécula biológicamente activa que por el contrario es no reactivo hacia cualquiera de los 20 aminoácidos comunes. En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., de hGH enlazado al polímero soluble en agua se prepara reactivando un Polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende un aminoácido que contiene carbonilo, con una molécula de poli (etilen glicol) que comprende un grupo aminooxi, hidrazino, hidrazida o semicarbazida. En algunas modalidades, el grupo aminooxi, hidrazino, hidrazida o semicarbazida se encuentra enlazado a la molécula de poli (etilen glicol) a través de un enlace amido. En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., de hGH enlazado al polímero soluble en agua se prepara reactivando una molécula de poli (etilen glicol) que comprende un grupo carbonilo, con un polipéptido que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que comprende un grupo aminooxi, hidrazino, hidrazida o semicarbazida. En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., de hGH enlazado al polímero soluble en agua se prepara reactivando un Polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende un aminoácido que contiene alquino con una molécula de poli (etilen glicol) que comprende un residuo azida. En algunas modalidades, el grupo azida o alquino se encuentra enlazado a la molécula de poli (etilen glicol) a través de un residuo amido. En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., de hGH enlazado al polímero soluble en agua se prepara reactivando un Polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende un aminoácido que contiene azida con una molécula de poli (etilen glicol) que comprende un residuo alquino. En algunas modalidades, el grupo azida o alquino se encuentra enlazado a la molécula de poli (etilen glicol) a través de un enlace amido. En algunas modalidades, la molécula de poli (etilen glicol) tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 100 kDa. En algunas modalidades, la molécula de poli (etilen glicol) tiene un peso molecular de entre 0.1 kDa y 50 kDa. En algunas modalidades, la molécula de poli (etilen glicol) es un polímero ramificado. En algunas modalidades, cada ramificación del polímero de poli (etilen glicol) ramificado tiene un peso molecular de entre 1 kDa y 100 kDa, o de entre 1 kDa y 50 kDa.
En algunas modalidades, el polímero soluble en agua enlazado a el polipéptido de GH, e.g., de hGH, comprende un residuo de polialquilen glicol. En algunas modalidades, el residuo de aminoácido codificado de manera no natural incorporado en el polipéptido de GH, e.g., de hGH comprende un grupo carbonilo, un grupo aminooxi, un grupo hidrazida, un grupo hidrazino, un grupo semicarbazida, un grupo azida o un grupo alquino. En algunas modalidades, el residuo de aminoácido codificado de manera no natural incorporado en el polipéptido de GH, e.g., de hGH, comprende un residuo carbonilo, y el polímero soluble en agua comprende un residuo aminooxi, hidrazida, hidrazino, o semicarbazida. En algunas modalidades, el residuo de aminoácido codificado de manera no natural incorporado en el polipéptido de GH, e.g., de hGH, comprende un residuo alquino, y el polímero soluble en agua comprende un residuo azida. En algunas modalidades, el residuo de aminoácido codificado de manera no natural incorporado en el polipéptido de GH, e.g., de hGH comprende un residuo azida, y el polímero soluble en agua comprende un residuo alquino. La presente invención proporciona también composiciones que comprenden un Polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua. La presente invención proporciona también células que comprenden un polinucleótido que codifica para el polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende un codón de selección. En algunas modalidades, las células constan de una sintetasa de ARN ortogonal y/o un ARNt ortogonal para la sustitución de un aminoácido codificado de manera no natural en el polipéptido de GH, e.g., de hGH. La presente invención proporciona también métodos para preparar un Polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural. En algunas modalidades, los métodos comprenden el cultivo de las células que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos que codifican para un Polipéptido de GH, e.g., de hGH, una sintetasa de ARN ortogonal y/o ARNt ortogonal bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido de GH, e.g., de hGH; y la purificación del polipéptido de GH, e.g., de hGH, a partir de las células y/o el medio de cultivo. La presente invención proporciona también métodos para aumentar la vida media terapéutica, la vida media en suero o el tiempo de circulación de los GH, e.g., polipéptidos de hGH. La presente invención proporciona también métodos para modular la inmunogenicidad de los GH, e.g., polipéptidos de hGH. En algunas modalidades, los métodos comprenden la sustitución de un aminoácido codificado de manera no natural por cualquiera o más aminoácidos en GH de origen natural, e.g., polipéptidos de hGH y/o el enlace del polipéptido de GH, e.g., de hGH, a un enlazador, un polímero, un polímero soluble en agua, o una molécula biológicamente activa. La presente invención proporciona también métodos para el tratamiento de un paciente que necesita tal tratamiento, con una cantidad efectiva de una molécula de GH, e.g., de hGH de la presente invención. En algunas modalidades, los métodos comprenden la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un Polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua. La presente invención proporciona también GH, e.g., polipéptidos de hGH que comprenden una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, o cualquier otra secuencia del polipéptido de GH, excepto que al menos un aminoácido se sustituye por un aminoácido codificado de manera no natural. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende un residuo de poli (etilen glicol). En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural comprende un grupo carbonilo, un grupo aminooxi, un grupo hidrazida, un grupo hidrazino, un grupo semicarbazida, un grupo azida o un grupo alquino. En algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente sustituido se sustituye en una posición seleccionada del grupo que comprende los residuos 1-5, 82-90, 117-134 y 169-176 de la SEQ ID NO: 3 (hGH) . La invención proporciona también composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y un Polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1, 2, 3 o cualquier otra secuencia del polipéptido de GH, en donde al menos un aminoácido se sustituye por un aminoácido codificado de manera no natural. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural comprende un residuo sacárido. En algunas modalidades, un polímero soluble en agua se encuentra enlazado al polipéptido mediante un residuo sacárido. En algunas modalidades, un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa se encuentra enlazado a el polipéptido de GH, e.g., de hGH mediante un residuo sacárido. La presente invención proporciona también un Polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende un polímero soluble en agua enlazado por medio de una unión covalente a el polipéptido de GH, e.g., de hGH, en un solo aminoácido. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende un residuo de poli (etilen glicol). En algunas modalidades, el aminoácido que se encuentra enlazado de manera covalente al polímero soluble en agua, es un aminoácido codificado de manera no natural presente en el polipéptido. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural se sustituye en la posición 35, 92, 143 o 145 de la SEQ ID NO: 2. La presente invención proporciona un Polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende al menos un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa, en donde dicho enlazador, polímero o molécula biológicamente activa se encuentra unido al polipéptido a través de un grupo funcional de un aminoácido codificado de manera no natural incorporado en el polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido es monopegilado . La presente invención proporciona también un Polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa unido a uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals, en donde dicho aminoácido codificado de manera no natural se encuentra incorporado de manera ribosomal en el polipéptido en sitios preseleccionados . En otra modalidad, la conjugación del polipéptido de hGH que comprende uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals, a otra molécula, incluyendo, pero sin limitarse a, PEG, proporciona una hGH sustancialmente purificada debido a la única reacción química utilizada para la conjugación al aminoácido no natural. La conjugación de la hGH que comprende uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals a otra molécula, tal como PEG, puede efectuarse con otras técnicas de purificación previo a o después de la etapa de conjugación para proporcionar hGH sustancialmente pura. La presente invención proporciona además una composición hormonal que contiene una hormona del crecimiento (GH) enlazada a al menos un polímero soluble en agua mediante una unión covalente, en donde la unión covalente es una unión oxima. En algunas modalidades, la GH es una hormona del crecimiento humana (hGH) , tal como una secuencia que es al menos aproximadamente 80% idéntica a la SEQ ID NO: 2; en algunas modalidades, la secuencia es la secuencia de la SEQ ID NO: 2. La GH puede incluir uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals (NEAAs), tales como NEAA, que incluye un grupo carbonilo, e.g., una cetona, tal como NEAA que es para-acetilfenilalanina . En algunas modalidades, la unión oxima es entre el NEAA y el polímero soluble en agua. La GH puede sustituirse con una para-acetilfenilalanina en la posición correspondiente a la posición 35 de la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua incluye una o más moléculas de polietilen glicol (PEG). El PEG puede ser lineal, e.g., un PEG lineal de un peso molecular de aproximadamente 0.1 y aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 1 y aproximadamente 60 kDa, o de aproximadamente 20 y aproximadamente 40 kDa o de aproximadamente 30 kDa. En algunas modalidades, el PEG es un PEG ramificado, e.g., un PEG ramificado que tiene un peso molecular de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 30 y aproximadamente 50 kDa o de aproximadamente 40 kDa. En algunas modalidades, la GH se encuentra enlazada por una pluralidad de uniones covalentes a una pluralidad de polímeros solubles en agua, en donde al menos una de las uniones covalentes son uniones oxima . En algunas de estas modalidades, la GH es una hormona del crecimiento humana (GH, e.g., hGH), e.g., una GH, e.g., hGH, con una secuencia que es al menos aproximadamente 80% idéntica a la SEQ ID NO: 2; en algunas modalidades, la secuencia es la secuencia de la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades en las cuales la GH, e.g., hGH, se encuentra enlazada a una pluralidad de polímeros solubles en agua, la GH comprende una pluralidad de NEAAs. En ciertas modalidades, la invención proporciona una composición de GH que contiene una GH, e.g., hGH, que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2, en donde la GH, e.g., hGH, se encuentra enlazada mediante una unión oxima a un PEG lineal de 30 kDa, y en donde la unión oxima se forma con una para-acetilfenilalanina sustituida en la posición correspondiente a la posición 35 de la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición hormonal que contiene una GH, e.g., hGH, enlazada mediante una unión oxima a al menos un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH, comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y contiene al menos un NEAA sustituido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de los residuos 1-5, 6-33, 34-74, 75-96, 97-105, 106-129, 130-153, 154-183 y 184-191. En algunas modalidades, el (los) NEAA(s) se sustituye (n) en una o más posiciones seleccionadas del grupo que comprende los residuos antes de la posición 1 (i.e., en la terminación N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (i.e., en la terminación carboxilo de la proteína). En algunas modalidades, el (los) NEAA(s) se sustituye (n) en una o más posiciones seleccionadas del grupo que comprende los residuos 35, 92, 131, 134, 143 y 145. En algunas modalidades, el (los) NEAA(s) se sustituye (n) en una o más posiciones seleccionadas del grupo que comprende los residuos 30, 35, 74, 92, 103, 143 y 145. En algunas modalidades, el (los) NEAA(s) se sustituye (n) en una o más posiciones seleccionadas del grupo que comprende los residuos 35, 92, 143 y 145. En algunas modalidades, el NEAA se sustituye en una la posición 35. Al menos uno de los NEAAs es una para-acetilfenilalanina en algunas modalidades. En algunas modalidades, el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 0.1 y aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 1 y aproximadamente 60 kDa, o de aproximadamente 20 y aproximadamente 40 kDa o de aproximadamente 30 kDa. Aún en otras modalidades, la invención proporciona un método para preparar una GH, e.g., hGH, enlazada mediante una unión oxima a un polímero soluble en agua, que comprende contacto de la GH, e.g., hGH que comprende un NEAA que comprende un grupo carbonilo, con un oxiamino de PEG bajo condiciones adecuadas para la formación de una unión oxima. El NEAA puede contener un grupo cetona, e.g., un carbonilo. El NEAA puede ser para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades que contienen una para-acetilfenilalanina, la para-acetilfenilalanina se sustituye en una posición en la GH, e.g., la hGH, correspondiente al aminoácido 35 en la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, el oxiamino de PEG es un oxiamino de PEG de monometoxi (MPEG) . En algunas modalidades el oxiamino de MPEG es lineal, e.g., un MPEG lineal de aproximadamente 20-40 kDa o aproximadamente 30 kDa. En algunas modalidades, el oxiamino de MPEG es un hidrocloruro de monometoxi-PEG-2-aminooxi etilamina carbamato lineal de 30 kDa. En algunas modalidades, la GH, e.g., hGH, que comprende un NEAA se prepara introduciendo (i) un ácido nucleico que codifica para una GH, e.g., hGH, en donde el ácido nucleico se ha modificado para proporcionar un codón de selección para la incorporación del NEAA; y (ii) el NEAA a un organismo cuya maquinaria celular es capaz de incorporar el NEAA en una proteína en respuesta al codón de selección del ácido nucleico de (i) . En algunas modalidades, las condiciones de reacción para la formación de la unión oxima incluyen el mezclado de MPEG y GH, e.g., hGH, para producir una MPEG-GH, e.g., mezcla de hGH, con una MPEG:GH, e.g., una relación de hGH de aproximadamente 5 a 10, un pH de aproximadamente 4 a 6; y una agitación suave del MPEG-GH, e.g., una mezcla de MPEG-GH durante aproximadamente 10 a 50 horas a temperatura ambiente. En algunas modalidades, el método incluye además la purificación de la GH, e.g., hGH, a al menos aproximadamente 99% pura. La maquinaria celular incluye, pero no se limita a, una sintetasa de ARNt ortogonal y/o ARNT aminoacilo. Aún en una modalidad adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que contiene una composición hormonal que comprende una hormona del crecimiento enlazada por una unión covalente a al menos un polímero soluble en agua, en donde la unión covalente es una unión oxima, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, la GH es una GH, e.g., hGH. En algunas modalidades, la GH comprende un NEAA. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende un PEG, tal como un PEG lineal. En algunas modalidades el PEG es un PEG lineal de aproximadamente 30 kDa y la GH es una GH, e.g., hGH sustituida en una posición correspondiente al aminoácido 35 de la SEQ ID NO: 2, con para-acetilfenilalanina, y la unión oxima se forma entre la para-acetilfenilalanina y el PEG. En algunas modalidades, la invención proporciona un método de tratamiento administrando a un individuo que necesita el tratamiento, una cantidad efectiva de una composición hormonal que contiene una hormona del crecimiento (GH) enlazada por unión (es) covalente (s) a al menos un polímero soluble en agua, en donde la(s) unión (es) covalente (s) es (son una unión oxima . En algunas modalidades, la GH es hGH. En algunas modalidades, la GH comprende un NEAA. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende un PEG, tal como un PEG lineal. En algunas modalidades, el PEG es un PEG lineal de aproximadamente 30 kDa y la GH es hGH sustituida en una posición correspondiente al aminoácido 35 de la SEQ ID NO: 2 con una para-acetilfenilalanina, y la unión oxima se forma entre la para-acetilfenilalanina y el PEG. En algunas modalidades, el individuo tratado es un humano. En algunas modalidades, el individuo tratado sufre de deficiencia pediátrica de la hormona del crecimiento, corta estatura idiopática, deficiencia adulta de la hormona del crecimiento de origen en la niñez, deficiencia adulta de la hormona del crecimiento de origen en la madurez, o deficiencia secundaria de la hormona del crecimiento. En algunas modalidades, la GH es hGH. En algunas modalidades, la GH comprende un NEAA. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende un PEG, tal como un PEG lineal. En algunas modalidades, el PEG es un PEG lineal de aproximadamente 30 kDa y la GH, e.g., hGH, es sustituida en una posición correspondiente al aminoácido 35 de la SEQ ID NO: 2 con una para-acetilfenilalanina, y la unión oxima se forma entre la para-acetilfenilalanina y el PEG. En algunas modalidades, la invención proporciona un método de tratamiento administrando a un individuo que necesita el tratamiento, una cantidad efectiva de una composición hormonal que contiene una hormona del crecimiento (GH) enlazada por unión (es) covalente (s) a al menos un polímero soluble en agua, en donde el polímero soluble en agua es un polímero lineal, y en donde la composición hormonal se proporciona a una frecuencia de no más de una vez a la semana, una vez cada dos semanas, o una vez al mes. En algunas modalidades, el polímero es un PEG. En algunas modalidades, la GH comprende un NEAA. En algunas modalidades, el polímero se encuentra enlazado a la GH mediante una unión oxima. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición hormonal que comprende una GH, e.g., hGH, en donde la GH, e.g., hGH tiene un promedio de vida media en suero de al menos aproximadamente 12 horas al administrarse a un mamífero de manera subcutánea. En algunas modalidades, la GH, e.g., hGH comprende un NEAA. En algunas modalidades, la composición hormonal contiene además un polímero soluble en agua, tal como un PEG, e.g., un PEG lineal. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición hormonal que comprende una GH, e.g., hGH enlazada a un PEG, en donde la GH, e.g., hGH tiene un promedio de vida media en suero de al menos aproximadamente 7 veces la vida media en suero de una composición que comprende la GH, e.g., hGH sin el PEG, al administrarse a un mamífero de manera subcutánea. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 - Se muestra un diagrama de la estructura general para proteínas de conjuntos de cuatro hélices . Figura 2 - Se muestra un diagrama de la estructura general para la hormona del crecimiento (GH) de proteína de conjuntos de cuatro hélices. Figura 3 Se muestra un diagrama de la estructura general para la eritropoyetina (EPO) de proteína de conjuntos de cuatro hélices. Figura 4 - Se muestra un diagrama de la estructura general para interferón alfa-2 (IFNOÍ-2) de la proteína de conjuntos de cuatro hélices. Figura 5 - Se muestra un diagrama de la estructura general para el factor estimulante de la colonia de granulocitos de la proteína de conjuntos de cuatro hélices . Figura 6 - Se muestra un SDS-PAGE coloreado con azul de Coomassie demostrando la expresión de la hGH que comprende la p-acetilfenilalanina de aminoácido codificado de manera no natural en cada una de las siguientes posiciones: Y35, F92, Ylll, G131, R134, K140, Y143 o K145. Figura 7, Paneles A y B - Se muestra un diagrama de la actividad biológica de la hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural (Panel B) y una hGH de tipo silvestre (Panel A) en células IM9. Figura 8 - Se muestra un SDS-PAGE coloreado con azul de Coomassie demostrando la producción de la hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que se encuentra pegilado mediante enlace covalente de PEG (5, 20 y 30 kDa) al aminoácido codificado de manera no natural. Figura 9 - Se muestra un diagrama demostrando la actividad biológica de las varias formas pegiladas de hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural en células IM9. Figura 10, Panel A - Esta figura representa la estructura primaria de hGH con los sitios de separación de tripsina indicados y especificando la sustitución del aminoácido no natural, F92pAF, con una flecha (figura modificada de Becker et al., Biotechnol. Appl. Biochem., (1988) 10 (4) -326-337) . Figura 10, Panel B - se muestran mapas trípticos superpuestos de los péptidos generados a partir de un polipéptido de hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que se encuentra pegilado (marcado A) , los péptidos generados de un polipéptido de hGH que comprenden un aminoácido codificado de manera no natural (marcado B) , y los péptidos generados de WHO rhGH (marcado C) . Figura 10, Panel C - Se muestra el pico 9 del Panel B magnificado. La Figura 11, Panel A y Panel B muestra un análisis SDS-PAGE coloreado con azul de Coomassie de polipéptidos PEG-hGH purificados. Figura 12 - Se muestra un diagrama de la actividad biológica de una molécula de dímero de hGH en células IM9. Figura 13, Panel A - Se muestra un diagrama de los datos del análisis de IM9 que miden la fosforilación de pSTAT5 mediante el antagonista hGH con la sustitución G120R.
Figura 13, Panel B - Se muestra un diagrama de los datos del análisis de IM9 que miden la fosforilación de pSTAT5 mediante un polipéptido de hGH con un aminoácido no natural incorporado en la misma posición (G120). Figura 14 - Se muestra un diagrama indicando que un dímero del antagonista de hGH mostrado en la Figura 13, Panel B, carece también de actividad biológica en el análisis de IM9. Figura 15 - Se muestra un diagrama comparando la vida media en suero en ratas del polipéptido de hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que se encuentra pegilado con el polipéptido de hGH que no se encuentra pegilado. Figura 16 - Se muestra un diagrama comparando la vida media en suero en ratas de polipeptidos que comprenden un aminoácido codificado de manera no natural que se encuentra pegilado. Figura 17 - Se muestra un diagrama comparando la vida media en suero en ratas de polipéptidos que comprenden un aminoácido codificado de manera no natural que se encuentra pegilado. Se dosificó a las ratas una vez con 2.1 mg/kg . Figura 18, Panel A - Se muestra un diagrama del efecto en el aumento del peso corporal de la rata después de la administración de una sola dosis de los polipéptidos de hGH que comprenden un aminoácido codificado de manera no natural que se encuentra pegilado (posición 35, 92). Figura 18, Panel B - Se muestra un diagrama del efecto en los niveles de IGF-1 circulantes en plasma después de la administración de una sola dosis de los polipéptidos de hGH que comprenden un aminoácido codificado de manera no natural que se encuentra pegilado (posición 35, 92). Figura 18, Panel C - Se muestra un diagrama del efecto en el aumento del peso corporal de la rata después de la administración de una sola dosis de los polipéptidos de hGH que comprenden un aminoácido codificado de manera no natural que se encuentra pegilado (posición 92, 134, 145, 131, 143). Figura 18, Panel D - Se muestra un diagrama del efecto en los niveles de IGF-1 circulantes en plasma después de la administración de una sola dosis de los polipéptidos de hGH que comprenden un aminoácido codificado de manera no natural que se encuentra pegilado (posición 92, 134, 145, 131, 143). Figura 18, Panel E - Se muestra un diagrama comparando la vida media en suero en ratas, de los polipéptidos de hGH que comprenden un aminoácido codificado de manera no natural que se encuentra pegilado (posición 92, 134, 145, 131, 143). Figura 19 - Se muestra un diagrama de la estructura del hidrocloruro de monometoxi-poli (etilen glicol) -2-ammoox? etilamma carbamato lineal de 30 kDa. Figura 20 - Se muestra un diagrama ilustrando la síntesis de PEG enlazado a carbamato oxiammo-derivatizado . La Figura 21 presenta ejemplos ilustrativos, no limitantes de reactivos que contienen PEG que pueden utilizarse para modificar polipéptidos de aminoácido no natural para formar polipéptidos de aminoácido no natural enlazados a oxima que contienen PEG. La Figura 22 presenta ejemplos ilustrativos, no limitantes de la síntesis de reactivos que contienen PEG que pueden utilizarse para modificar polipéptidos de aminoácido no natural para formar polipeptidos de aminoácido no natural enlazados a oxima que contienen PEG. La Figura 23 presenta un ejemplo ilustrativo, no limitante de la síntesis de un reactivo de hidroxilamma que contiene PEG a base de amido que puede utilizarse para modificar polipeptidos de aminoácido no natural para formar polipeptidos de aminoácido no natural enlazados a oxima que contienen PEG. La Figura 24 presenta un ejemplo ilustrativo, no limitante de la síntesis de un reactivo a base de carbamato que contiene PEG que puede utilizarse para modificar polipéptidos de aminoácido no natural para formar polipéptidos de aminoácido no natural enlazados a oxima que contienen PEG. La Figura 25 presenta un ejemplo ilustrativo, no limitante de la síntesis de un reactivo a base de carbamato que contiene PEG que puede utilizarse para modificar polipéptidos de aminoácido no natural para formar polipéptidos de aminoácido no natural enlazados a oxima que contienen PEG. La Figura 26 presenta ejemplos ilustrativos, no limitantes de la síntesis de reactivos simples que contienen PEG que pueden utilizarse para modificar polipéptidos de aminoácido no natural para formar polipéptidos de aminoácido no natural enlazados a oxima que contienen PEG. La Figura 27 presenta ejemplos ilustrativos, no limitantes de los reactivos ramificados que contienen PEG que pueden utilizarse para modificar polipéptidos de aminoácido no natural para formar polipéptidos de aminoácido no natural enlazados a oxima que contienen PEG, y el uso de tal reactivo para modificar un polipéptido de aminoácido no natural a base de carbonilo. La Figura 28 presenta una gráfica que ilustra la concentración de IGF-1 en plasma en ratas hipofisectomizadas tratadas semanalmente con placebo o incrementando la dosis de PEG-ahGH, o diariamente con placebo o Genotropin.
La Figura 29 presenta una gráfica que ilustra la longitud ósea de la tibia en ratas hipofisectomizadas tratadas semanalmente con placebo o PEG-ahGH, o diariamente con placebo o Genotropin. La Figura 30 presenta una gráfica que ilustra el porcentaje en el cambio del peso corporal en ratas hipofisectomizadas tratadas semanalmente con placebo o PEG-ahGH, o diariamente con placebo o Genotropin. La Figura 31 presenta una gráfica que ilustra la concentración en plasma contra el tiempo para PEG-ahGH administrado de manera subcutánea en los días 0 y 7. La Figura 32 presenta una gráfica que ilustra la concentración en plasma contra el tiempo para PEG-a (met ) hGH administrado como una sola dosis subcutánea o intravenosa. DEFINICIONES Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos, líneas celulares, estructuras y reactivos particulares descritos en la presente, y por tanto pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente es con el propósito de describir solo las modalidades particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que se limitará solamente por las reivindicaciones anexas. Como se utiliza en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas en singular "un, "una" y "el" incluyen la referencia al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por consiguiente, por ejemplo, la referencia a una "hGH" es una referencia a una o más de esas proteínas e incluye sus equivalentes conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica, y así sucesivamente . A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado comunmente comprendido por el de experiencia ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque pueden utilizarse todos lo métodos, aparatos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente en la práctica o prueba de la invención, se describen ahora los métodos, aparatos y materiales preferidos. Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la presente se incorporan en la presente por la referencia con el propósito de describir y detallar, por ejemplo, las estructuras y metodologías descritas en las publicaciones, las cuales pueden utilizarse en relación con la invención descrita en la presente. Las publicaciones tratadas en la presente se proporcionan únicamente para su descripción previo a la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente debe considerarse como una admisión de que los inventores no se encuentran autorizados para antefechar tal descripción en virtud de una invención previa o por cualquier otra razón. El término "sustancialmente purificada" se refiere a un polipéptido de GH, e.g., de hGH que puede encontrarse sustancial o esencialmente libre de los componentes que normalmente se anexan o interactúan con la proteína como se encuentra en su ambiente de origen natural, i.e., una célula natural, o célula huésped en el caso de una GH producida de manera recombinante, e.g., los polipéptidos de hGH. El polipéptido de GH, e.g., de hGH que puede encontrarse sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos que aproximadamente 30%, menos que aproximadamente 25%, menos que aproximadamente 20%, menos que aproximadamente 15%, menos que aproximadamente 10%, menos que aproximadamente 5%, menos que aproximadamente 4%, menos que aproximadamente 3%, menos que aproximadamente 2% o menos que aproximadamente 1% (por peso en seco) de la proteína contaminante. Cuando el polipéptido de GH, e.g., de hGH o una variante de la misma, se produce de manera recombinante por las células huésped, la proteína puede encontrarse presente en aproximadamente el 30%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 5%, aproximadamente el 4%, aproximadamente el 3%, aproximadamente el 2% o aproximadamente el 1% o menos del peso en seco de las células. Cuando el polipéptido de GH, e.g., de hGH o una variante de la misma, se produce de manera recombinante por las células huésped, la proteína puede encontrarse presente en aproximadamente 5 g/L, aproximadamente 4 g/L, aproximadamente 3 g/L, aproximadamente 2 g/L, aproximadamente 1 g/L, aproximadamente 750 mg/L, aproximadamente 500 mg/L, aproximadamente 250 mg/L, aproximadamente 100 mg/L, aproximadamente 50 mg/L, aproximadamente 10 mg/L, o aproximadamente 1 mg/L o menos del peso en seco de las células. Por consiguiente, el polipéptido de GH "sustancialmente purificado", e.g., de hGH producido mediante los métodos de la presente invención puede tener un nivel de pureza de al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, específicamente, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 75%, 80%, 85% y más específicamente, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 90%, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 95%, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 99% o mayor determinado por medio de los métodos apropiados tales como análisis SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC y electroforesis capilar. Una "célula huésped recombinante" o "célula huésped" se refiere a una célula que incluye un polinucleótido exógeno, no obstante el método utilizado para la inserción, por ejemplo absorción directa, transducción, equivalencia f, u otros métodos conocidos en la técnica para crear células huésped recombinantes. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido, o alternativamente, puede integrarse en el genoma huésped. Como se utiliza en la presente, el término "medios" o "medio" incluye cualquier medio de cultivo, solución, soporte sólido, semisólido, o rígido que puede soportar o contener cualquier célula huésped, incluyendo, células bacteriales huésped, células huésped de levadura, células huésped de insecto, células huésped vegetales, células huésped eucarióticas, células huésped de mamífero, células CHO, células huésped procarióticas o células huésped pseudomonas y contenidos celulares. Por consiguiente, el término puede abarcar medios en los cuales se ha cultivado la célula huésped, e.g., el medio en el cual se ha secretado el polipéptido de GH, e.g., de hGH, incluyendo el medio ya sea antes o después de una etapa de proliferación. El término también puede abarcar amortiguadores o reactivos que contienen lisados de célula huésped, tal como en el caso en donde el polipéptido de GH, e.g., de hGH se produce de manera intracelular y las células huésped se lisan o se fracturan para liberar el polipéptido de GH, e.g., de hGH. "Agente de reducción", como se utiliza en la presente con respecto a redoblamiento de proteínas, se define como cualquier compuesto o material que mantiene los grupos sulfhidrilo eñ estado reducido y reduce las uniones disulfuro intra o intermoleculares. Los agentes de reducción adecuados incluyen, pero no se limitan a, ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol, ditioeritritol, cisteínas, cisteamina (2-aminoetanotiol) y glutationa reducida. Es fácilmente aparente para los de experiencia ordinaria en la técnica que una gran variedad de agentes de reducción son adecuados para su uso en los métodos y composiciones de la presente invención . "Agente de oxidación" como se utiliza en la presente con respecto al redoblamiento de proteínas, se define como cualquier compuesto o material capaz de remover un electrón de un compuesto que se oxida. Los agentes de oxidación adecuados incluyen, pero no se limitan a, glutationa oxidada, cistina, cistamina, ditiotreitol oxidado, eritreitol oxidado y oxígeno. Es fácilmente aparente para los de experiencia ordinaria en la técnica que una gran variedad de agentes de oxidación son adecuados para su uso en los métodos y composiciones de la presente invención. "Agente de desnaturalización" o "desnaturalizador", como se utiliza en la presente, se define como cualquier compuesto o material que ocasiona el desdoblamiento reversible de una proteína. La resistencia de un agente de desnaturalización o desnaturalizador, se determinará tanto por las propiedades como por la concentración del agente de desnaturalización o desnaturalizador particular. Los agentes de desnaturalización o desnaturalizadores adecuados pueden ser caotropos, detergentes, solventes orgánicos, solventes mezclables en agua, fosfolípidos o una combinación de dos o más de esos agentes. Los caotropos adecuados incluyen, pero no se limitan a urea, guanidina e isocianato de sodio. Los detergentes útiles pueden incluir, pero no se limitan a, detergentes fuertes tales como sulfato de sodio dodecilo, o polioxietileno éteres (e.g., detergentes Tween o Tritón), Sarkosyl, detergentes suaves no iónicos (e.g., digitonin) , detergentes catiónicos suaves tales como N-2, 3- (dioleioxi) -propil-N, N, N-trimetilamonio, detergentes iónicos suaves (e.g., colato de sodio o deoxicolato de sodio) o detergentes zwiteriónicos incluyendo, pero sin limitarse a, sulfobetaínas (Zwittergent ) , 3- (3-clolamidopropil ) dimetilamonio-1-propano sulfato (CHAPS), y 3- (3-clolamidopropil) dimetilamonio-2-hidroxi-1-propano sulfonato (CHAPSO) . Pueden utilizarse como desnaturalizadores, solventes orgánicos mezclables en agua, tales como acetonitrilo, alcanoles inferiores (especialmente alcanoles C2-C4 tales como etanol o isopropanol), o alcandioles inferiores (especialmente alcandioles C2-C4 tales como etileno-glicol) . Los fosfolípidos útiles en la presente invención pueden ser fosfolípidos de origen natural tales como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina y fosfatidilinositol o derivados de fosfolípidos sintéticos o variantes tales como dihexanoilfosfatidilcolina o diheptanoilfosfatidilcolina . "Redoblamiento" como se utiliza en la presente, describe cualquier proceso, reacción o método que transforma polipéptidos que contienen unión disulfuro de un estado inapropiadamente doblado a una conformación natural o apropiadamente doblada con respecto a las uniones disulfuro. "Codoblamiento" como se utiliza en la presente, se refiere específicamente a procesos, reacciones o métodos de redoblamiento que emplean al menos dos polipéptidos que interactúan entre sí y dan como resultado la transformación de polipéptidos no doblados o inapropiadamente doblados a polipéptidos natural o apropiadamente doblados. Como se utiliza en la presente, "hormona del crecimiento" o "GH" incluirá aquellos polipéptidos y proteínas que tienen al menos una actividad biológica de una hormona del crecimiento de cualquier especie de mamífero incluyendo, pero sin limitarse a, humana (hGH) , bovina (bGH) , porcina, y de otros animales de ganado o granja incluyendo pero sin limitarse a, pollos, así como análogos de GH, isoformas de GH, miméticos de GH, proteínas híbridas de GH, proteínas de fusión, oligómeros y multímeros, homólogos, variantes del patrón de glicosilación, variantes, variantes de separación y muteínas de los mismos, no obstante la actividad biológica de los mismos, y además no obstante el método de síntesis o manufactura de los mismos incluyendo, pero sin limitarse a, métodos recombinantes (ya sea producidos a partir de ADNc, ADN genómico, ADN sintético u otros a partir de ácido nucleico) , in vitro, in vivo, mediante microinyección de moléculas de ácido nucleico, sintéticos, transgénicos y activados por el gen. El término "polipéptido de hGH" abarca polipéptidos de hGH que comprenden una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido. Las sustituciones ejemplares incluyen, e.g., la sustitución de la lisina en la posición 41 o de la fenilalanina en la posición 176 de la hGH natural. En algunos casos, la sustitución puede ser un residuo isoleucina o arginina, si la sustitución se encuentra en la posición 41, o es un residuo tirosina si la posición es 176. La posición FIO puede sustituirse, e.g., con A, H o l. la posición M14 puede sustituirse, e.g., con W, Q o G. Otras sustituciones ejemplares incluyen cualquier sustitución o sus combinaciones, incluyendo, pero sin limitarse a: R167N, D171S, E174S, F176Y, I179T; R167N, D171S, E174S, F176Y; F10A, M14W, H18D, H21N; F10A, M14W, H18D, H21N, R167N, D171S, E174S, F176Y, I179T; FlOA, M14W, H18D, H21N, R167N, D171A, E174S, F176Y, I179T; FlOA, M14G, H18N, H21N; FlOA, M14W, H18D, H21N, R167N, D171A, T175T, I179T; o F10I, M14Q, H18E, R167N, D171S, I179T. Ver, e.g., Patente de E.U. No. 6,143,523, que se incorpora en la presente por la referencia . Se han descrito las sustituciones ejemplares en una amplia variedad de posiciones de aminoácido en hGH de origen natural incluyendo sustituciones que incrementan la actividad agonista, incrementan la resistencia a proteasa, convierten al polipéptido en un antagonista, etc., y se encuentran abarcadas por el término "polipéptido de hGH". Secuencias de GH agonista, e.g., de hGH, incluyen, e.g., la secuencia de hGH de origen natural que comprende las siguientes modificaciones H18D, H21N, R167N, D171S, E174S, I179T. Ver, e.g., Patente de E.U. No. 5,849,535, que se incorpora por la referencia en la presente. Las secuencias adicionales de hGH agonista incluyen: H18D, Q22A, F25A, D26A, E65A, K168A, E174S; H18D, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174S; o H18D, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174A. Ver, e.g., Patente de E.U. 6,022,711, que se incorpora en la presente por la referencia. Los polipéptidos de hGH que comprenden sustituciones en H18A, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174A mejoran la afinidad para el receptor de hGH en el sitio I. Ver, e.g., Patente de E.U. No. 5,854,026, que se incorpora en la presente por la referencia. Las secuencias de hGH con resistencia aumentada a proteasas incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos de hGH que comprenden una o más sustituciones de aminoácido dentro del circuito C-D. En algunas modalidades, las sustituciones incluyen, pero no se limitan a, R134D, T135P, K140A y cualquier combinación de las mismas. Ver, e.g., Alam et al., (1998) J. Biotechnol. 65:183-190. Los antagonistas de la hormona del crecimiento humana incluyen, e.g., aquellos con una sustitución en G120 (e.g., G120R, G120K, G120W, G120Y, G120F o G120E) y algunas veces incluyen además las siguientes sustituciones: H18A, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174A. Ver, e.g., Patente de E.U. No. 6,004,931, que se incorpora por la referencia en la presente. En algunas modalidades, los antagonistas de hGH constan de al menos una sustitución en las regiones 106-108 o 127-129 que ocasionan que la GH actúe como un antagonista. Ver, e.g., Patente de E.U. No. 6,608,183, que se incorpora por la referencia en la presente. En algunas modalidades, el antagonista de hGH comprende un aminoácido codificado de manera no natural enlazado a un polímero soluble en agua que se encuentra presente en la región de unión del Sitio II de la molécula de hGH. En algunas modalidades, el polipéptido de hGH consta además de las siguientes sustituciones: H18D, H21N, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S, I179T con una sustitución en G120. (Ver, e.g., Patente de E.U. 5,849,535). Para la secuencia completa de aminoácido de GH humana de origen natural de longitud total así como para la secuencia madura de aminoácido de GH de origen natural y el mutante de origen natural, ver SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente, en la presente. E? algunas modalidades, los polipéptidos de GH, e.g., los polipéptidos de hGH de la invención son sustancialmente idénticos a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3 o cualquier otra secuencia de un polipéptido de hormona del crecimiento. Por ejemplo, en algunas modalidades, los polipéptidos de GH, e.g., los polipéptidos de hGH de la invención, son al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% idénticos a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 2 o cualquier otra secuencia de un polipéptido de hormona del crecimiento. En algunas modalidades, los polipéptidos de GH, e.g., los polipéptidos de hGH de la invención son al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% idénticos a la SEQ ID NO: 2. Se ha identificado un número de mutantes de hGH de origen natural. Estos incluyen hGH-V (Seeburg, DNA 1:239 (1982); Patentes de E.U. Nos. 4,446,235, 4,670,393, y 4,665,180 que se incorporan mediante la referencia en la presente) y una hGH de 20 kDa que contiene una supresión de los residuos 32-46, de hGH (SEQ ID NO: 3) (Kostyo et al., Biochem. Biophys., Acta 925:314 (1987); Lewis U., et al., J. Biol. Chem., 253-2679-2687 (1978)). La hormona del crecimiento de placenta se describe en Igout A., et al., Nucleic Acids Res., 17(10) :3998 (1989)). Además, se han reportado numerosas variantes de hGH que surgen del procesamiento post-transcripcional, post-traducción, secretorio, metabólico, y otros procesos fisiológicos, incluyendo variantes proteolíticamente separadas o bicatenarias (Baumann, G., Endocrine Reviews 12: 424 (1991)). Los dímeros de hGH enlazados directamente a través de enlaces disulfuro Cys-Cys se describen en Lewis U. J., et al., J. Biol. Chem. 252:3697-3702 (1977); Brostedt, P. y Roos, P., Prep Biochem. 19:217-229 (1989)). Las moléculas de ácido nucleico que codifican para mutantes de hGH y polipéptidos de hGH mutantes son muy conocidas e incluyen, pero no se limitan a, aquellas descritas en las Patentes de E.U. Nos.: 5,534,617; 5,580,723; 5,688,666; 5,750,373; 5,834,250 5,834,598; 5,849,535; 5,854,026; 5,962,411; 5,955,346 6,013,478; 6,022,711; 6,136,563; 6,143,523; 6,428,954 6,451,561; 6,780,613 y Publicación de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0153003 que se incorporan en la presente por la referencia . Las preparaciones comerciales de hGH se venden bajo los nombres: Humatrope™ (Elli Lilly & Co J , Nutropin™ (Genentech) , Norditropin™ (Novo-Nordisk) , Genotropin™ (Pfizer) y Saizen/Serostim™ (Serono). El término "polipéptido de hGH" incluye también las sales y prodrogas farmacéuticamente aceptables, y prodrogas de las sales, polimorfos, hidratos, solvatos, fragmentos biológicamente activos, variantes biológicamente activas y estereoisómeros de la hGH de origen natural así como variantes agonistas, miméticas y antagonistas de la hGH de origen natural y sus fusiones de polipéptidos. Las fusiones que comprenden aminoácidos adicionales en la terminación amino, terminación carboxilo o ambas, se encuentran abarcadas por el término "polipéptido de hGH". Las fusiones ejemplares incluyen, pero no se limitan a, e.g., hormona del crecimiento de metionilo en la cual una metionina se encuentra enlazada a la terminación N de la hGH resultante de la expresión recombinante de la forma madura de hGH que carece del péptido de señal de secreción o una porción de la misma, fusiones para el propósito de purificación (incluyendo, pero sin limitarse a, epítopes de poli-histidma o afinidad) , fusiones con péptidos de unión de albúmina de suero y fusiones con proteínas de suero tales como albúmina de suero. La Patente de E.U. No. 5,750,373, que se incorpora por la referencia en la presente, describe un método para seleccionar nuevas proteínas tales como la hormona del crecimiento y variantes del fragmento de anticuerpo que tienen propiedades alteradas de unión para sus moléculas receptoras respectivas. El método comprende una fusión de un gen que codifica para una proteína de ínteres al dominio de terminación carboxi de la proteina de revestimiento del gen III del fago filamentoso M13. Varias referencias describen modificaciones de polipéptidos mediante conjugación o glicosilación de polímeros. El término "polipéptido de hGH" incluye polipéptidos conjugados a un polímero tal como PEG y pueden contener una o más depvatizaciones adicionales de cisteína, Usina u otros residuos. Además, el polipéptido de hGH puede contar de un enlazador o polímero, en donde, el aminoácido al cual se conjuga el enlazador o polímero puede ser un aminoácido no natural de acuerdo con la presente invención, o puede conjugarse a un aminoácido naturalmente codificado utilizando técnicas conocidas en la técnicas tales como acoplamiento a lisina o cisteína.
Se ha reportado la conjugación de polímeros de polipéptidos de hGH. Ver, e.g., Patentes de E.U. Nos. 5,849, 535, 6,136,563 y 6,608,183, que se incorporan en la presente por la referencia. La Patente de E.U. No. 4,904,584 describe polipeptidos agotados con lisma pegilada, en donde al menos un residuo lisina se ha suprimido o reemplazado con cualquier otro residuo de aminoácido. La WO 99/67291 describe un proceso para la conjugación de una proteína con PEG, en donde al menos un residuo de aminoácido en la proteína se suprime y la proteina se pone en contacto con PEG bajo condiciones suficientes para lograr la conjugación a la protema. La WO 99/03887 describe variantes pegiladas de polipéptidos que pertenecen a la superfamilia de la hormona del crecimiento, en donde se ha sustituido un residuo cisteína con un residuo de aminoácido no esencial ubicado en una región especificada del polipeptido. La WO 00/26354 describe un método para la producción de una variante de polipéptido glicosilada con alergenicidad reducida, . Que, en comparación con un polipéptido de origen correspondiente, comprende al menos un sitio adicional de glicosilación . La Patente de E.U. No. 5,218,092, que se incorpora por la referencia en la presente, describe la modificación del factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF) y de otros polipéptidos a fin de introducir al menos una cadena adicional de carbohidratos en comparación con el polipéptido natural.
El término "polipéptido de hGH" incluye también hGH glicosilada, así como, pero sin limitarse a, polipéptidos glicosilados en cualquier posición de aminoácidos, formas glicosiladas N-enlazadas u O-enlazadas del polipéptido. Las variantes que contienen cambios únicos de nucleótido también se consideran variantes biológicamente activas del polipéptido hGH. Además, se incluyen también las variantes de separación. El término "polipéptido de hGH" incluye también el polipéptido de GH, e.g., de hGH, heterodímeros, homodímeros, heteromultímeros u homomultímeros de cualquiera o más GH, e.g., polipéptidos de hGH o cualquier otro polipéptido, proteína, carbohidrato, polímero, molécula pequeña, enlazador, ligando u otra molécula biológicamente activa de cualquier tipo, enlazados mediante medios químicos o expresados como una proteína de fusión, así como análogos de polipéptido que contienen, por ejemplo, supresiones específicas u otras modificaciones manteniendo aún la actividad biológica. Todas las referencias a posiciones de aminoácido en la GH, e.g., hGH, descritas en la presente, se basan en la posición en la SEQ ID NO: 2, a menos que se especifique lo contrario (i.e., cuando se describe que ña comparación se basa en la SEQ ID NO: 1, 3, u otra secuencia de hGH) . Los expertos en la técnica apreciarán que las posiciones de aminoácido correspondientes a las posiciones en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, o cualquier otra secuencia de GH, pueden identificarse fácilmente en cualquier otra molécula de GH, e.g., de hGH tal como GH o fusiones de hGH, variantes, fragmentos, etc. por ejemplo, los programas de alineación de secuencia tales como BLAST, pueden utilizarse para alinear e identificar una posición particular en una proteína que corresponde con una posición en la SEQ ID NO: 1, 2, 3 u otra secuencia de GH . Las sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos descritas en la presente con referencia a la SEQ ID NO: 1, 2, 3 u otra secuencia de GH, pretenden referirse también a las sustituciones, supresiones o adiciones en las posiciones correspondientes en las fusiones de GH, o de hGH, variantes, fragmentos, etc., descritos en la presente o conocidos en la técnica y se encuentran expresamente abarcados por la presente invención. El término "polipéptido de hGH" o "hGH" abarca polipéptidos de hGH que comprenden una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido. Los polipéptidos de hGH de la presente invención pueden comprender modificaciones con uno o más aminoácidos naturales en conjunción con una o más modificaciones de aminoácidos no naturales. Se han descrito sustituciones ejemplares en una amplia variedad de posiciones de aminoácidos en polipéptidos de hGH de origen natural incluyendo, pero sin limitarse a, sustituciones que modulan una o más actividades biológicas del polipéptido de hGH, tales como, pero sin limitarse a, aumento en la actividad agonista, aumento en la solubilidad del polipéptido, disminución de la susceptibilidad a proteasa, conversión del polipéptido en un antagonista, etc., y se encuentran abarcadas por el término "polipéptido de hGH". Los antagonistas de GH humana incluyen, pero no se limitan a, aquellos con sustituciones en: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123 y 127 o una adición en la posición ° (i.e., en la terminación N) , o cualquier combinaciones de las mismas (SEQ ID NO: 2, o el aminoácido correspondiente en la SEQ ID NO: 1, 3, o cualquier otra secuencia de GH) . En algunas modalidades, los antagonistas de hGH constan de al menos una sustitución en las regiones 1-5 (terminación N) , 6-33 (hélice A), 34-74 (región entre la hélice A y la hélice B, el circuito A-B) , 75-96 (hélice B) , 97-105 (región entre la hélice B y la hélice C, el circuito B-C), 106-129 (hélice C) , 130-153 (región entre la hélice C y la hélice D, circuito C-D) , 154-183 (hélice D) , 184-191 (terminación C) que ocasiona que la GH actúe como un antagonista. En otras modalidades, los sitios ejemplares de incorporación de un aminoácido codificado de manera no natural incluyen los residuos dentro de la región de terminación amino de la hélice A y una porción de la hélice C. En otra modalidad, la sustitución de G120 con un aminoácido codificado de manera no natural tal como p-azida-L-fenilalanina o O-propargil-L-tirosina . En otras modalidades, las sustituciones antes listadas se combinan con sustituciones adicionales que ocasionan que el polipéptido de hGH sea un antagonista de hGH. Por ejemplo, un aminoácido codificado de manera no natural se sustituye en una de las posiciones identificadas en la presente y se introduce una sustitución simultánea en G120 (e.g., G120R, G120K, G120W, G120Y, G120F o G120E) . en algunas modalidades, el antagonista de hGH comprende un aminoácido codificado de manera no natural enlazado a un polímero soluble en agua que se encuentra presente en una región de unión del receptor de la molécula de hGH. En algunas modalidades, los GH, e.g., polipéptidos de hGH, comprenden además una adición, sustitución o supresión que modula la actividad biológica del polipéptido de GH o de hGH. Por ejemplo, las adiciones, sustituciones o supresiones pueden modular una o más de las propiedades o actividades de la GH, e.g., hGH. Por ejemplo, las adiciones, sustituciones o supresiones pueden modular la afinidad para el receptor del Polipéptido de GH, e.g., de hGH, modular (incluyendo, pero sin limitarse a, aumento o disminución) la dimerización del receptor, estabilizar los dímeros del receptor, la vida media en circulación, modular la vida media terapéutica, modular la estabilidad del polipéptido, modular la separación mediante proteasas, modular la dosis, modular la liberación o bio-disponibilidad, facilitar la purificación o mejorar o alterar una vía de administración particular. De manera similar, el polipéptido de GH, e.g., de hGH, puede comprender secuencias de separación de proteasa, grupos reactivos, dominios de unión de anticuerpo (incluyendo pero sin limitarse a, FLAG o poly-His) u otras secuencias en base a afinidad (incluyendo, pero sin limitarse a, FLAG, poly-His, GST, etc.), o moléculas enlazadas (incluyendo, pero sin limitarse a, biotina) que mejoran la detección (incluyendo, pero sin limitarse a, GFP) , purificación u otras características del polipéptido. El termino "polipéptido de hGH" abarca también homodímeros, heterodímeros, homomultímeros y heteromultímeros que se encuentran enlazadas, incluyendo, pero sin limitarse a aquellos enlazados directamente a través de cadenas laterales de aminoácidos codificado de manera no naturals, ya sea a las mismas o a diferentes cadenas laterales de aminoácidos codificado de manera no naturals, a cadenas laterales de aminoácidos naturalmente codificados o indirectamente a través de un enlazador. Los enlazadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, compuestos orgánicos pequeños, polímeros solubles en agua de una variedad de longitudes tales como pol?(et?len glicol) o polidextran o polipeptidos de varias longitudes. Un "aminoácido codificado de manera no natural" se refiere a un aminoácido que no es uno de los 20 aminoácidos comunes o pirrolisina o selenocisteína. Otros términos que pueden utilizarse como sinónimos del término "aminoácido codificado de manera no natural" son "aminoácido no natural", "aminoácido no natural", "aminoácido de origen no natural", y variadas versiones con guión y sin guión de los mismos. El término "aminoácido codificado de manera no natural" incluye también, pero no se limita a, aminoácidos que se presentan por modificación (e.g., modificaciones post-traducciónes) de un aminoácido naturalmente codificado (incluyendo, pero sin limitarse a, los 20 aminoácidos comunes o pirrolisina y selenocisteína), pero que en sí no se encuentran naturalmente incorporados en una cadena de polipéptidos creciente por medio del complejo de translación. Ejemplos de tales aminoácidos de origen no natural incluyen, pero no se limitan a, N-acetilglucosaminil-L-serina, N-acetilglucosaminil-L-treonina, y O-fosfotirosina . Un "grupo de modificación de la terminación amino" se refiere a cualquier molécula que pueda unirse a la terminación amino de un polipéptido. De manera similar, un "grupo de modificación de la terminación carboxi" se refiere a cualquier molécula que pueda unirse a la terminación carboxi de un polipéptido. Los grupos de modificación de terminación incluyen, pero no se limitan a, varios polímeros, péptidos o proteínas solubles en agua tales como albúmina de suero u otros residuos que incrementan la vida media en suero de los péptidos. Los términos "grupo funcional", "residuo activo", "grupo de activación", "grupo de salida", "sitio reactivo", "grupo químicamente reactivo" y "residuo químicamente reactivo" se utilizan en la técnica y en la presente para referirse a distintas porciones o unidades definibles de una molécula. Los términos son de alguna forma sinónimos en las artes químicas y se utilizan en la presente para indicar las porciones de moléculas que efectúan alguna función o actividad y son reactivas con otras moléculas. El término "enlace" o "enlazador" se utiliza en la presente para referirse a grupos o uniones que se forman normalmente como resultado de una reacción química y típicamente son enlaces covalentes. Enlaces hidrolíticamente estables significa que los enlaces son sustancialmente estables en agua y no reaccionan con agua a valores de pH útiles, incluyendo, pero sin limitarse a, bajo condiciones fisiológicas durante un extenso período de tiempo, tal vez incluso indefinidamente. Los enlaces hidrolíticamente inestables o degradables significa que los enlaces son degradables en agua o en soluciones acuosas, incluyendo, por ejemplo, en sangre. Enlaces enzimáticamente inestables significa que el enlace puede degradarse por una o más enzimas. Como se entiende en la técnica, el PEG y los polímeros relacionados puede incluir enlaces degradables en la estructura del polímero o en el grupo enlazador entre la estructura de polímero y uno o más grupos funcionales de terminación de la molécula de polímero. Por ejemplo, los enlaces de éster formados por la reacción de ácidos carboxílicos de PEG o ácidos carboxílicos de PEG activados con grupos alcohol en un agente biológicamente activo, generalmente se hidrolizan bajo condiciones fisiológicas para liberar el agente. Otros enlaces hidrolíticamente degradables incluyen, pero no se limitan a, enlaces carbonato; enlaces imina resultantes de la reacción de una amina y un aldehido; enlaces de fosfato éster formados reactivando un alcohol con un grupo fosfato; enlaces hidrazona que son el producto de reacción de una hidrazida y un aldehido; enlaces acetal que son el producto de reacción de un aldehido y un alcohol; enlaces ortoéster que son el producto de reacción de un formato y un alcohol; enlaces péptido formados por un grupo amina, incluyendo, pero sin limitarse a, en un extremo de un polímero tal como PEG, un grupo carboxilo de un péptido; y enlaces oligonucleótido formados por un grupo fosforamidita, incluyendo, pero sin limitarse a, en un extremo de un polímero, y un grupo 5' hidroxilo de un oligonucleótido. El término "molécula biológicamente activa", "residuo biológicamente activo" o "agente biológicamente activo" al utilizarse en la presente, significa cualquier sustancia que pueda afectar cualquiera de las propiedades físicas o bioquímicas de un sistema biológico, ruta, molécula, o interacción relacionada a un organismo, incluyendo, pero sin limitarse a, virus, bacterias, bacteriófagos, transposón, prión, insectos, hongos, plantas, animales y humanos. En particular, como se utiliza en la presente, las moléculas biológicamente activas incluyen, pero no se limitan a, cualquier sustancia para diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de enfermedades en humanos u otros animales, o de otra manera para mejorar el bienestar físico o mental de humanos o animales. Ejemplos de moléculas biológicamente activas incluyen, pero no se limitan a, péptidos, proteínas, enzimas, drogas de molécula pequeñas, drogas duras, drogas suaves, carbohidratos, átomos o moléculas inorgánicos, colorantes, lípidos, nucleósidos, radionúclidos, oligonucleótidos, toxinas, células, virus, liposomas, micropartículas y micelos. Las clases de agentes biológicamente activos que son adecuados para su uso con la invención, incluyen, pero no se limitan a drogas, prodrogas, radionúclidos, agentes de visualización, polímeros, antibióticos, fungicidas, agentes antivirales, agentes antiinflamatorios, agentes anti-tumor, agentes cardiovasculares, agentes anti-ansiedad, hormonas, factores de crecimiento, agentes esteroidales, toxinas microbialmente derivadas y lo similar. Un "polímero bifuncional" se refiere a un polímero que comprende dos grupos funcionales discretos que son capaces de reaccionar específicamente con otros residuos (incluyendo pero sin limitarse a, grupos laterales de aminoácidos) para formar enlaces covalentes o no covalentes. Puede utilizarse un enlazador bifuncional que tiene un grupo bifuncional reactivo con un grupo en un componente particular biológicamente activo, y otro grupo reactivo con un grupo en un segundo componente biológico para formar un conjugado que incluye el primer componente biológicamente activo, el enlazador bifuncional y el segundo componente biológicamente activo. Se conocen muchos procedimientos y moléculas de enlace para la unión de varios compuestos a péptidos. Ver, e.g., Solicitud de Patente Europea No. 188,256; Patentes de E.U. Nos. 4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784; 4,680,338 y 4,569,789 que se incorporan en la presente por la referencia. Un "polímero multi-funcional" se refiere a un polímero que comprende dos o más grupos funcionales discretos capaz de reaccionar específicamente con otros residuos (incluyendo, pero sin limitarse a, grupos laterales de aminoácidos) para formar enlaces covalentes o no covalentes. Un polímero bifuncional o multifuncional puede ser de cualquier longitud o peso molecular deseado, y puede seleccionarse para proporcionar una separación o conformación particular deseada entre una o más de las moléculas enlazadas a la molécula de GH, e.g., de hGH. Cuando los grupos sustituyentes se especifican por sus fórmulas químicas convencionales, escritas de izquierda a derecha, abarcan igualmente los sustituyentes químicamente idénticos que resultarían de la escritura de derecha a izquierda de la estructura, por ejemplo, la estructura -CH20-es equivalente a la estructura -0CH2- . El término "sustituyentes" incluye, pero sin limitarse a, "sustituyentes de no interferencia". Los "sustituyentes de no interferencia" son aquellos grupos que producen compuestos estables. Los sustituyentes o radicales de no interferencia adecuados incluyen, pero no se limitan a, halo, alquilo Ci-Cio, alquenilo C2-C?0, alquinilo C2-C?o, alcoxi Ci-Cio, aralquilo C?-C?2, cicloalquilo C3-C12, cicloalquenilo C3-C12, fenilo, fenilo sustituido, toluilo, xilenilo, bifenilo, alcoxiaralquilo C2-C?2, alcoxiarilo C2-C?2, ariloxialquilo C7-C12, oxiarilo C7-C12, alquilsulfinilo Ci-Cß, alquilsulfonilo C1-C10, -- (CH2) m-0— (alquilo C1-C10) en donde m es de 1 a 8, arilo, arilo sustituido, alcoxi sustituido, fluoroalquilo, radical heterocíclico, radical heterocíclico sustituido, nitroalquilo, —N02, -CN, —NRO (O) - (alquilo Ci-C10) , -C(O) — ( alquilo C1-C10) , tioalquilo alquilo C1-C10, (C(0)0-( alquilo C1-C10) , -OH, -S02, =S, -COOH, -NR2 carbonilo, —C(O) - (alquilo d-C10)-CF3, -C(0)-CF3, -C(0)NR2, -(arilo Ci- C?o)-S-(arilo C6-C10) , -C(0)-(arilo C?-C10) , - (CH2)ra-0- (-- (CH2)m-0- (alquilo C1-C10) , en donde cada m es de 1 a 8, --C(0)NR2, --C(S)NR2, --S02NR2, --NRC(0)NR2, --NRC(S)NR2, sales de los mismos y lo similar. Cada R como se utiliza en la presente es H, alquilo o alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido, aralquilo o alcarilo. El término "halógeno" incluye flúor, cloro, yodo y bromo . El término "alquilo", por si mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se declare lo contrario, una cadena recta o ramificada, o un radical de hidrocarburo cíclico, o una combinación de los mismos, que puede encontrarse totalmente saturado, mono o poliinsaturado, y puede incluir radicales di y multivalentes que tienen el número de átomos de carbono designado (i.e., C?-C10 significa de uno a diez carbonos) . Ejemplos de radicales de hidrocarburo saturado incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciciohexilo, (ciciohexil) metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros, por ejemplo, de n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y lo similar. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene una o más uniones dobles o uniones triples. Ejemplos de grupos alquilo insaturado incluyen, pero no se limitan a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentilo, 2- (butadienilo) , 2,4- pentadienilo, 3- ( 1, 4-pentad?en?lo) , etmilo, 1- y 3-propinilo, 3-but?n?lo, y los homólogos e isómeros más altos. El término "alquilo", a menos que se anote de otra manera, también pretende incluir aquellos derivados de alquilo definidos en mayor detalle abajo, tales como "heteroalquilo" . Los grupos alquilo que se limitan a grupos hidrocarburo se denominan "homoalquilo" . El termino "alquileno" por si mismo o como parte de otro sustituyente, significa un radical bivalente derivado de alcano, como se ejemplifica, pero no se limita, por las estructuras -CH2CH2- y -CH2CH2CH2CH2-, e incluye además aquellos grupos descritos abajo como "heteroalqui leno'J Típicamente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá de 1 a 24 átomos de carbono, teniendo aquellos grupos 10 o menos átomos de carbono que son una modalidad particular de los métodos y composiciones descritos en la presente. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena más corta, que tiene generalmente ocho o menos átomos de carbono. Los términos "alcoxi", "alquilamino" y "alquiltio" (o tioalcoxi) se utilizan en su sentido convencional, y se refieren a aquellos grupos alquilo unidos al resto de la molécula a través de un átomo de oxígeno, un grupo arrimo, o un átomo de azufre, respectivamente. El término "heteroalquilo", por si mismo o en combinación con otro término, significa, a menos que se declare de otra manera, un radical de cadena estable recta o ramificada, o radical de hidrocarburo cíclico, o combinaciones de los mismos, que comprende número de átomos de carbono y de al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que comprende 0, N, Si y S, y en donde los átomos de nitrógeno y azufre puede oxidarse opcionalmente y el heteroátomo de nitrógeno puede cuaternizarse opcionalmente. El (los) heteroátomo (s) , 0, N y S y Si, pueden colocarse en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo o en la posición en la cual el grupo alquilo se encuentra unido al resto de la molécula. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, -CH2-CH2-0-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N (CH3) -CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(0)-CH3, -CH2CH2-S(0)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3 y -CH=CH-N (CH3) -CH3. Hasta dos heteroátomos pueden ser consecutivos, tales como, por ejemplo, -CH2-NH-OCH3 y -CH2-0-Si (CH3) 3. De manera similar, el término "heteroalquileno" por si mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de heteroalquilo, como se ejemplifica, pero no se limita por, -CH2-CH2-S-CH2-CH2 y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2. Para grupos heteroalquileno, los mismos o diferentes heteroátomos pueden ocupar también cualquiera o ambas terminaciones de cadena (incluyendo pero sin limitarse a, alquilenoxi, alquilenodioxi, alquilenoamino, alquilenodiamino, aminooxialquileno, y lo similar) . Aún adicionalmente, para grupos de enlace alquileno y heteroalquileno, no se encuentra implicado ningún grupo de enlace por la dirección en la cual se escribe la fórmula del grupo de enlace. Por ejemplo, la fórmula -C(O)2R0- representa tanto -C(0)2R'- como -R'C(0)2-. Los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo", por si mismos o en combinación con otros términos, representan, a menos que se declare de otra manera, versiones cíclicas de "alquilo" y "heteroalquilo" respectivamente. Por consiguiente, cicloalquilo o heterocicloalquilo pueden incluir enlaces de anillo parcialmente saturados y totalmente insaturados. Adicionalmente, para heterocicloalquilo, un heteroátomo puede ocupar la posición en la cual el heterociclo se une al resto de la molécula. Ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopentilo, ciciohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, ciclopentilo y lo similar. Ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, 1- ( 1, 2, 5, 6-tetrahidropiridilo) , 1-piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1-piperazinilo, 2-piperazinilo y lo similar. Adicionalmente, el término abarca estructuras de anillo bicíclico y tricíclico. De manera similar, el término "heterocicloalquileno" por si mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de heterocicloalquilo, y el término "cicloalquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de cicloalquilo. Como se utiliza en la presente, el término "polímero soluble en agua" se refiere a cualquier polímero soluble en solventes acuosos. El enlace de los polímeros solubles en agua los GH, e.g., polipéptidos de hGH, puede dar como resultado cambios que incluyen, pero no se limitan a, aumento o modulación de la vida media en suero, o aumento o modulación de la vida media terapéutica en relación a la forma no modificada, modulación de inmunogenicidad, modulación de las características de asociación física tales como la agregación y la formación de multímeros, alteración de la unión del receptor y alteración de la dimerización o multimerización del receptor. El polímero soluble en agua puede o no tener su propia actividad biológica y puede utilizarse como un enlazador para unir la GH, e.g., hGH a otras sustancias, incluyendo, pero sin limitarse a una o más GH, e.g., polipéptidos de hGH, o una o más moléculas biológicamente activas. Los polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, polietilen glicol, polietilen glicol propionaldehído, mono alcoxi Cl-ClO o sus derivados ariloxi (descritos en la Patente de E.U. No. 5,252,714 que se incorpora por la referencia en la presente) , monometoxi-polietilen glicol, polivinil pirrolidona, alcohol polivinílico, ácidos poliammo, anhídrido diviniléter maleico, N- (2-h?drox?prop?l) -metacrilamida, dextrano, derivados dextrano incluyendo dextrano sulfato, polipropilen glicol, copolímero de polipropileno óxido/etileno óxido, poliol polioxietilado, heparma, fragmentos de heparma, polisacaridos, oligosacápdos, glicanos, celulosa y derivados de celulosa, incluyendo, pero sin limitarse a metilcelulosa y carboximetil celulosa, almidón y derivados de almidón, polipéptidos, polialquilen glicol y sus derivados, copolimeros de polialquilen glicoles y sus derivados, polivinil etil éteres y alfa-beta-poli [ (2-h?drox?et?l) -DL-aspartamida, y lo similar o mezclas de los mismos. Ejemplos de tales polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilen glicol y albúmina de suero. Como se utiliza en la presente, el término "polialquilen glicol" o "pol?(alquen glicol), se refiere a polietilen glicol (pol?(et?len glicol)), polipropilen glicol, polibutilen glicol, y sus derivados. El término "polialquilen glicol" y/o "polietilen glicol" abarca polímeros tanto lineales como ramificados y pesos moleculares promedio de entre 0.1 kDa y 100 kDa. Otras modalidades ejemplares se encuentran listadas, por ejemplo, en catálogos del proveedor comercial, tales como el catálogo de Shearwater Corporation (Polyet ilene Glycol and Depvatives for Biomedical Applications" (2001) .
El término "arilo" significa, a menos que se declare de otra manera, un sustituyente de hidrocarburo poliinsaturado aromático que puede ser un solo anillo o anillos múltiples (incluyendo, pero sin limitarse a, de 1 a 3 anillos) que se fusionan entre sí o se enlazan de manera covalente. El término "heteroarilo" se refiere a grupos arilo (o anillos) que contienen de uno a cuatro heteroátomos seleccionados de N, 0 y S, en donde los átomos de nitrógeno y azufre se encuentran opcionalmente oxidados y el (los) átomo (s) de nitrógeno se encuentra (n) opcionalmente cuaternizado (s) . Un grupo heteroarilo puede encontrarse unido al resto de la molécula mediante un heteroátomo. Ejemplos no limitados de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-bencimidazolilo, 5-indolilo, 1-isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo, y 6-quinolilo. Los sustituyentes para cada uno de los sistemas de anillo de arilo y heteroarilo antes anotados se seleccionan del grupo de los sustituyentes aceptables descritos abajo. Por brevedad, el término "arilo" al utilizarse en combinación con otros términos (incluyendo, pero sin limitarse a, ariloxi, ariltioxi, arilalquilo) incluye anillos tanto arilo como heteroarilo como se definió anteriormente, por consiguiente, el término "arilalquilo" pretende incluir aquellos radicales en los cuales un grupo arilo se encuentra unido a un grupo alquilo (incluyendo, pero sin limitarse a, bencilo, fenetilo, piridilmetilo y lo similar) incluyendo aquellos grupos alquilo en los cuales un átomo de carbono (incluyendo, pero sin limitarse a un grupo metileno) se ha reemplazado, por ejemplo, por un átomo de oxígeno (incluyendo, pero sin limitarse a, fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3- (1-naftiloxi) propilo y lo similar). Cada uno de los términos anteriores (incluyendo, pero sin limitarse a, "alquilo", "heteroalquilo", "arilo", y "heteroarilo") pretenden incluir formas tanto sustituidas como no sustituidas del radical indicado. Los sustituyentes ejemplares para cada tipo de radical se proporcionan abajo. Los sustituyentes para los radicales alquilo y heteroalquilo (incluyendo aquellos grupos referidos frecuentemente como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo, y heterocicloalquenilo) pueden ser uno o más de una variedad de grupos seleccionados de, pero sin limitarse a: -OR' , =0, =NR' , =N-OR' , -NR'R'', -SR' , halógeno, -SiR' R' ' R' ' ' , -OC(0)R', -C(0)R', -C02R' , -CONR'R'', -OC(0)NR'R' ' , -NR''C(0)R', -NR' -C (O) NR" R" ' , -NR' ' C (O) 2R' , -NR-C(NR'R' 'R' ' ' )=NR' ' ' ' , -NR-C (NR' R' ' ) =NR' ' ' , -S (O) R' , S(0)2R', -S (O) 2NR' R' ' , -NRS02R' y -N02 en un número que varía de cero a (2m'+l), en donde m' es el número total de átomos de carbono en tal radical . R' , R' ' , R' ' ' y R' ' ' ' cada uno independientemente se refieren a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, incluyendo, pero sin limitarse a, arilo sustituido con 1-3 halógenos, alquilo sustituido o no sustituido, grupos alcoxi o tioalcoxi, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como cada grupo R' , R' ' , R' ' ' y R' ' ' cuando más de uno de estos grupos se encuentra presente. Cuando R' y R' ' se encuentran unidos al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R'' pretende incluir, pero sin limitarse a, 1-pirrolidinilo y 4-morfolinilo . A partir de la descripción anterior de sustituyentes, el experto en la técnica entenderá que el término "alquilo" pretende incluir grupos que incluyen átomos de carbono unidos a grupos diferentes a los grupos de hidrógeno, tales como haloalquilo (incluyendo, pero sin limitarse a, -CF3 y -CH2CF ) y acilo (incluyendo, pero sin limitarse a, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C(0)CH2OCH3 y lo similar. De manera similar a los sustituyentes descritos para el radical alquilo, los sustituyentes para los grupos arilo y heteroarilo varían y se seleccionan de, pero no se limitan a, halógeno, -OR' , =0, =NR' , =N-0R' , -NR'R'', -SR' , -halógeno, -SiR' R' ' R' ' ' , -0C(0)R', -C(0)R', -C02R' , -CONR'R'', -0C(0)NR'R", -NR''C(0)R', -NR' -C (0) NR' ' R' ' ' , -NR' ' C (0) 2R' , -NR-C (NR'R' 'R' ' ' )=NR' ' ' ' , -NR-C (NR' R' ' ) =NR' ' ' , -S (0) R' , S(0)2R', -S (0)2NR'R' ' , -NRS02R' y -N02, -R' , -N3, -CH(Ph)2, fluoro (C?-C ) alcoxi, y fluoro (C?-C4) alquilo, en un número que varía de cero al número total de valencias abiertas en el sistema de anillo aromático; y en donde R' , R' ' , R' ' ' y R' ' ' ' se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, arilo y heteroarilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como cada uno de los grupos R' , R' ' , R' ' ' y R' ' ' ' cuando más de uno de estos grupos se encuentra presente. Como se utiliza en la presente, el término "vida media en suero modulada" significa el cambio positivo o negativo en la vida media en circulación de una hGH modificada en relación a su forma no modificada. La vida media en suero se mide tomando muestras de sangre en varios puntos de tiempo después de la administración de la hGH, y determinando la concentración de esa molécula en cada muestra. la correlación de la concentración de suero con el tiempo permite el cálculo de la vida media en suero. El aumento de la vida media en suero tiene deseablemente al menos aproximadamente dos veces, pero puede ser útil un incremento menor, por ejemplo, cuando permite un régimen de dosis satisfactorio o evita el efecto tóxico. En algunas modalidades, el incremento es de al menos aproximadamente tres veces, al menos aproximadamente cinco veces, o al menos aproximadamente diez veces. El término "vida media terapéutica modulada" como se utiliza en la presente significa el cambio positivo o negativo en la vida media de la cantidad terapéuticamente efectiva de una hGH modificada en relación a su forma no modificada. La vida media terapéutica se mide calculando las propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas de la molécula en varios puntos de tiempo después de la administración. El aumento en la vida media terapéutica permite deseablemente un régimen de dosis benéfico particular, una dosis total benéfica particular, o evita el efecto indeseable. En algunas modalidades, el aumento en la vida media terapéutica resulta del aumento en la potencia, del aumento o disminución de la unión de la molécula modificada a su objetivo, del aumento o disminución de la fractura de la molécula mediante enzimas tales como proteasas, o del aumento o disminución en otro parámetro o mecanismo de acción de la molécula no modificada. El término "aislado", cuando se aplica a un ácido nucleico o proteina, denota que el ácido nucleico o proteína se encuentra libre de al menos algunos de los componentes celulares con los cuales se asocia en su estado natural, o que el ácido nucleico o protema se ha concentrado a un nivel mayor que la concentración de su producción ín vivo o ín vitro. Puede encontrarse en un estado homogéneo. Las sustancias aisladas pueden encontrarse en un estado ya sea seco o semi-seco, o en solución, incluyendo, pero sin limitarse a, una solución acuosa. Puede ser un componente de una composición farmacéutica que comprende vehículos y/o excipientes adicionales farmacéuticamente aceptables. La pureza y homogeneidad se determinan típicamente utilizando técnicas de química analítica tales como electroforesis de gel de poliacplamida o cromatografía líquida de alto desempeño. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación se encuentra sustancialmente purificada. En particular, un gen aislado se separa de los marcos de lectura abierta que flanquean el gen y codifican una proteína diferente al gen de interés. El término "purificado" denota que un ácido nucleico o proteína da lugar sustancialmente a una banda en un gel electroforético. Particularmente, puede significar que el ácido nucleico o proteína es al menos 85% pura, al menos 90% pura, al menos 95% pura, al menos 99% o más pura. El término "ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos, desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos o ribonucleótidos y sus polímeros en forma ya sea mono o bicatenaria. A menos que se limite específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos de origen natural. A menos que se limite específicamente de otra manera, el término se refiere también a análogos de oligonucleótido incluyendo PNA (ácido peptidonucleico) , análogos de ADN utilizados en tecnología de antisentido (fosforotioatos, fosforoamidatos y lo similar). A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de ácido nucleico también abarca implícitamente sus variantes conservadoramente modificadas (incluyendo, pero sin limitarse a, sustituciones degeneradas de codón) , y secuencias complementarias así como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente las sustituciones degeneradas de codón pueden lograrse generando secuencias en las cuales la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mezclada y/o de deoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acids Res., 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse a un polímero o residuos de aminoácido. Es decir, una descripción dirigida a un polipéptido se aplica igualmente a la descripción de un peptido y a la descripción de una protema y viceversa. Los términos se aplican a polímeros de aminoácido de origen natural así como a polímeros de aminoácido en los cuales uno o más de los residuos de aminoácido es un aminoácido codificado de manera no natural. Como se utilizan en la presente, los términos abarcan cadenas de aminoácido de cualquier longitud, incluyendo proteínas de longitud total en donde los residuos de aminoácido se encuentran enlazados por uniones de péptido covalentes. El termino "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y de origen no natural, así como a análogos de aminoácido y mimeticos de aminoácido que funcionan de una manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos naturalmente codificados son los 20 aminoácidos comunes (alamna, arginina, asparagma, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidma, ísoleucma, leucina, lisina, metionina, fenilalanma, prolina, serina, treonina, triptofán, tirosina y valina) y pirrolisina y selenocisteína . Análogos de aminoácido se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, ?.e., un carbono alfa unido a un hidrógeno, grupo carboxilo, grupo amino, y un grupo R, tal como homosepna, norleucma, metionina sulfóxido, metionina metil sulfonio. Tales análogos tienen grupos R modificados (tales como, norleucina) o estructuras de péptido modificadas, pero retienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. Los aminoácidos pueden referirse en la presente ya sea por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Los nucleotidos, de manera similar, pueden referirse por sus códigos de una sola letra comunmente aceptados. "Variantes conservadoramente modificadas" se aplica a secuencias tanto de aminoácidos como de ácido nucleico. Con respecto a las secuencias particulares de ácido nucleico, las "variantes conservadoramente modificadas" se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican para secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica para una secuencia de aminoácido, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican para cualquier proteína dada. Por consiguiente, en cada posición, en donde una alanina se especifica por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones conservadoramente modificadas. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente, que codifica para un polipéptido describe también cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. El de experiencia ordinaria en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es ordinariamente el único codón para metionina, y TGG, que es ordinariamente el único codón para triptofán) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica para un polipéptido se encuentra implícita en cada secuencia descrita . En cuanto a las secuencias de aminoácido, el de experiencia ordinaria en la técnica reconocerá que las sustituciones, supresiones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido, o proteína, que alteren, agreguen o supriman un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante conservadoramente modificada" en donde la alteración da como resultado la supresión de un aminoácido, la adición de un aminoácido o la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica. tales variante conservadoramente modificadas son adicionales a y no excluyen las variante polimórficas, homólogos interespecies y alelos de la invención. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son conocidas por el de experiencia ordinaria en la técnica. los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G) ; 2) Ácido aspártico (D), ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina ®, Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofán (W) ; 7) Serina (S), Treonina (T) ; y 8) Cisteína ©, Metionina (M) . (ver, e.g., Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co., 2a edición (Diciembre 1993) . Los términos "idéntica" o "identidad" porcentual, en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son la misma. Las secuencias son "sustancialmente idénticas" si tienen un porcentaje de residuos de aminoácido o nucleótidos que son los mismos (i.e., al menos aproximadamente 60% de identidad, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de identidad sobre una región especificada), al compararse y alinearse para la máxima correspondencia sobre una ventana de comparación, o la región designada medida utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia (u otros algoritmos disponibles para las personas de experiencia ordinaria en la técnica) o mediante alineación manual e inspección visual. Esta definición se refiere también al complemento de una secuencia de prueba. Esta identidad puede existir sobre una región que es de al menos aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o sobre una región que es de 75-100 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o cuando no se especifica, a través de toda la secuencia de un polinucleótido o polipéptido. Típicamente, para comparación de secuencia, una secuencia actúa como secuencia de referencia con la cual se comparan las secuencias de prueba. Al utilizar un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en una computadora, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan parámetros de programa de algoritmo de secuencia. Pueden utilizarse parámetros de programa de falla, o pueden designarse parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencia calcula entonces las identidades de secuencia porcentuales para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia en base a los parámetros de programa. Una "ventana de comparación", como se utiliza en la presente, incluye referencia a un segmento de cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste de desde 20 hasta 600, comúnmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más comúnmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en las cuales una secuencia puede compararse a una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de alinear de manera óptima las dos secuencias. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. La alineación óptima de secuencias para comparación puede conducirse, incluyendo pero sin limitarse a, por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl. Math., 2:482c, por medio del algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443, por medio de la búsqueda por el método de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 85:2444, por medio de implementaciones computanzadas de estos algoritmos (GAP. BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsm Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science, Dr . Madison, Wl), o por medio de alineación manual e inspección visual (ver, e.g., Ausubel et al., Current Protocols ín Molecular Biology (1995 suplemento) ) . Un ejemplo de un algoritmo adecuado para determinar la identidad de secuencia porcentual y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen el Altschul et al., (1997) Nuc. Acids Res., 25:3389-3402, y Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol., 215:403-410, respectivamente. El software para efectuar los análisis BLAST se encuentra publicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information, disponible en la World Wide Web en ncbi.nlm.nih.gov. Los parámetros de algoritmo BLAST W, T y X, determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como fallas una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=4 y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como fallas una longitud de palabra de 3, y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (ver, Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Nati. Acad. Sci., EUA 89:10915) alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4 y una comparación de ambas cadenas. El algoritmo BLAST se lleva a cabo típicamente cerrando el filtro de "baja complejidad". El algoritmo BLAST también efectúa un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, e.g., Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:5873-5787). Una medición de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se presentará una correspondencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña, comparando el ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia, puede ser menor que aproximadamente 0.2m o menos que aproximadamente 0.01 o menor que aproximadamente 0.001. La frase "se hibrida selectivamente (o específicamente) a" se refiere a la unión, duplicación o hibridación de una molécula solo a una secuencia particular de nucleótidos bajo condiciones rígidas de hibridación cuando esa secuencia se encuentra presente en una mezcla de complejo (incluyendo, pero sin limitarse a, ADN o ARN total celular o de biblioteca) . La frase "condiciones rígidas de hibridación" se refiere a la hibridación de secuencias de ADN, ARN, ANP u otros miméticos de ácido nucleico, o sus combinaciones bajo condiciones de baja resistencia iónica y alta temperatura como se conoce en la técnica. Típicamente, bajo condiciones rígidas una sonda se hibridará a su subsecuencia objetivo en una mezcla compleja de ácido nucleico (incluyendo, pero sin limitarse a, ADN o ARN total celular o de biblioteca) pero no se hibrida a otras secuencias en la mezcla de complejo. Las condiciones rígidas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a más altas temperaturas. Una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Generalmente, las condiciones rígidas se seleccionan de aproximadamente 5-10° C menores al punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a un pH de resistencia iónica definido. El Tm es la temperatura (bajo una resistencia iónica definida, pH y concentración nucleica) a la cual el 50% de las sondas complementarias al objetivo se hibridan a la secuencia objetivo en equilibrio (dado que las secuencias objetivo se encuentran presentes en exceso, al Tm, el 50% de las sondas se encuentran ocupadas en equilibrio) . Las condiciones rígidas pueden ser aquellas en las cuales las concentración de sal es menor que aproximadamente 1.0 M de ion de sodio, típicamente de aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de ion de sodio (u otras sales) a un pH de 7.0 a 8.3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (incluyendo, pero sin limitarse a, 10 a 50 nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60° para sondas largas (incluyendo, pero sin limitarse a, más de 50 nucleótidos). Las condiciones rígidas también pueden lograrse con la adición de agentes de desestabilización tales como formamida. Para hibridación selectiva o específica, una señal positiva puede ser de al menos dos veces de fondo, opcionalmente de 10 veces de fondo de hibridación. Las condiciones de hibridación rígida ejemplares pueden ser como sigue: 50% formamida, 5X SSC, y SDS al 1%, incubación a 42°C, o 5X SSC, SDS al 1%, incubación a 65°C con lavado en 0.2 X SSC, y SDS al 1% a 65°C. tales lavados pueden efectuarse durante 5, 15, 30, 60, 120 o más minutos. Como se utiliza en la presente, el término "eucarioto" se refiere a organismos que pertenecen al dominio filogenético Eucarya, tales como animales (incluyendo, pero sin limitarse a, insectos, reptiles, aves, etc.), ciliados, plantas (incluyendo, pero sin limitarse a, monocotiledóneas, dicotiledóneas, algas, etc.), hongos, levaduras, flagelados, microsporidia, protists, etc. Como se utiliza en la presente, el término "no eucarioto" se refiere a organismos no eucarióticos. Por ejemplo, un organismo no eucariótico puede pertenecer al dominio filogenético Eubacteria (incluyendo, pero sin limitarse a, Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, etc.), o Archaea (incluyendo, pero sin limitarse a, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium tales como Haloferax volcanii y al dominio filogenético de la especie Halobacterium NRC-1, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, etc . ) . El término "sujeto" como se utiliza en la presente, se refiere a un animal, en algunas modalidades un mamífero, y en otras modalidades a un humano, que es el objetivo de tratamiento, observación o experimento. El término "cantidad efectiva" como se utiliza en la presente, se refiere a esa cantidad del polipéptido de aminoácido no natural modificado que se administra, que aliviará en cierto grado uno o más de los síntomas de la enfermedad, condición o trastorno que se trata. Las composiciones que contienen el polipéptido de aminoácido no natural modificado descrito en la presente, pueden administrarse para tratamientos profilácticos, de mejoramiento y/o terapéuticos. Los términos "mejorar" o "mejoramiento" significan que se aumenta o prolonga en potencia o duración un efecto deseado. Por consiguiente, con respecto al mejoramiento del efecto de agentes terapéuticos, el término "mejoramiento" se refiere a la capacidad para aumentar o prolongar ya sea en potencia o duración, el efecto de otros agentes terapéuticos en un sistema. Una "cantidad de mejoramiento efectiva" como se utiliza en la presente, se refiere a una cantidad adecuada para mejorar el efecto de otro agente terapéutico en un sistema deseado. Cuando se utilizan en un paciente, las cantidades efectivas para ese uso dependerán de la severidad y el curso de la enfermedad, trastorno o condición, la terapia previa, el estado de salud del paciente y la respuesta a las drogas, y al juicio del médico que lo trata. El término "modificado" como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier cambio efectuado a un polipéptido dado, tal como los cambios en la longitud del polipéptido, la secuencia de aminoácidos, la estructura química, la modificación co-translacional, o la modificación post-traducción de un polipéptido. La forma del término "(modificado)" significa que los polipéptidos tratados se encuentran opcionalmente modificados, es decir, los polipéptidos tratados pueden encontrarse modificados o no modificados . El término "modificado de manera post-traducción" se refiere a cualquier modificación de un aminoácido natural o no natural que se presenta en tal aminoácido después de haberse incorporado en una cadena de polipéptidos. El término abarca, solo a manera de ejemplo, modificaciones co-translacionales in vivo, modificaciones co-translacionales in vitro (tal como en un sistema de translación libre de células), modificaciones post-traducciónes in vivo y modificaciones post-traducciónes in vitro. En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen el polipéptido de aminoácido no natural modificado se administran a un paciente susceptible o de otra manera en riesgo de una enfermedad, trastorno o condición particular. Tal cantidad se define como una "cantidad profilácticamente efectiva". En este uso, las cantidades precisas dependen también del estado de salud del paciente, el peso y lo similar. Se considera dentro del experto en la técnica la determinación de tales cantidades profilácticamente efectivas mediante experimentación de rutina (e.g., un juicio clínico de escala de dosis). El término "protegido" se refiere a la presencia de un "grupo protector" o residuo que evita la reacción del grupo funcional químicamente reactivo bajo ciertas condiciones de reacción. El grupo protector variará dependiendo del tipo de grupo químicamente reactivo que se protege. Por ejemplo, si el grupo químicamente reactivo es una amina o una hidrazida, el grupo protector puede seleccionarse del grupo de ter-butiloxicarbonilo (t-Boc) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Si el grupo químicamente reactivo es un tiol, el grupo protector puede ser un ortopiridildisulfuro. Si el grupo químicamente reactivo es un ácido carboxílico, tal como ácido butanoico o propiónico, o un grupo hidroxilo, el grupo protector puede ser un grupo bencilo o alquilo tal como metilo, etilo, o ter-butilo. Otros grupos protectores conocidos en la técnica pueden utilizarse también en o con los métodos y composiciones descritos en la presente, incluyendo grupos fotolábiles tales como Nvoc y MeNvoc. Otros grupos protectores conocidos en la técnica pueden utilizarse también en o con los métodos y composiciones descritos en la presente. Solo a manera de ejemplo, los grupos de bloqueo/protección pueden seleccionarse de: Alilo Bn Cbz all .oc Me H3C--C "-- ! t-?C;?-"" Et t-butilo TBDMS Teoc Boc pMBn tritilo acetilo Fmoc Otros grupos protectores se describen en Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a ed . John Wiley & Sons, New York, NY, 1999, que se incorpora por la referencia en la presente en su totalidad. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones que contienen el polipéptido de aminoácido no natural modificado se administran a un paciente que sufre ya de una enfermedad, condición o trastorno, en una cantidad suficiente para curar o al menos disminuir parcialmente los síntomas de la enfermedad, trastorno o condición. Tal cantidad se define como una "cantidad terapéuticamente efectiva" y dependerá de la severidad y el curso de la enfermedad, trastorno o condición, la terapia previa, el estado de salud del paciente y la respuesta a las drogas, y al juicio del médico que lo trata. Se considera dentro del experto en la técnica la determinación de tales cantidades profilácticamente efectivas mediante experimentación de rutina (e.g., un juicio clínico de escala de dosis) . El término "tratar" se utiliza para referirse a tratamientos ya sea profilácticos y/o terapéuticos. Los polipéptidos de aminoácido codificado de manera no natural presentados en la presente, pueden incluir compuestos marcados de manera isotópica con uno o más átomos reemplazados por un átomo que tiene una masa atómica o número de masa diferente a la masa atómica o número de masa comúnmente encontrado en la naturaleza. Ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en los presentes compuestos incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, flúor y cloro, tales como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 180, 170, 35S, 18F, 36C1, respectivamente. Ciertos compuestos marcados de manera isotópica descritos en la presente, por ejemplo aquellos en los cuales se incorporan isótopos radiactivos tales como 3H y 1C, pueden ser útiles en análisis de distribución de tejido de drogas y/o sustratos. Además, la sustitución con isótopos tales como deuterio, i.e., 2H, puede producir ciertas ventajas terapéuticas resultantes de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, vida media in vivo incrementada o requerimientos de dosis reducidos. Todos los isómeros, incluyendo, pero sin limitarse a diastereómeros, enantiómeros, y mezclas de los mismos, se consideran como parte de las composiciones descritas en la presente. En modalidades adicionales o agregadas, los polipéptidos de aminoácido codificado de manera no natural se metabolizan al administrarse a un organismo que lo necesita para producir un metabolito que se utiliza entonces para producir un efecto deseado, incluyendo un efecto terapéutico deseado. En modalidades, agregadas o adicionales, son metabolitos activos de polipéptidos de aminoácido codificado de manera no natural. En algunas situaciones, los polipéptidos de aminoácido codificado de manera no natural pueden existir como tautomeros. Además, los polipéptidos de aminoácido codificado de manera no natural descritos en la presente pueden existir en formas no disueltas asi como disueltas con solventes farmacéuticamente aceptables tales como agua, etanol, y lo similar. Las formas disueltas también se consideran descritas en la presente. Los de experiencia ordinaria en la técnica reconocerán que algunos de los compuestos en la presente pueden existir en varias formas tautomericas . Todas esas formas tautoméricas se consideran como parte de las composiciones descritas en la presente. A menos que se indique lo contrario, se emplean métodos convencionales de espectroscopia de masa, NMR, HPLC, química proteica, bioquímica, técnicas y farmacología de ADN recombmante, dentro de la experiencia en la técnica. DESCRIPCIÓN DETALLADA I. Introducción Se proporcionan en la invención moléculas de GH, e.g., de hGH que comprenden al menos un aminoácido no natural. En ciertas modalidades de la invención, el polipéptido de GH, e.g., de hGH con al menos un aminoácido no natural incluye al menos una modificación post-traducción.
En una modalidad, la al menos una modificación posttraducción comprende la unión de una molécula incluyendo, pero sin limitarse a, una marca, un colorante, un polímero, un polímero soluble en agua, un derivado de polietilen glicol, un fotorreticulador, un radionúclido, un compuesto citotóxico, una droga, una marca de afinidad, una marca de fotoafinidad, un compuesto reactivo, una resina, una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un quelador de metal, un cofactor, un ácido graso, un carbohidrato, un polinucleótido, un ADN, un ARN, un polinucleótido de antisentido, un sacárido, dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un ácido ribonucleico inhibidor, un biomaterial, una nanopartícula, una marca giratoria, un fluoróforo, un residuo que contiene metal, un residuo radiactivo, un nuevo grupo funcional, un grupo que interactúa de manera covalente o no covalente con otras moléculas, un residuo fotoencerrado, un residuo excitable de radiación actínica, un residuo fotoisomerizable, biotina, un derivado de biotina, un análogo de biotina, un residuo que incorpora un átomo pesado, un grupo químicamente separable, un grupo foto separable, una cadena lateral alargada, un azúcar enlazado a carbono, un agente activo de reducción, un amino tioácido, un residuo tóxico, un residuo marcado de manera isotópica, una sonda biofísica, un grupo fosforescente, un grupo quimioluminiscente, un grupo denso de electrón, un grupo magnético, un grupo de intercalado, un cromóforo, un agente de transferencia de energía, un agente biológicamente activo, una marca detectable, una molécula pequeña, un punto cuántico, un nanotransmisor, un radionucleótido, un radiotransmisor, un agente de captura de neutrón, o cualquier combinación de los anteriores o cualquier otro compuesto o sustancia deseable que comprende un segundo grupo reactivo para al menos un aminoácido no natural que comprende un primer grupo reactivo utilizando metodología química conocida por el de experiencia ordinaria en la técnica por ser adecuada para los grupos reactivos particulares. Por ejemplo, el primer grupo reactivo es un residuo alquinilo (incluyendo, pero sin limitarse a, en la p-propargiloxifenilalanina de aminoácido no natural, en donde el grupo propargilo también se refiere algunas veces como un residuo acetileno) , y el segundo grupo reactivo es un residuo azida, y se utilizan metodologías de química de cicloadición [3+2]. En otro ejemplo, el primer grupo reactivo es el residuo azida (incluyendo, pero sin limitarse a, en la p-azida-L-fenilalanina de aminoácido no natural) y el segundo grupo reactivo es el residuo alquinilo. En ciertas modalidades del polipéptido de GH modificado, e.g., de hGH de la presente invención, se utiliza al menos un aminoácido no natural (incluyendo, pero sin limitarse a, el aminoácido no natural que contiene un grupo ceto funcional) que comprende al menos una modificación post-traducción, en donde la al menos una modificación post-traducción comprende un residuo sacárido. En ciertas modalidades, la modificación post-traducción se efectúa in vivo en una célula eucariótica o en una célula no eucariótica. En ciertas modalidades, la proteína incluye al menos una modificación post-traducción que se elabora in vivo por una célula huésped, en donde la modificación post-traducción no se elabora normalmente por otro tipo de célula huésped. En ciertas modalidades, la proteína incluye al menos una modificación post-traducción que se elabora in vivo por una célula eucariótica, en donde la modificación posttraducción no se efectúa normalmente por una célula no eucariótica. Ejemplos de modificaciones post-traducciónes incluyen, pero no se limitan a, glicosilación, acetilación, acilación, modificación de lípidos, palmitoilación, adición de palmitato, fosforilación, modificación de enlace de glicolípidos y lo similar. En una modalidad, la modificación post-traducción comprende la unión de un oligosacárido a una asparagina mediante un enlace de GlcNAc-asparagina (incluyendo, pero sin limitarse a, cuando el oligosacárido comprende (GlcNAc-Man) 2-Man-GlcNAc-GlcNAc, y lo similar). En otra modalidad, la modificación post-traducción comprende la unión de un oligosacárido (incluyendo, pero sin limitarse, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, etc.) a una serina o treonina mediante un enlace GalNAc-serina, GalNAc-treonina, GlcNAc-serina o GlcNAc-treonina . En ciertas modalidades, una proteína o polipéptido de la invención puede comprender una secuencia de secreción o localización, una marca de epítope, una marga FLAG, una marca polihistidina, una fusión GST, y/o lo similar. Ejemplos de secuencias de señal de secreción, incluyen, pero sin limitarse a, una secuencia procariótica de señal de secreción, una secuencia eucariótica de señal de secreción, una secuencia eucariótica de señal de secreción 5' -optimizada para expresión bacterial, una nueva secuencia de señal de secreción, una secuencia de pectato liasa de señal de secreción, una secuencia Omp A de señal de secreción, y una secuencia fago de señal de secreción. Ejemplos de secuencias de señal de secreción incluyen, pero no se limitan a, STII (procariótica), Fd Gilí y M13 (fago), Bgl2 (levadura), y la secuencia de señal bla derivada de un transposón . La proteína o polipéptido de interés puede contener al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o diez o más aminoácidos no naturales. Los aminoácidos no naturales pueden ser el mismo o diferente, por ejemplo, pueden existir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sitios diferentes en la proteína que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos no naturales diferentes. En ciertas modalidades, al menos uno, pero menos que todos, de los aminoácidos particulares presentes en la versión de origen natural de la proteína, se sustituye con un aminoácido no natural. La presente invención proporciona métodos y composiciones a base de miembros de la familia del supergén de GH, en particular hGH, que comprenden al menos un aminoácido codificado de manera no natural. La introducción de al menos un aminoácido codificado de manera no natural en un miembro de la familia del supergén de GH puede permitir la aplicación de químicas de conjugación que implican las reacciones químicas específicas, que incluyen, pero no se limitan a, con uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals siempre que no reaccionen con los 20 aminoácidos que se presentan comúnmente. En algunas modalidades, el miembro de la familia del supergén de GH que comprende el aminoácido codificado de manera no natural se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua tal como polietilen glicol (PEG) , a través de la cadena lateral del aminoácido codificado de manera no natural. Esta invención proporciona un método altamente eficiente para la modificación selectiva de proteínas con derivados de PEG, que implica la incorporación selectiva de aminoácidos no genéticamente codificados, incluyendo, pero sin limitarse a, aquellos aminoácidos que contienen grupos funcionales o sustituyentes no encontrados en los 20 aminoácidos naturalmente incorporados, incluyendo, pero sin limitarse a cetona, un residuo azida o acetileno, en proteínas en respuesta a un codón de selección y la modificación subsecuente de aquellos aminoácidos con un derivado de PEG adecuadamente reactivo. Una vez incorporadas, las cadenas laterales de aminoácido pueden entonces modificarse utilizando metodologías de química conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica por ser adecuados para los grupos funcionales o sustituyentes particulares presentes en el aminoácido codificado de manera no natural . Las metodologías químicas conocidas de una amplia variedad son adecuadas para su uso en la presente invención para la incorporación de un polímero soluble en agua en la proteína. Tales metodologías incluyen, pero no se limitan a la reacción Huisgen de cicloadición [3+2] (ver, e.g., Padwa A. en Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4 (1991) Ed. Trost. B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; y Huisgen R. en 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176) con, incluyendo pero sin limitarse a, derivados de acetileno o azida, respectivamente . Dado que el método Huisgen de cicloadición [3+2] implica una cicloadición en lugar de una reacción de sustitución nucleofílica, las proteínas pueden modificarse con una selectividad extremadamente alta. La reacción puede llevarse a cabo a temperatura ambiente en condiciones acuosas con excelente regioselectividad (1,4 > 1,5) por medio de la adición de cantidades catalíticas de sales de Cu (I) a la mezcla de reacción. Ver, e.g., Tornoe et al., (2002) J. Org. Chem., 67:3057-3064; y Rostovtsev et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed., 41:2596-2599; y WO 03/101972. Una molécula que puede agregarse a una proteína de la invención mediante una cicloadición [3+2] incluye virtualmente cualquier molécula con un grupo funcional o sustituyente adecuado incluyendo, pero sin limitarse a un derivado azida o acetileno. Estas moléculas pueden agregarse a un aminoácido no natural con un grupo acetileno, incluyendo, pero sin limitarse a, p-propargiloxifenilalanina o grupo azida, incluyendo, pero sin limitarse a p-azida-fenilalanina, respectivamente. El anillos de cinco miembros que resulta de la cicloadición Huisgen [3+2] no es generalmente reversible en la reducción de ambientes y es estable contra la hidrólisis durante extensos períodos en ambientes acuosos. En consecuencia, las características físicas y químicas de una amplia variedad de sustancias pueden modificarse bajo demandantes condiciones acuosas con los derivados de PEG activo de la presente invención. Incluso más importante, debido a que los residuos azida y acetileno son específicos uno para el otro (y, por ejemplo, no reaccionan con ninguno de los 20 aminoácidos comunes genéticamente codificados), las proteínas pueden modificarse en uno o más sitios específicos con una selectividad extremadamente alta. La invención proporciona también derivados solubles en agua e hidrolíticamente estables de los derivados de PEG y polímeros hidrófilos relacionados que tienen uno o más residuos acetileno o azida. Los derivados de polímero de PEG que contienen residuos acetileno son altamente selectivos para el acoplamiento con residuos azida que se han introducido selectivamente en proteínas en respuesta a un codón de selección. De manera similar, los derivados de polímero de PEG que contienen residuos azida son altamente selectivos para el acoplamiento con residuos acetileno que se han introducido selectivamente en proteínas en respuesta a un codón de selección. Más específicamente, los residuos azida comprenden, pero no se limitan a, alquilo azidas, arilo azidas y derivados de estos azidas. Los derivados de los azidas alquilo y arilo pueden incluir otros sustituyentes siempre que se mantenga la reactividad específica de acetileno. Los residuos de acetileno comprenden alquilo y arilo acetilenos y derivados de cada uno. Los derivados de los alquilo y arilo acetilenos pueden incluir otros sustituyentes siempre que se mantenga la reactividad específica de azida. La presente invención proporciona conjugados de sustancias que tienen una amplia variedad de grupos funcionales, sustituyentes o residuos, con otras sustancias incluyendo, pero sin limitarse a, una marca; un colorante; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilen glicol; un fotorreticulador ; un radionúclido; un compuesto citotóxico; una droga; una marca de afinidad; una marca de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un cofactor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido de antisentido; un sacárido; dendrímero soluble en agua; una ciclodextrina; un ácido ribonucleico inhibidor; un biomaterial; una nanopartícula; una marca giratoria; un fluoróforo; un residuo que contiene metal; un residuo radiactivo; un nuevo grupo funcional; un grupo que interactúa de manera covalente o no covalente con otras moléculas; un residuo fotoencerrado; un residuo excitable de radiación actínica; un residuo fotoisomerizable; biotina; un derivado de biotina; un análogo de biotina; un residuo que incorpora un átomo pesado; un grupo químicamente separable; un grupo foto separable; una cadena lateral alargada; un azúcar enlazado a carbono; un agente activo de reducción; un amino tioácido; un residuo tóxico; un residuo marcado de manera isotópica; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrón; un grupo magnético; un grupo de intercalado; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una marca detectable; una molécula pequeña; un punto cuántico; un nanotransmisor; un radionucleótido; un radiotransmisor; un agente de captura de neutrón; o cualquier combinación de los anteriores o cualquier otro compuesto o sustancia deseable. La presente invención incluye también conjugados de sustancias que tienen residuos azida o acetileno con derivados de polímero de PEG que tienen los residuos de acetileno o azida correspondientes. Por ejemplo, un polímero de PEG que contiene un residuo azida puede acoplarse a una molécula biológicamente activa en una posición en la proteína que contiene un aminoácido no genéticamente codificado que contiene una funcionalidad de acetileno. El enlace mediante el cual se acoplan el PEG y la molécula biológicamente activa incluye, pero no se limita al producto Huisgen de cicloadición [3+2]. Se encuentra muy establecido en la técnica que el PEG puede utilizarse para modificar las superficies de biomateriales (ver, e.g., Patente de E.U. No. 6,610,281; Mehvar, R. J., Pharm. Pharm. Sci., 3(1):125-136 (2000) que se incorporan mediante la referencia en la presente) . La invención incluye también biomateriales que comprenden una superficie que tiene uno o más sitios azida o acetileno reactivos y uno o más de los polímeros que contienen azida o acetileno de la invención acoplados a la superficie mediante el enlace Huisgen de cicloadición [3+2]. Los biomateriales y otras sustancias también pueden acoplarse a los derivados del polímero activado por azida o acetileno a través de un enlace diferente al enlace de azida o acetileno, tal como a través de un enlace que comprende un residuo de ácido carboxílico, amina, alcohol o tiol para dejar disponible el residuo azida o acetileno para reacciones subsecuentes. La invención incluye un método para sintetizar los polímeros que contienen azida y acetileno de la invención. En el caso del derivado de PEG que contiene azida, la azida puede unirse directamente a un átomo de carbono del polímero. Alternativamente, el derivado de PEG que contiene azida puede prepararse uniendo un agente de enlace que tiene el residuo azida en una terminación, a un polímero convencional activado, de manera que el polímero resultante tiene el residuo azida en su terminación. En el caso del derivado de PEG que contiene acetileno, el acetileno puede unirse directamente a un átomo de carbono del polímero. Alternativamente el derivado de PEG que contiene acetileno puede prepararse uniendo un agente de enlace que tiene el residuo acetileno en una terminación, a un polímero convencional activado, de manera que el polímero resultante tiene el residuo acetileno en su terminación.
Más específicamente, en el caso del derivado de PEG que contiene azida, un polímero soluble en agua que tiene al menos un residuo hidroxilo activo, experimenta una reacción para producir un polímero sustituido que tiene un residuo más reactivo, tal como un grupo de salida mesilato, tresilato, tosilato o halógeno en el mismo. La preparación y el uso de derivados de PEG que contienen haluros de ácido sulfonilo, átomos de halógeno y otros grupos de salida son conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. el polímero sustituido resultante experimenta entonces una reacción para sustituir por el residuo mas reactivo un residuo azida en la terminación del polímero. Alternativamente, un polímero soluble en agua que tiene al menos un residuo nucleofílico o electrofílico experimenta una reacción con un agente de enlace que tiene un azida en una terminación de manera que se forma una unión covalente entre el polímero de PEG y el agente de enlace y el residuo azida se coloca en la terminación del polímero. Los residuos nucleofílicos y electrofílicos, incluyendo aminas, tioles, hidrazidas, hidraz as, alcoholes, carboxilatos, aldehidos, cetonas, tioésteres y lo similar, son conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. Más específicamente, en el caso del derivado de PEG que contiene acetileno, un polímero soluble en agua que tiene al menos un residuo hidroxilo activo experimenta una reacción para desplazar un halógeno u otro grupo de salida activado de un precursor que contiene un residuo acetileno. Alternativamente, un polímero soluble en agua que tiene al menos un residuo nucleofílico o electrofílico experimenta una reacción con un agente de enlace que tiene un acetileno en una terminación de manera que se forma una unión covalente entre el polímero de PEG y el agente de enlace y el residuo acetileno se coloca en la terminación del polímero. El uso de residuos de halógeno, el grupo de salida activado, los residuos nucleofílicos y electrofílicos en el contexto de la síntesis orgánica y la preparación y el uso de derivados de PEG se encuentran muy establecidos para los practicantes de la técnica. La invención proporciona también un método para la modificación selectiva de proteínas para agregar otras sustancias a la proteína modificada, incluyendo, pero sin limitarse a, polímeros solubles en agua tales como PEG y derivados de PEG que contienen un residuo azida o acetileno. Los derivados de PEG que contienen azida y acetileno pueden utilizarse para modificar las propiedades de superficies y moléculas proporcionando al mismo tiempo un medio más selectivo para unir los derivados de PEG a proteínas que el previamente conocido en la técnica. II. Familia del Supergén de la Hormona del crecimiento Las siguientes proteínas incluyen aquellas codificadas por los genes de la familia del supergén de la hormona del crecimiento (GH) (Bazan F., Immunology Today 11:350-354; Bazan J. F. Science 257:410-413 (1992); Mott H. R., y Campbell I. D., Current Opinión in Structural Biology 5:114-121 (1995); Silvennoinen, O e Ihle, J. N., Signalling by the Hematopoietic Cytokine Receptors (1996)); hormona del crecimiento, prolactina, lactógeno de placenta, eritropoyetina (EPO) , trombopoyetina (TPO) , interleucina-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (subunidad p35), IL-13, IL-15, oncostatina M, factor ciliar neurotrófico (CNTF) , factor inhibidor de leucemia (LIF) , interferón alfa, interferón beta, interferón épsilon, interferón gamma, interferón omega, interferón tau, factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF) , factor estimulante de colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulador de colonia de macrófagos (M-CSF) y cardiotrofina-1 (CT-1) ("la familia del supergén de GH") . Se anticipa que los miembros adicionales de esta familia del gen se identificarán en el futuro a través de clonación y secuenciado del gen. Los miembros de la familia del supergén de GH tienen estructuras secundarias y terciarias similares, a pesar del hecho de que generalmente tienen limitada identidad de secuencia de aminoácidos o ADN. Las características estructurales compartidas permiten la fácil identificación de nuevos miembros de la familia del gen y la aplicación similar de los métodos y composiciones del aminoácido no natural descritos en la presente. Dado el grado de homología estructural entre los miembros de la familia del supergén de GH, pueden incorporarse aminoácidos codificado de manera no naturals en cualquiera de los miembros de la familia del supergén de GH utilizando la presente invención. Cada miembro de esta familia de proteínas comprende un conjunto de cuatro hélices, cuya estructura general se muestra en la Figura 1. Las estructuras generales de los miembros de la familia hGH, EPO, IFNa-2 y G-CSF se muestran en las Figuras 2, 3, 4 y 5, respectivamente . Las estructuras de un número de citosinas, incluyendo G-CSF (Zink et al., FEBS Lett. 314:435 (1992); Zink et al., Biochemistry 33:8453 (1994); Hill et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:5167 (1993), GM-CSF (Diederichs, K., et al., Science 154:1779-1782 (1991); Walter et al., J. Mol. Biol., 224:1075-1085 (1992)), IL-2 (Bazan J. F., y McKay, D. B. Science 257:410-413 (1992), IL-4 (Redfield et al., Biochemistry 30:11029-11035 (1991); Powers et al., Science 256:1673-1677 (1992)), e IL-5 (Milburn et al., Nature 363:172-176 (1993)) se han determinado mediante difracción de rayos X y estudios de NMR y muestran una conservación nivelada con la estructura de GH a pesar de la falta de una homología de secuencia primaria significativa. IFN se considera un miembro de esta familia en base al modelado y otros estudios (Lee et al., Interferon Cytokine Res., 15:341 (1995); Murgolo et al., Proteins 17:62 (1993); Radhakrishnan et al., Structure 4:1453 (1996); Klaus et al., J. Mol. Biol. 274:661 (1997)). EPO se considera un miembro de esta familia en base al modelado y a estudios de mutagénesis (Boissel et al., J. Biol. Chem. 268:15983-15993 (1993); Wen et al., J. Biol. Chem., 269:22839-22846 (1994)). Actualmente se considera que todas las citosinas y factores de crecimiento anteriores comprenden una gran familia del gen. Además de compartir estructuras secundarias y terciarias similares, los miembros de esta familia comparten la propiedad de que deben oligomerizar receptores de superficie celular para activar las rutas de señalización intracelular. Algunos miembros de la familia de GH, incluyendo, pero sin limitarse a: GH y EPO, se unen a un solo tipo de receptor y ocasionan que forme homodímeros. Otros miembros de la familia, incluyendo, pero sin limitarse a IL-2, IL-4 e IL-6, se unen a más de un tipo de receptor y ocasionan que los receptores formen heterodímeros o agregados de orden mayor (Davis et al., (1993), Science 260:1805-1808; Painessa et al., (1995), EMBO J. 14:1942-1951; Mott y Campbell, Current Opinión in Structural Biology 5:114-121 (1995)). Los estudios de mutagénesis han mostrado que, como la GH, estas otras citosinas y factores de crecimiento contienen múltiples sitios de unión del receptor, típicamente dos, y unen a sus receptores cognado secuencialmente (Mott y Campbell, Current Opinión in Structural Biology 5:114-121 (1995); Matthews et al., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci., EUA 93:9471-9476). Como para la GH, los sitios primarios de unión del receptor para estos otros miembros de la familia se presentan principalmente en las cuatro hélices alfa y en el circuito A-B. Los aminoácidos específicos en los conjuntos helicoidales que participan en la unión del receptor difieren entre los miembros de la familia. La mayoría de los receptores de superficie celular que interactúan con miembros de la familia del supergén de GH se encuentran relacionados estructuralmente y comprenden una segunda gran familia multi-genes. Ver e.g., Patente de E.U. No. 6,608,183, que se incorpora por la referencia en la presente. Una conclusión general lograda a partir de estudios de mutación de varios miembros de la familia del supergén de GH es que los ciclos que unen las hélices alfa tienden generalmente a no encontrarse involucrados en la unión del receptor. En particular, el circuito corto B-C parece ser no esencial para la unión del receptor en la mayoría, si no es que en todos, de los miembros de la familia. Por esta razón, el circuito B-C puede sustituirse con aminoácidos codificado de manera no naturals como se describe en la presente en miembros de la familia del supergén de GH . El circuito A-B, el circuito C-D (y el circuito D-E de miembros tipo interferón/IL-10 de la superfamilia de GH) también pueden sustituirse con un aminoácido de origen no natural. Los aminoácidos próximos a la hélice A y distantes a la hélice final también tienden a no encontrarse implicados en la unión del receptor y también pueden ser sitios para la introducción de aminoácidos de origen no natural. En algunas modalidades, un aminoácido codificado de manera no natural se sustituye en cualquier posición dentro de una estructura de circuito, incluyendo pero sin militarse a, los primeros 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o más aminoácidos del circuito A-B, B-C, C-D o D-E. En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals se sustituyen dentro de los últimos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más aminoácidos del circuito A-B, B-C, C-D o D-E. Ciertos miembros de la familia de GH, incluyendo, pero sin limitarse a, EPO, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, G-CSF, TPO, IL-10, IL-12 p35, IL-13, IL-15 y interferón beta, contienen azúcares enlazados a N y/O enlazados a O. los sitios de glicosilación en las proteínas se presentan casi exclusivamente en las regiones de circuito y no en los conjuntos de hélice alfa. Debido a que las regiones de circuito generalmente no se encuentran implicadas en la unión del receptor y debido a que son sitios para la unión covalente de grupos azúcar, pueden ser sitios útiles para la introducción de sustituciones de aminoácido de origen no natural en las proteínas. Los aminoácidos que comprenden los sitios de glicosilación enlazados a N u 0 en las proteínas pueden ser sitios para sustituciones de aminoácido de origen no natural debido a que estos aminoácidos son de superficie expuesta. En consecuencia, la proteína natural puede tolerar grupos azúcar bultosos unidos a las proteínas en estos sitios y los sitios de glicosilación tienden a encontrarse ubicados lejos de los sitios de unión del receptor. En el futuro, es probable que se descubran miembros adicionales de la familia del supergén de GH . Nuevos grupos de la familia del supergén de GH pueden identificarse a través de análisis de estructura secundaria y terciaria auxiliados por computadora de las secuencias de proteínas predichas, y mediante técnicas de selección diseñadas para identificar moléculas que se unen a un objetivo particular. Los miembros de la familia del supergén de GH poseen típicamente cuatro o cinco hélices amfifáticas por aminoácidos no helicoidales (las regiones de circuito). Las proteínas pueden contener una secuencia de señal hidrófoba en su terminación N para promover la secreción de la célula. Tales miembros últimamente descubiertos de la familia del supergén de GH también se encuentran incluidos dentro de esta invención. Una solicitud relacionada es la Solicitud de Patente Internacional titulada "Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses" publicada como WO 05/074650 en Agosto 18 de 2005, la cual se incorpora en la presente por la referencia . Por consiguiente, la descripción de la familia del supergén de la hormona del crecimiento se proporciona solo para propósitos ilustrativos y a manera de ejemplo y no como limitante del alcance de los métodos, composiciones, estrategias y técnicas descritas en la presente. Además, la referencia a polipéptidos de GH en esta solicitud pretende utilizar el término genérico como ejemplo de cualquiera de los miembros de la familia del supergén de GH . Por consiguiente, se entiende que las modificaciones y químicas descritas en la presente con referencia a los polipéptidos o proteínas de hGH pueden aplicarse igualmente a cualquiera de los miembros de la familia del supergén de GH, incluyendo aquellos específicamente listados en la presente. III. Métodos Generales de Ácido Nucleico Recombinante para su Uso con la Invención En numerosas modalidades de la presente invención, los ácidos nucleicos que codifican para un Polipéptido de GH, e.g., de hGH, de interés se aislarán, se clonarán y frecuentemente se alterarán utilizando métodos recombinantes. Se utilizan tales modalidades incluyendo, pero sin limitarse a, para expresión de proteínas o durante la generación de variantes, derivados, casetes de expresión, u otras secuencias derivadas de un Polipéptido de GH, e.g., de hGH. En algunas modalidades, las secuencias que codifican para los polipéptidos de la invención se encuentran operablemente enlazadas a un promotor heterólogo. El aislamiento de la hGH y la producción de la GH en células huésped se describen e.g., en las Patentes de E.U. Nos. 4,601,980, 4,604,359, 4,634,677, 4,658,021, 4,898,830, 5,424,199, 5,795,745, 5,854,026, 5,849,535; 6,004,931; 6,022,711; 6,143,523 y 6,608,183 las cuales se incorporan en la presente por la referencia. Una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural, puede sintetizarse en base a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de origen, incluyendo, pero sin limitarse a, teniendo la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 (hGH) y después cambiando la secuencia de nucleótidos a fin de efectuar la introducción (i.e., incorporación o sustitución) o el retiro (i.e., supresión o sustitución) de el (los) residuo (s= de aminoácido relevante (s ) . La secuencia de nucleótidos puede modificarse convenientemente mediante mutagénesis dirigida al sitio de acuerdo con los métodos convencionales. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos puede prepararse mediante síntesis química incluyendo, pero sin limitarse a, utilizando un sintetizador de oligonucleótidos, en donde los oligonucleótidos se diseñan en base a la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado, y preferentemente seleccionando aquellos codones favorecidos en la célula huésped en la cual se producirá el polipéptido recombinante. Por ejemplo, diversos oligonucleótidos pequeños que codifican para porciones del polipéptido deseado pueden sintetizarse y ensamblarse mediante PCR, ligando o reacción de ligando en cadena. Ver, e.g., Barany et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 88:189-193 (1991); Patente de E.U. 6,521,427 que se incorpora en la presente por la referencia. Esta invención utiliza técnicas de rutina en el campo de la genética recombinante. Los textos básicos que describen los métodos generales de uso en esta invención incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)). Los textos generales que describen técnicas biológicas moleculares incluyen Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzimology volumen 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2a ed.) volumen 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") y Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds. Current Protocols, una asociación entre Greene Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc., (suplementada en 1999) ("Ausubel")). Estos textos describen mutagénesis, el uso de vectores, promotores y muchos otros tópicos relevantes relacionados con, incluyendo, pero sin limitarse a, la generación de genes o polinucleótidos que incluyen codones de selección para la producción de proteínas que incluyen aminoácidos no naturales, ARNts ortogonales, sintetasas ortogonales y sus pares. Se utilizan en la invención varios tipos de mutagénesis para una diversidad de propósitos, incluyendo, pero sin limitarse a, para la producción de nuevas sintetasas o ARNts, para la mutación de moléculas de ARNt, para la mutación de polinucleótidos que codifican para sintetasas, para la producción de bibliotecas de ARNts, para la producción de bibliotecas de sintetasas, para la producción de codones de selección, para la inserción de codones de selección que codifican para aminoácidos no naturales en una proteína o polipéptido de interés. Estos incluyen, pero no se limitan a mutagénesis de punto aleatorio dirigida al sitio, recombinación homologa, arrastre de ADN u otros métodos de mutagénesis repetitivos, construcción quimérica, mutagénesis utilizando plantillas que contienen uracilo, mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, mutagénesis de ADN modificada con fosforotioato, mutagénesis utilizando ADN de doble abertura o lo similar, o cualquier combinación de las mismas. Los métodos adicionales adecuados incluyen reparación de no correspondencia de punto, mutagénesis utilizando cadenas huéspedes deficientes en reparación, restricción-selección y restricción-purificación, mutagénesis de supresión, mutagénesis mediante síntesis de gen total, reparación de fractura bicatenaria, y lo similar. Las mutagénesis, incluyendo, pero sin limitarse a, las que implican estructuras quiméricas se encuentran también incluidas en la presente invención. En una modalidad, la mutagénesis puede guiarse por la información conocida de la molécula de origen natural o molécula alterada o mutada de origen natural, incluyendo, pero sin limitarse a, secuencia, comparaciones de secuencia, propiedades físicas, estructura secundaria, terciaria o cuaternaria, estructura cristalina o lo similar. Los textos y ejemplos encontrados en la presente describen estos procedimientos. Se encuentra información adicional en las siguientes publicaciones y referencias citadas en: Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal. Biochem., 254 (2 ): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol., 57:369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet., 19:423-462 (1985); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201 (1985); Cárter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1- 7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, en Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlín) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82:488-491 (1985); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol, 154, 367-382 (1987); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res., 10:6487-6500 (1982); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol, 100:468-500 (1983); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagénesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA témplate, Methods in Enzymol., 154:329-350 (1987); Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucí. Acids Res., 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frecuency using phosphorothioate-modified DNA, Nucí.
Acids Res., 13:8765-8785 (1985); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucí. Acids Res., 14:9679-9698 (1986); Sayers et al., 5'-3' Exonucleases m phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucí. Acids Res., 16:791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containmg DNA by reaction with restpction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucí. Acids Res., 16:803-814; Kramer et al., The gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucí. Acids Res., 12:9441-9456 (1984); Kramer & Fritz, Oligonucleotide-directed construction of mutations vía gapped dúplex DNA, Methods in Enzymol., 154:350-367 (1987); Kramer et al., Improved enzymatic m vitro reactions in the gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucí. Acids Res., 16:7207 (1988); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped dúplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucí. Acids Res., 16:6987-6999 (1988); Kramer et al., Different base/base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNA mismatch-repair system of E. coll, Cell 38:879-887 (1984); Cárter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucí. Acids Res., 13:4431-4443 (1985); Cárter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol., 154:382-403 (1987); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to genérate large deletions, Nucí. Acids Res. 14:5115 (1986); Wells et al., Importance of Hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond., A 317:415-423 (1986); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223:1299-1301 (1984); Sakmar y Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin) , Nucí. Acids Res., 14:6361-6372 (1988); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of múltiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Grundstrom et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale "shot-gun" gene synthesis, Nucí. Acids Res., 13:3305-3316 (1985); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-stranded break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 83:7177-7181 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinión in Biotechnology 4:450-455 (1993); Sieber et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001); W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); y I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res., 23, 3067-8 (1995). Detalles adicionales acerca de muchos de los métodos anteriores pueden encontrarse en Methods in Enzymology, Volumen 154, que también describe controles útiles para problemas de localización de averías con varios métodos de mutagénesis. Los oligonucleótidos, e.g., para uso en la mutagénesis de la presente invención, e.g., bibliotecas de mutación de sintetasas, o en la alteración de ARNts, típicamente se sintetizan químicamente de acuerdo con el método de fosforamidita triéster en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letts., 22 (20) : 1859-1862 (1981), e.g., utilizando un sintetizador automatizado, como se describe en Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res. , 12: 6159-6168 (1984) . La invención se refiere también a células huésped eucarióticas, células huésped no eucarióticas y organismos para la incorporación in vivo de un aminoácido no natural a través de pares de ARNt ortogonal/RS . Las células huésped se encuentran genéticamente fabricadas (incluyendo, pero sin limitarse a, transformadas, transducidas o transfectadas) con los polinucleótidos de la invención o estructuras que incluyen un polinucleótido de la invención, incluyendo, pero sin limitarse a, un vector de la invención, que puede ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. Por ejemplo, las regiones de codificación para el ARNt ortogonal, la ARNt sintetasa ortogonal, y la proteína que va a derivarse, se encuentran operablemente enlazadas a elementos de control de la expresión del gen que son funcionales en la célula huésped deseada. El vector puede encontrarse, por ejemplo, en forma de un plásmido, un cósmido, un fago, una bacteria, un virus, un polinucleótido desnudo, o un polinucleótido conjugado. Los vectores se introducen en células y/o microorganismos mediante métodos estándar incluyendo electroporación (Fromm et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82, 5824 (1985)), infección por vectores virales, penetración balística de alta velocidad mediante pequeñas partículas con el ácido nucleico ya sea dentro de la matriz de pequeñas perlas o partículas, o sobre la superficie (Klein et al., Nature, 327, 70-73 (1987), y/o lo similar. Las células huésped fabricadas pueden cultivarse en medio nutritivo convencional modificado según sea apropiado para actividades tales como, por ejemplo, etapas de visualización, promotores de activación o transformadores de selección. Estas células opcionalmente, pueden cultivarse en organismos transgénicos. Otras referencias útiles, incluyendo, pero sin limitarse a, para aislamiento y cultivo celular (e.g., para subsecuente aislamiento del ácido nucleico) incluyen, Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley-Liss, New York, y las referencias citadas en la misma; Payne et al., (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY; Gamborg y Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab. Manual, Springer-Verlag (Berlín Hiedelberg, New York) y Atlas y Parks (eds) The Handbook of Microbiologycal Media (1993) CRC Press, Boca Ratón, FL . Varios métodos muy conocidos para la introducción de ácidos nucleicos objetivo en células se encuentran disponibles, de los cuales cualquiera puede utilizarse en la invención. Estos incluyen: fusión de las células receptoras con protoplastos bacteriales que contienen el ADN, electroporación, bombardeo de proyectil, e infección con vectores virales (tratado adicionalmente, abajo), etc. Las células bacteriales pueden utilizarse para amplificar el número de plásmidos que contienen las estructuras de ADN de esta invención. Las bacterias se cultivan en fase log y los plásmidos dentro de las bacterias pueden aislarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook) . Adicionalmente, se encuentran comercialmente disponibles equipos para la purificación de plásmidos de bacterias, (ver, e g., EasyPrep™, FlexiPrep™, ambos de Pharmacia Biotech.; StrataClean™ de Stratagene; y QIAprep™, de Qiagen) . Los plásmidos aislados y purificados se manipulan entonces adicionalmente para producir otros plásmidos, utilizados para transfectar células o incorporados en vectores relacionados para infectar organismos. Los vectores típicos contienen term adores de transcripción y translación, secuencias de iniciación de transcripción y translación, y promotores útiles para regular la expresión del acido nucleico objetivo particular. Los vectores comprenden opcionalmente secuencias que permiten la replicacion del cásete en eucariotas, o procariotas, o ambas, (incluyendo pero sin limitarse a, vectores de lanzadera) y marcadores de selección para sistemas tanto procarióticos como eucarioticos . Los vectores son adecuados para repetición e integración en procariotas, eucariotas o ambos. Ver, Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts et al., Nature, 328:731 (1987); Schneider E., et al., Protein Expr. Pupf., 6(1): 10-14 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (todos supra) . Se proporciona un catalogo de bacterias y bacteriófagos útiles para clonación, e.g., por la ATCC, e.g., The ATCC Catalogue of Bacteria and Bactepophage (1992) Gherna et al., (eds) publicado por la ATCC. También se encuentran procedimientos básicos adicionales para secuenciado, clonación y otros aspectos de la biología molecular y subrayando las consideraciones teóricas en Watson et al., (1992) Recombinant DNA Second Edition, Scientific American Books, NY. Además, esencialmente cualquier ácido nucleico (y virtualmente cualquier ácido nucleico marcado, ya sea estándar o no estándar) puede ordenarse a la medida o estándar de cualquiera de una variedad de fuentes comerciales, tales como la Midland Certified Reagent Company (Midland, TX, disponible en la World Wide Web en mcrc.com), The Great American Gene Company (Ramona, CA, disponible en la World Wide Web en genco.com), ExpressGen Inc., (Chicago, IL, disponible en la World Wide Web en expressgen.com), Operon Technologies Inc., (Alameda, CA) y muchas otras. (a) Codones de Selección los codones de selección de la invención expanden la estructura genética del codón de la maquinaria biosintética de la proteína. Por ejemplo, un codón de selección incluye, pero no se limita a, un codón único de tres bases, un codón de no sentido, tal como un codón de paro, incluyendo, pero son limitarse a un codón ámbar (UAG) , un codón ocre, un codón opalino (UGA), un codón no natural, un codón de cuatro o más bases, un codón raro, o lo similar. Es fácilmente aparente para los de experiencia ordinaria en la técnica que existe un amplio rango en el número de codones de selección que pueden introducirse en un gen o polinucleótido deseado, incluyendo pero sin limitarse a, uno o más, dos o más, tres o más, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más en un solo polinucleótido que codifica para al menos una porción del polipéptido de hGH. En una modalidad, los métodos implican el uso de un codón de selección que es un codón de paro para la incorporación de uno o más aminoácidos no naturales in vivo en una célula. Por ejemplo, se produce un O-ARNt que reconoce al codón de paro, incluyendo, pero sin limitarse a, UAG, y se encuentra aminoacilado por una O-RS con un aminoácido no natural deseado. Este O-ARNt no es reconocido por las aminoacil-ARNt sintetasas del huésped de origen natural. Puede utilizarse mutagénesis convencional dirigida al sitio para introducir el codón de paro, incluyendo, pero sin limitarse a, TAG, en el sitio de interés en un polipéptido de interés. Ver, e.g., Sayers J. R., et al., (1988), 5' -3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res., 16:791-802. Cuando la O-RS, O-ARNt y el ácido nucleico que codifica para el polipéptido de interés se combinan in vivo, el aminoácido no natural se incorpora en respuesta al codón de UAG para dar un polipéptido que contiene el aminoácido no natural en la posición especificada. La incorporación de aminoácidos no naturales in vivo puede efectuarse sin perturbación significativa de la célula huésped eucariótica. Por ejemplo, debido a que la eficiencia de supresión para el codón de UAG depende de la competencia entre la O-ARNt, incluyendo, pero sin limitarse a, el ARNt supresor ámbar, y un factor de liberación eucariótico (incluyendo, pero sin limitarse a, eRF) (que se une a un codón de paro e inicia la liberación del péptido en crecimiento del ribosoma), la eficiencia de supresión puede modularse, incluyendo, pero sin limitarse a, mediante el aumento del nivel de expresión de O-ARNt, y/o del ARNt de supresión . Los aminoácidos no naturales también pueden codificarse con codones raros. Por ejemplo, cuando la concentración de arginina en una reacción de síntesis de proteínas in vivo se reduce, el codón raro de arginina, AGG, ha probado ser eficiente para la inserción de Ala mediante un ARNt sintético acilado con alanina. Ver, e.g., Ma et al., Biochemistry, 32:7939 (1993). En este caso, el ARNt sintético compite con el ARNtArg de origen natural, que existe como una especie menor en Escherichia coli. Algunos organismos no utilizan todos los codones triples. Un codón AGA no asignado en Micrococcus luteus se ha utilizado para la inserción de aminoácidos en un extracto in vitro de transcripción/translación. Ver, e.g., Kowal y Oliver, Nucleic Acid Res., 25:4685 (1997). Los componentes de la presente invención pueden generarse para el uso de estos codones raros in vivo. Los codones de selección comprenden también codones extendidos, incluyendo, pero sin limitarse a, cuatro o más codones base, tal como, cuatro, cinco, seis o más codones base. Ejemplos de codones de cuatro bases incluyen, pero no se limitan a, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU y lo similar. Ejemplos de codones de cinco bases incluyen, pero no se limitan a, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC y lo similar. Una característica de la invención incluye el uso de codones extendidos en base a supresión de deslizamiento de estructura. Pueden insertarse cuatro o más codones base incluyendo, pero sin limitarse a, uno o múltiples aminoácidos no naturales en la misma proteína. Por ejemplo, en presencia de O-ARNts mutados, incluyendo, pero sin limitarse a, ARNts especiales de supresión de deslizamiento de estructura, con ciclos anticodón, por ejemplo, con al menos 8-10 ciclos anticodón nt, los cuatro o más codones base se leen como un solo aminoácido. En otras modalidades, los ciclos anticodón pueden decodificarse, incluyendo, pero sin limitarse a, al menos un codón de cuatro bases, al menos un codón de cinco bases, o al menos un codón de seis bases o más. Dado que existen 256 posibles codones de cuatro bases, múltiples aminoácidos no naturales pueden codificarse en la misma célula utilizando un codón de cuatro o más bases. Ver Anderson et al., (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol., 307:755-769. Por ejemplo, se han utilizados codones de cuatro bases para incorporar aminoácidos no naturales en proteínas utilizando métodos biosintéticos in vitro. Ver, e.g., Ma et al., (1993) Biochemistry, 32:7939; y Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121:34. CGGG y AGGU se utilizaron para incorporar simultáneamente 2-naftilalanina y un derivado de NBD de lisina en estreptavidina in vitro con dos ARNts de supresión de deslizamiento de estructura químicamente acilados. Ver, e.g., Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121:12194. En un estudio in vivo, Moore et al., examinaron la capacidad de derivados de ARNtLeu con anticodones NCUA para suprimir codones UAGN (N puede ser U, A, G o C) , y se encontró que la cuadrupla UAGA puede decodificarse por medio de un ARNtLeu con un anticodón UCUA con una eficiencia de 13 a 26% con poca decodificación en la estructura 0 o 1. Ver, Moore et al., (2000) J. Mol. Biol., 298:195. En una modalidad, pueden utilizarse en la presente invención codones extendidos en base a codones raros o codones de no sentido, que pueden reducir la lectura de no sentido y la supresión de deslizamiento de estructura en otros sitios no deseados. Para un sistema dado, un codón de selección puede incluir también uno de los codones de tres bases naturales, en donde el sistema endógeno no utiliza (o rara vez utiliza) el codón base natural. Por ejemplo, este incluye un sistema que carece de un ARNt que reconoce el codón natural de tres bases y/O un sistema en donde el codón de tres bases es un codón raro. Los codones de selección incluyen opcionalmente pares base no naturales. Estos pares base no naturales expanden adicionalmente el alfabeto genético existente. Un par base extra incrementa el número de codones triples de 64 a 125. Las propiedades de los pares de tres bases incluyen emparejamiento base estable y selectivo, incorporación enzimática eficiente en ADN con alta fidelidad mediante una pollmerasa, y la eficiente extensión inicial continuada después de la síntesis del naciente par base no natural. Descripciones de pares base no naturales que pueden adaptarse para loa métodos y composiciones incluyen, e.g., Hirao, et al., (2002) An unnatural base paír for mcorporating ammo acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182. Ver también, Wu, Y., et al., (2002) J. Am. Chem. Soc., 124:14626-14630. Otras publicaciones relevantes se listan abajo . Para uso m vivo, el nucleósido no natural es permeable en la membrana y se encuentra fosforilado para formar el trifosfato correspondiente. Además, la información genética aumentada es estable y no se destruye por las enzimas celulares. Previos esfuerzos de Benner y otros tomaron ventaja de los patrones de unión de hidrógeno que son diferentes a aquellos en pares canónicos Watson-Crick, cuyo ejemplo más notable es el par iso-C:iso-G. Ver, e.g., Switzer et al., (1989) J. Am. Chem. Soc., 111:8322; y Piccirilli et al., (1990) Nature, 343:33; Kool (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602. Estas bases en general no se emparejan a algún grado con las bases naturales y no pueden repetirse enzimáticamente. Kool y colaboradores demostraron que las interacciones hidrófobas de empaque entre las bases pueden reemplazar la unión de hidrógeno para conducir la formación del par base. Ver, Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602; y Guckian y Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed . Engl., 36, 2825. En un esfuerzo por desarrollar un par base no natural que satisfaga todos los requerimientos anteriores, Schultz, Romesberg y colaboradores han sintetizado y estudiado sistemáticamente una serie de bases hidrófobas no naturales. Se encontró que un auto-par PICS:PICS es más estable que los pares base naturales, y puede incorporarse eficientemente en el ADN por medio del fragmento Klenow de Escherichia coli ADN polimerasa I (KF) . Ver, e.g., McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121:11585-6; y Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:3274. Un auto-par 3MN:3MN puede sintetizarse mediante KF con eficiencia y selectividad suficiente para la función biológica. Ver, e.g., Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:8803. Sin embargo, ambas bases actúan como un terminador de cadena para repetición adicional. Se ha desarrollado recientemente n ADN polimerasa mutante que puede utilizarse para repetir el auto par PICS. Adicionalmente, un auto par 7AI puede repetirse. Ver, e.g., Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc., 123:7439. También se ha desarrollado un nuevo par metalobase, Dipic:Py, que forma un par estable al unir Cu (II) . Ver, Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:10714. Debido a que los codones extendidos y los codones no naturales son intrínsecamente ortogonales a los codones naturales, los métodos de la invención puede tomar ventaja de esta propiedad para general ARNts ortogonales para ellos. También puede utilizarse un sistema de paso translacional para incorporar un aminoácido no natural en un polipéptido deseado. En un sistema de paso translacional, se incorpora una gran secuencia en un gen pero no se traslada en la proteína. La secuencia contiene una estructura que sirve como una clave para inducir el salto del ribosoma sobre la secuencia y resumir la translación aguas abajo de la inserción. En ciertas modalidades, la proteína o polipéptido de interés (o porción del mismo) en los métodos y/o composiciones de la invención, se codifica por un ácido nucleico. Típicamente, el ácido nucleico comprende al menos un codón de selección, al menos dos codones de selección, al menos tres codones de selección, al menos cuatro codones de selección, al menos cuatro codones de selección, al menos cuatro codones de selección, al menos cinco codones de selección, al menos seis codones de selección, al menos siete codones de selección, al menos ocho codones de selección, al menos nueve codones de selección, diez o más codones de selección. Los genes que codifican para las proteínas o polipéptidos de interés pueden mutagenizarse utilizando métodos muy conocidos por los expertos en la técnica, y se describen en la presente para incluir, por ejemplo, uno o más codones de selección para la incorporación de un aminoácido no natural. Por ejemplo, un ácido nucleico para una proteína de interés se mutageniza para incluir uno o más codones de selección, proporcionando la incorporación de uno o más aminoácidos no naturales. La invención incluye cualquiera de tales variantes, incluyendo, pero sin limitarse a versiones mutantes de cualquier proteína, por ejemplo, incluyendo al menos un aminoácido no natural. De manera similar, la invención incluye también ácidos nucleicos correspondientes, i.e., cualquier ácido nucleico con uno o más codones de selección que codifican para uno o más aminoácidos no naturales . Las moléculas de ácido nucleico que codifican para una proteína de interés tales como un polipéptido de hGH, pueden mutarse fácilmente para introducir una cisteína en cualquier posición deseada del polipéptido. La cisteína se utiliza ampliamente para introducir moléculas reactivas, polímeros solubles en agua, proteínas, o una amplia variedad de otras moléculas, sobre una proteína de interés. Los métodos adecuados para la incorporación de cisteína en una posición deseada de un polipéptido son .conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica, tal como los descritos en la Patente de E.U. No. 6,608,183, que se incorpora por la referencia en la presente, y técnicas estándar de mutagénesis . IV. Aminoácidos codificado de manera no naturals Una muy amplia variedad de aminoácidos codificado de manera no naturals son adecuados para uso en la presente invención. Cualquier número de aminoácidos codificado de manera no naturals pueden introducirse en un Polipéptido de GH, e.g., de hGH. En general, los aminoácidos codificado de manera no naturals introducidos son sustancialmente químicamente inertes hacia los 20 aminoácidos comunes genéticamente codificados (i.e., alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofán, tirosina y valina) . En algunas modalidades, los aminoácidos codificado de manera no naturals incluyen grupos funcionales de cadena lateral que reaccionan eficiente y selectivamente con grupos funcionales no encontrados en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo, pero sin limitarse a, grupos azida, cetona, aldehido y aminooxi) para formar conjugados estables. Por ejemplo, un Polipéptido de GH, e.g., de hGH que incluye un aminoácido codificado de manera no natural que contiene un grupo azida funcional, puede reactivarse con un polímero (incluyendo, pero sin limitarse a, poli (etilen glicol) o, alternativamente, un segundo polipéptido que contiene un residuo alquino para formar un conjugado estable resultante para la reacción selectiva de los grupos funcionales azida y alquino para formar un producto Huisgen de cicloadición [3+2]. La estructura genérica de un aminoácido alfa se ilustra como sigue (Fórmula I) : Un aminoácido codificado de manera no natural es típicamente cualquier estructura que tiene la fórmula antes listada, en donde el grupo R es cualquier sustituyente diferente al utilizado en los veinte aminoácidos naturales, y puede ser adecuado para su uso en la presente invención. Debido a que los aminoácidos codificado de manera no naturals de la invención típicamente difieren de los aminoácidos naturales solo en la estructura de la cadena lateral, los aminoácidos codificado de manera no naturals forman uniones amida con otros aminoácidos, incluyendo, pero sin limitarse a, natura o codificado de manera no naturals, de la misma manera en que se forman en polipéptidos de origen natural. Sin embargo, los aminoácidos codificado de manera no naturals tienen grupos de cadena lateral que los distinguen de los aminoácidos naturales. Por ejemplo, R comprende opcionalmente .un grupo alquilo, arilo, acilo, ceto, azida, hidroxilo, hidrazina, ciano, halo, hidrazida, alquenilo, alquinilo, éter, tiol, seleno, sulfonilo, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldehido, éster, tioácido, hidroxilamina, amino, o lo similar o cualquier combinación de los mismos. Otros aminoácidos de origen no natural de interés que pueden ser adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero sin limitarse a, aminoácidos que comprenden un reticulador fotoactivable, aminoácidos de marca giratoria, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos de unión de metal, aminoácidos que contienen metal, aminoácidos radiactivos, aminoácidos con nuevos grupos funcionales, aminoácidos que interactúan de manera covalente o no covalente con otras moléculas, aminoácidos fotoencerrados y/o fotoisomerizables, aminoácidos que comprenden biotina o un análogo de biotina, aminoácidos glicosilados tales como una serina sustituida con azúcar, otros aminoácidos modificados con carbohidrato, aminoácidos que contienen ceto, aminoácidos que comprenden polietilen glicol o poliéter, aminoácidos sustituidos con átomos pesados, aminoácidos químicamente separables y/o foto separables, aminoácidos con cadenas laterales alargadas en comparación con los aminoácidos naturales, incluyendo, pero sin limitarse a, poliéteres o hidrocarburos de cadena larga, incluyendo, pero sin limitarse a, mayores que aproximadamente 5 o mayores que aproximadamente 10 carbonos, aminoácidos enlazados a carbono que contienen azúcar, aminoácidos activos de reducción, aminoácidos que contienen amino tioácido, y aminoácidos que comprenden uno o más residuos tóxicos. Los aminoácidos codificado de manera no naturals ejemplares que pueden ser adecuados para su uso en la presente invención y que son útiles para reacciones con polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, aquellos con grupos reactivos carbonilo, aminooxi, hidrazina, hidrazida, semicarbazida, azida y alquino. En algunas modalidades, los aminoácidos codificado de manera no naturals comprenden un residuo sacárido. Ejemplos de tales aminoácidos incluyen N-acetil-L-glucosaminil-L-serina, N-acetil-L-galactosaminil-L-serina, N-acetil-L-glucosaminil-L-treonina, N-acetil-L-glucosaminil-L-asparagina y O-manosaminil-L-serina . Ejemplos de tales aminoácidos incluyen también ejemplos en donde el enlace N u O de origen natural entre el aminoácido y el sacárido se reemplaza por un enlace covalente no encontrado comúnmente en la naturaleza, incluyendo, pero sin limitarse a, un alqueno, una oxima, un tioéter, una amida y lo similar. Ejemplos de tales aminoácidos incluyen también sacáridos que no se encuentran comúnmente en proteínas de origen natural tales como 2-deoxi-glucosa, 2-deoxigalactosa y lo similar. Muchos de los aminoácidos codificado de manera no naturals proporcionados en la presente, se encuentran comercialmente disponibles, e.g., de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) , Novabiochem (una división de EMD Biosciences, Darmstadt, Alemania) o Peptech (Burlington, MA, EUA) . Aquellos que no se encuentran comercialmente disponibles se sintetizan opcionalmente como se proporciona en la presente o utilizando métodos estándar conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. Para técnicas de síntesis orgánica, ver, e.g., Organic Chemistry por Fessendon y Fessendon, (1982, Segunda edición, Willard Grant Press, Boston, Mass.); Advanced Organic Chemistry por March (Tercera Edición, 1985, Wiley and Sons, New York); y Advanced Organic Chemistry por Carey y Sundberg (Tercera Edición, Partes A y B, 1990, Plenum Press, New York) . Ver también las Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0082575 y 2003/0108885, que se incorporan mediante la referencia en la presente. Además de los aminoácidos no naturales que contienen nuevas cadenas laterales, los aminoácidos no naturales que pueden ser adecuados para su uso en la presente invención, también comprenden opcionalmente estructuras de estructura modificada incluyendo, pero sin limitarse a, como se ilustra por las estructuras de la Fórmula II y III: II ül en donde Z comprende típicamente OH, NH2, SH, NH-R' , o S-R' ; X y Y, que pueden ser el mismo o diferente, comprenden típicamente S u O, y R y R' , que son opcionalmente el mismo o diferentes, se seleccionan típicamente de la misma lista de constituyentes para el grupo R descrito anteriormente para los aminoácidos no naturales que tienen la Fórmula I así como hidrógeno. Por ejemplo, los aminoácidos no naturales de la invención comprenden opcionalmente sustituciones en el grupo amino o carboxilo como se ilustra por las Fórmulas II y III. Los aminoácidos no naturales de este tipo incluyen, pero sin limitarse a, ácidos a-hidroxi, a-tioácidos, a-aminotiocarboxilatos, incluyendo, pero sin limitarse a, con cadenas laterales que corresponden a los veinte aminoácidos naturales comunes o cadenas laterales no naturales. Además, las sustituciones en el a-carbono incluyen opcionalmente, pero sin limitarse a, L, D. o aminoácidos a-a-disustituidos tales como D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutírico, y lo similar. Otras alternativas estructurales incluyen aminoácidos cíclicos, tales como análogos de prolina así como análogos de prolina de anillo de 3, 4, 6, 7, 8 y 9 miembros, aminoácidos ß y ? tales como ácido ß-alanina y ?-amino butírico. Muchos aminoácidos no naturales se basan en aminoácidos naturales tales como tirosina, glutamina, fenilalanina y lo similar, y son adecuados para su uso en la presente invención. Los análogos de tirosina incluyen, pero no se limitan a, tirosinas para-sustituidas, tirosinas orto-sustituidas, y tirosinas meta-sustituidas, en donde la tirosina sustituida comprende, incluyendo, pero sin limitarse a, un grupo ceto (incluyendo, pero sin limitarse a, un grupo acetilo) , un grupo benzoilo, un grupo amino, un grupo hidrazina, uno hidroxiamina, un grupo tiol, un grupo carboxi, un grupo isopropilo, un grupo metilo, un hidrocarburo C6-C2o de cadena recta o ramificado, un hidrocarburo saturado o insaturado, un grupo O-metilo, un grupo poliéter, un grupo nitro, un grupo alquinilo o lo similar. Adicionalmente, también se contemplan múltiples anillos arilo sustituidos.
Los análogos de glutamina que pueden ser adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, derivados a-hidroxi, derivados y-sustituidos, derivados cíclicos, y derivados glutamina amida-sustituidos. Ejemplos de análogos de fenilalanina que pueden ser adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, fenilalaninas para-sustituidas, fenilalaninas orto-sustituidas, y fenilalaninas meta-sustituidas, en donde el sustituyente comprende, incluyendo, pero sin limitarse a, un grupo hidroxi, un grupo metoxi, un grupo metilo, un grupo alilo, un aldehido, un azida, un yodo, un bromo, un grupo ceto (incluyendo, pero sin limitarse a, un grupo acetilo), un benzoilo, un grupo alquinilo o lo similar. Ejemplos específicos de aminoácidos no naturales que pueden ser adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, una p-acetil-L-fenilalanina, una O-metil-L-tirosina, una L-3- (2-naftil ) alanina, una 3-metil-fenilalanina, una 0-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNAcb-serina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azida-L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina, una fosfonotirosina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, una isopropil-L-fenilalanina y una p-propargiloxi-fenilalanina, y lo similar. Ejemplos de estructuras de una variedad de aminoácidos no naturales que pueden ser adecuadas para su uso en la presente invención, se proporcionan, por ejemplo, en la WO 2002/085923 titulada "In vivo incorporation of unnatural amino acids". Ver también Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24, que se incorpora por la referencia en la presente para análogos de metionina adicionales. En una modalidad, se proporcionan composiciones de un Polipéptido de GH, e.g., de hGH, que incluyen un aminoácido no natural (tal como p- (propargiloxi) -fenilalanina) . Se proporcionan también varias composiciones que comprenden p- (propargiloxi) -fenilalanina e incluyen, pero no se limitan a proteínas y/o células. En un aspecto, una composición que incluye el aminoácido no natural de p- (propargiloxi) -fenilalanina incluye además un ARNt ortogonal. El aminoácido no natural puede unirse (incluyendo pero sin limitarse a, covalentemente) al ARNt ortogonal, incluyendo, pero sin limitarse a, unirse covalentemente al ARNt ortogonal a través de una unión amino-acilo, unirse covalentemente a un 3' OH o un 2' OH de un azúcar de terminación ribosa del ARNt ortogonal, etc. Los residuos químicos a través de aminoácidos no naturales que pueden incorporarse en proteínas ofrecen una variedad de ventajas y manipulaciones de la proteína. Por ejemplo, la reactividad única de un grupo ceto funcional permite la modificación selectiva de proteínas con cualquiera de un número de reactivos que contienen hidrazina o hidroxilamina in vitro e in vivo. Un aminoácido no natural de átomo pesado, por ejemplo, puede ser útil para la fase de datos de estructura de rayos X. Esta introducción específica del sitio de átomos pesados utilizando aminoácidos no naturales proporciona también selectividad y flexibilidad para seleccionar posiciones para los átomos pesados. Los aminoácidos no naturales fotorreactivos (incluyendo, pero sin limitarse a, aminoácidos con benzofenona y arilazidas (incluyendo, pero sin limitarse a, cadenas laterales de fenilazida) , por ejemplo, permiten la eficiente fotorreticulación in vivo e in vitro de la proteína. Ejemplos de aminoácidos no naturales fotorreactivos incluyen, pero sin limitarse a, p-azida-fenilalanina y p-benzoil-fenilalanina . La proteína con los aminoácidos no naturales fotorreactivos puede entonces reticularse a voluntad mediante la excitación del control temporal que proporciona el grupo fotorreactivo. En un ejemplo, el grupo metilo de un aminoácido no natural puede sustituirse con un grupo marcado de manera isotópica, incluyendo, pero sin limitarse a, metilo, como una sonda de estructura local y dinámica, incluyendo, pero sin limitarse a, con el uso de resonancia magnética nuclear y espectroscopia de vibración. Los grupos funcionales alquinilo o azida, por ejemplo, permiten la modificación selectiva de proteínas con moléculas a través de una reacción de cicloadición [3+2]. Un aminoácido no natural incorporado en un polipéptido en la terminación amino, puede encontrarse compuesto de un grupo R que es cualquier sustituyente diferente del utilizado en los veinte aminoácidos no naturales y un segundo grupo reactivo diferente al grupo NH2 normalmente presente en a-aminoácidos (ver Fórmula I) . un aminoácido no natural similar puede incorporarse en la terminación carboxilo con un segundo grupo reactivo diferente al grupo COOH normalmente presente en a-aminoácidos (ver Fórmula I ) . Los aminoácidos no naturales de la invención, pueden seleccionarse o diseñarse para proporcionar características adicionales no disponibles en los veinte aminoácidos naturales. Por ejemplo, el aminoácido no natural puede diseñarse o seleccionarse opcionalmente para modificar las propiedades biológicas de una proteína en la cual se incorpora. Por ejemplo, las siguientes propiedades pueden modificarse opcionalmente mediante la inclusión de un aminoácido no natural en una proteína: toxicidad, biodistribución, solubilidad, estabilidad, e.g., resistencia térmica, hidrolítica, oxidativa a la degradación enzimática y lo similar, facilidad de purificación y procesamiento, propiedades estructurales, propiedades espectroscópicas, propiedades químicas y/o fotoquímicas, actividad catalítica, potencial de reducción, vida media, capacidad para reaccionar con otras moléculas, e.g., covalentemente o no covalentemente y lo similar. ESTRUCTURA Y SÍNTESIS DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES: GRUPOS CARBONILO, TIPO CARBONILO, CARBONILO ENMASCARADOS, CARBONILO PROTEGIDOS, Y GRUPOS HIDROXILAMINO En algunas modalidades, la presente invención proporciona una GH, e.g., hGH, enlazada a un polímero soluble en agua, e.g., un PEG, mediante una unión oxima. Muchos tipos de aminoácidos codificado de manera no naturals son adecuados para la formación de uniones oxima. Estos incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos codificado de manera no naturals que contienen un grupo carbonilo, dicarbonilo o hidroxilamino . Tales aminoácidos se describen en las Solicitudes de Patente de E.U. Nos. 60/638,418; 60/638,527; y 60/639,195, tituladas "Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polipeptides", presentadas en Diciembre 22 de 2004, que se incorporan en la presente por la referencia en su totalidad. Tales aminoácidos también se describen en las Solicitudes de Patente de E.U. Nos. 60/696,210; 60/696,302; y 60/696,068, tituladas "Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polipeptides", presentadas en Julio 1 de 2005, que se incorporan en la presente por la referencia en su totalidad. Los aminoácidos codificado de manera no naturals se describen también en la Solicitud de Patente de E.U. No. 10/126,931 presentada en Abril 19 de 2002 y en la Solicitud de Patente de E.U. No. 10/126,927, presentada en Abril 19 de 2002, que se incorporan mediante la referencia en la presente en su totalidad. Algunas modalidades de la invención utilizan GH, e.g., polipéptidos de hGH que se sustituyen en una o más posiciones con aminoácido de para-acetilfenilalanina. La síntesis de p-acetil- (+/-) -fenilalanina y m-acetil- (+/ . ) -fenilalanina se describe en Zhang Z., et al., Biochemistry 42:6735-6746 (2003), incorporada por la referencia. Otros aminoácidos que contienen carbonilo o dicarbonilo pueden prepararse de manera similar por el de experiencia ordinaria en la técnica. además, ñas síntesis ejemplares no limitantes del aminoácido no natural incluidas en la presente se presentan en las Figuras 4, 24-34 y 36-39 de la Solicitud de Patente de E.U. No. 10/126,931, que se incorpora por la referencia en la presente en su totalidad. Los aminoácidos con un grupo reactivo eletrofílico permiten una variedad de reacciones para el enlace de moléculas mediante reacciones de adición nucleofílica entre otras. Tales grupos reactivos electrofílicos incluyen un grupo carbonilo (incluyendo un grupo ceto y un grupo dicarbonilo) , un grupo tipo carbonilo (que tiene una reactividad similar a un grupo carbonilo (incluyendo un grupo ceto y un grupo dicarbonilo) y es estructuralmente similar a un grupo carbonilo) , un grupo carbonilo enmascarado (que puede convertirse fácilmente en un grupo carbonilo (incluyendo un grupo ceto y un grupo dicarbonilo)) o un grupo carbonilo protegido (que tiene una reactividad similar a un grupo carbonilo (incluyendo un grupo ceto y un grupo dicarbonilo) a la detección) . Tales aminoácidos incluyen aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (IV) : en donde: A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -0-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k-, en donde k es 1, 2 o 3, -S (0) k- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C(0)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(0)=-, -S(0)kN(R' )-, -N (R' ) C (0) N (R' ) -, -N(R' )C(S)N(R' )-, -N(R' ) S(0)kN(R' )-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R' )=N-N(R' )-, -C(R')=N-N=, -C (R' ) 2-N=N- , y -C (R' ) 2-N (R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; cada R' ' es independientemente, H, alquilo, alquilo sustituido, o un grupo protector, o cuando más de un grupo R' ' se encuentra presente, dos R' ' forman opcionalmente un heterocíeloalqulio; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polmucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resma, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior, o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; o los grupos -A-B-J-R conjuntamente forman un cicloalquilo o heterocicloalquilo bicíclico o tricíclico que comprende al menos un grupo carbonilo, incluyendo un grupo dicarbonilo, un grupo carbomlo protegido, incluyendo un grupo dicarbonilo protegido, o un grupo carbonilo enmascarado, incluyendo un grupo dicarbonilo enmascarado; o los grupos -J-R conjuntamente forman un cicloalquilo o heterocicloalquilo monocícllco o bicíclico que comprende al menos un grupo carbonilo, incluyendo un grupo dicarbonilo, un grupo carbonilo protegido, incluyendo un grupo dicarbonilo protegido, o un grupo carbonilo enmascarado, incluyendo un grupo dicarbonilo enmascarado; con la salvedad de que cuando A sea fenileno y cada R3 sea H, B se encuentre presente; y que cuando A sea -(CH2)4-y cada R3 sea H, B no sea -NHC (0) (CH2CH2)-; y que cuando A y B se encuentren ausentes y cada R3 sea H, R no sea metilo. Adicionalmente. se incluyen teniendo la estructura de la Fórmula (V) : en donde : A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -0-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k-, en donde k es 1, 2 o 3, - S (O) k- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C(0)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(0)0-, -S (0) kN (R' ) - , -N (R' ) C (0) N (R' ) -, -N(R' )C(S)N(R' )-, -N(R' ) S(0)kN(R' )-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R' )=N-N(R' )-, -C(R')=N-N=, -C (R' ) 2-N=N- , y -C (R' ) 2-N (R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; con la salvedad de que cuando A sea fenileno, B se encuentre presente; y cuando A sea -(CH2)4-, B no sea -NHC (O) (CH2CH2)-; y que cuando A y B se encuentren ausentes, R no sea metilo. Adicionalmente, se incluyen aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (VI) : en donde: B es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, - S(0)k-, en donde k es 1, 2 o 3, -S (0) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C (O) - (alquileno o alquileno sustituido) - -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido) - -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido) - -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido) - -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno ssuussttiittuuiiddoo))--, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' )-, -N(R' )C(0)N(R' )-, -N (R' ) C (S ) N (R' ) - , -N(R' ) S (0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , -C(R')=N-N=, -C(R' )2-N=N-, y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) -, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, - N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1, 2 o 3, -C(0)N(R')2, -OR' , y -S(0)kR', en donde R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido. Adicionalmente, se incluyen los siguientes aminoácidos : en donde, tales compuestos son opcionalmente un grupo amino protegido, carboxilo protegido o una sal de los mismos. Además, cualquiera de los siguientes aminoácidos no naturales puede incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural.
Adicionalmente, se incluyen los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (VII) : en donde, B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -0-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k-, en donde k es 1, 2 o 3, S (O) k- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(0)0-, -S (O) kN (R' ) -, -N (R' ) C (O) N (R' ) -, -N(R' )C(S)N(R' )-, -N(R' )S(0)kN(R' )-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R' )=N-N (R' ) -, -C(R')=N-N=, -C (R' ) 2~N=N-, y -C (R' ) 2-N (R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1, 2 o 3, -C(0)N(R')2, -OR' , y -S(0)kR', en donde R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; y n es de 0 a 8; con la salvedad de que cuando A sea -(CH2)4, B no sea - NHC(O) (CH2CH2)-. Adicionalmente, se incluyen los siguientes aminoácidos : y en donde, tales compuestos son opcionalmente amino protegido, opcionalmente carboxilo protegido, opcionalmente amino protegido y carboxilo protegido o una sal de los mismos.
Además, estos aminoácidos no naturales y cualquiera de los siguientes aminoácidos no naturales puede incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural. Adicionalmente se incluyen los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (VIII): íVJll): en donde A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -0-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k-, en donde k es 1, 2 o 3, -S (0) k- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C(0)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(0)0-, -S (O) kN (R' ) -, -N (R' ) C (0) N (R' ) - , -N(R' )C(S)N(R' )-, -N(R' )S(0)kN(R' )-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R' )=N-N(R' )-, -C(R')=N-N=, -C (R' ) 2-N=N-, y -C (R' ) 2"N (R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido. Adicionalmente se incluyen los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (IX) : B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -0-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k-, en donde k es 1, 2 o 3, -S (0) k- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C(0)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(0)0-, -S (0) kN (R' ) -, -N (R' ) C (0) N (R' ) -, -N(R' )C(S)N(R' )-, -N(R' ) S(0)kN(R' )-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R' )=N-N(R' )-, -C(R')=N-N=, -C (R' ) 2-N=N- , y -C (R' ) 2- (R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; en donde cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1, 2 o 3, - C(0)N(R')2, -OR' , y -S(0)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido. Adicionalmente se incluyen los siguientes aminoácidos en donde, tales compuestos son opcionalmente amino protegido, opcionalmente carboxilo protegido, opcionalmente amino protegido y carboxilo protegido o una sal de los mismos.
Además, estos aminoácidos no naturales y cualquiera de los siguientes aminoácidos no naturales puede incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural. Adicionalmente se incluyen los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (X) : en donde, B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -0-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k-, en donde k es 1, 2 o 3, -S (0) k- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C(0)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(0)0-, -S (0) kN (R' ) -, -N (R' ) C (0) N (R' ) -, -N(R' )C(S)N(R' )-, -N(R' )S(0)kN(R' )-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R' )=N-N(R' )-, -C(R')=N-N=, -C (R' ) 2-N=N-, y -C (R' ) 2-N (R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1, 2 o 3, -C(0)N(R')2, -OR' , y -S(0)kR', en donde R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; y n es de 0 a 8. Adicionalmente , se incluyen los siguientes aminoácidos : en donde, tales compuestos son opcionalmente amino protegido, opcionalmente carboxilo protegido, opcionalmente amino protegido y carboxilo protegido o una sal de los mismos. Además, estos aminoácidos no naturales y cualquiera de los siguientes aminoácidos no naturales puede incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural. Además de las estructuras monocarbonilo, los aminoácidos no naturales descritos en la presente, pueden incluir grupos tales como dicarbonilo, tipo dicarbonilo, gurpos dicarbonilo enmascarados y dicarbonilo protegidos. Por ejemplo, se incluyen los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XI) : en donde A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -0-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k-, en donde k es 1, 2 o 3, -S (0) k- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C(0)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' ) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' ) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(0)=-, -S (0) kN (R' ) -, -N (R' ) C (0) N (R' ) -, -N(R' )C(S)N(R' )-, -N(R' ) S (0)kN(R' )-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R' )=N-N(R' )-, -C(R')=N-N=, -C (R' ) 2~N=N- , y -C (R' ) 2-N (R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector arrimo, resma, aminoácido, polipeptido o polmucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resma, aminoácido, polipéptido o polmucleotido. Adicionalmente se incluyen los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XII): B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -0-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k-, en donde k es 1, 2 o 3, -S (0) k- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C(0)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(0)0-, -S (0)kN (R' ) -, -N (R' ) C (O) N (R' ) -, -N(R' )C(S)N(R' ) -, -N(R' )S(0)kN(R' )-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R' )=N-N(R' )-, -C(R')=N-N=, -C (R' ) 2-N=N- , y -C ( R'J 2-N ( R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1, 2 o 3, -C(0)N(R')2, -OR' , y -S(0)kR', en donde R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido. Adicionalmente, se incluyen los siguientes aminoácidos : onde, tales compuestos son opcionalmente amino protegido, opcionalmente carboxilo protegido, opcionalmente amino protegido y carboxilo protegido o una sal de los mismos. Además, estos aminoácidos no naturales y cualquiera de los siguientes aminoácidos no naturales puede incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural. Adicionalmente, se incluyen los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XIII): en donde B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k-, en donde k es 1, 2 o 3, -S (O) k- (alquileno o alquileno sustituido)-, C(0)-, -C (0) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) C (0) 0-, -S (0) kN (R' ) -, N(R' )C(0)N(R' )-, -N(R' )C(S)N(R' )-, -N (R' ) S (0) kN (R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R' )=N-N(R' )-, -C(R')=N-N=, -C (R' ) 2-N=N-, y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) -, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, - N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1, 2 o 3, -C(0)N(R')2, -OR' , y -S(0)kR', en donde R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; y n es de 0 a 8. Adicionalmente, se incluyen los siguientes aminoácidos : en donde, tales compuestos son opcionalmente amino protegido, opcionalmente carboxilo protegido, opcionalmente amino protegido y carboxilo protegido o una sal de los mismos. Además, estos aminoácidos no naturales y cualquiera de los siguientes aminoácidos no naturales puede incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural. Adicionalmente, se incluyen los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XIV) : en donde: A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, arileno, apleno sustituido, heteroapleno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector ammo, resma, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resma, aminoácido, polipéptido o polmucleotido; Xi es C, S o S(0); y L es alquileno, alquileno sustituido, N (R' ) (alquileno) o N (R' ) (alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Adicionalmente, se incluyen los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XIV-A) : en donde : A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; L es alquileno, alquileno sustituido, N (R' ) (alquileno) o N (R' ) (alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Adicionalmente, se incluyen los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XIV-B) : X- > í'XIV-B? en donde : A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; L es alquileno, alquileno sustituido, N (R' ) (alquileno) o N (R' ) (alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Adicionalmente, se incluyen los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XV) : en donde: A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; Xi es C, S o S(O); y n es O, 1, 2, 3, 4 o 5; y cada R8 y R9 en cada grupo CR8R9 se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, alcoxi, alquilamino, halógeno, alquilo, arilo o cualquiera de R8 y R9 pueden formar conjuntamente =0 o un cicloalquilo, o cualquiera adyacente a los grupos R8 puede formar conjuntamente un cicloalquilo. Adicionalmente, se incluyen los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XV-A) : en donde : A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; n es O, 1, 2, 3, 4 o 5; y cada R8 y R9 en cada grupo CR8R9 se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, alcoxi, alquilamino, halógeno, alquilo, arilo o cualquiera de R8 y R9 pueden formar conjuntamente =0 o un cicloalquilo, o cualquiera adyacente a los grupos R8 puede formar conjuntamente un cicloalquilo. Adicionalmente, se incluyen los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XV-B) : en donde: A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; n es 0, 1, 2, 3, 4 o 5; y cada R8 y R9 en cada grupo CR8R9 se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, alcoxi, alquilamino, halógeno, alquilo, arilo o cualquiera de R8 y R9 pueden formar conjuntamente =0 o un cicloalquilo, o cualquiera adyacente a los grupos R8 puede formar conjuntamente un cicloalquilo. Adicionalmente se incluyen los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XVI) : en donde: A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; Xi es C, S o S(O); ) ; y L es alquileno, alquileno sustituido, N (R' ) (alquileno) o N (R' ) (alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Adicionalmente, se incluyen los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XVI-A) : en donde : A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; L es alquileno, alquileno sustituido, N (R' ) (alquileno) o N (R' ) (alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Adicionalmente, se incluyen los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XVI-B) : en donde : A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; L es alquileno, alquileno sustituido, N(R' ) (alquileno) o N(R' ) (alquileno sustituido) , en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Adicionalmente, se incluyen los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XVII): en donde : A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; I í ( ! X / Y ) (M ? ;< ? ¡ i í:l ¡ K¡ (a) X í> \ ? <-» r s- (; ^ (¡I) ~ M e s -C(H3)- J en donde (a) indica la unión al grupo A y (b) indica la unión a los grupos carbonilo respectivos, R3 y R4 se seleccionan independientemente de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 o dos grupos R4 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; T3 es una unión, C(R) (R) , O, o S, y R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido. Adicionalmente, se incluyen aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XVIII) : íXVIII: en donde: en donde (a) indica la unión al grupo A y (b) indica la unión a los grupos carbonilo respectivos, R3 y R4 se seleccionan independientemente de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 o dos grupos R4 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; T3 es una unión, C(R) (R) , 0, o S, y R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, - N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1, 2 o 3, -C(0)N(R')2, -OR' , y -S(0)kR', en donde R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido. Adicionalmente, se incluyen aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XIX) : (XIX), en donde : R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; y T3 es 0 o S. Adicionalmente se incluyen aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XX) : en donde: R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido. Adicionalmente, se incluyen los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXI): La síntesis de p-acetil (+/-) -fenilalanina y m-acetil- (+/-) -fenilalanina se encuentra descrita en Zhang, A., et al., Biochemistry 42:6735-6746 (2003), la cual se incorpora por la referencia en la presente. Otros aminoácidos que contienen carbonilo o dicarbonilo pueden prepararse de manera similar por el de experiencia ordinaria en la técnica. Además, las síntesis ejemplares no limitantes de aminoácidos naturales incluidos en la presente, se presentan en las Figuras 4, 24-34 y 36-39. En algunas modalidades, un polipéptido que comprende un aminoácido no natural se encuentra químicamente modificado para generar un grupo carbonilo reactivo o dicarbonilo funcional. Por ejemplo, puede generarse una funcionalidad aldehido útil para las reacciones de conjugación a partir de una funcionalidad que tiene grupos amino e hidroxilo adyacentes. Cuando una molécula biológicamente activa es un polipéptido, por ejemplo, puede utilizarse una serina o treonina de terminación N (que puede encontrarse normalmente presente o puede encontrarse expuesta a través de digestión química o enzimática) para generar una funcionalidad aldehido bajo condiciones de separación oxidativa utilizando periodato. Ver, e.g., Gaertner et al., Bioconjug. Chem., 3:262-268 (1992); Geoghegan, K., & Stroh, JJ , Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner et al., JJ Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994). Sin embargo, los métodos conocidos en la técnica se restringen al aminoácido en la terminación N del péptido o proteína. En la presente invención, puede incorporarse en el polipéptido un aminoácido no natural que contienen grupos hidroxilo y amino adyacentes como una funcionalidad aldehido "enmascarada". Por ejemplo, 5-hidroxilisina contiene un grupo hidroxilo adyacente a la amina épsilon. Las condiciones de reacción para generar el aldehido implican típicamente la adición de un exceso molar de metaperiodato de sodio bajo condiciones suaves para evitar la oxidación en otros sitios dentro del polipéptido. El pH de la reacción de oxidación es típicamente de aproximadamente 7.0. Una reacción típica implica la adición de un exceso molar de aproximadamente 1.5 de metaperiodato de sodio a una solución amortiguada del polipéptido, seguido por la incubación durante aproximadamente 10 minutos en la oscuridad. Ver, e.g., Patente de E.U. No. 6,423,685. La funcionalidad carbonilo o dicarbonilo puede reactivarse selectivamente con un reactivo que contiene hidroxilamina bajo condiciones suaves en solución acuosa para formar el enlace oxima correspondiente que es estable bajo condiciones fisiológicas. Ver, e.g., Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. y Tam. J. P., J. Am. Chem. Soc., 117-3893-3899 (1995). Además, la reactividad única del grupo carbonilo o dicarbonilo permite la modificación selectiva en presencia de otras cadenas laterales de aminoácido. Ver, e.g., Cornish, V. ., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan K. F., & Stroh J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K., et al., Science 276:1125-1128 (1997). Estructura y Síntesis de Aminoácidos no Naturales: Aminoácidos que Contienen Hidroxilamina La Solicitud Provisional de Patente de E.U. No. 60/638,418 se incorpora por la referencia en su totalidad. Por consiguiente, las descripciones proporcionadas en la Sección V (titulada "Aminoácidos no Naturales"), Parte B (titulada "Estructura y Síntesis de Aminoácidos no Naturales: Aminoácidos que Contienen Hidroxilamina" ) , en la Solicitud Provisional de Patente de E.U. No. 60/638,418 se aplican totalmente a los métodos, composiciones (incluyendo las Fórmulas I-XXXV) , técnicas y estrategias para elaborar, purificar, caracterizar y utilizar los aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural, y polipéptidos de aminoácido no natural modificados descritos en la presente, en la misma medida en que si se presentaran tales descripciones totalmente en la presente. SÍNTESIS QUÍMICA DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES Muchos de los aminoácidos no naturales adecuados para su uso en la presente invención se encuentran comercialmente disponibles, e.g., de Sigma (EUA) o Aldrich (Milwaukee, Wl, EUA) . Aquellos que no se encuentran comercialmente disponibles se sintetizan opcionalmente como se proporciona en la presente o como se proporciona en las varias publicaciones o utilizando métodos estándar conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. para técnicas de síntesis orgánica, ver, e.g., Organic Chemistry por Fessendon y Fessendon, (1982, Segunda edición, Willard Grant Press, Boston, Mass.); Advanced Organic Chemistry por March (Tercera Edición, 1985, Wiley and Sons, New York) ; y Advanced Organic Chemistry por Carey y Sundberg (Tercera Edición, Partes A y B, 1990, Plenum Press, New York) . Las publicaciones adicionales que describen la síntesis de aminoácidos no naturales incluyen, e.g., WO 2002/085923 titulada "In vivo incorporation of unnatural amino acids", Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669; King F. E. & Kidd, D. A. A., (1949) A New Synthesis of Glutamine and of y-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates, J. Chem. Soc., 3315-3319; Friedman, O. M., & Chatterrji, R., (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents, J. Am. Chem. Soc., 81, 3750-3752; Craig, J. C, et al., (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino) -1-methylbutil] amino] quinoline (Chloroquine) , J. Org. Chem., 53, 1167-1170; Azoulay M., Vilmont M., & Frappier F., (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem., 26, 201-5; Koskinen, A. M. P., & Rapoport H., (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues, J. Org. Chem., 54, 1859-1866; Christie B. D., & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine . Application to the Total Synthesis of (+) -Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization, J. Org. Chem. 50:1239-1246; Barton et al., (1987) Synthesis of Novel alpha-Amino Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L and D-alpha-Amino-Adipic Acids, L-alpha-aminopimelic Acid and Appropiate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron 43:4297-4308; y, Subasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site, J. Med. Chem., 35:4602-7. Ver también la Publicación de Patente de E.U. No. US 2004/0198637 titulada "Protein Arrays" que se incorpora por la referencia en la presente. A. Grupos carbonilo reactivos Los aminoácidos con un grupo carbonilo reactivo permiten una variedad de reacciones para enlazar moléculas (incluyendo, pero sin limitarse a, PEG u otras moléculas solubles en agua) a través de la adición nucleofílica o reacciones de condensación de aldol entre otras. Los aminoácidos ejemplares que contienen carbonilo pueden representarse como sigue: en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido; R2 es H, alquilo, arilo, alquilo sustituido y arilo sustituido; y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de la terminación amino, y R4 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de la terminación carboxi. En algunas modalidades, n es 1, R es fenilo y R2 es un alquilo simple (i.e., metilo, etilo, o propilo) y el residuo cetona se encuentra colocado en la posición para en relación a la cadena lateral alquilo. En algunas modalidades, n es 1, Ri es fenilo y R2 es un alquilo simple (i.e., metilo, etilo, o propilo) y el residuo cetona se encuentra colocado en la posición meta en relación a la cadena lateral alquilo. La síntesis de p-acetil (+/-) -fenilalanina y m-acetil- (+/-) -fenilalanina se encuentra descrita en Zhang, A., et al., Biochemistry 42:6735-6746 (2003), la cual se incorpora por la referencia en la presente. Otros aminoácidos que contienen carbonilo pueden prepararse de manera similar por el de experiencia ordinaria en la técnica. En algunas modalidades, un polipéptido que comprende un aminoácido codificado de manera no natural se encuentra químicamente modificado para generar un grupo carbonilo reactivo funcional. Por ejemplo, puede generarse una funcionalidad aldehido útil para las reacciones de conjugación a partir de una funcionalidad que tiene grupos amino e hidroxilo adyacentes. Cuando una molécula biológicamente activa es un polipéptido, por ejemplo, puede utilizarse una serina o treonina de terminación N (que puede encontrarse normalmente presente o puede encontrarse expuesta a través de digestión química o enzimática) para generar una funcionalidad aldehido bajo condiciones de separación oxidativa utilizando periodato. Ver, e.g., Gaertner et al., Bioconjug. Chem., 3:262-268 (1992); Geoghegan, K., & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994). Sin embargo, los métodos conocidos en la técnica se restringen al aminoácido en la terminación N del péptido o proteína. En la presente invención, puede incorporarse en el polipéptido un aminoácido codificado de manera no natural que contiene grupos hidroxilo y amino adyacentes como una funcionalidad aldehido "enmascarada". Por ejemplo, 5-hidroxilisina contiene un grupo hidroxilo adyacente a la amina épsilon. Las condiciones de reacción para generar el aldehido implican típicamente la adición de un exceso molar de metaperiodato de sodio bajo condiciones suaves para evitar la oxidación en otros sitios dentro del polipéptido. El pH de la reacción de oxidación es típicamente de aproximadamente 7.0. Una reacción típica implica la adición de un exceso molar de aproximadamente 1.5 de metaperiodato de sodio a una solución amortiguada del polipéptido, seguido por la incubación durante aproximadamente 10 minutos en la oscuridad. Ver, e.g., Patente de E.U. No. 6,423,685, que se incorpora por la referencia en la presente. La funcionalidad carbonilo o dicarbonilo puede reactivarse selectivamente con un reactivo que contiene hidroxilamina bajo condiciones suaves en solución acuosa para formar el enlace oxima correspondiente que es estable bajo condiciones fisiológicas. Ver, e.g., Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. y Tam. J. P., J. Am. Chem. Soc., 117_3893-3899 (1995). Además, la reactividad única del grupo carbonilo o dicarbonilo permite la modificación selectiva en presencia de otras cadenas laterales de aminoácido. Ver, e.g., Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan K. F. , & Stroh J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K., et al., Science 276:1125-1128 (1997). La funcionalidad carbonilo puede reactivarse selectivamente con un reactivo que contiene hidrazina, hidrazida, hidroxilamina o semicarbazida bajo condiciones suaves en solución acuosa para formar enlaces hidrazona, oxima o semicarbazona correspondientes, respectivamente, que son estables bajo condiciones fisiológicas. Ver, e.g., Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. y Tam. J. P., J. Am. Chem. Soc., 117-3893-3899 (1995). Además, la reactividad única del grupo carbonilo permite la modificación selectiva en presencia de otras cadenas laterales de aminoácido. Ver, e.g., Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan K. F., & Stroh J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K., et al., Science 276:1125-1128 (1997). B. Grupos hidrazina, hidrazida o semicarbazida reactivos Los aminoácidos codificado de manera no naturals que contienen un grupo nucleofílico, tal como uno hidrazina, hidrazida o semicarbazida, permiten la reacción con una variedad de grupos electrofílicos para formar conjugados (incluyendo, pero sin limitarse a, con PEG u otros polímeros solubles en agua) . Los aminoácidos ejemplares que contienen hidrazina, hidrazida o semicarbazida pueden representarse como sigue: en donde n es 0-10; Ri es un alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido o no se encuentra presente; X es O, N o S o no se encuentra presente; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de la terminación amino, y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de la terminación carboxi . En algunas modalidades, n es 4, Rx no se encuentra presente y X es N. en algunas modalidades, n es 2, Ri no se encuentra presente y X no se encuentra presente. En algunas modalidades, n es 1, Rx es fenilo, X es O, y el átomo de oxígeno se encuentra colocado para al grupo alifático en el anillo arilo. Los aminoácidos que contienen hidrazida, hidrazina y semicarbazida se encuentran disponibles de fuentes comerciales. Por ejemplo, L-glutamato-y-hidrazida se encuentra disponible de Sigma Chemical (St. Louis, MO) . Otros aminoácidos no comercialmente disponibles pueden prepararse por el de experiencia ordinaria en la técnica. Los polipéptidos que contienen aminoácidos codificado de manera no naturals, que contienen funcionalidades hidrazida, hidrazina o semicarbazida pueden reactivarse eficiente y selectivamente con una variedad de moléculas que contienen aldehidos u otros grupos funcionales con reactividad química similar. Ver, e.g., Shao J. y Tam J., J. Am Chem Soc., 117:3893-3899 (1995). La reactividad única de los grupos hidrazida, hidrazina y semicarbazida funcionales, los hace significativamente más reactivos hacia aldehidos, cetonas y otros grupos electrofílicos en comparación con los grupos nucleofílicos presentes en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo, pero sin limitarse a, el grupo hidroxilo de serina o treonina o los grupos amino de lisina y la terminación N) .
C. Aminoácidos que contienen aminooxi Los aminoácidos codificado de manera no naturals que contienen un grupo aminooxi (también llamado una hidroxilamina) permiten la reacción con una variedad de grupos electrofílicos para formar conjugados (incluyendo, pero sin limitarse a, con PEG u otros polímeros solubles en agua) . Como las hidrazinas, hidrazidas y semicarbazidas, el aumento en la nucleofilicidad del grupo aminooxi le permite reaccionar eficiente y selectivamente con una variedad de moléculas que contienen aldehidos u otros grupos funcionales con reactividad química similar. Ver, e.g., Shao J. y Tam J., J. Am Chem Soc., 117:3893-3899 (1995); H. Hang y C. Bertozzi, Acc. Chem. Res., 34:727-736 (2001). Sin embargo, aunque el resultado de la reacción con un grupo hidrazina es la hidrazona correspondiente, una oxima resulta generalmente de la reacción de un grupo aminooxi con un grupo que contiene carbonilo tal como una cetona. Los aminoácidos ejemplares que contienen grupos aminooxi pueden representarse como sigue: en donde n es 0-10; Ri es un alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido o no se encuentra presente; X es O, N o S o no se encuentra presente; m es 0- 10; Y = C(O) o no se encuentra presente; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de la terminación amino, y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de la terminación carboxi. En algunas modalidades, n es 1, Rx es fenilo, X es O, m es 1 y Y se encuentra presente. En algunas modalidades, n es 2, Ri y X no se encuentran presentes, m es 0 y Y no se encuentra presente . Los aminoácidos que contienen aminooxi pueden prepararse de precursores de aminoácido fácilmente disponibles (homoserina, serina y treonina). Ver, e.g., M. Carrasco y R. Brown, J. Org. Chem., 68:8853-8858 (2003). Ciertos aminoácidos que contienen aminooxi, tales como L-2-amino-4- (ácido aminooxi) butírico, se han aislado de fuentes naturales (Rosenthal, G., Life Sci., 60:1635-1641 (1997). Otros aminoácidos que contienen aminooxi pueden prepararse por el de experiencia ordinaria en la técnica. D. Grupos azida y alquino reactivos La reactividad única de los grupos azida y alquino funcionales los hace extremadamente útiles para la modificación selectiva de polipéptidos y otras moléculas biológicas. Los azidas orgánicos, particularmente azidas alifáticos, y alquinos, son generalmente estables hacia condiciones químicas reactivas comunes. En particular, los grupos funcionales tanto azida como alquino son inertes hacia las cadenas laterales (i.e., grupos R) de los 20 aminoácidos comunes encontrados en polipéptidos de origen natural. Sin embargo, cuando se colocan en cercana proximidad, la naturaleza "de carga de resorte" de los grupos azida y alquino se revela y reaccionan selectiva y eficientemente mediante una reacción Huisgen de cicloadición [3+2] para generar el triazolo correspondiente. Ver, e.g., Chin J. et al., Science 301:964-7 (2003); Wang Q., et al., J. Am. Chem. Soc., 125, 3192-3193 (2003); Chin J. W. Et al., J. Am Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002). Debido a que la reacción Huisgen de cicloadición implica una reacción de cicloadición selectiva (ver, e.g., Padwa A. en Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4 (ed. Trost, B. M., 1991) p. 1069-1109; y Huisgen R. en 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry (Ed. Padwa, A., 1984), p. 1-176) en lugar de una sustitución nucleofílica, la incorporación de aminoácidos codificado de manera no naturals que contienen cadenas laterales azida y alquino permite que los polipéptidos resultantes se modifiquen selectivamente en la posición del aminoácido codificado de manera no natural. La reacción de cicloadición que implica el polipéptido de GH que contiene azida o alquino, e.g., de hGH, puede llevarse a cabo a temperatura ambiente bajo condiciones acuosas mediante la adición de Cu (II) (incluyendo, pero sin limitarse a, en forma de una cantidad catalítica de CuS04) en presencia de un agente de reducción para reducir Cu(II) a Cu(I), in situ, en una cantidad catalítica. Ver, e.g., Wang Q., et al., J. Am. Chem. Soc., 125, 3192-3193 (2003); Tornoe C. W. et al., J. Org. Chem. 67:3057-3064 (2002); y Rostovtsev et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599 (2002). Los agentes de reducción ejemplares incluyen, incluyendo, pero sin limitarse a, ascorbato, cobre metálico, quinina, hidroquinona, vitamina K, glutationa, cisteína, Fe2+, Co2+, y un potencial eléctrico aplicado . En algunos casos, cuando se desea una reacción Huisgen de cicloadición [3+2] entre un azida y un alquino, el polipéptido de GH, e.g., de hGH comprende un aminoácido codificado de manera no natural que comprende un residuo alquino y el polímero soluble en agua que va a unirse al aminoácido comprende un residuo azida. Alternativamente, también puede llevarse a cabo la reacción inversa (i.e., con el residuo azida en el aminoácido y el residuo alquino presente en el polímero soluble en agua) . El grupo azida funcional también puede' reactivarse selectivamente con un polímero soluble en agua que contiene un aril éster apropiadamente funcionalizado con un residuo aril fosfina para generar un enlace amida. El grupo de aril fosfina reduce la azida in situ y la amina resultante reacciona entonces eficientemente con un enlace éster próximo para generar la amida correspondiente. Ver, e.g., E. Saxon y C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000). El aminoácido que contiene azida puede ser ya sea un alquil azida (incluyendo, pero sin limitarse a, ácido 2-amino-6-azida-l-hexanoico) o un aril azida (p-azida-fenilalanina) . Los polímeros solubles en agua ejemplares que contienen un aril éster y un residuo fosfina pueden representarse como sigue: en donde X puede ser O, N, S o no se encuentra presente, Ph es fenilo, W es un polímero soluble en agua y R puede ser H, alquilo, arilo, alquilo sustituido y grupos arilo sustituidos. Los grupos R ejemplares incluyen, pero no se limitan a, -CH2, -C(CH3)3, -OR' , -NR'R'', -SR' , -halógeno, -C(0)R', -CONR'R", -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -CN y -N02. R' , R' ' , R' ' ' y R' ' ' ' cada uno independientemente se refieren a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, incluyendo, pero sin limitarse a, arilo sustituido con 1-3 halógenos, alquilo sustituido o no sustituido, grupos alcoxi o tioalcoxi, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como cada grupo R' , R' ' , R' ' ' y R' ' ' cuando más de uno de estos grupos se encuentra presente.
Cuando R' y R' ' se encuentran unidos al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R'' pretende incluir, pero sin limitarse a, 1-pirrolidinilo y 4-morfolinilo. A partir de la descripción anterior de sustituyentes, el experto en la técnica entenderá que el término "alquilo" pretende incluir grupos que incluyen átomos de carbono unidos a grupos diferentes a los grupos de hidrógeno, tales como haloalquilo (incluyendo, pero sin limitarse a, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (incluyendo, pero sin limitarse a, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C(0)CH2OCH3 y lo similar). El grupo azida funcional también puede reactivarse selectivamente con un polímero soluble en agua que contiene un tioéster y apropiadamente funcionalizado con un residuo aril fosfina para generar un enlace amida. El grupo aril fosfina reduce la azida in situ y el amino resultante reacciona entonces eficientemente con el enlace tioéster para generar el amido correspondiente. Los polímeros solubles en agua ejemplares que contienen un tioéster y un residuo fosfina pueden representarse como sigue: en donde n es 1-10; X puede ser O, N, S o no encontrarse presente, Ph es fenilo, y W es un polímero soluble en agua. Los aminoácidos ejemplares que contienen alquino pueden representarse como sigue : R-. ' xX cry en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido o no se encuentra presente; X es O, N o S o no se encuentra presente; m es 0-10; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de la terminación amino, y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de la terminación carboxi. En algunas modalidades, n es 1, Ri es fenilo, X no se encuentra presente, m es 0 y el residuo acetileno se encuentra colocado en la posición para en relación a la cadena lateral alquilo. En algunas modalidades, n es 1, R2 es fenilo, X es O, m es 1 y el grupo propargiloxi se encuentra colocado en la posición para en relación a la cadena lateral alquilo (i.e., O-propargil-tirosina) . En algunas modalidades, n es 1, Ri y X no se encuentran presentes y m es 0 (i.e., proparilglicina) . Los aminoácidos que contienen alquino se encuentran comercialmente disponibles. Por ejemplo propargilicina se encuentra comercialmente disponible de Peptech (Burlington, MA) . Alternativamente, los aminoácidos que contienen alquino pueden prepararse de acuerdo con métodos estándar. Por ejemplo, p-propargiloxifenilalanina puede sintetizarse, por ejemplo, como se describe en Deiters, A., et al., J. Am. Chem. Soc., 125:11782-11783 (2003), y 4-alquinil-L-fenilalanina puede sintetizarse como se describe en Kayser B., et al., Tetrahedron 53 (7 ): 2475-2484 (1997). Otros aminoácidos que contienen alquino pueden prepararse por el de experiencia ordinaria en la técnica. Los aminoácidos ejemplares que contienen azida pueden representarse como sigue: ¡X\?fi-AiCr,XX "1 en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo sustituido, arilo sustituido o no se encuentra presente; X es O, N o S o no se encuentra presente; m es 0-10; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de la terminación amino, y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de la terminación carboxi. En algunas modalidades, n es 1, Rx es fenilo, X no se encuentra presente, m es 0 y el residuo azida se encuentra colocado en la posición para en relación a la cadena lateral alquilo. En algunas modalidades, n es 0.4, Rx y X no se encuentran presentes, y m=0. En algunas modalidades, n es 1, Ri es fenilo, X es 0, m es 2 y el residuo b-azidoetoxi se encuentra colocado en la posición para en relación a la cadena lateral alquilo.
Los aminoácidos que contienen azida se encuentran disponibles de fuentes comerciales. Por ejemplo, 4-azidafenilalanina puede obtenerse de Chem-Impex International, Inc., (Wood Dale, IL) . Para aquellos aminoácidos que contienen azida que no se encuentran comercialmente disponibles, el grupo azida puede prepararse de manera relativamente fácil utilizando métodos estándar conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, a través del desplazamiento de un grupo de salida adecuado (incluyendo, pero sin limitarse a, haluro, mesilato, tosilato) o a través de la abertura de una lactona protegida adecuadamente. Ver, e.g., Advanced Organic Chemistry por March (Tercera Edición, 1985, Wiley and Sons, New York) . E. Grupos aminotiol reactivos La reactividad única de los grupos aminotiol funcionales beta-sustituidos los hace extremadamente útiles para la modificación selectiva de polipéptidos y otras moléculas biológicas que contienen grupos aldehido a través de la formación de la tiazolidina. Ver, e.g., J. Shao y J. Tam., J. Am. Chem. Soc., 1995, 117(14) 3893-3899. En algunas modalidades, los aminoácidos aminotiol beta-sustituidos pueden incorporarse en GH, e.g., polipéptidos de hGH y después reactivarse con polímeros solubles en agua que comprenden una funcionalidad aldehido. En algunas modalidades, un polímero soluble en agua, conjugado de droga u otra carga puede acoplarse a un Polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende un aminoácido de aminotiol beta-sustituido a través de la formación de la tiazolidina. ABSORCIÓN CELULAR DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES La absorción del aminoácido no natural por una célula es un concepto típicamente considerado cuando se diseñan y se seleccionan aminoácidos no naturales, incluyendo, pero sin limitarse a, para incorporación en una proteína. Por ejemplo, la alta densidad de carga de alfa-aminoácidos sugiere que es improbable que estos compuestos sean permeables a la célula. Los aminoácidos naturales se absorben en la célula eucariótica mediante una colección de sistemas de transporte en base a proteínas. Puede efectuarse una rápida visualización que establezca cuáles aminoácidos no naturales, en su caso, se absorben por las células. Ver, e.g., los análisis de toxicidad e.g., en la Publicación de Patente de E.U. No. US 2004/0198637 titulada "Protein Arrays" que se incorpora por la referencia en la presente; y Liu D. R., & Scultz P. G., (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785. Aunque la absorción se analiza fácilmente con diversos análisis, una alternativa para el diseño de aminoácidos no naturales dóciles a las trayectorias de absorción celular, es proporcionar trayectorias biosintéticas para crear aminoácidos in vivo, (i) BIOSÍNTESIS DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES Muchas trayectorias biosintéticas existen ya en células para la producción de aminoácidos y otros compuestos. Aunque puede no existir en la naturaleza un método biosintético para un aminoácido no natural particular, incluyendo, pero sin limitarse a, en una célula, la invención proporciona tales métodos. Por ejemplo, las trayectorias biosintéticas para aminoácidos no naturales que se generan opcionalmente en la célula huésped agregando nuevas enzimas o modificando las trayectorias de célula huésped existentes. Las nuevas enzimas adicionales son opcionalmente, enzimas de origen natural o enzimas desarrolladas artificialmente. Por ejemplo, la biosíntesis de p-aminofenilalanina (como se presenta en un ejemplo de la WO 2002/085923 titulada "In vivo incorporation of unnatural amino acids") se basa en la adición de una combinación de enzimas conocidas de otros organismos. Los genes para estas enzimas pueden introducirse en una célula eucariótica transformando la célula con un plásmido que comprende los genes. Los genes, cuando se expresan en la célula, proporcionan una trayectoria enzimática para sintetizar el compuesto deseado. Ejemplos de los tipos de enzimas que se agregan opcionalmente, se proporcionan en los ejemplos abajo. Secuencias de enzimas adicionales se encuentran, por ejemplo en Genbank. Las enzimas desarrolladas artificialmente se agregan también opcionalmente en una célula de la misma manera. De esta manera, la maquinaria y recursos celulares de una célula se manipulan para producir aminoácidos no naturales. Una variedad de métodos se encuentran disponibles para su uso en trayectorias biosintéticas o para la evolución de trayectorias existentes. Por ejemplo, la recombinación repetitiva, incluyendo, pero sin limitarse a, como se desarrolla por Maxygen, Inc. (disponible en la World Wide Web en maxygen.com), se utiliza opcionalmente para desarrollar nuevas enzimas y trayectorias. Ver, e.g., Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370 ( 4 ): 389-391 ; y Stemmer (1994), DNA shuffling by randon fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91:10747-10751. De manera similar, DesginPath™, desarrollado por Genecor (disponible en la World Wide Web en genencor.com), se utiliza opcionalmente para ingeniería de trayectoria metabólica, incluyendo, pero sin limitarse a, para fabricar una trayectoria para crear O-metil-L-tiriosina en una célula. Esta tecnología reconstruye las trayectorias existentes en organismos huésped utilizando una combinación de nuevos genes, incluyendo, pero sin limitarse a, aquellos identificados a través de genómica funcional y evolución y diseño molecular. Diversa Corporation (disponible en la World Wide Web en diversa.com) proporciona también tecnología para visualizar rápidamente bibliotecas de genes y trayectorias de genes , incluyendo, pero sin limitarse a, para la creación de nuevas trayectorias. Típicamente, el aminoácido no natural producido con una trayectoria biosintética fabricada de la invención, se produce en una concentración suficiente para la eficiente biosmtesis de proteínas, incluyendo, pero sin limitarse a, una cantidad celular natural, pero no a un grado tal que afecte la concentración de otros aminoácidos o que agote los recursos celulares. Las concentraciones típicas producidas ín vivo de esta manera son de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 0.05 mM. Una vez que una célula se transforma con un plasmido que comprende los genes utilizados para producir las enzimas deseadas para una trayectoria específica y que se genera un aminoácido no natural, se utilizan opcionalmente selecciones ín vivo para optimizar adicionalmente la producción del aminoácido no natural tanto para la síntesis de proteina ribosomal como para el crecimiento celular. (b) Polipeptidos con Aminoácidos no Naturales. La incorporación de un aminoácido no natural puede efectuarse para una variedad de propósitos, incluyendo, pero sin limitarse a, diseño de cambios en la estructura y/o función de la protema, cambio de tamaño, acidez, nucleofílicidad, unión a hidrógeno, hidrofobicidad, accesibilidad a sitios objetivo de proteasa, dirección hacia un residuo (incluyendo, pero sin limitarse a, para una disposición de protemas), adición de una molécula biológicamente activa, unión de un polímero, unión de un radionúclido, modulación de la vida media en suero, modulación de la penetración en tejido (e.g., tumores), modulación del transporte activo, modulación del tejido, especificidad o distribución en célula u órgano, modulación de la inmunogenicidad, modulación de la resistencia a proteasa, etc. Las protemas que incluyen un aminoácido no natural pueden tener propiedades catalíticas o biofísicas mejoradas o incluso completamente nuevas. Por ejemplo, las siguientes propiedades se modifican opcionalmente mediante la inclusión de un aminoácido no natural en una proteína: toxicidad, biodistribución, propiedades estructurales, propiedades espectroscopicas, propiedades químicas y/o fotoquímicas, capacidad catalítica, vida media (incluyendo, pero sin limitarse a, vida media en suero) , capacidad para reaccionar con otras moléculas, incluyendo, pero sin limitarse a, de manera covalente o no covalente, y lo similar. Las composiciones que incluyen proteínas que incluyen al menos un aminoácido no natural son útiles para, incluyendo, pero sin limitarse a, nuevos terapéuticos, diagnósticos, enzimas catalíticas, enzimas industriales, proteínas de unión (incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos), e incluyendo, pero sin limitarse a, el estudio y función de la estructura de proteínas. Ver, e.g., Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinión in Chemical Biology, 4:645-652. En un aspecto de la invención, una composición incluye al menos una proteína con al menos uno, incluyendo, pero sin limitarse a, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, o al menos diez o más aminoácidos no naturales. Los aminoácidos no naturales pueden ser el mismo o diferentes, incluyendo, pero sin limitarse a, que puede haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más sitios diferentes en la proteína que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más aminoácidos no naturales diferentes. En otro aspecto, una composición incluye una proteína con al menos uno, pero menos que todos, de un aminoácido particular presentes en la proteína sustituido con el aminoácido no natural. Para una proteína dada con más de un aminoácido no natural, los aminoácidos no naturales pueden ser idénticos o diferentes (incluyendo, pero sin limitarse a, que la proteína puede incluir dos o más diferentes tipos de aminoácidos no naturales, o puede incluir dos del mismo aminoácido no natural) . Para una proteína dada con más de dos aminoácidos no naturales, los aminoácidos no naturales pueden ser el mismo o diferentes o una combinación de un aminoácido no natural múltiple del mismo tipo con al menos un aminoácido no natural diferente. Las proteínas o polipéptidos de interés con al menos un aminoácido no natural son una característica de la invención. La invención incluye también polipéptidos o proteínas con al menos un aminoácido no natural producido utilizando las composiciones y métodos de la invención. También puede encontrarse presente con la proteína un excipiente (incluyendo, pero sin limitarse a, un excipiente farmacéuticamente aceptable) . Al producir proteínas o polipéptidos de interés con al menos un aminoácido no natural en células eucarióticas, las proteínas o polipéptidos incluirán típicamente modificaciones eucarióticas post-traducciónes. En ciertas modalidades, una proteína incluye al menos un aminoácido no natural y al menos una modificación post-traducción que se efectúa in vivo mediante una célula eucariótica, en donde la modificación post-traducción no se efectúa mediante una célula procariótica. Por ejemplo, la modificación de posttranslación incluye pero no se limita a, glicosilación, acetilación, acilación, modificación de lípidos, palmitoilación, adición de palmitato, fosforilación, modificación de enlace de glicolípidos, glicosilación y lo similar. En un aspecto, la modificación post-traducción incluye la unión de un oligosacárido (incluyendo, pero sin limitarse a, (GlcNAc-Man) 2-Man-GlcNAc-GlcNAc) ) a una asparagina mediante un enlace GlcNAc-asparagina . Ver Tabla 1 que lista algunos ejemplos de oligosacáridos N-enlazados de proteínas eucarióticas (también pueden encontrarse presentes residuos adicionales, que no se muestran) . En otro aspecto, la modificación post-traducción incluye la unión de un oligosacárido (incluyendo, pero sin limitarse a, (Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc etc.) a una serina o treonina mediante un enlace GalNAc-serina o GalNAc-treonina, o un enlace GlcNAc-serina o GlcNAc-treonina . Tabla 1: Ejemplos de oligosacáridos a través de enlace Glc-Nac Tipo Estructura Base 2 . ALTA-MANOSA Manal -6-- Manß1-4GlcNAcß1-4GlcNAcß1-Asn 3 . HÍBRI DO Manß1-4G!cNAcß1-4GlcNAcjV»-Asr. GlcNAcß1-2 — — 4 . COMPLEJO GIcNAeßt-2— - Manß1-4GlcNAcß1~4GlcNAcß1-Asn GlcMAcß1-2 — — 4 . XILOSA Manß 1 -4 GicNAcß 1 -4GlcNAcß 1 -Asn Aún en otro aspecto, la modificación posttranslación incluye el procesamiento proteolítico de precursores (incluyendo, pero sin limitarse a, precursor de calcitonina, precursor de péptido relacionado al gen de calcitonina, hormona preproparatiroidea, preproinsulina, proinsulina, preproopiomelanocortina, pro-opiomelanocortina y lo similar) , ensamblado en una proteína multisubunidad o ensamblado macromolecular, translación a otro sitio en la célula (incluyendo, pero sin limitarse a, a organelos, tales como el retículo endoplásmico, el aparato Golgi, el núcleo, lisosomas, peroxisonas, mitocondrio, cloroplastos, vacuolos etc., o a través de la trayectoria secretoria) . En ciertas modalidades, la proteína comprende una secuencia de secreción o localización, una marca de epítope, una marca FLAG, una marca polihistidina, una fusión GST o lo similar. Las Patentes de E.U. Nos. 4,963,495 y 6,436,674, que se incorporan en la presente por la referencia, detallan estructuras diseñadas para mejorar la secreción de polipéptidos de GH, e.g., de hGH. Una ventaja de un aminoácido no natural es que presenta residuos químicos adicionales que pueden utilizarse para agregar moléculas adicionales. Estas modificaciones pueden efectuarse in vivo en una célula eucariótica o no eucariótica o in vitro. Por consiguiente, en ciertas modalidades, la modificación post-traducción se efectúa a través del aminoácido no natural. Por ejemplo, la modificación post-traducción puede efectuarse a través de una reacción nucleofílica-electrofílica . La mayoría de las reacciones actualmente utilizadas para la modificación selectiva de proteínas implican la formación de una unión covalente entre socios de reacción nucleofílicos y electrofílicos, incluyendo, pero sin limitarse a, la reacción de alfa-halocetonas con cadenas laterales histidina o cisteína. La selectividad en estos casos se determina por el número y accesibilidad de los residuos nucleofílicos en la proteína. En las proteínas de la invención, pueden utilizarse otras reacciones más selectivas tales como la reacción de un aminoácido no natural con hidrazidas o compuestos aminooxi, in vitro e in vivo. Ver, e.g., Cornish, et al., (1996) J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151; Mahal et al., (1997) Science, 276:1125-1128; Wang et al., (2001) Science 292:498-500; Chin et al., (2002) J. Am. Chem. Soc., 124:9026-9027; Chin et al., (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. 99:11020.11024; Wang et al., (2003) Proc. Nati. Acad. Sci., 100:56-61; Zhang et al., (2003) Biochemistry, 42:6735-6746; y Chin et al., (2003) Science, 301:964-7, todas las cuales se incorporan por la referencia en la presente. Esto permite el marcado selectivo virtualmente de cualquier proteína con un huésped de reactivos incluyendo fluoróforos, agentes de reticulación, derivados sacárido y moléculas citotóxicas. Ver también, la Patente de E.U. No. 6,972,042 titulada "Glycoprotein synthesis", que se incorpora por la referencia en la presente. Las modificaciones post-traducciónes, incluyendo, pero sin limitarse a, a través de un aminoácido azida, también pueden efectuarse a través de ligando Staudinger (incluyendo, pero sin limitarse a, con reactivos triarilfosfina) . Ver, e.g., Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24. Esta invención proporciona otro método altamente eficiente para la modificación selectiva de proteínas que implica la incorporación genética de aminoácidos no naturales, incluyendo, pero sin limitarse a, un residuo azida o alquinilo en proteínas en respuesta a un codón de selección. Estas cadenas laterales de aminoácidos pueden modificarse entonces mediante, incluyendo, pero sin limitarse a, reacción Huisgen de cicloadición [3+2] (ver, e.g., Padwa A., en Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; y Huisgen R. en 1,3-dipolar Cycloaddition Chemistry (1984) Ed. Padwa A., Wiley, New York., p. 1-176) con, incluyendo, pero sin limitarse a, derivados alquinilo o azida, respectivamente.
Debido a que este método implica una cicloadición en lugar de una sustitución nucleofílica, las proteínas pueden modificarse con una selectividad extremadamente alta. Esta reacción puede llevarse a cabo a temperatura ambiente en condiciones acuosas con excelente regioselectividad (1,4 > 1,5) mediante la adición de cantidades catalíticas de sales de Cu(I) a la mezcla de reacción. Ver, e.g., Tornoe et al., (2002) J. Org. Chem., 67:3057-3064; y Rostovstev et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed., 41:2596-2599. Otro método que puede utilizarse es el intercambio de ligando en un compuesto bisarsénico con un motivo tetracisteína, ver, e.g., Griffin et al., (1998) Science 281:269-272. Una molécula que puede agregarse a una proteína de la invención a través de una cicloadición [3+2] incluye virtualmente cualquier molécula con un derivado azida o alquinilo. Las moléculas incluyen, pero no se limitan a, colorantes, fluoróforos, agentes de reticulación, derivados sacárido, polímeros (incluyendo, pero sin limitarse a, derivados de polietilen glicol), fotorreticuladores, compuestos citotóxicos, marcas de afinidad, derivados de biotina, resinas, perlas, una segunda proteína o polipéptido (o más), polinucleótido (s) (incluyendo, pero sin limitarse a ADN, ARN, etc.), queladores de metal, cofactores, ácidos grasos, carbohidratos y lo similar. Estas moléculas pueden agregarse a un aminoácido no natural con un grupo alquinilo, incluyendo, pero sin limitarse a, p-propargiloxifenilalamna o grupo azida, incluyendo, pero sin limitarse a, p-azida-fenilalanina, respectivamente. V. Generación ín vivo de polipéptidos de GH, e.g., de hGH que comprenden aminoácidos no genéticamente codificados Las GH e.g., polipéptidos de hGH de la invención, pueden generarse ín vivo utilizando ARNt modificado y ARNt smtetasas para agregar a o sustituir aminoácidos que no se encuentran codificados en sistemas de origen natural. Los métodos para generar ARNTs y ARNt sintetasas que utilizan aminoácidos que no se encuentran codificados en sistemas de origen natural, se describen e.g., en las Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0082575 (Serie No. 10/126,927) y 2003/0108885 (Serie No. 10/126,931) que se incorporan mediante la referencia en la presente. Estos métodos implican la generación de una maquinaria translacional que funciona independientemente de las smtetasas y ARNts endógenos al sistema de translación (y en consecuencia se refieren algunas veces como "ortogonales"). Típicamente, el sistema de translación comprende un ARNt ortogonal (O-ARNt) y una aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) . Típicamente, la O-RS preferentemente aminoacila el O-ARNt con al menos un aminoácido de origen no natural en el sistema de translación, y el O-ARNt reconoce al menos un codón de selección que no es reconocido por los otros ARNts en el sistema. El sistema de translación inserta así el aminoácido codificado de manera no natural en una proteína producida en el sistema en respuesta a un codón de selección codificado, "sustituyendo" así un aminoácido en una posición en el polipéptido codificado. Se han descrito en la técnica una amplia variedad de ARNts y aminoacil ARNts sintetasas para insertar aminoácidos sintéticos particulares en polipéptidos, y generalmente son adecuados para su uso en la presente invención. Por ejemplo, las O-ARNt ceto-específica/aminoacil-ARNt sintetasas se describen en Wang L., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 100:56-61 (2003) y Zhang, Z., et al., Biochem., 42 (22 ): 6735-6746 (2003). La O-RS ejemplar, o sus porciones, se encuentra codificada por secuencias de polinucleótidos e incluyen las secuencias de aminoácidos descritas en las Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0082575 y 2003/0108885, cada una incorporada en la presente por la referencia. Las moléculas de O-ARNt correspondientes para su uso con las O-RSs se describen también en las Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0082575 (Serie No. 10/126,927) y 2003/0108885 (Serie No. 10/126,931) que se incorporan mediante la referencia en la presente. Un ejemplo de un sistema de O-ARNt azida-específica/aminoacil-ARNt sintetasa se describe en Chin J.
W., et al., J. Am. Chem. Soc, 124:9026-9027 (2002). Las secuencias de O-RS ejemplares para un p-azida-L-Phe incluyen, pero no se limitan a, secuencias de nucleótidos SEQ ID Nos: 14-16 y 29-32 y las secuencias de aminoácidos SEQ ID Nos: 46-48 y 61-64 como se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0108885 (Serie No. 10/126,931) que se incorpora por la referencia en la presente. Las secuencias de O-ARNt adecuadas para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, secuencias de nucleótidos SEQ ID Nos: 1-3 como se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0108885 (Serie No. 10/126,931) que se incorpora por la referencia en la presente. Otros ejemplos de pares de O-ARNt&aminoacil-ARNt sintetasa específicos para aminoácidos particulares codificado de manera no naturals se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0082575 (Serie No. 10/126,927) que se incorpora por la referencia en la presente. La O-RS y la O-ARNt que incorporan aminoácidos que contienen tanto ceto como azida en S. cerevisiae se describen en Chin J. W., et al., Science 301:964-967 (2003) . Se han reportado varios otros pares ortogonales. Los sistemas glutaminilo (ver, e.g., Liu D. R., y Schultz P. G., (1999) Proc. Nati. Acad. Sci., EUA 96:4780-4785), aspartilo, (ver, e.g., Pastmak M., et al., (2000) Helv. Chim. Acta 83:2277-2286), y tirosilo (ver, e.g., Ohno, S., et al., (1980) J. Biochem (Tokio, Japón) 124:1065-1068; y Kowal, A. K., et al., (2001) Proc. Nati. Acad. Sci., EUA 98:2268-2273) derivados de S. cerevisiae ARNTs y sintetasas se han descrito para la incorporación potencial de aminoácidos no naturales en E. coli. Los sistemas derivados de E. coli glutaminilo (ver e.g., Kowal A. K., et al., (2001) Proc. Nati. Acad. Sci., EUA 98:2268-2273) y tirosilo (ver e.g., Edwards H. y Schimmel P., (1990) Mol. Cell. Biol., 10:1633-1641) sintetasas se han descrito para uso en S. cerevisiae. El sistema de E. coli tirosilo se ha utilizado para la incorporación de 3-yodo-L-tirosina in vivo, en células de mamífero. Ver Sakamoto K., et al., (2002) Nucleic Acids Res., 30:4692-4699. El uso de las O-ARNt/aminoacil ARNt sintetasas implican la selección de un codón específico que codifica el aminoácido codificado de manera no natural. Aunque puede utilizarse cualquier codón, es generalmente deseable seleccionar un codón que raramente o nunca se utiliza en la célula en la cual se expresa la O-ARNt/aminoacil ARNt sintetasa. Por ejemplo, los codones ejemplares incluyen un codón de no sentido como los codones de paro (ámbar, ocre y ópalo) , cuatro o más codones de base y otros codones naturales de tres bases que raramente o nunca se utilizan. El (los) codón (es) de selección específico (s) pueden introducirse en las posiciones apropiadas en la secuencia de codificación del polipéptido de GH, e.g., de hGH utilizando métodos de mutagénesis conocidos en la técnica (incluyendo, pero sin limitarse a, mutagénesis específica del sitio, mutagénesis de cásete, mutagénesis de restricción de selección, etc.). Los métodos para la generación de componentes de la maquinaria biosintética de proteínas, tales como O-RSs, 0-ARNts y pares ortogonales de 0-ARNt/O-RS que pueden utilizarse para incorporar un aminoácido codificado de manera no natural, se describen en Wang L., et al., Science 292:498-500 (2001); Chin J. W., et al., J. Am. Chem. Soc., 124:9026-9027 (2002); Zhang Z., et al., Biochemistry 42:6735-6746 (2003) . Los métodos y composiciones para la incorporación in vivo de aminoácidos codificado de manera no naturals, se describen en la Publicación de la Solicitud de Patente de E.U. 2003/0082575 (Serie No. 10/126,927) que se incorpora por la referencia en la presente. Los métodos para seleccionar un par ortogonal de ARNt-ARNt sintetasa para su uso en el sistema de translación in vivo de un organismo, se describen también en las Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0082575 (Serie No. 10/126,927) y 2003/0108885 (Serie No. 10/126,931) que se incorporan mediante la referencia en la presente. La Publicación PCT No. WO 04/035743 titulada "Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins" que se incorpora por la referencia en la presente en su totalidad, describe RS ortogonal y pares de ARNt para la incorporación de aminoácidos ceto. La Publicación PCT No. WO 04/094593 titulada "Expandmg the Eukapotic Genetic Code", que se incorpora por la referencia en la presente en su totalidad, describe RS ortogonal y pares de ARNt para la incorporación de aminoácidos codificado de manera no naturals en células huésped eucarioticas . Los métodos para la producción de al menos una ammoacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) comprenden: (a) la generación de una biblioteca de RSs (opcionalmente mutante) derivadas de al menos una am oacil-ARNt smtetasa (RS) a partir de un primer organismo, incluyendo, pero sin limitarse a, un organismo procariotico, tal como Methanococcus janaschn, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Eschenchia coll, A. fulgidus, P. furiosus, P. hirokoshn, A. pernix, T. thermophilus o lo similar, o un organismo eucariótico; (b) la selección (y/o visualización) de una biblioteca de RSs (opcionalmente RSs mutantes) para miembros que aminoacilan un ARNt ortogonal (O-ARNt) en presencia de un aminoácido codificado de manera no natural y un aminoácido natural, proporcionando así un depósito de RSs activas (opcionalmente mutantes); y/o (c) la selección (opcionalmente a través de selección negativa) del depósito para RSs activas (incluyendo, pero sin limitarse a, RSs mutantes) que preferentemente aminoacilan la O-ARNt en ausencia del aminoácido codificado de manera no natural, proporcionando así la al menos una O-RS recombinante; en donde la al menos una O-RS recombinante preferentemente aminoacila la O-ARNt con el aminoácido codificado de manera no natural. En una modalidad, la RS es una RS inactiva. La RS inactiva puede generarse mutando una RS activa. Por ejemplo, la RS inactiva puede generarse mutando al menos aproximadamente 1, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, o al menos aproximadamente 10 o más aminoácidos a diferentes aminoácidos, incluyendo, pero sin limitarse a, alanina. Las bibliotecas de RSs mutantes pueden generarse utilizando varias técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, diseño racional en base a la estructura de RS tridimensional de la proteína, o mutagénesis de nucleótidos RS en una técnica aleatoria o racional de diseño. Por ejemplo, las RSs mutantes pueden generarse mediante mutaciones específicas del sitio, mutaciones aleatorias, mutaciones de recombinación generadoras de diversidad, estructuras quiméricas, diseño racional y mediante otros medios descritos en la presente o conocidos en la técnica. En una modalidad, la selección (y/o visualización) de la biblioteca de RSs (opcionalmente RSs mutantes) para miembros que son activos, incluyendo, pero sin limitarse a, que aminoacilan un ARNt ortogonal (O-ARNt) en presencia de un aminoácido codificado de manera no natural y un aminoácido natural, incluye: la introducción de un marcador positivo de selección o visualización, incluyendo, pero sin limitarse a, un gen de resistencia al antibiótico o lo similar, y la biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células, en donde el marcador positivo de selección y/o visualización comprende al menos un codón de selección, incluyendo, pero sin limitarse a un codón ámbar, ocre u opalino; el cultivo de la pluralidad de células en presencia de un agente de selección; la identificación de células que sobreviven (o muestran una respuesta específica) en presencia del agente de selección y/o visualización suprimiendo el al menos un codón de selección en el marcador positivo de selección o visualización, proporcionando así un subconjunto de células positivamente seleccionadas que contienen el depósito de RSs activas (opcionalmente mutantes). Opcionalmente, la concentración del agente de selección y/o visualización puede variar. En un aspecto, el marcador positivo de selección es un gen de cloramfenicol acetiltransferasa (CAT) y el codón de selección es un codón de paro ámbar en el gen CAT. Opcionalmente, el marcador positivo de selección es un gen de b-lactamasa y el codón de selección es un codón de paro ámbar en el gen de b-lactamasa. En otro aspecto, el marcador positivo de visualización comprende un marcados de visualización fluorescente o luminiscente o un marcador de visualización en base a afinidad (incluyendo, pero sin limitarse a un marcador de superficie celular) . En una modalidad, la selección o visualización negativa del depósito para las RSs activas (opcionalmente mutantes) que preferentemente aminoacilan la O-ARNt en ausencia del aminoácido codificado de manera no natural incluye: la introducción de un marcador negativo de selección o visualización con el depósito de RSs activas (opcionalmente mutantes) a partir de la selección o visualización positiva en una pluralidad de células de un segundo organismo, en donde el marcador negativo de selección o visualización comprende al menos un codón de selección (incluyendo, pero sin limitarse a, un gen de resistencia al antibiótico, incluyendo pero sin limitarse a un gen de cloramfenicol acetiltransferasa (CAT) ) ; y la identificación de las células que sobreviven o muestran una respuesta de visualización específica en un primer medio complementado con el aminoácido codificado de manera no natural y un agente de visualización o selección, pero fallan la supervivencia o muestran la respuesta específica en un segundo medio no complementado con el aminoácido codificado de manera no natural y el agente de selección o visualización, proporcionando así células supervivientes o células visualizadas con la al menos una 0-RS recombinante. Por ejemplo, el protocolo de identificación de CAT actúa opcionalmente como una selección positiva y/o visualización negativa en la determinación de la O-RS recombinante apropiada. Por ejemplo, un depósito de clones se repite opcionalmente en placas de cultivo que contienen CAT (que comprende al menos un codón de selección) ya sea con o sin uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals. Las colonias que crecen exclusivamente en las placas que contienen aminoácidos codificado de manera no naturals se considera que contienen O-RS recombinante. En un aspecto, la concentración del agente de selección (y/o visualización) varía. En algunos aspectos, el primero y segundo organismos son diferentes. Por consiguiente, el primero y/o segundo organismo comprende opcionalmente, una procariota, una eucariota, un mamífero, una Escherichia coli, un hongo, una levadura, una arquibacteria, una eubacteria, una planta, un insecto, un protista, etc. En otras modalidades, el marcador de visualización comprende un marcador de visualización fluorescente o luminiscente o un marcador de visualización en base a afinidad. En otra modalidad la visualización o selección (incluyendo, pero sin limitarse a la selección negativa), del depósito de RSs activas (opcionalmente mutantes) incluye: el aislamiento del depósito de RSs activas mutantes a partir de la etapa de selección positiva (b) ; la introducción de un marcador negativo de selección o visualización, en donde el marcador negativo de selección o visualización comprende al menos un codón de selección (incluyendo, pero sin limitarse a, un gen de marcador tóxico, incluyendo, pero sin limitarse a un gen de ribonucleasa barnasa, que comprende al menos un codón de selección) , y el depósito de RSs activas (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células de un segundo organismo; y la identificación de las células que sobreviven o muestran una respuesta de visualización específica en un primer medio no complementado con el aminoácido codificado de manera no natural, pero fallan la supervivencia o muestran la respuesta de visualización específica en un segundo medio complementado con el aminoácido codificado de manera no natural, proporcionando así células supervivientes o visualizadas con la al menos una O-RS recombinante, en donde la al menos una O-RS recombinante es específica para el aminoácido codificado de manera no natural. En un aspecto, el al menos un codón de selección comprende aproximadamente dos o más codones de selección. Tales modalidades pueden incluir opcionalmente, en donde el al menos un codón de selección comprende dos o más codones de selección, o en donde el primero y segundo organismos son diferentes (incluyendo, pero sin limitarse a, cada organismo es opcionalmente, incluyendo, pero sin limitarse a, una procariota, una eucariota, un mamífero, una Escherichia coli, un hongo, una levadura, una arquibacteria, una eubacteria, una planta, un insecto, un protista, etc.). También algunos aspectos incluyen en donde el marcador negativo de selección comprende un gen de ribonucleasa barnasa (que comprende al menos un codón de selección) . Otros aspectos incluyen, en donde el marcador de visualización comprende opcionalmente un marcador de visualización fluorescente o luminiscente o un marcador de visualización en base a afinidad. En las modalidades presentes, las visualizaciones y/o selecciones incluyen opcionalmente la variación de la rigidez de visualización y/o selección. En una modalidad, los métodos para producir al menos una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal recombinante (0-RS) pueden comprender además: (d) el aislamiento de la al menos una O-RS recombinante; (e) la generación de un segundo conjunto de O-RS (opcionalmente mutadas) derivadas de la al menos una O-RS recombinante; y (f) la repetición de las etapas (b) y (c) hasta obtener una O-RS mutada que comprende la capacidad de aminoacilar preferentemente la O-ARNt. Opcionalmente, las etapas (d)-(f) se repiten, incluyendo, pero sin limitarse a, al menos dos veces. En un aspecto, el segundo conjunto de O-RS mutadas derivadas de al menos una 0-RS recombinante puede generarse mediante mutagénesis, incluyendo, pero sin limitarse a, mutagénesis aleatoria, mutagénesis específica del sitio, recombinación o una combinación de las mismas. La rigidez de las etapas de selección/visualización, incluyendo, pero sin limitarse a, la etapa (b) de selección/visualización positiva, la etapa (c) de selección/visualización negativa o las etapas tanto (b) como (c) de selección/visualización positiva y negativa, en los métodos antes descritos, opcionalmente incluye la variación de la rigidez de selección/visualización. En otra modalidad, la etapa (b) de selección/visualización positiva, la etapa (c) de selección/visualización negativa o las etapas tanto (b) como (c) de selección/visualización positiva y negativa comprenden el uso de un informante, en donde el informante se detecta mediante selección de célula activada por fluorescencia (FACS) o en donde el informante se detecta mediante luminiscencia. Opcionalmente el informante se despliega en una superficie celular, en despliegue fago o lo similar y se selecciona en base a la afinidad o la actividad catalítica que implica al aminoácido codificado de manera no natural o un análogo. En una modalidad, la sintetasa mutada se despliega en una superficie celular, en un despliegue fago o lo similar. Los métodos para producir un ARNt ortogonal recombinante (O-ARNt) incluyen: (a) la generación de una biblioteca de ARNts mutantes derivadas de al menos una ARNt incluyendo, pero sin limitarse a, un supresor de ARNt de un primer organismo; (b) la selección (incluyendo, pero sin limitarse a, selección negativa) o visualización de la biblioteca para ARNts (opcionalmente mutantes) que se aminoacilan por una aminoacil-ARNt sintetasa (RS) de un segundo organismo en ausencia de una RS del primer organismo, proporcionando así un depósito de ARNts (opcionalmente mutantes); y (c) la selección o visualización del depósito de ARNts (opcionalmente mutantes) para miembros que se aminoacilan por una RS ortogonal (O-RS) introducida, proporcionando así al menos una O-ARNt recombinante; en donde la al menos una O-ARNt recombinante reconoce un codón de selección y no es reconocida eficientemente por la O-RS. En algunas modalidades, la al menos una ARNt es una ARNt de supresión y/o comprende un codón único de tres bases de bases naturales y/o no naturales, o es un codón de no sentido, un codón raro, un codón no natural, un codón que comprende al menos 4 bases, un codón ámbar, un codón ocre o un codón de paro opalino. En una modalidad, la O-ARNt recombinante posee una mejora de ortogonalidad. Se apreciará que en algunas modalidades, la O-ARNt se importa opcionalmente en un primer organismo a partir de un segundo organismo sin necesidad de modificación. En varias modalidades, el primero y segundo organismos son el mismo o diferentes y se seleccionan opcionalmente de, incluyendo, pero sin limitarse a, procariotas (incluyendo, pero sin limitarse a, Methanococcus jannaschn, Methanobacterium thermoautotrophicum, Escherichia coli, Halobacterium etc.), eucariotos, mamíferos, hongos, levaduras, archaebacterium, eubacterium, plantas, insectos, protists, etc. Adicionalmente la ARNt recombinante se aminoacila opcionalmente por un aminoácido codificado de manera no natural, en donde el aminoácido codificado de manera no natural se bios tetiza m vivo ya sea naturalmente o a través de manipulación genética. El aminoácido codificado de manera no natural se agrega opcionalmente a un medio de crecimiento para al menos el primero o segundo organismo . En un aspecto, la selección (incluyendo, pero sin limitarse a, selección negativa) o visualización de la biblioteca para ARNts (opcionalmente mutantes) que se ammoacilan por una aminoacil-ARNt smtetasa (etapa (B) ) incluye: la introducción de un gen marcador tóxico, en donde el gen marcador tóxico comprende al menos uno de los codones de selección (o un gen que conduce a la producción de un agente tóxico o estático o un gen esencial para el organismo en donde tal gen marcador comprende al menos un codón de selección) y la biblioteca de ARNts (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células del segundo organismo; y la selección de las células sobrevivientes, en donde las células supervivientes contienen el depósito de ARNts (opcionalmente mutantes) que comprenden al menos un ARNt ortogonal o ARNt no funcional. Por ejemplo, las células supervivientes pueden seleccionarse utilizando un análisis de comparación de densidad celular promedio. En otro aspecto, el gen marcador tóxico puede incluir dos o más codones de selección. En otra modalidad de los métodos, el gen marcador tóxico es un gen de ribonucleasa barnasa, en donde el gen de ribonucleasa barnasa comprende al menos un codón ámbar. Opcionalmente el gen de ribonucleasa barnasa puede incluir dos o más codones ámbar. En una modalidad, la selección o visualización del depósito de ARNts (opcionalmente mutantes) para miembros que se aminoacilan por una RS ortogonal (O-RS) introducida pueden incluir: la introducción de un gen marcados de selección o visualización positiva, en donde el gen marcador positivo comprende un gen resistente a la droga (incluyendo, pero sin limitarse a, el gen de b-lactamasa, que comprende al menos uno de los codones de selección, tales como al memos un codón de paro ámbar) o un gen esencial para el organismo, o un gen que conduce a la detoxificación de un agente tóxico, conjuntamente con la O-RS, y el depósito de ARNts (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células del segundo organismo; y la identificación de células supervivientes o visualizadas cultivadas en presencia de un agente de selección o visualización, incluyendo, pero sin limitarse a, un antibiótico, proporcionando así un depósito de células que poseen el al menos un ARNt recombinante, en donde el al menos un ARNt recombinante se aminoacila por la O-RS y se inserta como un aminoácido en un producto de translación codificado por el gen marcador positivo, en respuesta al, al menos un codón de selección. Se proporcionan métodos para generar pares de 0-ARNt/0-RS específicos. Los métodos incluyen: (a) la generación de una biblioteca de ARNts mutantes derivados de al menos un ARNt de un primer organismo; (b) la selección o visualización negativa de la biblioteca para ARNts (opcionalmente mutantes) que se aminoacilan por una aminoacil-ARNt sintetasa (RS) a partir de un segundo organismo en ausencia de una RS del primer organismo, proporcionando así un depósito de ARNts (opcionalmente mutantes); (c) la selección o visualización del depósito de ARNts (opcionalmente mutantes) para miembros que se aminoacilan por una RS ortogonal (O-RS) introducida, proporcionando así al menos una O-ARNt recombinante. La al menos una O-ARNt recombinante reconoce un codón de selección y no es reconocida eficientemente por la RS del segundo organismo y preferentemente se aminoacila por la O-RS. El método incluye también (d) la generación de una biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) derivadas de al menos una ammoacil-ARNt sintetasa (RS) de un tercer organismo; (e) la selección o visualización de la biblioteca de RSs mutantes para miembros que preferentemente aminoacilan la al menos una O-ARNt recombmante en presencia de un aminoácido codificado de manera no natural y un aminoácido natural, proporcionando así un depósito de RSs activas (opcionalmente mutantes); y (f) la selección o visualización negativa del depósito para RSs activas (opcionalmente mutantes) que aminoacilan preferentemente la al menos una O-ARNt recombinante en ausencia de un aminoácido codificado de manera no natural, proporcionando así el al menos un par de O-ARNt/O-RS específico, en donde el al menos un par de O-ARNt/O-RS comprende al menos una O-RS recombmante que es específica para el aminoácido codificado de manera no natural y la al menos una O-ARNt recombmante. Se incluyen los pares de 0-ARNt/O-RS específicos producidos mediante los métodos. Por ejemplo, el par de O-ARNt/O-RS específico puede incluir, incluyendo, pero sin limitarse a, un par mutARNTyr-mutTyrRS, tal como un par mutARNTyr-SS12TyrRS, un par mutARNLeu-mutLeuRS, un par mutARNThr-mutThrRS, un par mutARNGlu-mutGluRS o lo similar. Adicionalmente, tales métodos incluyen en donde el primero y el tercer organismo son el mismo (incluyendo, pero sin limitarse a, Methanococcus jannaschii) . También se incluyen en la presente invención métodos para seleccionar un par de ARNt ortogonal-ARNt smtetasa para su uso en un sistema de translación m vivo de un segundo organismo. Los métodos incluyen: la introducción de un gen marcador, un ARNt y una ammoacil-ARNt smtetasa (RS) aislada o derivada de un primer organismo, en un primer conjunto de células del segundo organismo; y, la selección de células supervivientes en el primer conjunto que fallan en sobrevivir en el conjunto de células duplicado o la visualizacion de células que muestran una respuesta de visualizacion especifica que fallan en proporcionar tal respuesta en el conjunto de células duplicado, en donde el primer conjunto y el conjunto de células duplicado se cultivan en presencia de un agente de selección o visualizacion, en donde las células supervivientes o visualizadas comprenden un par de ARNt ortogonal-ARNt smtetasa para su uso en el sistema de translación m vivo del segundo organismo. En una modalidad, la comparación y selección incluyen un análisis de complemento m vivo. La concentración del agente de selección o visualizacion puede variar. Los organismos de la presente invención comprenden una variedad de organismos y una variedad de combinaciones. Por ejemplo, el primero y segundo organismos de los métodos de la presente invención pueden ser el mismo o diferente. En una modalidad, los organismos son opcionalmente un organismo procariótico, incluyendo, pero sin limitarse a, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus o lo similar. Alternativamente, los organismos comprenden opcionalmente un organismo eucariótico, incluyendo, pero no se limitan a, plantas (incluyendo, pero sin limitarse a, plantas complejas tales como monocotiledóneas o dicotiledóneas), algas, protists, hongos (incluyendo, pero sin limitarse a, levadura, etc.), animales (incluyendo, pero sin limitarse a mamíferos, insectos, artrópodos, etc.) o lo similar. En otra modalidad, el segundo organismo es un organismo procariótico, incluyendo, pero sin limitarse a, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus o lo similar. Alternativamente, el segundo organismo puede ser un organismo eucariótico, incluyendo, pero sin limitarse a una levadura, una célula animal, una célula vegetal, un hongo, una célula de mamífero o lo similar. En varias modalidades, el primero y segundo organismos son diferentes. VI. Ubicación de aminoácidos de origen no natural en GH, e.g., polipéptidos de hGH La presente invención contempla la incorporación de uno o más aminoácidos de origen no natural en polipéptidos de GH, e.g., de hGH. Uno o más aminoácidos de origen no natural pueden incorporarse en una posición particular que no fractura la actividad del polipéptido. Esto puede lograrse elaborando sustituciones "conservadoras", incluyendo, pero sin limitarse a, la sustitución de aminoácidos hidrófobos con aminoácidos hidrófobos, aminoácidos bultosos por aminoácidos bultosos, aminoácidos hidrófilos por aminoácidos hidrófilos y/o la inserción del aminoácido de origen no natural en una ubicación que no se requiere para la actividad. Las regiones de GH, e.g., de hGH pueden ilustrarse como sigue, en donde las posiciones de aminoácidos en la hGH se indican en la fila media (SEQ ID NO: 2) : Hélice A Hélice B Hélice C Hélice D [1-5] -[6-33] -[34-74] -[75-96] -[97-105] -[106-129] -[130-153] -[154-183] -[184-191] term-N circuito A-B circuito B-C circuito C-D term-C Puede emplearse una variedad de procedimientos bioquímicos y estructurales para seleccionar los sitios deseados para sustitución con un aminoácido codificado de manera no natural dentro del polipéptido de GH, e.g., de hGH. Es fácilmente aparente para los de experiencia ordinaria en la técnica que cualquier posición de la cadena de polipéptido es adecuada para selección para incorporar un aminoácido codificado de manera no natural, y la selección puede basarse en el diseño racional o por medio de selección aleatoria para cualquier propósito o ninguno deseado en particular. La selección de los sitios deseados puede ser para producir una GH, e.g., molécula de hGH que tiene cualquier propiedad o actividad deseada, incluyendo, pero sin limitarse a, agonistas, super-agonistas, agonistas inversos, antagonistas, moduladores de unión del receptor, moduladores de actividad del receptor, formación de dímero o multímero, ningún cambio en la actividad o propiedad en comparación con la molécula de origen, o manipulación de cualquier propiedad física o química del polipéptido, tal como la solubilidad, la agregación o estabilidad. Por ejemplo, las ubicaciones en el polipéptido requerido para la actividad biológica de polipéptidos de GH, e.g., de hGH, pueden identificarse utilizando análisis de mutación de punto, métodos de exploración alanina o exploración homologa conocidos en la técnica. Ver, e.g., Cunningham, B. y Wells, J. Science, 244:1081-1085 (1989) (que identifica 14 residuos críticos para la bioactividad de GH, e.g., hGH) y Cunningham B. et al., Science 243:1330-1336 (1989) (que identifica anticuerpos y epítopes receptor utilizando mutagénesis de exploración homologa). Las Patentes de E.U. Nos. 5,580,723; 5,834,250; 6,013,478; 6,428,954; y 6,451,561, que se incorporan mediante la referencia en la presente, describen métodos para el análisis sistemático de la estructura y función de polipéptidos tales como de hGH identificando dominios activos que influyen la actividad del polipéptido con una sustancia objetivo. Los residuos diferentes a los identificados como críticos a la actividad biológica mediante mutagénesis de exploración alanina u homologa, pueden ser buenos candidatos para la sustitución con un aminoácidos codificado de manera no natural dependiendo de la actividad deseada buscada para el polipéptido. Alternativamente, los sitios identificados como críticos para la actividad biológica también pueden ser buenos candidatos para la sustitución con un aminoácido codificado de manera no natural, de nuevo dependiendo de la actividad deseada buscada para el polipéptido. Otra alternativa sería simplemente la elaboración de sustituciones en serie en cada posición en la cadena de polipéptidos con un aminoácido codificado de manera no natural y la observación del efecto en las actividades del polipéptido. Es fácilmente aparente para los de experiencia ordinaria en la técnica que cualquier medio, técnica o método para la selección de una posición para la sustitución con un aminoácido no natural en cualquier polipéptido es adecuado para su uso en la presente invención . La estructura y actividad de mutantes de origen natural de polipéptidos de hGH que contienen supresiones, también puede examinarse para determinar regiones de la proteína que son probablemente tolerantes a la sustitución con un aminoácido codificado de manera no natural. Ver, e.g., Kostyo et al., Biochem. Biophys. Acta, 925:314 (1987); Lewis, U., et al., J. Biol. Chem., 253:2679-2687 (1978) para hGH. De manera similar, puede utilizarse digestión proteasa y anticuerpos monoclonales para identificar las regiones de hGH que son responsables de la unión del receptor de hGH. Ver, e.g., Cunnmgham B. et al., Science 243:1330-1336 (1989); Mills J. et al., Endocrmology, 107:391-399 (1980); Li C, Mol. Cell. Biochem., 46:31-41 (1982) (que indica que los aminoácidos entre los residuos 134-149 pueden suprimirse sin pérdida de actividad) . Una vez que los residuos que son probablemente intolerantes a la sustitución con aminoácidos codificado de manera no naturals se han eliminado, el impacto de las sustituciones propuestas en cada una de las posiciones restantes puede examinarse a partir de la estructura tridimensional cristalina de la hGH y sus proteínas de unión. Ver, de Vos, A. et al., Science 255:306-312 (1992) para hGH; todas las estructuras cristalinas de hGH se encuentran disponibles en el Protein Data Bank (que incluye 3HHR, 1AXI, y 1HWG) (PDB, disponible en la World Wide Web en rcsb.org), una base de datos centralizada que contiene datos estructurales tridimensionales de grandes moléculas de proteínas y ácidos nucleicos. Los modelos pueden elaborarse investigando la estructura secundaria y terciaria de polipéptidos, si los datos estructurales tridimensionales no se encuentran disponibles. por consiguiente, los de experiencia ordinaria en la técnica pueden identificar fácilmente las posiciones de aminoácido que pueden sustituirse con aminoácidos codificado de manera no naturals. En algunas modalidades, polipéptidos de GH, e.g., de hGH de la invención comprenden uno o más aminoácidos de origen no natural colocados en una región de la proteína que no fractura las hélices de la estructura secundaria de hoja beta del polipéptido. Los residuos ejemplares de incorporación de un aminoácido codificado de manera no natural pueden ser aquellos que se encuentra excluidos de las regiones potenciales de unión del receptor (incluyendo, pero sin limitarse a, Sitio I y Sitio II), pueden exponerse total o parcialmente al solvente, tienen mínima o ninguna interacción de unión de hidrógeno con residuos cercanos, pueden exponerse mínimamente a residuos reactivos cercanos, y pueden encontrarse en regiones altamente flexibles (incluyendo, pero sin limitarse a, circuito C-D) o estructuralmente rígidas (incluyendo, pero sin limitarse a hélice B) y predichas mediante la estructura cristalina tridimensional, estructura secundaria, terciaria o cuaternaria de hGH, unidas o no unidas a su receptor. En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals se encuentran incorporados en cualquier posición en una o más de las siguientes regiones correspondientes a las estructuras secundarias en la hGH como sigue: 1-5 (terminación N) , 6-33 (hélice A), 34-74 (región entre la hélice A y la hélice B, el circuito A-B) , 75-96 (hélice B) , 97-105 (región entre la hélice B y la hélice C, el circuito B-C), 106-129 (hélice C) , 130-153 (región entre la hélice C y la hélice D, el circuito C-D) , 154-183 (hélice D) , 184-191 (terminación C) de la SEQ ID NO: 2. En otras modalidades, los polipéptidos de polipéptidos de GH, e.g., de hGH de la invención comprenden al menos un aminoácido de origen no natural sustituido por al menos un aminoácido en al menos una región de GH, e.g., de hGH seleccionada del grupo que consiste de las regiones correspondientes a la terminación N (1-5), el extremo de terminación N del circuito A-B (32-46), el circuito B-C (97-105), el circuito C-D (132-149) y la terminación C (184-191) de la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals se incorporan en una o más de las siguientes posiciones en la GH, e.g., hGH correspondientes a: antes de la posición 1 (i.e., en la terminación N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (i.e., en la terminación carboxilo de la proteína) de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. Los sitios ejemplares de incorporación de uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals incluyen los sitios correspondientes a 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186 y 187 o cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. Un subconjunto de sitios ejemplares para la incorporación de uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals incluye los sitios correspondientes a 29, 33, 35, 37, 39, 49, 57, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 186 y 187 o cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. Un examen de la estructura cristalina de GH, e.g., hGH y sus interacciones con la GH, e.g., receptor de hGH indica que las cadenas laterales de estos residuos de aminoácido se encuentran total o parcialmente accesibles al solvente y la cadena lateral de un aminoácido codificado de manera no natural puede apuntarse lejos de la superficie de la proteína y hacia el solvente. Las posiciones ejemplares para la incorporación de uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals incluyen los sitios correspondientes a 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145 y 155 o cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. Un examen de la estructura cristalina de GH, e.g., hGH y sus interacciones con la GH, e.g., receptor de hGH indica que las cadenas laterales de estos residuos de aminoácido se encuentran totalmente expuestas al solvente y la cadena lateral del residuo de origen se apunta lejos hacia el solvente. Un subconjunto de los sitios ejemplares para la incorporación de uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals incluye los sitios correspondientes a 30, 74, 103 o cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. Otro subconjunto de los sitios ejemplares para la incorporación de uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals incluye sitios correspondientes a 35, 92, 143, 145 o cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3.
Un subconjunto adicional de sitios ejemplares para la incorporación de uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals incluye los sitios correspondientes a 35, 92, 131, 134, 143, 145 o cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. Aún un subconjunto adicional de sitios ejemplares para la incorporación de uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals incluye los sitios correspondientes a 30, 35, 74, 92, 103, 145 o cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. Aún un subconjunto adicional de sitios ejemplares para la incorporación de uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals incluye los sitios correspondientes a 35, 92, 143, 145 o cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. En ciertas modalidades, los sitios de incorporación para la incorporación de uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals incluye un sitio correspondiente a 35 de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. En algunas modalidades, al menos uno de los aminoácidos codificado de manera no naturals incorporados en la GH, e.g., hGH contiene un grupo carbonilo, e.g., un grupo cetona. En ciertas modalidades, al menos uno de los aminoácidos codificado de manera no naturals incorporados en la GH, e.g., hGH es para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades, en las cuales la GH, e.g., hGH contiene una pluralidad de aminoácidos codificado de manera no naturals, más de uno de los aminoácidos codificado de manera no naturals incorporados en la GH, e.g., hGH es para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades, en las cuales la GH, e.g., hGH contiene una pluralidad de aminoácidos codificado de manera no naturals, sustancialmente todos los aminoácidos codificado de manera no naturals incorporados en la GH, e.g., hGH son para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua en una o más posiciones, incluyendo, pero sin limitarse a las posiciones correspondientes a: antes de la posición 1 (i.e., en la terminación N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (i.e., en la terminación carboxilo de la proteína) (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua en posiciones incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones correspondientes a una o más de estas posiciones: 30, 35, 74, 92, 103, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua en posiciones incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones correspondientes a una o más de estas posiciones: 35, 92, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua en posiciones incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones correspondientes a una o más de estas posiciones: 35, 92, 131, 143, 145 o cualquier combinación de las mismas de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua en posiciones incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones correspondientes a una o más de estas posiciones: 30, 35, 74, 92, 103, 145 o cualquier combinación de las mismas de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua en posiciones incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones correspondientes a una o más de estas posiciones: 35, 92, 143, 145 o cualquier combinación de las mismas de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua en una posición correspondiente a, pero sin limitarse a, la posición 35 de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3 se enlazan a un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el (los) polímero(s) soluble (s) en agua enlazados a la GH, e.g., hGH, incluye (n) una o más moléculas de polietilen glicol (PEGs). El polímero, e.g., PEG, puede ser lineal o ramificado. Típicamente, los polímeros lineales, e.g., PEGs, utilizados en la invención pueden tener un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o de aproximadamente 30 kDa. Típicamente, los polímeros ramificados, e.g., PEGs, utilizados en la invención pueden tener un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o de aproximadamente 40 kDa. Los polímeros tal como PEGs se describen adicionalmente en la presente. En ciertas modalidades, el enlace entre la GH, e.g., hGH y el polímero soluble en agua, e.g., PEG, es una unión oxima. Ciertas modalidades de la invención abarcan composiciones que incluyen una GH, e.g., hGH, enlazada a al menos un polímero soluble en agua mediante una unión covalente, en donde la unión covalente es una unión oxima. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua es un PEG, e.g., un PEG lineal. En algunas modalidades que abarcan al menos un PEG lineal enlazado por una unión oxima a una GH, e.g., hGH, el PEG puede tener un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o de aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades, que abarcan un PEG lineal enlazado por una unión oxima a una GH, e.g., hGH, el PEG tiene un MW de aproximadamente 30 kDa. En algunas modalidades que abarcan al menos un PEG ramificado enlazado por una unión oxima a una GH, e.g., hGH, el PEG puede tener un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o de aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades, que abarcan un PEG ramificado enlazado por una unión oxima a una GH, e.g., hGH, el PEG tiene un MW de aproximadamente 40 kDa. En algunas modalidades, la GH es una GH, e.g., hGH y en ciertas de estas modalidades, la GH, e.g., hGH tiene una secuencia que es al menos aproximadamente 80% idéntica a la SEQ ID NO: 2; en algunas modalidades la GH, e.g., hGH tiene una secuencia que es la secuencia de la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, la GH, e.g., hGH contiene al menos un aminoácido codificado de manera no natural; en algunas de estas modalidades, la al menos una unión oxima se encuentra entre el aminoácido codificado de manera no natural y el al menos un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural contiene un grupo carbonilo, tal como un grupo cetona; en algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural es para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades, la para-acetilfenilalanina se sustituye en una posición correspondiente a la posición 35 de la SEQ ID NO: 2. Por consiguiente, en algunas modalidades, la invención proporciona una GH; e.g., hGH, enlazada a al menos un polímero soluble en agua, e.g., un PEG, mediante una unión covalente, en donde la unión covalente es una unión oxima. En ciertas modalidades, el polímero soluble en agua es un PEG y el PEG es un PEG lineal. En estas modalidades el PEG lineal tiene un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o de aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades, que abarcan un PEG lineal enlazado por una unión oxima a una GH, e.g., hGH, el PEG tiene un MW de aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades, el polímero soluble en agua es un PEG que es un PEG ramificado. En estas modalidades, el PEG ramificado tiene un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o de aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades, que abarcan un PEG ramificado enlazado por una unión oxima a una GH, e.g., hGH, el PEG tiene un MW de aproximadamente 40 kDa. En algunas modalidades, la invención proporciona una GH, e.g., hGH, en donde la GH, e.g., hGH contiene un aminoácido codificado de manera no natural, en donde la GH se encuentra enlazada a al menos un polímero soluble en agua, e.g., un PEG, mediante una unión covalente, y en donde la unión covalente es una unión oxima entre el aminoácido codificado de manera no natural y el polímero soluble en agua, e.g., PEG. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural se incorpora en la GH, e.g., hGH, en una posición correspondiente a la posición 35 de la SEQ ID NO: 2. En ciertas modalidades, en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG lineal. En estas modalidades, el PEG lineal tiene un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o de aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades, que abarcan un PEG lineal enlazado por una unión oxima a una GH, e.g., hGH, el PEG tiene un MW de aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades, en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG ramificado. En estas modalidades, el PEG ramificado tiene un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o de aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades, que abarcan un PEG ramificado enlazado por una unión oxima a una GH, e.g., hGH, el PEG tiene un MW de aproximadamente 40 kDa. En algunas modalidades, la invención proporciona una GH, e.g., hGH, en donde la GH, e.g., hGH contiene un aminoácido codificado de manera no natural que es un aminoácido codificado de manera no natural que contiene carbonilo, en donde la GH se encuentra enlazada a al menos un polímero soluble en agua, e.g., un PEG, mediante una unión covalente, y en donde la unión covalente es una unión oxima entre el aminoácido codificado de manera no natural que contiene carbonilo y el polímero soluble en agua, e.g., PEG. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural que contiene carbonilo se incorpora en la GH, e.g., hGH, en una posición correspondiente a la posición 35 de la SEQ ID NO: 2. En ciertas modalidades, en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG lineal. En estas modalidades, el PEG lineal tiene un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o de aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades, que abarcan un PEG lineal enlazado por una unión oxima a una GH, e.g., hGH, el PEG tiene un MW de aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades, en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG ramificado. En estas modalidades, el PEG ramificado tiene un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o de aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades, que abarcan un PEG ramificado enlazado por una unión oxima a una GH, e.g., hGH, el PEG tiene un MW de aproximadamente 40 kDa. En algunas modalidades, la invención proporciona una GH, e.g., hGH que contiene un aminoácido codificado de manera no natural que incluye un grupo cetona, en donde la GH se encuentra enlazada a al menos un polímero soluble en agua, e.g., un PEG, mediante una unión covalente, y en donde la unión covalente es una unión oxima entre el aminoácido codificado de manera no natural que contiene un grupo cetona y el polímero soluble en agua, e.g., PEG. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural que contiene un grupo cetona se incorpora en la GH, e.g., hGH, en una posición correspondiente a la posición 35 de la SEQ ID NO: 2. En ciertas modalidades, en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG lineal. En estas modalidades, el PEG lineal tiene un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o de aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades, que abarcan un PEG lineal enlazado por una unión oxima a una GH, e.g., hGH, el PEG tiene un MW de aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades, en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG ramificado. En estas modalidades, el PEG ramificado tiene un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o de aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades, que abarcan un PEG ramificado enlazado por una unión oxima a una GH, e.g., hGH, el PEG tiene un MW de aproximadamente 40 kDa. En algunas modalidades, la invención proporciona una GH, e.g., hGH, que contiene un aminoácido codificado de manera no natural que es para-acetilfenilalanina, en donde la GH se encuentra enlazada a al menos un polímero soluble en agua, e.g., un PEG, mediante una unión covalente, y en donde la unión covalente es una unión oxima entre la para-acetilfenilalanina y el polímero soluble en agua, e.g., PEG. En algunas modalidades, la para-acetilfenilalanina se incorpora en la GH, e.g., hGH, en una posición correspondiente a la posición 35 de la SEQ ID NO: 2. En ciertas modalidades, en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG lineal. En estas modalidades, el PEG lineal tiene un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o de aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades, que abarcan un PEG lineal enlazado por una unión oxima a una GH, e.g., hGH, el PEG tiene un MW de aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades, en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG ramificado. En estas modalidades, el PEG ramificado tiene un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o de aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades, que abarcan un PEG ramificado enlazado por una unión oxima a una GH, e.g., hGH, el PEG tiene un MW de aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades, la invención proporciona una GH, e.g., hGH que incluye la SEQ ID NO: 2, y en donde la GH, e.g., hGH se sustituye en una posición correspondiente a la posición 35 de la SEQ ID NO: 2 con para-acetilfenilalanina que se encuentra enlazada por un enlace oxima a un PEG lineal de MW de aproximadamente 30 kDa. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición hormonal que incluye una GH, e.g., hGH, enlazada mediante una unión oxima a al menos un PEG, e.g., un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH, comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y en donde la GH, e.g., hGH contiene al menos un aminoácido codificado de manera no natural sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones correspondientes a: antes de la posición 1 (i.e., en la terminación N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (i.e., en la terminación carboxilo de la proteína) (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, la invención proporciona una composición hormonal que incluye una GH, e.g., una hGH enlazada mediante una unión oxima a al menos un PEG, e.g., un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y en donde la GH, e.g., hGH contiene al menos un aminoácido codificado de manera no natural sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones correspondientes a: 30, 35, 74, 92, 103, 143 y 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3). En algunas modalidades, la invención proporciona una composición hormonal que incluye una GH, e.g., una hGH enlazada mediante una unión oxima a al menos un PEG, e.g., un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y en donde la GH, e.g., hGH contiene al menos un aminoácido codificado de manera no natural sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones correspondientes a: 35, 92, 143 y 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, la invención proporciona una composición hormonal que incluye una GH, e.g., una hGH enlazada mediante una unión oxima a al menos un PEG, e.g., un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y en donde la GH, e.g., hGH contiene al menos un aminoácido codificado de manera no natural sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones correspondientes a: 35, 92, 131, 134, 143 y 145 o cualquier combinación de las mismas, de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición hormonal que incluye una GH, e.g., una hGH enlazada mediante una unión oxima a al menos un PEG, e.g., un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y en donde la GH, e.g., hGH contiene al menos un aminoácido codificado de manera no natural sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones correspondientes a: 30, 35, 74, 92, 103 y 145 o cualquier combinación de las mismas de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición hormonal que incluye una GH, e.g., una hGH enlazada mediante una unión oxima a al menos un PEG, e.g., un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y en donde la GH, e.g., hGH contiene al menos un aminoácido codificado de manera no natural sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones correspondientes a: 35, 92, 143 y 145 o cualquier combinación de las mismas de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición hormonal que incluye una GH, e.g., una hGH enlazada mediante una unión oxima a al menos un PEG, e.g., un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y en donde la GH, e.g., hGH contiene al menos un aminoácido codificado de manera no natural sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones correspondientes a la posición 35 de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. En modalidades en las cuales el PEG es un PEG lineal, el PEG puede tener un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o de aproximadamente 30 kDa. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición hormonal que incluye una GH, e.g., hGH, enlazada mediante una unión oxima a al menos un PEG, e.g., un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH, incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y en donde la GH, e.g., hGH contiene al menos un aminoácido codificado de manera no natural que es para-acetilfenilalanina sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones correspondientes a: antes de la posición 1 (i.e., en la terminación N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (i.e., en la terminación carboxilo de la proteína) (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3). En algunas modalidades, la invención proporciona una composición hormonal que incluye una GH, e.g., una hGH enlazada mediante una unión oxima a al menos un PEG, e.g., un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y en donde la GH, e.g., hGH contiene al menos un aminoácido codificado de manera no natural que es para-acetilfenilalanina sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones correspondientes a: 30, 35, 74, 92, 103, 143 y 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, la invención proporciona una composición hormonal que incluye una GH, e.g., una hGH enlazada mediante una unión oxima a al menos un PEG, e.g., un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y en donde la GH, e.g., hGH contiene al menos un aminoácido codificado de manera no natural que es para-acetilfenilalanina sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones correspondientes a: 35, 92, 143 y 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, la invención proporciona una composición hormonal que incluye una GH, e.g., una hGH enlazada mediante una unión oxima a al menos un PEG, e.g., un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia O de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y en donde la GH, e.g., hGH contiene al menos un aminoácido codificado de manera no natural que es para-acetilfenilalanina sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones correspondientes a: 35, 92, 131, 134, 143 y 145 o cualquier combinación de las mismas, de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición hormonal que incluye una GH, e.g., una hGH enlazada mediante una unión oxima a al menos un PEG, e.g., un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y en donde la GH, e.g., hGH contiene al menos un aminoácido codificado de manera no natural que es para-acetilfenilalanina sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones correspondientes a: 30, 35, 74, 92, 103 y 145 o cualquier combinación de las mismas de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición hormonal que incluye una GH, e.g., una hGH enlazada mediante una unión oxima a al menos un PEG, e.g., un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y en donde la GH, e.g., hGH contiene al menos un aminoácido codificado de manera no natural que es para-acetilfenilalanina sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones correspondientes a: 35, 92, 143 y 145 o cualquier combinación de las mismas de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición hormonal que incluye una GH, e.g., una hGH enlazada mediante una unión oxima a al menos un PEG, e.g., un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y en donde la GH, e.g., hGH contiene al menos un aminoácido codificado de manera no natural que es para-acetilfenilalanina sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones correspondientes a la posición 35 de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. En modalidades en las cuales el PEG es un PEG lineal, el PEG puede tener un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o de aproximadamente 30 kDa. En algunas modalidades, la invención proporciona una GH, e.g., hGH, en donde la GH, e.g., hGH contiene al menos un aminoácido codificado de manera no natural, en donde la GH se encuentra enlazada a una pluralidad de polímeros solubles en agua, e.g., una pluralidad de PEGs, mediante uniones covalentes, en donde una o más de las uniones covalentes es una unión oxima entre al menos uno de los aminoácidos codificado de manera no naturals y el polímero soluble en agua, e.g., PEG. La GH, e.g., hGH, puede enlazarse a aproximadamente 2-100 polímeros solubles en agua, e.g., PEGs, o aproximadamente 2-50 polímeros solubles en agua, e.g., PEGs, o aproximadamente 2-25 polímeros solubles en agua, e.g., PEGs, o aproximadamente 2-10 polímeros solubles en agua, e.g., PEGs, o aproximadamente 2-5 polímeros solubles en agua, o aproximadamente 5-100 polímeros solubles en agua, e.g., PEGs, o aproximadamente 5-50 polímeros solubles en agua, e.g., PEGs, o aproximadamente 5-25 polímeros solubles en agua, e.g., PEGs, o aproximadamente 5-10 polímeros solubles en agua, e.g., PEGs, o aproximadamente 10-100 polímeros solubles en agua, e.g., PEGs, o aproximadamente 10-50 polímeros solubles en agua, e.g., PEGs, o aproximadamente 10-20 polímeros solubles en agua, e.g., PEGs, o aproximadamente 20-100 polímeros solubles en agua, e.g., PEGs, o aproximadamente 20-50 polímeros solubles en agua, e.g., PEGs, o aproximadamente 5-100 polímeros solubles en agua, e.g., PEGs. Los uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals pueden incorporarse en la GH, e.g., hGH, en cualquiera de las posiciones descritas en la presente. En algunas modalidades, el al menos un aminoácido codificado de manera no natural se encuentra incorporado en la GH, e.g., hGH, en una posición correspondiente a la posición 35 de la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, los aminoácidos codificado de manera no naturals incluyen al menos un aminoácido codificado de manera no natural que es un aminoácido codificado de manera no natural que contiene carbonilo, e.g., un aminoácido codificado de manera no natural que contiene cetona tal como para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades, la GH, e.g., hGH, incluye una para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades, la para-acetilfenilalanina se encuentra incorporada en la GH, e.g., hGH en una posición correspondiente a la posición 35 de la SEQ ID NO: 2, en donde la para-acetilfenilalanina se encuentra enlazada a uno de los polímeros, e.g., uno de los PEGs, mediante un enlace oxima. En algunas modalidades, al menos uno de los polímeros solubles en agua, e.g., PEGs se encuentra enlazado a la GH, e.g., hGH, mediante una unión covalente a al menos uno de los aminoácidos codificado de manera no naturals. En algunas modalidades, la unión covalente es una unión oxima. En algunas modalidades, una pluralidad de los polímeros solubles en agua, e.g., PEGs, se encuentran enlazados a la GH, e.g., hGH mediante uniones covalentes a una pluralidad de los aminoácidos codificado de manera no naturals. En algunas modalidades, la al menos una unión covalente es una unión oxima; en algunas modalidades, sustancialmente todas las uniones son uniones oxima. La pluralidad de polímeros solubles en agua, e.g., PEG, pueden ser lineales, ramificados, o una combinación de los mismos. En modalidades que incorporan uno o más PEGs lineales, tienen un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o de aproximadamente 30 kDa. En modalidades que incorporan uno o más PEGs ramificados, los PEGs ramificados tienen un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o de aproximadamente 40 kDa. Se apreciará que las modalidades que emplean una pluralidad de polímeros solubles en agua, e.g., PEGs, en general, emplearán tales polímeros a un MW menor que las modalidades en las cuales se utiliza un solo PEG. Por consiguiente, en algunas modalidades, el MW total de la pluralidad de PEGs es de aproximadamente 0.1-500 kDa, o de aproximadamente 0.1-200 kDa, o de aproximadamente 0.1-100 kDa, o de aproximadamente 1-1000 kDa, o de aproximadamente 1-500 kDa, o de aproximadamente 1-200 kDa, o de aproximadamente 1-100 kDa, o de aproximadamente 10-1000 kDa, o de aproximadamente 10-500 kDa, o de aproximadamente 10-200 kDa, o de aproximadamente 10-100 kDa, o de aproximadamente 10-50 kDa, o de aproximadamente 20-1000 kDa, o de aproximadamente 20-500 kDa, o de aproximadamente 20-200 kDa, o de aproximadamente 20-100 kDa, o de aproximadamente 20-80 kDa, o de aproximadamente 20-60 kDa, o de aproximadamente 5-100 kDa, o de aproximadamente 5-50 kDa, o de aproximadamente 5-20 kDa. Los antagonistas de GH humana incluyen, pero no se limitan a, aquellos con sustituciones en: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123 y 127 o una adición en la posición 1 (i.e., en la terminación N) , o cualquier combinación de las mismas (SEQ ID NO: 2, o el aminoácido correspondiente en la SEQ ID NO: 1, 3 o cualquier otra secuencia de GH) . Una amplia variedad de aminoácidos codificado de manera no naturals pueden sustituirse por, o incorporarse en, una posición dada en una Polipéptido de GH, e.g., de hGH. En general, un aminoácido codificado de manera no natural particular se selecciona para la incorporación en base a un examen de la estructura cristalina tridimensional de una Polipéptido de GH, e.g., de hGH, con su receptor, prefiriendo las sustituciones conservadoras (i.e., en base a aminoácidos codificado de manera no naturals, tales como p-acetilfenilalanina o O-propargiltirosina sustituyendo por Phe, Tyr o Trp) , y la química de conjugación específica que se desea introducir en el polipéptido de GH, e.g., de hGH (e.g., la introducción de 4-azidafenilalanina si se desea efectuar una cicloadición Huisgen [3+2] con un polímero soluble en agua que contiene un residuo alquino o una formación de unión amida con un polímero soluble en agua que contiene un aril éster que, a su vez, incorpora un residuo fosfina) . En una modalidad, el método incluye además la incorporación en la proteína del aminoácido no natural, en donde el aminoácido no natural comprende un primer grupo reactivo; y poner en contacto la proteína con una molécula (incluyendo, pero sin limitarse a, una marca, un colorante, un polímero, un polímero soluble en agua, un derivado de polietilen glicol, un fotorreticulador, un radionúclido, un compuesto citotóxico, una droga, una marca de afinidad, una marca de fotoafinidad, un compuesto reactivo, una resina, una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un quelador de metal, un cofactor, un ácido graso, un carbohidrato, un polinucleótido, un ADN, un ARN, un polinucleótido de antisentido, un sacárido, dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un ácido ribonucleico inhibidor, un biomaterial, una nanopartícula, una marca giratoria, un fluoróforo, un residuo que contiene metal, un residuo radiactivo, un nuevo grupo funcional, un grupo que interactúa de manera covalente o no covalente con otras moléculas, un residuo fotoencerrado, un residuo excitable de radiación actínica, un residuo fotoisomerizable, biotina, un derivado de biotina, un análogo de biotina, un residuo que incorpora un átomo pesado, un grupo químicamente separable, un grupo foto separable, una cadena lateral alargada, un azúcar enlazado a carbono, un agente activo de reducción, un amino tioácido, un residuo tóxico, un residuo marcado de manera isotópica, una sonda biofísica, un grupo fosforescente, un grupo quimioluminiscente, un grupo denso de electrón, un grupo magnético, un grupo de intercalado, un cromóforo, un agente de transferencia de energía, un agente biológicamente activo, una marca detectable, una molécula pequeña, un punto cuántico, un nanotransmisor, un radionucleótido, un radiotransmisor, un agente de captura de neutrón, o cualquier combinación de los anteriores o cualquier otro compuesto o sustancia deseable) que comprende un segundo grupo reactivo. El primer grupo reactivo reacciona con el segundo grupo reactivo para unir la molécula al aminoácido no natural a través de cicloadición [3+2]. En una modalidad, el primer grupo reactivo es un residuo alquinilo o azida y el segundo grupo reactivo es un residuo azida o alquinilo. Por ejemplo, el primer grupo reactivo es el residuo alquinilo (incluyendo, pero sin limitarse a, en la p-propargiloxifenilalanina de aminoácido no natural, y el segundo grupo reactivo es un residuo azida. En otro ejemplo, el primer grupo reactivo es el residuo azida (incluyendo, pero sin limitarse a, en la p-azida-L-fenilalanina de aminoácido no natural) y el segundo grupo reactivo es el residuo alquinilo. En algunos casos, la(s) sustitución (es) de aminoácido codificado de manera no natural se combinará (n) con otras adiciones, sustituciones o supresiones dentro del polipéptido de GH, e.g., de hGH para afectar otras características biológicas del polipéptido de GH, e.g., de hGH. En algunos casos, las otras adiciones, sustituciones o supresiones pueden incrementar la estabilidad (incluyendo, pero sin limitarse a, la resistencia a la degradación proteolitica) del polipeptido de GH, e.g., de hGH o incrementar la afinidad del polipéptido de GH, e.g., de hGH para su receptor. En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., de hGH comprende una sustitución amino seleccionada del grupo que consiste de FlOA, F10H, F10I; M14W, M14Q, M14G; H18D; H21N; G120A; R167N; D171S; E174S; F176Y, I179T o cualquier combinación de las mismas en la SEQ ID NO: 2. En algunos casos, las otras adiciones, sustituciones o supresiones pueden incrementar la solubilidad (incluyendo, pero sin limitarse a, cuando se expresan en E. coli u otras células huésped) del polipéptido de GH, e.g., de hGH. En algunas modalidades, las adiciones, sustituciones o supresiones pueden incrementar la solubilidad del polipéptido después de la expresión en E. coli u otras células huésped recorabinantes . En algunas modalidades, los sitios se seleccionan para sustitución con un aminoácido naturalmente codificado o no natural en adición a otro sitio para la incorporación de un aminoácido no natural que da como resultado el incremento de la solubilidad del polipéptido después de la expresión en E. coli u otras células huésped recombmantes . En algunas modalidades, el polipéptido de GH, e.g., de hGH comprende otra adición, sustitución o supresión que modula la afinidad para la GH, e.g., el receptor del polipéptido de hGH, modula (incluyendo, pero sin limitarse a, aumenta o disminuye) la dimerización del receptor, estabiliza los dimeros del receptor, modula la vida media en circulación, modula la liberación o bio-disponibilidad, facilita la purificación o mejora o altera una vía de administración particular. Por ejemplo, además de introducir uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals como se describe en la presente, se introducen una o más de las siguientes sustituciones: FlOA, F10H, o F10I; M14W, M14Q, o M14G; H18D; H21N; G120A; R167N; D171S; E174S; F176Y, y I179T para aumentar la afinidad de la GH, e.g., variante de hGH para su receptor. De manera similar, el polipéptido de GH, e.g., de hGH, puede comprender secuencias de separación química, o enzimáticas, secuencias de separación de proteasa, grupos reactivos, dominios de unión de anticuerpo (incluyendo pero sin limitarse a, FLAG o poly-His) u otras secuencias en base a afinidad (incluyendo, pero sin limitarse a, FLAG, poly-His, GST, etc.), o moléculas enlazadas (incluyendo, pero sin limitarse a, biotma) que mejoran la detección (incluyendo, pero sin limitarse a, GFP), purificación, transporte a través de tejidos o membranas celulares, liberación o activación de prodroga, reducción del tamaño de la hGH, u otras características del polipéptido. En algunas modalidades la sustitución de un aminoácido codificado de manera no natural genera un antagonista de GH, e.g., hGH. Un subconjunto de los sitios ejemplares para la incorporación de uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals incluyen: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, . 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123 y 127 o una adición antes de la posición 1 (SEQ ID NO: 2, o el aminoácido correspondiente en la SEQ ID NO: 1, 3 o cualquier otra secuencia de GH) . En algunas modalidades, los antagonistas de GH, e.g., de hGH comprenden al menos una sustitución en las regiones 1-5 (terminación N) , 6-33 (hélice A), 34-74 (región entre la hélice A y la hélice B, el circuito A-B) , 75-96 (hélice B) , 97-105 (región entre la hélice B y la hélice C, el circuito B-C), 106-129 (hélice C) , 130-153 (región entre la hélice C y la hélice D, el circuito C-D), 154-183 (hélice D) , 184-191 (terminación C) que ocasionan que la GH actúe como un antagonista. En otras modalidades, los sitios de incorporación ejemplares de un aminoácido codificado de manera no natural incluyen residuos dentro de la región de terminación amino de la hélice A y una porción de la hélice C. En otra modalidad, la sustitución de G120 con un aminoácido codificado de manera no natural tal como p-azida-L-fenilalanina o O-propargil-L-tirosina . En otras modalidades, las sustituciones antes listadas se combinan con sustituciones adicionales que ocasionan que el polipéptido de GH, e.g., de hGH sea un antagonista de GH, e.g., de hGH. Por ejemplo, un aminoácido codificado de manera no natural se sustituye en una de las posiciones identificadas en la presente y se introduce una sustitución simultánea en G120 (e.g., G120R, G120K, G120W, G120Y, G120F o G120E). En algunas modalidades, el antagonista de GH, e.g., de hGH comprende un aminoácido codificado de manera no natural enlazado a un polímero soluble en agua que se encuentra presente en una región de unión del receptor de la molécula de GH, e.g., de hGH. En algunos casos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos se sustituyen con uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals. En algunos casos, el polipéptido de GH, e.g., de hGH, incluye además 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones de uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals. Por ejemplo, en algunas modalidades, uno o más residuos en las siguientes regiones de GH, e.g., de hGH se sustituyen con uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals: 1-5 (terminación N) , 32-46 (extremo de terminación N del circuito A-B); 97-105 (circuito B-C), y 132-149 (circuito C-D), y 184- 191 (terminación C) . en algunas modalidades, uno o más residuos en las siguientes regiones de GH, e.g., hGH, se sustituyen con uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals: 1-5 (terminación N) , 6-33 (hélice A), 34-74 (región entre la hélice A y la hélice B, el circuito A-B) , 75-96 (hélice B) , 97-105 (región entre la hélice B y la hélice C, el circuito B-C), 106-129 (hélice C) , 130-153 (región entre la hélice C y la hélice D, el circuito C-D) , 154-183 (hélice D) , 184-191 (terminación C) . en algunos casos, los uno o más residuos codificado de manera no naturals se encuentran enlazados a uno o más PEGs lineales o ramificados de más bajo peso molecular (aproximadamente - 5-20 kDa en masa o menos), mejorando así la afinidad de unión y la vida media en suero comparable relativa a las especies unidas a un solo PEG de mayor peso molecular. En algunas modalidades, hasta dos de los siguientes residuos de GH, e.g., de hGH, se sustituyen con uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals en la posición: 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186 y 187. En algunos casos, se efectúan cualquiera de los siguientes pares de sustituciones: K38X* y K140X*; K41X* y K145X*; Y35X* y E88X*; Y35X* y F92X*, Y35X* y Y143X*; F92X* y Y143X*, en donde X* representa un aminoácido codificado de manera no natural. Los sitios preferidos para la incorporación de dos o más aminoácidos codificado de manera no naturals incluyen combinaciones de los siguientes residuos: 29, 33, 35, 37, 39, 49, 57, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 186 y 187. Los sitios particularmente preferidos para la incorporación de dos o más aminoácidos codificado de manera no naturals incluyen combinaciones de los siguientes residuos: 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145 y 155. Los sitios preferidos para la incorporación en GH, e.g., hGH de dos o más aminoácidos codificado de manera no naturals incluyen combinaciones de los siguientes residuos: antes de la posición 1 (i.e., en la terminación N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (i.e., en la terminación carboxilo de la proteína) (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) .
VII. Expresión en no Eucariotos y Eucariotos Para obtener un alto nivel de expresión de un polinucleótido de GH, e.g., de hGH, típicamente se subclonan polinucleótidos que codifican para un polipéptido de GH, e.g., de hGH de la invención en un vector de expresión que contiene un fuerte promotor para dirigir la transcripción, un terminador de transcripción/translación, y si es para un ácido nucleico que codifica para una proteína, un sitio de unión de ribosoma para la iniciación translacional. Los promotores bacteriales adecuados son conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica y se describen e.g., en Sambrook et al., y Ausubel et al. Los sistemas bacteriales de expresión para expresar los polipéptidos de GH, e.g., de hGH de la invención, se encuentran disponibles, incluyendo pero sin limitarse a, en E. coli, Bacillus sp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, y Salmonella (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983)). Los equipos para tales sistemas de expresión se encuentran comercialmente disponibles. Los sistemas de expresión eucarióticos para células de mamífero, levadura, y células de insecto son conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica y también se encuentran comercialmente disponibles. En casos en los cuales se utilizan ARNts ortogonales y aminoacil ARNt sintetasas (antes descritos) para expresar los polipéptidos de GH, e.g., de hGH de la invención, las células huésped para la expresión se seleccionan en base a su capacidad para utilizar los componentes ortogonales. Las células huésped ejemplares incluyen bacterias Gram positivas (incluyendo, pero sin limitarse a, B. brevis, B. subtilis o Streptomyces) y bacterias Gram negativas (E. coli, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida), así como levadura y otras células eucarióticas. Las células que comprenden pares de O-ARNt/O-RS pueden utilizarse como se describe en la presente. Una célula huésped eucariótica o célula huésped no eucariótica de la presente invención, proporciona la capacidad de sintetizar proteínas que comprenden aminoácidos no naturales en grandes cantidades útiles. En un aspecto, la composición incluye opcionalmente, incluyendo, pero sin limitarse a, al menos 10 microgramos, al menos 50 microgramos, al menos 75 microgramos, al menos 100 microgramos, al menos 200 microgramos, al menos 250 microgramos, al menos 500 microgramos, al menos 1 miligramo, al menos 10 miligramos, al menos 100 miligramos, al menos un gramo o más de la proteína que comprende un aminoácido no natural, o una cantidad que puede lograrse con métodos de producción de proteínas in vivo (se proporcionan en la presente detalles acerca de la producción y purificación de proteína recombinante) . En otro aspecto, la proteína se encuentra presente opcionalmente en la composición a una concentración de, incluyendo, pero sin limitarse a, al menos 10 microgramos de proteína por litro, al menos 50 microgramos de proteína por litro, al menos 75 microgramos de proteína por litro, al menos 100 microgramos de proteína por litro, al menos 200 microgramos de proteína por litro, al menos 250 microgramos de proteína por litro, al menos 500 microgramos de proteína por litro, al menos 1 miligramo de proteína por litro, o al menos 10 miligramos de proteína por litro o más, incluyendo, pero sin limitarse a, en un lisado celular, un amortiguador, un amortiguador farmacéutico, u otra suspensión líquida (incluyendo, pero sin limitarse a, en un volumen de, incluyendo, pero sin limitarse a, cualquiera de aproximadamente 1 ni a aproximadamente 100 1) . La producción de grandes cantidades (incluyendo, pero sin limitarse a, mayores que aquella típicamente posible con otros métodos, incluyendo, pero sin limitarse a, translación in vivo) de una proteína en una célula eucariótica incluyendo al menos un aminoácido no natural es una característica de la invención. Una célula huésped eucariótica o célula huésped no eucariótica de la presente invención proporciona la capacidad de biosintetizar proteínas que comprenden aminoácidos no naturales en grandes cantidades útiles. Por ejemplo, las proteínas que comprenden un aminoácido no natural pueden producirse a una concentración de, incluyendo, pero sin limitarse a, al menos 10 µg/litro, al menos 50 µg/litro, al menos 75 µg/litro, al menos 100 µg/litro, al menos 200 µg/litro, al menos 250 µg/litro, o al menos 500 µg/litro, al menos 1 mg/litro, al menos 2 mg/litro, al menos 3 mg/litro, al menos 4 mg/litro, al menos 5 mg/litro, al menos 6 mg/litro, al menos 7 mg/litro, al menos 8 mg/litro, al menos 9 mg/litro, al menos 10 mg/litro, al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/litro, 1 g/litro, 5 g/litro, 10 g/litro o más de proteína en un extracto celular, lisado celular, medio de cultivo, un amortiguador y/o lo similar. I . Sistemas de Expresión, Cultivo y Aislamiento Los polipéptidos de GH, e.g., de hGH pueden expresarse en cualquier número de sistemas de expresión adecuados, incluyendo, por ejemplo, levadura, células de insecto, células de mamífero y bacterias. Se proporciona abajo una descripción de los sistemas de expresión ejemplares . Levadura Como se utiliza en la presente, el término "levadura incluye cualquiera de las varias levaduras capaz de expresar un gen que codifica un polipéptido de GH, e.g., de hGH. Tales levaduras incluyen, pero no se limitan a, levaduras ascosporógenas (Endomycetales) , levaduras basidiosporógenas y levaduras que pertenecen al grupo Fungi imperfecti (Blastomycetes). Las levaduras ascosporógenas se dividen en dos familias, Spermophthoraceae y Saccharomycetaceae . La última se comprende de cuatro subfamilias, Schizosaccharomycoideae (e.g., género Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoideae y Saccharomycoideae (e.g., género Pichia, Kluyveromyces y Saccharomyces). Las levaduras basidiosporógenas incluyen los géneros Leucosporidium, Phodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium y Filobasidiella . Las levaduras que pertenecen al grupo Fungi imperfecti (Blastomycetes) se dividen en dos familias, Sporobolomycetaceae (e.g., género Sporobolomyces y Bullera) y Cryptococcaceae (e.g., género Candida). De particular interés para su uso con la presente invención, son las especies dentro del género Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Torulopsis, y Candida, incluyendo, pero sin limitarse a, P. pastoris, P. guillerimondii, S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S. norbensis, S. oviformis, K. Lactis, K. Fragilis, C. albicans, C. maltosa y H. polimorpha. La selección de levadura adecuada para la expresión de polipéptidos de GH, e.g., de hGH se encuentra dentro del de experiencia ordinaria en la técnica. al seleccionar huéspedes de levadura para la expresión, los huéspedes adecuados pueden incluir aquellos que muestran tener, por ejemplo, buena capacidad de secreción, ba a actividad proteolítica, buena capacidad de secreción, buena producción de proteína soluble, y robustez general. Las levaduras se encuentran disponibles generalmente de una variedad de fuentes, incluyendo pero sin limitarse a Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of Caifornia (Berkeley, CA) y del American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA) . El termino "huésped de levadura" o "célula huésped de levadura" incluye levaduras que pueden ser o han sido utilizadas como recipiente para vectores recombmantes u otro ADN de transferencia. El término incluye la progenie de la célula huésped de levadura original que ha recibido los vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. Se entiende que la progenie de una sola célula de origen puede no necesariamente ser completamente idéntica en morfología o en complemento genómico o total de ADN a la de origen, debido a mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula de origen que es suficientemente similar a la original que va a caracterizarse por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de GH, e.g., de hGH, se incluye en la progenie pretendida para esta definición. Los vectores de expresión y transformación, incluyendo replicones extracromosomales o vectores de integración, se han desarrollado para la transformación en muchos huéspedes de levadura. Por ejemplo, los vectores de expresión se han desarrollado por S . cerevisiae (Sikorski et al., GENETICS (1989) 122:19; Ito et al., J. BACTERIOL. (1983) 153:163; Hinnen et al., PROC. NATL. ACAD. SCI USA (1978) 75:1929); C. albicans (Kurtz et al., MOL. CELL. BIOL. (1986) 6:142); C. mal tosa (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141); H. polyímorpha (Gleeson et al., J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132:3459; Roggenkamp et al., MOL. GENETICS AND GENOMICS (1986) 202:302); K. fragilis (Das et al., J. BACTERIOL. (1984) 158:1165); K lactis (De Louvencourt et al., J. BACTERIOL. (1983) 154:737; Van den Berg et al., BIOTECHNOLOGY (NY) (1990) 8:135); P. guillerimondii (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL (1985) 25:141); P. pastoris (U.S. Patent Nos. 5,324,639; 4,929,555; y 4,837,148; Cregg et al, MOL. CELL. BIOL. (1985) 5:3376); Schizosa ccharomyces pombe (Beach et al., NATURE (1982) 300:706); y Y. lipolytica ; A . nidulans (Ballance et al., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112:284-89; Tilburn et al., GENE (1983) 26:205-221; y Yelton et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81:1470-74); A . niger (Kelly y Hynes, EMBO J. (1985) 4:475-479); T. reesia (EP 0 244 234); y hongos filamentosos tal como, e.g., Neurospora , Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357), cada una incorporada en la presente mediante la referencia. Las secuencias de control para vectores de levadura son conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, pero sin limitarse a, regiones promotoras de genes tales como alcohol dehidrogenasa (ADH) (EP 0 284 044); enolasa; glucosinasa; glucosa-6-fosfato isomerasa; gliceraldehído-3-fosfato-dehidrogenasa (GAP o GAPDH) ; hexosinasa; fosfofructosinasa; 3-fosfoglicerato mutasa; y piruvato cinasa (PyK) (EP 0 329 203) . El gen PH05 de levadura, que codifica para ácido fosfatasa, también puede proporcionar secuencias promotoras útiles (Miyanohara et al., Proc. Nati. Acad. Sci., EUA (1983) 80:1). Otras secuencias promotoras adecuadas para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. (1980) 255:12073); y otras enzimas glicolíticas, tales como piruvato decarboxilasa, triosafosfato isomerasa, y fosfoglucosa isomerasa (Holland et al., Biochemistry (1978) 17:4900; Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., (1969) 7:149). Los promotores de levadura inductibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, pueden incluir las regiones promotoras para alcohol dehidrogenasa 2; isocitocromo C; ácido fosfatasa; metalotioneina; gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa; enzimas de degradación asociadas con el metabolismo del nitrógeno; y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión de levadura se describen además en la EP O 073 657. También pueden utilizarse mejoradores de levadura con los promotores de levadura. Adicionalmente, los promotores sintéticos también pueden funcionar como promotores de levadura. Por ejemplo, las secuencias de activación aguas arriba (UAS) de un promotor de levadura pueden unirse con la región de activación de transcripción de otro promotor de levadura, creando un promotor híbrido sintético. Ejemplos de tales promotores híbridos incluyen la secuencia reguladora de ADH enlazada a la región de activación de transcripción GAP. Ver, Patentes de E.U. Nos. 4,880,734 y 4,876,197, que se incorporan mediante la referencia en la presente. Otros ejemplos de promotores híbridos incluyen promotores que consisten de las secuencias reguladoras de los genes ADH2, GAL4, GALIO, o PH05, combinados con la región de activación transcripcional de un gen de enzima glicólico tal como GAP o PyK. Ver, EP 0 164 556. Además, un promotor de levadura puede incluir promotores de origen natural de origen no levadura que tienen la capacidad para unirse a ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción. Otros elementos de control que pueden comprender parte de los vectores de expresión de levadura incluyen terminadores, por ejemplo, de GAPDH o los genes enolasa (Holland el al., J. Biol. Chem., (1981) 256:1385).
Adicionalmente, el origen de replicación del origen del plásmido 2µ es adecuado para levaduras. Un gen de selección adecuado para su uso en levaduras es el gen trpl presente en el plásmido de levadura. Ver, Tschumper et al., Gene (1980) 10:157; Kingsman et al., Gene (1979) 7:141. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una especie mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptofán. De manera similar, las especies de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20,622 o 38,626) se complementan por plásmidos conocidos que contienen el gen Leu2. Los métodos para inducir el ADN exógeno en huéspedes de levadura son conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica, e incluyen típicamente, pero sin limitarse a, ya sea la transformación de esferoplastos o de células huésped de levadura intactas tratadas con cationes alcalinos. Por ejemplo, la transformación de levaduras puede llevarse a cabo de acuerdo con el método descrito en Hsiao et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1979) 76:3829 y Van Solingen et al., J. Bact. (1977) 130:946. Sin embargo, también pueden utilizarse otros métodos para la introducción de ADN en células tales como, mediante inyección nuclear, electroporación, o fusión de protoplasto, como se describe generalmente en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Lab. Manual (2001). Las células huésped de levadura pueden cultivarse entonces utilizando técnicas estándar conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica. Otros métodos para la expresión de proteínas heterólogas en células huésped de levadura son conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. Ver en general, Publicación de Patente de E.U. No. 2002 0055 169, Patentes de E.U. Nos. 6,361,969; 6,312,923; 6,183,985; 6,083,723; 6,017,731; 5, 674,706; 5,629,203; 5,602,034; y 5,089,398; Patentes de E.U. reexaminadas Nos. RE37,343 y RE35,749; Solicitudes de Patente PCT Publicadas WO 99/07862; WO 98/37208; y WO 98/26080; Solicitudes de Patente Europea EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480; WO 90/10277; EP 0 340 986; EP 0 329 203; EP 0 324 274; y EP 0 164 556. Ver también Gellissen et al., Antonie Van Leeuwenhoek (1992) 62(1-2) :79-93; Romanos et al., Yeast (1992) 8 ( 6) : 423-488 ; Goeddel, Methods in Enzymology (1990) 185:3-7, cada una incorporada por la referencia en la presente. Las especies huésped de levadura pueden cultivarse en fermentadores durante la etapa de amplificación utilizando métodos estándar de fermentación de alimentación por lotes conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica, los métodos de fermentación pueden adaptarse para contar con las diferencias en una trayectoria de utilización del carbono, o modo de control de expresión del huésped de levadura particular. Por ejemplo, la fermentación de un huésped de levadura Saccharomyces puede requerir una sola alimentación de glucosa, una fuente de nitrógeno complejo (e.g., hidrolisados de caseína), y suplemento de vitaminas múltiples. En contraste, la levadura meilotrópica P. pastoris puede requerir alimentaciones de glicerol, metanol y mineral de rastro, pero solo sales de amoníaco simple (nitrógeno) para el crecimiento y expresión óptimos. Ver, e.g., Patente de E.U. No. 5,324,639; Elliot et al., J. Protein Chem., (1990) 9:95; y Fieschko et al., Biotech. Bioeng., (1987) 29:1113, incorporadas por la referencia en la presente. Sin embargo, tales métodos de fermentación pueden tener ciertas características comunes independientes de la especie de huésped de levadura empleada. Por ejemplo, puede agregarse un nutriente que limita el crecimiento, típicamente carbono, al fermentador durante la fase de amplificación para permitir un crecimiento máximo. Además, los métodos de fermentación emplean generalmente un medio de fermentación diseñado para contener cantidades adecuadas de carbono, nitrógeno, sales básales, fósforo, y otros nutrientes menores (vitaminas, minerales y sales de rastro, etc.). Ejemplos de medios de fermentación adecuados para su uso con Pichia, se describen en las Patentes de E.U. Nos. 5,324,639 y 5,231,178, que se incorporan en la presente por la referencia. Células de Insecto Infectadas por Baculovirus El término "huésped de insecto" o "célula huésped de insecto" se refiere a un insecto que puede ser, o ha sido, utilizado como recipiente para vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. El término incluye la progenie de la célula huésped de insecto original que se ha transfectado. Se entiende que la progenie de una sola célula de origen puede no necesariamente ser completamente idéntica en morfología o en genómica o complemento de ADN total a la de origen, debido a mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula de origen que es suficientemente similar a la original que va a caracterizarse por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido GH, e.g., de hGH, se incluye en la progenie pretendida por esta definición. La selección de células de insecto adecuadas para la expresión del polipéptido de GH, e.g., de hGH, se conoce por los de experiencia ordinaria en la técnica. Varias especies de insecto se encuentran descritas en la técnica y se encuentran comercialmente disponibles incluyendo Aedes aegypti, Bombix mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni. Al seleccionar huéspedes de insecto para la expresión, los huéspedes adecuados pueden incluir aquellos que muestran tener, inter alia, una buena capacidad de secreción, baja actividad proteolítica y robustez general. Los insectos se encuentran disponibles generalmente de una variedad de fuentes, incluyendo, pero sin limitarse a, Insect Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, Universidad de California (Berkeley, CA) ; y el American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA) . Generalmente, los componentes de un sistema de expresión de insecto infectado con baculovirus incluyen un vector de transferencia, comúnmente un plásmido bacterial, que contiene tanto un fragmento del genoma baculovirus como un sitio de restricción conveniente para la inserción del gen heterólogo que va a expresarse; un baculovirus de tipo silvestre con secuencias homologas al fragmento específico del baculovirus en el vector de transferencia (esto permite la recombinación homologa del gen heterólogo en el genoma de baculovirus); y células huésped de insecto y medio de crecimiento apropiados. Los materiales, métodos y técnicas utilizados en la construcción de vectores, transfección de células, selección de placas, crecimiento de células en cultivo, y lo similar, se conocen el la técnica y se encuentran disponibles manuales que describen estas técnicas. Después de insertar el gen heterólogo en el vector de transferencia, el vector y el genoma viral de tipo silvestre se transfectan en una célula huésped de insecto en donde el vector y el genoma viral se recombinan. El virus recombinante empacado se expresa y se identifican y se purifican las placas recombinantes. Los materiales y métodos para sistemas de expresión celular de baculovirus/insecto se encuentran comercialmente disponibles en forma de equipos, de, por ejemplo, Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) . Estas técnicas son generalmente conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica y se describen totalmente en Summers & Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987), incorporada en la presente por la referencia. Ver también, Richardson, 39 Methods in Molecular Biology; Baculovirus Expression Protocols (1995); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology 16.9-16.11 (1994); King y Posser, The Baculovirus System: A Laboratory Guide (1992); y O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (1992) . En efecto, la producción de varias proteínas heterólogas utilizando sistemas de expresión de células de baculovirus/insecto se conoce por los de experiencia ordinaria en la técnica Ver, e.g., Patentes de E.U. Nos. 6,368,825; 6,342,216 6,338,846 6,261,805 6,245,528 6,225,060; 6, 183, 987 6, 168, 932 6,126,944 6,096,304 6,013,433; 5.965,393 5, 939,285 5, 891, 676 5, 871, 986 5,861,279; 5,858,368 5,843,733 5,762, 939 5,762, 939 5,753,220; 5, 605, 827 5,583, 023 5,571,709 5,516, 657 5,290,686; WO 02/06305; WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956; WO 00/55345; WO 00/20032; WO 99/51721; WO 99/45130; WO 99/31257; WO 99/10515; WO 99/09193; WO 97/26332; WO 96/29400; WO 96/25496; WO 96/06161; WO 95/20672; WO 93/03173; WO 92/16619; WO 92/02628; WO 92/01801; WO 90/14428; WO 90/10078; WO 90/02566; WO 90/02186; WO 90/01556; WO 89/01038; WO 89/01037; WO 88/07082, que se incorporan mediante la referencia en la presente. Los vectores útiles en sistemas de expresión de célula de baculovirus/insecto son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, expresión de insectos y vectores de transferencia derivados del virus nuclear de polihedrosis baculovirus Autographacalifornica (AcNPV) , que es un vector de expresión viral independiente de auxiliar. Los vectores de expresión viral derivados de este sistema utilizan comúnmente el fuerte promotor del gen viral de polihedrina para conducir la expresión de genes heterólogos. Ver en general, O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (1992). Previo a la inserción del gen externo en el genoma de baculovirus, los componentes antes descritos, que comprenden un promotor, líder (si se desea), secuencia de codificación de interés, y secuencia de terminación de transcripción, se ensamblan típicamente en una estructura de transcolocación de intermediario (vector de transferencia). Las estructuras de transcolocación de intermediario se mantienen frecuentemente en un replicón, tal como un elemento extra cromosomal (e.g., plásmido) capaz de mantenerse de manera estable en un huésped, tal como bacterias. El replicón tendrá un sistema de repetición, permitiendo así que se mantenga en un huésped adecuado para clonación y amplificación. Más específicamente, el plásmido puede contener la señal de poliadenilación de polihedrma (Miller, Ann. Rev. Microbiol., (1988) 42:177) y un gen procariótico de resistencia a ampicilma (amp) y el origen de repetición para selección y propagación en E. coli. Un vector de transferencia comúnmente utilizado para la introducción de genes externos en AcNPV es pAc373. Muchos otros vectores conocidos por los expertos en la técnica, se han diseñado también, incluyendo, por ejemplo, pVL985, que altera el codon de inicio polihedrina de ATG a ATT, y que introduce un sitio de clonación BamHl 32 a 32 pares base aguas debajo de ATT. Ver, Luckow y Summers, Virology 170:31 (1989). Otros vectores comercialmente disponibles incluyen, por ejemplo, pBlueBac4-5/V5-H?s; pBlueBacH?s2; pMelBac; pBlueBac4-5 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) . Después de la inserción del gen heterólogo, el vector de transferencia y el genoma baculoviral de tipo silvestre se co-transfectan en un huésped de célula de insecto. Los métodos para introducir ADN heterólogo en el sitio deseado en el virus baculovirus se conocen en la técnica. Ver, Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987), Smith et al., Mol. Cell. Biol., (1983) 3:2156; Luckow y Summers, Virology (1989) 170:31. Por ejemplo, la inserción puede ser en un gen tal como el gen de polihedrina, mediante recombinación homologa de cruzamiento doble; la inserción también puede ser en un sitio de restricción de enzimas fabricado en el gen de baculovirus deseado. Ver, Miller et al., Bioessays (1989) 11(4) :91. La transfección puede completarse mediante electroporación. Ver, Trotter y Wood, 39 Methods in Molecular Biology; Mann y King, J. Gen. Virol., (1989) 70:3501. Alternativamente, pueden utilizarse liposomas para transfectar las células de insecto con el vector de expresión recombinante y el baculovirus. Ver, e.g., Liebman et al., Biotechniques (1999) 26(1) :36; Graves et al., Biochemistry (1998) 37:6050; Nomura et al., J. Biol. Chem. (1998) 273 (22) : 13570; Schmidt et al., Protein Expression and Purification (1998) 12:323; Siffert et al., Nature Genetics (1998) 18-45; Tilkins et al., Cell Biology: A Laboratory Handbook 145-154 (1998); Caí et al., Protein Expression and Purification (1997) 10:263; Dolphin et al., Nature Genetics (1997) 17:491; Kost et al., Gene (1997) 190:139; Jakobson et al., J. Biol. Chem., (1996) 271:22203; Rowles et al, J. Biol. Chem. (1996) 271 (37 ): 22376; Revery et al., J. Biol. Chem. (1996) 271 (39) :23607-10; Stanley et al., J. Biol. Chem., (1995) 270:4121; Sisk et al., J. Virol. (1994) 68(2) :766; y Peng et al., Biotechniques (1993) 14(2) :274. Los liposomas comercialmente disponibles incluyen, por ejemplo, Cellfectin® y Lipofectin® (Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA) . Adicionalmente, puede utilizarse transfección de fosfato de calcio. Ver Trotter y Wood, 39 Methods in Molecular Biology (1995); Kitts, NAR (1990) 18(19) :5667; y Mann y King, J. Gen. Virol., (1989) 70:3501. Los vectores de expresión de baculovirus contienen comúnmente un promotor de baculovirus. Un promotor de baculovirus es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a una ARN polimerasa de baculovirus e iniciar la transcripción aguas abajo (3') de una secuencia de codificación (e.g., gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de iniciación de transcripción que comúnmente se ubica próxima al extremo 5' de la secuencia de codificación. Esta región de iniciación de transcripción incluye típicamente un sitio de unión de ARN polimerasa y un sitio de iniciación de transcripción. Un promotor de baculovirus también puede tener un segundo dominio llamado un mejorador, que, si se encuentra presente, se encuentra comúnmente distante al gen estructural. Además, la expresión puede ser ya sea regulada o constitutiva. Los genes estructurales, abundantemente transcritos en momentos finales en el ciclo de infección, proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias derivadas del gen que codifica la proteína polihédrica viral (Friesen et al., The Regulation of Baculovirus Gene Expression en The Molecular Biology of Baculovirus (1986); EP 0 127 839 y 0 155 476) y el gen que codifica para la proteína plO (Vlak et al., J. Gen. Virol., (1988) 69:765) . El vector de expresión de baculovirus recién formado se empaca en un baculovirus recombinante infeccioso y subsecuentemente las placas cultivadas pueden purificarse mediante técnicas conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica. Ver Miller et al., Bioessays (1989) 11(4) :91; Summers & Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) . Se han desarrollado vectores de expresión de baculovirus recombinantes para infección en varias células de insecto. Por ejemplo, se han desarrollado baculovirus recombinantes para, inter alia, Aedes aegypti (ATCC No. CCL-125), Bombix mori (ATCC No. CRL-8910), Drosophila melanogas ter (ATCC No. 1963), Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni . Ver, Wright, Nature (1986) 321:718; Carbonell et al., J. Virol. (1985) 56:153; Smith et al., Mol. Cell. Biol., (1983) 3:2156. Ver en general, Fraser et al., In vitro cell. Dev. Biol., (1989) 25:225. Más específicamente, las líneas celulares utilizadas para sistemas de vector de expresión de baculovirus incluyen comúnmente, pero sin limitarse a, Sf9 (Spodoptera frugiperda) (ATCC No. CRL-1711), Sf21 ( Spodoptera frugiperda ) (Invitrogen Corp., Cat. No. 11497-013 (Carlsbad, CA) ) , Tri-368 (Trichoplusia ni) y High-Five™ BTI-TN-5B1-4 ( Trichopl usia n i ) . Las células y medios de cultivo se encuentran comercialmente disponibles para la expresión tanto directa como de fusión de polipéptidos heterólogos en una baculovirus/expresión, y la tecnología del cultivo celular se conoce generalmente por los de experiencia ordinaria en la técnica . E. coli, especies Pseudomonas y otras Procariotas Las técnicas de expresión bacterial son conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica. Se encuentran disponibles una amplia variedad de vectores para uso en huéspedes bacteriales. Los vectores pueden ser vectores de copia simple o de bajas o altas multicopias. Los vectores pueden servir para la clonación y/o expresión. En vista de la amplia literatura referente a vectores, se requiere tratar en la presente de manera no extensa la disponibilidad comercial de muchos vectores, e incluso de manuales que describen vectores y sus mapas de restricción y características. Como es bien conocido, los vectores implican normalmente marcadores que permiten la selección, marcadores que pueden proporcionar resistencia al agente citotóxico, prototropía o inmunidad. Frecuentemente, se encuentran presentes una pluralidad de marcadores, que proporcionan diferentes características. Un promotor bacterial es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a ARN polimerasa bacterial e iniciar la transcripción aguas abajo (3') de una secuencia de codificación (e.g., gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de iniciación de transcripción que comúnmente se ubica próxima al extremo 5' de la secuencia de codificación. Esta región de iniciación de transcripción incluye típicamente un sitio de unión de ARN polimerasa y un sitio de iniciación de transcripción. Un promotor bacterial también puede tener un segundo dominio llamado un operador, que puede sobreponerse en un sitio de unión adyacente de ARN polimerasa en el cual se inicia la síntesis de ARN. El operador permite la transcripción negativa regulada (inducible), dado que una proteína represora del gen puede unirse al operador e inhibir así la transcripción de un gen específico. La expresión constitutiva puede presentarse en ausencia de elementos reguladores negativos, tales como un operador. Además, la regulación positiva puede lograrse mediante una secuencia de unión de proteína activadora del gen, que, si se encuentra presente, se encuentra comúnmente próxima (5') a la secuencia de unión de ARN polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora de gen es la proteína activadora de catabolitos (CAP) , que ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al., Annu. Rev. Genet., (1984) 18:173]. En consecuencia, la expresión regulada puede ser ya sea positiva o negativa con lo cual ya sea mejora o reduce la transcripción . Las secuencias que codifican para enzimas de trayectoria metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas que metabolizan azúcares, tales como galactosa, lactosa (lac) [Chang et al., Nature (1977) 198:1056], y maltosa. Ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptofán (trp) [Goeddel el al., Nuc. Acids Res., (1980) 8:4057; Yelverton et al., Nucí. Acids Res., (1981) 9:731; Pat de E.U. No. 4,738,921; EP Pub. Nos. 036 776 y 121 775, que se incorporan mediante la referencia en la presente]. El sistema promotor de b-galactosidasa (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes". En Interferon 3 (Ed. I. Gresser)], los sistemas promotores de bacteriófago lambda PL [Shimatake et al., Nature (1981) 292:128] y T5 [Pat. de E.U. No. 4,689,406, que se incorporan mediante la referencia en la presente] proporcionan también secuencias promotoras útiles. Los métodos preferidos de la presente invención utilizan fuertes promotores, tales como el promotor T7 para inducir polipéptidos de GH, e.g., de hGH a altos niveles. Ejemplos de tales vectores son conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica e incluyen la serie pET29 de Novagen, y los vectores pPOP descritos en la WO 99/05297, que se incorpora por la referencia en la presente. Tales sistemas de expresión producen altos niveles de polipéptidos de GH, e.g., de hGH en el huésped sin comprometer la viabilidad o los parámetros de crecimiento de la célula huésped. pET19 (Novagen) es otro vector conocido en la técnica. Adicionalmente, los promotores sintéticos que no se presentan en la naturaleza funcionan también como promotores bacteriales. Por ejemplo, las secuencias de activación de transcripción de un promotor bacterial o bacteriófago, pueden unirse con las secuencias operón de otro promotor bacterial o bacteriófago creando un promotor híbrido sintético [Pat. de E.U. No. 4,551,433, que se incorpora por la referencia en la presente] . Por ejemplo, el promotor tac es un promotor trp-lac híbrido comprendido de las secuencias tanto de promotor trp como de operón lac que se regula por el represor lac [Amann et al., Gene (1983) 25:167; de Boer et al., Proc. Nati. Acad. Sci., (1983) 80:21]. Además, un promotor bacterial puede incluir promotores de origen natural de origen no bacterial que tienen la capacidad para unirse a ARN polimerasa bacterial e iniciar la transcripción. Un promotor de origen natural de origen no bacterial también puede acoplarse con una ARN polimerasa compatible para producir altos niveles de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema bacteriófago T7 de ARN polimerasa/promotor es un ejemplo de un sistema promotor acoplado [Studier et al, J. Mol. Biol. (1986) 189:113; Tabor et al., Proc. Nati. Acad. Sci., (1985) 82:1074]. Además, un promotor híbrido también puede comprenderse de un promotor bacteriófago y una región operadora de E. coli (EP Pub. No. 267 851) . Además de una secuencia promotora de función, también es útil un sitio de unión de ribosoma eficiente para la expresión de genes externos en procariotas. En E. coli, el sitio de unión de ribosoma se denomina secuencia Shine-Dalgrano (SD) e incluye un codón de iniciación (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud ubicada a 3-11 nucleótidos aguas arriba del codón de iniciación [Shine et al., Nature (1975) 254:34]. Se piensa que la secuencia SD promueve la unión del ARNm a la ribosoma mediante el emparejamiento de bases entre la secuencia SD y el 3' de E. coli 16S ARNr [Steitz et al., "Genetic signáis and nucleotide sequences in messenger RNA", en Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger 1979)], para expresar genes eucarióticos y genes procarióticos con débil sitio de unión de ribosoma [Sambrook et al., "Expression of clones genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989]. El término "huésped bacterial" o "célula huésped bacterial" se refiere a un bacterial que puede ser o ha sido utilizado como recipiente para vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. El término incluye la progenie de la célula huésped bacterial original que se ha transfectado. Se entiende que la progenie de una sola célula de origen puede no necesariamente ser completamente idéntica en morfología o en complemento genómico o total de ADN a la de origen, debido a mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula de origen que es suficientemente similar a la original que va a caracterizarse por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de GH, e.g., de hGH, se incluye en la progenie pretendida para esta definición. La selección de bacterias huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos de GH, e.g., de hGH es conocida por los de experiencia ordinaria en la técnica. Al seleccionar huéspedes bacteriales para expresión, los huéspedes adecuados pueden incluir aquellos que muestran tener, inter alia, buena capacidad de formación de cuerpo de inclusión, baja actividad proteolítica y robustez general. Los huéspedes bacteriales se encuentran generalmente disponibles de una variedad de fuentes incluyendo, pero sin limitarse a, Bacterial Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, Universidad de California (Berkeley, CA) ; y el American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA) . La fermentación industrial/farmacéutica generalmente utiliza bacteriales derivados de especies K (e.g., W3110) o de bacterias derivadas de especies B (e.g., BL21) . Estas especies son particularmente útiles debido a que sus parámetros de crecimiento son extremadamente bien conocidos y robustos . Adicionalmente, estas especies son no patogénicas, lo cual es comercialmente importante por razones de seguridad y ambientales. Otros ejemplos de huéspedes de E. coli adecuados incluyen, pero no se limitan a, especies BL21, DHlOB o sus derivados. En otra modalidad de los métodos de la presente invención, el huésped de E. coli es una especie menor de proteasa incluyendo, pero sin limitarse a OMP- y LON- . La especie de célula huésped puede ser una especie de Pseudomonas, incluyendo pero sin limitarse a, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, y Pseudomonas putida. Se sabe que la Pseudomonas fluorescens biovar 1, designada especie MB101, es útil para la producción recombinante y se encuentra disponible para procesos terapéuticos de producción de proteínas. Ejemplos de un sistema de expresión de Pseudomonas incluyen el sistema disponible de The Dow Chemical Company como una especie huésped (Midland, MI, disponible en la World Wide Web en dow.com). Las Patentes de E.U. Nos. 4,755,465 y 4,859,600 que se incorporan mediante la referencia en la presente, describen el uso de especies Pseudomonas como una célula huésped para la producción de GH, e.g., hGH. Una vez establecida una especie de célula huésped recombinante (i.e., la estructura de expresión se ha introducido en la célula huésped y se han aislado células huésped con la apropiada estructura de expresión) , la especie de célula huésped recombinante se cultiva bajo condiciones apropiadas para la producción de polipéptidos de GH, e.g., de hGH. Como será aparente para el experto en la técnica, el método de cultivo de la especie de célula huésped recombinante dependerá de la naturaleza de la estructura de expresión y de la identidad de la célula huésped. las especies huésped recombinantes se cultivan normalmente utilizando métodos conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. Las células huésped recombinantes se cultivan típicamente en medio líquido conteniendo fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y sales inorgánicas y, opcionalmente, conteniendo vitaminas, aminoácidos, factores de crecimiento y otros suplementos de cultivo proteináceo conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. El medio líquido para el cultivo de células huésped puede contener opcionalmente antibióticos o anti hongos para evitar el crecimiento de microorganismos y/o compuestos indeseables incluyendo, pero sin limitarse a, antibióticos para seleccionar células huésped conteniendo el vector de expresión. Las células huésped recombinantes pueden cultivarse en formatos por lotes o continuos, ya sea con cosecha celular (en el caso en donde el polipéptido de GH, e.g., de hGH se acumula intracelularmente) o cosechando el sobrenadante del cultivo en formatos ya sea por lotes o continuos. Para la producción en células huésped procarióticas, se prefiere el cultivo por lotes y la cosecha celular. Los polipéptidos de GH, e.g., de hGH de la presente invención, se purifican normalmente después de la expresión en sistemas recombinantes. El polipéptido de GH, e.g., de hGH puede purificarse de células huésped o medio de cultivo por medio de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Los polipéptidos de GH, e.g., de hGH producidos en células huésped bacteriales pueden ser escasamente solubles o insolubles (en forma de cuerpos de inclusión) . En una modalidad de la presente invención, pueden efectuarse fácilmente sustituciones de aminoácido en el polipéptido de GH, e.g., de hGH seleccionados con el propósito de incrementar la solubilidad de la proteína producida de manera recombinante utilizando los métodos descritos en la presente así como aquellos conocidos en la técnica. En el caso de proteína insoluble, la proteína puede colectarse de lisados de célula huésped mediante centrifugación y además puede seguirse por la homogeneización de las células. En el caso de proteína escasamente soluble, los compuestos que incluyen, pero no se limitan s polietileno ímina (PEÍ), pueden agregarse para inducir la precipitación de proteínas parcialmente solubles. La proteína precipitada puede entonces colectarse convenientemente mediante centrifugación. Las células huésped recombmantes pueden fracturarse u homogeneizarse para liberar los cuerpos de inclusión de dentro de las células utilizando una variedad de métodos conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. la fractura u homogeneizacion de la célula huésped puede efectuarse utilizando técnicas conocidas incluyendo, pero sin limitarse a, fractura celular enzimática, sonicación, homogeneización dounce, o fractura de liberación a alta presión. En una modalidad del método de la presente invención, la técnica de liberación a alta presión se utiliza para fracturar las células huésped de E. coll para liberar los cuerpos de inclusión de los polipéptidos de GH, e.g., hGH. Al manipular los cuerpos de inclusión del polipeptido de GH, e.g., de hGH, puede ser ventajoso minimizar el tiempo de homogeneización en repeticiones a fin de maximizar el rendimiento de los cuerpos de inclusión sin pérdida debido a factores tales como solubilización, corte mecánico o proteolisis . El polipéptido de GH, e.g., de hGH insoluole o precipitado puede solubilizarse entonces utilizando cualquier número de agentes de solubilización aceptables conocidos en la técnica. El polipéptido de GH, e.g., de hGH puede solubilizarse con urea o hidrocloruro de guanidina. El volumen del polipéptido de GH, e.g., de hGH solubilizado debe minimizarse a fin de poder producir grandes lotes utilizando tamaños de lote convenientemente manejables. Este factor puede ser significativo en el proceso comercial a gran escala en donde el huésped recombinante puede cultivarse en lotes que son de miles de litros en volumen. Además, al manufacturar el polipéptido de GH, e.g., de hGH en proceso comercial a gran escala, en particular para usos farmacéuticos humanos, deben evitarse, si es posible, los químicos peligrosos que pueden dañar la maquinaria y el depósito, o el producto de proteína en sí. Se ha mostrado en el método de la presente invención, que puede utilizarse el agente de desnaturalización más suave de urea para solubilizar los cuerpos de inclusión del polipéptido de GH, e.g., de hGH en lugar del agente de desnaturalización más peligroso hidrocloruro de guanidina. El uso de urea reduce significativamente el riesgo de daño al equipo de acero inoxidable utilizado en el proceso de fabricación y purificación del polipéptido de GH, e.g., de hGH mientras que se solubilizan eficientemente los cuerpos de inclusión del polipéptido de GH, e.g., de hGH.
En el caso de proteína de hGH soluble, la hGH puede secretarse en el espacio periplásmico o en el medio de cultivo. Además, la hGH soluble puede encontrarse presente en el citoplasma de las células huésped. Puede ser deseable concentrar la hGH soluble previo a llevar a cabo las etapas de purificación. Las técnicas estándar conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica pueden utilizarse para concentrar la hGH soluble de, por ejemplo, lisados celulares o medio de cultivo. Además, pueden utilizarse técnicas estándar conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica para fracturar células huésped y liberar hGH soluble del citoplasma o espacio periplásmico de las células huésped. Cuando el polipéptido de GH, e.g., de hGH se produce como una proteína de fusión, la secuencia de fusión puede retirarse. El retiro de una secuencia de fusión puede lograrse mediante separación enzimática o química. El retiro enzimático de las secuencias de fusión puede lograrse utilizando métodos conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. La selección de enzimas para el retiro de la secuencia de fusión se determinará por la identidad de la fusión, y las condiciones de reacción se especificarán por la selección de enzimas como será aparente para los de experiencia ordinaria en la técnica. La separación química puede lograrse utilizando reactivos conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, bromuro cianógeno, TEV proteasa, y otros reactivos. El polipéptido de GH, e.g., de hGH separado puede purificarse de la secuencia de fusión separada mediante métodos conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. Tales métodos se determinarán por la identidad y propiedades de la secuencia de fusión y del polipéptido de GH, e.g., de hGH, como será aparente para el de experiencia ordinaria en la técnica. Los métodos de purificación pueden incluir, pero sin limitarse a, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de intercambio de ion, o diálisis o cualquier combinación de las mismas. El polipéptido de GH, e.g., de hGH también puede purificarse para retirar el ADN de la solución de proteína. El ADN puede retirarse mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como precipitación o cromatografía de intercambio de ion, pero puede retirarse mediante precipitación con un agente de precipitación de ácido nucleico, tal como, pero sin limitarse a, sulfato de protamina. El polipéptido de GH, e.g., de hGH puede separarse del ADN precipitado utilizando métodos estándar muy conocidos incluyendo, pero sin limitarse a, centrifugación o filtración. El retiro de moléculas de ácido nucleico huésped es un factor importante en un procedimiento en donde va a utilizarse el polipéptido de GH, e.g., de hGH para tratar humanos y los métodos de la presente invención reducen el ADN de célula huésped a niveles farmacéuticamente aceptables. También pueden utilizarse métodos para fermentación a pequeña escala o a gran escala en la expresión de proteínas, incluyendo, pero sin limitarse a, fermentadores, matraces de agitación, biorreactores de lecho fluidizado, biorreactores de fibra hueca, sistemas de cultivo de botella rodante, y sistemas de biorreactor de tanque de agitación. Cada uno de estos métodos puede llevarse a cabo en un proceso en modo por lotes, por lotes de alimentación o continuo. Los polipéptidos de GH humana de la invención pueden recuperarse generalmente utilizando métodos estándar en la técnica. Por ejemplo, el medio de cultivo o lisado celular puede centrifugarse o filtrarse para retirar polvo celular. El sobrenadante puede concentrarse o diluirse a un volumen deseado o diafiltrarse en un amortiguador adecuado para acondicionar la preparación para purificación posterior. Además, la purificación del polipéptido de GH, e.g., de hGH de la presente invención incluye la separación de formas deamidadas y sujetadas de la variante del polipéptido de GH, e.g., de hGH a partir de la forma intacta. Cualquiera de los siguientes procedimientos ejemplares puede emplearse para la purificación de los polipéptido de GH, e.g., de hGH de la invención: cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio amónico o catión, (utilizando, incluyendo, pero sin limitarse a, DEAE SEPHAROSE) ; cromatografía en sílice; HPLC de fase inversa; filtración de gel (utilizando, incluyendo, pero sin limitarse a, SEPHADEX G-75); cromatografía de interacción hidrófoba; cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de metal-quelado; ultrafíltración/diafíltración; precipitación de etanol; precipitación de sulfato de amonio; cromatoenfoque; cromatografía de desplazamiento; procedimientos electroforeticos (incluyendo pero sin limitarse a enfoque isoeléctrico de preparación) , solubilidad diferencial (incluyendo, pero sin limitarse a, precipitación de sulfato de amonio), SDS-PAGE, o extracción. Las proteínas de la presente invención, incluyendo, pero sin limitarse a, proteínas que comprenden aminoácidos no naturales, los péptidos que comprenden aminoácidos no naturales, anticuerpos para proteínas que comprenden aminoácidos no naturales, socios de unión para proteínas que comprenden aminoácidos no naturales etc., pueden purificarse ya sea parcial o sustancialmente a homogeneidad, de acuerdo con procedimientos estándar conocidos y utilizados por los expertos en la técnica. En consecuencia, los polipéptidos de la invención pueden recuperarse y purificarse mediante cualquiera de un número de métodos conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción de ácido o base, cromatografía de columna, cromatografía de columna de afinidad, cromatografía de intercambio aniónico o catión, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de lectina, electroforesis de gel y lo similar. Pueden utilizarse etapas de redoblamiento de proteína, según se desee, para elaborar proteínas dobladas correctamente. La cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) , cromatografía de afinidad u otros métodos adecuados, pueden emplearse en etapas finales de purificación en donde se desea alta pureza. En una modalidad, los anticuerpos elaborados contra aminoácidos no naturales (o proteínas o péptidos que comprenden aminoácidos no naturales) se utilizan como reactivos de purificación, incluyendo, pero sin limitarse a, para la purificación en base a afinidad de proteínas o péptidos que comprenden uno o más aminoácidos no naturales. Una vez purificados, parcialmente o hasta homogeneidad, según se desee, los polipéptidos se utilizan opcionalmente para una amplia variedad de utilidades, incluyendo, pero sin limitarse a, como componentes de análisis, terapéuticos, profilácticos, diagnósticos, reactivos de investigación, y/o como inmunógenos para la producción de anticuerpos. Además de otras referencias anotadas en la presente, se conoce una variedad de métodos de purificación/doblamiento de proteína por los de experiencia ordinaria en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, aquellos descritos en R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y. (1990); Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press Inc.; Bollag et al., (1996) Protein Methods, 2a edición Wiley-Liss NY; Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook, Humana Press, NJ, Harris y Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach, IRL Press en Oxford, Oxford, Inglaterra; Harris y Angal, Protein Purification Applications: A Practical Approach, IRL Press en Oxford, Oxford, Inglaterra; Scopes (1993) Protein Purification: Principies and Practice 3a edición, Springer Verlag, NY; Janson y Ryden, (1998) Protein Purification: Principies, High Resolution Methods and Applications, Segunda Edición, Wiley-VCH, NY; y Walker (1998), Protein Protocols on CD-ROM, Humana Press, NJ; y las referencias citadas en las mismas. Una ventaja de la producción de una proteína o polipéptido de interés con un aminoácido no natural en una célula huésped eucariótica o célula huésped no eucariótica, es que típicamente las proteínas o polipéptidos se encontrarán doblados en sus conformaciones naturales. Sin embargo, en ciertas modalidades de la invención, los expertos en la técnica reconocerán que, después de la síntesis, expresión y/o purificación, las proteínas o péptidos pueden poseer una conformación diferente a las conformaciones deseadas de los polipéptidos relevantes. En un aspecto de la invención, la proteína expresada opcionalmente se desnaturaliza y después se re-naturaliza. Esto se logra utilizando métodos conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, agregando una chaperonina a la proteína o polipéptido de interés, solubilizando las proteínas en un agente caotrópico tal como guanidina HCl, utilizando proteína disulfuro isomerasa, etc. En general, ocasionalmente es deseable desnaturalizar y reducir los polipéptidos expresados y después ocasionar que los polipéptidos se redoblen en la conformación preferida. Por ejemplo, puede agregarse guanidina, urea, DTT, DTE y/o una chaperonina a un producto de translación de interés. Los métodos para reducir, desnaturalizar y re-naturalizar proteínas son conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica (ver, la referencia anterior, y Debinski et al., (1993), J. Biol. Chem., 268:14065-14070; Kreitman y Pastan (1993) Bioconj. Chem., 4:581-585; y Buckner et al., (1992) Anal. Biochem., 205:263-270). Debinski et al., por ejemplo, describen la desnaturalización y reducción de proteínas de cuerpo de inclusión en guanidina-DTE . Las proteínas pueden redoblarse en un amortiguador de reducción conteniendo, incluyendo, pero sin limitarse a, glutationa oxidada y L-arginina. Los agentes de redoblamiento pueden fluir o de otra manera moverse en contacto con el uno o más polipéptidos u otro producto de expresión, o viceversa. En el caso de la producción procariótica de polipéptido de GH, e.g., de hGH, el polipéptido de GH, e.g., de hGH así producido puede desdoblarse y por tanto carece de actividad biológica o la tiene reducida. La bioactividad de la proteína puede restaurarse mediante "redoblamiento". En general, el polipéptido de GH, e.g., de hGH no doblado se redobla solubilizando (cuando el polipéptido de GH, e.g., de hGH es también insoluble) , desdoblando y reduciendo la cadena de polipéptido utilizando, por ejemplo, uno o más agentes caotrópicos (e.g., urea y/o guanidina) y un agente de reducción capaz de reducir uniones disulfuro (e.g., ditiotreitol, DTT o 2-mercaptoetanol, 2-ME) . A una concentración de caotropo moderada, se agrega entonces un agente oxidante (e.g., cistina o cistamina), que permite la reformación de uniones disulfuro. El polipéptido de GH, e.g., de hGH puede redoblarse utilizando métodos estándar conocidos en la técnica, tales como los descritos en las Patentes de E.U. Nos. 4,511,502, 4,511,503 y 4,512,922, que se incorporan mediante la referencia en la presente. El polipéptido de GH, e.g., de hGH también puede co-doblarse con otras proteínas para formar heterodímeros o heteromultímeros. Después de co-doblarse, el polipéptido de GH, e.g., de hGH puede purificarse adicionalmente. la purificación de GH, e.g., hGH puede lograrse utilizando una variedad de técnicas conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica, incluyendo cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio de ion, cromatografía líquida de alto desempeño en fase inversa, cromatografía de afinidad, y lo similar o cualquier combinación de las mismas. La purificación adicional puede incluir también una etapa de secado o precipitación de la proteína purificada. Después de la purificación, la GH, e.g., hGH puede intercambiarse en amortiguadores diferentes y/o concentrarse mediante cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, diafiltración y diálisis. La GH, e.g., hGH que se proporciona como una sola proteína purificada puede someterse a agregación y precipitación. La GH, e.g., hGH purificada puede ser al menos 90% pura (calculado mediante cromatografía líquida de alto desempeño en fase inversa, RP-HPLC, o electroforesis de gel de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida, SDS-PAGE) o al menos 95% pura, o al menos 98% pura o al menos 99% pura o más. No obstante el valor numérico exacto de la pureza de la GH, e.g., hGH, la GH, e.g., hGH puede ser suficientemente pura para su uso como un producto farmacéutico o para procesamiento adicional, tal como conjugación con un polímero soluble en agua tal como PEG. Ciertas moléculas de GH, e.g., de hGH pueden utilizarse como agentes terapéuticos en ausencia de otros ingredientes activos o proteínas (diferentes a excipientes, vehículos y estabilizadores, albúmina de suero y lo similar) , o pueden complejarse con otra proteína o un polímero. Métodos Generales de Purificación Cualquiera de una variedad de etapas de aislamiento puede llevarse a cabo en el lisado celular, extracto, medio de cultivo, cuerpos de inclusión, espacio periplásmico de las células huésped, citoplasma de las células huésped, u otro material que comprende el polipéptido de GH, e.g., de hGH o en cualquier mezcla de polipéptido de GH, e.g., de hGH resultante de cualquier etapa de aislamiento incluyendo, pero sin limitarse a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio de ion, cromatografía líquida de alto desempeño ("HPLC") en fase inversa-HPLC ("RP-HPLC"), absorción de lecho expandido, o cualquier combinación y/o repetición de las mismas y en cualquier orden apropiado. Equipos y otros materiales necesarios utilizados para llevar a cabo las técnicas descritas en la presente, se encuentran comercialmente disponibles. Se encuentran disponibles, bombas, colectores de fracción, monitores, registradores, y sistemas completos, por ejemplo de, Applied Biosystems (Foster City, CA) , Bio-Rad Laboratories, Inc., (Hercules, CA) , y Amersham Biosciences, Inc., (Piscataway, NJ) . También se encuentran disponibles de tales compañías, materiales cromatográficos incluyendo, pero sin limitarse a, materiales de matriz de intercambio, medios y amortiguadores. El equilibrado, y otras etapas en los procesos de cromatografía de columna descritos en la presente, tales como lavado y elución, pueden lograrse más rápidamente utilizando equipo especializado tal como una bomba. Las bombas comercialmente disponibles, incluyen, pero sin limitarse a, HILOAD® Pump P-50, Peristatic Pump P-l, Pump P-901, y Pump P-903 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Ejemplos de colectores de fracción incluyen RediFrac Fraction Collector, FRAC-100 y FRAC-200 Fraction Collectors, y SUPERFRAC® Fraction Collector (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . También se encuentran disponibles mezcladores para formar pH y gradientes de concentración lineal. Los mezcladores comercialmente disponibles incluyen Gradient Mixer GM-1, y In-Line Mixers (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . El proceso cromatográfico puede monitorearse utilizando cualquier monitor comercialmente disponible.
Tales monitores pueden utilizarse para conjuntar información como UV, pH, y conductividad. Ejemplos de detectores incluyen Monitor UV-1, UVICORD® S II, Monitor UV-M II, Monitor UV-900, Monitor UPC-900, Monitor pH/C-900 y Conductivity Monitor (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . En efecto, se encuentran disponibles comercialmente sistemas completos incluyendo los varios sistemas AKTA® de Amersham Biosciences, (Piscataway, NJ) . En una modalidad de la presente invención, por ejemplo, el polipéptido de GH, e.g., de hGH puede reducirse y desnaturalizarse desnaturalizando primero el polipéptido de GH, e.g., de hGH purificado resultante en urea, seguido por dilución en amortiguador TRIS conteniendo un agente de reducción (tal como DTT) a un pH adecuado. En otra modalidad, el polipéptido de GH, e.g., de hGH se desnaturaliza en urea en un rango de concentración de entre aproximadamente 2 M a aproximadamente 9 M, seguido por dilución en amortiguador TRIS a un pH en el rango de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0. La mezcla de redoblamiento de esta modalidad puede incubarse entonces. En una modalidad, la mezcla de redoblamiento se incuba a temperatura ambiente durante cuatro a veinticuatro horas. La mezcla de polipéptido de GH, e.g., de hGH reducido y desnaturalizado puede aislarse o purificarse posteriormente. Como se detalla en la presente, el pH de la primera mezcla de polipéptido de GH, e.g., de hGH, puede ajustarse previo a efectuar cualquier etapa de aislamiento subsecuente. Además, la primera mezcla de polipéptido de GH, e.g., de hGH o cualquier mezcla subsecuente del mismo, puede concentrarse utilizando técnicas conocidas en la técnica. Además, el amortiguador de elución que comprende la primera mezcla de polipéptido de GH, e.g., de hGH o cualquier mezcla subsecuente del mismo puede intercambiarse por un amortiguador adecuado para la siguiente etapa de aislamiento utilizando técnicas conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica. Cromatografía de Intercambio de Ion En una modalidad, como una etapa opcional adicional, puede efectuarse la cromatografía de intercambio de ion en la primera mezcla de polipéptido de GH, e.g., de hGH. Ver, en general, Ion Exchange Chromatography: Principies and Methods (Cat. No. 18:1114-21, Amersham Biosciences, (Piscataway, NJ) . Las columnas de intercambio de ion comercialmente disponibles incluyen columnas HITRAP®, HIPREP®, y HILOAD® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Tales columnas utilizan fuertes permutadores de anión tales como Q SEPHAROSE® Fast Flow, Q SEPHAROSE® High Performance, y Q SEPHAROSE® XL; fuertes permutadores de catión tales como SO SEPHAROSE® High Performance, SP SEPHAROSE® Fast Flow, y SP SEPHAROSE® XL; débiles permutadores de anión tales como DEAE SEPHAROSE® Fast Flow; y débiles permutadores de catión tales como CM SEPHAROSE® Fast Flow (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . La cromatografía de columna de intercambio de catión puede llevarse a cabo en el polipéptido de GH, e.g., de hGH en cualquier etapa del proceso de purificación para aislar el polipéptido de GH, e.g., de hGH sustancialmente purificado. La etapa de cromatografía de intercambio de catión puede llevarse a cabo utilizando cualquier matriz adecuada de intercambio de catión. Las matrices útiles de intercambio de catión, incluyen, pero no se limitan a, materiales de matriz de intercambio de catión fibrosos, porosos, no porosos, microgranulares, granulados, o reticulados. Tales materiales de matriz de intercambio de catión incluyen, pero no se limitan a, celulosa, agarosa, dextrano, poliacrilato, polivinilo, poliestireno, sílice, poliéter, o compuestos de cualquiera de los anteriores. La matriz de intercambio de catión puede ser cualquier permutador de catión adecuado incluyendo, permutadores fuertes y débiles de catión. Los permutadores fuertes de catión pueden permanecer ionizados sobre un amplio rango de pH y por consiguiente, pueden ser capaces de unirse a GH, e.g., hGH sobre un amplio rango de pH . Sin embargo, los permutadores débiles de catión pueden perder isonización como una función del pH . Por ejemplo, un permutador débil de catión puede perder carga cuando el pH cae por debajo de aproximadamente un pH 4 o un pH 5. Los permutadores fuertes de catión adecuados incluyen, pero sin limitarse a, grupos funcionales cargados tales como sulfopropil (SP) , metil sulfonato (S), o sulfoetil (SE). La matriz de intercambio de catión puede ser un permutador fuerte de catión que tiene preferentemente un rango de pH de unión a GH, e.g., hGH de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 6.0. alternativamente, el permutador fuerte de catión puede tener un rango de pH de unión a GH, e.g., hGH de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 5.5. la matriz de intercambio de catión puede ser un permutador fuerte de catión que tiene un pH de unión a GH, e.g., hGH de aproximadamente 3.0. Alternativamente, la matriz de intercambio de catión puede ser un permutador fuerte de catión, que tiene preferentemente un rango de pH de unión a GH, e.g., hGH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0. La matriz de intercambio de catión puede ser un permutador fuerte de catión, que tiene preferentemente un rango de pH de unión a GH, e.g., hGH de aproximadamente 8.0 a aproximadamente 12.5. Alternativamente el permutador fuerte de catión puede tener un rango de pH de unión a GH, e.g., hGH de aproximadamente 8.0 a aproximadamente 12.0. Previo a la carga de la GH, e.g., hGH, la matriz de intercambio de catión puede equilibrarse, por ejemplo, utilizando varios volúmenes de columna de un ácido débil diluido, e.g., volúmenes de cuatro columnas de 20 mM de ácido acético, pH 3. Después del equilibrado, la GH, e.g., hGH puede agregarse y la columna puede lavarse de una a varias veces, previo a la elución de GH, e.g., hGH sustancialmente purificada, utilizando también una solución de ácido débil tal como una solución débil de ácido acético o de ácido fosfórico. Por ejemplo, pueden utilizarse aproximadamente 2-4 volúmenes de columna de 20 mM de ácido acético, pH 3, para lavar la columna. También pueden utilizarse lavados adicionales utilizando, e.g., 2-4 volúmenes de columna de 0.05 M de acetato de sodio, pH 5.5, o 0.05 M de acetato de sodio mezclado con 0.1 M de cloruro de sodio, pH 5.5. Alternativamente, utilizando métodos conocidos en la técnica, la matriz de intercambio de catión puede equilibrarse utilizando varios volúmenes de columna de una base débil diluida . Alternativamente, la GH, e.g., hGH sustancialmente purificada puede eluirse poniendo en contacto la matriz de intercambio de catión con un amortiguador que tiene un pH o resistencia iónica suficientemente bajos para desplazar la GH, e.g., hGH de la matriz. El pH del amortiguador de elución puede variar de aproximadamente un pH de 2.5 a aproximadamente un pH de 6.0. Más específicamente, el pH del amortiguador de elución puede variar de aproximadamente un pH de 2.5 a aproximadamente un pH de 5.5, aproximadamente un pH de 2.5 a aproximadamente un pH de 5.0. El amortiguador de elución puede tener un pH de aproximadamente 3.0. además, la cantidad del amortiguador de elución puede variar ampliamente y generalmente se encontrará en el rango de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 volúmenes de columna. Después de la absorción del polipéptido de GH, e.g., de hGH a la matriz de intercambio de catión, el polipeptido de hGH sustancialmente purificado puede eluirse poniendo en contacto la matriz con un amortiguador que tiene un pH o resistencia iónica suficientemente altos para desplazar el polipeptido de GH, e.g., de hGH de la matriz. Los amortiguadores adecuados para su uso en la elución a alto pH del polipeptido de GH, e.g., de hGH sustancialmente purificado que pueden encontrar su uso en la presente incluyen, pero sin limitarse a, amortiguadores citrato, fosfato, formato, acetato, HEPES y MES que varían en concentración de al menos aproximadamente 5 mM a al menos aproximadamente 100 mM. Cromatografía de Fase Inversa La RP-HPLC puede llevarse a cabo para purificar proteínas siguiendo protocolos adecuados conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. Ver, e.g., Pearson et al., Anal. Biochem. (1982) 124:217-230 (1982); Rivier et al., J. Chrom. (1983) 268:112-119; Kunitam et al., J. Chrom. (1986) 359:391-402. La RP-HPLC puede llevarse a cabo en el polipeptido de GH, e.g., de hGH para aislar el polipéptido de GH, e.g., de hGH sustancialmente purificado. A este respecto, pueden utilizarse resinas de sílice derivatizadas con funcionalidades alquilo con una amplia variedad de longitudes, incluyendo, pero sin limitarse a, de al menos aproximadamente C3 a al menos aproximadamente C30, de al menos aproximadamente C3 a al menos aproximadamente C?o^ O de al menos aproximadamente C3 a al menos aproximadamente Cíe • Alternativamente puede utilizarse una resina polimérica. Por ejemplo, puede utilizarse la resina TosoHaas Amberchrome CGlOOOsd, que es una resina de polímero de estireno. También pueden utilizarse resinas ciano o poliméricas con una amplia variedad de longitudes de cadena alquilo. Además, la columna RP-HPLC puede lavarse con un solvente tal como etanol. La columna Source RP es otro ejemplo de una columna de RP-HPLC. Puede utilizarse un amortiguador de elución adecuado que contienen un agente de formación de pares de ion y un modificador orgánico tal como metanol, isopropanol, tetrahidrofurano, acetonitrilo o etanol, para eluir el polipéptido de GH, e.g., de hGH de la columna de RP-HPLC. Los agentes de formación de pares de ion más comúnmente utilizados incluyen, pero no se limitan a, ácido acético, ácido fórmico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido trifluoroacético, ácido heptafluorobutírico, trietilamina, tetrametilamonio, tetrabutilamonio, y trietilamonio acetato.
Las elusiones pueden llevarse a cabo utilizando uno o más gradientes o condiciones isocráticas, prefiriéndose las condiciones de gradiente para reducir el tiempo de separación y para disminuir el ancho de pico. Otro método implica el uso de dos gradientes con diferentes rangos de concentración de solvente. Ejemplos de amortiguadores de elusión adecuados para su uso en la presente pueden incluir, pero sin limitarse a acetato de amonio y soluciones acetonitrilo. Técnicas de Cromatografía de Purificación de Interacción Hidrófoba La cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) puede llevarse a cabo en el polipéptido de GH, e.g., de hGH. Ver, en general, Hidrophobic Interaction Chromatography Handbook: Principies and Methods (Cat. No. 18-1020-90, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) que se incorpora por la referencia en la presente. Las matrices de HIC adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a, matrices sustituidas con alquilo, o arilo, tales como matrices sustituidas con butilo, hexilo, octilo o fenilo incluyendo matrices de agarosa, agarosa reticulada, sefarosa, celulosa, sílice, dextrano, poliestireno, poli (metacrilato) , y resinas en forma mezclada, incluyendo, pero sin limitarse a, una resina de polietilenoamina o una matriz de poli (metacrilato) sustituida con butilo o fenilo. Las fuentes comercialmente disponibles para cromatografía de columna de interacción hidrófoba incluyen, pero no se limitan a, columnas HITRAP®, HIPREP®, y HILOAD® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Brevemente, previo a la carga, la columna de HIC puede equilibrarse utilizando amortiguadores estándar conocidos por el de experiencia ordinaria en la técnica, tales como solución de ácido acético/cloruro de sodio o HEPES conteniendo sulfato de amonio. El sulfato de amonio puede utilizarse como el amortiguador para cargar la columna de HIC. Después de cargar el polipéptido de GH, e.g., de hGH, la columna puede lavarse entonces utilizando amortiguadores y condiciones estándar para retirar materiales no deseados, pero reteniendo el polipéptido de GH, e.g., de hGH en la columna de HIC. El polipéptido de GH, e.g., de hGH puede eluirse con de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 volúmenes de columna de un amortiguador estándar tal como un amortiguador HEPES conteniendo EDTA y una concentración de sulfato de amonio menor que el amortiguador de equilibrio, o un amortiguados de ácido acético/cloruro de sodio, entre otros. También puede utilizarse un gradiente de sal lineal disminuido utilizando, por ejemplo, un gradiente de fosfato de potasio, para eluir las moléculas de GH, e.g., de hGH. El eluyente puede concentrarse entonces, por ejemplo, mediante filtración tal como diafiltración o ultrafiltración. La diafiltración puede utilizarse para retirar la sal utilizada para eluir el polipéptido de GH, e.g., de hGH. Otras Técnicas de Purificación Puede llevarse a cabo aún otra etapa de aislamiento, por ejemplo, filtración de gel (Gel Filtration: Principies and Methods (Cat. No. 18-1022-18, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) que se incorpora por la referencia en la presente, cromatografía de hidroxilapatita (las matrices adecuadas incluyen, pero no se limitan a, HA-Ultrogel, High Resolution (Calbiochem), CHT Ceramic Hydroxylapatite (BioRad) , Bio - Gel HTP Hydroxylapatite (BioRad) ) , HPLC, absorción de lecho extendido, ultrafiltración, diafiltración, liofilización y lo similar, en la primera mezcla de polipéptido de GH, e.g., de hGH o cualquier mezcla subsecuente del mismo, para retirar todo exceso de sales y para reemplazar el amortiguador con un amortiguador adecuado para la siguiente etapa de aislamiento o incluso la formulación del producto de droga final . La producción del polipéptido de GH, e.g., de hGH incluyendo el polipéptido de GH, e.g., de hGH sustancialmente purificado, puede monitorearse en cada una de las etapas descritas en la presente utilizando técnicas conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica. tales técnicas también pueden utilizarse para establecer la producción del polipéptido de GH, e.g., de hGH sustancialmente puro después de la última etapa de aislamiento. Por ejemplo, la producción del polipéptido de GH, e.g., de hGH puede monitorearse utilizando diversas columnas de cromatografía líquida a alta presión de fase inversa, que tienen una variedad de longitudes de cadena alquilo tales como ciano RPHPLC, CisRP-HPLC; así como HPLC de intercambio de catión y HPLC de filtración de gel. En modalidades específicas de la presente invención, la producción de GH, e.g., hGH después de cada etapa de purificación puede ser de al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, al menos aproximadamente 99.9%, o al menos aproximadamente 99.99% de la GH, e.g., hGH en el material de inicio para cada etapa de purificación. La pureza puede determinarse utilizando técnicas estándar tales como SDS-PAGE, o midiendo el polipéptido de GH, e.g., de hGH utilizando análisis Western y ELISA. Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos policlonales contra proteínas aisladas de la fermentación de levadura de control negativo y la recuperación de intercambio de catión. Los anticuerpos también pueden utilizarse para probar la presencia de proteínas contaminantes de célula huésped. El material de RP-HPLC Vydac C4 (Vydac) consiste de partículas de gel de sílice, cuyas superficies contienen cadenas C4-alquilo. La separación del polipéptido de GH, e.g., de hGH de las impurezas proteináceas se basa en las diferencias en la resistencia de las interacciones hidrófobas. La elusión se lleva a cabo con un gradiente acetonitrilo en ácido trifluoroacético diluido. La HPLC de preparación se lleva a cabo utilizando una columna de acero inoxidable (llena con 2.8 a 3.2 litros de Vydac C4 silicagel). El eluido Hydroxylapatite Ultrogel se acidifica agregando ácido trifluoroacético y cargando en la columna Vydac C4. Para el lavado y la elusión se utiliza un gradiente acetonitrilo en ácido trifluoroacético diluido. Las fracciones se colectan e inmediatamente se neutralizan con amortiguador de fosfato. Las fracciones del polipéptido de GH, e.g., de hGH que se encuentran dentro de los límites de IPC se depositan. El material DEAE Sepharose (Pharmacia) consiste de grupos de dietilaminoetil (DEAE) que se encuentran unidas de manera covalente a la superficie de perlas de Sepharose. La unión del polipéptido de GH, e.g., de hGH a grupos DEAE se encuentra mediada por interacciones iónicas. El acetonitrilo y el ácido trifluoroacético pasa a través de la columna sin ser retenido. Después de haber retirado estas sustancias, se retiran las impurezas de rastro lavando la columna con amortiguador de acetato a un bajo pH . Después la columna se lava con amortiguador de fosfato neutro y el polipéptido de GH, e.g., de hGH se eluye con un amortiguador con aumentada resistencia iónica. La columna se empaca con flujo rápido de DEAE Sepharose. El volumen de la columna se ajusta para asegurar una carga de polipéptido de GH, e.g., de hGH en el rango de 3-10 mg del polipéptido de GH, e.g., de hGH/ml de gel. La columna se lava con agua y amortiguador de equilibrado (sodio/fosfato de potasio). Las fracciones depositadas del eluido de HPLC se cargan y la columna se lava con amortiguador de equilibrado. Después la columna se lava con amortiguador de lavado (amortiguador de acetato de sodio) seguido por lavado con amortiguados de equilibrado. Subsecuentemente el polipéptido de GH, e.g., de hGH se eluye de la columna con amortiguador de elución (cloruro de sodio, sodio/fosfato de potasio) y se colecta en una sola fracción de acuerdo con el perfil maestro de elución. El eluido de la columna de DEAE Sepharose se ajusta a la conductividad especificada. La sustancia de droga resultante se filtra en botellas de Teflón y se almacena a -70°C. Los métodos adicionales que pueden emplearse incluyen, pero no se limitan a, etapas para retirar endotoxinas. Las endotoxinas son lipopoli-sacáridos (LPSs) que se ubican en la membrana externa de células huésped Gram positivas, tales como, por ejemplo, Escherichia coli. Los métodos para reducir los niveles de endotoxina son conocidos por el de experiencia ordinaria en la técnica, e incluyen, pero sin limitarse a, técnicas de purificación utilizando soportes de sílice, polvo de vidrio o cromatografía de hidroxilapatita, de fase inversa, de afinidad, exclusión de tamaño, de intercambio aniónico, cromatografía de interacción hidrófoba, una combinación de estos métodos y lo similar. Pueden requerirse modificaciones o métodos adicionales para retirar contaminantes tales como proteínas co-migrantes del polipéptido de interés. Los métodos para medir los niveles de endotoxina son conocidos por el de experiencia ordinaria en la técnica e incluyen, pero sin limitarse a, análisis Limulus Amebocyte Lysate (LAL) . Puede utilizarse una amplia variedad de métodos y procedimientos para establecer la producción y pureza de una proteína de GH, e.g., de hGH en uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals, incluyendo, pero sin limitarse a, el análisis Bradford, SDS-PAGE, SDS-PAGE de coloración de plata, SDS-PAGE de coloración de coomassie, espectrometría de masa (incluyendo, pero sin limitarse a, MALDI-TOF) y otros métodos para caracterización de proteínas conocidos por el de experiencia ordinaria en la técnica. Los métodos adicionales incluyen, pero no se limitan a: SDS-PAGE acoplado con métodos de coloración de proteínas, inmunomanchado, espectrometría de masa de desorbción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-MS), cromatografía líquida/espectrometría de masa, enfoque isoeléctrico, intercambio aniónico analítico, cromatoenfoque, y dicroismo circular. VIII. Expresión en Sistemas Alternados Se han empleado varias estrategias para introducir aminoácidos no naturales en proteínas en células huésped no recombinantes, células huésped mutagenizadas o en sistemas libres de células. Estos sistemas también se encuentran disponibles para su uso en la fabricación de los polipéptidos de GH, e.g., de hGH de la presente invención. La derivatización de aminoácidos con cadenas laterales reactivas tales como Lys, Cys y Tyr dio como resultado la conversión de lisina en N2-acetil-lisina . La síntesis química también proporciona un método directo para la incorporación de aminoácidos no naturales. Con el reciente desarrollo de ligación enzimática y ligación química natural de fragmentos de péptido, es posible la elaboración de proteínas más grandes. Ver, e.g., P. E. Dawson y S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem., 69:923 (2000). La ligación química de péptidos y la ligación química natural se describen en la Patente de E.U. No. 6,184,344 y la Publicación de Patente de E.U. No. 2004/0138412, la Publicación de Patente de E.U. No. 2003/0208046, WO 02/098902 y WO 03/042235, que se incorporan mediante la referencia en la presente. Un método general biosintético in vitro en el cual se agrega un ARNt supresor químicamente acilado con el aminoácido no natural deseado a un extracto in vitro capaz de soportar la biosíntesis de proteína, se ha utilizado para incorporar de manera específica en el sitio hasta 100 aminoácidos no naturales en una variedad de proteínas virtualmente de cualquier tamaño. Ver, e.g., V. W. Cornish, D. Mendel y P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed . Engl., 1995 34_621 (1995); C. J. Noren, S. J. Anthony-Cahill, M. C. Griffith, P. G. Schultz, A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244:182-188 (1989); y J. D. Bain, C. G. Glabe, T. A. Dix, A. R. Chamberlin, E. S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc., 111:8013-8014 (1989). Un amplio rango de grupos funcionales se ha introducido en proteínas para estudios de estabilidad de proteínas, doblamiento de proteínas, mecanismo enzimático, y transducción de señal. Se desarrolló, un método in vivo, llamado incorporación de presión selectiva, para explotar la promiscuidad de sintetasas de tipo silvestre. Ver, e.g., N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder y R. Huber, FASEB J. 13:41 (1999). Una especie auxotrópica, en la cual la trayectoria metabólica relevante que suministra a la célula un aminoácido natural particular, se desactiva, se cultiva en medio mínimo conteniendo concentraciones limitadas del aminoácido natural, mientras se reprime la transcripción del gen objetivo. Al establecimiento de la fase estacionaria de crecimiento, el aminoácido natural se agota y se reemplaza con el análogo de aminoácido no natural. La inducción de la expresión de la proteína recombinante, da como resultado la acumulación de una proteína que contiene el análogo no natural. Por ejemplo, al utilizar esta estrategia, o, m y p-fluorofenilalaninas se han incorporado en las proteínas y exhiben dos brazos característicos en el espectro UV que pueden identificarse fácilmente, ver, e.g., C. Minks, R. Huber, L. Moroder y N. Budisa, Anal. Biochem. 284:29 (2000); se ha utilizado trifluorometionina para reemplazar la metionina en lisozima bacteriófago T4 para estudiar su interacción con ligandos quitooligosacárido mediante 19F NMR, ver, e.g., H. Duewel, E. Daub, V. Robinson y J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404 (1997); y se ha incorporado trifluoroleucina en lugar de leucina, dando como resultado estabilidad térmica y química aumentada de una proteína de ziper de leucina. Ver, e.g., Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado y D. A. Tirrell, Angew Chem. Int. Ed. Engl., 40:1494 (2001). Además, se incorpora selenometionina y telurometionina en varias proteínas recombinantes para facilitar la solución de fases en cristalografía de rayos X. Ver, e.g., W. A. Hendrickson, J. R. Horton y D. M. Lemaster, EMBO J., 9:1665; J. 0. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda y M. Hatada, Nat. Struct. Biol., 1:283 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellerman y R. Huber, Eur. J. Biochem., 230:788 (1995); y N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, I. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder y R. Huber, J. Mol. Biol. 270:616 (1997). También se han incorporado eficientemente análogos de metionina con funcionalidades alqueno o alquino permitiendo la modificación adicional de proteínas mediante medios químicos. Ver, e.g., J. C. van Hest y D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428:68 (1998); J. C. van Hest, K. L. Kiick y D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc . , 122:1282 (2000); y K. L. Kiick y D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000); Patente de E.U. No. 6,586,207; Publicación de Patente de E.U. 2002/0042097, que se incorporan en la presente por la referencia. El éxito de este método depende del reconocimiento de los análogos de aminoácido no natural por las aminoacil-ARNt sintetasas, que, en general, requiere alta selectividad para asegurar la fidelidad de la translación de proteína. Una forma de expandir el alcance de este método es relajar la especificidad de sustrato de aminoacil-ARNt sintetasas, lo cual se ha logrado en un número limitado de casos. Por ejemplo, el reemplazo de Ala294 por Gly en Escherichia coli fenilalanil-ARNt sintetasa (PheRS) aumenta el tamaño del saco de unión del sustrato, y da como resultado la acilación de ARNtPhe mediante p-Cl-fenilalanina (p-Cl-Phe) . Ver, M. Ibba, P. Kast y H. Hennecker, Biochemistry, 33:7107 (1994). Una especie de Escherichia coli que contiene esta PheRS mutante permite la incorporación de p-Cl-fenilalanina o p-Br-fenilalanina en lugar de fenilalanina. Ver, e.g., M. Ibba y H. Hennecke, FEBS. Lett, 364:272 (1995); Y N. Sharma, R. Furter, P. Kast y D. A. Tirrell FEBS Lett., 467:37 (2000). De manera similar, una mutación de punto Phel30Ser cercana al sitio de unión de aminoácido de Escherichia coli tirosil-ARNt sintetasa, mostró que permite la incorporación de azatirosina más eficientemente que la tirosina. Ver, e.g., F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Solí y S. Nishimura, J. Biol, Chem., 275:40324 (2000) . Otra estrategia para incorporar aminoácidos no naturales en proteínas in vivo, es modificar las sintetasas que tienen mecanismos de lectura probada. Estas sintetasas no pueden discriminar y en consecuencia activar aminoácidos que son estructuralmente similares a los aminoácidos naturales cognado. Este error se corrige en un sitio separado, que deacila el aminoácido mal cargado del ARNt para mantener la fidelidad de la translación de proteína. Si la actividad de lectura probada de la sintetasa se desactiva, los análogos estructurales que se desactivan pueden escapar a la función de edición e incorporarse. Este procedimiento se ha demostrado recientemente con la valil-ARNt sintetasa (ValRS) . Ver, V. Doring, H. D. Mootz, J. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel y P. Marliere, Science, 292:501 (2001). ValRS puede aminoacilar mal el ARNtVal con Cys, Thr, o aminobutirato (Abu) ; estos aminoácidos no cognado se hidrolizan subsecuentemente por el dominio de edición. Después de la mutagénesis aleatoria del cromosoma de Escherichia coli, se seleccionó una especie de Escherichia coli mutante que tiene una mutación en el sitio de edición de ValRS . Este ValRS de edición defectuosa carga incorrectamente la ARNtVal con Cys. Debido a que Abu se asemeja estéricamente a Cys (el grupo -SH de Cys se reemplaza con -CH3 en Abu) , la ValRS mutante incorpora también Abu en proteínas cuando esta especie mutante de Escherichia coli se cultiva en presencia de Abu. El análisis espectrométrico de masa muestra que aproximadamente el 24% de las valinas se reemplaza por Abu en cada posición valina en la proteína natural . Métodos de síntesis de fase sólida y semi sintéticos también han permitido la síntesis de un número de proteínas que contienen nuevos aminoácidos. Por ejemplo, ver las siguientes publicaciones y referencias citadas en las mismas, que son como sigue: Criek, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General na ture of the genetic code for proteins . Nature, 192:1227-1232 (1961); Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides . XXXVI The effect of pyra zole-imida zole repla cements on the S-protein a ctiva ting potency of an S-peptide fragmen t, J. Am Chem, 88(24) :5914-5919 (1966); Kaiser, E.T. Syn thetic approa ches to biologi cally a ctive peptides and proteins including enyzmes, Acc Chem Res, 22:47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segmen t coupling ca talyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J . Am Chem Soc, 109:3808-3810 (1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Cons tructing proteins by dovetailing unprotected syn thetic peptides : ba ckbone-engineered HIV protease, Science, 256(5054) :221-225 (1992); Chaiken, I.M. Semisyn thetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem, 11(3) :255- 301 (1981); Offord, R.E. Protein engineering by chemical means ? Protein Eng. , 1(3):151-157 (1987); y, Jackson, D.Y., Burnier, J., Quan, C, Stanley, M., Tom, J., Wells, J.A. A Designed Peptide Ligase for Total Syn thesis of Ribonuclease A wi th Unna tural Ca talytic Resídues , Science, 266 (5183) : 243 (1994). Se ha utilizado la modificación química para introducir una variedad de cadenas laterales no naturales, incluyendo cofactores, marcas giratorias y oligonucleótidos en proteínas in vitro. Ver, e . g. , Corey, D.R., Schultz, P.G. Genera tion of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxy ribonuclease, Science, 238 (4832) : 1401-1403 (1987); Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S.E. The chemical modf ica tion of enzyma tic specif ici ty, Annu Rev Biochem, 54:565-595 (1985); Kaiser, E.T., Lawrence, D.S. Chemical muta tion of enyzme active si tes, Science, 226 ( 4674 ): 505-511(1984); Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol -subtilisin, J Biol. Chem, 243 (24 ): 6392-6401 (1968); Polgar, L. et M.L. Bender. A new enzyme con taining a syn thetically formed active si te Thiol -subtilisin . J . Am Chem Soc, 88:3153-3154 (1966); y, Pollack, S.J., Nakayama, G. Schultz, P.G. In troduction of nucleophiles and spectroscopic probes in to an tibody combining si tes , Science, 242(4881): 1038-1040 (1988) . Alternativamente, se han utilizado métodos biosintéticos que emplean aminoacil-ARNts químicamente modificados para incorporar varias sondas biofísicas en proteínas sintetizadas in vitro. Ver las siguientes publicaciones y referencias citadas en las mismas: Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev. Biochem. 62:483-514 (1993); y Krieg, U. C. Ealter P. Hohnson, A. E. Photocrosslinking of the signal seguence of nascent preprolactin of the 54-kilodal ton polypeptide of the signal recogni tion particle, Proc. Nati. Acad. Sci., 83(22) :8604- 8608 (1986) . Previamente, se ha mostrado que los aminoácidos no naturales pueden incorporarse de manera específica en el sitio en proteínas in vitro mediante la adición de ARNts de supresión químicamente aminoacilados a reacciones de síntesis de proteínas programadas con un gen que contiene una mutación de no sentido ámbar deseada. Utilizando estos procedimiento, puede sustituirse un número de los veinte aminoácidos comunes con homólogos estructurales cercanos, e.g., fluorofenilalanina por fenilalanina, utilizando especies auxotrópicas para un aminoácido particular. Ver, e.g., Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for si te-specif l c incorpora tion of unna tural amino acids in to proteins , Science, 244: 182-188 (1989); M.W. Nowak, et al, Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Díala, E.S. Biosyn theti c si te-specfic Incorpora tion of a non -na tural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999); Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C.J., Schultz, P.G Biosyn thetic method for in troducing unna tural amíno acids si te-specif ically in to proteins , Methods in Enz . , vol. 202, 301-336 (1992); y, Mendel, D., Comish, V.W. & Schultz, P.G. Si te-Directed Mutagenesis wi th an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24, 435-62 (1995) .
Por ejemplo, se preparó un ARNt de supresión que reconoce el codón de paro UAG y se aminoaciló químicamente con un aminoácido no natural. Se utilizó mutagénesis convencional dirigida al sitio para introducir el codón de paro TAG en el sitio de interés en el gen de proteína. Ver, e.g., Sayers, J. R. Schmidt, W. Eckstein, F, 5'-3' Exonucleases in phosphothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucleic Acids Res. 16 (3) : 791-802 (1988). Cuando el ARNt de supresión acilado y el gen mutante se combinaron en un sistema de transcripción/translación in vitro, el aminoácido no natural se incorporó en respuesta al codón UAG que dio una proteína conteniendo ese aminoácido en la posición especificada. Experimentos utilizando [3H]-Phe y experimentos con ácidos alfa-hidroxi demostraron que solo el aminoácido deseado se incorpora en la posición especificada por el codón UAG y que este aminoácido no se incorpora en ningún otro sitio en la proteína. Ver, e.g., Noren, et al., supra; Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10(6) :425-432; y Ellman, J. A., Mendel, D. Schultz, P. G. Site specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science 255 (5041) : 197-200 (1992). Un ARNt puede aminoacilarse con un aminoácido deseado mediante cualquier método o técnica, incluyendo, pero sin limitarse a aminoacilación química o enzimática. La aminoacilación puede lograrse por medio de aminoacil-ARNt sintetasas o mediante otras moléculas enzimáticas, incluyendo, pero sin limitarse a, ribozimas. El término "ribozima" es intercambiable con "ARN catalítico". Cech y colaboradores (Cech, 1987, Science, 236:1532-1539; McCorkle et al., 1987, Concepts Biochem. 64:221-226) demostraron la presencia de ARNs de origen natural que pueden actuar como catalizadores (ribozimas). Sin embargo, aunque estos catalizadores de ARN natural solo han mostrado que actúan en sustratos de ácido ribonucleico para separación y división, el desarrollo reciente de la evolución artificial de ribozimas ha expandido el repertorio de catalizadores a varias reacciones químicas. Los estudios han identificado moléculas de ARN que pueden catalizar uniones de aminoacil-ARN en sus propias terminaciones (2') 3' ( Illangakekare et al., 1995 Science 267:643-647), y una molécula de ARN que puede transferir un aminoácido de una molécula de ARN a otra (Lohse et al., 1996, Nature 381:442-444). La Publicación de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0228593, que se incorpora por la referencia en la presente, describe métodos para construir ribozimas y su uso en la aminoacilación de ARNts con aminoácidos naturalmente codificados y codificado de manera no naturals. Las formas inmovilizadas en sustrato de moléculas enzimáticas que pueden aminoacilar ARNts, incluyendo, pero sin limitarse a, ribozimas, pueden permitir una eficiente purificación de afinidad de los productos aminoacilados . Ejemplos de sustratos adecuados incluyen agarosa, sefarosa y perlas magnéticas. La producción y uso de una forma inmovilizada en sustrato de ribozima para aminoacilación se describe en Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084 y la Publicación de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0228593, que se incorporan en la presente por la referencia. Los métodos de aminoacílación química incluyen, pero no se limita a los introducidos por Hecht y colaboradores (Hecht, S. M. Acc. Chem. Res. 1992, 25, 545; Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C; Chang, P Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254; Hecht, S. M.; Alford, B.L.; Kuroda, Y.; Kitano, S.J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517) y por Schultz, Chamberlin, Dougherty y otros (Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621; Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722; Noren, C. J.; Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182; Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013; Bain, J. D. et al. Nature 1992, 356, 537; Gallivan, J. P.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740; Turcatti, et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991; Nowak, M. W. et al. Science, 1995, 268, 439; Saks, M. E. et al. J. Biol. Chem, 1996, 271, 23169; Hohsaka, T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34), que se incorporan mediante la referencia en la presente, para evitar el uso de sintetasas en la aminoacilación. Tales métodos u otros métodos de aminoacilación química pueden utilizarse para aminoacilar moléculas de ARNt. Los métodos para generar ARN catalítico pueden implicar la generación de depósitos separados de secuencias de ribozima aleatorizadas, para llevar a cabo la evolución dirigida en los depósitos, visualizar los depósitos por la actividad de aminoacilación deseada, y seleccionar secuencias de aquellas ribozimas que exhiben la actividad de aminoacilación deseada. Las ribozimas pueden comprender motivos y/o regiones que facilitan la actividad de acilación, tales como un motivo GGU y una región rica en U. Por ejemplo, se ha reportado que las regiones ricas en U pueden facilitar el reconocimiento de un sustrato de aminoácido, y un motivo GGU puede formar pares base con las terminaciones 3' de un ARNt. En combinación, el motivo GGU y la región rica en U facilitan el reconocimiento simultáneo tanto del aminoácido como de la ARNt simultáneamente, y por tanto facilitan la aminoacilación de las terminaciones 3' de la ARNt. Las ribozimas pueden generarse mediante la selección in vitro utilizando un r24mini parcialmente aleatorizado conjugado con ARNtAsnccg, seguido por la fabricación sistemática de una secuencia de consenso encontrada en los clones activos. Una ribozima ejemplar obtenida mediante este método, se denomina "ribozima Fx3" y se describe en la Solicitud de Publicación de E.U. No. 2003/0228593, cuyo contenido se incorpora por la referencia en la presente, actúa como un catalizador versátil para la síntesis de varios aminoacil-ARNts cargados con aminoácidos cognado no naturales. La inmovilización en un sustrato puede utilizarse para permitir la eficiente purificación de afinidad de los ARNts aminoacilados . Ejemplos de sustratos adecuados incluyen, pero no se limitan a, agarosa, sefarosa y perlas magnéticas. Las ribozimas pueden inmovilizarse en resinas tomando ventaja de la estructura química del ARN, tal como el 3'-cis-diol en la ribosa del ARN puede oxidarse con periodato para producir el dialdehído correspondiente para facilitar la inmovilización del ARN en la resina. Varios tipos de resina pueden utilizarse incluyendo resinas de hidazida inexpresivas en donde la aminación de reducción hace de la interacción entre la resina y la ribozima un enlace irreversible. La síntesis de aminoacil-ARNts puede facilitarse significativamente mediante esta técnica de aminoacilación en columna. Kouroiklis et al., Methods 2005; 36:239-4 describen un sistema de aminoacilación en base a columna. El aislamiento de los ARNts aminoacilados puede lograrse en una variedad de formas. Un método adecuado es eluir los ARNts ammoacilados de una columna con un amortiguador tal como una solución de acetato de sodio con 10 mM de EDTA, un amortiguador conteniendo 50 mM N-(2-hidroxietil) piperazma-N' - (3-ác?do propanosulfónico), 12.5 mM de KCl, pH 7.0, 10 mM de EDTA, o simplemente un agua amortiguada con EDTA (pH 7.0). Los ARNts am oacilados pueden agregarse a reacciones de translación a fin de incorporar el aminoácido con el cual se ammoacilo el ARNt en una posición seleccionada en un polipeptido elaborado mediante la reacción de translación. Ejemplos de sistemas de translación en los cuales pueden utilizarse los ARNts ammoacilados de la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, lisados celulares. Los lisados celulares proporcionan componentes de reacción necesarios para translación ín vitro de un polipéptido de un ARNm de entrada. Ejemplos de tales componentes de reacción incluyen, pero no se limitan a, proteínas ribosomales, ARNr, aminoácidos, ARNts, GTP, ATP, factores de iniciación de translación y de alargamiento y factores adicionales asociados con la translación. Adicionalmente, los sistemas de translación pueden ser translaciones por lotes o translación compartimentalizada . Los sistemas de translación por lotes combinan los componentes de reacción en un solo compartimento mientras que los sistemas de translación compartimentalizada separan los componentes de reacción de translación de los productos de reacción que pueden inhibir la eficiencia de la translación. Tales sistemas de translación se encuentran comercialmente disponibles . Además, puede utilizarse un sistema acoplado de transcripción/translación. Los sistemas acoplados de transcripción/translación permiten la transcripción de un ADN de entrada en un ARNm correspondiente, que a su vez se traslada por los componentes de reacción. Un ejemplo de un sistema acoplado de transcripción/translación comercialmente disponible es el Rapid Translation System (RTS, Roche Inc.). El sistema incluye una mezcla que contiene lisado de E. coli para proporcionar componentes translacionales tales como ribosomas y factores de translación. Adicionalmente, la ARN polimerasa se incluye para la transcripción del ADN de entrada en una plantilla de ARNm para su uso en la translación. El RTS puede utilizar la compartimentalización de los componentes de reacción por medio de una membrana interpuesta entre los compartimentos de reacción, incluyendo un compartimento de suministro/desecho y un compartimento de transcripción/transiación. La aminoacilación del ARNt puede llevarse a cabo mediante otros agentes, incluyendo, pero sin limitarse a, transferasas, polimerasas, anticuerpos catalíticos, proteínas multifuncionales y lo similar.
Lu et al., en Mol. Cell. 2001 Oct; 8(4):759-69 describen un método en el cual una proteína se liga químicamente a un péptido sintético que contiene aminoácidos no naturales (ligación de proteína expresada). También se han utilizado técnicas de microinyección para incorporar aminoácidos no naturales en proteínas. Ver, e.g., M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C.G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty y H. A. Lester, Science, 268:439 (1995); y D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:645 (2000). Se co-inyectó un oocito Xenopus con dos especies de ARN elaboradas in vitro: un ARNm que codifica la proteína objetivo con un codón de paro UAG en la posición de aminoácido de interés y un ARNt de supresión ámbar aminoacilado con el aminoácido deseado. La maquinaria translacional del oocito inserta entonces el aminoácido no natural en la posición especificada por UAG. Este método ha permitido estudios in vivo de estructura-función de proteínas de membrana integral, que generalmente no son dóciles a sistemas de expresión in vitro. Los ejemplos incluyen la incorporación de un aminoácido fluorescente en un receptor taquinquinina neuroquinina-2 para medir las distancias mediante transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, ver, e.g., G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgeton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, M. Peitsch, J.
Knowles, H. Vogel, y A. Chollet, J. Biol. Chem., 271:19991 (1996); la incorporación de aminoácidos biotinilados para identificar residuos de superficie expuesta en canales de ion, ver, e.g., J. P. Gallivan, H. A. Lester y D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4:739 (1997); el uso de análogos de tirosina encerrados para monitorear los cambios conformacionales en un canal de ion en tiempo real, ver, e.g., J. C. Miller, S. K. Silvermam P. M. England, D. A. Dougherty y H. A. Lester, Neuron 20:619 (1998); y el uso de aminoácidos alfa hidroxi para cambiar las estructuras de canales de ion para probar sus mecanismos de puerta. Ver, e.g., P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty y H. A. Lester, Cell 96:89 (1999); y T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L., Y. Jan, P. G. Schultz y J. Yang, Nat. Neurosci., 4:239 (2001). La capacidad para incorporar aminoácidos no naturales directamente en proteínas in vivo ofrece una amplia variedad de ventajas incluyendo pero sin limitarse a, altos rendimientos de proteínas mutantes, facilidad técnica, el potencial para estudiar las proteínas mutantes en células o posiblemente en organismos vivos, y el uso de estas proteínas mutantes en tratamientos terapéuticos y usos diagnósticos. La capacidad para incluir aminoácidos no naturales con varios tamaños, acideces, nucleofilicidades, hidrofobicidades, y otras propiedades en proteínas, puede expandir grandemente nuestra capacidad para manipular racional y sistemáticamente las estructuras de las proteínas, tanto para probar la función de la proteína como para crear nuevas proteínas u organismos con nuevas propiedades. En un intento por incorporar de manera específica en el sitio, para-F-Phe, se utilizó un par de supresión ámbar de levadura ARNtPheCUA/fenilalanil-ARNt en una especie de Escherichia coli resistente a p-F-Phe, Phe auxotrópica. Ver, e.g., R. Furter, Protein Sci., 7:419 (1998). También puede ser posible obtener la expresión de un polinucleótido de GH, e.g., de hGH de la presente invención, utilizando un sistema translacional (in vivo) libre de células. Los sistemas de translación puede ser celulares o libres de células, y pueden ser procarióticos o eucarióticos. Los sistemas de translación celulares incluyen, pero no se limitan a, preparaciones de célula completa tales como células permeabilizadas o cultivos celulares en donde puede transcribirse una secuencia deseada de ácido nucleico a ARNm y el ARNm trasladado. Los sistemas de translación libres de células se encuentran comercialmente disponibles y muchos tipos y sistemas diferentes son muy conocidos. Ejemplos de sistemas libres de células incluyen, pero no se limitan a, lisados procarióticos tales como lisados de Escherichia coli, y lisados celulares tales como extractos de germen de trigo, lisados de célula de insecto, lisados de reticulocito de conejo, lisados de oocito de conejo y lisados de célula humana. Los extractos o lisados eucarióticos pueden preferirse cuando la proteína resultante es glicosilada, fosforilada o de otra manera modificada debido a que tales modificaciones son posibles solo en sistemas eucarióticos. Algunos de estos extractos y lisados se encuentran comercialmente disponibles (Promega; Madison, Wis.; Stratagene; La Jolla, Calif.; Amersham; Arlington Heights, 111.; GIBCO/BRL; Grand Island, N.Y). También se encuentran disponibles extractos membranosos, tales como los extractos pancreáticos caninos que contienen membranas microsomales, que son útiles para trasladar proteínas secretorias. En estos sistemas, que pueden incluir ya sea ARNm como plantilla (translación in vitro) o ADN como plantilla (transcripción y translación combinadas in vitro) , la síntesis in vitro se dirige por los ribosomas. Se ha aplicado un esfuerzo considerable al desarrollo de sistemas de expresión libres de proteínas. Ver, e.g., Kim, D. M. y J. R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74:309-316 (2001); Kim, D. M. y J. R. Swatrz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000); Kim, D. M. y J. R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); Kim, D. M. y J. R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering 66:180-188 (1999), y Patnaik, R. y J. R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868, (1998); Patente de E.U. NO. 6,337,191; Publicación de Patente de E.U. No. 2002/0081660; WO 00/55353; WO 90/05785, que se incorporan mediante la referencia en la presente. Otro procedimiento que puede aplicarse a la expresión de los polipéptidos de GH, e.g., de hGH que comprenden un aminoácido codificado de manera no natural incluye la técnica de fusión de ARNm-péptido. Ver, e.g., R. Roberts y J. Szostak, Proc. Nati. Acad. Sci., (EUA) 94:12297-12302 (1997); A. Frankel, et al., Chemistry & Biology 10:1043-1050 (2003). En este procedimiento, la plantilla de ARNm enlazada a puromicina se traduce en el péptido en la ribosoma. Si una o más moléculas de ARNt se ha modificado, los aminoácidos no naturales pueden incorporarse también en el péptido. Después de haber leído el último codón de ARNm, la puromicina captura la terminación C del péptido. Si se encuentra que el conjugado resultante de ARNm-péptido tiene propiedades interesantes en un análisis in vitro, su identidad puede revelarse fácilmente de la secuencia de ARNm. De esta manera, pueden visualizarse bibliotecas de polipéptidos de GH, e.g., de hGH que comprenden uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals para identificar polipéptidos que tienen las propiedades deseadas. Más recientemente, se han reportado translaciones in vitro con componentes purificados que permiten la síntesis de péptidos sustituidos con aminoácidos codificado de manera no naturals. Ver, e.g., A. Forster et al., Proc. Nati. Acad. Sci., (EUA) 100:6353 (2003).
También pueden utilizarse sistemas de translación reconstituidos. También se han utilizado con éxito mezclas de factores de translacón purificados para trasladar el ARNm en proteínas así como combinaciones de lisados o lisados complementados con factores de translación purificados tales como el factor-1 de iniciación (IF-1), IF-2, IF-3 (alfa o beta), factor de alargamiento T (EF-Tu) o factores de terminación. Los sistemas libres de células también pueden ser sistemas acoplados de transcripción/translación en donde el ADN se introduce al sistema, se transcribe en ARNm y el ARNm se traslada como se describe en Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., editores, Wiley Interscience, 1993), que se incorpora específicamente en la presente por la referencia. El ARN transcrito en el sistema de transcripción eucariótico puede encontrarse en forma de ARN heteronuclear (ARNhn) o tapas de extremo 5' (7-metil guanosina ( y ARNm maduro de extremo 3' poli A, que pueden ser una ventaja en ciertos sistemas de translación. Por ejemplo, los ARNms tapados se trasladas con alta eficiencia en el sistema de lisado de reticulocito. IX. Polímeros Macromoleculares Acoplados a Polipéptidos de GH, e.g., de hGH Pueden efectuarse diversas modificaciones a los polipéptidos de aminoácido no natural descritos en la presente utilizando las composiciones, métodos, técnicas y estrategias descritos en la presente. Estas modificaciones incluyen la incorporación de funcionalidad adicional en el componente de aminoácido no natural del polipéptido, incluyendo, pero sin limitarse a, una marca, un colorante, un polímero, un polímero soluble en agua, un derivado de polietilen glicol, un fotorreticulador, un radionúclido, un compuesto citotóxico, una droga, una marca de afinidad, una marca de fotoafinidad, un compuesto reactivo, una resina, una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un quelador de metal, un cofactor, un ácido graso, un carbohidrato, un polinucleótido, un ADN, un ARN, un polinucleótido de antisentido, un sacárido, dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un ácido ribonucleico inhibidor, un biomaterial, una nanopartícula, una marca giratoria, un fluoróforo, un residuo que contiene metal, un residuo radiactivo, un nuevo grupo funcional, un grupo que interactúa de manera covalente o no covalente con otras moléculas, un residuo fotoencerrado, un residuo excitable de radiación actínica, un residuo fotoisomerizable, biotina, un derivado de biotina, un análogo de biotina, un residuo que incorpora un átomo pesado, un grupo químicamente separable, un grupo foto separable, una cadena lateral alargada, un azúcar enlazado a carbono, un agente activo de reducción, un amino tioácido, un residuo tóxico, un residuo marcado de manera isotópica, una sonda biofísica, un grupo fosforescente, un grupo quimioluminiscente, un grupo denso de electrón, un grupo magnético, un grupo de intercalado, un cromóforo, un agente de transferencia de energía, un agente biológicamente activo, una marca detectable, una molécula pequeña, un punto cuántico, un nanotransmisor, un radionucleótido, un radiotransmisor, un agente de captura de neutrón, o cualquier combinación de los anteriores o cualquier otro compuesto o sustancia deseable. Como un ejemplo ilustrativo no limitante de las composiciones, métodos técnicas y estrategias descritos en la presente, la siguiente descripción se enfocará en agregar polímeros macromoleculares al polipéptido de aminoácido no natural en el entendimiento de que las composiciones, métodos, técnicas y estrategias descritas en la misma también son aplicables (con las modificaciones apropiadas, si es necesario y por las cuales el experto en la técnica podría elaborarlas con la descripción en la presente) para agregar otras funcionalidades incluyendo pero sin limitarse a las listadas anteriormente. Una amplia variedad de polímeros macromoleculares y otras moléculas pueden enlazarse a los polipéptidos de GH, e.g., de hGH de la presente invención para modular las propiedades biológicas del polipéptido de GH, e.g., de hGH, y/o proporcionar nuevas propiedades biológicas a la molécula de GH, e.g., de hGH. Estos polímeros macromoleculares pueden enlazarse al polipéptido de GH, e.g., de hGH a través de un aminoácido naturalmente codificado, mediante un aminoácido codificado de manera no natural o un sustituyente funcional de un aminoácido natural o no natural, o cualquier sustituyente o grupo funcional agregado a un aminoácido natural o no natural. El peso molecular del polímero puede ser de un amplio rango, incluyendo pero sin limitarse a, entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular del polímero puede encontrarse entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da, incluyendo, pero sin limitarse a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, y 100 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero se encuentra entre aproximadamente 100 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero se encuentra entre aproximadamente 100 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero se encuentra entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero se encuentra entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero se encuentra entre aproximadamente 10,000 Da y 40,000 Da. La presente invención proporciona preparaciones sustancialmente homogéneas de conjugados de polímero: proteína . "Sustancialmente homogéneas" como se utiliza en la presente, significa que se ha observado que las moléculas de conjugados de polímero :proteína son más grandes que la mitad de la proteína total. El conjugado de polímero : proteína tiene una actividad biológica y las preparaciones Pegiladas "sustancialmente homogéneas" de polipéptido de GH, e.g., de hGH en la presente, son aquellas que son suficientemente homogéneas para desplegar las ventajas de una preparación homogénea, e.g., facilidad en la aplicación clínica en la capacidad de predecir lot o farmacocinéticos lot. Puede seleccionarse preparar la mezcla de moléculas de conjugados de polímero :proteína y la ventaja que se proporciona en la presente es que puede seleccionarse la proporción del conjugado de mono-polímero:proteína para incluir en la mezcla. Por consiguiente, si se desea, puede prepararse una mezcla de varias proteínas con varios números de residuos de polímero unidos (i.e., di-, tri-, tetra-, etc.) y combinar dichos conjugados con el conjugado de mono-polímero :proteína preparado utilizando los métodos de la presente invención, y tener una mezcla con una proporción predeterminada de conjugados de mono-polímero :proteína . El polímero seleccionado puede ser soluble en agua a fin de que la proteína a la cual se encuentra unido, no se precipite en un ambiente acuoso, tal como un ambiente fisiológico. El polímero puede ser ramificado o ramificado. Para uso terapéutico de la preparación del producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de polímeros incluyen, pero no se limitan a polialquil éteres y sus análogos tapados con alcoxi (e.g., polioxietilen glicol, polioxietileno/propileno glicol y sus análogos tapados con metoxi o etoxi, especialmente polioxietilen glicol, este último también conocido como polietilenoglicol o PEG) ; polivinilpirrolidonas; polivinilalquil éteres; polioxazolinas, polialquil oxazolinas y polihidroxialquil oxazolinas; poliacrilamidas, polialquil acrilamidas y polihidroxialquil acrilamidas (e.g., polihidroxipropilmetacrilamida y sus derivados); polihidroxialquil acrilatos; ácidos polisiálicos y sus análogos; secuencias de péptido hidrófilo; polisacáridos y sus derivados, incluyendo dextrano y derivados dextrano, e.g., carboximetildextrano, dextrano sulfatos, aminodextrano; celulosa y sus derivados, e.g., carboximetil celulosa, hidroxialquil celulosas; quitina y sus derivados, e.g., quitosán, succinil quitosán, carboximetilquitín, carboximetilquitosán; ácido hialurónico y sus derivados; almidones; alginatos; condroitina, sulfato; albúmina; pululan y carboximetil pululan; poliaminoácidos y sus derivados, e.g., ácidos poliglutámicos, polilisinas, ácidos poliaspárticos, poliaspartamidas; copolímeros de anhídrido maleico tales como: copolímero de estireno de anhídrido maleico, copolímero de diviniletil éter de anhídrido maleico; alcoholes polivinílicos; sus copolímeros; sus terpolímeros; mezclas de los mismos y derivados de los anteriores. La proporción de moléculas de polietilen glicol a moléculas de proteína variará, así como sus concentraciones en la mezcla de reacción. En general, la relación óptima (en términos de eficiencia de reacción en las que existe un mínimo exceso de proteína o polímero sin reactivar) puede determinarse por el peso molecular del polietilen glicol seleccionado y del número de grupos reactivos disponibles. En cuanto se refiere al peso molecular, típicamente el peso molecular más alto del polímero, el número más pequeño de moléculas de polímeros que puede unirse a la proteína. De manera similar, la ramificación del polímero debe tomarse en cuenta al optimizar estos parámetros. Generalmente, entre mayor es el peso molecular (o mayores ramificaciones) mayor es la proporción de polímero :proteína . Como se utiliza en la presente, y al contemplar los conjugados de PEG:polipéptido de GH, e.g., de hGH, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad que da el beneficio deseado a un paciente. La cantidad variará de un individuo a otro y dependerá de un número de factores, incluyendo, la condición física general del paciente y la causa subyacente de la condición que va a tratarse. La cantidad de polipéptido de GH, e.g., de hGH utilizada para terapia da una relación aceptable de cambio y mantiene la respuesta deseada a un nivel benéfico. Una cantidad terapéuticamente efectiva de las presentes composiciones puede establecerse fácilmente por el de experiencia ordinaria en la técnica utilizando materiales y procedimientos públicamente disponibles. El polímero soluble en agua puede ser cualquier forma estructural incluyendo, pero sin limitarse a lineal, en tridente o ramificado. Típicamente, el polímero soluble en agua es un poli (alquileno glicol), tal como poli (etilen glicol) (PEG), pero también pueden emplearse otros polímeros solubles en agua. A modo de ejemplo, PEG se utiliza para describir ciertas modalidades de esta invención. PEG es un polímero muy conocido soluble en agua que se encuentra comercialmente disponible o puede prepararse mediante polimerización de abertura de anillo de etilen glicol de acuerdo con métodos conocidos por los de experiencia ordinaria en la tñecnica (Sandler y Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3 páginas 138-161). El término "PEG" se utiliza ampliamente para abarcar cualquier molécula de polietilen glicol, sin tener en cuenta el tamaño o la modificación en un extremo del PEG, y puede representarse enlazado al polipéptido de GH, e.g., de hGH mediante la fórmula: XO-(CH2CH2?)n-CH2CH2-Y en donde n es de 2 a 10,000 y X es H o una modificación de terminal, incluyendo, pero sin limitarse a, alquilo C?_4, un grupo protector o un grupo funcional terminal. En algunos casos, un PEG utilizado en la invención, termina en un extremo con hidroxi o metoxi, i.e., X es H o CH3 ("PEG metoxi"). Alternativamente, el PEG puede terminar con un grupo reactivo, formando así un polímero bifuncional. Los grupos reactivos típicos pueden incluir aquellos grupos reactivos que se utilizan comúnmente para reaccionar con los grupos funcionales encontrados en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo, pero sin limitarse a, grupos maleimida, carbonatos activados (incluyendo, pero sin limitarse a, p-nitrofenil éster), esteres activados (incluyendo, pero sin limitarse a, N-hidroxisuccinimida, p-nitrofenil éster) y aldehidos) así como grupos funcionales que son inertes a los 20 aminoácidos comunes pero que reaccionan específicamente con grupos funcionales complementarios presentes en aminoácidos codificado de manera no naturals (incluyendo, pero sin limitarse a, grupos azida, grupos alquino) . Se anota que el otro extremo del PEG, que se muestra en la fórmula anterior por Y, se unirá ya sea directa o indirectamente a un polipéptido de GH, e.g., de hGH a través de un aminoácido de origen natural o codificado de manera no natural. Por ejemplo, Y puede ser un enlace amida, carbamato o urea a un grupo amino (incluyendo pero sin limitarse a, la amina épsilon de lisina o la terminación N) del polipéptido. Alternativamente, Y puede ser un enlace maleimida a un grupo tiol (incluyendo, pero sin limitarse a, el grupo tiol de cisteína) . Alternativamente, Y puede ser un enlace a un residuo no comúnmente accesible a través de los 20 aminoácidos comunes. Por ejemplo, un grupo azida en el PEG puede reactivarse con un grupo alquino en el polipéptido de GH, e.g., de hGH para formar un producto de cicloadición Huisgen [3+2]. Alternativamente, un grupo alquino en el PEG puede reactivarse con un grupo azida presente en un aminoácido codificado de manera no natural para formar un producto similar. En algunas modalidades, un nucleófilo fuerte (incluyendo, pero sin limitarse a, hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, semicarbazida) puede reactivarse con un grupo aldehido o cetona presente en un aminoácido codificado de manera no natural para formar una hidrazona, oxima o semicarbazona, según sea aplicable, que en algunos casos puede reducirse adicionalmente mediante tratamiento con un agente de reducción apropiado. Alternativamente, el nucleófilo fuerte puede incorporarse en el polipéptido de GH, e.g., de hGH a través de un aminoácido codificado de manera no natural y utilizarse para reaccionar preferentemente con un grupo cetona o aldehido presente en el polímero soluble en agua . Puede utilizarse cualquier masa molecular para un PEG según se desee en la práctica, incluyendo, pero sin limitarse a, de aproximadamente 100 Daltons (Da) a 100,000 Da o más según se desee (incluyendo, pero sin limitarse a, algunas veces 0.1-50 kDa o 10,40 kDa). El peso molecular de PEG puede ser de un amplio rango incluyendo, pero sin limitarse a, entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular del PEG puede encontrarse entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da, incluyendo, pero sin limitarse a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, y 100 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG se encuentra entre aproximadamente 100 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG se encuentra entre aproximadamente 100 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG se encuentra entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG se encuentra entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG se encuentra entre aproximadamente 10,000 Da y 40,000 Da. También pueden utilizarse PEGs de cadena ramificada, incluyendo, pero sin limitarse a, moléculas de PEG teniendo cada cadena un MW variando de 1-100 kDa (Incluyendo, pero sin limitarse a, 1-50 kDa o 5-20 kDa) . El peso molecular de cada cadena del PEG de cadena ramificada puede ser, incluyendo, pero sin limitarse a, entre aproximadamente 1,000 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular de cada cadena del PEG de cadena ramificada puede encontrarse entre aproximadamente 1,000 Da y aproximadamente 100,000 Da, incluyendo, pero sin limitarse a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, y 1,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena del PEG de cadena ramificada se encuentra entre aproximadamente 1,000 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena del PEG de cadena ramificada se encuentra entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena del PEG de cadena ramificada se encuentra entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena del PEG de cadena ramificada se encuentra entre aproximadamente 5, 000 Da y 20,000 Da. Un amplio rango de moléculas de PEG se describe en, incluyendo, pero sin limitarse a, el catálogo Shearwater Polymers, Inc., el catálogo Nektar Therapeutics, incorporados en la presente por la referencia. Generalmente, al menos una terminación de la molécula de PEG se encuentra disponible para la reacción con el aminoácido codificado de manera no natural. Por ejemplo, los derivados de PEG que contienen residuos alquino y azida para la reacción con cadenas laterales de aminoácido, pueden utilizarse para unir PEG a aminoácidos codificado de manera no naturals como se describe en la presente. Si el aminoácido codificado de manera no natural comprende un azida, entonces el PEG contendrá típicamente un residuo alquino para efectuar la formación del producto de cicloadición [3+2] o una especie de PEG activado (i.e., éster, carbonato) conteniendo un grupo fosfma para efectuar la formación del enlace amida. Alternativamente, si el aminoácido codificado de manera no natural comprende un alquino, entonces el PEG contendrá típicamente un residuo azida para efectuar la formación del producto de cicloadición Huisgen [3+2]. Si el aminoácido codificado de manera no natural comprende un grupo carbonilo, el PEG contendrá típicamente un potente nucleófilo (incluyendo, pero sin limitarse a una funcionalidad hidrazida, hidrazina, hidroxilamina o semicarbazida) a fin de efectuar la formación de los enlaces hidrazona, oxima y semicarbazona correspondientes, respectivamente. En otras alternativas, puede utilizarse una reversa de la orientación de los grupos reactivos descritos anteriormente, i.e., un residuo azida en el aminoácido codificado de manera no natural, puede reactivarse con un derivado de PEG conteniendo un alquino. EN algunas modalidades, la variante del polipéptido de GH, e.g., de hGH con un derivado de PEG contiene una funcionalidad química reactiva con la funcionalidad química presente en la cadena lateral del aminoácido codificado de manera no natural. La invención proporciona en algunas modalidades, derivados de polímero que contiene azida y acetileno, que comprenden una estructura de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da. La estructura de polímero del polímero soluble en agua puede ser poli (etilen glicol). Sin embargo, debe entenderse que también son adecuados una amplia variedad de polímeros solubles en agua, incluyendo, pero sin limitarse a poli (etilen glicol) y otros polímeros relacionados incluyendo poli (dextrano) y poli (propileno glicol), para uso en la práctica de la invención y que el uso del término PEG o poli (etilen glicol) pretende abarcar e incluir todas esas moléculas. El término PEG incluye, pero no se limita a, poli (etilen glicol) en cualquiera de sus formas, incluyendo PEG bifuncional, PEG nultibrazos, PEG derivatizado, PEG de tridente, PEG ramificado, PEG pendiente (i.e., PEG o polímeros relacionados que tienen uno o más grupos funcionales pendientes a la estructura de polímero) o PEG con enlaces degradables en el mismo. El PEG es típicamente claro, incoloro, inodoro, soluble en agua, estable al calor, inerte a muchos agentes químicos, no se hidroliza o deteriora, y es generalmente no tóxico. Poli (etilen glicol) se considera biocompatible, es decir que el PEG es capaz de coexistir con tejidos u organismos vivos sin ocasionar daño. Más específicamente, el PEG es sustancialmente no inmunogénico, es decir que el PEG no tiende a producir una respuesta inmune en el cuerpo. Cuando se une a una molécula que tiene una función deseable en el cuerpo, tal como un agente biológicamente activo, el PEG tiende a enmascarar el agente y puede reducir o eliminar cualquier respuesta inmune de manera que un organismo puede tolerar la presencia del agente. Los conjugados de PEG tienden a no producir una respuesta inmune sustancial u ocasionar recubrimiento u otros efectos indeseables. El PEG que tiene la fórmula -CH2CH20-(CH2CH2?) n-CH2CH2—, en donde n es de aproximadamente 3 a aproximadamente 4,000, típicamente de aproximadamente 20 a aproximadamente 2000, es adecuado para su uso en la presente invención. El PEG que tiene un peso molecular de desde aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da es, en algunas modalidades de la presente invención, particularmente útil como estructura del polímero. El peso molecular de PEG puede ser de un amplio rango, incluyendo, pero sin limitarse a, entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular del PEG puede encontrarse entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da, incluyendo, pero sin limitarse a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, y 100 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG se encuentra entre aproximadamente 100 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG se encuentra entre aproximadamente 100 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG se encuentra entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG se encuentra entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG se encuentra entre aproximadamente 10,000 Da y 40,000 Da. La estructura del polímero puede ser lineal o ramificada. Las estructuras ramificadas de polímero son generalmente conocidas en la técnica. Típicamente, un polímero ramificado tiene un residuo núcleo de rama central y una pluralidad de cadenas de polímero lineal enlazadas al núcleo de rama central. PEG se utiliza comúnmente en formas ramificadas que pueden prepararse mediante la adición de óxido de etileno a varios polioles, tales como glicerol, oligómeros de glicerol, pentaeritritol y sorbitol. El residuo de rama central también puede derivarse de varios aminoácidos tales como lisina. El poli (etilen glicol) ramificado puede representarse en forma general como R(-PEG-OH)ra en el cual R se deriva de un residuo núcleo, tal como glicerol, oligómeros de glicerol o pentaeritritol, y m representa el número de brazos. Las moléculas de PEG multibrazos, tales como las descritas en las Patentes de E.U. Nos. 5,932,462; 5,643,575; 5,229,490; 4,289,872; Solicitud de Patente de E.U. 2003/0143596; WO 96/21469; y WO 93/21259, cada una de las cuales se incorpora por la referencia en la presente en su totalidad, también pueden utilizarse como la estructura de polímero. El PEG ramificado también puede encontrarse en forma de un PEG de tridente representado por PEG (--YCHZ2) n en donde Y es un grupo de enlace y Z es un grupo terminal activado enlazado a CH por medio de una cadena de átomos de longitud definida. Aún otra forma ramificada, el PEG pendiente, tiene grupos reactivos, tales como carboxilo, a lo largo de la estructura de PEG en lugar de al final de las cadenas de PEG. Además de estas formas de PEG, el polímero también puede prepararse con enlaces débiles o degradables en la estructura. Por ejemplo, PEG puede prepararse con enlaces éster en la estructura del polímero que se encuentran sujetos a hidrólisis. Como se muestra bajo, esta hidrólisis da como resultado la separación del polímero en fragmentos de menor peso molecular: -PEG-C02-PEG-+H20 ? PEG-C02H+HO-PEG- Se entiende por los de experiencia ordinaria en la técnica que el término poli (etilen glicol) o PEG representa o incluye todas las formas conocidas en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a aquellas descritas en la presente. Muchos otros polímeros son adecuados también para su uso en la presente invención. En algunas modalidades, las estructuras de polímero que son solubles en agua, con de 2 a aproximadamente 300 terminaciones, son particularmente útiles en la invención. Ejemplos de polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, otros poli (alquileno glicoles), tales como poli (propileno glicol) ("PPG"), sus copolímeros (incluyendo, pero sin limitarse a copolímeros de etilen glicol y propileno glicol), sus terpolímeros, sus mezclas y lo similar. Aunque el peso molecular de cada cadena de la estructura del polímero puede variar, se encuentra típicamente en el rango de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100, 000 Da, frecuentemente de aproximadamente 6,000 Da a aproximadamente 80,000 Da. El peso molecular de cada cadena de la estructura del polímero puede encontrarse entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da, incluyendo, pero sin limitarse a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, y 100 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena de la estructura del polímero se encuentra entre aproximadamente 100 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena de la estructura del polímero se encuentra entre aproximadamente 100 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena de la estructura del polímero se encuentra entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena de la estructura del polímero se encuentra entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena de la estructura del polímero se encuentra entre aproximadamente 10,000 Da y 40, 000 Da. Los de experiencia ordinaria en la técnica reconocerán que la lista anterior para estructuras sustancialmente solubles en agua de ninguna manera es exhaustiva y es meramente ilustrativa, y que todos los materiales poliméricos que tienen las cualidades antes descritas se contemplan como adecuadas para su uso en la presente invención. En algunas modalidades de la presente invención,' los derivados del polímero son "multifuncionales" lo que significa que la estructura del polímero tiene al menos dos terminaciones y posiblemente tantas como aproximadamente 300 terminaciones, funcionalizadas o activadas con un grupo funcional. Los derivados de polímero multifuncionales, incluyen, pero no se limitan a, polímeros lineales que tienen dos terminaciones, encontrándose unida cada terminación a un grupo funcional que puede ser el mismo o diferente. En una modalidad, el derivado de polímero tiene la estructura : X-A-POLY-B-N=N=N en donde: N=N=N es un residuo azida; B es un residuo de enlace, que puede encontrarse presente o ausente; POLY es un polímero no antigénico soluble en agua; A es un residuo de enlace, que puede encontrarse presente o ausente y que puede ser el mismo que B o diferente; y X es un segundo grupo funcional. Ejemplos de un residuo de enlace para A y B incluyen, pero no se limitan a, un grupo alquilo múltiple funcionalizado que contiene hasta 18, y puede contener entre 1-10 átomos de carbono. Puede incluirse un heteroátomo tal como nitrógeno, oxígeno o azufre con la cadena alquilo. La cadena alquilo también puede ser ramificada en un heteroátomo. Otros ejemplos de un residuo de enlace para A y B incluyen, pero no se limitan a, un grupo arilo múltiple funcionalizado, que contiene hasta 10 y puede contener 5-6 átomos de carbono. El grupo arilo puede sustituirse con uno o más átomos de carbono, nitrógeno, oxígeno o azufre. Otros ejemplos de grupos de enlace adecuados incluyen aquellos grupos de enlace descritos en las Patentes de E.U. Nos. 5,932,462; 5,643,575 y Publicación de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0143596, cada una de las cuales se incorpora por la referencia en la presente. Los de experiencia ordinaria en la técnica reconocerán que la lista anterior de residuos de enlace de ninguna manera es exhaustiva y es meramente ilustrativa, y que todos los residuos de enlace que tienen las cualidades antes descritas se contemplan como adecuados para su uso en la presente invención. Ejemplos de grupos funcionales adecuados para su uso como X, incluyen, pero no se limitan a, hidroxilo, hidroxilo protegido, alcoxilo, éster activo, tal como esteres de N-hidroxisuccinimidil y 1-benzotriazolil esteres, carbonato activo, tal como N-hidroxisuccinimidil carbonatos y 1-benzotriazolil carbonatos, acetal, aldehido, hidratos de aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, glioxalos, dionas, mesilatos, tosilatos, tresilato, alqueno, cetona y azida. Como se entiende por los de experiencia ordinaria en la técnica, el residuo X seleccionado debe ser compatible con el grupo azida a fin de que no ocurra la reacción con el grupo azida. Los derivados de polímero que contienen azida pueden ser homobifuncionales, lo que significa que el segundo grupo funcional (i.e., X) es también un residuo azida, o heterobifuncionales, lo que significa que el segundo grupo funcional es un grupo funcional diferente. El término "protegido" se refiere a la presencia de un grupo o residuo protector que evita la reacción del grupo funcional químicamente reactivo bajo ciertas condiciones. El grupo protector variará dependiendo del tipo de grupo químicamente reactivo que se protege. Por ejemplo, si el grupo químicamente reactivo es una amina o hidrazida, el grupo protector puede seleccionarse del grupo de ter-butiloxicarbonilo (t-Boc) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) . Si el grupo químicamente reactivo es un tiol, el grupo protector puede ser ortopiridildisulfuro. Si el grupo químicamente reactivo es un ácido carboxílico, tal como ácido butanoico o propiónico, o un grupo hidroxilo, el grupo protector puede ser bencilo o un grupo alquilo tal como metilo, etilo, o ter-butilo. Otros grupos protectores conocidos en la técnica también pueden utilizarse en la presente invención. Ejemplos específicos de grupos funcionales terminales en la literatura incluyen, pero no se limitan a, N-succinimidil carbonato (ver, e.g., Patentes de E.U. Nos. 5,281,698, 5,468,478), amina (ver, e.g., Buckmann et al., Makromol. Chem., 182:1379 (1981); Zalipsky et al., Eur. Polym., J. 19:1177 (1983)), hidrazida (ver, e.g., Andresz et al., Makromol. Chem. 179:301 (1978)), succinimidilo propionato y succinimidilo butanoato (ver, e.g., Olson et al., en Poly (ethilene glycol) Chemistry & Biologícal Applications, pp 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D. C, 1997; ver también Pat. de E.U. Nos. 5,672,662), succinimidil succinato (ver, e.g., Abuchowski et al., Cáncer Biochem. Biophys., 7:175 (1984) y Joppich et al., Makromol. Chem. 180:1381 (1979), succinimidil éster (ver, e.g., Pat. de E.U. No. 4,670,417), benzotriazolo carbonato (ver e.g., Pat. de E.U. No. 5,650,234), glicidil éster (ver, e.g., Pitha et al., Eur. J. Biochem., 94:11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991), oxicarbonilimidazolo (ver, e.g., Beauchamp et al., Anal. Biochem., 131:25 (1983), Tondelli et al., J. Controlled Reléase 1:251 (1985)), p-nitrofenil carbonato (ver, e.g., Veronese et al., Appl. Biochem. Biotech., 11:141 (1985); y Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991), aldehido (ver, e.g., Harris et al., J. Polym. Sci. Chem. Ed . 22:341 (1984), Pat. de E.U. No. 5,824,784, Pat. de E.U. No. 5,252,714)), maleimido (ver, e.g., Goodson et al., Biotechnology (NY) 8:343 (1990), Romani et al., en Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)), y Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)), ortopiridil-disulfuro (ver, e.g., Woghiren et al., Bioconj. Chem., 4:314 (1993)), acrilol (ver, e.g., Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993)), vinilsulfone (ver, e.g., Pat. de E.U. No. 5,900,461). Todas las referencias y patentes anteriores se incorporan en la presente por la referencia. En ciertas modalidades de la presente invención, los derivados de polímero de la invención comprenden una estructura de polímero que tienen la estructura: X-CH2CH20- (CH2CH20) n-CH2CH2-N=N=N en donde : X es un grupo funcional como se describió anteriormente; y n es de aproximadamente 20 a aproximadamente 4000. En otra modalidad, los derivados de polímero de la invención comprenden una estructura de polímero que tienen la estructura : X-CH2CH2?-(CH2CH2?)n-CH2CH2-0- (CH2 ) m-W-N=N=N en donde: W es un residuo de enlace alifático o aromático que comprende entre 1-10 átomos de carbono; n es de aproximadamente 20 a aproximadamente 4000; y X es un grupo funcional como se describió anteriormente. m es de entre 1 y 10. Los derivados de PEG que contienen azida de la invención, pueden prepararse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica y/o descritos en la presente. En un método, mostrado abajo, una estructura de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, teniendo la estructura de polímero una primera terminación unida a un primer grupo funcional y una segunda terminación unida a un grupo de salida adecuado, se reactiva con un anión azida (que puede formar pares con cualquiera de un número de contra iones adecuados, incluyendo, sodio, potasio, ter-butilamonio y así sucesivamente) . El grupo de salida experimenta un desplazamiento nucleofílico y se reemplaza por el residuo azida, produciendo el polímero PEG que contiene azida, deseado . X-PEG-L + N3 ? X-PEG-N3 Como se muestra, una estructura de polímero adecuada para su uso en la presente invención, tiene la fórmula X-PEG-L, en donde PEG es poli (etilen glicol) y X es un grupo funcional que no reacciona con grupos azida y L es un grupo de salida adecuado. Ejemplos de grupos funcionales adecuados, incluyen, pero no se limitan a, hidroxilo, hidroxilo protegido, acetal, alquenilo, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, maleimido, ditiopiridina y vinilpiridina y cetona. Ejemplos de grupos de salida adecuados incluyen, pero no se limitan a, cloruro, bromuro, yoduro, mesilato, tresilato y tosilato. En otro método para la preparación de los derivados de polímero que contienen azida de la presente invención, se pone en contacto un agente de enlace que contiene una funcionalidad azida con una estructura de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, en donde el agente de enlace contiene una funcionalidad química que reaccionará selectivamente con una funcionalidad química en el polímero de PEG, para formar un producto de derivado de polímero que contiene azida en donde la azida se separa de la estructura de polímero mediante un grupo de enlace. Un esquema de reacción ejemplar se muestra abajo: X-PEG-M+N-enlazador-N=N=N?PG-X-PEG-enlazador-N=N=N en donde: PEG es poli (etilen glicol) y X es un grupo de tapa tal como alcoxi o un grupo funcional como se describió anteriormente; y M es un grupo funcional que es no reactivo con la funcionalidad azida pero que reaccionará eficiente y selectivamente con el grupo N funcional. Ejemplos de grupos funcionales adecuados incluyen, pero no s-e limitan a, siendo M un ácido carboxílico, carbonato o un éster activo si N es una amina; siendo M una cetona si N es un residuo hidrazida o aminooxi; siendo M un grupo de salida su N es un nucleófilo. La purificación del producto crudo puede lograrse por métodos conocidos incluyendo, pero sin limitarse a, precipitación del producto seguido por cromatografía, si es necesario . Un ejemplo más específico se muestra abajo en el caso de diamina de PEG, en el cual uno de los aminos se encuentra protegido por un residuo del grupo protector tal como ter-butil-Boc y la diamina de PEG mono protegida resultante se reactiva con un residuo de enlace que contiene la funcionalidad azida: BOCHN-PEG-NH2+H02C- (CH2) 3-N=N=N En este caso, el grupo amino puede acoplarse al grupo de ácido carboxílico utilizando una variedad de agentes de activación tales como tionil cloruro o reactivos carbodiimida y N-hidroxisuccinimida o N-hidroxibenzotriazolo para crear una unión amido entre el derivado de PEG monoamino y el residuo de enlace que contiene azida. Después de la exitosa formación de la unión amido, el derivado de N-ter-butil-Boc-protegido que contiene azida puede utilizarse directamente para modificar moléculas bioactivas o puede elaborarse adicionalmente para instalar otros grupos funcionales útiles. Por ejemplo, el grupo N-t-Boc puede hidrolizarse mediante tratamiento con ácido fuerte para generar un omega-amino-PEG-azida . El amino resultante puede utilizarse como un asa sintética para instalar otra funcionalidad útil tal como grupos maleimido, disulfuros activados, esteres activados y así sucesivamente para la creación de valiosos reactivos heterobifuncionales. Los derivados heterobifuncionales son particularmente útiles cuando se desea unir diferentes moléculas a cada terminación del polímero. Por ejemplo, el PEG omega-N-amino-N-azido permitiría la unión de una molécula que tiene un grupo electrofílico activado, tal como un aldehñido, cetona, éster activado, carbonato activado y así sucesivamente, a una terminación del PEG y una molécula que tiene un grupo acetileno, a la otra terminación del PEG. En otra modalidad de la invención, el derivado de polímero tiene la estructura: X-A-POLY-B-C=C-R en donde: R puede ser ya sea H, o un grupo alquilo, alquileno, o arilo o arilo sustituido; B es un residuo de enlace, que puede encontrarse presente o ausente; POLY es un polímero no antigénico soluble en agua; A es un residuo de enlace, que puede encontrarse presente o ausente y que puede ser el mismo que B o diferente; y X es un segundo grupo funcional. Ejemplos de un residuo de enlace para A y B incluyen, pero no se limitan a, un grupo alquilo múltiple funcionalizado que contiene hasta 18, y puede contener entre 1-10 átomos de carbono. Puede incluirse un heteroátomo tal como nitrógeno, oxígeno o azufre con la cadena alquilo. La cadena alquilo puede encontrarse también ramificada en un heteroátomo. Otros ejemplos de un residuo de enlace para A y B incluyen, pero no se limitan a, un grupo arilo múltiple funcionalizado, que contiene hasta 10 y puede contener 5-6 átomos de carbono. El grupo arilo puede sustituirse con uno o más átomos de carbono, nitrógeno, oxígeno o azufre. Otros ejemplos de grupos de enlace adecuados incluyen aquellos grupos de enlace descritos en las Patentes de E.U. Nos. 5,932,462; 5,643,575 y Publicación de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0143596, cada una de las cuales se incorpora por la referencia en la presente. Los de experiencia ordinaria en la técnica reconocerán que la lista anterior de residuos de enlace de ninguna manera es exhaustiva y es meramente ilustrativa, y que una amplia variedad de residuos de enlace que tienen las cualidades antes descritas se contemplan como útiles para su uso en la presente invención. Ejemplos de grupos funcionales adecuados para su uso como X, incluyen, pero no se limitan a, hidroxilo, hidroxilo protegido, alcoxilo, éster activo, tal como esteres de N-hidroxisuccinimidil y 1-benzotriazolil esteres, carbonato activo, tal como N-hidroxisuccinimidil carbonatos y 1-benzotriazolil carbonatos, acetal, aldehido, hidratos de aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, glioxalos, dionas, mesilatos, tosilatos y tresilato, alqueno, cetona y acetileno. Como se entiende, el residuo X seleccionado debe ser compatible con el grupo acetileno a fin de que no ocurra la reacción con el grupo acetileno. Los derivados de polímero que contienen acetileno pueden ser homobifuncionales, lo que significa que el segundo grupo funcional (i.e., X) es también un residuo acetileno, o heterobifuncionales, lo que significa que el segundo grupo funcional es un grupo funcional diferente. En otra modalidad de la presente invención, los derivados de polímero comprenden una estructura de polímero que tiene la estructura: X-CH2CH2?-(CH2CH2?)n-CH2CH2-0- (CH2)m-C=CH en donde : X es un grupo funcional como se describió anteriormente; n es de aproximadamente 20 a aproximadamente 4000; y m es de entre 1 y 10. Se muestran abajo ejemplos específicos de cada uno de los polímero PEG heterobufuncionales . Los derivados de PEG que contienen acetileno de la invención, pueden prepararse utilizando métodos conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica y/o descritos en la presente. En un método, una estructura de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, teniendo la estructura de polímero una primera terminación unida a un primer grupo funcional y una segunda terminación unida a un grupo nucleofílico adecuado, se reactiva con un compuesto que contiene tanto una funcionalidad acetileno como un grupo de salida adecuado para la reacción con el grupo nucleofílico en el PEG. Cuando se combinan el polímero de PEG que contiene el residuo nucleofílico y la molécula que contiene el grupo de salida el grupo de salida experimenta un desplazamiento nucleofílico y se reemplaza por el residuo nucleofílico, produciendo el polímero que contiene acetileno deseado. X-PEG-Nu + L-A-C - X-PEG-Un-A-C=CR' Como se muestra, una estructura de polímero preferida para su uso en la reacción, tiene la fórmula X-PEG-Nu, en donde PEG es poli (etilen glicol), Nu es un residuo nucleofílico y X es un grupo funcional que no reacciona con Nu, L o la funcionalidad acetileno. Ejemplos de Nu incluyen, pero sin limitarse a, amina, alcoxi, ariloxi, sulfhidrilo, imino, carboxilato, hidrazida, grupos aminoxi que reaccionarían principalmente a través de un mecanismo tipo SN2. Ejemplos adicionales de grupos Nu incluyen aquellos grupos funcionales que reaccionarían principalmente a través de una reacción de adición nucleofílica. Ejemplos de grupos L incluyen, cloruro, bromuro, yoduro, mesilato, tresilato, y tosilato y otros grupos que se espera experimenten un desplazamiento nucleofílico así como cetonas, aldehidos, tioésteres, olefinas, grupos carbonilo alfa-beta insaturados, carbonatos y otros grupos electrofílicos que se espera experimenten adición mediante nucleófilos. En otra modalidad de la presente invención, A es un enlazador alifético de entre 1-10 átomos de carbono o un anillo arilo sustituido de entre 6-14 átomos de carbono. X es un grupo funcional que no reacciona con grupos azida y L es un grupo de salida adecuado. En otro método para la preparación de derivados de polímero que contienen acetileno de la invención, un polímero de PEG que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, que contiene ya sea un grupo funcional protegido o un agente de tapa en una terminación y un grupo de salida adecuado en la otra terminación, se pone en contacto mediante un anión acetileno . Se muestra abajo un esquema de reacción ejemplar: X-PEG-L + -C=CR' -> X-PEG-C=CR' en donde : PEG es poli (etilen glicol) y X es un grupo de tapa tal como alcoxi o un grupo funcional como se describió anteriormente; y R' es ya sea H, un grupo alquilo, alcoxi, arilo o ariloxi o un grupo alquilo sustituido, alcoxilo, arilo o ariloxi. En el ejemplo anterior, el grupo de salida L debe ser suficientemente reactivo para experimentar un desplazamiento de tipo SN2 cuando se pone en contacto con una concentración suficiente del anión acetileno. Las condiciones de reacción requeridas para lograr el desplazamiento SN2 de los grupos de salida mediante aniones acetileno, son conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. La purificación del producto crudo puede lograrse comúnmente mediante métodos conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, precipitación del producto seguido por cromatografía, si es necesario. Los polímeros solubles en agua pueden enlazarse a los polipéptidos GH, e.g., de hGH de la invención. Los polímeros solubles en agua pueden enlazarse a través de un aminoácido codificado de manera no natural incorporado en el polipéptido de GH, e.g., de hGH o cualquier grupo funcional o sustituyente de un aminoácido codificado de manera no natural o naturalmente codificado, o cualquier grupo funcional o sustituyente agregado a un aminoácido codificado de manera no natural o naturalmente codificado. Alternativamente, los polímeros solubles en agua se encuentran enlazados a un polipéptido de GH, e.g., de hGH que incorpora un aminoácido codificado de manera no natural a través de un aminoácido de origen natural (incluyendo, pero sin limitarse a cisteína, lisina o el grupo amina del residuo de terminación N) . En algunos casos, los polipéptidos de GH, e.g., de hGH de la invención comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 aminoácidos no naturales, en donde uno o más de los aminoácidos codificado de manera no naturals se encuentran enlazados a polímeros solubles en agua (incluyendo, pero sin limitarse a PEG y/O oligosacáridos) . En algunos casos, los polipéptidos de GH, e.g., de hGH de la invención comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 aminoácidos codificado de manera no naturals enlazados a polímeros solubles en agua. En algunos casos los polipéptidos de GH, e.g., de hGH de la invención comprenden uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals enlazados a polímeros solubles en agua y uno o más aminoácidos de origen natural enlazados a polímeros solubles en agua. En algunas modalidades, los polímeros solubles en agua utilizados en la presente invención mejoran la vida media en suero del polipéptido de GH, e.g., de hGH en relación con la forma no conjugada . El número de polímeros solubles en agua enlazados al polipéptido de GH, e.g., de hGH (i.e., el grado de pegilación o glicosilación) de la presente invención, puede ajustarse para proporcionar una característica farmacológica, farmacocinética o farmacodinámica alterada (incluyendo, pero sin limitarse a, aumenta o disminuida) tal como la vida media in vivo. En algunas modalidades, la vida media de GH, e.g., hGH aumenta al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 por ciento, 2 veces, 5 veces, 6 ves, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 16 veces, 17 veces, 18 veces, 19 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 35 veces, 40 veces, 50 veces o al menos aproximadamente 100 veces sobre un polipéptido no modificado. Derivados de PEG que contienen un fuerte grupo nucleofílico (?.e., hidrazida, hidrazma, hidroxilamma o semicarbazida) En una modalidad de la presente invención, un polipéptido de GH, e.g., hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que contiene carbonilo se modifica con un derivado de PEG que contiene un residuo de terminación hidrazma, hidroxilamina, hidrazida o semicarbazida que se enlaza directamente a la estructura de PEG. En algunas modalidades, el derivado de PEG de terminación hidroxilam a tendrá la estructura: RO-(CH2CH20)n-0- (CH2)ra-0-NH2 en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es de 100-1,000 (?.e., el peso molecular promedio es de entre 5-40 kDa) . En algunas modalidades, el derivado de PEG que contiene hidrazina o hidrazida tendrá la estructura: R0-(CH2CH20)n-0- (CH2)ra-X-NH-NH2 en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 y X es opcionalmente un grupo carbonilo (C=0) que puede encontrarse presente o ausente . En algunas modalidades, el derivado de PEG que contiene semicarbazida tendrá la estructura: RO-(CH2CH20)n-0- (CH2)m-NH-C(0)-NH-NH2 en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m 2-10 y n es 100-1,000. En otra modalidad de la invención, un polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende aminoácido que contiene carbonilo, se modifica con un derivado de PEG que contiene un residuo de terminación hidroxilamma, hidrazida, hidrazma o semicarbazida que se enlaza a la estructura de PEG por medio de un enlace amida. En algunas modalidades, los derivados de PEG de terminación hidroxilamma tienen la estructura: RO- (CH2CH20) n-O- (CH2) 2-NH-C (O) (CH2)m-0-NH2 en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m 2-10 y n es 100-1,000 (?.e., el peso molecular promedio es de entre 5-40 kDa). En algunas modalidades, los derivados de PEG que contienen hidraz a o hidrazida tienen la estructura: RO- (CH2CH20) n-O- (CH2) 2-NH-C (O) (CH2 ) m-X-NH-NH2 en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m 2-10 y n es 100-1,000 y X es opcionalmente un grupo carbonilo (C=0) que puede encontrarse presente o ausente.
En algunas modalidades, los derivados de PEG que contienen semicarbazida tienen la estructura: RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) 2-NH-C (0) (CH2)m-NH-C (0) -NH-NH2 en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m 2-10 y n es 100-1,000. En otra modalidad de la invención, el polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende un aminoácido que contiene carbonilo, se modifica con un derivado de PEG ramificado que contiene un residuo de terminación hidrazina, hidroxilamina, hidrazida o semicarbazida, teniendo cada cadena del PEG ramificado un MW de 10-40 kDa, y puede ser de 5-20 kDa. En otra modalidad de la invención, el polipéptído de GH, e.g., de hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural se modifica con un derivado PEG que tiene una estructura ramificada. Por ejemplo, en algunas modalidades, el derivado de PEG de hidrazina o hidrazida tendrá la siguiente estructura: [RO- (CH2CH20)n-0- (CH2) -NH-C(0) ] 2CH (CH2) m-X-NH-NH2 en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m 2-10 y n es 100-1,000, y X es opcionalmente un grupo carbonilo (C=0) que puede encontrarse presente o ausente. En algunas modalidades, los derivados de PEG que contienen un grupo semicarbazida tendrán la estructura: [RO- (CH2CH20) n-O- (CH2) 2-C (O) -NH-CH2-CH2] 2CH-X- (CH2)m-NH-C (O) -NH-NH2 en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), X es opcionalmente NH, O, S, C(O) o no se encuentra presente, m 2-10 y n es 100-1,000. En algunas modalidades, los derivados de PEG que contienen un grupo hidroxilamina tendrán la estructura: [RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)2-C(0) -NH-CH2-CH2] 2CH-X- (CH2)m-0-NH2 en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), X es opcionalmente NH, O, S, C(O) o no se encuentra presente, m 2-10 y n es 100-1,000. El grado y sitios en los cuales se encuentra enlazado el (los) polímero(s) soluble(s) en agua al polipéptido de hGH en el Sitio I. En algunas modalidades, la invención proporciona una GH, e.g., hGH que se encuentra enlazada a al menos un PEG mediante un enlace oxima, en donde el PEG utilizado en la reacción para formar la unión oxima es un monometoxi-poli (etilen glicol) -2-aminooxi etilamina carbamato hidrocloruro de 30 kDa, como se muestra en la Figura 19. La Figura 20 presente un ejemplo ilustrativa de la síntesis de un monometoxi-poli (etilen glicol) -2-aminooxi etilamina carbamato hidrocloruro de 30 kDa útil en la síntesis de ciertas modalidades de la invención. Solo a modo de ejemplo y no como limitación en los tipos y clases de reactivos PEG que pueden utilizarse con las composiciones, métodos, técnicas y estrategias descritos en la presente, la Figura 21 presenta ejemplos ilustrativos adicionales de reactivos de PEG que contienen hidroxilamina que pueden reactivarse con polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen carbonilo para formar polipéptidos de aminoácido no natural que contienen oxima enlazados al grupo PEG, así como ejemplos de reactivos de PEG que contienen carbonilo que pueden reaccionar con polipéptidos de aminoácido no natural que contienen oxima o polipéptidos de aminoácido no natural que contienen hidroxilamina para formar nuevos polipeptidos de aminoácido no natural que contienen oxima a grupos PEG. La Figura 22 presenta cuatro ejemplos ilustrativos de métodos sintéticos para formar reactivos de PEG que contienen hidroxilamina, o formas protegidas de reactivos de PEG que contienen hidroxilamma, o formas enmascaradas de reactivos de PEG que contienen hidroxilamina . La Figura 23 presenta un ejemplo ilustrativo de métodos sintéticos para formar reactivos de PEG enlazados a amina que contienen hidroxilamma, o formas protegidas de reactivos de PEG enlazados a amida que contienen PEG, o formas enmascaradas de reactivos de PEG enlazados a amida que contienen hidroxilamma . La Figuras y Figura 25 presentan ejemplos ilustrativos de métodos sintéticos para formar reactivos de PEG enlazados a carbamato que contienen hidroxilamma, o formas protegidas de reactivos de PEG enlazados a carbamato que contienen hidroxilamma, o formas enmascaradas de reactivos de PEG enlazados a carbamato que contienen hidroxilamina. La Figura 26 presenta ejemplos ilustrativos de métodos sintéticos para formar reactivos simples de PEG que contienen hidroxilamina, o formas protegidas de reactivos simples de PEG que contienen hidroxilamina o formas enmascaradas de reactivos simples de PEG que contienen hidroxilamina. La Figura 27 presenta ejemplos ilustrativos de reactivos de PEG que contienen hidroxilamina que tienen múltiples ramificaciones de grupos PEG enlazados, y además muestra la reacción de tales reactivos multi-PEG-ramificados que contienen hidroxilamina con un polipéptido de aminoácido no natural que contiene carbonilo para formar un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima con un grupo multi-PEG-ramificado enlazado. Ejemplos adicionales de polímeros solubles en agua, e.g., PEGs, útiles en la invención, e.g., PEG modificado, capaces de formar una unión oxima, pueden encontrarse en las Solicitudes de Patente de E.U. Nos. 60/638,418; 60/638,527 y 60/639,195, tituladas "Compositions containing, methods involving and uses of unnatural amino acids and polipeptides" presentadas en Diciembre 22 de 2004, que se incorporan en la presente por la referencia en su totalidad. También se describen en las solicitudes de Patente de E.U. Nos. 60/696,210; 60/696,302 y 60/696,068 tituladas "Compositions containing, methods involving and uses of unnatural amino acids and polipeptides" presentadas en Julio 1 de 2005, que se incorporan en la presente por la referencia en su totalidad . El grado y sitios en los cuales se enlazan los polímeros solubles en agua al del polipéptido de GH, e.g., de hGH, pueden modular la unión del polipéptido de GH, e.g., de hGH al receptor del polipéptido de GH, e.g., de hGH en el Sitio I. En algunas modalidades, los enlaces se disponen de tal manera que el polipéptido de GH, e.g., de hGH se une al receptor del polipéptido de GH, e.g., de hGH en el Sitio I con un Kd de aproximadamente 400 nM o menor, con un Kd de 150 nM o menor, y en algunos casos con un Kd de 100 nM o menor, calculado mediante un análisis de unión de equilibrio, tal como el descrito en Spencer et al., J. Biol . Chem., 263:7862-7867 (1988) para GH, e.g., hGH. Los métodos y química para la activación de polímeros así como para conjugación de péptidos se describen en la literatura y se conocen en la técnica. los métodos comúnmente utilizados para la activación de polímeros incluyen, pero no se limitan a, activación de grupos funcionales con bromuro cianógeno, periodato, glutaraldehído, biepóxidos, epiclorohidrina, divmilsulfona, carbodnmida, sulfonil haluros, triclorotpazina, etc. (ver, R. F. Taylor (1991), Protein Immobilisation, Fundamental and Applications, Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong (1992), Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, Boca Ratón; G. T. Hemanson et al., (1993), Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, N.Y.; Dunn R. L. et al., Eds., Polimeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D. C. 1991) . Varias revisiones y monografías sobre la funcionalización y conjugación de PEG se encuentran disponibles. Ver, por ejemplo, Harris, Macromol. Chem. Phys., C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135:30-65 (1987); Wong et al., Enzyme. Microb. Technol., 14:866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Theraputics Drug Carrier Systems 9:249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem., 6:150-165 (1995). Los métodos para activación de polímeros también pueden encontrarse en la WO 94/17039, Pat. de E.U. No. 5,324,844, WO 94/18247, WO 94/04193, Pat. de E.U. No. 5,219,564, Pat. de E.U. No. 5,122,614, WO 90/13540, Pat. de E.U. No. 5,281,698 y WO 93/15189, y para conjugación entre polímeros activados y enzimas, incluyendo, pero sin limitarse al Factor de Coagulación VIII (WO 95/15625), hemoglobina (WO 94/09027), molécula portadora de oxígeno (Pat. de E.U. No. 4,412,989), ribonucleasa y superóxido dismutasa (Veronese et al., App. Biochem. Biotech., 11:141-52 (1985)). Todas las referencias y patentes citadas se incorporan por la referencia en la presente. La pegilación (i.e., adición de cualquier polímero soluble en agua) de polipéptidos de GH, e.g., hGH que contienen un aminoácido codificado de manera no natural, tal como p-azido-L-fenilalanina, se lleva a cabo mediante cualquier método conveniente. Por ejemplo, el polipéptido de GH, e.g., de hGH se encuentra pegilado con un derivado de PEGm terminado en alquino. Brevemente, se agrega un exceso de mPEG (5000) -0-CH2-C=CH sólido con agitación a una solución acuosa de polipéptido de GH, e.g., de hGH que contiene p-azido-L-Phe a temperatura ambiente. Típicamente, la solución acuosa se amortigua con un amortiguador que tiene un pKa cercano al pH al cual va a llevarse a cabo la reacción (generalmente aproximadamente un pH 4-10) . Ejemplos de amortiguadores adecuados para pegilación a un pH de 7.5, por ejemplo, incluyen, pero no se limitan a, HEPES, fosfato, borato, TRIC-HC1, EPPS y TES. El pH se monitorea continuamente y se ajusta si es necesario. La reacción típicamente se deja continuar durante entre aproximadamente 1-48 horas. Los productos de reacción se someten subsecuentemente a cromatografía de interacción hidrófoba para separar las variantes del polipéptido de GH, e.g., de hGH pegilado del mPEG (5000) -0-CH2-C=CH libre y todo complejo de alto peso molecular del polipéptido de GH, e.g., de hGH pegilado que pueda formarse al activar el PEG no bloqueado en ambos extremos de la molécula, reticulando así las moléculas de la variante de polipéptido de GH, e.g., de hGH. Las condiciones durante la cromatografía de interacción hidrófoba son tales que el mPEG (5000) -0-CH2-C=CH libre fluye a través de la columna, mientras que todo complejo de variante del polipéptido de GH, e.g., de hGH reticulado pegilado se eluye después de que las formas deseadas, que contienen una molécula de variante del polipéptido de GH, e.g., de hGH conjugada a uno o más grupos PEG. Las condiciones adecuadas varían dependiendo de los tamaños relativos de los complejos reticulados contra los conjugados deseados y se determinan fácilmente por los de experiencia ordinaria en la técnica. El eluyente que contiene los conjugados deseados se concentra mediante ultrafiltración y se desala mediante diafiltración. Si es necesario, el polipéptido de GH, e.g., de hGH pegilado obtenido de la cromatografía hidrófoba puede purificarse mediante uno o más procedimientos conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio aniónico o catión, (utilizando, incluyendo, pero sin limitarse a, DEAE SEPHAROSE) ; cromatografía en sílice; HPLC de fase inversa; filtración de gel (utilizando, incluyendo, pero sin limitarse a, SEPHADEX G-75); cromatografía de interacción hidrófoba; cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de metal-quelado; ultrafiltración/diafiltración; precipitación de etanol; precipitación de sulfato de amonio; cromatoenfoque; cromatografía de desplazamiento; procedimientos electroforéticos (incluyendo pero sin limitarse a enfoque isoeléctrico de preparación) , solubilidad diferencial (incluyendo, pero sin limitarse a, precipitación de sulfato de amonio), o extracción. El peso molecular aparente puede estimarse mediante GPC por comparación con los estándares de proteína globular (Preneta, AZ en Protein Purification Methods, A Practical Approach (Harris & Angal, Eds.), IRL Press 1989, 293-306). La pureza del conjugado de GH, e.g., hGH-PEG puede lograrse mediante degradación proteolítica (incluyendo, pero sin limitarse a, separación de tripsina) seguida por análisis de espectrometría de masa. Pepinsky RB., et al., J. Pharmacol. & Exp. Ther., 297 (3) : 1059-66 (2001) . La pegilación (i.e., adición de cualquier polímero soluble en agua) de polipéptidos de GH, e.g., de hGH que contienen un aminoácido codificado de manera no natural que contiene un grupo carbonilo, e.g., tal como p-actil-fenilalanina, también se lleva a cabo mediante cualquier método conveniente. Como un ejemplo no exclusivo, un polipéptido de GH, e.g., de hGH que contiene un aminoácido codificado de manera no natural que contiene carbonilo, e.g., p-acetil-L-fenilalanma, se pegila con un derivado de PEG aminooxi etilamina carbamato de un MW de aproximadamente 0.1-100 kDa, o aproximadamente 1-100 kDa, o aproximadamente 10-50 kDa, o aproximadamente 20.40 kDa o e.g., 30 kDa. Brevemente se agrega un exceso de MPEG-oxama sólido, e.g., mPEG(30, 000) -O-CO-NH- (CH2)2-OHN3+ (un hidrocloruro de monometoxi-poli (etilen glicol) -2-ammoox? etilamma carbamato de 30 kDa, 30K MPEG-oxiamina) , con agitación, a una solución acuosa de polipeptido de GH, e.g., hGH que contiene p-acetil-L-fenilalanma a temperatura ambiente. La relación molar de PEG-GH, e.g., hGH puede ser de aproximadamente 2-15, o aproximadamente 5-10, o aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Típicamente, la solución acuosa se amortigua con un amortiguador que tiene un pKa cercano al pH al cual va a llevarse a cabo la reacción (generalmente aproximadamente un pH 2-8) . Un amortiguador adecuado para pegilación a un pH de 4.0, por ejemplo, incluye, pero no se limita a, un amortiguador de acetato de sodio/glicma ajustado a un pH de 4.0 mediante adición de acido acético. La reacción típicamente se deja continuar durante entre aproximadamente 1-60 horas o aproximadamente 10.50 horas, o aproximadamente 18-48 horas o aproximadamente 39-50 horas a temperatura ambiente con agitación suave. La pegilación puede confirmarse mediante gel de SDS. Los productos de reacción se someten subsecuentemente a purificación, e.g., a partir de MPEG-oxiamina y complejos de alto peso molecular del polipéptido de GH, e.g., de hGH pegilado que puede formarse cuando se activa el PEG no bloqueado en ambos extremos de la molécula reticulando así las moléculas de variante de polipéptido de GH, e.g., de hGH. Puede utilizarse cualquier método adecuado de purificación, e.g., cromatografía de columna tal como la columna SourceQ funcionando con SourceQ Buffer A y SourceQ Buffer B. La mezcla de reacción puede diluirse con base TRIS y SourceQ Buffer A y agua MilliQ previo a la carga en la columna. el eluyente que contiene los conjugados deseados puede concentrarse adicionalmente mediante ultrafiltración y desalarse mediante diafiltración. Si es necesario, el polipéptido de GH, e.g., de hGH pegilado obtenido de la cromatografía puede purificarse adicionalmente mediante uno o más procedimientos conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica, y los descritos en la presente (ver, e.g., anteriormente). El polipéptido de GH, e.g., de hGH pegilado final puede obtenerse a una pureza mayor que 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99, 99.9 o 99.99%. La pureza puede determinarse mediante métodos conocidos en la técnica. los métodos ejemplares no limitantes para lograr la pureza incluyen SDS-PAGE, medición de GH, e.g., hGH utilizando inmunoanálisis Western y análisis ELISA, análisis Bradford, espectrometría de masa (incluyendo, pero sin limitarse a MALDI-TOF) , métodos de HPLC tales como RP HPLC, HPLC de intercambio de catión, y HPLC de filtración de gel y otros métodos para la caracterización de proteínas conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. Un polímero soluble en agua enlazado a un aminoácido de un polipéptido de GH, e.g., de hGH de la invención puede derivatizarse o sustituirse adicionalmente sin limitación. Derivados de PEG que Contienen Azida En otra modalidad de la invención un polipéptido de GH, e.g., de hGH se modifica con un derivado de PEG que contiene un residuo azida que reaccionará con un residuo alquino presente en la cadena lateral del aminoácido codificado de manera no natural. En general, los derivados de PEG tendrán un peso molecular promedio que varía de 1-100 kDa y, en algunas modalidades de 10.40 kDa. En algunas modalidades, el derivado de PEG de terminación azida tendrá la estructura: RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-N3 en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es de 100-1,000 (i.e., el peso molecular promedio es de entre 5-40 kDa). En otra modalidad, el derivado de PEG que contiene azida tendrá la estructura: RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) ra-NH-C (O) -CH2) -N3 en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10 y n es de 100-1,000 (?.e., el peso molecular promedio es de entre 5-40 kDa) . En otra modalidad de la invención, un polipeptido de GH, e.g., de hGH que comprende un aminoácido que contiene alquino se modifica con un derivado de PEG ramificado que contiene un residuo de terminación azida, teniendo cada cadena del PEG ramificado un MW que varía de 10-40 kDa y puede ser de 5-20 kDa. Por ejemplo, en algunas modalidades, el derivado de PEG de terminación azida tendrá la siguiente estructura : [RO- (CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0) ] 2CH (CH2 ) ra-X- (CH2 ) p-N3 en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10 y n es de 100-1,000 y X es opcionalmente Un grupo O, N, S o carbonilo (C=0) en cada caso que puede encontrarse presente o ausente. Derivados de PEG que contienen alquino En otra modalidad de la invención, un polipeptido de GH, e.g., de hGH se modifica con un derivado de PEG que contiene un residuo alquino que reaccionará con un residuo azida presente en la cadena lateral del aminoácido codificado de manera no natural. En algunas modalidades, el derivado de PEG de terminación alquino tendrá la siguiente estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)m-C=CH en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, y n es de 100-1,000 (i.e., el peso molecular promedio es de entre 5-40 kDa) . En otra modalidad de la invención un polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que contiene alquino se modifica con un derivado de PEG que contiene un residuo de terminación azida o terminación alquino que se encuentra enlazado a la estructura de PEG por medio de un enlace amida. En algunas modalidades, el derivado de PEG de terminación alquino tendrá la siguiente estructura: RO- (CH2CH20) n-O- (CH2)m-NH-C (O) -CH2)p-C=CH en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10 y n es de 100-1,000. En otra modalidad de la invención, un polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende un aminoácido que contiene azida se modifica con un derivado de PEG ramificado que contiene un residuo de terminación alquino, teniendo cada cadena del PEG ramificado un MW que varía de 10-40 kDa y puede ser de 5-20 kDa. Por ejemplo, en algunas modalidades, el derivado de PEG de terminación alquino tendrá la siguiente estructura : [RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0) ] 2CH (CH2 ) m-X- (CH2 ) P=CH en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10 y n es de 100-1,000 y X es opcionalmente Un grupo 0, N, S o carbonilo o no se encuentra presente . Derivados de PEG que Contienen Fosfina En otra modalidad de la invención, un polipéptido de GH, e.g., de hGH se modifica con un derivado de PEG que contiene un grupo funcional activado (incluyendo, pero sin limitarse a, éster, carbonato) que comprende además un grupo aril fosfina que reaccionará con un residuo azida presente en la cadena lateral del aminoácido codificado de manera no natural. En general, los derivados de PEG tendrán un peso molecular promedio que varía de 1-100 kDa y en algunas modalidades, de 10-40 kDa. En algunas modalidades, el derivado de PEG tendrá la estructura: ,s. .x Ph?P(H:.C?„'' '"¡;' V. Q en donde n es 1-10; X puede ser O, N, S o no presente, Ph es fenilo, y W es un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el derivado de PEG tendrá la estructura: en donde X puede ser O, N, S o no presente, pH es fenilo, W es un polímero soluble en agua y R puede ser H, alquilo, arilo, alquilo sustituido y grupos arilo sustituido. Los grupos R ejemplares incluyen, pero no se limitan a, -CH2, -C(CH3)3, -OR' , -NR'R'', -SR' , -halógeno, -C(0)R', -CONR'R'', -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -CN y -N02. R' , R' ' , R" ' y R" ' ' cada uno independientemente se refieren a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, incluyendo, pero sin limitarse a, arilo sustituido con 1-3 halógenos, alquilo sustituido o no sustituido, grupos alcoxi o tioalcoxi, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como cada grupo R' , R' ' , R' ' ' y R' ' ' cuando más de uno de estos grupos se encuentra presente. Cuando R' y R' ' se encuentran unidos al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R'' pretende incluir, pero sin limitarse a, 1-pirrolidinilo y 4-morfolinilo. A partir de la descripción anterior de sustituyentes, el experto en la técnica entenderá que el término "alquilo" pretende incluir grupos que incluyen átomos de carbono unidos a grupos diferentes a los grupos de hidrógeno, tales como haloalquilo (incluyendo, pero sin limitarse a, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (incluyendo, pero sin limitarse a, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C(0)CH2OCH3 y lo similar). Otros Derivados de PEG y Técnicas Generales de Pegilación Otras moléculas de PEG ejemplares que pueden enlazarse a polipéptidos de GH, e.g., de hGH, así como métodos de pegilación incluyen aquellos descritos en e.g., Publicaciones de Patente de E.U. No. 2004/0001838 2002/0052009; 2003/0162949; 2004 0013637; 2003/0228274 2003/0220447; 2003/0158333; 2003/0143596 2003/0114647 2003/0105275; 2003/0105224; 2003/0023023 2002/0156047 2002/0099133; 2002/0086939; 2002/0082345 2002/0072573 2002/0052430, 2002/0040076; 2002/0037949 2002/0002250 2001/0056171; 2001/0044526; 2001/0021763; Patente de E.U. No 66,, 664466,, 111100; 55,,882244,,777788;; 5,476,653; 5,219,564; 5,629,384 5,736, 625 4,902,502; 5,281,698; 5,122,614; 5,473,034 5,516, 673 5,382, 657; 6,552,167; 6,610,281; 6,515,100 6,461, 603 6, 36,386; 6,214,966; 5,990,237; 5,900,461 5,739,208 5,672, 662; 5,446,090; 5,808,096; 5,612,460 5,324,844 5,252,714; 6,420,339; 6,201,072; 6,451,346 6,306,821 5,559,213; 5,747,646; 5,834,594; 5,849,860 5,980, 948 6,004,573; 6,129,912; WO 97/32607, EP 229,108 EP 402,378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO 95/13090 WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134 WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40191, WO 98/32466, WO 95/06058 EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, WO 98/05363 EP 809 996, WO 96/41813 WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472 EP 183 503 y EP 154 316, que se incorporan mediante la referencia en la presente. Cualquiera de las moléculas de PEG descritas en la presente pueden utilizarse en cualquier forma, incluyendo pero sin limitarse a, monocatenaria, de cadena ramificada, de cadena multibrazos, única funcional, bifuncional, multifuncional o cualquier combinación de las mismas . Aumento de afinidad para albúmina de suero Varias moléculas pueden fusionarse también a los polipéptidos de GH, e.g., de hGH de la invención, para modular la vida media de los polipéptidos de GH, e.g., de hGH en suero. En algunas modalidades, las moléculas se enlazan o se fusionan a los polipéptidos de GH, e.g., de hGH de la invención para aumentar la afinidad de la albúmina de suero endógena en un animal. Por ejemplo, en algunos casos, se efectúa la fusión recombinante de un polipéptido de GH, e.g., de hGH y una secuencia de unión de albúmina. Las secuencias de unión de albúmina ejemplares incluyen, pero no se limitan a, el dominio de unión de albúmina de la proteína G estreptococal (ver, e.g., Makrides et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 277:534-542 (1996) y Sjolander et al., J. Immunol . Methods 201:115-123 (1997)), o péptidos de unión de albúmina tales como los descritos en e.g., Dennis et al., J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002). En otras modalidades, los polipéptidos de GH, e.g., de hGH de la presente invención se acilan con ácidos grasos. En algunos casos, los ácidos grasos promueven la unión a albúmina de suero. Ver, e.g., Kurtzhals et al., Biochem. J., 312:725-731 (1995) . En otras modalidades, los polipéptidos de GH, e.g., de hGH de la presente invención se fusionan directamente con albúmina de suero (incluyendo, pero sin limitarse a, albúmina de suero humana) . Los expertos en la técnica reconocerán que una amplia variedad de otras moléculas pueden enlazarse a GH, e.g., hGH en la presente invención para modular el enlace a albúmina de suero u otros componentes de suero. X. Glicosilación de Polipéptidos de GH, e.g., hGH La invención incluye polipéptidos de GH, e.g., de hGH que incorporan uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals que contienen residuos sacárido. Los residuos sacárido pueden ser ya sea naturales (incluyendo, pero sin limitarse a N-acetilglucosamina) o no naturales (incluyendo, pero sin limitarse a, 3-fluorogalactosa) . Los sacáridos pueden encontrarse enlazados a los aminoácidos codificado de manera no naturals ya sea mediante un enlace glicosídico de enlace N u O (incluyendo, pero sin limitarse a N-acetilgalactosa-L-serina) o un enlace no natural (incluyendo, pero sin limitarse a una oxima o la glicosida de enlace C o S correspondiente . Los residuos sacárido (incluyendo, pero sin limitarse a glicosilo) pueden agregarse a los polipéptidos de GH, e.g., de hGH ya sea ín vivo o in vitro. En algunas modalidades de la invención, se modifica un polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que contiene carbonilo, con un sacárido derivatizado con un grupo aminooxi para generar el polipéptido glicosilado correspondiente enlazado a través de un enlace oxima. Una vez unido al aminoácido codificado de manera no natural, el sacárido puede elaborarse adicionalmente mediante tratamiento con glicosiltransferasas y otras enzimas para generar una unión oligosacárido al polipéptido de GH, e.g., de hGH. Ver, e.g., H. Liu et al., J. Am. Chem. Soc., 125:1702-1703 (2003). En algunas modalidades de la invención el polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que contiene carbonilo se modifica directamente con un glicano con estructura definida preparado como un derivado aminooxi. El de experiencia ordinaria en la técnica reconocerá que pueden utilizarse otras funcionalidades, incluyendo azida, alquino, hidrazida, hidrazina y semicarbazida, para enlazar el sacárido al aminoácido codificado de manera no natural. En algunas modalidades de la presente invención, un polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que contiene azida o alquinilo puede entonces modificarse, incluyendo, pero sin limitarse a, mediante una reacción Huisgen de cicloadición [3+2] con, incluyendo, pero sin limitarse a, derivados alquinilo o azida, respectivamente. Este método permite modificar las proteínas con selectividad extremadamente alta. XI. Dímeros y Multímeros de Miembros de la Familia del Supergén de GH La presente invención proporciona también combinaciones de miembros de la familia del supergén de GH (incluyendo, pero sin limitarse a GH, e.g., hGH y análogos de hGH) tales como homodímeros, heterodímeros, homomultímeros o heteromultímeros (i.e., trímeros, tetrámeros, etc.), en donde un polipéptido miembro de la familia del supergén de GH tal como GH, e.g., hGH que contiene uno o más aminoácidos codificado de manera no natural, se une a otro miembro de la familia del supergén de GH o su variante o cualquier otro polipéptido que sea un miembro de la familia del supergén de GH o su variante, ya sea directamente a la estructura del polipéptido o a través de un enlazador. Debido a su aumentado peso molecular en comparación con los monómeros el miembro de la familia del supergén de GH, tal como conjugados de dímero o multímero de GH, e.g., hGH, puede exhibir propiedades nuevas o deseables, incluyendo, pero sin limitarse a, diferentes propiedades farmacológicas, farmacocinéticas, farmacodinámicas, vida media terapéutica modulada o vida media en plasma modulada, en relación al miembro de la familia del supergén de GH . En algunas modalidades, el miembro de la familia del supergén de GH, tal como los dímeros de GH, e.g., de hGH de la invención, modulará la dimerización del receptor del miembro de la familia del supergén de GH . En otras modalidades, los dímeros o multímeros del miembro de la familia del supergén de GH de la presente invención actuarán como antagonista, agonista, o modulador del miembro de la familia del supergén de GH. En algunas modalidades, una o más de las moléculas de GH, e.g., de hGH presentes en un dímero o multímero que contiene GH, e.g., hGH, comprenden un aminoácido codificado de manera no natural enlazado a un polímero soluble en agua que se encuentra presente en la región de unión del Sitio II. Como tal, cada una de las moléculas de GH, e.g., de hGH del dímero o multímero se encuentra accesible para la unión al receptor del polipéptido de GH; e.g., de hGH a través de la interfaz del Sitio 1, pero se encuentra no disponible para la unión a un segundo receptor de polipéptido de GH, e.g., de hGH a través de la interfaz del Sitio II. Por tanto, el dímero o multímero del polipéptido de GH, e.g., de hGH puede engranase a los sitios de unión del Sitio I de cada uno de dos receptores distintos del polipéptido de GH, e.g., de hGH pero, dado que las moléculas de GH, e.g., de hGH tienen un polímero soluble en agua unido a un aminoácido no genéticamente codificado presente en la región del Sitio II, los receptores del polipéptido de GH, e.g., de hGH no pueden engranarse a la región del Sitio II del ligando del polipéptido de GH, e.g., de hGH y el dímero o multímero actúa como un antagonista del polipéptido de GH, e.g., de hGH. En algunas modalidades, una o más de las moléculas de GH, e.g., de hGH presente en un polipéptido de GH, e.g., de hGH que contiene un dímero o un multímero, comprende un aminoácido codificado de manera no natural enlazado a un polímero soluble en agua que se encuentra presente dentro de la región de unión del Sitio I, permitiendo la unión a la región del Sitio II. Alternativamente, en algunas modalidades una o más de las moléculas de GH, e.g., de hGH presentes en un polipéptido de GH, e.g., de hGH que contiene un dímero o multímero, comprende un aminoácido codificado de manera no natural enlazado a un polímero soluble en agua que se encuentra presente en un sitio que no se encuentra dentro de la región de unión del Sitio I o del Sitio II, de manera que ambos se encuentran disponibles para la unión. En algunas modalidades, se utiliza una combinación de moléculas de GH, e.g., de hGH que tiene el Sitio I, el Sitio II o ambos disponibles para la unión. Una combinación de moléculas de GH, e.g., de hGH en donde al menos una tiene el Sitio I disponible para unión, y al menos una tiene el Sitio II disponible para unión, puede proporcionar moléculas que tienen la actividad o propiedad deseada. Además una combinación de moléculas de GH, e.g., de hGH que tiene el Sitio I, el Sitio II o ambos disponibles para la unión, puede producir una molécula de GH, e.g., de hGH super agonista. En algunas modalidades, los polipéptidos miembros de la familia del supergén de GH se encuentran enlazados directamente, incluyendo, pero sin limitarse a, a través de un enlace amida Asn-Lys o enlace disulfuro Cys-Cys. En algunas modalidades, los polipéptidos miembros de la familia del supergén de GH y/o el miembro de la familia del supergén no de GH, comprenderá diferentes aminoácidos codificado de manera no naturals para facilitar la dimerización, incluyendo, pero sin limitarse a, un alquino en un aminoácido codificado de manera no natural de un primer polipéptido de GH, e.g., de hGH y una azida en un segundo aminoácido codificado de manera no natural de un segundo polipéptido miembro de la familia del supergén de GH se conjugarán a través de una cicloadición Huisgen [3+2]. Alternativamente, un polipéptido primer miembro de la familia del supergén de GH y/o el miembro de la familia del supergén no de GH enlazado, que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que contiene cetona puede conjugarse a un segundo polipéptido miembro de la familia del supergén de GH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que contiene hidroxilamina y los polipéptidos se reactivan a través de la formación de la oxima correspondiente. Alternativamente, los dos polipéptidos miembros de la familia del supergén de GH y/o miembro de la familia del supergén no de GH, se encuentran enlazados a través de un enlazador. Puede utilizarse cualquier enlazador hetero u homobifuncional para enlazar los dos polipéptidos miembros de la familia del supergén de GH, y/o miembros de la familia del supergén no de GH enlazado, que pueden tener la misma o diferente secuencia primaria. En algunos casos, el enlazador utilizado para unir los polipéptidos miembros de la familia del supergén de GH, y/o miembros de la familia del supergén no de GH enlazado entre sí puede ser un reactivo de PEG bifuncional. El enlazador puede tener un amplio rango de pesos moleculares o longitudes moleculares. Pueden utilizarse enlazadores de mayor o menor peso molecular para proporcionar un relación o conformación espacial deseada entre el miembro de la familia del supergén de GH y la entidad enlazada o entre el miembro de la familia del supergén de GH y el receptor para el miembro de la familia del supergén de GH, o entre la entidad enlazada y el receptor para el miembro de la familia del supergén de GH. Los enlazadores que tienen mayor o menor longitud molecular también pueden utilizarse para proporcionar un espacio de flexibilidad deseado entre el miembro de la familia del supergén de GH y la entidad enlazada o entre el miembro de la familia del supergén de GH y su receptor, o entre la entidad enlazada y el receptor del miembro de la familia del supergén de GH . De manera similar, un enlazador que tiene una forma o conformación particular puede utilizarse para impartir una forma o conformación particular al miembro de la familia del supergén de GH o la entidad enlazada, ya sea antes o después de que el miembro de la familia del supergén de GH alcance su objetivo. Esta optimización de la relación espacial entre el miembro de la familia del supergén de GH y la entidad enlazada puede proporcionar propiedades nuevas, moduladas o deseadas a la molécula. En algunas modalidades, la invención proporciona enlazadores bifuncionales solubles en agua que tienen una estructura de campana que incluye: a) un residuo que contiene una azida, un alquino, una hidrazina, una hidrazida, una hidroxilamina o un carbonilo en al menos un primer extremo de una estructura de polímero y; b) al menos un segundo grupo funcional en un segundo extremo de la estructura de polímero. El segundo grupo funcional puede ser el mismo o diferente al primer grupo funcional. La invención proporciona en algunas modalidades, compuestos solubles en agua que comprenden al menos un brazo de una estructura molecular ramificada. Por ejemplo, la estructura molecular ramificada puede ser dendrítica.
En algunas modalidades, la invención proporciona multímeros que comprenden uno o más miembros de la familia del supergén de GH, tal como de GH, e.g., hGH, formados por reacciones con polímeros activados solubles en agua que tienen la estructura: R-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-X en donde n es de aproximadamente 5 a 3,000, m es 2-10, X puede ser un residuo que contiene una azida, un alquino, una hidrazida, una hidrazina, un grupo aminooxi, una hidroxilamina, un acetilo, o un carbonilo, y R es un grupo de tapa, un grupo funcional o un grupo de salida que puede ser el mismo o diferente a X. R puede ser, por ejemplo un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de hidroxilo, hidroxilo protegido, alcoxilo, N-hidroxisuccinimidil éster, 1-benzotriazolil éster, N-hidroxisuccinimidil carbonato, 1-benzotriazolil carbonato, acetal, aldehido, hidratos de aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, glioxalos, dionas, mesilatos, tosilatos y tresilato, alqueno, y cetona. XII. Medición de la Actividad del Polipéptido de hGH y de la Afinidad del Polipéptido de hGH para el Receptor del Polipéptido de hGH El receptor de hGH puede prepararse como se describe en McFarland et al., Science 245:494-499 (1989) y Leung D., et al., Nature 330:537-543 (1987). La actividad del polipéptido de hGH puede determinarse utilizando análisis estándar o conocidos in vitro o in vivo. Por ejemplo, pueden utilizarse las líneas celulares que proliferan en presencia de hGH (e.g., una línea celular que expresa el receptor de hGH o un receptor lactogénico) para monitorear la unión del receptor de hGH. Ver, e.g., Clark et al., J. Biol. Chem., 271 (36) :21969 (1996); Wada et al., Mol. Endocrinol, 12:146-156 (1998); Gout P. W. et al., Cáncer Res., 40, 2433-2436 (1980); WO 99/03887. Para un polipéptido de hGH no pegilado o pegilado que comprende un aminoácido no natural, la afinidad de la hormona para su receptor puede medirse utilizando un biosensor BIAcore™ (Pharmacia). Ver, e.g., Patente de E.U. No. 5,849,535; Spencer S. A., et al., J. Biol. Chem., 263:7862-7867 (1988). Los modelos animales in vivo para probar la actividad de hGH incluyen los descritos en Clark et al., J. Biol. Chem. 271 (36) : 21969-21977 (1996). Los análisis para capacidad de dimerización de polipéptidos de hGH que comprenden uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals pueden conducirse como se describe en Cunningham, B., et al., Science, 254:821-825 (1991) y Fuh G., et al., Science 256:1677-1680 (1992). Todas las referencias y patentes citadas se incorporan por la referencia en la presente . La compilación de referencias para metodologías de análisis no es exhaustiva, y los de experiencia ordinaria en la técnica reconocerán otros análisis útiles para probar el resultado final deseado. XIII. Medición de Parámetros de Potencia, Vida Media Funcional In Vivo, y Farmacocinética Un aspecto importante de la invención es la vida media biológica prolongada que se obtiene mediante la construcción del polipéptido de hGH con o sin conjugación del polipéptido a un residuo de polímero soluble en agua. La rápida disminución de las concentraciones en suero del polipéptido de hGH ha hecho importante la evaluación de las respuestas biológicas al tratamiento con polipéptido de hGH conjugado y no conjugado y sus variantes. El polipéptido de hGH conjugado y no conjugado y sus variantes de la presente invención puede tener prolongada vida media en suero también después de la administración subcutánea o i.v., haciendo posible la medición mediante, e.g., el método ELISA o mediante un análisis de visualización primaria. Pueden utilizarse equipos ELISA o RÍA ya sea de BioSource International (Camarillo, CA) o Diagnostic Systems Laboratories (Webster, TX) . La medición de la vida media biológica in vivo se lleva a cabo como se describe en la presente . La potencia y la vida media funcional in vivo de un polipéptido de hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural puede determinarse de acuerdo con el protocolo descrito en Clark R., et al., J. Biol. Chem., 271 (36) :21969-21977 (1996). Los parámetros farmacocinéticos para un polipéptido de hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural pueden evaluarse en ratas macho normales Sprague-Dawley (N=5 animales por grupo de tratamiento) . Los animales recibirán ya sea una sola dosis de 25 ug/rata i.v. o 50 ug/rata se, y aproximadamente se tomarán 5-7 muestras de sangre de acuerdo con un curso de tiempo predefinido, cubriendo generalmente aproximadamente 6 horas para un polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural conjugado a un polímero soluble en agua y aproximadamente 4 días para un polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural y conjugado a un polímero soluble en agua. Los datos farmacocinéticos para polipéptidos de GH, e.g., de hGH se han estudiado en varias especies y pueden compararse directamente con los datos obtenidos para polipéptidos de GH, e.g., de hGH que comprenden un aminoácido codificado de manera no natural. Ver, Mordenti J., et al., Pharm. Res. 8 (11) : 1351-59 (1991) para estudios relacionados con la GH, e.g., hGH. Los parámetros farmacocinéticos también pueden evaluarse en un primate, e.g., monos cinomolgos . Típicamente, se administra una sola inyección ya sea de manera subcutánea o intravenosa, y se monitorean al paso del tiempo los niveles de GH, e.g., hGH en suero. Ver, e.g., Ejemplos, para una descripción adicional. En algunas modalidades, la invención proporciona una GH, e.g., hGH, que tiene una vida media promedio en suero de al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o más de 16 horas al administrarse a un mamífero de manera subcutánea. En algunas modalidades, la invención proporciona una GH, e.g., hGH, que tiene una vida media promedio en suero de al menos aproximadamente 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más de 12 horas al administrarse a un mamífero de manera subcutánea. Una vida media "promedio" en suero es la media de al menos tres animales, o al menos cuatro animales, o al menos cinco animales o más de cinco animales. El mamífero es, en algunas modalidades, una rata; en algunas modalidades, el mamífero es un primate, tal como mono cinomolgo, o tal como un humano. En algunas modalidades, la invención proporciona una GH pegilada, e.g., una hGH pegilada que tiene una vida media promedio en suero en un mamífero que es de al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 veces o más de 50 veces la vida media promedio en suero de la GH, e.g., hGH, en su forma no pegilada al administrarse de manera subcutánea. En algunas modalidades, la invención proporciona una GH pegilada, e.g., una hGH pegilada que tiene una vida media promedio en suero en un mamífero que es de al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 veces o más de 50 veces la vida media promedio en suero de la GH, e.g., hGH, en su forma no pegilada al administrarse de manera intravenosa. Una vida media "promedio" en suero es la media de al menos tres animales, o al menos cuatro animales, o al menos cinco animales o más de cinco animales. El mamífero es, en algunas modalidades, una rata; en algunas modalidades, el mamífero es un primate, tal como mono cinomolgo, o tal como un humano. En algunas modalidades, la GH, es una GH, e.g., hGH. En algunas modalidades, la hormona del crecimiento se encuentra enlazada mediante una unión covalente a al menos un polímero soluble en agua, en donde la unión covalente es una unión oxima. La GH puede ser una GH, e.g., hGH. En algunas modalidades, la GH, e.g., hGH, incluye un aminoácido codificado de manera no natural, tal como un aminoácido codificado de manera no natural que contiene carbonilo. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural es un aminoácido que contiene cetona, e.g., para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades, la GH, e.g., hGH, contiene un aminoácido codificado de manera no natural, e.g., para-acetilfenilalanina, sustituido en una posición en la GH, e.g., hGH correspondiente al aminoácido 35 en la SEQ ID NO: 2. El polímero soluble en agua puede ser un PEG. Los PEGs adecuados incluyen PEGs lineales y ramificados; puede utilizarse cualquier PEG descrito en la presente. En ciertas modalidades, el PEG es un PEG lineal de aproximadamente 0.1-100 kDa, o aproximadamente 1-100 kDa, o aproximadamente 10-50 kDa, o aproximadamente 20-40 kDa o aproximadamente 30 kDa. En algunas modalidades, la composición farmacéutica contiene una GH, e.g., hGH, enlazada a un PEG de 30 kDa mediante una unión oxima, en donde la unión oxima es entre una para-acetilfenilalanina en la GH ubicada en una posición correspondiente al aminoácido 35 en la SEQ ID NO: 2 y el PEG. La actividad específica de los polipéptidos de GH, e.g., de hGH de acuerdo con esta invención, puede determinarse mediante varios análisis conocidos en la técnica. La actividad biológica de muteínas del polipéptido de GH, e.g., de hGH, o sus fragmentos, obtenida y purificada de acuerdo con esta invención, puede probarse mediante los métodos descritos o referidos en la presente o los conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. XIV. Administración y Composiciones Farmacéuticas Los polipéptidos o proteínas de la invención (incluyendo, pero sin limitarse a GH, e.g., hGH, sintetasas, proteínas que comprenden uno o más aminoácidos no naturales, etc.), se emplean opcionalmente para usos terapéuticos incluyendo, pero sin limitarse a, en combinación con un vehículo farmacéutico adecuado. Tales composiciones, por ejemplo, comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal vehículo o excipiente incluye, pero no se limita a, salina, salina amortiguada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y/o combinaciones de los mismos. La formulación se elabora para adecuarse al modo de administración. En general, los métodos para administración de las proteínas son conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica y pueden aplicarse a la administración de los polipéptidos de la invención. En algunas modalidades, a invención proporciona una composición farmacéutica que contiene una composición hormonal que comprende una hormona del crecimiento enlazada mediante una unión covalente a al menos un polímero soluble en agua, en donde la unión covalente es una unión oxima; y un excipiente farmacéuticamente aceptable. La GH puede ser una hGH. En algunas modalidades, la GH, e.g., hGH, incluye un aminoácido codificado de manera no natural tal como un aminoácido codificado de manera no natural que contiene carbonilo. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural es un aminoácido que contiene cetona, e.g., para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades, la GH, e.g., hGH, contiene un aminoácido codificado de manera no natural, e.g., para-acetilfenilalanina, sustituido en una posición en la GH, e.g., hGH correspondiente al aminoácido 35 en la SEQ ID NO: 2. El polímero soluble en agua puede ser un PEG. Los PEGs adecuados incluyen PEGs lineales y ramificados; puede utilizarse cualquier PEG descrito en la presente. En ciertas modalidades, el PEG es un PEG lineal de aproximadamente 0.1-100 kDa, o aproximadamente 1-100 kDa, o aproximadamente 10-50 kDa, o aproximadamente 20-40 kDa o aproximadamente 30 kDa. En algunas modalidades, la composición farmacéutica contiene una GH, e.g., hGH, enlazada a un PEG de 30 kDa mediante una unión oxima, en donde la unión oxima es entre una para-acetilfenilalanina en la GH ubicada en una posición correspondiente al aminoácido 35 en la SEQ ID NO: 2 y el PEG. Las composiciones terapéuticas que comprenden uno o más de los polipéptidos de la invención se prueban opcionalmente en uno o más modelos animales de enfermedad in vitro y/o in vivo apropiados, para confirmar la eficacia, el metabolismo del tejido y para estimar las dosis, de acuerdo con los métodos conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. En particular, las dosis pueden determinarse inicialmente por la actividad, estabilidad u otras mediciones adecuadas de homólogos de aminoácido no naturales a naturales (incluyendo, pero sin limitarse a, comparación de un polipéptido de GH, e.g., de hGH modificado para incluir uno o más aminoácidos no naturales a un polipéptido de GH, e.g., de hGH de aminoácido no natural), i.e., en un análisis relevante . La administración es mediante cualquiera de las vías normalmente utilizadas para introducir una molécula en contacto final con la sangre o células de tejido. Los polipéptidos de aminoácido no natural de la invención, se administran de cualquier manera adecuada, opcionalmente con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptable. Los métodos adecuados de administración de tales polipéptidos en el contexto de la presente invención, a un paciente, se encuentran disponibles y, aunque puede utilizarse más de una vía para administrar una composición particular, una vía particular puede proporcionar frecuentemente una acción o reacción más inmediata y más efectiva que otra vía. Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular utilizado para administrar la composición. En consecuencia, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención.
Los polipéptidos de hGH de la invención, incluyendo, pero sin limitarse a hGH pegilada, pueden administrarse mediante cualquier vía convencional adecuada para proteínas o péptidos, incluyendo, pero sin limitarse a parenteralmente, e.g., inyecciones incluyendo, pero sin limitarse a, de manera subcutánea o intravenosa o en cualquier otra forma de inyecciones o infusiones. Las composiciones de polipéptidos pueden administrarse por un número de vías incluyendo, pero sin limitarse a medios orales, intravenosos, intraperitoneales, intramusculares, transdérmicos, subcutáneos, tópicos, sublinguales o rectales. Las composiciones que comprenden polipéptidos de aminoácido no natural, modificados o no modificados, también pueden administrarse a través de liposomas. Tales vías de administración y formulaciones apropiadas se conocen generalmente por los expertos en la técnica. el polipéptido de hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural, incluyendo, pero sin limitarse a hGH pegilada, pueden utilizarse solos o en combinación con otros componentes adecuados tales como un vehículo farmacéutico. El polipéptido de GH, e.g., de hGH que comprende un aminoácido no natural, solo o en combinación con otros componentes adecuados, también puede elaborarse en formulaciones en aerosol (i.e., pueden "nebulizarse") para administrarse mediante inhalación. Las formulaciones pueden colocarse en impulsores aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y lo similar. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral, tales como, por ejemplo, mediante vías intraarticulares (en las articulaciones), intravenosas, intramusculares, intradérmicas, intraperitoneales, y subcutáneas, incluyen acuosas y no acuosas, soluciones isotónicas de inyección estériles, que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacterióstatos y solutos que hacen a la formulación isotónica con la sangre del receptor pretendido, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizadores, agentes de espesado, estabilizadores y preservativos. Las formulaciones de hGH pueden presentarse en envases sellados de dosis unitaria o dosis múltiple, tales como ampolletas y viales . La administración parenteral y la administración intravenosa son métodos preferidos de administración. En particular, las vías de administración ya en uso para terapéuticos homólogos de aminoácido natural (incluyendo, pero sin limitarse a, aquellas típicamente utilizadas para EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFNs, interleucinas, anticuerpos y/o otra proteína farmacéuticamente suministrada), conjuntamente con las formulaciones de uso actual, proporcionan vías de administración y formulaciones preferidas para los polipéptidos de la invención. La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención, es suficiente para tener una respuesta terapéutica benéfica en el paciente al paso del tiempo, u otra actividad apropiada, dependiendo de la aplicación. La dosis se determina por la eficacia del vector o formulación particular, y la actividad, estabilidad o vida media en suero del polipéptido de aminoácido no natural empleado, y la condición del paciente, así como del peso corporal o el área de superficie del paciente que se trata. El tamaño de la dosis se determina también por la existencia, naturaleza, y extensión de todo efecto secundario adverso que acompañe la administración de un vector, formulación particular o lo similar en un paciente particular. Al determinar la cantidad efectiva del vector o formulación que va a administrarse en el tratamiento o profilaxis de la enfermedad (incluyendo, pero sin limitarse a, cánceres, enfermedades hereditarias, diabetes, SIDA, o lo similar), el médico evalúa los niveles en plasma circulantes, las toxicidades de la formulación, el progreso de la enfermedad, y/o si es relevante, la producción de anticuerpos de polipéptido de aminoácido no natural. La dosis administrada, por ejemplo, a un paciente de 70 kilogramos, típicamente se encuentra en el rango equivalente a las dosis de proteínas terapéuticas actualmente utilizadas, ajustada para la actividad alterada de la vida media en suero de la composición relevante. Los vectores o formulaciones farmacéuticas de esta invención pueden suplementar condiciones de tratamiento mediante cualquier terapia convencional conocida, incluyendo, administración de anticuerpos, administración de vacunas, administración de agentes citotoxicos, polipeptidos de aminoácido natural, ácidos nucleicos, análogos de nucleótido, modificadores de respuesta biológica y lo similar. Para administración, las formulaciones de la presente invención se administran a una relación determinada por el LD-50 o ED-50 de la formulación relevante y/o por la observación de los efectos secundarios de los polipéptidos de aminoácido no natural a varias concentraciones, incluyendo pero sin limitarse a, aplicadas a la masa y salud general del paciente. La administración puede lograrse a través de dosis únicas o divididas. Si un paciente que experimenta la infusión de una formulación desarrolla fiebres, escalofríos o dolores musculares, éste recibe la dosis apropiada de aspirina, íbuprofeno, acetaminofén, u otra droga para el control de dolor/fiebre. Los pacientes que experimentan reacciones a la infusión tales como fiebre, dolores musculares y escalofríos, se premedican 30 minutos antes de las futuras infusiones ya sea con aspirina, acetaminofén o, incluyendo, pero sin limitarse a, difenhidramina. Se utiliza meperidina para escalofríos y dolores musculares más severos que no responden rápidamente a antipiréticos y antihistaminas . La infusión celular se retrasa o se discontinua dependiendo de la severidad de la reacción. Los polipéptidos de GH humana de la invención, pueden administrarse directamente a un sujeto mamífero. La administración se efectúa mediante cualquiera de las vías normalmente utilizadas para la introducción del polipéptido de hGH a un sujeto. Las composiciones de polipéptido de hGH de acuerdo con las modalidades de la presente invención, incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, tópica, inhalación (incluyendo, pero sin limitarse a, a través de un aerosol), bucal, (incluyendo, pero sin limitarse a, sublingual), vaginal, parenteral (incluyendo, pero sin limitarse a, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraarticular, intrapleural, intraperitoneal, intracerebral, intraarterial o intravenosa), tópica (i.e., tanto en superficies de piel como mucosas, incluyendo superficies aéreas) y transdérmica, aunque la vía más adecuada en cualquier caso dado, dependerá de la naturaleza y severidad de la condición que se trata. La administración puede ser ya sea local o sistémica. Las formulaciones de compuestos pueden presentarse en envases sellados de dosis unitaria o dosis múltiples, tales como ampolletas y viales. Los polipéptidos de GH, e.g., de hGH de la invención pueden prepararse en una mezcla en una forma de dosis unitaria inyectable (incluyendo, pero sin limitarse a, solución, suspensión o emulsión) con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los polipéptidos de GH; e.g., de hGH de la invención también puede administrarse mediante infusión continua (utilizando, incluyendo pero sin limitarse a, minibombas tales como bombas osmóticas), formulaciones de dosis única o de depósito de liberación lenta. Las formulaciones adecuadas para administración incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones isotónicas estériles, que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacterióstatos, y solutos que hacen a la formulación isotónica, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizadores, agentes de espesado, estabilizadores, y preservativos. Las soluciones y suspensiones pueden prepararse a partir de polvos estériles, granulos y tabletas del tipo previamente descrito. El secado por congelamiento es una técnica comúnmente empleada para presentar proteínas, que sirve para retirar el agua de la preparación de proteína de interés. El secado por congelación, o liofilización, es un proceso mediante el cual, el material que va a secarse se congela primero y después el hielo del solvente congelado se retira por sublimación en un ambiente al vacío. Puede incluirse un excipiente en formulaciones pre-liofilizadas para aumentar la solubilidad durante el proceso de secado por congelamiento y/o para mejorar la estabilidad del producto liofilizado al almacenarse. Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) y Arakawa et al., Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991). El secado por aspersión de farmacéuticos también es conocido por los de experiencia ordinaria en la técnica . Por ejemplo, ver, Broadhead J. et al., "The Spray Drying of Pharmaceuticals", en Drug Dev. Ind. Pharm., 18(11 & 12), 1169-1206 (1992). Además de los farmacéuticos de molécula pequeña, se han secado por aspersión una variedad de materiales biológicos y estos incluyen: enzimas, suero, plasma, microorganismos y levaduras. El secado por aspersión es una técnica útil debido a que puede convertir una preparación farmacéutica líquida en un polvo fino, sin polvo o aglomerado en un proceso de una etapa. La técnica básica comprende las siguientes cuatro etapas: a) atomización de la solución de alimentación en una aspersión; b) contacto de aspersión al aire; c) secado de la aspersión; y d) separación del producto secado del aire de secado. Las Patentes de E.U. Nos. 6,235,710 y 6,001,800, que se incorporan mediante la referencia en la presente, describen la preparación de eritropoyetina recombinante mediante secado por aspersión. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender un vehículo, excipiente o estabilizador aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular utilizado para administrar la composición. En consecuencia, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas (incluyendo vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables) de la presente invención (e.g., Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed. 1985) ) . Los vehículos adecuados incluyen, amortiguadores que contienen succinato, fosfato, borato, HEPES, citrato, histidina o derivados de histidina, imidazolo, acetato, bicarbonato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo, pero sin limitarse a ácido ascórbico, ; polipéptidos de bajo peso molecular incluyendo, pero sin limitarse a, aquellos de menos de aproximadamente 10 residuos; proteínas, incluyendo, pero sin limitarse a, albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos incluyendo, pero sin limitarse a, polivinilpirrolidona; aminoácidos incluyendo, pero sin limitarse a, glicina, glutamina, asparagina, arginina, histidina y derivados de histidina, metionina, glutamato o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo, pero sin limitarse a, trehalosa, sucrosa, glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes incluyendo, pero sin limitarse a, EDTA; iones de metal divalentes incluyendo, pero sin limitarse a, zinc, cobalto, o cobre; alcoholes de azúcar incluyendo, pero sin limitarse a, manitol, o sorbitol; contraiones formadores de sal incluyendo, pero sin limitarse a, sodio; y/o surfactantes no iónicos incluyendo, pero sin limitarse a, Tween™ (incluyendo, pero sin limitarse a, Tween 80 (polisorbato 80 ( y Tween 20 (polisorbato 20) , Pluronics™ y otros ácidos plurónicos, incluyendo, pero sin limitarse a, otros ácidos plurónicos, incluyendo, pero sin limitarse a, ácido plurónico F68 (polioxámero 188) o PEG. Los surfactantes adecuados incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a poliéteres en base a poli (etileno óxido) -poli (propileno óxido) -poli (etileno óxido), i.e., (PEO-PPO-PEO) , o poli (propileno óxido) -poli(etileno óxido) -poli (propileno óxido) i.e., ( PPO-PEO-PPO) o una combinación de los mismos. PEO-PPO-PEO y PPO-PEO-PPO se encuentran comercialmente disponibles bajo los nombres comerciales de Pluronics™, R-Pluronics™, Tetronics™, y R-Tetronics™ (BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.) y se describen además en la Pat. de E.U. No. 4,820,352 incorporada en la presente en su totalidad por la referencia. Otros polímeros de bloque de etileno/polipropileno pueden ser surfactantes adecuados. Puede utilizarse un surfactante o una combinación de surfactantes para estabilizar la hGH pegilada contra una o más tensiones incluyendo, pero sin limitarse a la tensión resultante de la agitación. Algunos de los anteriores pueden referirse como "agentes de abultamiento" . Algunos también pueden referirse como "modificadores de tonicidad". Los polipéptidos de GH, e.g., de hGH de la invención, incluyendo aquellos enlazados a polímeros solubles en agua tales como PEG, también pueden administrarse por, o como parte de sistemas de liberación sostenida. Las composiciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, matrices de polímero semipermeables en forma de artículos configurados, incluyendo, pero sin limitarse a, películas, o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen, de materiales biocompatibles tales como poli (2-hidroxietil metacrilato) (Langer et al., Biomed. Mater. Res. 15:267-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982), etileno vinil acetato (Langer et al., supra) o ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico (EP 133,988), poliláctidos (ácido poliláctico) (Patente de E.U. No. 3,773,919; EP 58,481), poliglicolido (polímero de ácido glicólico), polilactido co-glicolido (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico) polianhídridos, copolímeros de ácido L-glutámico y gama-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolimers, 22, 547-556 (1983), poli (orto) esteres, polipéptidos, ácido hialurónico, colágeno, sulfato de condroit a, ácidos carboxílicos, ácidos grasos, fosfolípidos, polisacápdos, ácidos nucleicos, poliammoácidos, aminoácidos tales como fenilalanina, tirosma, ísoleucma, polmucleótidos, polivinil propileno, polivmilpirrolidona y silicona. Las composiciones de liberación sostenida incluyen también un compuesto liposomalmente atrapado. Los liposomas que contienen el compuesto se preparan mediante métodos conocidos per se: DE 3,218,121; Eppstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci . , EUA 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci., EUA 77:4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; Patente de E.U. No. 4,619,794; EP 143,949; Patente de E.U. No. 5,021,234; Solicitud de Patente Japonesa 83-118008; Patentes de E.U. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. Todas las referencias y patentes citadas se incorporan por la referencia en la presente. Los polipéptidos de GH, e.g., de hGH liposomalmente atrapados pueden prepararse mediante métodos descritos e.g., en DE 3,218,121; Eppstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci . , EUA 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci., EUA 77:4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; Patente de E.U. No. 4,619,794; EP 143,949; Patente de E.U. No. 5,021,234; Solicitud de Patente Japonesa 83-118008; Patentes de E.U. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. La composición y el tamaño de los liposomas son muy conocidos o pueden determinarse fácilmente empíricamente por el de experiencia ordinaria en la técnica. algunos ejemplos de liposomas como se describe e.g., en Park JW et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 92:1327-1331 (1995); Lasic D y Papahadjopoulos D (eds): Medical Applications of Liposomes (1998); Drummond DC et al., Liposomal drug delivery systems for cáncer therapy, en Teicher B (ed) ; Cáncer Drug Discovery and Development (2002); Park JW et al., Clin. Cáncer Res., 8:1172-1181 (2002); Nielsen UB et al., Biochim. Biophys. Acta 1591 (1-3) : 109-118 (2002); Mamot C. et al., Cáncer Res., 63:3154-3161 (2003). Todas las referencias y patentes citadas se incorporan por la referencia en la presente. La dosis administrada a un paciente en el contexto de la presente invención, debe ser suficiente para ocasionar una respuesta benéfica en el sujeto al paso del tiempo. Generalmente, la cantidad total farmacéuticamente efectiva del polipéptido de GH, e.g., de hGH de la presente invención administrada parenteralmente por dosis, se encuentra en el rango de aproximadamente 0.01 ug/kg/día a aproximadamente 100 ug/kg/día, o aproximadamente 0.05 ug/kg/día a aproximadamente 1 mg/kg, del peso corporal del paciente, aunque esto se encuentra sujeto a discreción terapéutica. La frecuencia de dosificación también se somete a discreción terapéutica, y puede ser más frecuente o menos frecuente que los productos del polipéptido de GH, e.g., de hGH comercialmente disponibles aprobados para su uso en humanos. Generalmente, un polipéptido de GH, e.g., de hGH pegilado de la invención puede administrarse mediante cualquiera de las vías de administración antes descritas. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición que comprende cualquiera de las GH, e.g., hGH descritas en la presente en una composición farmacéutica que es suficientemente estable para los regímenes de almacenamiento y dosificación descritos en la presente. Los métodos para probar la estabilidad se conocen en la técnica. XV. Usos Terapéuticos de los Polipéptidos de GH, e.g., de hGH de la Invención Los polipéptidos de GH, e.g., de hGH de la invención, son útiles para el tratamiento de un amplio rango de trastornos. Los polipéptidos de antagonista de GH, e.g., de hGH de la invención pueden ser útiles, por ejemplo, para tratar la deficiencia del crecimiento, trastornos inmunes, y para estimular la función cardiaca. Los individuos con deficiencias de crecimiento, incluyen, e.g., individuos con síndrome de Turner, individuos con deficiencia de GH (incluyendo niños), niños que experimentan lentitud o retraso en su curva normal de crecimiento aproximadamente 2-3 años antes de cerrar su placa de crecimiento (algunas veces conocidos como "niños cortos normales") , e individuos en los cuales se ha bloqueado químicamente la respuesta del factor de crecimiento I tipo insulina (IGF-I) a la GH (i.e., tratamiento glucocorticoide) o mediante una condición natural tal como en pacientes adultos en los cuales se reduce naturalmente la respuesta IGF-I a GH . Los polipéptidos de hGH de la invención, puede ser útil para tratar individuos con las siguientes condiciones: deficiencia pediátrica de la hormona del crecimiento, corta estatura idiopática, deficiencia adulta de la hormona del crecimiento de origen en la niñez, deficiencia adulta de la hormona del crecimiento de origen en la madurez, o deficiencia secundaria de la hormona del crecimiento. Los adultos diagnosticados con deficiencia en la hormona del crecimiento en la madurez pueden haber tenido un tumor o radiación pituitaria. Las condiciones incluyendo, pero sin limitarse a, síndrome metabólico, daño en cabeza, obesidad, osteoporosis, o depresión, pueden dar como resultado síntomas tipo deficiencia en la hormona del crecimiento en adultos. Una variante agonista de GH, e.g., hGH puede actuar para estimular el sistema inmune de un mamífero incrementando su función inmune, ya sea que el incremento se deba a la mediación del anticuerpo o a la mediación celular, y ya sea que el sistema inmune sea endógeno al huésped tratado con el polipéptido de GH, e.g., de hGH o se transplante de un donante al receptor huésped dado el polipéptido de GH, e.g., de hGH (como en transplantes de médula espinal) . Los "trastornos inmunes" incluyen cualquier condición en la cual el sistema inmune de un individuo tiene una respuesta de anticuerpo o celular reducida al antígeno de lo normal, incluyendo, aquellos individuos con bazos reducidos con inmunidad reducida debido a tratamientos con drogas (e.g., quimioterapéuticos). Ejemplos de individuos con trastornos inmunes incluyen, e.g., pacientes ancianos, individuos que experimentan quimioterapia o terapia de radiación, individuos recuperándose de una enfermedad importante o que van a experimentar cirugía, individuos con SIDA, pacientes con deficiencias de célula B congénitas y adquiridas tales como hipogamaglobulinemia, agamaglobulinemia variada común, y deficiencias selectivas de inmunoglobulina (e.g., deficiencia de IgA, pacientes infectados con un virus tal como rabia, con un tiempo de incubación más corto que la respuesta inmune del paciente; e individuos con trastornos hereditarios tales como síndrome diGeorge. Los polipéptidos de antagonista de GH, e.g., de hGH de la invención, pueden ser útiles para el tratamiento de gigantismo y acromegalia, diabetes y complicaciones (retinopatía diabética, neuropatía diabética) que surgen de la diabetes, enfermedades oculares vasculares (e.g., que implican neovascularización proliferativa) , nefropatía, y malignidades que responden a GH .
Las enfermedades oculares vasculares incluyen, e.g., retinopatía (ocasionadas e.g., por pre-madurez o anemia de célula enferma) y degeneración macular. Las malignidades que responden a GH incluyen, e.g., tumor de Wilm, sarcomas (e.g., sarcoma osteogénico), cánceres de mama, colon, próstata y tiroides y cánceres de tejidos que expresan el ARNm del receptor de GH (i.e., placenta, timo, cerebro, glándula salival, próstata, médula espinal, músculo esquelético, tráquea, cordón espinal, retina, nodo linfático y linfoma de Burkitt, carcinoma colorrectal, carcinoma pulmonar, leucemia linfoblástica y melanoma) . Los polipéptidos de agonista de GH, e.g., de hGH de la invención, pueden ser útiles, por ejemplo, para tratar falla renal crónica, falla del crecimiento asociada con insuficiencia renal crónica (CRI), corta estatura asociada con el síndrome de Turner, síndrome pediátrico Prader-Willi (PWS), pacientes de VIH con desgaste o caquexia, niños nacidos pequeños para la edad de gestación (SGA) , obesidad y osteoporosis . Las cantidades promedio de la GH, e.g., hGH, pueden variar y en particular deben basarse en las recomendaciones y prescripción de un médico calificado. La cantidad exacta de GH, e.g., hGH es cuestión de preferencia sometida a factores como el tipo exacto de la condición que se trata, la condición del paciente que se trata, así como los otros ingredientes en la. composición. La invención proporciona también la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de otro agente activo. La cantidad que va a darse puede determinarse fácilmente por el de experiencia ordinaria en la técnica en base a la terapia con hGH. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden fabricarse de manera convencional. En algunas modalidades, la invención proporciona un método de tratamiento que incluye la administración a un individuo que lo necesita, de una cantidad efectiva de una composición hormonal que comprende una hormona del crecimiento (GH) enlazada por una unión covalente a al menos un polímero soluble en agua, en donde la(s) unión (es) covalente (s) es una unión oxima. En algunas modalidades, los métodos incluyen la administración al individuo, e.g., humano, de una GH, e.g., hGH. En algunas modalidades, la GH, e.g., hGH incluye un aminoácido codificado de manera no natural tal como un aminoácido codificado de manera no natural que contiene carbonilo. En algunas modalidades, el aminoácido codificado de manera no natural es un aminoácido que contiene cetona, e.g., para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades, la GH, e.g., hGH, contiene un aminoácido codificado de manera no natural, e.g., para-acetilfenilalanina, sustituido en una posición en la GH, e.g., hGH correspondiente al aminoácido 35 en la SEQ ID NO: 2. El polímero soluble en agua puede ser un PEG. Los PEGs adecuados incluyen PEGs lineales y ramificados; puede utilizarse cualquier PEG descrito en la presente. En ciertas modalidades, el PEG es un PEG lineal de aproximadamente 0.1-100 kDa, o aproximadamente 1-100 kDa, o aproximadamente 10-50 kDa, o aproximadamente 20-40 kDa o aproximadamente 30 kDa. En algunas modalidades, la composición farmacéutica contiene una GH, e.g., hGH, enlazada a un PEG de 30 kDa mediante una unión oxima, en donde la unión oxima es entre una paraacetilfenilalanina en la GH ubicada en una posición correspondiente al aminoácido 35 en la SEQ ID NO: 2 y el PEG. En algunas modalidades, el individuo que se trata sufre de deficiencia pediátrica de la hormona del crecimiento, corta estatura idiopática, deficiencia adulta de la hormona del crecimiento de origen en la niñez, deficiencia adulta de la hormona del crecimiento de origen en la madurez, o deficiencia secundaria de la hormona del crecimiento. La GH, e.g., hGH puede administrarse al individuo en cualquier forma, vía, dosis, frecuencia, y duración adecuada como se describe en la presente y como se conoce en la técnica. en algunas modalidades, la invención proporciona un método de tratamiento que incluye la administración a un individuo que necesita el tratamiento, de una cantidad efectiva de una composición hormonal que comprende una hormona del crecimiento (GH) enlazada mediante una unión covalente a al menos un polímero soluble en agua, en donde el polímero soluble en agua es un polímero lineal, y en donde la composición hormonal se da a una frecuencia de no más de aproximadamente una vez cada tercer día, una vez cada 3, 4, 5 o 6 días, una vez a la semana, una vez cada 8, 9, 10, 11, 12 o 13 días, una vez cada dos semanas, una vez cada 15, 16, 17, 18, 19 o 20 días, una vez cada tres semanas, una vez cada 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 días, una vez al mes o menos que aproximadamente una vez al mes. Se apreciará que la frecuencia de administración puede alterarse en la discreción del individuo o, más típicamente, del profesional que lo trata, y que puede utilizarse cualquier combinación de frecuencias. En algunas modalidades, la composición de GH se administra no más de aproximadamente una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez al mes. En algunas modalidades, la composición de GH se administra no más de aproximadamente una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez al mes. En algunas modalidades, la composición de GH se administra no más de aproximadamente una vez por semana. En algunas modalidades, la composición de GH se administra no más de aproximadamente una vez cada dos semanas. En algunas modalidades, la composición de GH se administra no más de aproximadamente una vez al mes. La invención proporciona también la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de otro agente activo conjuntamente con la hGH de la presente invención. La cantidad que va a darse puede determinarse fácilmente por el de experiencia ordinaria en la técnica en base a terapia con hGH. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden fabricarse de manera convencional. EJEMPLOS Se ofrecen los siguientes ejemplos para ilustrar, pero no para limitar, la invención reivindicada. Ejemplo 1 Este ejemplo describe uno de muchos conjuntos de criterios potenciales para la selección de los sitios preferidos para la incorporación de aminoácidos codificado de manera no naturals en la hGH. Este ejemplo demuestra cómo se seleccionaron los sitios preferidos dentro del polipéptido de hGH para la introducción de un aminoácido codificado de manera no natural. Se utilizó la estructura cristalina 3HHR compuesta de hGH complejada con dos moléculas del dominio extracelular del receptor (hGHbp) , para determinar las posiciones preferidas en las cuales pueden introducirse uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals. Otras estructuras de hGH (e.g., 1AXI) se utilizaron para examinar la variación potencias de elementos estructurales primarios y secundarios entre los conjuntos de datos de la estructura cristalina. Las coordenadas de estas estructuras se encuentran disponibles en el Protein Data Bank (PDB) (Bernstein et al., J. Mol. Biol., 1997, 112 pp 535) o a través de The Research Collaboratory for Structural Bioinformatics PDB, disponible en la World Wide Web en rcsb.org. El modelo estructural 3HHR contiene la toda secuencia madura de 22 kDA de hGH con la excepción de los residuos 148-153 y el residuo F191 de terminación C que se omitieron debido a trastornos en el cristal. Se encuentran presentes dos puentes disulfuro formados por C52 y C165 y C182 y C185. La numeración de secuencias utilizada en este ejemplo es de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de hGH madura (variante de 22 kDA) mostrada en la SEQ ID NO: 2. Se utilizaron los siguientes criterios para evaluar cada posición de hGH para la introducción de un aminoácido codificado de manera no natural: el residuo (a) no debe interferir con la unión ya sea de hGHbp en base al análisis estructural de 3HHR, 1AXI, y 1HWG (estructuras cristalográficas de hGH conjugada con el monómero o dímero de hGHbp) , b) , no debe afectarse por la mutagénesis de visualización de alanina u homólogo (Cunningham et al., Science (1989) 244:1081-1085 y Cunningham et al., Science (1989) 243:1330-1336, (c) debe exponerse a la superficie y exhibir mínimas interacciones van der Waals o de unión de hidrógeno con los residuos circundantes, (d) debe ser ya sea suprimido o variable en variantes de hGH (e.g., Tyr35, Lys38, Phe92, Lysl40), (e) dará como resultado cambios conservadores al sustituirse con un aminoácido codificado de manera no natural y (f) podría encontrarse ya sea en regiones altamente flexibles (incluyendo, pero sin limitarse a circuito CD) o regiones estructuralmente rígidas (incluyendo, pero sin limitarse a hélice B) . adicionalmente, se realizaron cálculos adicionales en la molécula de hGH, utilizando el programa Cx (Pintar et al., (2002) Bioinformatics, 18 pp 980) para evaluar el grado de protrusión para cada átomo de proteína. Como resultado, en algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals se incorporan en, pero sin limitarse a, una o más de las siguientes posiciones en la GH, e.g., hGH: antes de la posición 1 (i.e., en la terminación N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (i.e., en la terminación carboxilo de la proteína) (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals se sustituyen en una o más de las siguientes posiciones: 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186 y 187 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals se sustituyen en una o más de las siguientes posiciones: 29, 33, 35, 37, 39, 49, 57, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 186 y 187 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals se sustituyen en una o más de las siguientes posiciones: 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145 y 155 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals se sustituyen en una o más de las siguientes posiciones: 30, 74, 103 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado de manera no naturals se sustituyen en una o más de las siguientes posiciones: 35, 92, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural en una o más de estas posiciones se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua, incluyendo, pero sin limitarse a las posiciones: antes de la posición 1 (i.e., en la terminación N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (i.e., en la terminación carboxilo de la proteína) (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural en una o más de estas posiciones se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua, incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones: 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186 y 187 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural en una o más de estas posiciones se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua, incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones: 29, 33, 35, 37, 39, 49, 57, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 186 y 187 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3). En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural en una o más de estas posiciones se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua, incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones: 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145 y 155 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural en una o más de estas posiciones se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua, incluyendo, pero sin limitarse a, las posiciones: 30, 74, 103 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural en una o más de estas posiciones se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua: 30, 35, 74, 92, 103, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural en una o más de estas posiciones se encuentra enlazado a un polímero soluble en agua: 35, 92, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . Algunos sitios para la generación de un antagonista de hGH incluyen: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, . 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123 y 127 o una adición antes de la posición 1, o una combinación de las mismas (SEQ ID NO: 2, o el aminoácido correspondiente en la SEQ ID NO: 1, 3 o cualquier otra secuencia de GH) . Estos sitios se seleccionaron utilizando el criterio ©-(e) del diseño de agonista. El diseño de antagonista también puede incluir modificaciones dirigidas al sitio de residuos del sitio I para incrementar la afinidad de unión a hGHbp. Ejemplo 2 Este ejemplo detalla la clonación y expresión de un polipéptido de hGH que incluye un aminoácido codificado de manera no natural en E. coli. Este ejemplo describe también un método para establecer la actividad biológica de polipéptidos de hGH modificados.
Los métodos para clonar hGH y sus fragmentos se detallan en las Patentes de E.U. Nos. 4,601,980, 4,604,359, 4,634,677, 4,658,021, 4,898,830, 5,424,199, y 5,795,745 que se incorporan mediante la referencia en la presente. El ADNc que codifica para la hGH de longitud total o la forma madura de hGH que carece de la secuencia de señal de terminación N se muestra en la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, respectivamente . Un sistema de translación introducido que comprende un ARNt ortogonal (O-ARNt) y una aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) se utiliza para expresar la hGH que contiene un aminoácido codificado de manera no natural. La O-RS aminoacila preferentemente el O-ARNt con un aminoácido codificado de manera no natural. A su vez, el sistema de translación inserta el aminoácido codificado de manera no natural en la hGH en respuesta a un codón de selección codificado. Tabla 2: Secuencias O-RS y O-ARNt fenilalamna p-BpaRS(l) SEQ ID NO 9 Aminoacil ARNt sintetasa para la incorporación de propargil- RS fenilalanina Propargil-PheRS SEQ ID NO 10 Aminoacil ARNt sintetasa para la íncorporacion de propargil- RS fenilalanina Propargil-PheRS SEQ ID NO 11 Arainoacil ARNt smtetasa para la íncorporacion de propargil- RS fenilalanina Propargil-PheRS SEQ ID NO 12 Aminoacil ARNt sintetasa para la incorporación de p- RS azido fenilalamna p-AZ-PheRS (1) SEQ ID NO 13 Aminoacil ARNt sintetasa para la incorporación de RS p azido fenilalamna p-Az-PheRS (3) SEQ ID NO 14 Aminoacil ARNt sintetasa para la íncorporacion de p-azido- RS femlalamna p-Az-PheRS (4) SEQ ID NO 15 Ammoacil ARNt sintetasa para la íncorporacion de p-azido- RS femlalamna p-AZ-PheRS (2) SEQ ID NO 16 Aminoacil ARNt sintetasa para la mcorporacion de p-acetil- RS femlalamna (L l) SEQ ID NO 17 Aminoacil ARNt smtetasa para la íncorporacion de p-acetil- RS femlalanina (L 5) SEQ ID NO 18 Aminoacil ARNt sintetasa para la íncorporacion de p-acetil- RS femlalanina (LW6) SEQ ID NO 19 Ammoacil ARNt sintetasa para la íncorporacion de p-azido- RS fenilalanma (AzPheRS-5) SEQ ID NO 20 Aminoacil ARNt sintetasa para la íncorporacion de p-azido- RS femlalanina (AzPheRS-6) La transformación de E. coli con plásmidos que contienen el gen de hGH modificado y el par de aminoacil ARNt sintetasa ortogonal/ARNt (específico para el aminoácido codificado de manera no natural deseado) permite la incorporación específica en el sitio del aminoácido codificado de manera no natural en el polipéptido de hGH. El E. coli transformado cultivado a 37°C en medio conteniendo entre 0.01-100 mM del aminoácido codificado de manera no natural particular, expresa la hGH modificada con alta fidelidad y eficiencia. La hGH marcada His que contiene un aminoácido codificado de manera no natural se produce mediante las células huésped de E. coli como cuerpos de inclusión o agregados. Los agregados se solubilizan y se purifican por afinidad bajo condiciones de desnaturalización en 6M guanidina HCl. El redoblamiento se lleva a cabo mediante diálisis a 4°C durante la noche en 50 mM de TRIS-HC1, pH 8.0, 40 uM de CuS04, y Sarkosyl al 2% (peso/v) . el material se dializa entonces contra 20 mM TRIS-HC1, pH 8.0, 100 mM de NaCl, 2 mM de CaCL2, seguido por el retiro de la marca His. Ver, Boissel et al., (1993) J. Bio. Chem., 268:15983-93. Los métodos para purificación de hGH son conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica y se confirman mediante SDS-PAGE, inmunoanálisis Western, o espectrometría de masa de trampa de ion de ionización por electroaspersión y lo similar.
La Figura 6 es un SDS-PAGE de polipéptidos de hGH purificados. Las proteínas de hGH mutantes marcadas His se purificaron utilizando la ProBond Nickel-Chelating Resin (Invitrogen, Carlsbad, CA) a través de procedimientos estándar de purificación de proteína marcada His proporcionados por el fabricante, seguidos por una columna de intercambio aniónico previo a la carga en el gel. El campo 1 muestra el marcador de peso molecular, y el campo 2 representa la hGH N-His sin la incorporación de un aminoácido no natural. Los campos 3-10 contienen mutantes de hGH N-His que comprenden la p-acetil-fenilalanina de aminoácido no natural en cada una de las posiciones Y35, F92, Ylll, G131, R134, K140, Y143 y K145, respectivamente. Para establecer adicionalmente la actividad biológica de los polipéptidos de hGH modificados, se utilizó un análisis de medición de un marcador aguas debajo de la interacción de la hGH con su receptor. La interacción de hGH con su receptor producido de manera endógena conduce a la fosforilación de tirosina de un transductor de señal y un activador del miembro de la familia de transcripción, STAT 5, en la línea celular de linfocito IM-9 humano. Se identificaron dos formas de STAT5, STAT5A y STAT5B a partir de la biblioteca de ADNc IM-9. Ver, e.g., Silva et al., Mol. Endocrinol (1996) 10 (5 ): 508-518. El receptor de la hormona del crecimiento humana en células IM-9 es selectivo para la hormona del crecimiento humana dado que ni la hormona del crecimiento de rata ni la prolactma humana dieron como resultado una fosforilación de STAT5 detectable. De manera importante, el dominio extracelular GHR de rata (L43R) y el G120R que contiene hGH compiten efectivamente contra la fosforilación de pSTAT5 estimulada por hGH. Las células IM-9 se estimularon con los polipeptidos hGH de la presente invención. Los lmfocitos IM-9 humanos se adquirieron de ATCC (Manassas, VA) y se desarrollaron en RPMl 1640 complementado con piruvato de sodio, penicilina, estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, Dan Diego) y 10% de suero de bovino fetal termo activado (Hyclone, Logan, UT) . Las células IM-9 se subalimentaron durante la noche en medio de ensayo (RPMl libre de rojo de fenol, Hepes lOmM, 1% de carbón vegetal/FBS tratado con dextrán, piruvato de sodio, penicilina y estreptomicina) antes de la estimulación con un rango de dosis de 12 puntos de polipéptidos hGH durante 10 mm. a 37°C. Las células estimuladas se fijaron con formaldehído al 1% antes de la permeabilizacion con metanol helado al 90% durante 1 hora en hielo. Se detecto el nivel de fosforilación de STAT5 mediante tinción intra-celular con un anticuerpo fosfo-STAT5 primario (Cell Signalmg, Technology, Beverly, MA) a temperatura ambiente durante 30 min seguido por un anticuerpo secundario conjugado con PE. La adquisición de la muestra se realizó sobre un ordenamiento FACS con datos adquiridos analizados sobre el software Flowjo (Tree Star Inc., Ashland, OR) . Los valores EC50 sederivaron de las curvas de respuesta a la dosis representadas con medios de intensidad fluorescente (MFI) contra la concentración de proteína utilizando SigmaPlot. La Tabla 3 de abajo resume los datos IM-9 generados con polipéptidos hGH mutantes. Se probaron varios polipéptidos hGH con una sustitución de aminoácido no natural en diferentes posiciones con células IM-9 humanas como se describe. Específicamente, la Figura 7, Panel A muestra los datos IM-9 para el polipéptido hGH etiquetado con His, y la Figura 7, Panel B muestra los datos IM-9 para hGH etiquetado con His que comprende la sustitución la p-acetil-fenilanina del aminoácido no natural para Y143. Se utilizó el mismo ensayo para valorar la actividad biológica de los polipéptidos hGH que comprende un aminoácido no natural que es PEGilado.
Ejemplo 3 Este ejemplo detalla la introducción del aminoácido que contiene carbonilo y la reacción subsecuente con un PEG conteniendo aminooxi Este ejemplo demuestra un método para la generación del polipéptido hGH que incorpora un aminoácido codificado no natural que contiene cetona que reacciona subsecuentemente con un PEG que confien aminooxi de aproximadamente 5,000 MW (peso molecular) . Cada uno de los residuos 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 11, 120, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145 y 166 identificados de acuerdo con el criterio del Ejemplo 1 (hGH) se sustituyen de manera separada con un aminoácido codificado de manera no natural que tiene la siguiente estructura: Las secuencias utilizadas para la incorporación del sitio específico de p-acetil-fenilalanina en hGH son SEQ ID NO: 2 (hGH) yJ SEQ ID NO: 4 (ARNmut, M. jannaschií ARNmt C TyUrA ), y la 16, 17 o 18 (TyrRS LWl, 5 o 6) descritas en el Ejemplo 2 anterior .
Una vez modificado, la variante del polipéptido hGH que comprende el aminoácido que contiene carboxilo reacciona con un PEG que contiene aminooxi derivado de la forma: R-PEG(N)-0-(CH2)n-0-NH2 en donde R es metilo, n es 3 y N es aproximadamente de 5,000 MW. la HgH purificado, que contiene p-acetilfenilalanina disuelto en 10 mg/ml en MES 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 6.0, Hepes 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 7.0 o en Acetato de Sodio 10 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 4.5, se hace reaccionar conun exceso de 10 a 100 veces de PEG conteniendo aminooxi, y después se agita durante 10 -16 horas a temperatura ambiente (Jencks, W.J. Jm Chem . Soc . 1959, 81, pp 475) . la HgH de PEG se diluye entonces en amortiguador apropiado por purificación y análisis inmediatos . Ejemplo 4 Conjugación con PEG que consiste de un grupo hidroxilamina enlazado al PEG a través de un enlace amida. Un reactivo PEG que tiene la siguiente estructura se acopla a un aminoácido codificado no natural que contiene cetona utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 3: R-PEG (N) -0- (CH2) 2-NH-C (0) (CH2) n-0-NH2 En donde R = metilo, n=4 y N es aproximadamente de 20,000 MW .
Las condiciones de reacción, purificación y análisis son como se describe en el Ejemplo 3. Ejemplo 5 Este Ejemplo detalla la introducción de dos distintos aminoácidos codificados no naturales en péptidos hGH. Este ejemplo demuestra un método para la generación de un polipéptido hGH que incorpora aminoácidos codificados no naturales que comprenden una funcionalidad cetona en dos posiciones entre los siguientes residuos: E30, E74, Y103, K38,K41, K140 Y K145. El polipéptido hGH se prepara como se describe en los Ejemplos 1 y 2, excepto que el codón selector se introduce en dos distintos sitios dentro del ácido nucleico . Ejemplo 6 Este ejemplo detalla la conjugación del polipéptido hGH a un PEG que contiene hidrazida y la subsecuente reducción in si tu . Un polipéptido que incorpora un aminoácido que contiene carboxilo se prepara de acuerdo con el procedimiento descrito en los Ejemplos 2 y 3. Una vez modificado el PEG que contiene hidrazida que tiene la siguiente estructura se conjuga al polipéptido hGH: R-PEG (N) -O- (CH2)2-NH-C(0) (CH2 ) n-X-NH-NH2 En donde R = metilo, n = 2 y N = 10, 000 MW y X es un grupo carbonilo (C=0) . La hGH purificada conteniendo p-acetilfenilalanina disuelta entre 0.1-10 mg/ml en MES 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 6.0, Hepes 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 7.0, o en Acetato de Sodio 10 mM (Sigma Chemical, St . Louis, MO) pH 4.5, se hiso reaccionar con un exceso de 1 a 100 veces de PEG conteniendo hidrazida, y la hidrazona correspondiente se redujo in si tu mediante la adición de NaCNBH3 de existencias (Sigma Chemical, St. Louis, MO) , disuelto en H20, hasta una concentración final de 10-50 mM. Las reacciones se llevaron a cabo en la oscuridad a 4°C a temperatura ambiente durante 18-24 horas. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de Tris ÍM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) a aproximadamente pH 7.6 hasta una concentración final de Tris de 50 mM o diluido en amortiguador apropiado para purificación inmediata. Ejemplo 7 Este Ejemplo detala la introducción de un aminoácido conteniendo alquino en un polipéptido hGH y la derivación con mPEG-azida. Los siguientes residuos 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 131, 133, 134, 135, 136, 140, 143, 145 y 155, se sustituyeron cada uno con el siguiente aminoácido codificado no natural ( hGH ; SEQ I D NO : 2 Las secuencias utilizadas para la incorporación de sitio específico de p-propargil-tirosina en hGH son SEQ ID NO: 2 (hGH), SEQ ID NO: 4 (ARNmut, M. jannaschii ARNmt C TyUr A ) , 9, 10 u 11 descritas en el Ejemplo 2 anterior. El polipéptido hGH que contiene la propargil tirosina se expresa en E . col i y se purifica utilizando las condiciones descritas en el Ejemplo 3.
La hGH purificada conteniendo propargil-tirosina disuelta entre 0.1-10 mg/ml en amortiguador PB (fosfato de sodio 100 mM, NaCl 0.15 mM, pH = 8 ) y un exceso de 10 a 100 veces de PEG conteniendo azida se agregó a la mezcla de reacción. Se agregó entonces a la mezcla de reacción una cantidad catalítica de CuS04 y alambre de Cu. Después que la mezcla se incubó (incluyendo pero sin limitarse a, aproximadamente 4 horas a temperatura ambiente o 37 °C, o durante la noche a 4°C), se agregó H20 y la mezcla se filtró a través de una membrana de diálisis. La muestra se analizó para la adición, incluyendo pero sin limitarse a, mediante procedimientos similares a los descritos en al Ejemplo 3.
En este Ejemplo el PEG tendrá la siguiente estructura : R-PEG(N)-0-(CH2)2-NH-C(0) (CH2)n-N3 En donde R es metilo, n es 4 y N es de 10,000 MW. Ejemplo 8 Este ejemplo detalla la sustitución de un aminoácido hidrofóbico grande en un polipéptido hGH con propargil tirosina. Un residuo presente en Phe, Trp o Tyr con una de las siguientes regiones de hGH: 1-5 (terminal N) , 6-33 (hélice A), 34-74 (región entre hélice A y hélice B, el ciclo A-B), 75-96 (hélice B) , 97-105 (región entre hélice B y hélice C, ciclo B-C), 106.12 (hélice C) , 130-153 (región entre hélice C y hélice D, ciclo C-D) , 154-183 (hélice D) , 184-191 (terminal C) (SEQ ID NO: 7) Una vez modificado, el PEG se une a una variante del polipéptido hGH que comprende el aminoácido que contiene alquino. El PEG tendrá la siguiente estructura: Me-PEG(N)-0- (CH2)2-N3 y los procedimientos de acoplamiento seguirían estos en el Ejemplo 7. Esto generará una variante de polipéptido hGH que comprende un aminoácido codificado no natural que es aproximadamente isostérico con uno de los que ocurren de manera natural, los grande aminoácidos hidrofóbicos y que se modifican con un derivado de PEG en un sitio distinto dentro del polipéptido. Ejemplo 9 Este ejemplo detall la generación de un homodímero, heterodímero, homomultímero o heteromultímero de polipéptido hGH separado por uno o más enlaces PEG. La variante de polipéptido hGH contniendo alquino producido en el Ejemplo 7 se hace reaccionar con un derivado PEG bifuncional de la forma: N3- (CH2) n-C (O) -NH- (CH2) 2-O-PEG (N) -O- (CH2) 2-NH-C (O) - (CH2) n-N3 en donde n es 4 y el PEG tiene un MW promedio de aproximadamente 5,000, para generar el homodímero de polipéptido hGH correspondiente en donde las dos moléculas de hGH se separan físicamente por PEG. En una manera análoga un polipéptido PEG puede acoplarse a uno o más de otros polipéptidos para formar heterodímeros, homomultímeros o heteromultímeros. El acoplamiento, purificación y anánlis se realizará como en el Ejemplo 7 y 3. Ejemplo 10 Este ejemplo detalla el acoplamiento de un residuo sacárido a un polipéptido de hGH. Uno del los siguientes residuos se sustituye con un aminoácido no natural de los siguientes: 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186 y 187 (hGH, SEQ ID NO: 2) como se describe en el Ejemplo 3. p 'I di I Una vez modificada, la variante de polipéptido hGH que comprende el aminoácido que contiene carboxilo se hiso reaccioner con un análogo aminooxy ß-enlazado de N-acetilglucosamina (GlcNAc) . La variante de polipéptido hGH (10 mg/ml) y el sacárido aminooxi (21 mM) se mezclan en amortiguador de acetato de sodio lOOmM acuoso (pH 5.5.) y se incuban a 37°C durante 7 a 26 horas. Un segundo sacárido se acopla al primero de manera enzimática al incubar el polipéptido hGH conjugado al sacárido (5 mg/ml) con UDP-galactosa (16 mM) y ß-1 , 4-galactosiltransferasa (0.4 unidades/ml) en amortiguadoir HEPES 150 mM (pH 7.4) durante 48 horas a temperatura ambiente (Schanbacher et a l . , J. Bi ol .
Chem . 1970, 245, 5057-5061). Ejemplo 11 Este ejemplo etalla la generación de un antagonista de polipéptido hGH PEGilado. Uno de los siguientes residuos 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123 o 127 (hGH, SEQ ID NO: 2 o el aminoácido corerspondiente en la SEQ ID NO: 3), se sustituye con el siguiente aminoácido codificado de manera no natural como se describe en el Ejemplo 3. -•-v H.. ?"Ü f Una vez modificada, la variante de polipéptido hGH que comprende el aminoácido que contiene carboxilo reaccionará con un derivado de PEG conteniendo ammooxi de la forma: R-PEG (N) -O- (CH2) n-0-NH2 en donde R es metilo, n es 4 y N es de 20,000 MW para generara una antagonista de polipéptido hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que se modifica con un derivado de PEG en un solo sitio dentro del polipéptido. El acoplamiento, purificación y anánlis se realizan como en el Ejemplo 3.
Ejemplo 12 Generación de un homodímero, heterodímero, homomultímero o heteromúltímero de polipéptido hGH en el que las Moléculas hGH se Enlazan Directamente Una variante de polipéptido hGH que comprende el aminoácido que contiene alquino puede acoplarse directamente a otra variante de polipéptido hGH que comprende el aminoácido que contiene azido, cada una de las cuales comprende sustituciones de aminoácido codificado de manera no natural en los sitios descritos en, pero sin limitarse a, el Ejemplo 10. Esto generará el homodímero de polipéptido hGH correspondiente en donde las dos variantes de polipéptido hGH se unen físicamente en la interfwerencia de unión del sitio II. En una manera anáoga un polipéptido hGH puede acoplarse a uno u otros más polipéptidos para formar heterodímeros, homomultímeros o heteromultímeros. El acoplamiento, purificación y anánlis se realiza como en el Ejemplo 3, 6 y 7. Ejemplo 13 PEG-OH+Br-(CH2)n-C=CR' - PEG-O- (CH2) n-C=CR' A B El polialquilen glicol (P-OH) se hace reaccionar con el alquil haluro (A) para formar el éter (B) . En estos compuestos, n es un entero de uno a nueve y R' puede ser un grupo alquilo o heteroalquilo de Cl a C20 saturado o insaturdo, de cadena recta o ramificada. R' también puede ser un ciclil alquilo o ciclil heteroalquilo saturado o insaturado C3 a C7, un grupo arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido, o un gupo alcarilo (el alquilo es un alquilo Cl a C20 saturado o insaturado) o heteroalcarilo . Típicamente, PEG-OH es polietilen glicol (PEG) o monometoxi polietilen glicol (mPEG) que tiene un peso molecular de 800 a 40, 000 Daltones (Da) . Ejemplo 14 mPEG-OH+Br-CH2-C=CH-mPEG-0-CH2-C=CH Se trató mPEG-OH con un peso molecular de 20,000 Da (mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, Sunbio) con NaH (12 mg, 0.5 mmol) en THF (35 ml ) . Una solución de bromuro de propargilo, disuelto como un 80% por peso de solución en xileno (0.56 ml, 5 mmol, 50 equiv., Aldrich) y una cantidad catalítica de Kl se agregaron entonces a la solución y la mezcla resultante se calentó a reflujo durante 2 horas. Se agregó entonces agua (1 ml ) y el solvente se retiró bajo vacío. Al residuo se agregó CH2C12 (25 ml) y la capa orgánica se separó, se secó sobre Na2S04 anhidro y el volumen se redujo a aproximadamente 2 ml . Esta solución de CH2C12 se agregó a gotas a dietil éter (150 ml). Se recolectó el precipitado resultante, se lavó con varias porciones de dietil éter frío y se secó para proporcionar propargil-O-PEG. Ejemplo 15 mPEG-OH+Br- (CH2) 3-C=CH?mPEG-0- (CH2) 3-C=CH Se trató mPEG-OH con un peso molecular de 20,000 Da (mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, Sunbio) con NaH (12 mg, 0.5 mmol) en THF (35 ml ) . Se agregaron entonces a la mezcla cincuenta equivalentes de 5-bromo-l-pentino (0.53 ml, 5 mmol, Aldrich) y una cantidad catalítica de Kl . La mezcla resultante se calentó a reflujo durante 16 horas. Se agregó entonces agua (1 ml) y el solvente se retiró bajo vacío. Al residuo se agregó CH2C12 (25 ml) y la capa orgánica se separó, se secó sobre Na2S04 anhidro y el volumen se redujo a aproximadamente 2 ml . Esta solución de CH2C12 se agregó a gotas a dietil éter (150 ml). Se recolectó el precipitado resultante, se lavó con varias porciones de dietil éter frío y se secó para proporcionar el alquino correspondiente. Puede utilizarse 5-cloro-l-pentino en una reacción similar. Ejemplo 16 ( 1 ) /n-HOCH2C6H OH+NaOH+Br-CH2-C=CH?inHOCH2C6H40-CH2-C=CH (2) m-H0CH2C6H40-CH2-C=CH+MsCl+N (Et) 3?Í?-MSOCH2C6H40-CH2-C=CH (3) /n-MsOCH2C6H40-CH2-C=CH+LiBr?m-BrCH2C6H40-CH2-C=CH ( 4 ) mPEG-OH+/n-Br-CH2C6H40-CH2-C=CH?mPEG-0-CH2-C6H40-CH2-C=CH A una solución de 3-hidroxibencilalcohol (2.4 g, 20 mmol) en THF (50 ml) y agua (2.5 ml) se agregó primero hidróxido de sodio en polvo (1.5 g, 37.5 mmol) y después una solución de bromuro de propargilo, se disolvió como un 80% por peso de solución en xileno (3.36 ml, 30 mmol) . La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 6 horas. A la mezcla se agregó 10% de ácido cítrico (2.5 ml) y se retiró el solvente bajo vacío. El residuo se extrajo con etil acetato (3 x 15 ml ) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución de NaCl saturado (10 ml ) , se secó sobre MgS04 y se concentró para dar el 3-propargiloxibencil alcohol. Se agregaron metanosulfonil cloruro (2.5 g, 15.7 mmol) y trietilamina (2.8 ml, 20 mmol) a una solución del compuesto 3 (2.0 g, 11.0 mmol) en CH2C12 a 0°C y la reacción se colocó en el refrigerador durante 16 horas. Una preparación usual proporcionó el mesilato como un aceite amarillo pálido. Este aceite (2.4 g, 9.2 mmol) se disolvió en THF (20 ml) y se agregó LiBr (2.0 g, 23.0 mmol). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 1 hora y se enfrió entonces a temperatura ambiente. A la mezcla se agregó agua (2.5 ml) y el solvente se retiró bajo vacío. El residuo se extrajo con etil acetato (3 x 15 ml ) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución de NaCl saturada (10 ml ) , se secó sobre Na2S04 anhidro y se concentró para dar el bromuro deseado. Se disolvió mPEG-OH 20 kDa (1.0 g, 0.005 mmol Sunbio) en THF (20 ml ) y la solución se enfrió en un baño de hielo. Se agregó NaH (6 mg, 0.25 mmol) con agitación vigorosa durante un periodo de varios minutos seguido por la adición del bromuro obtenido de lo anterior (2.55 g, 11.4 mmol) y una cantidad catalítica de Kl . El baño frío se retiró y la mezcla resultante se calentó a reflujo durante 12 horas. Se agregó agua (1.0 ml ) a la mezcla y el solvente se retiró bajo vacío. Al residuo se agregó CH2C12 (25 ml ) y la capa orgánica se separó, se secaron sobre Na S04 anhidro y el volumen se redujo a aproximadamente 2 ml . La adición a gotas a una solución de éter (150 ml) resultó en un precipitado blanco, que se recolectó para proporcionar el derivado PEG. Ejemplo 17 mPEG-NH2+X-C(0) - (CH2 ) n-C=CR' ?mPEG-NH-C (O) - (CH2)n-C=CR' Los polímeros de poli (etilen glicol) que contienen la terminal alquino pueden también obtenerse al acoplar un polímero de poli (etilen glicol) que contiene un grupo funcional terminal a una molécula reactiva que contiene la funcionalidad alquino como se muestra arriba. n se encuentra entre 1 y 10. R' puede ser H o un grupo alquilo pequeño de Cl a C4. Ejemplo 18 ( 1 ) H02C- ( CH2 ) 2-C=CH+NHS + DCC?NHSO-C ( 0 ) - ( CH2 ) 2-C=CH ( 2 ) mPEG-NH2+NHSO-C ( O ) - ( CH2 ) 2-C=CH?mPEG-NH-C ( O ) - ( CH2 ) 2-C=CH Se disolvió ácido 4-pentinóico (2.943 g, 3.0 mmol) en CH2C12 (25 ml). Se agregaron N-hidroxisuccinimida (3.80 g, 3.3 mmol) y DCC (4.66 g, 3.0 mmol) y la solución se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El éster 7 NHS crudo resultante se utilizó en la siguiente reacción sin purificación adicional. Se disolvió mPEG-NH2 con un peso molecular de 5, 000 Da (mPEG-NH2, 1 g, Sunbio) en THF (50 ml) y la mezcla se enfrió a 4°C. Se agregó éster 7 NHS (400 mg, 0.4 mmol)en porciones con agitación vigorosa. La mezcla se dejó agitar durante 3 horas mientras se templó a temperatura ambiente. Se agregó entonces agua (2 ml ) y el solvente se retiró bajo vacío. Al residuo se agregó CH2C12 (50 ml) y la capa orgánica se separó, se secó sobre Na2S04 anhidro y el volumen se redujo a aproximadamente 2 ml . Esta solución de CH2C12 se agregó a gotas al éter (150 ml ) . El precipitado resultante se recolectó y se secó in vacuo. Ejemplo 19 Este ejemplo representa la preparación del éster de metano sulfonilo de poli (etilen glicol), que también puede referirse como el metanosulfonato o mesilato de poli (etilen glicol). El tosilato correspondiente y los haluros pueden prepararse mediante procedimientos similares. mPEG-OH+CH3S02Cl+N (Et ) 3?-mPEG-0-S02CH3?mPEG-N3 El mPEG-OH (MW = 3,400, 25 g, 10 mmol) en 150 ml de tolueno se destiló aceotrópicamente durante 2 horas bajo nitrógeno y la solución se enfrió a temperatura ambiente. Se agregaron 40 ml de CH2C12 seco y 2.1 ml de trietilamina seca (15 mmol) a la solución. La solución se enfrió en un baño de hielo y se agregó a gotas 1.2 ml de metanosulfonil cloruro destilado (15 mmol) . La solución se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante la noche y la reacción se enfrió al agregar 2 ml de etanol absoluto. La mezcla se evaporó bajo vacío para retirar los solventes, principalmente aquellos diferentes al tolueno, se filtró, se concentró de nuevo bajo vacío y después se precipitó en 100 ml de dietil éter. El filtrado se lavó con varias porciones de dietil éter frío y se secó in vacuo para producir el mesilato. El mesilato (20 g, 8 mmol) se disolvió en 75 ml de THF y la solución se enfrió a 4°C. A la solución enfriada se agregó azida de sodio (1.56 g, 24 mmol). La reacción se calentó a reflujo bajo nitrógeno durante 2 horas. Los solventes se evaporaron entonces y el residuo se diluyó con CH2C12 (50 ml ) . La fracción orgánica se lavó con solución de NaCl y se secó sobre MgS04 anhidro. El volumen se redujo a 20 ml y el producto se precipitó mediante la adición a 150 ml de éter seco frío. Ejemplo 20 (1) N3-C6H4-C02H?N3-C6H4CH2OH (2) N3-C6H4CH2OH?Br-CH2-C6H4-N3 (3) mPEG-OH+Br-CH2-C6H4-N3?mPEG-0-CH2-C6H4-N3 Puede producirse 4-azidobencil alcohol utilizando el método descrito en la Patente de E.U. No. 5,998,595 que se incorpora en la presente mediante la referencia. Se agregaron metanosulfonil cloruro (2.5 g, 15.7 mmol) y trietilamina (2.8 ml, 20 mmol) a una solución de 4-azidobencil alcohol (1.75 g, 11.0 mmol) en CH2C12 a 0°C y la reacción se colocó en el refrigerador durante 16 horas. La preparación usual produjo el mesilato como un aceite amarillo pálido. Este aceite (9.2 mmol) se disolvió en THF (20 ml) y se agregó LiBr (2.0 g, 23.0 mmol) . La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 1 hora y después se enfrió a temperatura ambiente. A la mezcla se agregó agua (2.5 ml) y el solvente se retiró bajo vacío. El residuo se extrajo con etil acetato (3 x 15 ml) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución de NaCl saturada (10 ml), se secaron sobre Na2S04 anhidro y se concentraron para dar el bromuro deseado . El mPEG-OH 20 kDa (2.0 g, 0.1 mmol, Sunbio) se trató con NaH (12 mg, 0.5 mmol) en THF (35 ml) y se agregó el bromuro (3.32 g, 15 mmol) a la mezcla junto con una cantidad catalítica de Kl . La mezcla resultante se calentó a reflujo durante 12 horas. Se agregó agua (1.0 ml) a la mezcla y el solvente se retiró bajo vacío. Al residuo se agregó CH2C12 (25 ml) y la capa orgánica se separó, se secó sobre Na2S04 anhidro y el volumen se redujo a aproximadamente 2 ml . La adición a gotas a una solución de éter (150 ml) resultó en un precipitado, que se recolectó para producir mPEG-0-CH2-C6H4-N3. Ejemplo 21 NH2-PEG-0-CH2CH2C02H + N3-CH2CH2C?2-NHS ? N3-CH2CH2.C (O) NH-PEG- 0-CH2CH2C02H Se disolvió NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H (MW 3,400 Da, 2.0 g) en una solución acuosa saturada de NaHC03 (10 ml) y la solución se enfrió a 0°C. Se agregó propianato de 3-azido-l-N-hidroxisuccinimido (5 equiv.) con agitación vigorosa. Después de 3 horas, se agregaron 20 ml de H20 y la mezcla se agitó por 45 minutos adicionales a temperatura ambiente. El pH se ajustó a 3 con 0.5 N H2S04 y se agregó NaCl a una concentración de aproximadamente 15% por peso. La mezcla de reacción se extrajo con CH2CI2 (100 ml x 3), se secó sobre Na2S04 y se concentró. Después de la precipitación con dietil éter frío, el producto se recolectó mediante filtración y se secó bajo vacío para producir el derivado PEG omega-carboxi-azida . Ejemplo 22 mPEG-OMs+HC=Li?mPEG-0-CH2-CH2-C=H A una solución de acetiluro de litio (4 equiv), preparada como se conce en la técnica y enfriada a -78 °C en THF, se agregó a gotas una solución de mPEG-OMs disuelta en THF con agitación vigorosa. Después de 3 horas, la reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se enfrió con la adición de 1 ml de butanol. Se agregaron entonces 20 ml de H20 y la mezcla se agitó durante 45 minutos adicionales a temperatura ambiente. El pH se ajustó a 3 con 0.5 N H2S04 y se agregó NaCl a una concentración de aproximadamente 15% por peso. La mezcla de reacción se extrajo con CH2CI2 (100 ml x 3), se secó sobre Na2S04 y se concentró. Después de la precipitación con dietil éter frío, el producto se recolectó mediante filtración y se secó bajo vacío para producir el 1-(but-3-iniloxi) -metoxipolietilen glicol (mPEG) . Ejemplo 23 Se incorporaron aminoácidos que contienen azida y acetileno selectivamente en el sitio en proteínas utilizando los métodos descritos en L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500, J.W. Chin et al., Science 301:964-7 (2003), J.W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J.W. Chin & P.G. Schultz, (2002), Chem Bio Chem 3 (11) : 1135-1137; J.W. Chin, et al., (2002), PNAS Unites States of America 99:11020-11024: y L. Wang & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm. , 1:1-11. Una vez que los aminoácidos se incorporaron, se llevó a cabo la reacción de cicloadición con 0.01 mM de proteína en amortiguador de fosfato (PB), pH 8, en la presencia de 2 mM de derivado PEG, 1 mM de CuS04 y ~1 mg de alambre de Cu durante 4 horas a 37 °C. Ejemplo 24 Este ejemplo describe la síntesis de derivados de p-Acetil-D, L-fenilalanina (pAF) y m-PEG-hidroxilamina . Se sintetizó el pAF racémico utilizando el procedimiento previamente descrito en Zhang, Z., Smith, B.A.C., Wang, L., Brock, A., Cho, C. & Schultz, P.G., Biochemistry, (2003) 42, 6735-6746. Para sintetizar el derivado de m-PEG-hidroxilamina, se completaron los siguientes procedimientos. A una solución de ácido (N-t-Boc-aminooxi) acético (0.382 g, 2.0 mmol) y 1,3- Diisoporpilcarbodiimida (0.16 ml, 1.0 mmol) en diclorometano (DCM, 70 ml ) , que se agitó a temperatura ambiente (RT) durante 1 hora, se agregaron metoxi-plietilen glicol amina (m-PEG-NH2, 7.5 g, 0.25 mmol, Mt . 30 K, de Bio Vectra) y Diisopropiletilamina (0.1 ml, 0.5 mmol). La reacción se agitó a RT durante 48 horas y después se concentró a aproximadamente 100 ml . La mezcla se agregó a gotas a éter frío (800 ml) . El producto t-Boc protegido se precipitó y se recolectó mediante filtración, se lavó mediante 3xl00ml de éter. Se purificó adicionalmente al re-disolverse en DCM (100 ml) y se precipitó en éter (800 ml) dos veces. El producto se secó al vacío produciendo 7.2 g (96%), confirmado por NMR y prueba de Nihidrina. El deBoc del producto protegido (7.0 g) obtenido arriba se llevó a cabo en 50% de TFA/DCM (40 ml) a 0°C durante 1 hora y después a RT durante 1.5 horas. Después de retirar la mayoría de TFA al vacío, la sal de TFA del derivado de hidroxilamina se convirtió a la sal de HCl al agregar al residuo 4N HCl en dioxano (1 ml) . El precipitado se disolvió en DCM (50 ml) y se re-precipitó en éter (800 ml). El producto final (6.8 g, 97%) se recolectó mediante filtración, se lavó con éter 3x 100 ml, se secó al vacío, se almacenó bajo nitrógeno. Se sintetizaron otros derivados de PEG (5K, 20K) hidroxilamina utilizando el mismo procedimiento . Ejemplo 25 Este ejemplo describe los métodos de expresión y purificación utilizados para polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido no natural. Las células huésped se han transformado con ARNt ortogonal, sintetasa de ARNt aminoacil ortogonal y construcciones de hGH. Un pequeño intento a partir de una provisión de glicerol congelado de las células DHlOB (fis3) transformadas se desarrollaron primero en 2 ml del medio definido (medio mínimo de glucosa complementada con leucina, isoleucina, metales en trazas y vitaminas) con 100 µg/ml de ampicilina a 37°C. Cuando el OD6oo alcanzó 2-5, se transfirieron 60 µl a 60 ml del medio fresco definido con 100 µg/ml de ampicilina y de nuevo se desarrollaron a 37°C a un OD6oo de 2-5. Se transfirieron 50 ml del cultivo a 2 litros del medio definido con 100 µg/ml de ampicilina en un fermentador de 5 litros (Sartorius BBI). El pH del fermentador se controló a un pH 6.9 con carbonato de potasio, la temperatura a 37°C, la tasa de flujo de aire a 5 lpm y la espuma con el desespumante de polialquileno KFO F119 (Lubrizol). Las velocidades de agitación se ajustaron automáticamente para mantener los niveles de oxígeno disueltos >30% y se utilizó oxígeno puro para complementar el rociado de aire si las velocidades del agitador alcanzan su valor máximo. Después de 8 horas a 37°C, el cultivo se alimentó a un concentrado de 50X del medio definido a una tasa exponencialmente incrementada para mantener una tasa de crecimiento específica de 0.15 horas"1. Cuando el OD6oo alcanzó aproximadamente 100, se agregó una mezcla racémica de para-acetil-fenilalanina a una concentración final de 3.3 mM y la temperatura se disminuyó a 28°C. Después de 0.75 horas, se agregó isopropil-b-D-tiogalactopiranosida a una concentración final de 0.25 mM. Se desarrollaron las células unas 8 horas adicionales a 28°C, se granularon y se congelaron a -80°C hasta el procesamiento adicional . Las proteínas de hGH mutantes His etiquetadas se purificaron utilizando el ProBond Níkel-Chelating Resin (Resina de Quelación de Niquel ProBond) (Invitrogen, Carlsbad, CA) a través de los procedimientos estándar de purificación de la proteína His etiquetada proporcionados por el manual de instrucción de Invitrogen, seguido por una columna de intercambio aniónico. La HgH purificada se concentró a 8 mg/ml y el amortiguador se intercambió con el amortiguador de la reacción (20 mM de acetato de sodio, 150 mM NaCl, mM EDTA, pH 4.0) . Se agregó polvo de MPEG-Oxiamina a la solución de hGH a una proporción molar de 20:1 de PEG:hGH. La reacción se llevó a cabo a 28°C durante 2 días con agitación suave. El PEG-hGH se purifició a partir de PEG y hGH sin reaccionar a través de una columna de intercambio aniónico. La calidad de cada hGH mutante PEGilado se evaluó mediante tres ensayos antes de introducir experimentos animales. Se examinó la pureza del PEG-hGH al correr un gel NuPAGE Bis-Tris de arcrilamida al 4-12% con MES SDS corriéndole amortiguador bajo condiciones sin reducción (Invitrogen) . Los geles se tiñeron con azul Coomassie. La banda de PEG-hGH fue mayor del 95% de pureza en base a la exploración de densitometría. El nivel de endotoxina en cada PEG-hGH se probó mediante un ensayo LAL cinético utilizando el equipo KTA2 de Charles River Laboratorios (Wilmington, mA) y fue menor de 5 EU por dosis. Se valoró la actividad biológica del PEG-hGH con el bioensayo IM-9 pSTAT5 (mencionado en el Ejemplo 2) y el valor EC50 fue menor de 15 nM.
Ejemplo 26 Este ejemplo describe los métodos para evaluar la purificación y homogeneidad de los polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido no natural. La Figura 8 es un SDS-PAGE de los polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido no natural en la posición 92. Las líneas 3, 4 y 5 del gel muestran hGH que comprende una p-acetil-fenilalanina en la posición 92 covalentemente enlazada ya sea con un 5 kDa, 20 kDa o 30 kDa de la molécula PEG. Los polipéptidos hGH adicionales comprenden un aminoácido no natural que es PEGilado se muestran en la Figura 11. Se cargaron cinco µg de cada proteína PEG-hGH en cada SDS-PAGE. Figura 11, Panel A: Línea 1, marcador de peso molecular; línea 2, estándar de referencia WHO rhGH (2 µg) ; líneas 3 y 7, 30KPEG-F92pAF; línea 4, 30KPEG-Y35pAF; línea 5, 30KPEG-Rl34pAF; línea 6, 20KPEG-R134pAF; línea 8, estándar de referencia WHO rhGH (20 µg) . Figura 11, Panel B: Línea 9, marcador de peso molecular, línea 10, estándar de referencia WHO rhGH (2 µg) ; línea 11, 30KPEG-F92pAF; línea 12, 30KPEG-K145pAF; línea 13, 30KPEG-Y143pAF; línea 14, 30KPEG-G131pAF; ; línea 15, 30KPEG-F92pAF/G120R, línea 16 Estándar de referencia WHO rhGH (20 µg) . La Figura 9 muestra la actividad biológica de los pllipéptidos hGH PEGilados (5 kDa, 20 kDa o 30 kDa de PEG) en células IM-9; los métodos se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 2.
La pureza del conjugado hGH-PEG puede valorarse mediante degradación proteolítica (incluyendo pero sin limitarse a desdoblamiento de tripsina) seguiuda por análisis de espectrometría de masa. Pepinsky RB . , et al., J. Pharmacol . & Exp . Ther . 297 (3 ): 1059-66 (2001). Los métodos para llevar a cabo la digestión tríptica también se describen en la European Pharmacopoeia (2002) 4a Edición pp . 1938). Se llevaron a cabo las modificaciones para los métodos descritos. Se dializaron las muestras durante la noche en 50 nM TRIS-HC1, pH 7.5. Se incubaron los polipéptidos rhGH con tripsina (tripsina tratada con TPCK, Worthington) a una proporción de masa de 66:1 durante 4 horas en una baño de agua a 37°C. Las muestras se incubaron en hielo por varios minutos para detener la reacción de la digestión y subsecuentemente mantenerse a 4°C durante el análisis HPLC. Las muestras digeridas (~200 µg) se cargaron sobre una columna Vydac C-8 de 25 por 0.46 cm (tamaño de perla 5 µm, tamaño de poro 100 A) en 0.1% de ácido trifluoroacético y se eluyó con un gradiente de 0 a 80% de acetonitrilo durante 70 minutos a una tasa de flujo de 1 ml/min a 30°C. Se monitoreó la elusión de los péptidos trípticos mediante absorbencia a 214 m. La Figura 10, Panel A representa la estructura primaria de hGH con los sitios de desdoblamiento de tripsina indicados y la sustitución del aminoácido no natural, F92pAF, especificada con una flecha (Figura modificada de Becker et al. Biotechnol Appl Biochem. (1988) 10 (4 ): 326-337 ) . El Panel B muestra los mapas trípticos sobrepuestos de los péptidos generados a partir de un polipéptido hGH que comprende un aminoácido codificado no de manera natural que es PEGilado (30K PEG His6-F92pAF rhGH, etiquetado A), los péptidos generados a partir de un polipéptido hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural (His6~F92pAF rhGH, etiquetado B) y péptidos generados a partir de la hGH tipo silvestre (WHO rhGH, etiquetada C) . La comparación de los mapas trípticos de WHO rhGH y His6-F92pAF rhGH revela solo dos cambios pico, el pico 1 de péptido y el pico 9 de péptido y los picos restantes son idénticos. Estas diferencias se ocasionan por la adición del His6 sobre la N-terminal del His6-F92pAF rhGH expresado, dando como resultadoun cambio del pico 1; mientras que el cambio en el pico 9 se ocasiona por la sustitución de fenilalanina en el residuo 92 con p-acetil-fenilalanina. Se muestra la magnificación del pico 9 del Panel C-A desde el Panel B. La comparación de los mapas trípticos de His6-F92pAF y el 30K PEG His6-F92pAF rhGH revelan la desaparición del pico 9 en la pegilación de His6~F92pAF rhGH, confirmando así que la modificación es específica para el péptido 9. Ejemplo 27 Ese ejemplo describe un homodímero formado de dos polipéptidos hGH comprendiendo cada uno un aminoácido no natural . La Figura 12 compara los resultados del ensayo IM-9 de un polipéptido hGH His etiquetado que comprende una sustitución de p-acetil-fenilalanina en la posición 92 con un homodímero de este polipéptido modificado unido con un enlazador que es bifuncional que tiene grupos funcionales y la reactividad como se describe en el Ejemplo 25 para la PEGilación de hGH. Ejemplo 28 Este ejemplo describe un polipéptido hGH de monómero y dímero que actúa como antagonista hGH. Una muteína hGH en la cual se ha introducido una sustitución G120R en el sitio II es capaz de unirse a un solo receptor hGH, pero no es capaz de dimerizar dos receptores. La muteína actúa como un antagonista hGH in vi tro, presumiblemente al ocupar sitios del receptor sin activar trayectorias de señalización intracelulares (Fuh, G., et al., Science 256:1677-1680 (1992)). La Figura 13 Panel A muestra los datos del ensayo IM-9 que miden la forforilación de pSTAT5 por hGH con la sustitución G120R. Un polipéptido hGH con un aminoácido no natural incorporado en la misma posición (G120) da como resultado una molécula que también actúa como un antagonista hGH, como se muestra en la Figura 13, Panel B. Un dímero del antagonista hGH mostrado en la Figura 13, Panel B se construyó unido con un enlazador que es bifuncional teniendo los grupos funcionales y reactividad como se describe en el Ejemplo 25 para la PEGilación de hGH. La Figura 14 muestra que este dímero también carece de actividad biológica en el ensayo IM-9. Se llevaron a cabo ensayos adicionales que comparan el polipéptido hGH que comprende una sustitución G120pAF con un dímero de polipéptidos hGH, G120pAF modificados unidos mediante un enlazador PEG. La fosforilación de STAT5 inducida por HgH WHO compitió con un rango de respuesta de dosis del monómero y el dímero unidos mediante un enlazador PEG. También se llevaron a cabo estudios de competencia del receptor de superficie demostrando que el monómero y el dímero compiten con GH para la unión al receptor de superficie celular en IM-9 y células de rata GHR (L43R)/BAF3. El dímero actuó como un antagonista más potente que el monómero. La talbla 4 muestra los datos de estos estudios.
Ejemplo 29 Este ejemplo detalla la medición de la actividad de hGH y la afinidad de los polipéptidos hGH para el receptor hGH. Clonación y purificación del receptor GH de rata.
El dominio extracelular del receptor GH de rata (GHR ECD, aminoácidos S29-T238) se clonó en el vector pET20b (Novagen) entre los sitios Nde I y Hind III en la estructura con un marcador 6His C-terminal. Se introdujo una mutación de L43 a R para aproximar adicionalmente el sitio de unión del receptor GH humano (Souza et al., Proc Nati Acad Sci USA (1995) 92(4): 959-63). Se produjo la proteína recombinate en células E. coli BL21 (DE3) (Novagen) mediante la inducción con 0.4 mM IPTG a 30° durante 4-5 horas. Después de lisar las células, el pelet se lavó cuatro veces mediante resuspensión en un homogenizador dounce con 30 ml de 50 mM Tris, pH 7.6, 100 mM de NaCl, 1 mM EDTA, 1% de Tritón X-100 y dos veces con el mismo amortiguador sin Tritón X-100. En este punto los cuerpos de inclusión consistieron de más del 95% de GHR ECD y se solubilizaron en O.lM Tris, Ph 11.5, 2M de urea. Se llevó a cabo la duplicación por medio de pasar una alícuota de la solución del cuerpo de inclusión a través de una columna de filtración de gel SlOO (Sigma), equilibrada con 50 mM de Tris, pH 7.8, 1 M de L-arginina, 3.7 mM de cistamina, 6.5 mM de cisteamina. Las fracciones que contienen proteína soluble se combinaron y dializaron contra 50 mN de Tris, pH 7.6, 200 mM NaCl, 10% de glicerol. La muestra se centrifugó brevemente para retirar cualquier precipitado y se incubó con una alícuota de resina Talón (Clontech), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de lavar la resina con 20 volúmenes de amortiguador de diálisis complementado con 5 mM de imidazol, la proteína se eluyó con 120 nM de imidazol en amortiguador de diálisis. Finalmente, la muestra se dializó durante la noche contra 50 mM Tris, pH 7.6, 30 mM de NaCl, 1 mM EDTA, 10% de glicerol brevemente centrifugado para retirar cualquier precipitado, ajustado a 20% de concentración final de glicerol, alicuotado y almacenado a -80°C. Se midió la concentración de la proteína mediante OD (280) utilizando un coeficiente de extinción calculado de e=65,700 M"1*cm"1. Biocore ™ Analysis de la unión de GH a GHR Aproximadamente 600-800 RUs de GHR ECD soluble se inmovilizaron sobre un chip Biacore™ CM5, utilizando un procedimiento de acoplamiento de amina estándar, como se recomedó por el fabricante. Aunque se inactivo una porción significativa del receptor mediante esta técnica, se encontrpo experimentalmente que este nivel de inmovilización fue suficiente para producir la respuesta de unión GH específica máxima de aproximadamente 100-150 RUs, sin cambio perceptible en la cinética de unión. Ver, e.g., Cunnungham et al J Mol Biol (1993) 234(3): 554-63 y Wells JA. Proc Nati Acad Sci USA (1996) 93(1) :l-6. Se inyectaron varias concentraciones del GH (0.1-300nM)tipo silvestre o mutante en amortiguador HBS-EP (Biacore™, Pharmacia) sobre la superficie GHR a una tasa de flujo de 40 µl/min durante 4-5 minutos y se monitoreó la disociación durante 15 minutos post-inyección. La superficie se regeneró mediante un impulso de 15 segundos de 4.5M MgCl2. Solo se observó una mínima pérdida de afinidad de unión (1-5%) después de al menos 100 ciclos de regeneración. Se utilizó la célula de referencia sin receptor inmovilizado para sustraer cualquier efecto volumétrico del amortiguador y la unión no específica. Se procesaron los datos de unión cinética obtenidos a partir de experimentos de titulación de GH con software BiaEvaluation 4.1 (BIACORE™). El modelo de asociación de "analito bivalente" proporción adecuación satisfactoria (valores chi2 generalmente por debajo de 3) de acuerdo con la dimerización 1:2 (GH:GHR) secuencial propuesta (Wells JA Proc Nati Acad Sci USA (1996) 93(1) :l-6). Las constantes de disociación de equilibrio (Kd) se calcularon como proporciones de constantes de tasa individuales (koff/kon).
La Tabla 5 indica los parámetros de unión a partir de Biacore™ utilizando GHR ECD de rata (L43R) inmovilizada sobre un chip CM5.
Líneas Cel ulares Es tables de GHR La línea celular de ratón dependiente de IL-3, BAF3, se pasó de manera rutinaria en RPMl 1640, piruvato de sodio, penicilina, estreptomicina, suero fetal de ternero inactivado con calor al 10%, 50uM 2-mercaptoetanol y medio acondicionado de la línea celular WEHI-3 al 10% como fuente de IL-3. Todos los cultivos celulares se mantuvieron a 37°C en una atmósfera humidificada de 5% de C02. La línea celular BAF3 se utilizó para establecer el clon celular estable GHR de rata (L43R) , 2E2-2B12-F4. En resumen, las células BAF3 moderadamente confluentes 1X107 se electroporaron con 15 ug de plásmido pcADN3.1 linearizado conteniendo el ADNc de GHR (L43R) de rata de longitud total. Las células transfectadas se les dejó recuperar durante 48 horas antes de clonarse mediante dilución limitante en el medio que contiene 800 ug/ml de G418 y 5 nM de WHO hGH. Los transfectantes que expresan GHR se identificaron al teñir la superficie con anticuerpo contra GHR humano (R&D Systems, Minneapolis, MN) y se analizaron sobre un Arreglo FACS (BD Biosciences, San Diego, CA) . Los transfectantes que expresan un buen nivel de GHR se detectaron sistemáticamente entonces para la actividad proliferativa contra WHO hGH en un ensayo de proliferación BrdU (como se describe abajo) . Los clones celulares GHR de rata (L43R) transfectados de manera estable se establecieron en dos rondas adicionales de subclonación repetida de los transfectantes deseados en la presencia de 1.2 mg/ml G418 y 5 nM hGH con perfilación constante para la expresión del receptor de superficie y la capacidad proliferativa. El clon celular, 2E2-2B12-F4, así establecido se mantiene de de manera rutinaria en el medio BAF3 más 1.2 mg/ml de G418 en la ausencia de hGH. Prolifera ción median te etiquetado de BrdU La línea celular BAF3 que expresa GHR (L43R) en suero de rata subalimentada, 2E2-2B12-F4, se colocó en placas a una densidad de 5 X 104 células/pozo en una placa de 96 pozos. Las células se activaron con un rango de dosis de 12 puntos de proteínas hGH y se etiquetaron al mismo tiempo con 50 uM de BrdU (Sigma, St. Louis, MO) . Después de 48 horas en el cultivo, las células se fijaron/permeabilizaron con 100 ul de solución citofijación/citopermeación BD (BD Biosciences) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para exponer los epítopes BrdU, se trataron las células fijas/permeabilizadas con 30 ug/pozo de DNasa (Sigma) durante 1 hora a 37°C. La tinción inmunofluorecente con el anticuerpo anti-BrdU APC conjugado (BD Biosciences) permitió el análisis de muestra en el arreglo FACS. La Tabla 6 muestra la bioactividad de los mutantes hGH de PEG como se perfilan en pSTAT5 (IM-9) y los ensayos de proliferación BrdU. WHO hGH se expresan como unidad para la comparación entre los ensayos .
Ejemplo 30 Este ejemplo describe los métodos para medir la actividad ín vi tro e in vivo del hGH PEGilado. Ensayos de Unión Celular Se incubaron las células (3xl06) en duplicado en PBS/1% de BSA (100 µl) en la ausencia o presencia de varias concentraciones (volumen: 10 µl) de Gh, hGH o GM-CSF no etiquetado y en la presencia de 125I-GH (aproximadamente 100,000 cpm o 1 ng) a 0°C durante 90 minutos (volumen total: 120 µl) . Las células se resuspendieron entonces y se estratificaron sobre 200 µl de FCS en frío en un tubo centrífugo de plástico de 350 µl y se centrifugó (1000 g; 1 minuto) . El sedimento celular se recolectó al cortar el extremo del tubo y el sedimento celular y el sobrenadante se contaron por separado en un contador gama (Packard). Se determinó la unión específica (cpm) como la unión total en la ausencia de un competidor (medio de duplicados) menos la unión (cpm) en la presencia de un exceso de 100 veces de GH no etiquetado (unión no específica). La unión no específica se midió para cada uno de los tipos celulares utilizados. Los experimentos se corren en días separados utilizando la misma preparación de 125I-GH y deben desplegar consistencia interna. 125I-GH demuestra la unión a las células que producen el receptor. La unión se inhibe en una forma dependiente de la dosis mediante GH o hGH natural no etiquetado, pero no solo mediante GH-CSF u otro control negativo. La capacidad de hGH para competir para la unión del 1 5I-GH natural, similar al GH natural, sugiere que los receptores reconocen ambas formas igualmente bien. Estudios In Vivo de hGH PEGilada PEG-hGH, hGH no modificado y la solución de amortiguador se administran a ratones o ratas. Los resultados mostrarán actividad superior y vida media prolongada del hGH PEGilado de la presente invención comparada con hGH no modificado que se indica mediante el peso corporal significativamente incrementado.
Medición de la Vida-Media in vivo de hGH Conjugado y No Conjugado y Variantes de los Mismos Toda la experimentación animal se condujo en una facilidad acreditada AAALAC y bajo protocolos aprobados por la Institucional Animal Care and Use Comité of St. Louis University. Las ratas se alojaron individualmente en jaulas en cuartos con un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad. Se proporcionó acceso a los animales de comida para roedor de Purina certificada 5001 y agua ad libitum. Para las ratas hipofisectomizadas, el agua para beber contuvo adicionalmente 5% de glucosa. Estudios Farma cocinéticos Se evaluó la calidad de cada hGH mutante PEGilado mediante tres ensayos antes de entrar a los experimentos animales. Se examinó la pureza dek PEG-hGH al correr un 4-12% de gel Bis-Tris NuPAGE de arcrilamida con MES SDS corriendo el amortiguador bajo condiciones de no reducción (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Los geles se tiñeron con azul Comassie. La banda PEG-hGH fue mayor del 95% de pureza en base a la exploración de densitometría. Se probó el nivel de endotoxina en cada PEG-hGH mediante un ensayo LAL cinético utilizando un equipo KTA2 de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) y fue menos de 5 EU por dosis. Se valoró la actividad biológica de PEG-hGH con el bioensayo IM-9 pSTAT5 (descrito en el Ejemplo 2) y se confirmó el valor EC50 para ser menos e 15 nM. Se compararon entre sí las propiedades farmacocinéticas de los compuestos de la hormona del crecimiento PEG modificada y para la hormona del crecimiento no PEGilada en ratas macho Sprague-Dawley (261-425g) obtenidas de Charles River Laboratories. Los catéteres se instalaron quirúrgicamente en la arteria carótida para recolectar sangre. Después de la exitosa instalación del catéter, los animales se asignaron a grupos de tratamiento (tres a seis por grupo) antes de la dosificación. Los animales se dosificaron subcutáneamente con 1 mg/kg del compuesto en un volumen de dosis de 0.41-0.55 ml/kg. Se recolectaron las muestras sanguíneas a varios puntos de tiempo a través del catéter residente y en los tubos de microfuga cubiertos con EDTA. El plasma se recolectó después de la centrifugación y se almacenó a -80°C hasta el análisis. Se midieron las concentraciones del compuesto utilizando equipos ELISA de la hormona del crecimiento en sandwich del anticuerpo desde ya sea la BioSource Internacional (Camarillo, CA) o Diagnostic Systems Laboratories (Webster, TX) . Se calcularon las concentraciones utilizando estándares correspondientes con al análogo que se dosificó. Se estimaron los parámetros farmacocinéticas utilizando el programa de modelación WinNonlin (Pharsight, versión 4.1). Se utilizó el análisis sin compartimientos con integración trapezoidal lineal-hacia arriba/log-hacia abajo y los datos de concentración se pesaron de manera uniforme. La Figura 15 muestra la media ( +/-D.S.) de las concentraciones de plasma después de una sola dosis subcutánea en ratas. Las ratas (n=3-4 por grupo) dieron una sola dosis rápida de 1 mg/kg de proteína tipo silvestre de hGH (WHO hGH), polipéptido hGH His-etiquetado (his-hGH) o polipéptido hGH His etiquetado que comprende p-acetil-fenilalanina de aminoácido no natural en la posición 92 enlazado covalentemente con 30 kDa de PEG (30KPEG-pAF92 (his ) hGH) . Se tomaron las muestras de plasma sobre los intervalos de tiempo indicados como se ensayaron para el compuesto inyectado como se describe. 30KPEG-pAF92 (his) hGH extendió dramáticamente la circulación comparada para controlar el hGH. La Figura 16 muestra la media (+/-D.S.) de las concentraciones de plasma después de una sola dosis subcutánea en ratas. Las ratas (n=3-4 por grupo) dieron una sola dosis rápida de 1 mg/kg de proteína. Los polipéptidos hGH que comprenden comprende p-acetil-fenilalanina de aminoácido no natural covalentemente enlazado con 30 kDa de PEG en cada una de las seis diferentes posiciones que se compararon para WHO hGH y (his) -hGH. Las muestras de plasma se tomaron sobre los intervalos de tiempo indicado y se ensayaron para el compuesto inyectado como se describe. La Tabla 7 muestra los valores del parámetro farmacocinética para la administración de una sola dosis de los polipéptidos hGH mostrados en la Figura 16. Se evaluaron las curvas de concentración contra el tiempo mediante análisis no compartamental (Pharsight, versión 4.1). Los valores mostrados son promedios (+/- de desviación estándar). Cmax: concentración máxima; terminal t?/2 : vida media terminal; AUC0->inf' : área bajo la curva de concentración extrapolada para infinidad; MRT : tiempo medio de residencia; Cl/f: claridad de plasma total aparente; Vz/f: volumen aparente de distribución durante la fase terminal. Tabla 7: Valores del parámetro farmacocinética para una sola dosis 1 mg/kg de administración rápida en ratas macho Sprague-Dawley .
Tabla 7: Valores del parámetro farmacocinética para la administración s.c. en bolo de una dosis única de 1 mg/kg en ratas Sprague-Dawley machos normales Estudios Farmacodinámicos Se obtuvieron ratas macho Sprague-Dawley hipofisectomizadas de Charles River Laboratories. Las pituitarias se retiraron quirúrgicamente a las 3-4 semanas de edad. Los animales se les dejó aclimatar por un periodo de tres semanas, durante cuyo tiempo se monitoreó el peso corporal. Los animales con una ganancia de peso corporal de 0-8 g sobre un periodo de tiempo de siete días antes de iniciar el estudio se incluyeron y aleatorizaron con los grupos de tratamiento. Las ratas se administraron subcutáneamente ya sea en una dosis rápida o dosis diaria. A través de todo el estudio las ratas se pesaron diaria y secuencialmente, anestesiaron, sangraron y dosificaron (cuando es aplicable) . Se recolectó sangre de los senos orbitales utilizando un tubo capilar heparinizado y colocados en una tubo de microfuga cubierto de EDTA. El plasma se aisló mediante centrifugación y se almacenó a -80°C hasta su análisis . La Figura 17 muestra la media ( +/- D.S.) de la concentración de plasma después de una sola dosis subcutánea en las ratas hipofisectomizadas. Las ratas (n=5-7 por grupo) dieron una sola dosis rápida de 2.1 mg/kg de proteína. Se muestran los resultados de los polipéptidos hGH que comprenden p-acetil-fenilalanina de aminoácido no natural covalentemente enlazados a 30 kDa de PEG en cada uno de las dos diferentes posiciones (posición 35, 92) . Las muestras de plasma se tomaron durante los intervalos de tiempo indicados y se ensayaron para el compuesto inyectado como se describe. El péptido IGF-1 es un miembro de la familia de los factores de crecimiento de somatomedinas o similares a la insulina. El IGF-1 media muchos de los efectos de promoción del crecimiento de la hormona del crecimiento. Las concentraciones de IGF-1 se midieron utilizando un equipo de inmunoensayo de enzima de unión competitivo contra los estándares IGF-1 de rata/ratón proporcionados (Diagnostic Systems Laboratories). Se determinó diferencia significativa por la prueba t utilizando dos distribuciones persistentes, impares de variancia igual. La Figura 18, Panel A muestra la evaluación de los compuestos en ratas hipofisectomizadas. Las ratas (n=5-7 por grupo) se dieron subcutáneamente ya sea en una sola dosis o dosis diaria. Los animales se pesaron secuencialmente, anestesiaron, sangraron y dosificaron diario (cuando es aplocable9. Los resultados del peso corporal se muestran para los tratamientos con placebo, polipéptidos hGH tipo silvestre (hGH), hGH his etiquetado ((his) hGH)) y hGH que comprenden p-acetil-fenilalanina covalentemente enlazado a 30 kDa de PEG en las posiciones 35 y 92. La Figura 18, Panel B-diagrama A muestra el efecto de los niveles de IGF-1 del plasma circulante después de la administración de una sola dosis de polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido codificado de manera no natural que es PEGilado. Las barras representan la desviación estándar. En la Figura 18, Panel A, la ganancia de peso corporal en el día 9 para el compuesto 30KPEG-pAF35 (his) hGH que es estadísticamente diferente (p<0.0005) del compuesto 30PEG-pAF92 (his) hGH, en que se observó mayor ganancia de peso. La Figura 18, Panel C muestra la evaluación de los compuestos en ratas hipofisectomizadas. Las ratas (n= 11 por grupo) dieron dieron subcutáneamente ya sea una sola dosis o dosis diaria. Los animales se pesaron secuencialmente, anestesiaron, sangraron y dosificaron diario (cuando es aplicable). Los resultados del peso corporal se muestran para tratamientos de placebo, polipéptidos hGH (hGH) y HGH que comprenden p-acetil-fenilalanina covalentemente enlazado a 30 kDa de PEG en las posiciones 92, 134, 145, 131 y 143. La Figura 18, Panel D-diagrama A muestra el efecto de los niveles de IGF-1 del plasma circulante después de la administración de una sola dosis de polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido codificado de manera no natural que es PEGilado (posición 92, 134, 145, 131, 143) comparado cn los tratamientos de placebo y la HgH tipo silvestre. La Figura 18 Panel E muestra la media (+/- D.S.) de las concentraciones de plasma que corresponden a los polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido codificado de manera no natural que es PEGilado (posición 92, 134, 145, 131, 143) . Se tomaron las muestras de plasma durante los intervalos de tiempo indicados y se ensayaron para el compuesto inyectado como se describe. Las barras representan la desviación estándar . Ejemplo 31 Pruebas Químicas Humanas de Seguridad y/o Eficacia de hGH PEGilado que Comprenden una Aminoácido codificado de manera no natural. Objetivo . Comparar la seguridad y farmacocinéticas del hGH recombinante PEGilado subcutáneamente administrado que comprende un aminoácido codificado de manera no natural con uno o más de los productos hGH comercialmente disponibles (incluyendo pero sin limitarse a Humatrope™ (Eli Lilly & Co.), Nutropin™ (Genentech), Norditropin™ (Novo-Nordisk) , Genotropin™ (Pfizer) y Saizen/Serotim™ (Serono)). Pacientes . Dieciocho voluntarios saludables que varían entre 20-40 años de edad y pesan entre 60-90 kg se enrolaron en el estudio. Los sujetos no tendrán valores de laboratorio significativos anormales para la hematología o qupimica de suero y se detectó sistemáticamente una toxicología de orina negativa, detección sistemática de HIV y antígeno de superficie de hepatitis B. Deben tener cualquier evidencia de la siguiente hipertensión; una historia de cualquier enfermedad hematológica primaria; historia de enfermedad significativa hepática, renal, cardiovascular, gastrointestinal, genitourinaria, metabólica, neurológica; una historia de anemia o trastorno apopléjico; una sensibilidad conocida para los productos derivados de bacterias o mamíferos, PEG o albúmina de suero humano; consumo habitual y pesado de bebidas que contienen cafeína; participación en cualquier otra prueba clínica o que ha transfundido o donado sangre dentro de los 30 días de entrar al estudio; haberse expuesto a hGH dentro de los tres meses de entrar al estudio; tener una enfermedad dentro de los siete días de entrar al estudio; y tener anormalidades significativas en el examen físico del pre-estudio o evaluaciones de laboratorio clínicas dentro de los 14 días de entrar al estudio. Todos los sujetos se valoran por seguridad y todas las recolecciones sanguíneas para el análisis farmacocinética se recolectaron como se esquematiza. Todos los estudios se llevaron a cabo con la aprobación del comité ético institucional y el consentimiento del paciente. Diseño de Estudio. Esta será una Fase I un estudio cruzado de dos periodos aleatorizado, etiquetado abierto en un solo centro en voluntarios hombres saludables. Dieciocho sujetos se asignaron en forma aleatoria para uno de dos grupos de secuencia del tratamiento (nueve sujetos/grupo) . Se administró GH durante dos periodos de dosificación separados como una inyección rápida en el recto utilizando dosis equivalentes del hGH PEGilado que comprende un aminoácido codificado de manera no natural y el producto seleccionado comercialmente disponible. La dosis y frecuencia de administración del producto comercialmente disponible es como se introdujo en la etiqueta de empaque. La dosificación adicional, frecuencia de dosificación u otro parámetro como se desea, utiliza los productos comercialmente disponibles pueden agregarse al estudiio al incluir grupos adicionales de sujetos. Cada periodo de dosificación se separa mediante un periodo de lavado de 14 días. Los sujetos se confinaron al centro de estudio al menos 12 horas antes y 72 horas después de la dosificación para cada uno de los dos periodos de dosificación pero no entre los periodos de dosificación. Pueden agregarse grupos adicionales de sujetos si son para se de un parámetro de dosificación adicional, de frecuencia u otro también para probarse para la HgH PEGilado. Pueden utilizarse en este estudio múltiples formulaciones de GH que se aprobaron para el uso humano. Humatrope™ (Eli Lilly & Co J , Nutropin™ (Genentech), Norditropin™ (Novo-Nordisk) , Genotropin™ (Pfizer) y Saizen/Serotim™ (Serono)) son productos GH comercialmente disponibles aprobados para el uso humano. La formulación experimental de hGH el la HgH PEGilado que comprende un aminoácido codificado de manera no natural . Muestra Sanguínea. Se extrajeron series sanguíneas mediante punzada directa a la vena antes y después de la administración de hGH. Las muestras venosas sanguíneas (5 ml) para la determinación de las concentraciones de GH en el suero se obtuvieron en aprox 30, 20 y 10 segundos antes de la dosificación (3 muestras de línea base) y a aproximadamente las siguientes veces después de la dosificación: 30 minutos y a 1 la 1, 2, 5, 8, 12, 15, 18 ,24,30, 36, 48, 60 y 72 horas. Cada muestra de suero se dividió en dos alícuotas. Todas las muestras de suero se almacenaron a -20°C. Las muestras de suero se embarcaron en hielo seco. Se llevaron a cabo pruebas de laboratorio clínicas más rápidas (hematologías, química de suero y urianálisis) inmediatamente antes de la dosis inicial en el día 1, la mañana del dái 4, inmediatamente antes de la dosificación en el día 16 y en la mañana del día 19. Métodos Bioanalíticos . Se utilizó un procedimiento de equipo ELISA (Diagnostic Systems Laboratory [DSL], Webster TX) para la determinación de las concentraciones GH en suero. Determinaciones de Seguridad. Se registraron señales vitales antes de cada dosificación (Días 1 y 16) y a las 6, 24, 48 y 72 horas después de cada dosificación. Las determinaciones de seguridad se basaron en la incidencia y el tipo de eventos adversos y los cambios en las pruebas de laboratorio clínicas a partir de la línea base. Además, se evaluaron los cambios a partir del pre-estudio en mediciones de signos vitales, incluyendo los resultados de la presión sanguínea y examen físico. Análisis de Datos. Se corrigieron los valores de la concentración del suero de post-dosis para las concentraciones GH de línea base de pre-dosis al restarse de cada uno de los valores de la post-dosis la concentración GH de línea base media determinada a partir de promediar los niveles GH de las tres muestras recolectadas en los minutos 30, 20 y 10 antes de la dosificación. No se incluyeron las concentracioneds GH de suero pre-dosis en el cálculo del valor medio si se encuentran debajo del nivel de cuantificación del ensayo. Los parámetros farmacocinéticas se determinaron se calcularon mediante métodos de modelos independientes en un sistema de computadora VAX 8600 de la Digital Equipment Corporation utilizando la última versión del software BIOAVL. Se determinaron los siguientes parámetros farmacocinéticas: concentración pico de suero (Cmax) ; tiempo para la concentración pico de suero (tmax) ; área bajo la curva de tiempo de concentración (AUC) desde el tiempo cero al último tiempo de muestreo sanguíneo (AUC0-72) calculada con el uso de la regla trapezoidal lineal; y vida media de eliminación terminal (t?/2) computada a partir de la constante de tasa de eliminación. Se estimó la constante de tasa de eliminación mediante regresión lineal de los puntos de datos consecutivos en la región terminal lineal del ensayo log-concentración lmeal-tiempo . Se calcularon para cada tratamiento la desviación estándar media (SD) y el coeficiente de variación (CV) de los parámetros farmacocinéticas. Se calculó la proporción de las medias del parámetro (formulación preservada/formulación no preservada). Resultados de Seguridad. La mdicendcia de los eventos adversos se distribuye igualmente a través de los grupos de tratamiento. No existen cambios clínicos significativos a partir de la línea base o pruebas de laboratorio clínicas de pre-estudio o presiones sanguíneas y sin cambios notables a partir del pre-estudio en resultados de exámenes físicos y mediciones de signos vitales. Los perfiles de seguridad para los dos grupos de tratamiento deben ser similares. Resultados Farmacocinéticos. La media de los perfiles de concentración-tiempo de GH de suero (no corregida para los niveles GH de línea base) en todos los 18 sujetos después de recibir una sola dosis de uno o más de los productos hGH comercialmente disponibles (incluyendo pero sin limitarse a Humatrope™ (Eli Lilly & Co.), Nutropin™ (Genentech) , Norditropin™ (Novo-Nordisk) , Genotropin™ (Pfizer) y Saizen/Serotim™ (Serono)). se comparan con la HgH PEGilado que comprende un aminoácido codificado de manera no natural en cada punto de tiempo medido. Todos los sujetos deben tener concentraciones GH de línea base de la pre-dosis dentro del rango fisiológico normal. Se determinaron los parámetros farmacocinéticas a partir de los datos del suero corregidos para las concentraciones GH de línea base medias de la pre-dosis y se determinaron el Cmax y tmax. La media tmax para el (los) comparador (es) clínico(s) seleccionado (s) (Humatrope™ (Eli Lilly & Co.), Nutropin™ (Genentech), Norditropin™ (Novo-Nordisk) , Genotropin™ (Pfizer) y Saizen/Serotim™ (Serono)) es significativamente más corto que el traax para la HgH PEGilado que comprende el aminoácido codificado de manera no natural. Los valores terminales de vida media sonmás corto significativamente para los productod hGH comercialmente disponibles probados comparados con la mvida media terminal para la HgH PEGilado que comprende un aminoácido codificado de manera no natural. Aunque el presente estudio se conduce en sujetos machos saludables, características de absorción y perfiles de seguridad similares pueden anticiparse en otras poblaciones de pacientes; tal como pacientes macho o hembra con cáncer o enfermedad renal crónica, pacientes con enfermedad renal pediátrica, pacientes en programas de predepósito antólogos o pacientes programados para cirugía electiva. En conclusión, las dosis sencillas administradas subcutáneamente de hGH PEGilado que comprende un aminoácido codificado de manera no natural estarán seguras y bien toleradas por sujetos macho saldables. En base a una insidencia comparativa de eventos adversos, los valores de laboratorio clínicos, signos vitales, y resultados de examen físico, los perfiles de seguridad de las formas comercialmente disponibles de hGH y hGH PEGilado que comprende un aminoácido codificado de manera no natural proporcionan potencialmente una gran utilidad clínica para pacientes y proveedores del cuidado de la salud.
Ejemplo 32 En los siguientes Ejemplos, ahGH y PEG-ahGH son respectivamente hGH y un hGH PEGilado de la SEQ ID NO: 2 con una para-acetilfenilalanina en la posición 35 y, en la HgH PEGilado, el PEG enlazado a través de una unión de oxima formada con la para-acetilfenilalanina, en donde el PEG es un PEG de 30 kDa lineal. La interacción de hGH con su receptor conduce a la fosforilación de tirosina de una transductor y activador de señal del miembro de la familia de transcripción, STAT5 en la línea celular de linfocito IM-9. La concentración de ahGH y PEGahGH (requerida para el 50% máximo de la fosforilación de STAT5 (EC50) se determinó al activar las células IM-9 con concentraciones incrementadas de ahGH y PEG-ahGH seguido por el teñido inmunofluorescente intra-celular para fosfo-STAT5. Con el EC50 de hGH estándar de la World Health Organization (WHO) como 1.0, el EC50 relativo de ahGH como se comparó con WHO hGH se determinó que es 1.1 mientras que PEG-ahGH fue 10.9. Ejemplo 33: Se determinó la actividad de PEG-ahGH in vi tro mediante el uso de una línea celular que prolifera en respuesta a la hormona del crecimiento. Un ejemplo de tal una línea celular es el clon celular GHR [L43R] /BAF3 de rata llamado 2E2-2B12-F4, una línea generada mediante células BAF3 de ratón establemente transfectadas con la GHR de rata orientando una sustitución Leu a Ag en la posición 43. La conversión de Leu-43 del receptor de rata a Arg-43 presta la GHR de rata más "similar a la humana" y por lo tanto facilita la unión hGH eficiente. Se empleó la etiquetación de bromodeoxiuridina (BrdU-) de las células GHR [L43R] /BAF3 de rata activamente divididas para proporcionar una alta resolución, método no reactivo de la cuantificación de la proliferación inducida por la hormona del crecimiento. Estableciendo el EC50 para WHO hGH como unidad, el EC50 relativo de ahGH y PEG-ahGH com se comparó con WHO hGH se determinaron para ser 1.06 i 0.29 (n=ll) y 5.37 1 1.23 (n=9) respectivamente . Ejemplo 34 Estudios de Eficacia de hGH PEGilado Se condujeron estudios de eficacia preclínicos en un modelo de rata con deficiencia de la hormona del crecimiento. En este modelo, la glándula pituitaria se retiró quirúrgicamente a aproximadamente a las 4 semans de edad. Los pesos corporales de estas ratas hipofisectomizadas se monitorearon después de la cirugía y los animales mostraron menos de 7.5 gramos de ganancia de peso corporal durante un periodo de 7 días antes de que el estudio se demandara exitosamente hipofisectomizado y se aleatorizaron entre los grupos de tratamiento. Los animales mostraon mas de 2.5 g de pérdida de peso sin demanda de salud y se excluyeron del estudio. El estudio se inició aproximadamente 3 semanas después de la cirugía. Los animales se dosificaron semanalmente (i.e. dosificaciones en los días 0 y 7) con ya sea placebo o incremento de dosis de PEG-ahGH . Un grupo de tratamiento adicional recibió diariamente enotropina o placebo. Los pesos corporales y sangre se recolectaron en la predosis y diariamente. Todos los animales se sacrificaron en el día 14. La Figura 28 muestra los niveles IGF-1 de plasma a través de todo el estudio. Se observó un fuerte incremento dependiente de la dosis en IGF-1. Se observó un incremento dependiente de la dosis en IGF-1 Cmax después de cada intervalo de dosis. La fijación de la curva en los valores Craax a partir de la primera dosis estimó el IGF-1 mínimo (Eo) y máximo (Emax) Craax a ser 136.7 y 1,136.2 ng/ml respectivamente y se determinó el ED50 a sed 0.136 mg/kg (Tabla 8) . Los niveles IGF.l de plasma también mostraron un ciaron incremento dependiente de dosis cuando se expresaronc omo AUC. Para este parámetro, el AUC se expresó como AUC arriba del nivel de plasma de IGF-1. Trabajos previos mostraron que una concentración de IGF-1 sostenida de 34 ng/ml arriba de la línea base resultó en la ganancia de peso corporal en las ratas hipofisectomizadas. En el estudi actual, el nivel IGF-1 de línea base determinado para el grupo de placebo a través de todo el estudio fue 128 ng/ml. Un incremento de 34 ng/ml sobrel28 ng/ml estima una eficacia del nivel de IGF-1 de 162 ng/ml. Así se integró el AUC arriba de 162 ng/ml. A partir de este análisis, se observó un incremento dependiente de dosis en AUC arriba del nivel de eficacia después de cada intervalo de dosis. La fijación de la curva de los valores AUC a partir de la primera dosis estimada el Eo y Emax IGF-1 AUC a ser 0 y 5,029.8 ngXhr/ml respectivamente y se determinó el ED50 para este parámetro a ser 0.909 mg/kg (Tabla 8). Se determinó la duración de los niveles IGF-1 inducidos arriba del nivel de eficacia estimado después de la primera dosis. En las dosis mas altas, los niveles IGF-1 no regresaron a la línea base antes de la segunda dosis. En estas instancias, la concentración de IGF-1 se extrapoló al nivel de eficacia utilizando las pendientes terminales calculadas. A partir de esta evaluación, fue evidente un incremento dependiente de dosis en duración de la concentración de IGF-1 arriba del nivel de eficacia. La fijación de la curva estimó las duraciones mínima y máxima para ser 0 y 8.84 días respectivamente y se determinpo el ED50 para este parámetro ser 0.173 mg/kg (Tabla 8) . El crecimiento del hueso se utilizó como una medida farmacodinámica adicional para calcular el PEG-ahgH ED50. Se recolectaron tibias de cada animal al final del estudio y se fijó la inmersión en 10% de fomalina amortiguada neutral seguiod por la radiografía. Los resultados se muestran en la Figura 29. Fue un ciaron incremento dependiente de dosis en la longitu del hueso tibial para los animales tratados con PEG-ahGH. Además, fue un efecto de prescindir de la dosis comparado con los animales tratados diariamente con Genotropina. La cantidad de Genotropina administrada durante un intervalo de 7 días es equivalente a 2.1 mg/kg de PEG-ahGH dado semanalmente (i.e., días 0 y 7) . Una inducción del incrmeneto de la longitud del hueso tibial similar a la Genotropina se muestra para PEG-ahGH en 0.42 a 1.0 mg/kg. Esto representa un >50% del efecto prescindido de dosis para PEG-ahGH cuando se comparó con Genotropina. PEG-ahGH también inducjo un incremento dependiente de dosis en el peso corporal (Figura 30). Además, como con la inducción de la longitud del hueso tibial, fue evidente un efecto de prescindir de dosis para PEG-ahGH sobre la Genotropina. El tratamiento diario con Genotropina a 0.3 mg/kd al día inducjo 27.74 (+/- 7.92)% decambio del peso corporal en el día 14 desde el día 0. PEG-ahGH administrado en la cantidad equivalente de GH (i.e., 2.1 mg/kg en los días 0 y 7) indujo un mayor incremento de peso corporal sobre la Genotropina. Esta dosis de PEG-ahGH resultó en 33.66 (+/-7.55)% de cambio de peso corporal en el día 14 desde el día 0. El porciento de camnio del peso corporal inducido por PEG-ahGH administrado en la dosis inferior de 1.0 mg/kg en los días 0 y 7 indujo 27.02 ( +/- 3.97)% de cambio de peso corporal en el día 14. Estos resultados representan un efecto de prescindir de dosis cercano a 50% para PEG-ahGH. La administración de GH no PEGilado semanalmente a 2.1 mg/kg de dosis falló para inducir la ganancia de peso corporal. La fijación de la curva de porciento del cambio del peso corporal en el día 14 estimaó el porcentaje de cambio de peso corporal mínimo y máximo, inducido por PEG-ahGH, para ser 7.17 y 50.65 respectivamente. A partir de esta curva, se determinó el ED50 para este parámetro a ser 1.097 mg/kg (Tabla Tabla 8. Resultados del estudio de eficiencia conPEG-ahGH Las mismas muestras de plasma recolectadas para la detrminación de la concentración de IGF-1 también se ensayaron para la concentración de PEG-ahGH . El ensayo ELISA utilizado es específico para hGH, muestra una reducción aún a través de la fuerte respuesta para PEG-ahGH, y no detecta GH de rata. Los perfiles de concentración-tiempo del plasma PEG-ahGH se muestran en la Figura 31. Ocurrión un incremento dependiende de dosis en PEG-ahGH Cmax. La duración de la persistencia de PEG-ahGH en la circulación así como todo el PEG-ahGH AUC, se incrementó en una forma dependiente de dosis. La Genotropina administrada diariamente, no se detectó en el plasma igualmente debido a la rápida depuración. Los resultados de la exposición de PEG-ahGH, soportan la eficacia dependiente de dosis antes mostrada. Los estudios de rata hipofisectomizada descritos arriba han mostrado lo siguiente: 1. Concentración de plasma IGF-1 incrementada dependientemente de la dosis de PEG-ahGH. IGF-1 Cmax así como IGF-1 AUC y la duración arriba del nivel de eficacia todos se incrementaron dependientemente de la dosis. 2. La longitud del hueso tibial y el peso corporal se incrementaron dependientemente de la dosis. 3. Se demostró prescindir de la dosis de >50% sobre la Genotropina administrada diariamente. 4. El PEG-ahGH mostró un incremento dependiente de dosis en Cmax AUC y la persistencia en la circulación que se correlacionó con los efectos farmacodinámicos anteriores. Ejemplo 35 Estudios Farmacocinéticas Farmacocinéticas de Rata La concentración de plasma contra los perfiles de tiempo para PEG-ahGH, administrados subcutáneamente a varias dosis en el modelo de enfermedad de rata se muestran en el Ejemplo 34 de arriba. Farmacocinéticas de Primate Las propiedades farmacocinéticas de la versión de PEG-ahGH, que difiere solo en que la molécula contiene una metionina en la posición N-terminal ( PEG-a (met ) hGH) se evaluaron en simios cinomolgus macho (Figura 32). Se administró una sola inyección de PEG-a (met ) hGH ya sea a una dosis subcutánea o intravenosa de 0.75 mg/kg o 0.15 mg/kg respectivamente. Después de la administración subcutánea, se alcancó un Cma? de 4,977 ( +/- 1,286) ng/ml aproximadamente 16 horas después de la inyección. La vida media terminal aparente fue 12.33 (+/- 1.72) horas, comparada con 7.05 ( +/- 0.47) en rata con PEG-ahGH. La vida media después de la administración intravenosa fue 6.42 (+/- 0.51) horas. Los valores AUC corregidos de dosis fueron 363,443 y 312,440 ngXhrXkg/ml/mg para las dosis subcutánea e intravenosa respectivamente. La biocapacidad a partir de la administración subcutánea se calculó ser de 116%. Ejemplo 36 Motivo Principal de Dosis y Régimen de Dosis Propuesto en el Protocolo Clínico Se determinó el régimen óptimo para un GH PEGilado en humanos a partir de los siguiuentes estudios en animales. Prescindir la doisi del estudio de eficacia de rata (i.e., eficacia comparable con Genotropina pero con menos dosis de PEG-ahGH) observada en los estudios preclínicos de eficacia que se utilizaron en la estimación de dosis requerida para la actividad biológica en hmanos .
La evaluación farmacocinética en ratas y mono cinomolgus-escalación alométrica se utilizó para estimar los parámetros farmacocinéticas en humanos. Se utilizaron estudios de seguridad exacta de una sola dosis en ratas y monos cinomolgus para valuar la exposición y determinar NOAEL (no se observó nivel de efecto adverso) . Se evaluó la seguridad del estudio de seguridad GLP de dosis repetida una vez al mes a la rata después de un mes de exposición a partir de las dosis que son 2X, 6X y 20X arriba de la dosis humana máxima recomendada (MRHD) .
MRHD=0.36 mg/kg/semana para GHD pediátrico. Se evaluó la seguridad del estudio de seguridad GLP de dosis repetida una vez al mes a monos cinomolgus después de un mes de exposición a partir de las dosis que son 2X, 10X y 30X arriba de la dosis humana máxima recomendada (MRHD) .
MRHD=0.36 mg/kg/semana para GHD pediátrico. Estudio de seguridad GLP de dosis repetida por seis meses a rata. Se evaluó la seguridad después de seis meses de exposición con dosificación tal que la exposición en ratas es 1-2X y 10X la exposición observada en MRHD en humanos. Estudio de seguridad GLP de dosis repetida por seis meses a monos cinomolgus. Se evaluó la seguridad después de seis meses de exposición con dosificación tal que la exposición en ratas es 1-2X y 10X la exposición observada en MRHD en humanos . Debe entenderse que los ejemplos y modalidades descritos aquí son solo para propósitos ilustrativos y que varias modificaciones o cambios a la luz de los mismos se sugerirán a personas exportas en la materia y se incluyen dentro del espíritu y vista previa de esta solicitud y alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente y/u otros documentos citados en esta solicitud se incorporan mediante la referencia en su totalidad para todos los propósitos a la misma extensión como en cada publicación individual, patente, solicitud de patente y/u otro documento indicados individualmente para incorporarse mediante la referencia para todos los propósitos.
Tabla 9: SEQUENCIAS CITADAS SEQ Nombre de la Secuencia ID # 1 Secuencia de aminoácido de longitud total de hGH 2 La secuencia de aminoácido maduro total de hGH (isoforma 1) 3 La variante de hGH de 20. kDa en la que se cancelan los residuos 32-46 de hGH 21 Secuencia de Nucleótidos para la longitud total de hGH 22 Secuencia de Nucleótidos para hGH maduro

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una composición hormonal que comprende una hormona del crecimiento (GH) enlazada a al menos un polímero soluble en gua mediante un enlace covalente, en donde el enlace covalente es un enlace de oxima. 2. La composición hormonal de la reivindicación 1 en donde la GH es una hormona del crecimiento humano (hGH) . 3. La composición hormonal de la reivindicación 2 en donde la hGH comprende una secuencia que es al menos de aproximadamente 80% idéntica a la SEQ ID NO: 2. 4. La composición hormonal de la reivindicación 2 en donde la hGH comprende la SEQ ID NO: 2. 5. La composición hormonal de la reivindicación 1 o 2 en donde la GH comprende un aminoácido codificado no natural (NEAA) . 6. La composición hormonal de la reivindicación 5 que comprende un enlace oxima entre el NEAA y el polímero soluble en agua. 7. La composición hormonal de la reivindicación 6 en donde el NEAA comprende un grupo carboxilo. 8. La composición hormonal de la reivindicación 7 en donde el NEAA comprende una cetona. 9. La composición hormonal de la reivindicación 8 en donde el NEAA es para-acetilfenilalanina. 10. La composición hormonal de la reivindicación 9 en donde el para-acetilfenilalanina se sustituye en la posición correspondiente a la posición 35 de la SEQ ID NO: 2. 11. La composición hormonal de la reivindicación 1 o 2 en donde el polímero soluble en agua comprende polietilen glicol (PEG) . 12. La composición hormonal de la reivindicación 11 en donde el PEG es un PEG lineal. 13. La composición hormonal de la reivindicación 12 en donde el PEG tiene un peso molecular entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 100 kDa. 14. La composición hormonal de la reivindicación 12 en donde el PEG tiene un peso molecular entre aproximadamente 1 y aproximadamente 60 kDa. 15. La composición hormonal de la reivindicación 12 en donde el PEG tiene un peso molecular entre aproximadamente 20 y aproximadamente 40 kDa. 16. La composición hormonal de la reivindicación 12 en donde el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 30 kDa. 17. La composición hormonal de la reivindicación 11 en donde el PEG es un PEG ramificado. 18. La composición hormonal de la reivindicación 17 en donde el PEG tiene un peso molecular entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 kDa. 19. La composición hormonal de la reivindicación 17 en donde el PEG tiene un peso molecular entre aproximadamente 30 y aproximadamente 50 kDa. 20. La composición hormonal de la reivindicación 17 en donde el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 40 kDa. 21. La composición hormonal de la reivindicación 7 en donde el polímero soluble en agua comprende un PEG. 22. La composición hormonal de la reivindicación 21 en donde el PEG es un PEG lineal. 23. La composición hormonal de la reivindicación 21 en donde el PEG tiene un peso molecular entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 100 kDa. 24. La composición hormonal de la reivindicación 21 en donde el PEG tiene un peso molecular entre aproximadamente 1 y aproximadamente 60 kDa. 25. La composición hormonal de la reivindicación 21 en donde el PEG tiene un peso molecular entre aproximadamente 20 y aproximadamente 40 kDa. 26. La composición hormonal de la reivindicación 21 en donde el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 30 kDa. 27. La composición hormonal de la reivindicación 7 en donde el PEG es un PEG ramificado. 28. La composición hormonal de la reivindicación 28 en donde el PEG tiene un peso molecular entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 kDa. 29. La composición hormonal de la reivindicación 28 en donde el PEG tiene un peso molecular entre aproximadamente 30 y aproximadamente 50 kDa. 30. La composición hormonal de la reivindicación 28 en donde el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 40 kDa. 31. La composición hormonal de la reivindicación 10 en donde el polímero soluble en agua es un PEG. 32. La composición hormonal de la reivindicación 31 en donde el PEG es un PEG lineal. 33. La composición hormonal de la reivindicación 32 en donde el PEG tiene un peso molecular entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 100 kDa. 34. La composición hormonal de la reivindicación 32 en donde el PEG tiene un peso molecular entre aproximadamente 1 y aproximadamente 60 kDa. 35. La composición hormonal de la reivindicación 32 en donde el PEG tiene un peso molecular entre aproximadamente 20 y aproximadamente 40 kDa. 36. La composición hormonal de la reivindicación 32 en donde el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 30 kDa. 37. La composición hormonal de la reivindicación 32 en donde la GH es hGH. 38. La composición hormonal de la reivindicación 37 en donde la hGH comprende la SEQ ID NO: 2. 39. La composición hormonal de la reivindicación 1 que comprende GH enlazada por una pluralidad de enlaces covalentes a una pluralidad de polímeros solubles en agua, en donde al menos uno de los enlaces covalentes son enlaces oxima . 40. La composición hormonal de la reivindicación 39 en donde la GH es una hormona del crecimiento humano (hGH) . 41. La composición hormonal de la reivindicación 40, en donde la hGH comprende una secuencia que es al menos aproximadamente 80% idéntica a la SEQ ID NO: 2. 42. La composición hormonal de la reivindicación 2 en donde la hGH comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2. 43. La composición hormonal de la reivindicación 39 o 41 en donde la GH comprende una pluralidad de NEAAs. 44. La composición hormonal que comprende una hGH enlazada a través de un enlace oxima a al menos un PEG lineal, en donde la hGH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y comprende al menos un NEAA sustituido en al menos una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de los residuos 1-5, 6-33, 34-74, 75-96, 97-105, 106-129, 130-153, 154-183 y 184-191. 45. La composición hormonal de la reivindicación 44 en donde el (los NEAA(s) se sustituyen en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de los residuos antes de la posición 1 (i.e., en la Terminal N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191 y 192 (i.e en la terminal carboxilo de la proteína) . 46. La composición hormonal de la reivindicación 44, en donde el (los) NEAA(s)se sustituyen en una o más posciones seleccionadas del grupo que consiste de los residuos 35, 92, 131, 134, 143 y 145. 47. La composición hormonal de la reivindicación 44, en donde el (los) NEAA (s) se sustituyen en una o más posciones seleccionadas del grupo que consiste de los residuos 30, 35, 74, 92, 103, 143 y 145. 48. La composición hormonal de la reivindicación 44, en donde el (los) NEAA(s)se sustituyen en una o más posciones seleccionadas del grupo que consiste de los residuos 35, 92, 143 y 145. 49. La composición hormonal de la reivindicación 44, que comprende un NEAA sustituido en la posición 35. 50. La composición hormonal de las reivindicaciones 44, 45, 46, 47, 48 o 49 que comprende un NEAA que es para-acetilfenilalanina. 51. La composición hormonal de la reivindicación 50 en donde el PEG tiene un peso molecular entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 100 kDa. 52. La composición hormonal de la reivindicación 50 en donde el PEG tiene un peso molecular entre aproximadamente 1 y aproximadamente 60 kDa. 53. La composición hormonal de la reivindicación 50 en donde el PEG tiene un peso molecular entre aproximadamente 20 y aproximadamente 40 kDa. 54. La composición hormonal de la reivindicación 50 en donde el PEG lineal tiene un MW de aproximadamente 30 kDa. 55. Un método para elaborar una GH enlazada a través de un enlace oxima a un polímero soluble en agua que comprende poner en contacto una GH que comprende un NEAA que comprende un grupo carbonilo con una oxiamina PEG bajo condiciones adecuadas para la formación de un enlace oxima. 56. El método de la reivindicación 55 en donde el NEAA contiene un grupo cetona. 57. El método de la reivindicación 56 en donde el NEAA es para-acetilfenilalanina. 58. El método de la reivindicación 57 en donde el para-acetilfenilalanina se sustituye en una posición en la GH, e . g. , hGH que corresponde al aminoácido 35 en la SEQ ID NO: 2. 59. El método de la reivindicación 55 en donde la oxiamina PEG es una oxiamina monometoxiPEG (MPEG) . 60. El método de la reivindicación 59 en donde la oxiamina MPEG es lineal. 61. El método de la reivindicación 60 en donde el MW (peso molecular) del PEG es aproximadamente de 20-40 kDa. 62. El método de la reivindicación 61 en donde el MW del PEG es aproximadamente de 30 kDa. 63. El método de la reivindicación 62 en donde la oxiamina MPEG es un hidrocloruro de monometil-PEG-2-aminooxi etilamina carbamato lineal de 30 kDa. 64. El método de la reivindicación 55 que comprende además elaborar la GH que comprende un NEAA mediante un proceso que comprende introducir (i) un ácido nucleico que codifica para una GH en donde el ácido nucleico se ha modificado para proporcionar una señal para la incorporación del NEAA; y (ii) el NEAA; a un organismo que es capaz de incorporar el NEAA en una proteína en respuesta a la señal del ácido nucleico de (i) . 65. El método de la reivindicación 55 en donde las condiciones comprenden (i) mezclar el MPEG y la GH para producir una mezcla de MPEG-GH con una proporción de MPEG:GH de aproximadamente 5 a 10, (ii) un pH de aproximadamente 4 a 6; y (iii) agitar suavemente la mezcla de MPEG-GH durante aproximadamente 10 a 50 horas a temperatura ambiente. 66. El método de la reivindicación 55 que comprende además purificar la GH . 67. El método de la reivindicación 56 en donde la GH producida mediante el proceso es al menos aproximadamente 99% pura. 68. Una composición farmacéutica que comprende (i) una composición hormonal que comprende una hormona del crecimiento enlazada por un enlace covalente a al menos un polímero soluble en agua, en donde el enlace covalente es un enlace oxima; y (ii) un excipiente farmacéuticamente aceptable. 69. La composición farmacéutica de la reivindicación 68 en donde la GH es hGH. 70. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 68 o 69 en donde la composición comprende una formulación farmacéuticamente aceptable líquida para inyección. 71. La composición farmacéutica de la reivindicación 69 en donde la GH comprende un NEAA. 72. La composición farmacéutica de la reivindicación 71 en donde el polímero soluble en agua comprende un PEG. 73. La composición farmacéutica de la reivindicación 71 en donde el PEG es un PEG lineal. 74. La composición farmacéutica de la reivindicación 73 en donde el PEG es un PEG lineal de aproximadamente 30 kDa y la GH es hGH sustituida en una posición correspondiente al aminoácido 35 de la SEQ ID NO: 2 con una para-acetilfenilalanina, y en donde el enlace oxima se forma entre la para-acetilfenilalanina y el PEG. 75. Un método de tratamiento que comprende administrar a un individuo con necesidad de tratamiento una cantidad efectiva de la composición hormonal que comprende una hormona del crecimiento (GH) enlazada por enlace (s) covalente (s) a al menos un polímero soluble en agua, en donde el (los) enlace (s) covalente (s) es un enlace oxima. 76. El método de la reivindicación 75 en donde el individuo sufre de una condición seleccionada del grupo que consiste de deficiencia pediátrica de hormona del crecimiento, estatura corta idiopática, deficiencia adulta de hormona del crecimiento iniciada en la infancia, deficiencia adulta de la hormona del crecimiento iniciada en la adultez y deficiencia secundaria de la hormona del crecimiento. 77. Un método de tratamiento que comprende administrar a un individuo con necesidad de tratamiento una cantidad efectiva de una composición hormonal que comprende una hormona del crecimiento (GH) enlazada por enlace (s) covalente (s) a al menos un polímero souble en agua, en donde el polímero soluble en agua es un polímero lineal, y en donde la composición hormonal se da a una frecuencia de no más de una vez por semana, una vez cada dos semanas o una vez por mes. 78. Una composición hormonal que comprende una GH, en donde la GH tiene una vida media promedio en suero de al menos aproximadamente 12 horas cuando se administra subcutáneamente a un mamífero. 79. Una composición hormonal que comprende una GH enlazada a través de un enlace oxima a un PEG, en donde la GH tiene una vida media promedio en suero de al menos aproximadamente 7 veces la vida media en suero de una composición que comprende la GH sin el PEG, cuando se administra subcutáneamente a un mamífero.
MX2007007580A 2004-12-22 2005-12-21 Hormona del crecimiento humana modificada. MX2007007580A (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US63861604P 2004-12-22 2004-12-22
US72799605P 2005-10-17 2005-10-17
PCT/US2005/046542 WO2006069220A2 (en) 2004-12-22 2005-12-21 Modified human growth hormone

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MX2007007580A true MX2007007580A (es) 2007-12-11

Family

ID=36602317

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2007007580A MX2007007580A (es) 2004-12-22 2005-12-21 Hormona del crecimiento humana modificada.

Country Status (15)

Country Link
US (6) US7939496B2 (es)
EP (2) EP2284191A3 (es)
JP (1) JP2008525473A (es)
KR (1) KR20070090023A (es)
CN (1) CN103690936A (es)
AT (1) ATE542920T1 (es)
AU (2) AU2005319099B2 (es)
BR (1) BRPI0519430A2 (es)
CA (1) CA2594557C (es)
GB (1) GB2436266A (es)
IL (1) IL183343A (es)
MX (1) MX2007007580A (es)
NZ (1) NZ584597A (es)
SG (1) SG160437A1 (es)
WO (1) WO2006069220A2 (es)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4889505B2 (ja) * 2004-02-02 2012-03-07 アンブレツクス・インコーポレイテツド 被修飾されたヒト成長ホルモンポリペプチドおよびこれらの使用
WO2009100255A2 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Ambrx, Inc. Modified leptin polypeptides and their uses
WO2006069246A2 (en) * 2004-12-22 2006-06-29 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
EP1861125A2 (en) * 2005-03-23 2007-12-05 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of an hgh moiety and peg derivatives
CA2612794A1 (en) * 2005-06-15 2006-12-21 Novo Nordisk Health Care Ag Transglutaminase mediated conjugation of growth hormone
KR20080038391A (ko) 2005-08-30 2008-05-06 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 페그화 성장 호르몬의 액체 제제
ATE500215T1 (de) * 2005-11-08 2011-03-15 Ambrx Inc Beschleuniger für die modifikation nichtnatürlicher aminosäuren und nichtnatürlicher aminosäurepolypeptide
US9175061B2 (en) 2006-07-07 2015-11-03 Novo Nordisk Health Care Ag Protein conjugates and methods for their preparation
CA2663300C (en) * 2006-09-15 2014-10-07 Creabilis Therapeutics S.P.A. Polymer conjugates of box-a of hmgb1 and box-a variants of hmgb1
WO2008055972A2 (en) * 2006-11-09 2008-05-15 Novo Nordisk A/S N-terminal pegylated prolactin receptor molecules
CL2008002053A1 (es) * 2007-07-17 2009-05-22 Hoffmann La Roche Metodo para la purificacion de una eritropoyetina monopeguilada (epompeg) que consiste en proporcionar una solucion que contiene eritropoyetina mono, poli y no peguilada y hacerla pasar por dos pasos de cromatografia de intercambio cationico y metodo para producir epo mpeg que incluye metodo de purificacion.
US7960336B2 (en) * 2007-08-03 2011-06-14 Pharmain Corporation Composition for long-acting peptide analogs
ES2632504T3 (es) 2007-11-20 2017-09-13 Ambrx, Inc. Polipéptidos de insulina modificados y sus usos
EP2889370A1 (en) 2007-12-11 2015-07-01 The Scripps Research Institute In vivo unnatural amino acid expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris
PE20110832A1 (es) * 2008-09-26 2011-11-24 Ambrx Inc Polipeptidos de eritropoyetina felina modificados
US8637306B2 (en) * 2008-12-10 2014-01-28 The Scripps Research Institute Production of carrier-peptide conjugates using chemically reactive unnatural amino acids
US20090197339A1 (en) * 2008-12-10 2009-08-06 The Scripps Research Institute In vivo unnatural amino acid expression in the methylotrophic yeast pichia pastoris
WO2010096394A2 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Redwood Biosciences, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
WO2010099477A2 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Atyr Pharma, Inc. Polypeptide structural motifs associated with cell signaling activity
EP2437789A1 (en) * 2009-06-01 2012-04-11 Ablitech, Inc. Biomolecule-polymer conjugates and methods of making same
AU2010332958B2 (en) 2009-12-15 2014-09-18 Ascendis Pharma Endocrinology Division A/S Dry growth hormone composition transiently linked to a polymer carrier
EA201290541A1 (ru) * 2009-12-21 2013-05-30 Амбркс, Инк. Модифицированные бычьи соматотропиновые полипептиды и их применение
CN102666578A (zh) * 2009-12-21 2012-09-12 Ambrx公司 经过修饰的猪促生长素多肽和其用途
AU2011248625B2 (en) 2010-04-26 2017-01-05 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of cysteinyl-tRNA synthetase
CN108165537A (zh) 2010-04-27 2018-06-15 Atyr医药公司 与苏氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
CA2797362C (en) 2010-04-27 2020-12-08 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of isoleucyl trna synthetases
CA2797271C (en) 2010-04-28 2021-05-25 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of alanyl trna synthetases
AU2011248490B2 (en) 2010-04-29 2016-11-10 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of Asparaginyl tRNA synthetases
AU2011248457B2 (en) 2010-04-29 2017-02-16 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of valyl tRNA synthetases
EP2566516B1 (en) 2010-05-03 2019-07-03 aTyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of seryl-trna synthetases
US9034321B2 (en) 2010-05-03 2015-05-19 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of phenylalanyl-alpha-tRNA synthetases
EP2566496B1 (en) 2010-05-03 2018-02-28 aTyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of methionyl-trna synthetases
CA2797277C (en) 2010-05-03 2021-02-23 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of arginyl-trna synthetases
CA2798301C (en) 2010-05-04 2020-09-15 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glutamyl-prolyl-trna synthetases
AU2011248101B2 (en) 2010-05-04 2016-10-20 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of p38 multi-tRNA synthetase complex
CA2799197C (en) 2010-05-14 2019-10-29 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of phenylalanyl-beta-trna synthetases
AU2011256366C1 (en) 2010-05-17 2017-06-15 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of leucyl-tRNA synthetases
JP6046607B2 (ja) 2010-05-27 2016-12-21 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド グルタミニルｔＲＮＡ合成酵素のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見
WO2011153277A2 (en) 2010-06-01 2011-12-08 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of lysyl-trna synthetases
US8999321B2 (en) 2010-07-12 2015-04-07 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glycyl-tRNA synthetases
US8969301B2 (en) 2010-07-12 2015-03-03 Atyr Pharma Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of aspartyl-tRNA synthetases
AU2011289831C1 (en) 2010-07-12 2017-06-15 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glycyl-tRNA synthetases
AU2011289833C1 (en) 2010-07-12 2017-06-15 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of Histidyl-tRNA synthetases
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
CA2808596C (en) 2010-08-17 2020-12-15 Ambrx, Inc. Modified relaxin polypeptides and their uses
EP2608801B1 (en) 2010-08-25 2019-08-21 aTyr Pharma, Inc. INNOVATIVE DISCOVERY OF THERAPEUTIC, DIAGNOSTIC, AND ANTIBODY COMPOSITIONS RELATED TO PROTEIN FRAGMENTS OF TYROSYL-tRNA SYNTHETASES
JP6039566B2 (ja) 2010-10-06 2016-12-07 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド 治療用、診断用および抗体組成物に関連したトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素のタンパク質フラグメントの革新的発見
JP6162606B2 (ja) 2011-01-14 2017-07-12 レッドウッド バイオサイエンス， インコーポレイテッド アルデヒド−タグ付き免疫グロブリンポリペプチド及びその使用方法
WO2013022982A2 (en) 2011-08-09 2013-02-14 Atyr Pharma, Inc. Pegylated tyrosyl-trna synthetase polypeptides
US9816084B2 (en) 2011-12-06 2017-11-14 Atyr Pharma, Inc. Aspartyl-tRNA synthetases
US9822353B2 (en) 2011-12-06 2017-11-21 Atyr Pharma, Inc. PEGylated aspartyl-tRNA synthetase polypeptides
WO2013115926A2 (en) 2011-12-29 2013-08-08 Atyr Pharma, Inc. Aspartyl-trna synthetase-fc conjugates
NZ628126A (en) 2012-02-16 2016-10-28 Atyr Pharma Inc Histidyl-trna synthetases for treating autoimmune and inflammatory diseases
EP2820033A4 (en) * 2012-02-29 2015-01-07 Ambrx Inc INTERLEUKIN 10 POLYPEPTIDE CONJUGATES AND ITS USES
DK3460054T3 (da) 2013-03-15 2021-01-18 Atyr Pharma Inc Histidyl-tRNA-syntetase-Fc-konjugater
JP2019515677A (ja) 2016-04-26 2019-06-13 アール．ピー．シェーラー テクノロジーズ エルエルシー 抗体複合体ならびにそれを作製および使用する方法
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
CN110637027A (zh) 2017-02-08 2019-12-31 百时美施贵宝公司 包含药代动力学增强子的修饰的松弛素多肽及其用途
CA3060514A1 (en) 2017-04-20 2018-10-25 Atyr Pharma, Inc. Compositions and methods for treating lung inflammation
CN109402134A (zh) * 2018-11-29 2019-03-01 湖南百尔泰克生物科技有限公司 一种高效表达生长激素的工程菌的制备方法及其应用
CA3121241A1 (en) * 2018-12-11 2020-06-18 Molecular Technologies Laboratories Llc Pegylated growth hormone antagonists
CN110897047A (zh) * 2019-10-25 2020-03-24 广西泓尚科技有限责任公司 一种含有糖蜜的饲料添加剂的制备及其干燥方法
CN112868668B (zh) * 2021-03-19 2021-09-14 常州英诺升康生物医药科技有限公司 一种Fe3O4-DA-AMP纳米复合抗菌材料及其制备方法和应用
CN113880954B (zh) * 2021-09-29 2024-05-14 江苏大学 一种重组人生长激素及其构建方法和应用
WO2024026224A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 University Of Rochester Methods for improving muscle mass, strength, or function with a combination of testosterone and growth hormone

Family Cites Families (269)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4289872A (en) 1979-04-06 1981-09-15 Allied Corporation Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units
US4342832A (en) * 1979-07-05 1982-08-03 Genentech, Inc. Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
US4898830A (en) 1979-07-05 1990-02-06 Genentech, Inc. Human growth hormone DNA
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
DE3169595D1 (en) 1980-11-10 1985-05-02 Gersonde Klaus Method of preparing lipid vesicles by ultrasonic treatment, the use of this method and apparatus for its application
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
FR2504010B1 (fr) 1981-04-15 1985-10-25 Sanofi Sa Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation
US4551433A (en) 1981-05-18 1985-11-05 Genentech, Inc. Microbial hybrid promoters
JPS57206622A (en) 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
JPS58118008A (ja) 1982-01-06 1983-07-13 Nec Corp デ−タ処理装置
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4670393A (en) 1982-03-22 1987-06-02 Genentech, Inc. DNA vectors encoding a novel human growth hormone-variant protein
US4446235A (en) 1982-03-22 1984-05-01 Genentech, Inc. Method for cloning human growth hormone varient genes
DE3218121A1 (de) 1982-05-14 1983-11-17 Leskovar, Peter, Dr.-Ing., 8000 München Arzneimittel zur tumorbehandlung
EP0102324A3 (de) 1982-07-29 1984-11-07 Ciba-Geigy Ag Lipide und Tenside in wässriger Phase
US4512922A (en) 1982-12-22 1985-04-23 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4511502A (en) 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4511503A (en) 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4820352A (en) 1983-01-10 1989-04-11 Bausch & Lomb Incorporated Cleaning and conditioning solutions for contact lenses and methods of use
CA1341302C (en) 1983-02-22 2001-10-09 Rae Lyn Burke Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis of foreign protein
US5089398A (en) 1983-02-22 1992-02-18 Chiron Corporation Enhanced yeast transcription employing hybrid GAPDH promoter region constructs
US4876197A (en) 1983-02-22 1989-10-24 Chiron Corporation Eukaryotic regulatable transcription
JPS59166086A (ja) 1983-03-09 1984-09-19 Teruhiko Beppu 新規な発現型プラスミドとそれらを用いて仔牛プロキモシン遺伝子を大腸菌内で発現させる方法
US4859600A (en) 1983-04-25 1989-08-22 Genentech, Inc. Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone
US4755465A (en) 1983-04-25 1988-07-05 Genentech, Inc. Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas
ATE78293T1 (de) 1983-05-27 1992-08-15 Texas A & M Univ Sys Verfahren zur herstellung eines rekombinanten baculovirus-expressionsvektors.
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US4689406A (en) 1983-08-10 1987-08-25 Amgen Enhancement of microbial expression of polypeptides
EP0142641B1 (de) 1983-09-26 1991-01-16 Udo Dr. Ehrenfeld Mittel und Erzeugnis für die Diagnose und Therapie von Tumoren sowie zur Behandlung von Schwächen der zelligen und humoralen Immunabwehr
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
DK518384A (da) 1984-01-31 1985-07-01 Idaho Res Found Vektor til fremstilling af et gen-produkt i insektceller, fremgangsmaade til dens fremstilling samt dens anvendelse
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
EP0480480A3 (en) 1984-05-11 1992-06-10 Chiron Corporation Enhanced yeast transcription employing hybrid promoter region constructs
US4880734A (en) 1984-05-11 1989-11-14 Chiron Corporation Eukaryotic regulatable transcription
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4738921A (en) 1984-09-27 1988-04-19 Eli Lilly And Company Derivative of the tryptophan operon for expression of fused gene products
US4963495A (en) 1984-10-05 1990-10-16 Genentech, Inc. Secretion of heterologous proteins
US4659839A (en) 1984-10-10 1987-04-21 Mallinckrodt, Inc. Coupling agents for radiolabeled antibody fragments
US4837148A (en) 1984-10-30 1989-06-06 Phillips Petroleum Company Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia
US4665180A (en) * 1984-11-06 1987-05-12 Petrolite Corporation Substituted tetrahydropyrimidines and octahydrophenanthridines
GB8430252D0 (en) 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
DE3680924D1 (de) 1985-01-14 1991-09-26 Neorx Corp Metall-radionuklid markiertes protein fuer diagnose und therapie.
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
WO1987000056A1 (en) 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4680338A (en) 1985-10-17 1987-07-14 Immunomedics, Inc. Bifunctional linker
US4699784A (en) 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
JPS63123383A (ja) 1986-11-11 1988-05-27 Mitsubishi Kasei Corp ハイブリツドプロモ−タ−、発現調節ｄｎａ配列および発現ベクタ−
US5186933A (en) 1986-12-30 1993-02-16 Baylor College Of Medicine Synthesis and immunogenicity of rotavirus genes using a baculovirus expression system
EP0349594A4 (en) 1987-03-16 1990-09-26 American Biogenetic Sciences, Inc. Recombinant baculovirus occlusion bodies in vaccines and biological insecticides
EP0284044B1 (en) 1987-03-23 1994-03-23 Zymogenetics, Inc. High level expression in yeast
US5229490A (en) 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
US5688763A (en) * 1987-06-12 1997-11-18 Hammonds, Jr.; R. Glenn Compositions and methods for the synthesis of growth hormone receptor and growth hormone binding protein
US5057417A (en) * 1987-06-12 1991-10-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the synthesis of growth hormone receptor and growth hormone binding protein
WO1989001037A1 (en) 1987-07-24 1989-02-09 Cetus Corporation Production of ricin toxins in a baculovirus-insect cell expression system
WO1989001038A1 (en) 1987-07-24 1989-02-09 Cetus Corporation PRODUCTION OF BIOLOGICALLY ACTIVE FORMS OF CSF USING A BACULOVIRUS (AcNPV)-INSECT CELL EXPRESSION SYSTEM
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US4929555A (en) 1987-10-19 1990-05-29 Phillips Petroleum Company Pichia transformation
US5192669A (en) * 1987-11-09 1993-03-09 Eli Lilly And Company Method to produce recombinant proteins using an expression vector comprising transcriptional and translational activating sequences
US5063158A (en) * 1987-11-09 1991-11-05 Eli Lilly And Company Recombinant DNA expression vector comprising both transcriptional and translational activating sequences
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
CA1340772C (en) 1987-12-30 1999-09-28 Patricia Tekamp-Olson Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
CA1324969C (en) 1988-05-06 1993-12-07 Jeffrey R. Shuster High level expression of proteins in yeast
US5674706A (en) 1988-05-06 1997-10-07 Chiron Corporation High level expression of proteins in yeast
FR2631974B1 (fr) 1988-05-31 1992-12-11 Agronomique Inst Nat Rech Baculovirus modifie, son procede de preparation et son application en tant que vecteur d'expression de genes
WO1990001556A1 (en) 1988-08-05 1990-02-22 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York In vivo infection of live insects with a recombinant baculovirus
GB8819453D0 (en) 1988-08-16 1988-09-21 Roy P Production of bluetongue virus non-structural proteins using baculovirus expression vector
NZ230425A (en) 1988-09-02 1992-07-28 Molecular Eng Ass Production of paramyxovirus fusion (f) protein using recombinant baculovirus expression vector
US5218092A (en) 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
EP0397834B1 (en) 1988-10-28 2000-02-02 Genentech, Inc. Method for identifying active domains and amino acid residues in polypeptides and hormone variants
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
US5688666A (en) * 1988-10-28 1997-11-18 Genentech, Inc. Growth hormone variants with altered binding properties
US5534617A (en) * 1988-10-28 1996-07-09 Genentech, Inc. Human growth hormone variants having greater affinity for human growth hormone receptor at site 1
EP0446299A4 (en) 1988-11-18 1992-05-13 The Regents Of The University Of California Method for site-specifically incorporating unnatural amino acids into proteins
WO1990006952A1 (en) 1988-12-22 1990-06-28 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
AU5187190A (en) 1989-02-23 1990-09-26 University Of Ottawa Improved baculovirus expression system capable of producing foreign gene proteins at high levels
CA2045614C (en) 1989-02-24 1997-09-30 James W. Bacus Method and apparatus for determining a proliferation index of a cell sample
DE69033192T3 (de) 1989-04-19 2004-05-19 Enzon, Inc. Aktive karbonate von polyalkylenoxyden zur modifizierung von polypeptiden
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
CA2033070A1 (en) 1989-05-17 1990-11-18 Lois K. Miller Baculovirus expression vectors
DE69026306T2 (de) 1989-05-27 1996-10-17 Sumitomo Pharma Verfahren für die Herstellung von Polyethylenglykolderivate und modifizierte Proteine.
FR2649120B1 (fr) 1989-06-30 1994-01-28 Cayla Nouvelle souche et ses mutants de champignons filamenteux, procede de production de proteines recombinantes a l'aide de ladite souche et souches et proteines obtenues selon ce procede
US6267964B1 (en) * 1989-08-01 2001-07-31 Affibody Technology Sweden Ab Stabilized protein or peptide conjugates able to bond albumin having extended biological half-lives
US5350836A (en) * 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
US5162601A (en) 1989-11-22 1992-11-10 The Upjohn Company Plant potyvirus expression vector with a gene for protease
US5312808A (en) 1989-11-22 1994-05-17 Enzon, Inc. Fractionation of polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
US5219564A (en) 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
FR2664905B1 (fr) 1990-07-18 1994-08-12 Agronomique Inst Nat Rech Baculovirus modifie, son procede d'obtention, et vecteurs d'expression obtenus a partir dudit baculovirus.
WO1992001800A1 (en) 1990-07-20 1992-02-06 Chiron Corporation Method for integrative transformation of yeast using dispersed repetitive elements
JPH06501845A (ja) 1990-08-02 1994-03-03 カイロン　コーポレイション バキュロウイルス―昆虫細胞発現システムを用いたヒトｃｍｖ糖タンパク質―ｈの発現
JP3051145B2 (ja) * 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
CA2090969C (en) 1990-09-04 2001-08-21 Russell Arthur Brierley Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
EP0513332A4 (en) 1990-11-14 1993-03-17 Cargill, Incorporated Conjugates of poly(vinylsaccharide) with proteins for the stabilization of proteins
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5231178A (en) 1991-01-16 1993-07-27 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Method for the purification of intact, correctly-folded insulin-like growth factor-1
JPH06506217A (ja) 1991-03-18 1994-07-14 エンゾン，インコーポレーテッド ポリペプチドまたはグリコポリペプチドとポリマーとのヒドラジン含有結合体
WO1992016619A1 (en) 1991-03-19 1992-10-01 Us Army Expression of influenza nucleoprotein antigens in baculovirus
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US6013433A (en) 1991-04-26 2000-01-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Baculovirus expression vectors and recombinant antigens for detecting type-specific antibodies to herpes simplex virus
ATE196548T1 (de) * 1991-05-10 2000-10-15 Genentech Inc Auswählen von agonisten und antagonisten von liganden
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5290686A (en) 1991-07-31 1994-03-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Expression of influenza a M2 protein in baculovirus
IT1260468B (it) 1992-01-29 1996-04-09 Metodo per mantenere l'attivita' di enzimi proteolitici modificati con polietilenglicole
CA2118130A1 (en) 1992-04-14 1993-10-28 Jean M. J. Frechet Dendritic based macromolecules and method of production
US5516657A (en) 1992-05-11 1996-05-14 Cambridge Biotech Corporation Baculovirus vectors for expression of secretory and membrane-bound proteins
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
WO1994004193A1 (en) 1992-08-21 1994-03-03 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
FI935485A (fi) * 1992-12-09 1994-06-10 Ortho Pharma Corp PEG-hydratsoni- ja PEG-oksiimisidoksen muodostavat reagenssit ja niiden proteiinijohdannaiset
US5298643A (en) 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
WO1994015625A1 (en) 1993-01-15 1994-07-21 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
US5349001A (en) 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5321095A (en) 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
US5532142A (en) 1993-02-12 1996-07-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Method of isolation and purification of fusion polypeptides
IL104734A0 (en) 1993-02-15 1993-06-10 Univ Bar Ilan Bioactive conjugates of cellulose with amino compounds
AU7097094A (en) * 1993-06-01 1994-12-20 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
AU7113594A (en) 1993-06-21 1995-01-17 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
GB9317618D0 (en) * 1993-08-24 1993-10-06 Royal Free Hosp School Med Polymer modifications
JP2732783B2 (ja) * 1993-08-31 1998-03-30 沖電気工業株式会社 符号分割多元接続復調装置
US5762939A (en) 1993-09-13 1998-06-09 Mg-Pmc, Llc Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5491076A (en) 1993-11-01 1996-02-13 The Texas A&M University System Expression of foreign genes using a replicating polyprotein producing virus vector
US5605792A (en) 1993-11-04 1997-02-25 The Ohio State University Research Foundation Infectious bursal disease virus VP2 fusion protein expressed by baculovirus, use as diagnostic
ES2174915T3 (es) 1993-11-10 2002-11-16 Enzon Inc Productos de conjugacion mejorados de un interferon con un polimero.
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5597709A (en) * 1994-01-27 1997-01-28 Human Genome Sciences, Inc. Human growth hormone splice variants hGHV-2(88) and hGHV-3(53)
FR2715664B1 (fr) * 1994-01-31 1996-04-12 Proteine Performance Sa Baculovirus recombinant et son utilisation pour la production d'anticorps monoclonaux.
JP3090586B2 (ja) 1994-03-15 2000-09-25 片倉工業株式会社 システインプロテアーゼ遺伝子欠損バキュロウイルスおよびその製造法並びにこれを利用する有用タンパク質の製造法
US5473034A (en) 1994-03-18 1995-12-05 Hyogo Prefectural Government Method for producing protein-synthetic polymer conjugate and said conjugate produced thereby
US5629384A (en) 1994-05-17 1997-05-13 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces
AU2826495A (en) 1994-06-02 1996-01-04 Enzon, Inc. Method of solubilizing substantially water insoluble materials
US5730990A (en) 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US6403375B1 (en) * 1994-08-24 2002-06-11 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Establishment of Trichoplusia ni cell lines in serum-free medium for recombinant protein and baculovirus production
US5650234A (en) 1994-09-09 1997-07-22 Surface Engineering Technologies, Division Of Innerdyne, Inc. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces
US5871986A (en) 1994-09-23 1999-02-16 The General Hospital Corporation Use of a baculovirus to express and exogenous gene in a mammalian cell
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
WO1996041813A2 (en) 1994-11-09 1996-12-27 Offord Robin E Functionalized polymers for site-specific attachment
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
IL116085A (en) 1994-12-16 1999-12-31 Ortho Pharma Corp Spray dried erythropoietin
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
AU720337B2 (en) 1995-02-17 2000-05-25 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Production of biologically active recombinant bovine follicle stimulating hormone (REC bFSH) in the baculovirus expression system
FR2732035B1 (fr) 1995-03-23 1997-05-30 Agronomique Inst Nat Rech Procede de regulation de l'expression d'un gene dans un baculovirus, par un site de fixation d'un recepteur de l'acide retinoique, et vecteur pour la mise en oeuvre du dit procede
US6184344B1 (en) 1995-05-04 2001-02-06 The Scripps Research Institute Synthesis of proteins by native chemical ligation
NZ308772A (en) 1995-05-17 1999-04-29 Du Pont Recombinant baculovirus insecticides
WO1996040791A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Novo Nordisk A/S Modification of polypeptides
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
DE69635026T2 (de) 1995-09-21 2006-05-24 Genentech Inc., San Francisco Varianten des menschlichen wachstumshormons
GB9526733D0 (en) * 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
US5861279A (en) 1996-01-17 1999-01-19 Schering Corporation Baculovirus expression system for human interleukin 5 receptor and method of screening for interleukin 5 antagonists
AU1690697A (en) 1996-01-17 1997-08-11 Schering Corporation Baculovirus expression system for human interleukin 5 receptor and method of screening for interleukin antagonists
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
US20020077461A1 (en) 1996-04-24 2002-06-20 Soren Bjorn Pharmaceutical formulation
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
EP1731174A3 (en) 1996-08-02 2007-01-17 Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. Polypeptides having a covalently bound N-terminal polyethylene glycol via hydrazone or oxime bond
US5980948A (en) 1996-08-16 1999-11-09 Osteotech, Inc. Polyetherester copolymers as drug delivery matrices
US5901183A (en) * 1996-09-25 1999-05-04 Magellan Corporation Signal correlation technique for a receiver of a spread spectrum signal including a pseudo-random noise code that reduces errors when a multipath signal is present
US6214966B1 (en) 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
US5998595A (en) 1996-11-05 1999-12-07 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Azidohalogenobenzyl derivatives, sugar compounds and protection of hydroxy groups
US6017731A (en) 1996-12-13 2000-01-25 Chiron Corporation Method for expression of heterologous proteins in yeast
WO1998032466A1 (en) 1997-01-29 1998-07-30 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylation process
GB9703406D0 (en) 1997-02-19 1997-04-09 Chiron Spa Expression of heterologous proteins
JP4187277B2 (ja) 1997-04-30 2008-11-26 エンゾン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド グリコシル化し得る抗原結合単鎖タンパク質、それらの生成および使用
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
EP0921131B1 (en) 1997-06-06 2010-05-26 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Chemically modified polypeptides
US5965393A (en) 1997-07-01 1999-10-12 National Institute Of Immunology Method for enhancing foreign gene expression in baculovirus expression vector system
IL133974A0 (en) 1997-07-14 2001-04-30 Bolder Biotechnology Inc Derivatives of growth hormone and related proteins
GB9715660D0 (en) 1997-07-25 1997-10-01 Zeneca Ltd Proteins
EP1003889A1 (en) 1997-08-05 2000-05-31 Chiron Corporation NOVEL $i(PICHIA PASTORIS) GENE SEQUENCES AND METHODS FOR THEIR USE
DE19735593C2 (de) 1997-08-15 1999-08-26 Hepavec Ag Fuer Gentherapie Hüllprotein-modifizierter Baculovirus-Vektor für die Gentherapie
US6090584A (en) 1997-08-21 2000-07-18 University Technologies International Inc. Baculovirus artificial chromosomes and methods of use
US5989868A (en) 1997-09-12 1999-11-23 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Fusion protein systems designed to increase soluble cytoplasmic expression of heterologous proteins in esherichia coli
WO1999014318A1 (en) 1997-09-16 1999-03-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes
CA2320156A1 (en) 1997-09-26 1999-04-08 Uab Research Foundation Reduced antigenic cells and uses therefor
US6201072B1 (en) 1997-10-03 2001-03-13 Macromed, Inc. Biodegradable low molecular weight triblock poly(lactide-co- glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
US6004573A (en) 1997-10-03 1999-12-21 Macromed, Inc. Biodegradable low molecular weight triblock poly(lactide-co-glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
DE19748489A1 (de) 1997-11-03 1999-05-06 Roche Diagnostics Gmbh Polyethylenglykol-derivatisierte Biomoleküle und deren Verwendung in heterogenen Nachweisverfahren
US6448369B1 (en) 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
EP0924298A1 (en) 1997-12-18 1999-06-23 Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) Protein expression in baculovirus vector expression systems
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
KR100255565B1 (ko) * 1997-12-26 2000-05-01 정선종 코드분할 다중접속 시스템의 비동기 다중 경로 채널에서의다중 모드 감산형 잡음 제거 방법 및 장치
JP2002505110A (ja) 1998-03-04 2002-02-19 オニックス ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド 遺伝物質の高生産性発現のためのバキュロウイルス発現系及び方法
US6423685B1 (en) 1998-03-05 2002-07-23 Chiron Corporation Method for increasing the serum half-life of a biologically active molecule
EP1061954B1 (en) 1998-03-12 2004-06-09 Nektar Therapeutics Al, Corporation Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups
KR100264953B1 (ko) 1998-04-03 2001-03-02 박현우 재조합 베큘로바이러스, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 미생물 살충제
JP3024750B2 (ja) * 1998-04-07 2000-03-21 日本電気株式会社 Ｄｓ−ｃｄｍａマルチユーザ干渉キャンセラ装置及びｄｓ−ｃｄｍａ通信システム
DE69925830T2 (de) * 1998-04-28 2006-05-04 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Peg-lhrh analog konjugate
EA003789B1 (ru) 1998-04-28 2003-10-30 Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. КОНЪЮГАТЫ ПОЛИОЛ-β-ИНТЕРФЕРОН
US6451986B1 (en) 1998-06-22 2002-09-17 Immunex Corporation Site specific protein modification
US6160089A (en) * 1998-07-08 2000-12-12 Mitsui Chemicals, Inc. Method for secretory production of human growth hormone
US6168932B1 (en) 1998-07-13 2001-01-02 Parker Hughes Institute Recombinant DTctGMCSF fusion toxin in a baculovirus expression vector system
US6245528B1 (en) 1998-07-28 2001-06-12 Academia Sinica Latent baculovirus expression system
US6368825B1 (en) 1998-08-10 2002-04-09 Academia Sinica Baculovirus containing minimal CMV promoter
DK1400551T3 (da) 1998-08-28 2007-10-15 Amylin Pharmaceuticals Inc Polyamidkæder med præcis længde og deres konjugater med proteiner
SG84514A1 (en) * 1998-08-31 2001-11-20 Oki Techno Ct Singapore Pte Receiving device and channel estimator for use in a cdma communication system
JP2002526078A (ja) 1998-09-18 2002-08-20 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド インターフェロン−イプシロン
WO2000020032A1 (en) 1998-10-06 2000-04-13 Trustees Of Dartmouth College RECOMBINANT CAT ALLERGEN, Fel dI, EXPRESSED IN BACULOVIRUS FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CAT ALLERGY
US6420339B1 (en) 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
JP2002531067A (ja) 1998-10-30 2002-09-24 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 低下したアレルゲン性を有するグリコシル化タンパク質
US6451346B1 (en) 1998-12-23 2002-09-17 Amgen Inc Biodegradable pH/thermosensitive hydrogels for sustained delivery of biologically active agents
US6281211B1 (en) 1999-02-04 2001-08-28 Euro-Celtique S.A. Substituted semicarbazides and the use thereof
US6994986B2 (en) 1999-03-17 2006-02-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford University In vitro synthesis of polypeptides by optimizing amino acid metabolism
JP4707237B2 (ja) 1999-03-17 2011-06-22 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 外因性アミノ酸および新規ａｔｐ再生システムを用いたインビトロ高分子生合成の方法
US6342216B1 (en) 1999-03-17 2002-01-29 The Board Of Regents, The University Of Texas System Therapy of cancer by insect cells containing recombinant baculovirus encoding genes
US6337191B1 (en) 1999-03-22 2002-01-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Vitro protein synthesis using glycolytic intermediates as an energy source
US6384105B1 (en) 1999-04-16 2002-05-07 William Marsh Rice University Poly(Propylene Fumarate) cross linked with Poly(Ethylene Glycol)
US6514729B1 (en) 1999-05-12 2003-02-04 Xencor, Inc. Recombinant interferon-beta muteins
US6714585B1 (en) * 1999-06-25 2004-03-30 Ericsson Inc. Rake combining methods and apparatus using weighting factors derived from knowledge of spreading spectrum signal characteristics
US6261805B1 (en) 1999-07-15 2001-07-17 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Sialyiation of N-linked glycoproteins in the baculovirus expression vector system
PL211886B1 (pl) * 1999-10-04 2012-07-31 Novartis Vaccines & Diagnostic Stabilizowana ciekła kompozycja farmaceutyczna, sposób zwiększania trwałości polipeptydu, sposób zwiększania trwałości podczas przechowywania kompozycji, sucha postać kompozycji oraz preparat zawierający kompozycję
US6485937B1 (en) 1999-10-15 2002-11-26 The Rockefeller University System for rapid generation of recombinant baculovirus-based expression vectors for silkworm larvae
US6747969B1 (en) * 1999-11-23 2004-06-08 Olaf Hirsch Transmission gap interference measurement
US6348558B1 (en) 1999-12-10 2002-02-19 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom
PT1259563E (pt) 1999-12-22 2009-04-14 Nektar Therapeutics Al Corp Processo para a preparação de ésteres de 1-benzotriazolil- -carbonato de polímeros solúveis em água
WO2001046291A1 (en) 1999-12-22 2001-06-28 Shearwater Corporation Sterically hindered derivatives of water soluble polymers
US6413507B1 (en) 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
US6646110B2 (en) 2000-01-10 2003-11-11 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF polypeptides and conjugates
WO2001062827A2 (en) 2000-02-22 2001-08-30 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
WO2001062299A2 (en) 2000-02-28 2001-08-30 Shearwater Corporation Water-soluble polymer conjugates of artelinic acid
US6586207B2 (en) 2000-05-26 2003-07-01 California Institute Of Technology Overexpression of aminoacyl-tRNA synthetases for efficient production of engineered proteins containing amino acid analogues
GB0012997D0 (en) 2000-05-26 2000-07-19 Eurogene Limited Gene delivery
JP2002030098A (ja) 2000-07-17 2002-01-29 Institute Of Immunology Co Ltd バキュロウィルスの発芽ウイルスからウイルスエンベロープを回収する方法
DE10035676A1 (de) * 2000-07-21 2002-02-07 Siemens Ag Gasturbine und Verfahren zum Betrieb einer Gasturbine
KR20030046411A (ko) * 2000-09-08 2003-06-12 그리폰 테라퓨틱스, 인코포레이티드 '위'-천연 화학적 라이게이션
US7118737B2 (en) * 2000-09-08 2006-10-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Polymer-modified synthetic proteins
US6680727B2 (en) * 2000-10-17 2004-01-20 Qualcomm Incorporated Method and apparatus for canceling pilot interference in a CDMA communication system
US6436386B1 (en) 2000-11-14 2002-08-20 Shearwater Corporation Hydroxyapatite-targeting poly (ethylene glycol) and related polymers
TW593427B (en) 2000-12-18 2004-06-21 Nektar Therapeutics Al Corp Synthesis of high molecular weight non-peptidic polymer derivatives
KR100401296B1 (ko) 2000-12-27 2003-10-11 드림바이오젠 주식회사 수식물질에 의해 수식된 단백질 변이체 및 이것의 제조방법
TWI246524B (en) 2001-01-19 2006-01-01 Shearwater Corp Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
IL158419A0 (en) 2001-04-19 2004-05-12 Scripps Research Inst Methods and composition for the production of orthoganal trna-aminoacyl trna synthetase pairs
WO2002085924A2 (en) * 2001-04-23 2002-10-31 Abgenix, Inc. ANTI-α3(IV)NC1 MONOCLONAL ANTIBODIES AND ANIMAL MODEL FOR HUMAN ANTI-GLOMERULAR BASEMENT MEMBRANE AUTOANTIBODY DISEASE
GB0113657D0 (en) 2001-06-05 2001-07-25 Geneprot Inc Improved native chemical ligation with three or more components
FR2827720B1 (fr) 2001-07-20 2005-05-20 Thales Sa Dispositif a ondes acoustiques de surface a faibles pertes avec couche dielectrique de forte permittivite
US20040138412A1 (en) 2001-09-07 2004-07-15 Paolo Botti Extended native chemical ligation
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
CA2466027C (en) 2001-11-07 2013-01-08 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polymers and their conjugates
JP4399627B2 (ja) 2001-11-14 2010-01-20 ジェネプロット インコーポレーティッド ３つまたはそれ以上の成分による化学ペプチド連結
AP2004003050A0 (en) * 2001-11-20 2004-06-30 Pharmacia Corp Chemically modified human growth hormone conjugates
US20030171285A1 (en) * 2001-11-20 2003-09-11 Finn Rory F. Chemically-modified human growth hormone conjugates
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
WO2003070740A1 (en) 2002-02-15 2003-08-28 The Research Foundation Of State University Of New York RIBOZYMES WITH BROAD tRNA AMINOACYLATION ACTIVITY
DK2226316T3 (en) 2002-05-30 2016-04-11 Scripps Research Inst Copper catalyzed ligation of azides and acetylenes
US20070065469A1 (en) * 2002-07-09 2007-03-22 Michael Betz Liquid formulations with high concentration of human growth hormone (high) comprising glycine
ES2333422T3 (es) 2002-10-16 2010-02-22 The Scripps Research Institute Sintesis de glicoproteinas.
ATE429500T1 (de) 2002-10-16 2009-05-15 Scripps Research Inst Stellenspezifischer einbau von ketoaminosäuren in proteine
WO2004058946A2 (en) 2002-12-22 2004-07-15 The Scripps Research Institute Protein arrays
ATE542894T1 (de) * 2003-04-17 2012-02-15 Scripps Research Inst Ausweitung des eukaryotischen genetischen codes
US7993872B2 (en) 2003-06-18 2011-08-09 The Scripps Research Institute Unnatural reactive amino acid genetic code additions
MXPA06000242A (es) 2003-07-07 2006-04-07 Scripps Research Inst Composiciones de pares de lisil-trna ortogonal y aminoacil- trna sintetasa y sus usos.
EP1704242A4 (en) 2003-07-07 2008-06-18 Scripps Research Inst COMPOSITIONS WITH PAIRS OF ORTHOGONAL LEUCYL-TRNA AND AMINOACYL-TRNA-SYNTHETASE AND USES THEREOF
EP1658366A4 (en) 2003-07-07 2006-08-09 Scripps Research Inst COMPOSITIONS OF ORTHOGONAL GLUTAMYL-TRNA AND AMINOACYL-TRNA-SYNTHETASEPAARES AND THEIR USES
EP1675620B1 (en) 2003-10-09 2019-05-08 Ambrx, Inc. Polymer derivatives
JP4889505B2 (ja) 2004-02-02 2012-03-07 アンブレツクス・インコーポレイテツド 被修飾されたヒト成長ホルモンポリペプチドおよびこれらの使用
WO2006042847A2 (en) 2004-10-18 2006-04-27 Novo Nordisk A/S Method for the preparation of oxime, thiazolidine, dithiane, dithiolane or hydrazone linked analogues of growth hormone

Also Published As

Publication number Publication date
US20110294161A1 (en) 2011-12-01
AU2005319099A1 (en) 2006-06-29
WO2006069220A9 (en) 2007-08-02
GB0713656D0 (en) 2007-08-22
NZ584597A (en) 2011-09-30
EP2284191A3 (en) 2011-07-20
BRPI0519430A2 (pt) 2009-02-10
WO2006069220A2 (en) 2006-06-29
GB2436266A (en) 2007-09-19
EP2284191A2 (en) 2011-02-16
IL183343A (en) 2013-07-31
US8143216B2 (en) 2012-03-27
US20080102125A1 (en) 2008-05-01
ATE542920T1 (de) 2012-02-15
AU2010249317A1 (en) 2011-01-06
CA2594557C (en) 2016-04-26
JP2008525473A (ja) 2008-07-17
US7939496B2 (en) 2011-05-10
WO2006069220A3 (en) 2007-03-01
EP1836314A2 (en) 2007-09-26
EP1836314B1 (en) 2012-01-25
IL183343A0 (en) 2007-09-20
CA2594557A1 (en) 2006-06-29
US8178494B2 (en) 2012-05-15
AU2005319099B2 (en) 2010-09-16
EP1836314A4 (en) 2008-08-13
US20080113914A1 (en) 2008-05-15
SG160437A1 (en) 2010-04-29
US20060189529A1 (en) 2006-08-24
US20080102124A1 (en) 2008-05-01
KR20070090023A (ko) 2007-09-04
CN103690936A (zh) 2014-04-02
US20080107680A1 (en) 2008-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2005319099B2 (en) Modified human growth hormone
US8778880B2 (en) Human growth hormone modified at position 35
US7947473B2 (en) Methods for expression and purification of pegylated recombinant human growth hormone containing a non-naturally encoded keto amino acid
US20090093405A1 (en) Non-Natural Amino Acid Polypeptides Having Modified Immunogenicity
US20150031864A1 (en) Modified Adiponectin Polypeptides and Their Uses
MX2008009224A (es) Polipeptidos de aminoacidos no naturales, que tienen inmunogenicidad modulada

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration