PL211886B1

PL211886B1 - Stabilizowana ciekła kompozycja farmaceutyczna, sposób zwiększania trwałości polipeptydu, sposób zwiększania trwałości podczas przechowywania kompozycji, sucha postać kompozycji oraz preparat zawierający kompozycję

Info

Publication number: PL211886B1
Application number: PL370852A
Authority: PL
Inventors: Bao-Lu Chen; Maninder Hora
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 1999-10-04
Filing date: 2000-10-03
Publication date: 2012-07-31
Also published as: CA2477857A1; NO20021567L; BRPI0017437B1; NZ535205A; EP1491208A1; HU0401975D0; AU2006200141A1; BRPI0017437B8; EP1220682B1; HUP0203133A3; CZ305123B6; US7030086B2; US6525102B1; AU783306B2; AU2006200141B2; US20030180253A1; CN100389821C; NO20021567D0; ATE345810T1; US7807142B2

Description

Przedmiotem wynalazku jest stabilizowana ciekła kompozycja farmaceutyczna, sposób zwiększania trwałości polipeptydu lub jego odmiany w ciekłej kompozycji farmaceutycznej, sposób zwiększania trwałości podczas przechowywania kompozycji farmaceutycznej zawierającej polipeptyd lub jego odmianę, suchą postać kompozycji oraz preparat do diagnozowania, zapobiegania lub leczenia zawierający kompozycję.

Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznych zawierających polipeptydy, które zazwyczaj są nietrwałe w ciekłych preparatach farmaceutycznych.

Ostatnie postępy w rozwoju inżynierii genetycznej zaowocowały wieloma rozmaitymi aktywnymi biologicznie polipeptydami w ilościach wystarczających do zastosowania jako leki. Polipeptydy mogą jednakże tracić swoją aktywność biologiczną wskutek niestabilności fizycznej, obejmującej denaturację i powstawania rozpuszczalnych jak i nierozpuszczalnych agregatów oraz wskutek niestabilności chemicznej, jak hydroliza, utlenianie i deamidację. Trwałość polipeptydów w ciekłych preparatach farmaceutycznych może być zależna od czynników występujących podczas obróbki takich jak pH, siła jonowa, temperatura, powtarzane cyklicznie zamrażanie i rozmrażanie, oraz ekspozycja na działanie sił ścinających. Powstawanie agregatów i utrata aktywności biologicznej mogą także nastąpić w wyniku fizycznego mieszania i oddziaływania cząsteczek polipeptydu w roztworze i na granicy faz ciecz-powietrze wewnątrz fiolek do przechowywania. Kolejne zmiany konformacyjne mogą wystąpić w polipeptydach zaadsorbowanych na granicy faz powietrze -ciecz i ciało stałe - ciecz podczas ich sprężania-rozszerzania występujących w trakcie mieszania podczas transportu lub w innych przypadkach. Takie mieszanie może powodować zwijanie się białka, agregację, tworzenie cząstek oraz wytrącanie wraz z innymi zaadsorbowanymi białkami. Ogólny przegląd trwałości białkowych środków farmaceutycznych przedstawili np. Manning i in. (1989) przy pHarm. Res. 6: 903-918 oraz Wang i Hanson (1988) w J. Parenteral Sci. Tech. 42:S14.

Nietrwałość ciekłych preparatów farmaceutycznych zawierających polipeptyd wymusza pakowanie tych preparatów w postaci liofilizowanej wraz z odpowiednim ciekłym środkiem do odtwarzania. Chociaż liofilizacja zwiększa trwałość przechowywanej kompozycji, wiele polipeptydów wykazuje obniżoną aktywność podczas przechowywania w postaci suchej (Pikal (1990) Biopharm. 27:26-30) w wyniku powstawania agregatów lub utraty aktywności katalitycznej po ich odtworzeniu w postać ciekłego preparatu (patrz np. Carpenter i in. (1991) Develop. Biol. Standard 74:225-239; Broadhead i in. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 75:1169-1206; Mumenthaler i in. (1994) Pharm. Res. 17:12-20; Carpenter i Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; i Roser (1991) Biopharm. 4:47-53).

Publikacja EP 0229016 ujawnia ciekłą kompozycję IL-2, która następnie jest liofilizowana, przy czym wspomniana kompozycja zawiera argininę lub lizynę i kwas winowy lub kwas mlekowy a wartość pH wynosi 7. Jednakże, IL-2 jest poddawany ekstremalnym wartościom pH podczas przygotowywania kompozycji IL-2, co może powodować denaturację polipeptydu, a więc wpływać niekorzystnie na jego aktywność biologiczną.

Natomiast dokument US 5078997 ujawnia liofilizowaną a następnie rekonstytuowaną ciekłą kompozycję IL-2 zawierającą argininę i bufor cytrynianowy.

Jakkolwiek zastosowanie dodatków zwiększa trwałość osuszonego białka, to wiele powtórnie uwodnionych preparatów zawiera niedopuszczalną lub niepożądaną ilość nieaktywnego, zagregowanego białka (patrz np. Townsend i DeLuca (1983) J. Pharm. Sci. 80:63-66; Hora i in. (1992) Pharm. Res. 9:33-36; Yoshiaka i in. (1993) Pharm. Res, 70:687-691). Dodatkowo konieczność odtwarzania stanowi pewną niedogodność i może przyczynić się do nieprawidłowego dawkowania.

Skomponowano pewną liczbę ciekłych kompozycji farmaceutycznych, mając na celu stabilizację aktywności biologicznej zawartych w nich polipeptydów, jednakże degradacja polipeptydów w ciekłych preparatach jest ciągle problemem. Dlatego też występuje zapotrzebowanie na dodatkowe kompozycje farmaceutyczne zawierające fizjologicznie kompatybilne stabilizatory, wspomagające trwałość składników polipeptydowych, zachowując tym samym ich skuteczność terapeutyczną.

Przedmiotem wynalazku jest stabilizowana ciekła kompozycja farmaceutyczna zawierająca: polipeptyd lub jego odmianę jako składnik terapeutycznie aktywny, w stężeniu od 0,01 mg/ml do

2,0 mg/ml, przy czym wspomniany polipeptyd lub jego odmiana tworzą agregaty w ciekłym preparacie podczas przechowywania, i przy czym polipeptyd ten stanowi interleukina-2 (IL-2), a sekwencja aminokwasów wspomnianej odmiany polipeptydu jest co najmniej w 90% identyczna z interleukiną-2 (IL-2);

PL 211 866 B1 zasadowy aminokwas, obejmujący co najmniej jeden aminokwas wybrany z grupy obejmującej argininę, lizynę, kwas asparaginowy i kwas glutaminowy w stężeniu od 100 nM do 400 mM;

i środek buforujący wybrany z grupy obejmującej kwas octowy, kwas bursztynowy, kwas cytrynowy, kwas fosforowy, kwas glutaminowy, kwas maleinowy, kwas jabłkowy, kwas winowy, kwas asparaginowy, przy czym środek buforujący stanowi kwas wolny od jego soli, w stężeniu od 40 nM do 250 mM, przy czym wartość pH kompozycji wynosi od 4,0 do 9,0.

Korzystnie kompozycja ma osmolarność od 240 mmol/kg do 360 mmol/kg.

Korzystnie zawiera środek buforujący wybrany z grupy obejmującej kwas octowy, kwas bursztynowy, kwas cytrynowy, kwas fosforowy i kwas glutaminowy.

Korzystniej środkiem buforującym jest kwas bursztynowy.

Korzystnie kompozycja jako aminokwas zasadowy zawiera argininę w formie wolnej zasady w stężeniu od 100 mM do 400 mM, a kwas bursztynowy występuje w kompozycji w zakresie stężeń od 80 mM do 190 mM.

Korzystnie kompozycja zawiera argininę w formie wolnej zasady w stężeniu od 150 mM do 350 mM.

Korzystnie kompozycja zawiera argininę w formie wolnej zasady, w stężeniu 230 mM i kwas bursztynowy w stężeniu 128 mM.

Korzystnie kompozycja jako interleukinę-2 (IL-2) zawiera rekombinowaną ludzką interleukinę-2 (rhIL-2) lub jej odmianę.

Korzystnie kompozycja ma wartość pH od 5,0 do 6,5 oraz osmolarność od 250 mmol/kg do 330 mmol/kg.

Korzystnie kompozycja zawiera polipeptyd lub jego odmianę zawierającą co najmniej jedną resztę metioniny, która ulega utlenieniu w ciekłym preparacie podczas przechowywania.

Korzystnie kompozycja ponadto zawiera metioninę przy czym stosunek molowy metioniny dodanej do reszty metioniny z polipeptydu lub jego wariantu wynosi od 1:1 do 1000:1.

Korzystnie kompozycja ponadto zawiera niejonowy surfaktant w ilości wystarczającej do hamowania agregacji polipeptydu lub jego odmiany w wyniku zamrażania-rozmrażania lub mechanicznego naprężenia ścinającego podczas przechowywania kompozycji.

Korzystnie kompozycja jako niejonowy surfaktant zawiera polisorbat 80.

Korzystnie sekwencja aminokwasów odmiany polipeptydu jest co najmniej w 95% identyczna z ludzką IL-2 i zachowuje aktywność biologiczną IL-2.

Korzystnie polipeptyd stanowi IL-2, lub des-alanylo-1, seryno-125 ludzka interleukina-2.

Korzystnie kompozycja zawiera interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę w stężeniu od 0,02 mg/ml do 1,0 mg/ml.

Korzystnie kompozycja zawiera interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę w stężeniu od 0,03 mg/ml do 0,8 mg/ml.

Korzystnie kompozycja zawiera interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę w stężeniu od 0,03 mg/ml do 0,5 mg/ml.

Przedmiotem wynalazku jest także stabilizowana ciekła kompozycja farmaceutyczna zawierająca interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę w stężeniu od 0,01 mg/ml do 2,0 mg/ml, przy czym odmiana ma sekwencję aminokwasów co najmniej w 90% identyczną z interleukiną-2 (IL-2), argininę w formie wolnej zasady i kwas bursztynowy wolny od jego soli, przy czym arginina w formie wolnej zasady występuje w kompozycji w stężeniu od 150 mM do 350 mM, a kwas bursztynowy w stężeniu od 80 mM do 190 mM, przy czym wartość pH kompozycji wynosi od 4,0 do 9,0.

Korzystnie kompozycja zawiera argininę w formie wolnej zasady w stężeniu 230 mM i kwas bursztynowy w stężeniu 128 mM.

PL 211 886 B1

Przedmiotem wynalazku jest sposób zwiększania trwałości polipeptydu lub jego odmiany w ciekłej kompozycji farmaceutycznej, przy czym polipeptyd lub jego odmiana występuje w stężeniu od 0,01 mg/ml do 2,0 mg/ml i tworzy agregaty w ciekłym preparacie podczas przechowywania, przy czym polipeptyd ten stanowi interleukina-2 (IL-2), a sekwencja aminokwasów odmiany polipeptydu jest co najmniej w 90% identyczna z interleukiną-2 (IL-2), obejmujący wprowadzenie do kompozycji aminokwasu zasadowego oraz środka buforującego przy czym środek buforujący stanowi kwas wolny od jego soli, i przy czym aminokwas zasadowy obejmuje co najmniej jeden aminokwas wybrany z grupy obejmującej argininę, lizynę, kwas asparaginowy i kwas glutaminowy i występuje w stężeniu od 100 mM do 400 m i przy czym środek buforujący jest kwasem wolnym od jego soli występującym w stężeniu od 40 mM do 250 mM, wybranym z grupy obejmującej kwas octowy, kwas bursztynowy, kwas cytrynowy, kwas fosforowy, kwas glutaminowy, kwas maleinowy, kwas jabłkowy, kwas winowy, kwas asparaginowy, przy czym wartość pH kompozycji wynosi od 4,0 do 9,0.

Korzystnie stosuje się kompozycję o osmolarności od 240 mmol/kg do 360 mmol/kg.

Korzystnie stosuje się środek buforujący wybrany z grupy obejmującej kwas octowy, kwas bursztynowy, kwas cytrynowy, kwas fosforowy i kwas glutaminowy.

Korzystnie jako środek buforujący stosuje się kwas bursztynowy.

Korzystnie polipeptyd stanowi IL-2, lub des-alanylo-1, seryno-125 ludzka interleukina-2 i zachowuje aktywność biologiczną IL-2.

Korzystnie zawiera interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę w stężeniu od 0,02 mg/ml do 1,0 mg/ml.

Korzystnie zawiera interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę w stężeniu od 0,03 mg/ml do 0,8 mg/ml.

Korzystnie zawiera interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę w stężeniu od 0,03 mg/ml do 0,5 mg/ml.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób zwiększenia trwałości podczas przechowywania kompozycji farmaceutycznej zawierającej polipeptyd lub jego odmianę w stężeniu od 0,01 mg/ml do 2,0 mg/ml, i polipeptyd lub jego odmiana tworzy agregaty w ciekłym preparacie podczas przechowywania, przy czym polipeptyd ten stanowi interleukina-2 (IL-2), a sekwencja aminokwasów odmiany polipeptydu jest co najmniej w 90% identyczna z interleukiną-2 (IL-2), obejmujący wprowadzenie do kompozycji aminokwasu zasadowego oraz środka buforującego, przy czym środek buforujący stanowi kwas wolny od jego soli, przy czym aminokwas zasadowy zawiera co najmniej jeden aminokwas wybrany z grupy obejmującej argininę, lizynę, kwas asparaginowy i kwas glutaminowy i występuje w stężeniu od 100 mM do 400 m i przy czym środek buforujący jest kwasem wolnym od jego soli występującym w stężeniu od 40 mM do 250 mM, wybranym z grupy obejmującej kwas octowy, kwas bursztynowy, kwas cytrynowy, kwas fosforowy, kwas glutaminowy, kwas maleinowy, kwas jabłkowy, kwas winowy, kwas asparaginowy, a wartość pH kompozycji wynosi od 4,0 do 9,0.

Korzystnie jako środek buforujący stosuje się kwas bursztynowy.

Przedmiotem wynalazku jest także sucha postać kompozycji określonej powyżej wybrana z grupy obejmującej postać liofilizowaną i postać suszoną rozpyłowo.

Przedmiotem wynalazku jest także preparat do diagnozowania, zapobiegania lub leczenia chorób wrażliwych na leczenie interleukiną-2 (IL-2), który zawiera kompozycję farmaceutyczną określoną powyżej, przy czym polipeptyd stanowi IL-2, lub des-alanylo-1, seryno-125 ludzka interleukina-2.

PL 211 866 B1

A zatem celem wynalazku było uzyskanie kompozycji zawierających jako składnik terapeutycznie aktywny polipeptyd interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę i sposoby przydatne do wytwarzania tych kompozycji. Kompozycjami tymi są stabilizowane ciekłe kompozycje farmaceutyczne zawierające polipeptyd, którego skuteczność jako terapeutycznie aktywnego składnika normalnie spada podczas przechowywania w ciekłych preparatach na skutek agregacji polipeptydu. Stabilizowane ciekłe kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają oprócz polipeptydu, który podczas przechowywania w ciekłym preparacie tworzy agregaty, pewną ilość zasadowego aminokwasu wystarczającą do zmniejszenia powstawania agregatów polipeptydu podczas jego przechowywania, przy czym zasadowym aminokwasem jest aminokwas lub kombinacja aminokwasów, w której każdy aminokwas występuje w postaci wolnej zasady lub jej soli. Kompozycje zawierają ponadto środek buforujący, utrzymujący pH ciekłej kompozycji w zakresie trwałości polipeptydu, przy czym środkiem buforującym jest kwas w zasadzie nie zawierający jego soli, kwas w formie soli lub mieszanina kwasu i jego soli.

Aminokwas zasadowy [ang. amino acid base] służy do stabilizowania polipeptydu, zapobiegając powstawaniu agregatów podczas przechowywania ciekłej kompozycji farmaceutycznej, podczas gdy zastosowanie kwasu zasadniczo nie zawierającego jego soli, kwasu w formie soli lub mieszaniny kwasu i jego soli jako środka buforującego daje w rezultacie ciekłą kompozycję o osmolarności bliskiej roztworowi izotonicznemu. Ciekła kompozycja farmaceutyczna może dodatkowo zawierać inne środki stabilizujące, a dokładniej metioninę, niejonowy surfaktant taki jak polisorbat 80 i EDTA, służące dalszemu zwiększeniu trwałości polipeptydu. Takie ciekłe kompozycje farmaceutyczne są stabilne, jako że dodanie zasadowego aminokwasu w połączeniu z kwasem nie zawierającym jego soli, kwasem w formie soli lub mieszaniną kwasu i jego soli daje w rezultacie kompozycje o zwiększonej trwałości podczas przechowywania w stosunku do ciekłych kompozycji farmaceutycznych skomponowanych bez dodatku tych dwóch składników w kombinacji.

Przedmiotem wynalazku są również sposoby zwiększania trwałości polipeptydu w ciekłej kompozycji farmaceutycznej i zwiększenia trwałości podczas przechowywania tej kompozycji farmaceutycznej. Sposoby te obejmują wprowadzenie do ciekłej kompozycji farmaceutycznej zasadowego aminokwasu w ilości wystarczającej do zmniejszenia powstawania agregatów polipeptydu podczas przechowywania tej kompozycji, i środka buforującego, którym jest kwas w zasadzie nie zawierający jego soli, kwas w formie soli lub mieszanina kwasu i jego soli. Sposoby te znajdują zastosowanie w wytwarzaniu ciekłych kompozycji farmaceutycznych według wynalazku.

Fig. 1 przedstawia zawartość procentową wolnej rozpuszczonej IL-2 w próbkach trwałościowych przechowywanych w temperaturze 40°C zanalizowaną metodą RP-HPLC. Preparaty zawierają 0,2 mg/ml IL-2, 10 mM roztwór bursztynianu sodu o wartości pH 6 i 270 mM sorbitolu lub sacharozy lub mannitolu.

Fig. 2 przedstawia zawartość procentową wolnej rozpuszczonej IL-2 w próbkach trwałościowych przechowywanych w temperaturze 50°C zanalizowaną metodą RP-HPLC. Preparaty zawierają 0,1 mg/ml IL-2, 10 mM roztwór bursztynianu sodu o wartości pH 6 i 150 mM różnych aminokwasów, jak to przedstawiono na Fig.

Fig. 3 przedstawia zawartość procentową wolnej rozpuszczonej IL-2 w próbkach trwałościowych przechowywanych w temperaturze 40°C zanalizowaną metodą RP-HPLC. Preparaty zawierają 0,2 mg/ml IL-2, 10 mM roztwór bursztynianu sodu o wartości pH 6 i 50, 100 lub 270 mM sorbitolu.

Fig. 4 przedstawia zawartość procentową wolnej rozpuszczonej IL-2 w próbkach trwałościowych przechowywanych w temperaturze 50°C zanalizowaną metodą RP-HPLC. Preparaty zawierają 0,2 mg/ml IL-2, 10 mM bursztynianu sodu o wartości pH 6 i 50, 100 lub 150 mM argininy.

Fig. 5 przedstawia okres półtrwania (t¹/? w dniach) pozostałej rozpuszczonej IL-2 zanalizowany metodą RP-HPLC, w funkcji pH w temperaturze 50°C. Preparaty zawierają 0,2 mg/ml IL-2, 10 mM roztwór buforu (glicyna, octan sodu, cytrynian sodu, bursztynian sodu, fosforan sodu, boran sodu) i 150 mM NaCl, 270 mM sorbitolu lub 150 mM argininy.

Fig. 6 przedstawia wykres Ln-Ln okresu półtrwania ^½) w zależności od początkowego stężenia białka dla próbek trwałościowych przechowywanych w temperaturze 50°C. Preparaty zawierają 0,1, 0,2 lub 0,5 mg/ml IL-2 w 10 mM roztworze bursztynianu sodu o wartości pH 6 i 150 mM L-argininy.

Fig. 7 przedstawia zawartość procentową wolnej rozpuszczonej IL-2 zanalizowaną metodą RP-HPLC w próbkach, względem których zastosowano 1, 3 i 5 cykli zamrażania-rozmrażania od temperatury -70°C do temperatury otoczenia. Preparaty zawierają 0,2 mg/ml IL-2, 10 mM roztwór bursztynianu sodu o wartości pH 6, 150 mM argininy i 0 do 0,1% polisorbatu 80.

PL 211 886 B1

Fig. 8 przedstawia zawartość procentową wolnej rozpuszczonej IL-2 zanalizowaną metodą RP-HPLC w próbkach transportowanych na lodzie z Emeryville w Kalifornii do St. Louis w Missouri i z powrotem. Zastosowano dwa preparaty zawierające różne ilości polisorbatu 80: preparat argininowy, zawierający 0,2 mg/ml IL-2 w 10 mM roztworze bursztynianu sodu o wartości pH 6 i 150 mM argininy; i preparat NaCl, zawierający 0,2 mg/ml IL-2 w 10 mM roztworze cytrynianu sodu o wartości pH 6,5 i 200 mM NaCl.

Fig. 9 przedstawia okres półtrwania (t% w dniach) wolnego rozpuszczonego TFPI w czterech preparatach zanalizowany metodą IEX-HPLC w funkcji stężenia argininy w temperaturze 50°C. Wszystkie preparaty zawierają 0,15 mg/ml TFPI i jako aminokwas zasadowy L-argininę lub chlorowodorek L-argininy i są buforowane do wartości pH 5,5 kwasem cytrynowym lub 10 mM roztworem kwasu cytrynowego i cytrynianu sodu. Specyficzne preparaty TFPI zawierają: (a) 20-150 mM chlorowodorku L-argininy, jako bufor 10 mM roztwór kwasu cytrynowego i cytrynianu sodu; (b) 20-150 mM zasadowej L-argininy zmiareczkowanej kwasem cytrynowym; (c) 100-300 mM chlorowodorku L-argininy, 10 mM roztwór kwasu cytrynowego i cytrynianu sodu jako bufor; (d) 100-300 mM zasadowej L-argininy zmiareczkowanej kwasem cytrynowym.

Fig. 10 przedstawia okres półtrwania (t% w dniach) wolnego rozpuszczonego TFPI w czterech preparatach zanalizowany metodą IEX-HPLC w funkcji stężenia argininy w temperaturze 50°C. Wszystkie preparaty zawierają 0,15 mg/ml TFPI i zasadową L-argininę lub chlorowodorek L-argininy i są buforowane do wartości pH 5,5 kwasem bursztynowym lub 10 mM roztworem kwasu bursztynowego i bursztynianu sodu. Specyficzne preparaty TFPI zawierają: (a) 20-150 mM chlorowodorku L-argininy, 10 mM roztwór kwasu bursztynowego i bursztynian sodu jako bufor; (b) 20-150 mM zasadowej L-argininy zmiareczkowanej kwasem bursztynowym; (c) 100-300 mM chlorowodorku L-argininy, 10 mM roztwór kwasu bursztynowego i bursztynianu sodu jako bufor; i (d) 100-300 mM zasadowej L-argininy miareczkowanego kwasem bursztynowym.

Fig. 11 przedstawia okres półtrwania (t% w dniach) wolnego rozpuszczonego TFPI w czterech preparatach zanalizowanych metodą IEX-HPLC w funkcji stężenia argininy w temperaturze 50°C. Wszystkie preparaty zawierają 0,15 mg/ml TFPI i zasadową L-argininę zmiareczkowaną do wartości pH 5,5 kwasem bursztynowym lub kwasem cytrynowym. Specyficzne preparaty TFPI zawierają: (a) 20-150 mM zasadowej L-argininy zmiareczkowanej kwasem cytrynowym; (b) 20-150 mM zasadowej L-argininy zmiareczkowanej kwasem bursztynowym; (c) 100-300 mM zasadowej L-argininy zmiareczkowanej kwasem cytrynowym; (d) 100-300 mM zasadowej L-argininy zmiareczkowanej kwasem bursztynowym.

Przedmiotem wynalazku są ciekłe kompozycje farmaceutyczne zawierające jako terapeutycznie aktywny składnik polipeptyd interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę oraz sposoby przydatne do wytwarzania tych kompozycji. W niniejszym wynalazku, termin „ciekły w odniesieniu do kompozycji lub preparatów farmaceutycznych odpowiada terminowi „wodny. Stosowany tu termin „polipeptyd obejmuje występujące naturalnie (natywne), syntetyczne i rekombinowane polipeptydy i białka, oraz ich biologicznie aktywne odmiany omówione dokładniej w dalszej części opisu. Termin „terapeutycznie aktywny składnik obejmuje polipeptyd specyficznie wprowadzony do kompozycji w celu wywołania pożądanej odpowiedzi terapeutycznej w leczeniu, zapobieganiu lub diagnozowaniu choroby lub stanu, w którym tę kompozycję farmaceutyczną podaje się pacjentowi.

Dokładniej, kompozycjami według wynalazku są stabilizowane ciekłe kompozycje farmaceutyczne, których terapeutycznie aktywne składniki obejmują polipeptyd, zazwyczaj tworzący agregaty w ciekłych farmaceutycznych preparatach podczas przechowywania. Termin „tworzenie agregatów oznacza zamierzone fizyczne oddziaływanie pomiędzy cząsteczkami polipeptydu, dzięki któremu powstają oligomery, które mogą pozostać rozpuszczone lub tworzyć duży widoczny agregat wytrącający się z roztworu. Termin „przechowywane oznacza, że wstępnie przygotowanej ciekłej kompozycji farmaceutycznej lub preparatu nie podaje się pacjentowi natychmiast. Zazwyczaj po przygotowaniu umieszcza się je w opakowaniach do przechowywania w postaci ciekłej, zamrożonej lub w postaci suchej do późniejszego odtworzenia do postaci ciekłej lub innej odpowiedniej do podawania pacjentowi. Termin „postać sucha oznacza ciekłą kompozycję farmaceutyczną lub preparat osuszone metodą liofilizacji (patrz np. Williams i Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 35:48-59), suszenia rozpyłowego (patrz Masters (1991) według Spray-Drying Handbook (wydanie 5-te; Longman Scientific i Technical, Essez, U.K.), str. 491-676; Broadhead i in. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; i Mumenthaler i in. (1994) Pharm. Res. 77:12-20) lub suszenia powietrzem (Carpenter i Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; i Roser (1991) Biopharm. 4:47-53). Powstawanie agregatów polipeptydoPL 211 866 B1 wych podczas przechowywania ciekłej kompozycji farmaceutycznej może szkodliwie wpływać na aktywność biologiczną tego polipeptydu, prowadząc w efekcie do utraty działania terapeutycznego kompozycji farmaceutycznej. Ponadto powstawanie agregatów może powodować inne problemy, jak zatykanie przewodów, membran lub pomp, jeśli kompozycję farmaceutyczną zawierającą polipeptyd podaje się jako wlew.

Stabilizowane ciekłe kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają zasadowy aminokwas w ilości wystarczającej do zmniejszenia powstawania agregatów polipeptydu podczas przechowywania kompozycji. Termin „zasadowy aminokwas oznacza aminokwas lub kombinację aminokwasów, w której dowolny aminokwas występuje w postaci wolnej zasady lub w jej soli. Tam gdzie stosuje się kombinację aminokwasów, wszystkie aminokwasy mogą występować, jako wolne zasady, wszystkie mogą występować w formie soli lub niektóre mogą występować jako wolne zasady, a inne w formie soli. Korzystnymi aminokwasami do przygotowania kompozycji według wynalazku są te, które zawierają naładowany łańcuch boczny, takie jak arginina, lizyna, kwas asparaginowy i kwas glutaminowy. W kompozycjach farmaceutycznych może występować dowolny stereoizomer (tj. izomer L, D lub DL) poszczególnych aminokwasów lub kombinacje tych stereoizomerów, jeśli tylko poszczególne aminokwasy występują jako wolne zasady lub w formie soli. Korzystny do zastosowania jest stereoizomer L. Kompozycje można także skomponować z analogami tych korzystnych aminokwasów. Termin „analog aminokwasu oznacza pochodną naturalnie występującego aminokwasu, która wywołuje pożądany efekt w postaci zmniejszenia powstawania agregatów polipeptydu podczas przechowywania ciekłych kompozycji farmaceutycznych. Odpowiednie analogi argininy obejmują np. aminoguanidynę i N-monoetylo-L-argininę. Tak jak korzystne aminokwasy, analogi aminokwasu wprowadzane są do kompozycji jako wolne zasady lub w formie soli.

Stabilizowane ciekłe kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają, w połączeniu ze zdefiniowanym powyżej zasadowym aminokwasem, kwas w zasadzie nie zawierający jego soli, w celu utrzymania wartości pH roztworu. Korzystnie, wartość pH utrzymuje się z zastosowaniem aminokwasu zasadowego w połączeniu z kwasem nie zawierającym jego soli. Taka kombinacja zapewnia niższą osmolarność roztworu niż zastosowanie kwasu i jego soli jako buforu w połączeniu z zasadowym aminokwasem w celu uzyskania stabilnej kompozycji farmaceutycznej. Zaletą takiej kombinacji jest to, że można wprowadzić do kompozycji farmaceutycznej więcej stabilizatora, zasadowego aminokwasu, bez utraty izotoniczności roztworu. Termin „kwas w zasadzie nie zawierający jego soli oznacza, że kwas służący jako środek buforujący w ciekłej kompozycji farmaceutycznej występuje sam bez żadnej z jego soli. Zazwyczaj gdy stosuje się bufor zawierający kwas w ciekłej kompozycji farmaceutycznej, to przygotowuje się go przy użyciu soli tego kwasu lub też stanowi kombinację kwasu i soli tego kwasu. Dlatego też bufor wytwarza się np. stosując kwas z jego przeciwjonem, takim jak sód, potas, jon amoniowy, wapń lub magnez. Zatem, bufor bursztynianowy składa się na ogół z soli kwasu bursztynowego, takiej jak bursztynian sodu lub mieszaniny kwasu bursztynowego i bursztynianu sodu. Chociaż kwas użyty jako środek buforujący w celu stabilizowania ciekłych kompozycji farmaceutycznych może być w formie soli kwasu lub mieszaniny kwasu i jego soli, korzystnie według wynalazku kwas służący jako środek buforujący występuje wyłącznie w formie kwasu.

Kwasy odpowiednie do zastosowania w komponowaniu stabilizowanych ciekłych kompozycji zawierających polipeptyd według niniejszego wynalazku obejmują, lecz nie ograniczają się do nich, kwas bursztynowy, kwas cytrynowy, kwas fosforowy, kwas glutaminowy, kwas maleinowy, kwas jabłkowy, kwas octowy, kwas winowy i kwas asparaginowy, korzystniej kwas bursztynowy i kwas cytrynowy, a najkorzystniej kwas bursztynowy.

Ciekłe kompozycje farmaceutyczne zawierające polipeptyd według wynalazku są „stabilizowane. Termin „stabilizowane oznacza ciekłe kompozycje o zwiększonej trwałości podczas przechowywania w stosunku do kompozycji wytworzonych bez ujawnionej w niniejszym wynalazku kombinacji zasadowego aminokwasu i środka buforującego. Tę zwiększoną trwałość podczas przechowywania obserwuje się w preparacie ciekłym, przechowywanym bezpośrednio w postaci do późniejszego zastosowania, przechowywanym w postaci zamrożonej i rozmrażanej przed użyciem, lub w postaci suchej, liofilizowanej, osuszonej powietrzem lub osuszonej rozpyłowo, a później odtwarzanej przed użyciem w ciekłą lub inną postać. Korzystnie, kompozycje według wynalazku przechowuje się bezpośrednio w postaci ciekłej, tak aby w pełni korzystać ze zwiększonej trwałości podczas przechowywania postaci ciekłej, łatwości podawania bez odtwarzania i możliwości podawania preparatu we wcześniej napełnionych, gotowych do użytku strzykawkach lub w formie preparatów do wielokrotnego podawania, jeśli preparat jest kompatybilny ze środkami bakteriostatycznymi.

PL 211 886 B1

Stabilizacja kompozycji opiera się na stwierdzeniu, że dodanie argininy, lizyny, kwasu asparaginowego lub kwasu glutaminowego w formie wolnej zasady lub w formie soli w połączeniu z kwasem nie zawierającym jego soli, kwasem w formie soli lub mieszaniną kwasu i jego soli daje w rezultacie ciekłą kompozycję farmaceutyczną zawierającą polipeptyd o zwiększonej trwałości podczas przechowywania w porównaniu do ciekłej kompozycji farmaceutycznej zawierającej polipeptyd przygotowanej bez użycia kombinacji tych dwóch składników. Zwiększenie trwałości podczas przechowywania kompozycji uzyskuje się dzięki wpływowi aminokwasu na trwałość terapeutycznie aktywnego polipeptydu, a dokładniej dzięki jego działaniu na agregację polipeptydu w ciekłych preparatach podczas przechowywania. Ponadto, wprowadzenie zdefiniowanego powyżej zasadowego aminokwasu i kwasu nie zawierającego jego soli do ciekłych preparatów zawierających polipeptyd daje w rezultacie ciekłe kompozycje farmaceutyczne prawie izotoniczne, bez konieczności dodawania innych środków izotonizujących, takich jak chlorek sodu. Termin „prawie izotoniczna oznacza ciekłą kompozycję o osmolarności od 240 mmol/kg do 360 mmol/kg, korzystnie od 240 do 340 mmol/kg, korzystniej od 250 do 330 mmol/kg, nawet korzystniej od 260 do 320 mmol/kg, a najkorzystniej od 270 do 310 mmol/kg.

Aminokwas zasadowy wprowadzony do stabilizowanych ciekłych kompozycji farmaceutycznych według wynalazku zabezpiecza terapeutycznie aktywny polipeptyd przed agregacją, tym samym zwiększa trwałość polipeptydu podczas przechowywania kompozycji. Termin „zwiększenie trwałości oznacza, że powstawanie agregatów polipeptydu podczas przechowywania ciekłej kompozycji farmaceutycznej jest mniejsze w porównaniu z powstawaniem agregatów polipeptydu podczas przechowywania bez zastosowania tego szczególnego środka stabilizującego. Zmniejszenie powstawania agregatów poprzez dodanie zasadowego aminokwasu jest zależne od stężenia. Oznacza to, że zwiększenie stężenia zasadowego aminokwasu prowadzi do zwiększonej trwałości polipeptydu w ciekłej kompozycji farmaceutycznej, gdy polipeptyd ten tworzy normalnie agregaty podczas jego przechowywania w ciekłym preparacie bez dodania zasadowego aminokwasu. Określanie ilości konkretnego zasadowego aminokwasu, którą należy dodać do ciekłej kompozycji farmaceutycznej w celu zmniejszenia powstawania agregatów, a tym samym zwiększenia trwałości polipeptydu i zwiększenia trwałości przechowywanej kompozycji, można łatwo przeprowadzić dla dowolnego polipeptydu bez zbędnych doświadczeń, stosując metody ogólnie znane fachowcom w tej dziedzinie.

Z tego powodu wpływ poszczególnego zasadowego aminokwasu na agregację polipeptydu w ciekłej kompozycji podczas przechowywania można łatwo określić, mierząc zmianę rozpuszczalności polipeptydu w roztworze w czasie. Ilość rozpuszczonego polipeptydu w roztworze można określić ilościowo na drodze testów analitycznych służących do wykrywania żądanych polipeptydów. Takie testy obejmują np. (RP)-HPLC w odwróconym układzie faz, HPLC z wykluczaniem w oparciu o wymiar (SEC)-HPLC i absorbancję UV, opisane w podanych poniżej przykładach. Tam gdzie dany polipeptyd podczas przechowywania w ciekłych preparatach tworzy zarówno agregaty rozpuszczone jak i nierozpuszczone można stosować kombinację metod RP-HPLC i SEC-HPLC w celu rozróżnienia rozpuszczonego polipeptydu występującego w postaci rozpuszczalnych agregatów i biologicznie aktywnej postaci nie tworzącej agregatów, jak to opisano poniżej w Przykładzie 1.

W przypadku agregacji, za efektywną ilość zasadowego aminokwasu do wprowadzenia do ciekłej kompozycji farmaceutycznej zawierającej polipeptyd i uzyskania stabilnej kompozycji farmaceutycznej według wynalazku uznano taką ilość, która daje w rezultacie zmniejszone powstawanie agregatów w czasie i przez to zatrzymanie w roztworze większej ilości rozpuszczonego polipeptydu w jego biologicznie aktywnej niezagregowanej postaci. Dlatego też tam gdzie polipeptydem jest białko monomeryczne, takie jak interleukina-2 (IL-2) lub porównawczo inhibitor szlaku przemiany czynnika tkankowego (TFPI) opisane w przykładach poniżej, efektywną ilością środka stabilizującego do zastosowania podczas przygotowania stabilizowanej kompozycji według wynalazku jest taka ilość, która dawałaby w rezultacie większe zatrzymanie IL-2 lub porównawczo TFPI w ich formie monomerycznej.

Zwiększona trwałość podczas przechowywania stabilizowanych ciekłych kompozycji zawierających polipeptyd według wynalazku może także być związana z hamującym efektem działania zasadowego aminokwasu na deamidację reszty glutaminowej i/lub asparaginowej terapeutycznie aktywnego polipeptydu podczas jego przechowywania. Wpływ poszczególnego zasadowego aminokwasu na deamidację tych reszt podczas przechowywania w ciekłej kompozycji można łatwo określić przez obserwowanie zmian ilości polipeptydu w jego formie deamidowanej w czasie. Sposoby pomiarów cząsteczek natywnych lub zdeamidowanych konkretnego polipeptydu w roztworze są ogólnie znane w tej dziedzinie. Sposoby te obejmują rozdzielanie chromatograficzne różnych rodzajów cząsteczek i ich

PL 211 866 B1 identyfikację przy zastosowaniu standardów masy cząsteczkowej polipeptydu, tak jak w przypadku RP-HPLC opisanym poniżej.

Zastosowanie nowej kombinacji zasadowego aminokwasu buforowanego kwasem nie zawierającym jego soli w celu zwiększenia trwałości polipeptydu w stabilizowanych ciekłych kompozycjach farmaceutycznych według niniejszego wynalazku, jest korzystne np. przy zastosowaniu aminokwasu w układzie buforowym kwas bursztynowy/bursztynian sodu. Ta nowa kombinacja umożliwia otrzymywanie prawie izotonicznych preparatów o większym stężeniu stabilizującego aminokwasu niż przy zastosowaniu układu buforowego, tj. mieszaniny kwasu i jego soli. Większe stężenie aminokwasu stabilizującego umożliwia uzyskanie nawet dodatkowego zwiększenia trwałości polipeptydu i przez to zwiększonej trwałości podczas przechowywania preparatu.

Przykładowo, gdy do zbuforowania zasadowej argininy dodanej do ciekłego preparatu zawierającego interleukinę-2 (IL-2), o wartości pH optymalnej dla tego białka (pH 5,8), zastosuje się kwas bursztynowy, to stężenie argininy można zwiększyć do 230 mM, wciąż zachowując izotoniczność preparatu. Dzięki temu można wydłużyć dwukrotnie dopuszczalny okres przechowywania IL-2 w temperaturze 50°C, co jest miarą trwałości białka.

Chociaż podobny dopuszczalny okres przechowywania IL-2 można osiągnąć stosując takie samo stężenie argininy i kwas bursztynowy/bursztynian sodu jako środka buforującego, to aby osiągnąć podobną wartość pH argininę należy dodawać w formie kwasowej, co powoduje, że uzyskany preparat jest hipertoniczny (patrz Przykład 1, Tablica 1).

Podobnie, gdy do buforowania zasadowej argininy dodanej do porównawczego ciekłego preparatu zawierającego białko inhibitora szlaku przemiany czynnika tkankowego (TFPI) i o wartości pH odpowiedniej dla tego białka (pH 5,5) zastosuje się kwas cytrynowy, to stężenie argininy można zwiększyć do 300 mM, wciąż zachowując izotoniczność preparatu. Daje to w rezultacie prawie 50% wzrost dopuszczalnego okresu przechowywania TFPI w temperaturze 50°C. Chociaż podobny dopuszczalny okres przechowywania TFPI można osiągnąć stosując takie samo stężenie argininy i kwasu cytrynowego/cytrynianu sodu jako środka buforującego, to arginina należy ponownie dodać w formie kwasowej, co powoduje, że uzyskany preparat jest hipertoniczny (patrz Przykład 8, Tablica 18). Możliwość zastosowania większego stężenia aminokwasu jako głównego środka stabilizującego eliminuje potrzebę stosowania bardziej tradycyjnych stabilizatorów polipeptydowych, takich jak albumina surowicy bydlęcej lub albumina surowicy ludzkiej, które są mniej pożądanymi środkami stabilizującymi ze względu na ich potencjalne skażenia wirusami.

Ponadto pożądane jest aby ciekłe kompozycje farmaceutyczne były izotoniczne, gdyż powoduje to mniejszy ból po podaniu i minimalizuje potencjalne efekty hemolityczne związane z kompozycjami hipertonicznymi lub hipotonicznymi. Dlatego też stabilizowane kompozycje według wynalazku nie tylko mają zwiększoną trwałość podczas przechowywania, lecz także dodatkowo znacznie zmniejszają ból występujący po podaniu w porównaniu z preparatami z innymi, bardziej tradycyjnymi układami buforowymi składającymi się z kwasu i soli kwasu. Przykładowo, w jednym rozwiązaniu według wynalazku, stabilizowana ciekła kompozycja farmaceutyczna do wstrzykiwania zmniejsza palący i kłujący ból wywołany iniekcją normalnej solanki (patrz Przykład 7).

Uwzględniając korzyści wypływające z komponowania ciekłych kompozycji polipeptydowych według wynalazku z zasadowym aminokwasem jako głównym środkiem stabilizującym i kwasem nie zawierającym jego soli jako środkiem buforującym można określić, bez zbędnych doświadczeń, korzystne stężenia każdego składnika wprowadzanego do ciekłej kompozycji farmaceutycznej zawierającej pożądany, terapeutycznie aktywny polipeptyd, tworzący agregaty, w celu zwiększenia trwałości polipeptydu podczas przechowywania tej kompozycji. Postępując zgodnie z ujawnionymi procedurami, np. według poniższego Przykładu 1, można określić zakres pożądanych stężeń zasadowego aminokwasu i różnych kwasów buforujących zastosowanych w opisanych tu ciekłych kompozycjach farmaceutycznych. Korzystnie ilość zasadowego aminokwasu wprowadzonego do kompozycji mieści się w zakresie stężeń od 100 mM do 400 mM, korzystnie od 130 mM do 375 mM, korzystniej od 150 mM do 350 mM, nawet korzystniej od 175 mM do 325 mM, jeszcze korzystniej od 180 mM do 300 mM, nawet korzystniej od 190 mM do 280 mM, a najkorzystniej od 200 mM do 260 mM, zależnie od rodzaju białka w kompozycji. Chociaż środkiem buforującym może być kwas w formie soli lub mieszanina kwasu i jego soli, korzystnie dla ujawnionych tu korzyści środkiem buforującym jest kwas w zasadzie nie zawierający jego soli. Korzystnie kwas zastosowany jako środek buforujący dodaje się w zakresie stężeń od 40 mM do 250 mM, od 50 mM do 240 mM, od 60 mM do 230 mM, od 70 mM do 220 mM, korzystniej 80 mM do 210 mM, a najkorzystniej od 90 mM do 200 mM, zależnie od rodzaju kwasu

PL 211 886 B1 zastosowanego jako środek buforujący i optymalnej wartości pH dla polipeptydu stabilizowanego przed tworzeniem agregatów.

W jednym rozwiązaniu według wynalazku, zasadowym aminokwasem jest zasadowa arginina obecna w stężeniu od 230 mM i środkiem buforującym jest kwas bursztynowy w stężeniu 128 mM. Umożliwia to otrzymywanie ciekłej kompozycji farmaceutycznej zawierającej polipeptyd o osmolarności bliskiej roztworowi izotonicznemu i wartości pH 5,8. W innym rozwiązaniu, zasadowym aminokwasem jest zasadowa arginina obecna w stężeniu od 300 mM i środkiem buforującym jest kwas cytrynowy w stężeniu 120 mM. Umożliwia to otrzymywanie ciekłej kompozycji farmaceutycznej zawierającej polipeptyd, o osmolarności bliskiej roztworowi izotonicznemu i wartości pH 5,5. W jeszcze innym rozwiązaniu, zasadowym aminokwasem jest zasadowa arginina obecna w stężeniu od 200 mM do 300 mM i środkiem buforującym jest kwas bursztynowy w stężeniu od 120 mM do 180 mM. Umożliwia to otrzymywanie ciekłej kompozycji farmaceutycznej zawierającej polipeptyd o osmolarności od 256 mmol/kg do 363 mmol/kg i wartości pH 5,5.

Dlatego też, w innym rozwiązaniu według wynalazku, stabilizowana ciekła kompozycja farmaceutyczna zawiera jako polipeptyd IL-2 lub jej odmianę, zasadową argininę w stężeniu od 150 mM do 350 mM i kwas bursztynowy w stężeniu od 80 mM do 190 mM. W korzystnym rozwiązaniu, w ciekłej kompozycji farmaceutycznej zawierającej IL-2, zasadowa arginina występuje w stężeniu 230 mM, a kwas bursztynowy w stężeniu 128 mM. Ta korzystna kompozycja zawierająca IL-2 ma wartość pH 5,8 i osmolarność od 250 mmol/kg do 330 mmol/kg. Stężenie IL-2 lub jej odmiany w tych kompozycjach wynosi od 0,01 mg/ml do 2,0 mg/ml, korzystnie od 0,02 mg/ml do 1,0 mg/ml, korzystniej od 0,03 mg/ml do 0,8 mg/ml, a najkorzystniej od 0,03 mg/ml do 0,5 mg/ml.

W innym rozwiązaniu porównawczym, stabilizowana ciekła kompozycja farmaceutyczna zawiera jako polipeptyd TFPI lub jego odmianę, zasadową argininę w stężeniu od 100 mM do 400 mM i kwas bursztynowy w stężeniu od 80 mM do 190 mM. W kolejnym rozwiązaniu porównawczym w ciekłej kompozycji farmaceutycznej zawierającej TFPI zasadowa arginina występuje w stężeniu od 200 mM do 300 mM, a kwas bursztynowy w stężeniu od 120 mM do 180 mM. Taka porównawcza kompozycja zawierająca TFPI ma wartości pH 5,5 i osmolarność od 240 mmol/kg do 360 mmol/kg. Stężenie TFPI lub jego odmiany w tych kompozycjach porównawczych wynosi od 0,01 mg/ml do 5,0 mg/ml, korzystnie od 0,05 mg/ml do 2,0 mg/ml, korzystniej od 0,10 mg/ml do 1,0 mg/ml, a najkorzystniej od 0,10 mg/ml do 0,60 mg/ml.

W innym rozwiązaniu porównawczym, stabilizowana ciekła kompozycja farmaceutyczna zawiera jako polipeptyd TFPI lub jego odmianę, zasadową argininę w stężeniu od 175 mM do 400 i kwas cytrynowy w stężeniu od 40 mM do 200 mM. W innym rozwiązaniu porównawczym, zasadowa arginina w ciekłej kompozycji farmaceutycznej zawierającej TFPI występuje w stężeniu od 250 mM do 350 mM, a kwas cytrynowy w stężeniu od 100 mM do 150 mM. Ta korzystna kompozycja zawierająca TFPI ma wartość pH 5,0-6,5 i osmolarność od 240 mmol/kg do 360 mmol/kg. W jeszcze innym rozwiązaniu porównawczym, zasadowa arginina występuje w stężeniu 300 mM, a kwas cytrynowy w stężeniu 120 mM. Porównawcza kompozycja zawierająca TFPI ma wartość pH 5,5 i osmolarność od 240 mmol/kg do 360 mmol/kg. Stężenie TFPI lub jego odmiany w tych kompozycjach wynosi od 0,01 mg/ml do 5,0 mg/ml, korzystnie od 0,05 mg/ml do 2,0 mg/ml, korzystniej od 0,10 mg/ml do 1,0 mg/ml, a najkorzystniej od 0,10 mg/ml do 0,60 mg/ml.

Jak pokazano w przykładach poniżej, wartość pH ciekłego preparatu farmaceutycznego zawierającego polipeptyd wpływa na trwałość zawartego w nim polipeptydu, zasadniczo poprzez wpływ na tworzenie agregatów polipeptydu. Dlatego też, ilość kwasu buforującego występującego w kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku będzie się zmieniać zależnie od wartości pH optymalnego dla trwałości poszczególnego polipeptydu. Tę optymalną wartość pH można określić stosując metody ogólnie znane w tej dziedzinie i opisane w przedstawionych tu przykładach. Korzystne zakresy wartości pH dla kompozycji według wynalazku wynoszą od pH 4,0 do pH 9,0, dokładniej od 5,0 do 6,5, zależnie od polipeptydu. Dlatego też w jednym rozwiązaniu według wynalazku, pH wynosi 5,8, (polipeptydem jest IL-2 lub jej odmiana). W innym rozwiązaniu porównawczym, wartość pH wynosi 5,5, zwłaszcza gdy polipeptydem jest TFPI lub jego odmiana.

Stabilizowane kompozycje farmaceutyczne zawierające aminokwas zasadowy buforowany kwasem nie zawierającym jego soli, może także zawierać dodatkowe środki stabilizujące, które dodatkowo zwiększają trwałość terapeutycznie aktywnego polipeptydu. Poszczególne środki stabilizujące według niniejszego wynalazku obejmują między innymi metioninę i EDTA, które zabezpieczają poliPL 211 866 B1 peptyd przed utlenianiem metioniny; i niejonowy surfaktant, który zabezpiecza polipeptyd przed agregacją związaną z zamrażaniem-rozmrażaniem lub mechanicznym naprężeniem ścinającym.

W ten sposób metioninę można dodawać do sulfotlenku metioniny w celu hamowania utleniania reszt metioniny, gdy polipeptydem działającym jako środek terapeutyczny jest polipeptyd zawierający co najmniej jedną resztę metioniny wrażliwą na takie utlenianie. Termin „hamuje oznacza minimalne nagromadzenie utlenionych odmian metioniny w określonym czasie. Hamowanie utleniania metioniny daje w rezultacie większe zatrzymanie polipeptydu w jego właściwej formie cząsteczkowej. Można stosować dowolny stereoizomer metioniny (izomer L, D lub DL) lub ich kombinacje. Dodana ilość powinna być wystarczająca do hamowania utleniania reszt metioniny tak, aby ilość sulfotlenku metioniny mieściła się w normach instytucji ustawodawczych. Zazwyczaj oznacza to, że kompozycja zawiera nie więcej niż od 10% do 30% sulfotlenku metioniny. Można to osiągnąć przez dodanie metioniny w stosunku do reszt metioniny mieszczącym się w zakresie od 1:1 do 1000:1, a najkorzystniej od 10:1 do 100:1.

Korzystną ilość metioniny można łatwo określić empirycznie, przygotowując kompozycję zawierającą konkretny polipeptyd z różnymi stężeniami metioniny i określając jej względny wpływ na tworzenie utlenionych odmian polipeptydu, stosując np. chromatograficzne rozdzielanie odmian cząsteczek i identyfikację przy zastosowaniu standardów masy cząsteczkowej polipeptydu, tak jak w RPHPLC, jak to opisano w poniższym Przykładzie 2. Stężenie metioniny, przy którym występuje największe hamowanie utleniania reszt metioniny, bez szkodliwego wpływu na wywołane przez aminokwas hamowanie agregacji polipeptydu, odpowiada ilości metioniny, którą należy dodać do kompozycji w celu zwiększenia trwałości polipeptydu.

Degradacja polipeptydu wywołana zamrażaniem-rozmrażaniem lub mechanicznym naprężeniem ścinającym podczas obróbki ciekłej kompozycji według niniejszego wynalazku można hamować przez wprowadzenie do ciekłych kompozycji zawierających polipeptyd według wynalazku surfaktantów, a ma to na celu obniżenie napięcia powierzchniowego roztwór-powietrze. Typowymi stosowanymi surfaktantami są surfaktanty niejonowe, obejmujące polietoksylowane estry sorbitolu takie jak polisorbat 80 (Tween 80) i polisorbat 20 (Tween 20); estry polipropoksylowano-polietoksylowane takie jak Pluronic F68; alkohole polietoksylowane takie jak Brij 35; symetikon; glikol polietylenowy taki jak PEG400; lizofosfatydylocholina; i polioksyetylenowany p-t-oktylofenol taki jak Triton X-100. Klasyczny sposób stabilizacji środków farmaceutycznych za pomocą surfaktantów lub emulgatorów opisał np. Levine i in. (1991) w J. Parenteral Sci. Technol. 45(3):160-165, który załącza się na zasadzie odsyłacza. Korzystnym surfaktantem stosowanym w praktyce według niniejszego wynalazku jest polisorbat 80.

Oprócz środków ujawnionych powyżej, w celu dodatkowego zwiększenia stabilności ciekłych kompozycji farmaceutycznych, można dodawać inne środki stabilizujące takie jak albumina, kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) lub jedną spośród jego soli, taka jak sól dwusodowa EDTA. Albuminę można dodawać w stężeniu 1,0% wagowo/objętościowego lub mniejszym. EDTA działa jako wymiatacz jonów metali katalizujących wiele reakcji utleniania, a zatem jest dodatkowym środkiem stabilizującym.

W jednym rozwiązaniu według wynalazku, stabilizowana ciekła kompozycja farmaceutyczna zawiera IL-2 lub jej odmianę jako polipeptyd, zasadową argininę w stężeniu od 150 mM do 350 mM, kwas bursztynowy w stężeniu od 80 mM do 190 mM, metioninę w stężeniu od 0,5 mM do 10 mM, EDTA w stężeniu od 0,1 do 5,0 mM i polisorbat 80 w stężeniu od 0,001% do 0,2%. W korzystnym rozwiązaniu, zasadowa arginina występuje w tej ciekłej kompozycji farmaceutycznej zawierającej IL-2 w stężeniu 230 mM, a kwas bursztynowy występuje w stężeniu 128 mM. Ta korzystna kompozycja zawierająca IL-2 ma wartość pH 5,8 i osmolarność od 250 mmol/kg do 330 mmol/kg. Stężenie w tych kompozycjach IL-2 lub jej odmiany wynosi od 0,01 mg/ml do 2,0 mg/ml, korzystnie od 0,02 mg/ml do 1,0 mg/ml, korzystniej od 0,03 mg/ml do 0,8 mg/ml, a najkorzystniej od 0,03 mg/ml do 0,5 mg/ml.

Tam gdzie to pożądane, stabilizowane ciekłe kompozycje farmaceutyczne zawierające polipeptyd według niniejszego wynalazku mogą także zawierać cukry lub alkohole cukrowe. Można stosować dowolny cukier taki jak mono-, di- lub polisacharydy lub rozpuszczone w wodzie glukany, obejmujące np. fruktozę, glukozę, mannozę, sorbozę, ksylozę, maltozę, laktozę, sacharozę, dekstran, pullulan, dekstrynę, cyklodekstrynę, rozpuszczalną skrobię, hydroksyetyloskrobię i sól sodową karboksymetylocelulozy. Najkorzystniejszym cukrem jest sacharoza. Za alkohol cukrowy uznaje się węglowodór C4-C8 z grupą -OH, np. mannitol, sorbitol, inozytol, galacytitol, dulcytol, ksylitol i arabitol, przy czym najkorzystniejszym alkoholem cukrowym jest mannitol. Cukry lub alkohole cukrowe wymienione powyżej można stosować pojedynczo lub w kombinacji. Nie ma ustalonych granicznych ilości, jeśli tylko

PL 211 886 B1 cukier lub alkohol cukrowy rozpuszcza się w ciekłym preparacie i nie oddziałuje negatywnie na stabilizację osiąganą w wyniku zastosowania sposobu według wynalazku. Korzystnie stężenie cukru lub alkoholu cukrowego wynosi od 1,0% wagowo/objętościowego do 15,0% wagowo/objętościowych, korzystniej od 2,0% wagowo/objętościowych i 10,0% wagowo/objętościowych.

Stabilizowane ciekłe kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą zawierać inne związki zwiększające skuteczność lub pożądane właściwości konkretnego polipeptydu, służącego jako terapeutycznie aktywny składnik, jeśli tylko nie wpływają one negatywnie na pierwszorzędowy efekt stabilizacyjny uzyskany przez dodanie zasadowego aminokwasu. Kompozycja musi być bezpieczna do podawania wybraną drogą, sterylna i zachowywać swoją pożądaną aktywność terapeutyczną.

Kompozycje według niniejszego wynalazku przygotowuje się korzystnie przez wstępne zmieszanie substancji stabilizujących, buforów i dowolnych innych rozczynników przed wprowadzeniem pożądanego polipeptydu. Dowolne dodatkowe rozczynniki, które można dodawać w celu dalszej stabilizacji kompozycji według niniejszego wynalazku nie mogą wpływać szkodliwie na efekty stabilizacyjne pierwszorzędowego środka stabilizującego, którym jest zasadowy aminokwas w połączeniu ze środkiem buforującym, tj. kwasem nie zawierającym jego soli, kwasem w formie soli lub mieszaniną kwasu i jego soli, użytym w celu otrzymania ujawnionych tu nowych kompozycji. Po dodaniu korzystnej ilości zasadowego aminokwasu w celu zmniejszenia powstawania agregatów pożądanego polipeptydu, wartość pH ciekłej kompozycji reguluje się z zastosowaniem środka buforującego, korzystnie w ujawnionym tu zakresie, korzystniej do wartości pH optymalnej dla pożądanego polipeptydu. Chociaż wartość pH można regulować przez dodanie dodatkowej ilości pożądanego polipeptydu do kompozycji, korzystnie wartość pH reguluje się przed dodaniem tego polipeptydu, przez co można zmniejszyć ryzyko jego denaturacji. W celu osiągnięcia właściwego zmieszania składników stosuje się odpowiednie urządzenia mechaniczne.

Podczas gdy specyficzne rozwiązania ukierunkowane są na stabilizowanie kompozycji według wynalazku zawierających interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę lub porównawczych kompozycji zawierających inhibitor szlaku przemiany czynnika tkankowego (TFPI) lub jego odmianę, białka szczególnie wrażliwe na degradację wskutek tworzenia agregatów, przedmiotem niniejszego wynalazku są ogólnie dowolne kompozycje farmaceutyczne zawierające polipeptyd lub jego odmianę, który tworzy agregaty w ciekłym preparacie podczas przechowywania. Dlatego też polipeptydy odpowiednie do zastosowania w praktyce według niniejszego wynalazku obejmują przykładowo interleukiny (np. IL-2), lecz mogą nimi być także, co nie jest objęte zakresem wynalazku, interferony, w tym interferon β, (IFN-β) i jego muteiny takie jak IFN^_ser17 (ujawnione w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 185459B1 i opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4588585, wprowadzonych tu na zasadzie odsyłaczy), inhibitor szlaku przemiany czynnika tkankowego (TFPI), ludzki hormon wzrostu (hGH), insulina i inne podobne polipeptydy tworzące agregaty w ciekłym preparacie, jak również dowolne biologicznie aktywne ich odmiany.

Polipeptydy występujące w stabilizowanych ciekłych kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku mogą być natywne lub otrzymane technikami rekombinacyjnymi i z dowolnego źródła np. ssacze, jak np. mysie, szczurze, królicze, ssaków naczelnych, świńskie i ludzkie, jeżeli spełniają wymienione tu kryteria, tj. tworzą agregaty w ciekłych preparatach podczas przechowywania. Korzystnie takie polipeptydy mają pochodzenie ludzkie i korzystniej są to rekombinowane białka ludzkie uzyskane z mikroorganizmów.

Biologicznie aktywne odmiany pożądanego polipeptydu, służące jako terapeutycznie aktywny składnik w kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku, także objęte są stosowanym tu terminem „polipeptyd. Takie odmiany powinny utrzymywać pożądaną aktywność biologiczną natywnego polipeptydu tak, aby kompozycja farmaceutyczna zawierająca odmianę polipeptydu miała taki sam efekt terapeutyczny jak kompozycja farmaceutyczna zawierającą podawany pacjentowi natywny polipeptyd. To znaczy, że odmiana polipeptydu będzie funkcjonować jako terapeutycznie aktywny składnik w kompozycji farmaceutycznej na podobnej zasadzie jak natywny polipeptyd. W tej dziedzinie są dostępne metody określania czy odmiana polipeptydu utrzymuje pożądaną aktywność biologiczną, a zatem działa w kompozycji farmaceutycznej jako terapeutycznie aktywny składnik. Aktywność biologiczną można zmierzyć z zastosowaniem specjalnie zaprojektowanych testów pomiaru aktywności natywnego polipeptydu lub białka, obejmujących testy opisane w niniejszym wynalazku. Ponadto można badać zdolność przeciwciał przeciw biologicznie aktywnemu natywnemu polipeptydu do łączenia się z odmianą polipeptydu, przy czym skuteczne wiązanie wskazuje na konformację polipeptydu podobną do polipeptydu natywnego.

PL 211 866 B1

Odpowiednimi biologicznie aktywnymi odmianami natywnego lub naturalnie występującego pożądanego polipeptydu mogą być fragmenty, analogi i pochodne tego polipeptydu. Termin „fragment oznacza polipeptyd składający się tylko z części nienaruszonej sekwencji i struktury polipeptydu i może powstać w wyniku delecji od końca C lub końca N natywnego polipeptydu. Termin „analog oznacza analog natywnego polipeptydu lub fragmentu natywnego polipeptydu, przy czym analog zawiera sekwencję i strukturę natywnego polipeptydu oraz charakteryzuje się jedną lub więcej substytucją, insercją lub delecją aminokwasu. „Muteiny, takie jak tu opisane, oraz peptydy posiadające jeden lub więcej peptoidów (peptydomimetyki) także są objęte terminem analog (patrz zgłoszenie międzynarodowe WO nr 91/04282). Termin „pochodna oznacza dowolny odpowiednio zmodyfikowany pożądany natywny polipeptyd, fragment natywnego polipeptydu lub jego odpowiednie analogi, poprzez glikozylację, fosforylację lub inne wprowadzenie obcej grupy, jeśli tylko zostaje zachowana pożądana aktywność biologiczna natywnego polipeptydu. Metody uzyskiwania fragmentów polipeptydu, analogów i pochodnych są ogólnie znane w tej dziedzinie.

Przykładowo, sekwencję aminokwasów odmian polipeptydu można uzyskać metodą mutacji sklonowanej sekwencji DNA, kodującej natywny pożądany polipeptyd. Metody mutagenezy i zmiany sekwencji nukleotydowej są dobrze znane w tej dziedzinie. Patrz np. Walker i Gaastra, wyd. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nowy Jork); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel i in. (1987) Methods Enzymol. 154:367-382; Sambrook i in. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, Nowy Jork); opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4873192; i odsyłacze literaturowe tam cytowane; wszystkie załączone tu na zasadzie odsyłacza. Wskazówki odpowiednich substytucji aminokwasu, nie wpływających na aktywność biologiczną pożądanego polipeptydu, można znaleźć w modelu Dayhoffa i in. (1978) w Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), który załącza się na zasadzie odsyłacza. Korzystne mogą być konserwatywne substytucje, takie jak wymiana jednego aminokwasu na inny o podobnych właściwościach. Przykłady konserwatywnych substytucji obejmują między innymi Gly<=>Ala, Val<=>Ile<=>Leu, Asp<=>Glu, Lys<=>Arg, Asn<=>Gln i Phe<=>Trp<=>Tyr.

W konstruowaniu odmian pożądanego polipeptydu, modyfikacje przeprowadza się tak, aby odmiany nadal posiadały pożądaną aktywność. Oczywiście, żadne mutacje w DNA kodującym odmianę polipeptydu nie mogą występować w sekwencji poza ramką odczytu i korzystnie nie powinny tworzyć obszarów komplementarnych, mogących tworzyć drugorzędową strukturę mRNA. Patrz europejskie zgłoszenie patentowe nr EP 075444.

Biologicznie aktywne odmiany pożądanego polipeptydu są ogólnie co najmniej w 70%, korzystnie co najmniej w 80%, korzystniej od 90% do 95% lub więcej i najkorzystniej w 98% lub więcej procentach identyczne w sekwencji aminokwasów z sekwencją aminokwasów polipeptydu referencyjnego, który służy za podstawę porównania. Biologicznie aktywna odmiana natywnego pożądanego polipeptydu może różnić się od natywnego polipeptydu 1-15 reszt aminokwasów, 1-10, 6-10, 5, 4, 3, 2 lub nawet 1 resztą aminokwasu. Termin „identyczność sekwencji oznacza takie same reszty aminokwasów obecne w odmianie polipeptydu i cząsteczce polipeptydu referencyjnego, podczas orientowania i porównywania z sekwencją aminokwasów cząsteczki referencyjnej specyficznego, przylegającego segmentu sekwencji aminokwasów odmiany. Procent identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami aminokwasów oblicza się przez określenie liczby pozycji, w których występuje identyczna reszta aminokwasu w obu sekwencjach tak, aby uzyskać liczbę pozycji dopasowanych, a następnie dzieląc liczbę pozycji dopasowanych przez całkowitą liczbę pozycji w segmencie poddawanym porównywaniu z cząsteczką referencyjną, i mnożąc wynik przez 100.

Dla celów optymalnego orientowania tych dwóch sekwencji, przylegający segment sekwencji aminokwasów odmiany może posiadać dodatkowe reszty aminokwasów lub niektóre reszty aminokwasów usunięte w porównaniu z sekwencją aminokwasów cząsteczki referencyjnej. Przylegający segment użyty do porównania z sekwencją aminokwasów musi zawierać co najmniej dwadzieścia (20) kolejnych reszt aminokwasów i może być to 30, 40, 50, 100 lub więcej tych reszt. Korekty ze względu na wzrost identyczności sekwencji związany z lukami w sekwencji aminokwasów odmiany można przeprowadzić wyznaczając luki zabronione. Metody orientowania są dobrze znane w tej dziedzinie zarówno dla sekwencji aminokwasów jak i dla sekwencji nukleotydów kodujących sekwencje aminokwasów. Dlatego też, określanie procentu identyczności pomiędzy dowolnymi dwiema sekwencjami można przeprowadzić z zastosowaniem algorytmu matematycznego. Jednym z korzystnych nieograniczających przykładów algorytmu matematycznego stosowanego w celu porównania sekwencji jest algorytm Myers'a i Miller'a (1988) CABIOS 4:11-17. Taki algorytm jest stosowany w programie ALIGN

PL 211 886 B1 (wersja 2.0), który jest fragmentem oprogramowania do orientowania GCG. Do porównywania sekwencji aminokwasów można stosować tablicę mas reszt PAM120, lukę zabronioną o długości 12 i lukę zabronioną 4 wraz z programem ALIGN. Innym korzystnym nieograniczającym przykładem algorytmu matematycznego do zastosowania w porównaniu dwóch sekwencji jest algorytm Karlin'a i Altschul'a (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, zmodyfikowany przez Karlin'a i Altschul'a (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Taki algorytm włączono do programów NBLAST i XBLAST Altschula i in. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Przeszukiwania protein BLAST można przeprowadzić przy zastosowaniu programu NBLAST, skala = 100, długość słowa = 12, aby uzyskać sekwencje nukleotydów homologiczne z sekwencją nukleotydów kodującą pożądany polipeptyd. Przeszukiwanie protein BLAST można przeprowadzić przy zastosowaniu programu XBLAST, skala = 50, długość słowa = 3, uzyskując sekwencje aminokwasów homologiczne z pożądanym polipeptydem. W celu oszacowania luk dla porównania można zastosować Gapped BLAST opisany przez Altschul i in. (1997) w Nucleic Acid Res. 25:3389. Alternatywnie, do przeprowadzenia poszukiwania iterowanego można zastosować PSI-Blast, który wykrywa odległe powiązania pomiędzy cząsteczkami. Patrz Altschul i in. (1997) powyżej. Przy wykorzystaniu programów BLAST, Gapped BLAST i PSI-Blast, można stosować domyślne parametry odpowiednich programów (np. XBLAST i NBLAST). Patrz http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Patrz także program ALIGN (Dayhoff (1978) w Atlas of Protein Sequence and Structure 5: uzupełnienie 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, B.C.) i programy w Wisconsin Sequence Analysis Package, Wersja 8 (dostępne z Genetics Computer Group, Madizon, Wisconsin), np. program GAP, w których stosuje się parametry domyślne.

Rozpatrując procent identyczności sekwencji aminokwasów, niektóre pozycje reszt aminokwasów mogą różnić się na skutek konserwatywnych substytucji aminokwasów, które nie wpływają na funkcjonowanie białka. W tych przypadkach, procent identyczności sekwencji można regulować w górę tak, aby obliczyć podobieństwo konserwatywnie podstawionych aminokwasów. Takie regulacje są dobrze znane w tej dziedzinie. Patrz np. Myers i Miller (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17.

Dokładna budowa chemiczna polipeptydu zależy od wielu czynników. Jako że w cząsteczce występują jonizujące grupy aminowe i karboksylowe, poszczególne polipeptydy mogą występować w formie soli kwasowej lub zasadowej lub w postaci obojętnej. Stosowana tu definicja polipeptydów obejmuje wszystkie odmiany, które utrzymują swoją aktywność biologiczną, po umieszczeniu w odpowiednich warunkach środowiskowych. Ponadto, pierwszorzędową sekwencję aminokwasów polipeptydu można rozbudować metodą derywatyzacji przy zastosowaniu grup cukrowych (glikozylacja) lub innych dodatkowych cząsteczek takich jak lipidy, grupy fosforanowe, acetylowe itp. Można ją także rozbudować metodą sprzęgania z sacharydami. Niektóre aspekty takiego rozbudowywania są nieodłącznie związane z obróbką postranslacyjną u gospodarza; inne takie modyfikacje można wprowadzić in vitro. W każdym przypadku, takie modyfikacje objęte są przedstawioną tu definicją polipeptydu, o ile nie spada aktywność polipeptydu. Oczekuje się, że takie modyfikacje mogą ilościowo lub jakościowo wpłynąć na aktywność peptydu, zwiększając lub obniżając jego aktywność w różnych testach. Dodatkowo, poszczególne reszty aminokwasów w łańcuchu można zmodyfikować przez utlenianie, redukcję lub inną derywatyzację, a polipeptyd można rozerwać, z wytworzeniem fragmentów zachowujących aktywność. Takie zmiany, które nie zmniejszają aktywności, nie eliminują takiej sekwencji polipeptydu ze stosowanej tu definicji pożądanego polipeptydu.

W tej dziedzinie istnieje wiele wytycznych dotyczących preparatyki i stosowania odmian polipeptydów. Podczas wytwarzania odmian polipeptydów, fachowiec w tej dziedzinie może łatwo określić, które modyfikacje nukleotydów natywnego białka lub sekwencji aminokwasów dadzą w rezultacie odmianę odpowiednią do zastosowania jako terapeutycznie aktywny składnik kompozycji farmaceutycznej według niniejszego wynalazku, i w przypadku którego tworzenie agregatów zmniejsza się dzięki obecności zasadowego aminokwasu i kwasu nie zawierającego jego soli, soli kwasu lub mieszaniny kwasu i jego soli, jak to opisano.

W jednym rozwiązaniu według wynalazku, polipeptydem występującym jako terapeutycznie aktywny składnik w ciekłej kompozycji farmaceutycznej według wynalazku jest interleukina-2 (IL-2) lub jej odmiana, korzystnie rekombinowana IL-2. Interleukina-2 jest limfokiną wytwarzaną przez prawidłowe limfocyty krwi obwodowej i występuje w organizmie w niskich stężeniach. Indukuje ona proliferację stymulowanych antygenem lub mitogenem komórek T po ich ekspozycji na działanie lektyn roślinnych, antygenów lub innych bodźców. IL-2 po raz pierwszy opisał Morgana i in. (1976) Science 193:1007-1008, a pierwotnie uzyskała nazwę czynnika wzrostu komórek T ze względu na zdolność do indukowania proliferacji stymulowanych limfocytów T. Jest to białko o masie cząsteczkowej w zakresie

PL 211 866 B1 od 13000 do 17000 (Gillis i Watson (1980) J. Exp. Med. 159:1709) i punkcie izoelektrycznym w zakresie 6-8,5. Obecnie uważa się, że oprócz swych zwykłych właściwości czynnik wzrostu moduluje in vitro i in vivo różne funkcje układu immunologicznego. IL-2 jest jedną spośród kilku wytwarzanych przez limfocyty cząsteczek przekaźnikowych-regulatorowych, które pośredniczą w oddziaływaniach komórkowych i ich funkcjonowaniu. Ta naturalnie występująca limfokina wykazuje aktywność przeciwnowotworową względem różnych uzłośliwień sama lub w połączeniu z aktywowanymi limfokiną limfocytami cytotoksycznymi (LAK) lub limfocytami naciekającymi guz (patrz np. Rosenberg i in. (1987) N. Engl. J. Med. 316:889-897; Rosenberg (1988) Ann. Surg. 208:121-135; Topalian i in. 1988) J. Clin. Oncol. 6:839-853; Rosenberg i in. (1988) N. Engl. J. Med 319:1676-1680; i Weber i in. (1992) J. Clin. Oncol. 10:33-40). Chociaż aktywność przeciwnowotworowa IL-2 została najlepiej zbadana u pacjentów z przerzutami czerniaka i rakiem nerek, inne choroby, szczególnie takie jak chłoniak, także reagują na leczenie IL-2.

Termin „rekombinowana IL-2 oznacza interleukinę-2 o porównywalnej aktywności biologicznej do sekwencji natywnej IL-2 i uzyskaną technikami rekombinacji DNA opisanymi np. przez Taniguchi i in. (1983) w Nature 302:305-310 i Devos (1983) Nucleic Acids Research 11:4307-4323 lub mutacyjnie zmienioną IL-2 opisaną przez Wang i in. (1984) w Science 224:1431-1433. Sekwencja kodująca gen IL-2 zazwyczaj jest klonowana, a następnie ulega ekspresji w organizmach transformowanych, korzystnie mikroorganizmach, a najkorzystniej w E. coli. W organizmie gospodarza obcy gen ulega ekspresji dając IL-2. Syntetyczną, rekombinowaną IL-2 może także uzyskać u eukariota, takich jak drożdże lub komórki ludzkie. Sposoby hodowli, zbierania, dezintegracji lub izolacji IL-2 z komórek ujawniono np. w opisach patentowych St. Zjedn. Ameryki nr 4604377; 4738927; 4656132; 4569790; 4748234; 4530787; 4572298; i 4931543; załączonych w całości na zasadzie odsyłaczy.

Przykładowe odmiany białka IL-2 ujawniono w europejskich zgłoszeniach patentowych nr 136489; nr 83101035.0 złożonym 3 lutego 1983 (opublikowanym 19 października 1983 pod nr 91539); nr 82307036.2 złożonym 22 grudnia 1982 (opublikowanym 14 września 1983 pod nr 88195); rekombinowane muteiny IL-2 ujawniono w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 83306221.9, złożonym 13 października 1983 (opublikowanym 30 maja 1984 pod nr 109748), które jest równoważne belgijskiemu zgłoszeniu patentowemu nr 893016, opartemu na pierwszeństwie z opisu patentowego St. Zjedn. Ameryki nr 4518584; muteiny ujawnione w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4752585 i międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr 99/60128; i muteina IL-2 stosowana w podanych tu przykładach i ujawniona w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4931543; przy czym wszystkie wymienione publikacje załącza się tu na zasadzie odsyłaczy. Ponadto IL-2 można zmodyfikować przy zastosowaniu glikolu polietylenowego, uzyskując jej zwiększoną rozpuszczalność i zmieniony profil farmakokinetyczny (patrz opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4766106, załączony w całości na zasadzie odsyłacza).

W innym rozwiązaniu porównawczym, polipeptydem występującym jako terapeutycznie aktywny składnik w ciekłej kompozycji farmaceutycznej jest interferon, dokładniej fibroepitelialny interferon β (IFN-β) lub jego odmiany, korzystnie rekombinacyjny IFN-β wytworzono technikami rekombinacji DNA znanymi w tej dziedzinie. Interferony wytwarzają komórki ssacze w odpowiedzi na działanie rozmaitych induktorów, takich jak mitogeny, polipeptydy, wirusy itp. Te względnie małe, gatunkowo-specyficzne, jednołańcuchowe polipeptydy wykazują właściwości immunoregulacyjne, przeciwwirusowe i przeciwproliferacyjne. Interferony są przedmiotem zainteresowania jako środki terapeutyczne do leczenia chorób wirusowych i walki z nowotworami.

Sekwencje DNA kodujące ludzki gen IFN-β są dostępne w tej dziedzinie (patrz Goeddel i in. (1980) Nucleic Acids Res.. 5:4057 i Taniguchi i in. (1979) Proc. Japan acad. Sci. 555:464), a gen ulega ekspresji w komórkach E. coli (Taniguchi i in. (1980) Gene 70:11-15) i komórkach jajnika chomika chińskiego (patrz np. opisy patentowe St. Zjedn. Ameryki nr 4966843 i 5376567). Odmiany IFN-β ujawniono w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 185459B1, a opisy patentowe St. Zjedn. Ameryki nr 4518584, 4588585 i 4737462 ujawniają muteiny takie jak IFN^_ser17 ulegające ekspresji w komórkach E. coli, przy czym wszystkie te publikacje załącza się tu na zasadzie odsyłaczy.

W jeszcze innym rozwiązaniu porównawczym, polipeptydem występującym jako terapeutycznie aktywny składnik w ciekłej kompozycji farmaceutycznej jest inhibitor szlaku przemiany czynnika tkankowego (TFPI) lub jego odmiany, korzystnie rekombinowany TFPI. Ten polipeptyd, który jest inhibitorem kaskady koagulacji znany jest także jako inhibitor koagulacji związany z lipoproteiną (LACI), inhibitor czynnika tkankowego (TFI) i inhibitor szlaku zewnętrznego (EPI). TFPI po raz pierwszy wyizolowano z komórek ludzkiego raka wątroby Hep G2 (Broze i Miletich (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:

PL 211 886 B1

1886-1890) a następnie z ludzkiego osocza (Novotny i in. (1989) J. Biol. Chem. 264:18832-18837); raka wątroby Changa i komórek SK raka wątroby (Wun i in. (1990) J. Biol. Chem. 265:16096-16101). Z biblioteki cDNA wydzielono cDNA TFPI łożyskowe i śródbłonkowe (Wun i in. (1988) J. Biol. Chem. 263:6001-6004); Girard i in. (1989) Thromb. Res. 55:37-50). Przeglądu dokonali Rapaport (1989) Blood 73:359-365 (1989); Broze i in. (1990) Biochemistry 29:7539-7546. Klonowanie cDNA TFPI, kodującego białko TFPI złożone z 276 aminokwasów, ujawniono w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4966852; patrz także opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5773251 i 5849875; przy czym wszystkie publikacje załącza się tu na zasadzie odsyłaczy.

Odmiany TFPI są znane w tej dziedzinie. Patrz opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5212091, gdzie nieglikozylowaną formę rekombinowanego TFPI wytwarza się i izoluje z komórek E. coli; opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5106833, w którym ujawniono analogi i fragmenty; oraz opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5378614, w którym ujawniono produkcję analogów TFPI przez drożdże; przy czym wszystkie publikacje załącza się tu na zasadzie odsyłaczy.

Pacjentowi podaje się farmaceutycznie skuteczną ilość stabilizowanej ciekłej kompozycji farmaceutycznej zawierającej polipeptyd według wynalazku. Termin „farmaceutycznie skuteczna ilość oznacza ilość przydatną do leczenia, zapobiegania lub diagnozowania choroby. Typowe sposoby podawania obejmują między innymi podawanie doustne i pozajelitowe, w tym iniekcje dożylne, domięśniowe, podskórne, dotętnicze i dootrzewnowe, lub wlew. W jednym rozwiązaniu, kompozycja podawana jest iniekcyjnie, korzystnie metodą iniekcji podskórnej. Postacie kompozycji według wynalazku do wstrzykiwania obejmują między innymi roztwory, zawiesiny i emulsje.

Stabilizowana ciekła kompozycja farmaceutyczna zawierająca pożądany polipeptyd powinna być skomponowana w jednostkową postać dawkowania, np. do wstrzykiwania lub infuzji, jak roztwór, zawiesina lub emulsja. Ponadto można ją przechowywać w formie zamrożonej lub w postaci suchej, np. liofilizowanego proszku, odtwarzalnych do roztworu, zawiesiny lub emulsji przed podaniem doustnym lub pozajelitowym. Korzystnie kompozycję przechowuje się jako preparat ciekły, aby zwiększyć trwałość podczas przechowywania sposobami według niniejszego wynalazku przedstawionymi poniżej. Stabilizowaną kompozycję farmaceutyczną korzystnie sterylizuje się metodą filtracji membranowej i przechowuje w pojemnikach jednodawkowych lub wielodawkowych takich jak szczelnie zamknięte fiolki lub ampułki. W celu dodatkowego zwiększenia trwałości podczas przechowywania ciekłych kompozycji farmaceutycznych tu ujawnionych można stosować dodatkowe metody formulacji kompozycji farmaceutycznej, znane ogólnie w tej dziedzinie, pod warunkiem, że nie wpływają szkodliwie na korzystne efekty środków stabilizujących i buforów ujawnionych w sposobach według wynalazku. Dokładne omówienie formulacji i wyboru farmaceutycznie dopuszczalnych nośników, stabilizatorów itp. można znaleźć w Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) (wydanie 18, Mack Pub. Co., Eaton, Pensylwania), który załącza się tu na zasadzie odsyłacza.

Termin „pacjent oznacza dowolne zwierzę. Korzystnym pacjentem jest ssak, a najkorzystniej człowiek. Do ssaków o szczególnym znaczeniu, innych niż ludzie, należą między innymi psy, koty, krowy, konie, owce i świnie.

Jeżeli podawanie kompozycji ma na celu leczenie pacjenta, może być to leczenie profilaktyczne lub terapeutyczne. Przy podawaniu profilaktycznym, substancję podaje się przed wystąpieniem objawów. Podawanie profilaktyczne substancji służy zapobieganiu lub osłabianiu wszelkich późniejszych objawów. Przy podawaniu terapeutycznym, substancję podaje się podczas występowania objawów (lub krótko po). Terapeutyczne podawanie substancji służy osłabieniu wszelkich kolejnych objawów.

Dlatego też preparaty z efektywną ilością kompozycji farmaceutycznej według wynalazku zawierającej IL-2 o sekwencji natywnej lub jej odmianę można stosować do leczenia, zapobiegania i diagnozowania wielu wskazań klinicznych, odpowiadających na leczenie tym polipeptydem. Biologicznie aktywne odmiany IL-2 o natywnej sekwencji, takie jak muteiny IL-2, które zachowują aktywność IL-2, w szczególności muteina IL-2.sub.ser125 i inne muteiny, w których cysteinę w pozycji 125 zastąpiono innym aminokwasem, można komponować i stosować w taki sam sposób jak IL-2 o natywnej sekwencji. Zgodnie z tym, preparaty według wynalazku zawierające IL-2 o natywnej sekwencji lub jej odmianę są przydatne do diagnozowania, zapobiegania i leczenia (miejscowego lub systemowego) infekcji bakteryjnych, wirusowych, pasożytniczych, pierwotniaczych i grzybiczych; w celu zwiększenia cytotoksyczności komórkowej; stymulacji aktywności komórek zabójców aktywowanych limfokiną (LAK); pośredniczenia w odzyskiwaniu funkcji immunologicznych limfocytów; osłabiania odpowiedzi na alloantygen; ułatwiania odzyskiwania funkcji immunologicznych w stanach nabytych braków odporności; w celu odtwarzania prawidłowego funkcjonowania układu odpornościowego

PL 211 866 B1 ludzi i zwierząt w podeszłym wieku; w celu opracowywania testów diagnostycznych wykorzystujących np. wzmocnienie enzymatyczne, znakowanie substancją radioaktywną, obrazowanie przy zastosowaniu substancji radioaktywnej i innych metod znanych w dziedzinie monitorowania poziomów IL-2 w stanie chorobowym; w celu przyśpieszania wzrostu komórek T in vitro w celach terapeutycznych i diagnostycznych; w celu blokowania miejsca receptorowego dla limfokiny; i w różnych innych zastosowaniach terapeutycznych, diagnostycznych i badawczych. Zbadano różne terapeutyczne i diagnostyczne zastosowania ludzkiej IL-2 lub jej odmian, takich jak muteiny IL-2, a przedstawił je Rosenberg i in. (1987) w N. Engl. J. Med. 316:889-897; Rosenberg (1988) w Ann. Surg. 208:121-135; Topalian i in. 1988 w J. Clin. Oncol. 6:839-853; Rosenberg i in. (1988) w N. Engl. J. Med. 319:1676-1680; Weber i in. (1992) w J. Clin. Oncol. 10:33-40; Grimm i in. (1982) w Cell. Immunol. 70(2):248-259; Mazumder (1997) w Cancer J. Sci. Am. 3 (uzupełnienie 1):37-42; Mazumder i Rosenberg (1984) w J. Exp. Med. 159(2):495-507; i Mazumder i in. (1983) w Cancer Immunol. Immunother. 15(1):1-10. Preparaty według wynalazku zawierające IL-2 lub jej odmianę można stosować jako pojedynczy terapeutycznie aktywny środek lub w połączeniu z innymi odpowiednimi immunologicznie komórkami B lub T, lub innymi środkami terapeutycznymi. Przykładami odpowiednich komórek są komórki B lub T, limfocyty cytotoksyczne, komórki LAK itp., a przykładowymi reagentami terapeutycznymi, które można stosować w połączeniu z IL-2 lub jej odmianą, są różne interferony, szczególnie interferon gamma, czynnik wzrostu komórek B, IL-1 i przeciwciała, np. przeciwciała anty-HER2 lub anty-CD20. Preparaty według wynalazku zawierające IL-2 lub jej odmianę można podawać ludziom lub zwierzętom doustnie, dootrzewnowo, domięśniowo, podskórnie, dożylnie, donosowo lub dopłucnie według wskazań lekarza. IL-2 (o natywnej sekwencji lub jej odmiany zachowującej aktywność biologiczną IL-2, jak tu ujawnione muteiny) można ₂ podawać w ilości w zakresie pomiędzy od 0,1 do 15 mlU/m². We wskazaniach takich jak rak nerek i czerniak przerzutowy, IL-2 lub jej biologicznie aktywne odmiany można podawać w bolusie w dawkach od 300000 do 800000 IU/kg/8 godzin.

Preparaty porównawcze zawierające skuteczną ilość kompozycji farmaceutycznych zawierających inhibitor szlaku przemian czynnika tkankowego (TFPI) o natywnej sekwencji lub jego odmianę są przydatne do diagnozowania, zapobiegania i leczenia (miejscowego lub systemowego) wskazań klinicznych odpowiadających na leczenie tym polipeptydem. Takie wskazania kliniczne obejmują np. wskazania związane ze zwiększoną syntezą i uwalnianiem elastazy neutrofilowej, jak choroby zapalne obejmujące groźne ostre zapalenie trzustki, rozedmę, reumatoidalne zapalenie stawów, uszkodzenie wielu organów, zwłóknienie torbielowate, zespół ostrego wyczerpania oddechowego dorosłych (ARDS) i posocznicę; i do diagnozowania i leczenia chorób związanych ze zwiększoną syntezą i uwalnianiem IL-8, obejmujących choroby zapalne takie jak ARDS, zaburzenie przepływu krwi (obejmujące zaburzenie przepływu krwi w płucach), posocznicę i zapalenie stawów. Patrz zgłoszenie WO nr 96/40224, załączone tu na zasadzie odsyłacza. Podawanie ludziom lub zwierzętom IFN-β lub jego mutein można realizować doustnie, dootrzewnowo domięśniowo, podskórnie, dożylnie, donosowo lub dopłucnie w zależności od wskazań lekarza.

Preparaty porównawcze zawierające efektywną ilość kompozycji farmaceutycznych zawierających β interferon (IFN-β) lub jego odmianę, taką jak IFN-p_ser17' są przydatne do diagnozowania, zapobiegania i leczenia (miejscowego lub systemowego) wskazań klinicznych odpowiadających na leczenie tym polipeptydem. Takie wskazania kliniczne obejmują, np. zaburzenia lub choroby ośrodkowego układu nerwowego (CNS), mózgu i/lub rdzenia kręgowego, obejmujące chorobę Alzheimera, chorobę Parkinsona, demencja Lewy'ego, stwardnienie rozsiane, padaczkę, ataksję móżdżkową, postępujący paraliż nadjądrowy, amiotroficzne stwardnienie boczne, choroby psychiczne z kręgu cyklofrenii, stany lękowe, natręctwa myślowe i czynności przymusowe, zaburzenia osobowości, zaburzenia koncentracji, hiperaktywność powiązaną z zaburzeniem koncentracji, zespół Touretta, Tay Sachs, Nieman Pick i schizofrenię; uszkodzenie nerwów w wyniku zaburzeń naczyniomózgowych takich jak udar mózgu lub rdzena kręgowego, infekcji CNS obejmujących zapalenie opon mózgowych i HIV, guzów mózgu i rdzenia kręgowego lub w wyniku chorób prionowych; chorób autoimmunologicznych, obejmujących nabyty niedobór odporności, reumatoidalne zapalenie stawów, łuszczycę, chorobę Crohna, zespół Sjogren'a, amiotroficzne stwardnienie boczne i toczeń; i nowotwory, obejmujące nowotwory sutka, prostaty, pęcherza, nerki i okrężnicy. Podawanie IFN-β lub jego mutein ludziom lub zwierzętom można realizować doustnie, dootrzewnowo, domięśniowo, podskórnie, dożylnie, donosowo lub dopłucnie, zależnie od wskazań lekarza.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób zwiększania trwałości polipeptydu w ciekłej kompozycji farmaceutycznej, w której polipeptyd ten, służący jako terapeutycznie aktywny składnik, tworzy

PL 211 886 B1 agregaty podczas jego przechowywania. Sposób ten obejmuje wprowadzenie do ciekłej kompozycji farmaceutycznej zasadowego aminokwasu w ilości wystarczającej do zmniejszenia tworzenia agregatów polipeptydu w ciekłej kompozycji farmaceutycznej podczas jego przechowywania oraz wprowadzenie kwasu nie zawierającego jego soli, przy czym kwas służy jako środek buforujący utrzymujący wartość pH ciekłej kompozycji w dopuszczalnym zakresie, co już wcześniej opisano.

Zwiększenie trwałości polipeptydu lub jego odmiany poprzez wprowadzenie zasadowego aminokwasu lub zasadowego aminokwasu z jednym lub więcej dodatkowymi tu opisanymi środkami stabilizującymi, w połączeniu z ujawnionym tu środkiem buforującym, tj. kwasem nie zawierającym jego prowadzi do zwiększenia trwałości podczas przechowywania ciekłej kompozycji farmaceutycznej zawierającej polipeptyd. Dlatego też przedmiotem wynalazku jest także sposób zwiększenia trwałości podczas przechowywania ciekłej kompozycji farmaceutycznej, gdy kompozycja ta zawiera polipeptyd tworzący agregat w ciekłym preparacie podczas przechowywania. Termin „o zwiększonej trwałości podczas przechowywania oznacza, że podczas przechowywania kompozycji farmaceutycznej polipeptyd lub jego odmiana występuje we właściwej niezagregowanej biologicznie aktywnej konformacji i dlatego też następuje mniejszy spadek efektywności terapeutycznej, niż w przypadku ciekłej kompozycji farmaceutycznej wytworzonej bez dodatku zasadowego aminokwasu lub zasadowego aminokwasu w połączeniu z opisanym tu jednym lub więcej środkami stabilizującymi, w połączeniu z ujawnionym tu środkiem buforującym.

Trwałość podczas przechowywania kompozycji farmaceutycznych zawierających polipeptyd przygotowanych zgodnie ze sposobami według wynalazku można oszacować stosując standardowe metody znane w tej dziedzinie. Typowo, trwałość podczas przechowywania takich kompozycji szacuje się z zastosowaniem profili trwałości podczas przechowywania. Otrzymuje się je monitorując zmiany w ilości polipeptydu występującego w jego niezagregowanej, biologicznie aktywnej formie cząsteczkowej i jego mocy w czasie w odpowiedzi na interesujące czynniki takie jak pH, rodzaj środka stabilizującego, stężenie środka stabilizującego itp., jak to pokazano w poniższych przykładach. Te profile trwałości można uzyskać dla kilku temperatur reprezentatywnych dla możliwych warunków przechowywania, takich jak temperatura zamarzania, temperatura przechowywania w warunkach chłodniczych, temperatura pokojowa lub temperatura podwyższona, jak 40-50°C. Trwałość podczas przechowywania porównuje się następnie pomiędzy profilami przez określanie np. okresu półtrwania niezagregowanej, biologicznie aktywnej cząsteczkowej formy pożądanego polipeptydu. Termin „okres półtrwania oznacza czas potrzebny do spadku ilości niezagregowanej, biologicznie aktywnej cząsteczkowej formy pożądanego polipeptydu o 50%. Kompozycje zawierające zasadową argininę i kwas w zasadzie nie zawierający jego soli wytworzone zgodnie ze sposobami według niniejszego wynalazku będą miały okres półtrwania co najmniej od około dwukrotnie do około dziesięciokrotnie dłuższy, korzystnie od co najmniej około trzykrotnie do co najmniej około dziesięciokrotnie dłuższy, korzystniej od co najmniej około czterokrotnie do około dziesięciokrotnie dłuższy, a najkorzystniej od co najmniej około pięciokrotnie do około dziesięciokrotnie dłuższy od okresu półtrwania ciekłej kompozycji wytworzonej bez zasadowego aminokwasu lub zasadowego aminokwasu z dodanym jednym lub więcej opisanymi tu środkami stabilizującymi, w połączeniu z kwasem nie zawierającym jego soli, solami kwasu lub mieszaniną kwasu i jego soli. Dla celów według niniejszego wynalazku, kompozycję farmaceutyczną o zwiększonej trwałości podczas przechowywania przygotowaną według niniejszego wynalazkiem uważa się za kompozycję farmaceutyczną „stabilizowaną. Taka stabilizowana kompozycja ma korzystnie trwałość podczas przechowywania co najmniej około 18 miesięcy, korzystniej co najmniej 20 miesięcy, jeszcze korzystniej co najmniej około 22 miesiące, a najkorzystniej co najmniej około 24 miesiące, podczas przechowywania w temperaturze 2-8°C.

Następujące przykłady ilustrują wynalazek, nie ograniczając jego zakresu.

Część doświadczalna

IL-2 jest silnym mitogenem stymulującym proliferację komórek T. Ma ona szerokie znaczenie terapeutyczne jako środek leczniczy w przerzutach raka, jako środek wspomagający leczenie raka i jako środek dodatkowy w chorobach zakaźnych.

W wyniku różnych prób klinicznych z zastosowaniem leczenia IL-2 stwierdzono, że niezbędne dla tego białka jest uzyskanie trwałego ciekłego preparatu. Taki preparat jest bardziej uniwersalny niż tradycyjne preparaty liofilizowane, ponieważ można go podawać w różnych dawkach według różnych reżimów dawkowania. Ciekły preparat jest także bardziej dogodny do podawania, jako że nie wymaga odtwarzania. Taki preparat może mieć postać uprzednio napełnionych, gotowych do użytku strzykawek lub preparatów wielodawkowych, jeżeli jest kompatybilny ze środkami bakteriostatycznymi.

PL 211 866 B1

Stwierdzono, że IL-2 w ciekłych preparatach ulega degradacji podczas przechowywania na drodze, co najmniej trzech szlaków: agregacji, utleniania metioniny i deamidacji (Kunitani i in. (1986) J. Chromatography 359:391-401; Kenney i in. (1986) Lymphokine Res. 5:523-527). Ponadto IL-2 jest podatna na nagłą degradację spowodowaną zamrażaniem i mechanicznym naprężeniem ścinającym. Dlatego też przy komponowaniu preparatu IL-2 należy wziąć pod uwagę zarówno możliwość degradacji nagłej jak i postępującej w czasie.

Zgodnie z tym wytworzono nowy trwały, monomeryczny preparat rhIL-2. W preparacie tym cząsteczki białka występują w roztworze w formie monomerycznej, a nie w formie zagregowanej. Dlatego też nie występują oligomery kowalencyjne lub hydrofobowe, ani też agregaty rhIL-2. Preparat zawiera kilka środków stabilizujących, głównie argininę i metioninę, co ma na celu ustabilizowanie białka, chroniąc je podczas długotrwałego przechowywania przed uszkodzeniami fizycznymi i chemicznymi, takimi jak agregacja, utlenianie metioniny i deamidacja. Ponadto, do preparatu wprowadzono niejonowy surfaktant, polisorbat 80, w celu zabezpieczenia białka przed nagłą degradacją spowodowaną procesami zamrażania-rozmrażania i mechanicznym naprężeniem ścinającym. Jak pokazano w poniższych przykładach, dodanie do preparatu rhIL-2 środków stabilizujących według wynalazku zwiększa jego trwałość podczas przechowywania.

Cząsteczką IL-2, którą zastosowano w tych przykładach, jest rekombinowana ludzka muteina IL-2, aldesleukina, z cysteiną-125 zastąpioną seryną (des-alanylo-1 seryna-125 ludzkiej interleukiny-2). Została ona wytworzona przez E. Coli, a następnie wyizolowana metodą diafiltracji i kationowymiennej chromatografii, jak to ujawniono w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4931543. Oczyszczona ilość do dalszego zastosowania wynosiła około 3 mg/ml IL-2 i skomponowano ją w 10 mM roztworze cytrynianu sodu o wartości pH 6, 200-250 mM NaCl (bufor zbiorczy CM) lub w buforze zawierającym 10 mM roztwór bursztynianu sodu o wartości pH 6 i 150 mM L-argininy.

Porównawczo inhibitorem szlaku czynnika tkankowego (TFPI) jest inne białko, ulegające degradacji w wyniku agregacji podczas przechowywania w ciekłym preparacie farmaceutycznym (Chen i in. (1999) J. Pharm. Sci. 88:881-888). Przykład 8 poniżej dotyczy ciekłych preparatów i wykazuje skuteczność stosowania kwasu w formie jego wolnej zasady w celu zmniejszenia tworzenia agregatów, i układu buforującego zasilanego kwasem nie zawierającym jego soli.

W przykładach zastosowano następujące procedury w celu określenia wpływu poszczególnego środka stabilizującego na degradację IL-2 lub porównawczo TFPI, a zatem na trwałość tego białka podczas przechowywania w ciekłych preparatach.

Pomiar absorbancji UV

Absorbancję UV roztworów białkowych zmierzono z zastosowaniem spektrometru Hewlett Packard Diode Array (Model 8452). Urządzenie wyzerowano w obecności ślepej próby, stosując odpowiedni dla preparatu bufor. Rejestrowano absorbancję przy 280 nm, stosując kuwetę kwarcową o wymiarze wewnętrznym 1,0 cm. W celu przekształcenia danych o absorbancji na stężenie IL-2

-1 -1 w mg/ml zastosowano współczynnik wygaszania 0,70 (mg/ml)^-1 cm^-1.

RP-HPLC

RP-HPLC przeprowadzono w układzie Waters 626 LC zaopatrzonym w autosampler 717 (Waters Corporation, Milford, Maine), stosując kolumnę Vydac 214BTP54 C4 i przedkolumnę Vydac 214GCC54 (Separations Group, Hesparia, Kalifornia). Kolumny początkowo zrównoważono fazą ruchomą A (10% acetonitrylu, 0,1% TFA). Następnie wprowadzono 20 ąg próbki IL-2 i białko eluowano fazą ruchomą B (100% acetonitrylu, 0,1% TFA) od 0 do 100% w ciągu 50 minut przy prędkości przepływu 1,0 ml/minutę. Główne rozpuszczone odmiany IL-2 eluowano przez w przy-bliżeniu 32 minuty i wykrywano przy długości UV 214 nm, stosując detektor Waters 486. Dane zbierano i przetwarzano z zastosowaniem układu Perkins-Elmer Turbochrom (PE Nelson, Cupertino, Kalifornia).

Dzięki metodzie RP-HPLC stwierdzono, że główne monomeryczne odmiany IL-2 tworzą pik B, odmiany utleniające metioninę (głównie utleniona Met¹⁰⁴) tworzą pik A, postacie zdeamidowane (prawdopodobnie Asn⁸⁸) tworzą pik B', a inne nieznane postacie eluują wcześniej lub później niż te piki.

SEC-HPLC

HPLC z wykluczeniem w oparciu o wymiar przeprowadzono w kolumnie TOSOHAAS G2000SWx1 i kolumnie zabezpieczającej TSK SWx1 (TOSOHAAS, Montgomeryville, Pensylwania). Zastosowano pojedynczą fazę ruchomą zawierającą 10 mM roztwór fosforanu sodu o wartości pH 7 i 200 mM siarczanu amonu przy szybkości przepływu 1,0 ml/minutę. Monomeryczne postacie IL-2 eluowano w przybliżeniu 14 minut i wykrywano przy długości UV 214 nm, stosując detektor Waters 486. Dane zbierano i przetwarzano z zastosowaniem układu Perkin-Elmer Turbochrom.

PL 211 886 B1

Stosując wewnętrzny protokół SEC-HPLC szczególnie przystosowany do monitorowania IL-2, eluowano rhIL-2 głównie pojedynczo, prawdopodobnie w formie monomerycznej, ponieważ dodanie agregujących dysocjujących środków, takich jak SDS, mocznik i DTT, nie wpłynęło na elucję tych postaci.

IEX-HPLC

Chromatografię jonowymienną (IEX)-HPLC przeprowadzono w kolumnie szklanej Pharmacia Mono-S HR 5/5, stosując system Waters 626 LC z autosamplerem 717 z układem grzewczo/chłodzącym, tak jak to opisał Chen i in. (1999) w J. Pharm. Sci. 88:881-888. Kolumnę zrównoważono 80% fazy ruchomej A (objętościowo 70:30, mieszanina 20 mM octanu sodu:acetonitryl o wartości pH 5,4) i 20% fazy ruchomej B (objętościowo 70:30, 20 mM octanu sodu i 1 M chlorku amonu:acetonitryl o pH 5,4). Po wstrzyknięciu eluowano rekombinacyjny ludzki (rh) TFPI, zwiększając fazę ruchomą B do 85% w ciągu 21 minut przy prędkości przepływu 0,7 ml/minutę. rhTFPI eluowano w przybliżeniu przez 16,5 minuty jako pojedynczy pik i wykrywano metodą absorbancji UV przy 280 nm, stosując detektor absorbancji Waters 486. Dane zbierano i przetwarzano w układzie Perkin-Elmer Turbochrom. Stężenie białka obliczono całkując powierzchnię piku i porównując ją z krzywą standardową uzyskaną na bazie próbek o znanych stężeniach.

SDS-PAGE

SDS-PAGE przeprowadzono zgodnie z protokołem Laemmli. Około 5 μg IL-2 wprowadzono do każdej ścieżki 18% żelu Norvex Tris-glicyna i prowadzono elektroforezę przy napięciu prądu 100 wolt. Prążki białka barwiono stosując niebieski barwnik Coomassie i analizowano przy zastosowaniu densytometru Molecular Dynamics zaopatrzonego w system Imagequan T (Molecular Dynamics, Sunnyvale, Kalifornia).

Proliferacja komórek HT-2 i barwienie na bioaktywność IL-2 przy zastosowaniu MTT

Moc IL-2 określa się metodą testu biologicznego in vitro, stosując test proliferacji komórek HT-2 i barwienie MTT (Gillis i in. (1978) J. Immunology 120:2027-2032; Watson (1979) J. Exp. Med. 150(6): 1510). W skrócie, 1 x 10⁴ mysich komórek HT-2, których wzrost jest zależny od IL-2, wprowadzono do studzienki płytki do hodowli tkankowej zawierającej standardy, próbki kontrolne lub próbki badane. Po 22 do 26 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C, do studzienek dodano MTT i kontynuowano inkubację w temperaturze 37°C przez 3 do 4 godzin. Następnie w celu odbarwienia dodano 20% SDS na noc w temperaturze pokojowej. Absorbancję studzienek odczytano przy 570 nm i przekształcono w bioaktywność IL-2, bazując na międzynarodowych standardach WHO.

Pomiary wartości pH i osmolarności

Wartość pH roztworów różnych preparatów zmierzono przy zastosowaniu pH-metru firmy Orion (Model 611, Orion Research Incorporated Laboratory Products Group, Boston, Massachuse tts). pH-metr skalibrowano metodą kalibracji dwubuforowej sugerowanej przez producenta, stosując standard dla pH 4 (Fisher Scientific, nr kat. SB 101-500) i standard dla pH 7 (Fisher Scientific, nr kat/ SB 107-500).

Osmolarność roztworów tych preparatów zmierzono przy zastosowaniu osmometru firmy Wescor (model 5500, Wescor Inc., Logan, Utah). Osmometr skalibrowano przy zastosowaniu dwóch standardów dostarczonych przez producenta: standardu 290 mmol/kg (Wescor, Reorder nr OA-010) i standardu 1000 mmol/kg (Wescor, Reorder nr OA-029).

Protokoły te zastosowano w celu oceny ilościowej działania różnych środków stabilizujących na degradację rhIL-2 w wyniku agregacji białka, utleniania metioniny i deamidacji.

P r z y k ł a d 1

Efekty różnych środków rozpuszczających na agregację białka i trwałość rhIL-2 podczas przechowywania

Agregacja białka jest głównym sposobem degradacji rhIL-2 w ciekłych nośnikach przy pH w zakresie od łagodnie kwaśnego do alkalicznego. rhIL-2 w roztworach skomponowanych w tych warunkach pH, przechowywanych w podwyższonych temperaturach, szybko agreguje, co prowadzi do widocznej precypitacji. Widoczne wytrącone białko można usunąć przez filtrację poprzez membranę o szerokości porów 0,2 μm. Pozostałe w roztworze rozpuszczone białko można oznaczyć ilościowo przy zastosowaniu wielu testów analitycznych takich jak RP-HPLC, SEC-HPLC i absorbancja UV. Agregacja daje także w rezultacie zmniejszenie aktywności biologicznej, które można określić opisaną tu metodą testu biologicznego in vitro.

PL 211 866 B1

Stosując opisane tu metody analityczne, trwałość podczas przechowywania rhIL-2 w kilku warunkach monitorowano poprzez zmiany w ilości rozpuszczonej rhIL-2 w funkcji czasu inkubacji w podwyższonych temperaturach.

1.A. Wpływ cukrów i aminokwasów

Wpływ cukrów na trwałość rhIL-2 podczas przechowywania badano dla sorbitolu, sacharozy i mannitolu w preparatach zawierających 0,2 mg/ml rhIL-2, 10 mM roztwór bursztynianu sodu o wartości pH 6 i 270 mM jednego spośród tych cukrów. Ilość rozpuszczonej rhIL-2 pozostałą w próbkach trwałościowych przedstawiono na wykresie w zależności od czasu inkubacji, jak to pokazano w Fig. 1. Krzywe sacharozy i mannitolu nałożone na siebie wskazują, że ich wpływ na trwałość IL-2 podczas przechowywania jest podobny. Krzywa sorbitolu jest niewiele wyższa niż krzywe pozostałych dwóch cukrów, co sugeruje, że sorbitol ma nieco większy wpływ stabilizacyjny niż pozostałe dwa cukry.

Wpływ aminokwasów na trwałość podczas przechowywania pokazano w Fig. 2. Preparaty zawierają 0,1 mg/ml IL-2, 10 mM roztwór bursztynianu sodu o wartości pH 6 i 150 mM jednego spośród dziewięciu wybranych aminokwasów. Jak pokazano w Fig. 2, szereg trwałości jest następujący Arg > Asp > Lys > Met > Asn > Leu = Ser = Pro = Gly.

Stabilizujący wpływ sorbitolu i argininy został potwierdzony w następnych badaniach, które wykazały że trwałość rhIL-2 podczas przechowywania zależy od ich stężenia. Dlatego też, trwałość rhIL-2 podczas przechowywania zwiększa się, gdy zwiększa się stężenie sorbitolu od 50 mM do 150 mM, a na koniec do 270 mM (Fig. 3). Podobnie, trwałość rhIL-2 podczas przechowywania zwiększa się wraz ze zwiększającym się stężeniem argininy w preparacie (Fig. 4).

1.B. Wpływ wartości pH preparatu

Zbadano profile trwałości rhIL-2 podczas przechowywania w zależności od pH w preparatach zawierających NaCl, sorbitol i argininę. Okres półtrwania pozostałej rozpuszczonej IL-2 w temperaturze 50°C przedstawiono na wykresie w zależności od pH w Fig. 5. Okres półtrwania ^½) zdefiniowano jako czas potrzebny do zmniejszenia rozpuszczalności białka w próbkach trwałościowych o 50%. Dłuższy okres półtrwania wskazuje na większą trwałość podczas przechowywania.

Jak pokazano w Fig. 5, optymalna wartość pH do stabilizacji rhIL-2, chroniąca przed agregacją białka, zależy od środka stabilizującego występującego w roztworze. Maksymalna trwałość podczas przechowywania rhIL-2 w NaCl osiąga się przy wartości pH 4, kiedy to okres półtrwania rhIL-2 w temperaturze 50°C wynosi w przybliżeniu 23 dni. rhIL-2 w preparatach sorbitolowych wykazuje zwiększoną trwałość przy zmniejszającej się wartości pH, z maksymalną trwałością występującą przy wartości pH 5, kiedy to okres półtrwania w temperaturze 50°C wynosi około 26 dni. Największa trwałość (tj. najdłuższy okres półtrwania) można osiągnąć, stosując jako środek stabilizujący argininę, w preparacie o wartości pH około 6,0, gdzie w temperaturze 50°C okres półtrwania białka wynosi około 32 dni. Wyniki te sugerują, że arginina jest korzystniejszym środkiem stabilizującym w stosunku do sorbitolu lub NaCl, jako że optymalna dla stabilizacji białka wartość pH występuje w bardziej fizjologicznie dopuszczalnej wartości pH.

1.C. Wpływ układu buforowego

Zastosowanie 10 mM roztworu układu buforowego w preparacie w celu uzyskania właściwej wartości pH i utrzymania pewnej ilości wydajności buforującej jest bardzo częste. Przykładowo, wartość pH preparatu 5,8 można osiągnąć stosując mieszaninę 10 mM roztworu kwasu bursztynowego i jego soli, takiej jak bursztynian sodu. Jeśli wybrano taki układ buforowy w preparacie można stosować jako pierwszorzędowy środek stabilizujący 150 mM chlorowodorku argininy, a nie 150 mM zasadowej argininy, ponieważ 150 mM zasadowej argininy uniemożliwiłoby regulację wartości pH do wartości 5,8 z zastosowaniem 10 mM roztworu buforu.

Jednakże, chlorowodorek argininy zwiększa osmolarność bardziej niż zasadowa arginina. Dlatego też preparat zawierający 150 mM chlorowodorku argininy o pH uregulowanym do 5,8 przy zastosowaniu 10 mM roztworu kwasu bursztynowego i bursztynianu sodu jako buforu, jest zbliżony do izotonicznego, o osmolarności około 253 mmol/kg i okresie półtrwania w temperaturze 50°C około 8 dni (Tablica 1). Pożądane jest większe stężenie argininy w preparacie, jako że trwałość podczas przechowywania zwiększa się wraz ze zwiększeniem stężenia tego środka stabilizującego. Gdy stężenie argininy zwiększa się do

PL 211 886 B1

230 mM przez dodanie argininy HCl i wartość pH reguluje do 5,8, stosując 10 mM roztwór kwasu bursztynowego i bursztynianu sodu jako bufor, okres półtrwania w temperaturze 50°C podwaja się (około 17 dni), w tym momencie roztwór jest hipertoniczny, o osmolarności około 372 mmol/kg.

Gdy jako układ buforujący stosuje się kwas bursztynowy, regulując wartość pH roztworu do 5,8, a zasadowym aminokwasem jest arginina, to zwiększając stężenie zasadowej argininy do 230 mM, uzyskuje się podobne podwojenie okresu półtrwania w temperaturze 50°C, tj. około 16 dni. Jednakże to zwiększenie trwałości podczas przechowywania uzyskuje się poprzez utrzymywanie prawie izotonicznego roztworu, o osmolarności około 271 mmol/kg (patrz Tablica 1). W ten sposób można stosować w preparacie 230 mM zasadowej argininy w celu zwiększenia trwałości rhIL-2 podczas przechowywania bez przekraczania izotoniczności preparatu.

T a b l i c a 1: Osmolarność roztworu i trwałość preparatów rhIL-2 podczas przechowywania. Trwałość podczas przechowywania przedstawiono jako okres półtrwania (ΓΛ) pozostałej rozpuszczonej rhIL-2 zmierzony metodą RP-HPLC po okresie przechowywania w temperaturze 50°C. Preparaty chlorowodorku argininy zawierają 0,5 mg/ml rhIL-2, 1 mM EDTA i 150 mM lub 230 mM chlorowodorku L-argininy i 10 mM roztwór kwasu bursztynowego i bursztynianu sodu w celu uregulowania pH do wartości 5,8. Preparaty zasadowej argininy zawierają 0,5 mg/ml rhIL-2, 1 mM EDTA i 150 mM lub 230 mM zasadowej L-argininy i 81 mM lub 128 mM roztwór kwasu bursztynowego w celu uregulowania wartości pH do 5,8.

Preparat (w całości zawiera 1 mM EDTA przy pH 5,8)	Osmolarność (mmol/kg)	ί¹Λ w temperaturze 50°C (dzień)
150 mM ArgHCl, 10 mM roztwór bursztynian sodu/kwas bursztynowy	253	8,0
150 mM argininy zasadowej 81 mM roztwór kwasu bursztynowego	192	9,9
230 mM ArgHCl 10 mM roztwór bursztynian sodu/kwas bursztynowy	372	16,9
230 mM argininy zasadowej, 128 mM roztwór kwasu bursztynowego	271	16,0

Te dwa sposoby regulowania wartości pH testowano dla innych układów buforów (Tablica 2). Gdy w preparacie zastosowano 150 mM argininy HCl i wartość pH uregulowano do 5,8 przez zastosowanie 10 mM roztworu kwasu i jego soli sodowej, wtedy wszystkie preparaty były poniżej izotoniczności, która wynosi w przybliżeniu 290 mmol/kg. Okres półtrwania rhIL-2 w tych preparatach w temperaturze 50°C był w zakresie od około 15 do około 20 dni. Gdy w preparacie zastosowano 230 mM zasadowa arginina i pH miareczkowano do wartości 5,8 układem buforowym w postaci kwasu nie zawierającego jego soli, wtedy preparaty o pH uregulowanym kwasem cytrynowym lub kwasem bursztynowym wykazały osmolarność roztworu wciąż poniżej izotonicznej, podczas gdy inne preparaty były albo w małym stopniu hipertoniczne, jak w przypadku kwasu fosforowego, lub hipertoniczne, jak w przypadku kwasu glutaminowego lub kwasu octowego. Jednakże, okres półtrwania w temperaturze 50°C wszystkich preparatów wynosił powyżej 30 dni. Dlatego też, stosując jako układ buforujący kwas cytrynowy lub kwas bursztynowy, oba nie zawierające ich soli, można zwiększyć stężenie argininy do 230 mM, stosując zasadową argininę, uzyskując zwiększoną trwałość rhIL-2 podczas przechowywania.

PL 211 866 B1

T a b l i c a 2: Osmolarność roztworu i trwałość podczas przechowywania preparatów rhIL-2. Trwałość podczas przechowywania jest przedstawiona jako okres półtrwania ^½) pozostałej rozpuszczonej rhIL-2 zmierzony metodą RP-HPLC po okresie przechowywania w temperaturze 50°C. Wszystkie preparaty zawierają 0,2 mg/ml rhIL-2, 5 mM metioniny, 1 mM soli disodowej EDTA, 0,1% polisorbatu 80 i 150 mM chlorowodorku L-argininy o wartości pH uregulowanej do 5,8 przy zastosowaniu 10 mM roztworu kwasu i jego soli sodowej lub 230 mM zasadowej L-argininy o wartości pH uregulowanej do wartości 5,8 metodą miareczkowania kwasem nie zawierającym jego soli.

Preparat	Osmolarność (mmol/kg)	ί¹Λ (dzień)
1	2	3
150 mM ArgHCl,	248	20,5
10 mM roztwór cytrynian sodu/kwas cytrynowy 230 mM argininy zasadowej	228	36,1
86 mM roztwór kwasu cytrynowego 150 mM ArgHCl	257	19,1
10 mM roztwór bursztynian sodu/kwas bursztynowy 230 mM argininy zasadowej	285	29,2
128 mM roztwór kwasu bursztynowego 150 mM ArgHCl	260	15,6
10 mM roztwór fosforan sodu/kwas fosforowy 230 mM argininy zasadowej	329	29,9
193 mM roztwór kwasu fosforowego 150 mM ArgHCl	264	14,6
10 mM roztwór glutaminian sodu/kwas glutaminowy 230 mM argininy zasadowej	407	47,5
225 mM roztwór kwasu glutaminowego 150 mM ArgHCl	259	20,8
10 mM roztwór octan sodu/kwas octowy 230 mM argininy zasadowej	408	31,9
250 mM roztwór kwasu octowego

1.D. Wpływ stężenia białka

Wpływ stężenia białka na trwałość podczas przechowywania badano w preparacie zawierającym 10 mM roztworu bursztynianu sodu o wartości pH 6 i 150 mM argininy. Jak pokazano w Fig. 6, w której okres półtrwania rozpuszczonej rhIL-2 w temperaturze 50°C przedstawiono na wykresie w zależności od początkowego stężenia białka, trwałość rhIL-2 podczas przechowywania zwiększa wraz ze zmniejszaniem stężenia białka. Stwierdzenie to jest zgodne z obserwacją doświadczalną, że agregacja jest głównym sposobem degradacji rhIL-2 w ciekłych preparatach.

1.E. Wpływ niejonowego surfaktanta - polisorbatu 80

Wpływ polisorbatu 80 (Tween 80 lub Tw 80) na trwałość rhIL-2 podczas przechowywania badano w preparacie zawierającym 0,5 mg/ml IL-2, 230 mM zasadowej argininy, 128 mM roztwór kwasu bursztynowego o wartości pH 5,8, 1 mM EDTA i 0, 0,02 i 0,1% polisorbatu 80. Jak pokazano w Tablicy 3, oba preparaty zawierające polisorbat 80 wykazują, co zmierzono metodą RP-HPLC, zmniejszenie okresu półtrwania rozpuszczonej IL-2 w temperaturze 50°C, z 16 do około 9 dni. Dlatego też obecność polisorbatu 80 w preparacie, w oparciu wyłącznie o jego wpływ na agregację białka, jest niekorzystna. Jednakże, środek ten ma wpływ stabilizujący, chroniący przed nagłą degradacją białka, związaną

PL 211 886 B1 z zamrażaniem-rozmrażaniem i mechanicznym naprężeniem ścinającym, korzystny podczas obróbki ciekłych preparatów zawierających to białko, jak to ujawniono w przykładach poniżej.

Zbadano także trwałość podczas przechowywania dwóch preparatów na bazie sorbitolu. Chociaż ich okresy półtrwania zmierzone metodą RP-HPLC i aktywność biologiczna były porównywalne do preparatów argininowych, okresy półtrwania zmierzone metodą SEC-HPLC były znacznie krótsze, co sugeruje, że większa część białka rhIL-2 w tych preparatach występuje prawdopodobnie w rozpuszczonych formach zagregowanych.

T a b l i c a 3: Okres półtrwania (1½) lub pozostałość rozpuszczonej rhIL-2 (pik B) zmierzone metodą RP-HPLC, SEC-HPLC i testem biologicznym in vitro w preparatach rhIL-2 przechowywanych w temperaturze 50°C.

1½ w temperaturze 50°C (dzień)

Preparat (w całości o pH 5,8 i 1 mM EDTA)

RP

Aktywność biologiczna

230 mM argininy zasadowej	16,0	21,3	25,6
128 mM roztwór kwasu bursztynowego, pH 5,8 230 mM argininy zasadowej	9,7	12,4	NA
128 mM roztwór kwasu bursztynowego, 0,02% Tw80, pH 5,8 230 mM argininy zasadowej	9,1	12,2	24,5
128 mM roztwór kwasu bursztynowego, 0,1% Tw 80, pH 5,8 270 mM sorbitolu	31,7	3,6	NA
10 mM roztwór bursztynianu sodu, 0,1% Tw 80, pH 4,5 270 mM sorbitolu	14,4	2,4	21,3

mM roztwór bursztynianu sodu, 0,1% Tw 80, pH 5,0

W Tablicy 3, okres półtrwania preparatu rhIL-2 z zasadową argininą i kwasem bursztynowym, zmierzony metodą RP-HPLC jest niewiele krótszy niż zmierzony metodą SEC-HPLC i znacznie krótszy niż zmierzony metodą testu biologicznego in vitro. Oszacowano elucje głównych postaci rhIL-2 metodą SEC-HPLC w celu dalszej oceny różnic. Próbki zarówno potraktowane jak i nie potraktowane SDS, mocznikiem i DTT nie wykazały zmiany w czasie elucji głównych postaci rhIL-2, wskazując że rhIL-2 w tych preparatach była obecna w formach monomerycznych. Jednakże, protokół SEC-HPLC nie umożliwia odróżnienia innych form monomerycznych, np. piku A formy zawierającej utlenioną metioninę od piku B głównych niezmienionych form monomerycznych. Zatem można oczekiwać niewielkich różnic wartości okresu półtrwania w zależności od metody oznaczania.

Test biologiczny in vitro zastosowany w celu określenia aktywności biologicznej, którego dane przedstawiono w Tablicy 3, prowadzono z dodaniem 0,1% SDS do rozcieńczalnika testowego. Dlatego też, przed nałożeniem próbek na płytkę do hodowli tkankowej, w celu reakcji z mysimi komórkami HT-2, próbki rozcieńczono rozcieńczalnikiem testowym, zawierającym 0,1% SDS. Możliwe, że rozcieńczenie SDS mogło spowodować dysocjację w tych próbkach pewnych agregatów rhIL-2 z powrotem do formy monomerycznej, prowadząc w efekcie do zawyżonego oznaczenia aktywności biologicznej danego preparatu. Dlatego też próbki trwałościowe testowano stosując rozcieńczalnik testowy z (+S) i bez (-S) SDS. Próbki badano z (+F) i bez (-F) filtracji przez pory o średnicy 0,2 μm, ponieważ filtracja umożliwia usunięcie dużych agregatów białkowych. Aktywność biologiczną zmierzoną dla próbek potraktowanych w ten sposób pokazano w Tablicy 4 wraz z trwałością podczas przechowywania otrzymaną przy zastosowaniu dla porównania protokołu RP-HPLC. Wartości przedstawiono jako procentową aktywność biologiczną otrzymaną dla podobnych próbek przechowywanych w temperaturze -70°C.

Ogólnie, preparaty rozcieńczane z dodatkiem SDS i nie przesączane przed kontaktem z komórkami HT-2 wykazują większą aktywność biologiczną niż preparaty rozcieńczane bez dodatku SDS w rozcieńczalniku testowym i przesączone przed rozpoczęciem testu. Wartości aktywności biologicznej otrzymane po zastosowaniu filtracji i rozcieńczenia bez dodatku SDS są porównywalne z wartościami uzyskanymi w wyniku zastosowania RP-HPLC. Dlatego też metoda ta jest zalecana w celu wiarygodnego pomiaru aktywności biologicznej monomerycznej rhIL-2.

PL 211 866 B1

T a b l i c a 4: Porównanie wyników uzyskanych dla analizy rozpuszczonej rhIL-2 z zastosowaniem RP-HPLC i aktywności biologicznej in vitro próbek trwałościowych przechowywanych 2 tygodnie w temperaturze 40°C lub 50°C.

Wszystkie wyniki przedstawiono w procentach dla odpowiednich próbek przechowywanych w temperaturze -70°C. Preparaty zawierają 0,5 mg/ml rhIL-2, 230 mM zasadowej L-argininy, 128 mM roztwór kwasu bursztynowego o wartości pH 5,8 i 1 mM EDTA, z (nr 1) i bez (nr 2) 0,1% polisorbatu 80.

Próbki w teście biologicznym przefiltrowano lub nie przez pory o średnicy 0,22 μm przed rozcieńczeniem rozcieńczalnikami z i bez 0,1% SDS.

% aktywności biologicznej % RP

Próbka HPLC (w procentach względem próbki (w procentach względem próbki przechowywanej w -70°C) przechowywanej w -70 C)

	-F+S^a	+F+S^a	-F-S^a	+F-S^ab
Nr 1 w temperaturze 40°C	106	100	104	100	101
Nr 1 w temperaturze 50°C	92	79	60	53	58
Nr 2 w temperaturze 40°C	101	69	106	112	98
Nr 2 w temperaturze 50°C	60	38	62	47	42

a „-F nieprzesączone. „+F przesączone.

„-S rozcieńczalnik bez dodatku SDS i „+S rozcieńczalnik z dodatkiem SDS. b zalecany protokół dla monomerycznej IL-2.

1.F. Kompatybilność środka konserwującego

Kompatybilność środka konserwującego zbadano w celu opracowania preparatu wielodawkowego. Wpływ środków konserwujących na trwałość IL-2 oszacowano w dwóch badaniach przyśpieszonych. W badaniu 1 określano efekt działania alkoholu benzylowego, m-krezolu i fenolu w preparacie zawierającym 0,2 mg/ml IL-2, 10 mM roztwór bursztynianu sodu o wartości pH 6 i 160 mM argininy. W badaniu 2 określano efekt działania chlorku benzeteoniowego, chlorku benzalkoniowego, układu metyloparaben/propyloparben i chlorobutanolu w preparacie zawierającym 0,2 mg/ml IL-2, 230 mM zasadowej L-argininy, 128 mM roztwór kwasu bursztynowego o wartości pH 5,8, 1 mM soli sodowa EDTA, 0,1% polisorbatu 80. Okres półtrwania rozpuszczonej rhIL-2 zmierzony metodą RPHPLC w preparatach przechowywanych w temperaturze 40°C przedstawiono w Tablicy 5.

Wszystkie badane środki konserwujące obniżały trwałość rhIL-2 w podwyższonej temperaturze. W badaniu 1, okres półtrwania rozpuszczonej rhIL-2 wynosił około 74 dni w temperaturze 40°C bez jakiegokolwiek środka konserwującego. Dodanie alkoholu benzylowego, m-krezolu lub fenolu znacznie skracało okres półtrwania, od 5- do 10-krotnie. W badaniu 2, wpływ środków konserwujących był znacznie mniejszy. Okres półtrwania rozpuszczonej rhIL-2 został przez chlorek benzenteniowy skrócony o mniej niż połowę i skrócony ponad dwukrotnie przez inne środki konserwujące. Ogólnie, chlorek benzenteniowy dawał najmniejsze skrócenie trwałości rhIL-2 spośród wszystkich badanych środków konserwujących.

T a b l i c a 5: Okres półtrwania ^½) rozpuszczonej rhIL-2 w temperaturze 40°C w preparatach zawierających środki konserwujące. Badanie 1: Preparaty zawierające 0,2 mg/ml rhIL-2, 10 mM roztwór bursztynianu sodu o wartości pH 6, 150 mM L-argininy i środki konserwujące. Badanie 2: Preparaty zawierające 0,2 mg/ml rhIL-2, 230 mM zasadowej L-argininy, 128 mM roztwór kwasu bursztynowego o wartości pH 5,8, 1 mM soli disodowej EDTA, 0,1% polisorbatu 80 i środki konserwujące.

Środek konserwujący	1½ w temperaturze 40°C (dzień)
1	2
Badanie 1
Bez środka konserwującego	74,0
0,9% (wagowo/objętościowego) alkoholu benzylowego	16,0
0,25% (wagowo/objętościowego) m-krezolu	7,5
0,5% (wagowo/objętościowego) fenolu	11,0

PL 211 886 B1 cd. tablicy 5

2

Badanie 2

Bez środka konserwującego 261,0

0,01% (wagowo/objętościowego) chlorku benzetoniowego 185,0

0,01% (wagowo/objętościowego) chlorku benzalkoniowego 67,0

0,18% (wagowo/objętościowego) metyloparabenu i 113,0

0,02% (wagowo/objętościowego) propyloparabenu

0,5% (wagowo/objętościowego) chlorobutanolu 84,0

Chociaż środki konserwujące wykazywały wpływ destabilizujący na rhIL-2 w podwyższonej temperaturze, zbadano również ich wpływ na krótkoterminową trwałość rhIL-2 podczas przechowywania w temperaturze 4°C lub 25°C. Przeprowadzono nowe doświadczenie w celu zbadania sześciu środków konserwujących w tym samym preparacie zawierającym 0,2 mg/ml rhIL-2, 230 mM zasadowej L-argininy, 128 mM roztwór kwasu bursztynowego, 1 mM EDTA, 5 mM metioniny i 0,1% polisorbatu 80 o wartości pH 5,8. W Tablicy 6 przedstawiono wyniki ilościowe rozpuszczonej rhIL-2 po roku przechowywania. Wszystkie preparaty, w porównaniu z kontrolą, nie wykazują znaczącego spadku poziomu rozpuszczonej rhIL-2 przy badaniu zarówno metodą RP-HPLC, jak i w teście biologicznym in vitro, z wyjątkiem preparatu zawierającego 0,25% m-krezolu, który wykazał wykrywalny spadek poziomu rozpuszczonej rhIL-2.

T a b l i c a 6. Roczną trwałość preparatów zawierających środek konserwujący podczas przechowywania w temperaturze 4°C lub 25°C przedstawiono jako procentową całkowitą pozostałość rozpuszczonej rhIL-2, co zbadano metodą całkowania powierzchni pików RP-HPLC i określenia aktywności biologicznej in vitro.

Preparat kontrolny zawierał 0,2 mg/ml IL-2, 230 mM zasadowej L-argininy, 128 mM roztwór kwasu bursztynowego, 1 mM EDTA, 5 mM metioniny i 0,1% polisorbatu 80 przy pH 5,8.

Środek konserwujący	% ilości początkowej IL-2 zmierzony metodą RP-HPLC	Aktywność biologiczna in vitro (x 10°IU/ml)
4°C	25°C	t=0	rok/4°C	25°C/rok
Kontrola	102	93	3,8	3,3	2,5
0,9% alkoholu benzylowego	100	88	4,8	4,0	5,0
0,25% m-krezolu	98	60	5,8	2,6	2,5
0,5% fenolu	99	87	4,7	3,9	3,2
0,01% chlorku benzalkoniowego	102	93	5,5	3,9	4,4
0,01% chlorku benzetoniowego	98	89	5,4	3,2	4,7
0,5% chlorobutanolu	99	91	5,1	3,6	4,5

P r z y k ł a d 2

Wpływ różnych czynników na utlenianie metioniny i trwałość rhIL-2 podczas przechowywania Utlenianie metioniny w IL-2 opisano już wcześniej w (Kunitani i in. (1986) J. Chromatography

359:391-402; Sasaoki i in. (1989) Chem. Pharm. Bull. 37(8):2160-2164). IL-2 posiada cztery reszty metioniny w pozycjach 23, 39, 36 i 104 w łańcuchu polipeptydowym. Spośród nich, Met¹⁰⁴ występuje na powierzchni białka i jest najbardziej narażona na utlenianie. Te związki utleniające metioninę można oddzielić jako wcześniej wymywane (pik A) niż główne odmiany IL-2 (pik B) z chromatogramu RP23 39

HPLC. Met^{* 23} i Met³⁹ są mniej podatne na utlenianie, które występuje tylko w wyjątkowo utleniających warunkach, prawdopodobnie z uwagi na ich występowanie we wnętrzu cząsteczki białka. Związki utleniające reszt MET można oddzielić jako wcześniej wymywane niż Met¹⁰⁴ na chromatogramie RPHPLC. Met⁴⁶ znajduje się głęboko wewnątrz cząsteczki białka i nie łatwo ją utlenić, jeśli białko całkowicie się nie rozwinie.

PL 211 866 B1

Badanie utleniania metioniny w IL-2 obejmowało przede wszystkim utlenianie Met¹⁰⁴ jako że jest to najbardziej podatna na utlenianie reszta metioniny, a zapobieganie temu utlenianiu obejmuje również zapobieganie utlenianiu innych reszt metioniny.

2.A. Wpływ wartości pH

Utlenianie metioniny badano w zakresie pH od 3 do 9 w preparatach zawierających 0,2 mg/ml IL-2, 150 mM NaCl i 10 mM różnych buforów. Utlenianie metioniny w tych preparatach badano szacując ilościowo zawartość procentową odmian IL-2 tworzących pik A (tj. odmian o utlenionej Met¹⁰⁴) w próbkach IL-2 przy czasie t=0 i t=3 miesięcy. Jak przedstawiono w Tablicy 7 nie zaobserwowano wpływu pH w czasie t=0 z wyjątkiem próbki buforowanej cytrynianem przy pH 6. W porównaniu z innymi próbkami, które stanowią 5% odmian tworzących pik A, próbka cytrynianowa wykazała zwiększenie wysokości piku A do 6%.

Przy t=3 miesięcy, wysokość piku A zwiększa się wraz ze wzrostem pH, co sugeruje katalizowany zasadowo mechanizm utleniania metioniny Met¹⁰⁴ przy pH 6, bursztynian lepiej niż cytrynian ogranicza utlenianie metioniny, jako że obserwowano niższe wartości piku A w preparacie bursztynianowym.

T a b l i c a 7: Analiza RP-HPLC utleniania metioniny, wyrażona w procentach całkowitej ilości rozpuszczonej IL-2 (pik A + pik B) jako pik A związków z utlenioną metioniną (% piku A całkowitej rozpuszczonej IL-2) w próbkach preparatu o pH w zakresie od 3 do pH 9 w czasie t=0 i 3 miesiące.

Preparaty zawierają 0,2 mg/ml IL-2, 150 mM NaCl, a pH uregulowano z zastosowaniem 10 mM roztworów różnych buforów.

piku A całkowitej rozpuszczonej IL-2

Bufor i pH		t=0			t=3 miesiące
		-70°C	4°C	25°C	40°C
10 mM glicyna, pH 3	5		4	5	6	7
10 mM octan, pH 4	5		5	6	7	6
10 mM octan, pH 5	NA		7	8	9	9
10 mM cytrynian, pH 6	6		6	8	12	14
10 mM bursztynian, pH 6	5		6	7	4	9
10 mM fosforan, pH 7	5		7	8	11	5
10 mM boran, pH 9	5		11	15	14	NA

2.B. Wpływ EDTA, polisorbatu 20, polisorbatu 80 i MgCl2

Wpływ środka chelatującego metal, dwóch niejonowych surfaktantów i dwuwartościowego jonu metalu na utlenianie metioniny przedstawiono w Tablicy 8. Obecność polisorbatu 20 lub polisorbatu 80 w preparacie zwiększa poziom związków utleniających metioninę w czasie t=0 i t=1 miesiąc. EDTA i MgCl2 zmniejszają natomiast poziom związków utleniających metioninę po 1 miesiącu przechowywania w temperaturze 40 i 50°C.

T a b l i c a 8: Całkowita ilość rozpuszczonej IL-2 (pik A + pik B) obecna jako pik A związków utleniających metioninę w procentach (% piku A) w próbkach IL-2 w czasie t=0 i t=1 miesiąc. Próbka kontrolna zawiera 0,2 mg/ml IL-2, 10 mM roztwór bursztynianu sodu o wartości pH 6 i 150 mM argininy.

Preparat	% pik A (utlenianie metioniny)
t=0	t=1 miesiąc
-70°C	4°C	40°C	50°C
Kontrola	2,8	3,5	5,1	19,7	36,3
1 mM EDTA	2,5	3,5	5,0	9,5	14,0
0,1% polisorbatu 80	5,8	4,3	6,9	21,5	41,4
1 mM EDTA + 0,1% polisorbatu 80	5,9	4,2	6,9	12,1	19,2
0,1% polisorbatu 20	4,1	5,4	9,6	25,3	42,8
5 mM MgCl2	3,9	4,8	6,9	9,7	12,1

PL 211 886 B1

2.C. Wpływ metioniny

Zbadano wpływ dodatku metioniny do preparatów na zapobieganie utlenianiu metioniny w IL-2. Tablica 9 przedstawia zmianę w piku A i całkowitej ilości rozpuszczonej IL-2 (pik A + pik B) w preparatach zawierających zmienną ilość metioniny po 2 tygodniach przechowywania w temperaturze 50°C. Zwiększenie stężenia metioniny w preparatach powoduje znaczne obniżenie wysokości piku A zarówno w czasie t=0 jak i 2 tygodni, podczas gdy ilość rozpuszczonej IL-2 po 2 tygodniach przechowywania nie zmienia się. Po dodaniu 5 mM metioniny, obserwuje się trzykrotny spadek wysokości piku A w czasie t=2 tygodni. Dlatego też dodanie metioniny daje w rezultacie znaczące zmniejszenie utleniania metioniny białka i ma niewielki wpływ na agregację IL-2.

T a b l i c a 9: Zmiana w piku A i całkowitej ilości rozpuszczonego białka w próbkach IL-2 w czasie t=0 i t=2 tygodnie w temperaturze 50°C. Preparaty zawierają 0,2 mg/ml IL-2, 230 mM argininy, 128 mM roztwór kwasu bursztynowego przy pH 5,8, 1 mM EDTA, 0,1% polisorbatu 80 i od 0 do 10 mM metioniny.

Preparat	% pik A (utlenianie metioniny)	% pozostałości IL-2
t=0	t=2 tygodnie w temperaturze 50°C	t=2 tygodnie w temperaturze 50°C
Brak metioniny	2,1	6,3	76
1 mM metioniny	1,4	2,7	77
5 mM metioniny	1,2	2,1	77
10 mM metioniny	1,2	1,9	76

Oprócz efektów wysokiej temperatury, rejestrowano również poziom utleniania metioniny w preparatach w temperaturze 4°C i 25°C po 3 miesiącach przechowywania z i bez 5 mM metioniny. Jak pokazano w Tablicy 10, obecność w preparacie 5 mM metioniny daje w rezultacie trzykrotne zmniejszenie wysokości piku A zarówno przy temperaturze 4°C i jak i 25°C. Dlatego też, dodanie 5 mM metioniny skutecznie zapobiega utlenianiu Met¹⁰⁴

T a b l i c a 10: Poziom utleniania metioniny wyrażony jako całkowita ilość rozpuszczonej IL-2 (pik A + pik B) w piku A związków utleniających metioninę w procentach (% piku A całkowitej rozpuszczonej IL-2) i pozostałość rozpuszczonej IL-2 w próbkach przechowywanych przez 3 miesiące w temperaturze 4°C lub 25°C w procentach. Preparaty zawierają 0,2 mg/ml IL-2, 230 mM argininy, 128 mM roztwór kwasu bursztynowego przy pH 5,8, 1 mM EDTA, 0,1% polisorbatu 80 i 0 lub 5 mM metioniny.

Preparat	% piku A całkowitej rozpuszczonej IL-2	% pozostałości IL-2 (pik główny)
4°C	25°C	4°C	25°C
0 mM	2,7	4,1	101	97
5 mM	0,8	1,4	101	100

2.D. Wpływ usunięcia tlenu przez przedmuchanie azotem i odgazowanie

Badano wpływ usunięcia tlenu w fiolkach zawierających próbkę IL-2 na zminimalizowanie utlenia₃ nia metioniny. Powietrze z przestrzeni nad 1 ml próbki IL-2, w fiolce o pojemności 3 cm³, usunięto zastępując azotem. Rozpuszczony tlen cząsteczkowy usunięto przez odgazowanie próżniowe. Tablica 11 przedstawia zmianę w piku A i całkowitej ilości rozpuszczonej IL-2 (pik A + pik B) po 1 tygodniu przechowywania w temperaturze 50°C. Samo przepłukiwanie azotem słabo zmniejsza w procentach ilość związków utleniających metioninę z 6,7% do 6,2%. Kombinacja odgazowania roztworu i przepłukiwania azotem przestrzeni nad roztworem zmniejsza wysokość piku A o około jeden punkt procentowy. Z drugiej strony, całkowita ilość w procentach rozpuszczonej IL-2 pozostaje niezmieniona zarówno przy przepłukiwaniu azotem lub odgazowaniu.

PL 211 866 B1

T a b l i c a 11: Zmiana całkowitej ilości rozpuszczonej IL-2 (pik A + pik B) w piku A związków utleniających metioninę w procentach (% piku A) i całkowitej ilości rozpuszczonej IL=2 pozostałej w próbkach przechowywanych w przez czas t=0 i t=1 tydzień w temperaturze 50°C w procentach. Preparaty zawierają 0,3 mg/ml IL-2, 230 mM argininy, 128 mM roztwór kwasu bursztynowego, 1 mM

EDTA i 0,1% polisorbatu 80.

% pik A (utlenianie metioniny) % pozostałości IL-2 ^Preparat t=1 tydzień w tem- t=1 tydzień w temperaturze ^t=0 peraturze 50°C 50°C

Kontrola	3,1	6,7	81
Przepłukiwanie azotem	3,1	6,2	82
Odgazowanie/Przepłukiwanie azotem	3,0	5,8	81

2.E. Wpływ środków konserwujących

Badano wpływ środków konserwujących na utlenianie metioniny. Tablica 12 przedstawia zmianę w piku A dla próbek preparatu z i bez jednego spośród sześciu środków konserwujących po 6 i 12 miesiącach przechowywania w temperaturze 4°C i 25°C. Wszystkie preparaty zawierające środki konserwujące wykazały podobną zmianę wysokości piku A względem kontroli, co wskazuje, że środki konserwujące nie wykazują wykrywalnego wpływu na utlenianie metioniny z wyjątkiem preparatu zawierającego 0,25% m-krezolu, który wykazał znaczący wzrost wysokości piku A.

T a b l i c a 12. Całkowita ilość rozpuszczonej IL-2 (pik A + pik B) w piku A związków utleniających metioninę w procentach (% piku A) w różnych preparatach, zawierających środek konserwujący przechowywanych 6 miesięcy i 12 miesięcy w temperaturze 4°C i 25°C. Preparat kontrolny zawiera 0,2 mg/ml IL-2, 230 mM zasadowej L-argininy, 128 mM roztwór kwasu bursztynowego, 1 mM EDTA, 5 mM metioniny, 0,1% polisorbatu 80, przy pH 5,8.

% pik A (utlenianie metioniny)

Środek konserwujący T=0 6 miesięcy 12 miesięcy

		4°C	25°C	4°C	25°C
Kontrola	1,5	1,6	1,9	1,8	2,6
0,9% alkoholu benzylowego	1,6	1,7	2,3	1,9	3,3
0,25% m-krezolu	1,6	1,8	6,7	2,1	3,5
0,5% fenolu	1,6	1,7	2,4	1,8	3,6
0,01 chlorku benzalkoniowego	1,5	1,6	2,0	1,0	3,0
0,01% chlorku benzetioniowego	1,5	1,7	2,0	1,8	2,8
0,5% chlorobutanolu	1,5	1,6	2,0	1,8	3,2

P r z y k ł a d 3

Wpływ różnych czynników na deamidację IL-2

Deamidacja IL-2 została już wcześniej opisana (Kunitani i in. (1986) J. Chromatography 359:391-402). Stwierdzono, że Asp^SS jest zasadowym miejscem deamidowanym w IL-2 (Sasaoki i in. (1992) Chem. Pharm. Bull. 40(4):976-980). Związki zdeamidowane można wykryć metodą RP-HPLC jako pik (pik B') występujący z tyłu za pikiem głównych związków (pikiem B). Deamidację IL-2 badano w preparatach zawierających argininę, NaCl i sorbitol. Tablica 13 przedstawia, że związki deamidowane można wykryć tylko w preparatach zawierających sorbitol i NaCl, lecz nie w preparatach zawierających argininę, po inkubacji w podwyższonych temperaturach przez 2 tygodnie. Dlatego też, arginina stabilizuje IL-2 chroniąc ją przed degradacją wskutek deamidacji.

PL 211 886 B1

T a b l i c a 13: Deamidacja wykrywana metodą RP-HPLC piku B' związków w preparatach zawierających 0,2 mg/ml IL-2, 10 mM roztwór bursztynianu sodu o wartości pH 6 i 150 mM argininy, 150 mM NaCl lub 270 mM sorbitolu.

Preparat	% pik B' (deamidacja) w czasie t=0 i t=2 tygodnie
T=0	-70°C	40°C	50°C
10 mM roztwór bursztynianu sodu, 150 mM arg, pH 6	0	0	0	0
10 mM roztwór bursztynianu sodu, 150 mM NaCl, pH 6	0	0	0	3
10 mM roztwór bursztynianu sodu, 270 mM sorbitolu, pH 6	0	0	2	2

P r z y k ł a d 4

Wpływ zamrażania-rozmrażania na trwałość IL-2

Wywołane zamrażaniem uszkodzenie białka spowodowane jest zazwyczaj trzema mechanizmami: (1) białko jest konformacyjnie nietrwałe w niskich temperaturach (zimna denaturacja); (2) białko jest wrażliwe na denaturację na powierzchni rozdziału wody i lodu; (3) białko jest uszkadzane w wyniku zmiany w stężeniu soli lub przesunięcia wartości pH po zamarznięciu.

W przypadku IL-2, utrata białka podczas zamrażania-rozmrażania prawdopodobnie spowodowana jest denaturacją i agregacją na powierzchni rozdziału wody i lodu, ponieważ niejonowy surfaktant - polisorbat 80 - skutecznie zabezpiecza IL-2 przed uszkodzeniem spowodowanym zamrażaniemrozmrażaniem. Jak przedstawiono w Fig. 7 ilość rozpuszczonej IL-2 zmniejsza się po każdym cyklu zamrażania-rozmrażania w preparacie zawierającym 0,2 mg/ml IL-2, 10 mM roztwór bursztynianu sodu o wartości pH 6 i 150 mM argininy. Dodanie polisorbatu 80 do preparatu zwiększa trwałość IL-2 w przypadku wielokrotnego zamrażania-rozmrażania. Gdy stężenie polisorbatu 80 osiąga 0,05% i powyżej, iL-2 jest całkowicie zabezpieczona przed uszkodzeniem spowodowanym zamrażaniemrozmrażaniem.

P r z y k ł a d 5

Wpływ mechanicznego naprężenia ścinającego na trwałość IL-2

5.1. Wpływ polisorbatu 80, EDTA, stężenia białka i objętości wypełnienia

Badania prowadzono w celu określenia utraty rozpuszczonej IL-2 wywołanej mechanicznym naprężeniem ścinającym. Oszacowano działanie dwóch typów ścinania: wytrząsania na wytrząsarce Orbital (VWR Scientific, nr kat. 57018-754) i wytrząsania na worteksie (Fisher scientific, model Genie 2, z prędkością obrotów ustawioną na 4). W fiolkach o pojemności 3 cm³ umieszczono różne preparaty IL-2 w objętości 1 ml. Fiolki te przechowywano w chłodziarce (próbki kontrolne), umieszczano na noc na stole laboratoryjnym (próbki statyczne), wytrząsano przy 200 obrotach na minutę przez noc (próbki wytrząsane) lub wytrząsano na worteksie przez jedną minutę (próbki worteksowane). Tablica 14 przedstawia zmianę w ilości rozpuszczonej IL-2 w tych próbkach.

W porównaniu z ochłodzonymi próbkami kontrolnymi, zarówno próbki statyczne jak i próbki wytrząsane nie wykazują utraty IL-2. Dlatego też IL-2 jest trwała w temperaturze otoczenia i odporna na wytrząsanie. Z drugiej strony, gdy preparaty te poddano wytrząsaniu przez jedną minutę na worteksie, wykryto różną ilość utraty białka. Wszystkie preparaty zawierające od 0,1 do 0,5 mg/ml IL-2 lub 1 i 5 mM EDTA lub niskie stężenia polisorbatu 80 (od 0,005 do 0,05%) wykazują 25-50% utratę rozpuszczonej IL-2. Dlatego też, wytrząsanie na worteksie przez 1 minutę było bardziej szkodliwe dla IL-2 niż wytrząsanie przez noc. Utracie IL-2 można zapobiec zwiększając stężenie polisorbatu 80 w preparacie do i powyżej 0,1%. Ponadto, w fiolkach całkowicie wypełnionych, bez powietrza w przestrzeni na roztworem także występuje minimalna utrata rozpuszczonej IL-2 po wytrząsaniu na worteksie przez 1 minutę, wskazując na to że powierzchnia rozdziału powietrzem - ciecz jest głównym czynnikiem wywołującym uszkodzenie.

PL 211 866 B1

T a b l i c a 14: Zmiana w ilości rozpuszczonej IL-2 w próbkach przechowywanych w temperaturze otoczenia przez noc (statyczne), wytrząsanych przy 200 obrotach na minutę przez noc (wytrząsanie) i wytrząsanych na worteksie przez 1 minutę (worteksowanie) w porównaniu z przechowywanymi w temperaturze 4°C. Preparat kontrolny zawierał 0,2 mg/ml IL-2, 10 mM roztwór bursztynianu sodu o wartości pH 6 i 150 mM argininy. Preparat zajmował objętość 1 ml w szklanych fiolkach ₃ o pojemności 3 cm³ z wyjątkiem całkowicie wypełnionej próbki, w której próbka kontrolna wypełniała ₃ całkowicie fiolkę o pojemności 3 cm³, bez wolnej przestrzeni nad roztworem. Rozpuszczalną IL-2 określono ilościowo metodą RP-HPLC.

Próbka (1 ml w fiolce o pojemności 3 cm³)	% pozostałości rozpuszczonej IL-2
Statycznie przez noc Wytrząsanie przez noc	Wytrząsanie na worteksie przez 1 minutę
0,2 mg/ml IL-2 (kontrola)	99,6	100,8	74,7
0,1 mg/ml IL-2	100,3	102,7	72,0
0,5 mg/ml IL-2	99,7	101,0	68,6
1 mM EDTA	97,6	101,2	59,6
5 mM EDTA	99,3	102,7	72,2
0,005% polisorbatu 80	100,6	100,0	46,5
0,01% polisorbatu 80	99,7	100,4	66,1
0,05% polisorbatu 80	99,3	100,3	93,9
0,1% polisorbatu 80	99,2	100,0	89,0
0,2% polisorbatu 80	99,3	99,2	99,8
0,5% polisorbatu 80	99,1	98,4	99,7
1 mM EDTA,	99,6	100,1	99,8
0,1% polisorbatu 80 fiolki cał-	99,4	100,1	96,5
kowicie wypełnione

5.2 Wpływ argininy

Wpływ argininy na trwałość IL-2 chroniący przed uszkodzeniem wywołanym wytrząsaniem na worteksie przedstawiono w Tablicy 15. Zwiększenie stężenia argininy od 150 mM do 230 mM daje w rezultacie 3% zwiększenie ilości rozpuszczonej IL-2 od 65% do 69% po wytrząsaniu na worteksie przez 1 minutę. Dlatego też arginina wykazuje mały wpływ na uszkodzenie IL-2 wywołane ścieraniem chociaż poprzednio wykazano duży wpływ stabilizujący IL-2 chroniący przed degradacją wywołaną tworzeniem agregatów.

Badano wpływ polisorbatu 80 w preparacie 230 mM argininy. Dodanie niskiego stężenia polisorbatu 80 (0,02%) destabilizuje IL-2, a dodanie wysokiego stężenia polisorbatu 80 (0,1%) stabilizuje IL-2, chroniąc przed uszkodzeniem wywołanym wytrząsaniem na worteksie.

T a b l i c a 15: Rozpuszczona w różnych preparatach IL-2 pozostała po wytrząsaniu przez 1 minutę na worteksie, zanalizowany metodą RP-HPLC w procentach

Preparat (w całości zawiera 0,5 mg/ml IL-2, jeżeli nie wskazano inaczej) % pozostałości IL-2

150 mM argininy, 10 mM roztwór bursztynianu sodu, 1 mM EDTA, pH 5,8 65,5

150 mM argininy, 81 mM roztwór kwasu bursztynowego, 1 mM EDTA, pH 5,8 65,3

230 mM argininy, 10 mM roztwór bursztynianu sodu, 1 mM EDTA, pH 5,8 69,0

230 mM argininy, 128 mM roztwór kwasu bursztynowego, 1 mM EDTA, pH 5,8 68,9

230 mM arginina, 128 mM roztwór kwasu bursztynowego, 1 mM EDTA, 0,02% Tw 80, pH 5,8 55,1

230 mM arginina, 128 mM roztwór kwasu bursztynowego, 1 mM EDTA, 0,1% Tw 80, pH 5,8 99,5

PL 211 886 B1

5.3. Badanie odporności na transport

Uszkodzenie IL-2 wywołane ścieraniem podczas transportowania produktu zbadano w warunkach rzeczywistych. IL-2 wytworzono jako preparat argininowy i preparat NaCl, w obu przypadkach ze zmienną ilością polisorbatu 80. Te próbki IL-2 transportowano na lodzie drogą powietrzną z Emeryville w Kalifornia, do St. Louis w Missouri i z St. Louis z powrotem do Emeryville. Fig. 8 przedstawia wynik analizy metodą RP-HPLC ilości rozpuszczonej w tych próbkach IL-2. Bez obecności polisorbatu 80 w preparacie, obserwuje się około 10% utraty IL-2 zarówno w próbkach argininowych i NaCl. Różnice w trwałości pomiędzy preparatem argininowym i preparatem NaCl są nieznaczne, 1%. Obecność polisorbatu 80 w preparacie redukuje utratę IL-2. Przy 0,1% polisorbacie 80, nie obserwuje się utraty IL-2, co wskazuje, że IL-2 przy tym stężeniu surfaktanta została zabezpieczona całkowicie. Dlatego też, 0,1% polisorbat 80 skutecznie zapobiega uszkodzeniu IL-2 w preparacie wywołanym ścieraniem podczas transportowania.

Podsumowując, arginina może służyć jako zasadowy środek stabilizujący w ciekłych preparatach farmaceutycznych zawierających IL-2 podczas długotrwałego przechowywania, zmniejszając agregację i deamidację IL-2. W celu dalszego zwiększenia stężenia argininy w preparacie i osiągnięcia przez to większej trwałości IL-2, przy wciąż zachowanej izotoniczności roztworu, stosuje się korzystnie kwas bursztynowy, miareczkując zasadową argininę do wartości pH 5,8. Ponadto, do preparatu można dodawać metioninę i EDTA, aby zapobiec utlenianiu metioniny białka. Na koniec, do preparatu można dodawać niejonowy surfaktant, taki jak polisorbat 80, aby zapobiec uszkodzeniu IL-2 w wyniku mechanicznego naprężenia ścinającego występującego podczas zamrażania-rozmrażania.

P r z y k ł a d 6

Test skuteczności środka konserwującego

Kilka preparatów zawierających konserwujące środki przeciwbakteryjne poddano testowi efektywności środków konserwujących według Farmakopei amerykańskiej (USP). Wyniki przedstawiono w Tablicy 16. Próbka kontrolna bez środka konserwującego nie spełniła kryteriów testu, podczas gdy wszystkie preparaty zawierające środek konserwujący spełniły kryteria testu.

T a b l i c a 16: Test efektywności środka konserwującego według USP preparatów rhIL-2. Preparat kontrolny zawierał 0,1 mg/ml rhIL-2, 230 mM zasadowej L-argininy, 128 mM roztwór kwasu bursztynowego, 1 mM EDTA, 5 mM metioniny, 0,1% polisorbatu 80, przy pH 5,8.

Środek konserwujący	test USP
Kontrola	wynik negatywny
0,9% alkoholu benzylowego	wynik pozytywny
1,3% alkoholu benzylowego	wynik pozytywny
1,7% alkoholu benzylowego	wynik pozytywny
0,5% chlorobutanolu	wynik pozytywny
0,5% fenolu	wynik pozytywny

P r z y k ł a d 7

Właściwości powodujące ból

W celu oceny właściwości preparatów wywołujących ból, dokładniej ból palący i kłujący, zastosowano model szczurzy opracowany w University of Florida, College of Dentistry, OMSDS Division of Neuroscience. Model ten opiera się na badaniu prądu indukowanego w komórkach czuciowych przenoszących informację bólową. W celu przeprowadzenia testu, wyizolowano w komorze rejestrującej komórki czuciowe (zwój nerwowy korzenia grzbietowego szczura). Wykonano rejestry z poszczególnych komórek uprzednio wybranych w oparciu o kryteria nocyceptywne (indukowanie bólu). Dla badanego preparatu obliczono źródła bólu palącego, bólu kłującego i standaryzowanego. Rezultat palącego bólu określono jako odpowiedź na preparat testowy w stosunku do odpowiedzi na kapsaicynę (500 nM). Kapsaicyna jest dobrze znana ze względu na zdolność wywoływania intensywnego palącego bólu u ludzi (Cooper i in. (1986) Pain 24:93-116). Rezultat bólu kłującego obliczono jako stosunek prądu indukowanego przez preparat testowy do prądu indukowanego przez roztwór buforowany do pH 5,0. Wynik dla bólu standaryzowanego preparatu podano w stosunku do normalnej solanki (0,9%

PL 211 866 B1

NaCl, nie buforowanej), powszechnego środka pozajelitowego stosowanego w szpitalach znanego z wywoływania odczucia kłucia.

W tym modelu analizie poddano ciekły preparat zawierający układ zasadowa L-arginina - kwas bursztynowy. Wyniki tych dwóch roztworów testowych pokazano w Tablicy 17.

W oparciu o wartości obliczone dla bólu palącego, bólu kłującego i bólu standaryzowanego stwierdzono, że preparat zawierający układ L-arginina - kwas bursztynowy wykazywał doskonałe właściwości w porównaniu z normalną solanką. Zaobserwowano także, że prąd testowy zmniejszał się podczas podawania preparatu (zmniejszenie zależne od czasu) podczas gdy nie zmniejszał się w przypadku podawania normalnej solanki. Świadczy to o tym, że ten preparat, co oszacowano przy pomocy tego testu, jest lepiej tolerowany niż solanka.

T a b l i c a 17: Źródła bólu palącego, kłującego i standaryzowanego dla ciekłego preparatu i 0,9% NaCl. Ciekły preparat zawierał 230 mM zasadowej L-argininy, 128 mM roztwór kwasu bursztynowego, 1 mM EDTA, 5 mM metioniny, 0,1% polisorbatu 80, przy pH 5,8.

Preparat	Punktacja bólu palącego	Punktacja bólu kłującego	Punktacja bólu standaryzowanego
0,9% NaCl	0,084±0,006	2,44±0,62	1,73±0,73
Ciekły preparat rhIL-2	0,044±0,019	0,65±0,23	0,16±0,05

P r z y k ł a d 8 przykład porównawczy

Badania trwałościowe z TFPI

Badania trwałościowe i rozpuszczalność TFPI w różnych preparatach wykazały, że L-arginina jest stabilizatorem (dane nie przedstawione) TFPI, a bufory obdarzone ładunkiem takie jak cytrynianowe mają silniejsze działanie rozpuszczające. W tym badaniu testowano wpływ stężenia L-argininy i układu buforującego na trwałość TFPI w różnych preparatach. W szczególności badano wpływ układu buforującego w postaci kwasu nie zawierającego soli w zależności od mieszaniny kwasu i jego soli w sposób przedstawiony dla preparatów IL-2 w powyższych przykładach.

Materiały i metody

Roztwór TFPI przygotowano jako 0,6 mg/ml w 20 mM roztworze cytrynianu sodu i 300 L-argininy o pH 5,5. Roztwór ten był buforem wymienianym metodą dializy w temperaturze 4°C przy zastosowaniu błon Spectral Por nr 7 (MWCO 3,500 Id nr 132-110) na różne preparaty L-argininowe buforowane do pH 6,5 układem buforującym cytrynianowym lub bursztynianowym. Po dializie zmierzono stężenie TFPI każdego roztworu stosując technikę spektroskopii UV/Vis. Każdy roztwór następnie rozcieńczono do 0,15 mg/ml, stosując odpowiedni bufor. Przygotowane roztwory następnie umiesz₃ czono (każda próbka 1 ml) w fiolkach o pojemności 3 cm³ w celu zbadania trwałości podczas przechowywania. Część fiolek pozostawiono do zbadania w tym punkcie jako czas T=0. Resztę fiolek umieszczono w inkubatorze w temperaturze 50°C do przyśpieszonego badania trwałościowego. Punkty czasowe ustalono na 3, 7, 14 i 30 dni. W celu analizy w każdym punkcie czasowym, zawartość każdej fiolki przeniesiono do 1,7 ml probówki do mikrowirowania i wirowano przy 10 K obrotów na minutę przez w przybliżeniu 2 minuty. Odwirowaną, sklarowaną ciecz z próbki pobrano z probówki do analizy przy zastosowaniu techniki IEX-HPLC (potrzebny opis), o której wiadomo z poprzednich badań, że określa trwałość.

Wyniki i ich omówienie

TFPI przygotowano w stężeniu końcowym równym 0,15 mg/ml, w różnych preparatach zawierających zasadową L-argininę lub chlorowodorek L-argininy. Preparaty chlorowodorku L-argininy buforowano do pH 5,5 10 mM roztworem kwasu cytrynowego lub kwasu bursztynowego w połączeniu z ich odpowiednią solą sodową. Preparaty zasadowej L-argininy miareczkowano do pH 5,5 kwasem cytrynowym lub kwasem bursztynowym. Ogółem przeprowadzono osiem badań wyszczególnionych poniżej:

1) 20-150 mM chlorowodorku L-argininy buforowano do pH 5,5 10 mM roztworem kwasu cytrynowego i cytrynianu sodu;

2) 20-150 mM zasadowej L-argininy miareczkowano do pH 5,5 kwasem cytrynowym;

3) 100-300 mM chlorowodorku L-argininy buforowano do pH 5,5 10 mM roztworem kwasu cytrynowego i cytrynianu sodu;

4) 100-300 mM zasadowej L-argininy miareczkowano do pH 5,5 kwasem cytrynowym;

5) 20-150 mM chlorowodorku L-argininy buforowano do pH 5,5 10 mM roztworem kwasu bursztynowego i bursztynianu sodu;

PL 211 886 B1

6) 20-150 mM zasadowej L-argininy miareczkowano do pH 5,5 kwasem bursztynowym;

7) 100-300 mM chlorowodorku L-argininy buforowano do pH 5,5 10 mM roztworem kwasu bursztynowego i bursztynianu sodu; i

8) 100-300 mM zasadowej L-argininy miareczkowano do pH 5,5 kwasem bursztynowym.

Główny sposób degradacji TFPI określono uprzednio jako agregację/wytrącanie (Chen i in.

(1999) J. Pharm. Sci. 88:881-888). Degradację TFPI można śledzić monitorując pozostałe w próbkach trwałościowych rozpuszczone białko. Roztwory TFPI o różnych stężeniach L-argininy do przyśpieszonego badania trwałościowego przechowywano w temperaturze 50°C. Próbki pobierano we wcześniej ustalonych przedziałach czasowych. Białko rozpuszczone w próbkach oddzielono od białka zagregowanego/wytrąconego poprzez odwirowanie w probówkach do mikrowirowania. Ilość rozpuszczonego białka określono metodą IEX-HPLC (Chen i in. (1999) J. Pharm. Sci. 88:881-888). Dane te następnie przedstawiono w funkcji czasu przechowywania w pojedynczym wykładniczym równaniu kinetycznym (Y=YoEXP(-klt) w celu obliczenia okresu półtrwania pozostałego rozpuszczonego białka, stosując program graficzny KaleidaGraph (Synergy Software, Reading Pensylwania).

Okresy półtrwania ^½) wolnego rozpuszczonego TFPI preparatów buforowanych cytrynianem lub cytrynianem sodu przedstawiono w Tablicy 18. Wartości preparatów buforowanych kwasem bursztynowym lub bursztynianem sodu przedstawiono w Tablicy 19. Dane te wskazują, że okres półtrwania w tych preparatach zwiększa się ze zwiększeniem stężenia L-argininy. Dane te przedstawiono na wykresie w Fig. 9 i 10 dla układów buforowych odpowiednio cytrynianowego i bursztynianowego. Okres półtrwania przedstawiono jako krzywą paraboliczną i wzrasta on w funkcji stężenia argininy. Świadczy to o tym, że L-arginina jest stabilizatorem TFPI.

Różnica w trwałości TFPI pomiędzy tymi dwoma układami buforującymi jest zaniedbywalna. Chociaż cytrynianowy układ buforujący wykazywał większą zmienność (Fig. 9), dwie krzywe okresu półtrwania w funkcji stężenia argininy bursztynianowego układu buforującego były w istocie nakładalne (Fig. 10). TFPI osiągał podobną trwałość przy podobnym stężeniu L-argininy, bez względu na to którego układu buforującego użyto w celu uregulowania pH. Fig. 11 także przedstawia porównanie krzywych okresu półtrwania w funkcji stężenia argininy w układzie buforowym kwasu bursztynowego i kwasu cytrynowego. Z tego Fig. wynika, że nie ma większej różnicy w trwałości TFPI, dopóki stężenie argininy w preparacie pozostaje takie samo. Dane te wskazują, że wpływ stabilizujący ma głównie arginina.

Jednakże, miareczkowanie kwasem bursztynowym lub kwasem cytrynowym umożliwia uzyskanie wyższego stężenia argininy w preparacie (a zatem zwiększoną trwałość), zachowując jego izotoniczność. Dlatego też, np. preparat 3-3 jak i preparat 4-3 przedstawione w Tablicy 18, zawierają 300 mM L-argininy i wartości ich okresów półtrwania są podobne. Jednakże, preparat 3-3, w którym użyto 10 mM roztwór kwasu cytrynowego i cytrynianu sodu do zbuforowania 300 mM chlorowodorku L-argininy do pH 5,5 ma osmolarność 497 mOsm/kg. Jest to preparat hipertoniczny i nie jest korzystny jako preparat do wstrzykiwania. Z drugiej strony, w preparacie 4-3 użyto 121 mM roztwór kwasu cytrynowego w połączeniu z 300 mM zasadowej L-argininy w celu uregulowania pH do 5,5 i osmolarność roztworu wynosi 295 mOsm/kg.

Preparat ten jest bardzo zbliżony do roztworu izotonicznego (290 mmol/kg) i dlatego też jest bardziej korzystny do wstrzykiwania. Jeśli zastosowano typowy sposób regulowania pH, np. 10 mM roztwór kwasu cytrynowego i cytrynianu sodu, można dodawać do preparatu trochę ponad 150 mM L-argininy bez utraty izotoniczności. Okres półtrwania 150 mM preparatu L-argininowego (1-6) wynosi 16 dni w porównaniu do 23 dni 300 mM preparatu L-argininowego (4-3). Dlatego też, komponowanie TFPI z podstawą kwasową (tj. podstawą argininową) jako stabilizatorem i buforem zawierającym kwas w zasadzie nie zawierający jego soli (tj. kwas bursztynowy) umożliwia dodanie większej ilości stabilizatora (tj. argininy) w celu zmaksymalizowania stabilizującego wpływu na TFPI.

Wnioski

Przykład ten demonstruje, że L-arginina stabilizuje TFPI przez wydłużenie trwałości podczas przechowywania. Stosując miareczkowanie kwasem, można do preparatu dodać więcej argininy w celu zmaksymalizowania wpływu stabilizującego bez przekraczania izotoniczności, która jest korzystna preparatach do wstrzykiwania.

PL 211 866 B1

T a b l i c a 18: Dane trwałościowe preparatów TFPI arginina-cytrynian przy pH 5,5. Okres półtrwania (1½) otrzymano z danych trwałościowych dla temperatury 50°C przy zastosowaniu pojedynczego kinetycznego równania wykładniczego.

Numer	Preparat	Osmolarność (mmol/kg)	ΓΛ (Dzień)
1-1	20 mM L-Arg HCl, 10 mM roztwór kwas cytrynowy/cytrynian sodu	66	9,4
1-2	40 mM L-Arg HCl, 10 mM roztwór kwas cytrynowy/cytrynian sodu	81	12,6
1-3	60 mM L-Arg HCl, 10 mM roztwór kwas cytrynowy/cytrynian sodu	91	10,7
1-4	80 mM L-Arg HCl, 10 mM roztwór kwas cytrynowy/cytrynian sodu	106	10,9
1-5	100 mM L-Arg HCl, 10 mM roztwór kwas cytrynowy/cytrynian sodu	190	12,5
1-6	150 mM L-Arg HCl, 10 mM roztwór kwas cytrynowy/cytrynian sodu	276	16,0
2-1	20 mM zasadowej L-argininy miareczkowanej 8,9 mM roztworem kwasu cytrynowego	67	5,7
2-2	40 mM zasadowej L-argininy miareczkowanej 17,8 mM roztworem kwasu cytrynowego	84	15,0
2-3	60 mM zasadowej L-argininy miareczkowanej 26,6 mM roztworem kwasu cytrynowego	95	17,0
2-4	80 mM zasadowej L-argininy miareczkowanej 34,2 mM roztworem kwasu cytrynowego	109	14,6
2-5	100 mM zasadowej L-argininy miareczkowanej 42,6 mM roztworem kwasu cytrynowego	119	18,2
2-6	150 mM zasadowej L-argininy miareczkowanej 62,4 mM roztworem	147	20,4
	kwasu cytrynowego
3-1	100 mM L-arg HCl, 10 mM roztwór kwas cytrynowy/cytrynian sodu	239	14,8
3-2	200 mm L-arg HCl, 10 mM roztwór kwas cytrynowy/cytrynian sodu	358	19,6
3-3	300 mM L-arg HCl, 10 mM roztwór kwas cytrynowy/cytrynian sodu	497	21,7
4-1	100 mM zasadowej L-argininy miareczkowanej 42,2 mM roztworem kwasu cytrynowego	155	16,7
4-2	200 mM zasadowej L-argininy miareczkowanej 81,8 mM roztworem kwasu cytrynowego	224	22,5
4-3	300 mM zasadowej L-argininy miareczkowanej 121 mM roztworem kwasu cytrynowego	295	23,3

T a b l i c a 19: Dane trwałościowe preparatów TFPI arginina-bursztynian przy pH 5,5. Okres półtrwania ^½) otrzymano z danych trwałościowych dla temperatury 50°C przy zastosowaniu pojedynczego kinetycznego równania wykładniczego.

Numer	Preparat	Osmolar- ność (mmol/kg)	ΓΛ (dzień)
1	2	3	4
1-1	20 mM L-arg HCl, 10 mM roztwór kwas bursztynowy/bursztynian sodu	66	9,9
1-2	40 mM L-arg HCl, 10 mM roztwór kwas bursztynowy/bursztynian sodu	97	11,5
1-3	60 mM L-arg HCl, 10 mM roztwór kwas bursztynowy/bursztynian sodu	129	15,3
1-4	80 mM L-arg HCl, 10 mM roztwór kwas bursztynowy/bursztynian sodu	163	16,7
1-5	100 mM L-arg HCl, 10 mM roztwór kwas bursztynowy/bursztynian sodu	197	20,5

PL 211 886 B1 cd. tablicy 19

1	2	3	4
1-6	150 mM L-arg HCl, 10 mM roztwór kwas bursztynowy/bursztynian sodu	282	21,9
2-1	20 mM zasadowej L-argininy miareczkowanej 12,5 mM roztworem kwasu bursztynowego	40	6,7
2-2	40 mM zasadowej L-argininy miareczkowanej 25,2 mM roztworem kwasu bursztynowego	62	12,6
2-3	60 mM zasadowej L-argininy miareczkowanej 37,5 mM roztworem kwasu bursztynowego	85	16,4
2-4	80 mM zasadowej L-argininy miareczkowanej 49,9 mM roztworem kwasu bursztynowego	107	19,6
2-5	100 mM zasadowej L-argininy miareczkowanej 62,4 mM roztworem kwasu bursztynowego	129	20,9
2-6	150 mM zasadowej L-argininy miareczkowanej 91,4 mM roztworem kwasu bursztynowego	192	23,1
3-1	100 mM L-arg HCl, 10 mM roztwór kwas bursztynowy/bursztynian sodu	207	16,5
3-2	200 mM L-arg HCl, 10 mM roztwór kwas bursztynowy/bursztynian sodu	353	21,6
3-3	300 mM L-arg HCl, 10 mM roztwór kwas bursztynowy/bursztynian sodu	515	21,7
4-1	100 mM zasadowej L-argininy miareczkowanej 61,3 mM roztworem kwasu bursztynowego	127	17,0
4-2	200 mM zasadowej L-argininy miareczkowanej 122 mM roztworem kwasu bursztynowego	256	21,4
4-3	300 mM zasadowej L-argininy miareczkowanej 180 mM roztworem kwasu bursztynowego	363	22,5

Wszystkie publikacje i zgłoszenia patentowe wymienione w opisie określają stan wiedzy w dziedzinie i wszystkie załącza się tu na zasadzie odsyłaczy w takim samym zakresie, jakby każda poszczególna publikacja lub zgłoszenie patentowe było specyficznie i indywidualnie wskazane jako załączone na zasadzie odsyłacza.

Chociaż powyższy wynalazek opisano w niektórych szczegółach za pomocą ilustracji i przykładów w celu pełniejszego zrozumienia, oczywiste jest, że można zastosować pewne zmiany i modyfikacje w zakresie załączonych zastrzeżeń patentowych.

Claims

1. Stabilizowana ciekła kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera: polipeptyd lub jego odmianę jako składnik terapeutycznie aktywny, w stężeniu od 0,01 mg/ml do 2,0 mg/ml, przy czym wspomniany polipeptyd lub jego odmiana tworzą agregaty w ciekłym preparacie podczas przechowywania, i przy czym polipeptyd ten stanowi interleukina-2 (IL-2), a sekwencja aminokwasów wspomnianej odmiany polipeptydu jest co najmniej w 90% identyczna z interleukiną-2 (IL-2);

zasadowy aminokwas, obejmujący co najmniej jeden aminokwas wybrany z grupy obejmującej argininę, lizynę, kwas asparaginowy i kwas glutaminowy w stężeniu od 100 mM do 400 mM;

i środek buforujący wybrany z grupy obejmującej kwas octowy, kwas bursztynowy, kwas cytrynowy, kwas fosforowy, kwas glutaminowy, kwas maleinowy, kwas jabłkowy, kwas winowy, kwas asparaginowy, przy czym środek buforujący stanowi kwas wolny od jego soli, w stężeniu od 40 mM do 250 mM, przy czym wartość pH kompozycji wynosi od 4,0 do 9,0.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że ma osmolarność od 240 mmol/kg do 360 mmol/kg.

PL 211 866 B1

3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera środek buforujący wybrany z grupy obejmującej kwas octowy, kwas bursztynowy, kwas cytrynowy, kwas fosforowy i kwas glutaminowy.

4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że środkiem buforującym jest kwas bursztynowy.

5. Kompozycja według zastrz. 3 lub 4, znamienna tym, że jako aminokwas zasadowy zawiera argininę w formie wolnej zasady w stężeniu od 100 mM do 400 mM, a kwas bursztynowy występuje w kompozycji w zakresie stężeń od 80 mM do 190 mM.

6. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że zawiera argininę w formie wolnej zasady w stężeniu od 150 mM do 350 mM.

7. Kompozycja według zastrz. 5 albo 6, znamienna tym, że zawiera argininę w formie wolnej zasady, w stężeniu 230 mM i kwas bursztynowy w stężeniu 128 mM.

8. Kompozycja według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 7, znamienna tym, że jako interleukinę-2 (IL-2) zawiera rekombinowaną ludzką interleukinę-2 (rhIL-2) lub jej odmianę.

9. Kompozycja według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 8, znamienna tym, że ma wartość pH od 5,0 do 6,5 oraz osmolarność od 250 mmol/kg do 330 mmol/kg.

10. Kompozycja według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 9, znamienna tym, że zawiera polipeptyd lub jego odmianę zawierającą co najmniej jedną resztę metioniny, która ulega utlenieniu w ciekłym preparacie podczas przechowywania.

11. Kompozycja według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 10, znamienna tym, że ponadto zawiera metioninę przy czym stosunek molowy metioniny dodanej do reszty metioniny z polipeptydu lub jego wariantu wynosi od 1:1 do 1000:1.

12. Kompozycja według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 11, znamienna tym, że ponadto zawiera niejonowy surfaktant w ilości wystarczającej do hamowania agregacji polipeptydu lub jego odmiany w wyniku zamrażania-rozmrażania lub mechanicznego naprężenia ścinającego podczas przechowywania kompozycji.

13. Kompozycja według zastrz. 12, znamienna tym, że jako niejonowy surfaktant zawiera polisorbat 80.

14. Kompozycja według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 13, znamienna tym, że sekwencja aminokwasów odmiany polipeptydu jest co najmniej w 95% identyczna z ludzką IL-2 i zachowuje aktywność biologiczną IL-2.

15. Kompozycja według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 14, znamienna tym, że polipeptyd stanowi IL-2, lub des-alanylo-1, seryno-125 ludzka interleukina-2.

16. Kompozycja według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 15, znamienna tym, że zawiera interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę w stężeniu od 0,02 mg/ml do 1,0 mg/ml.

17. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że zawiera interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę w stężeniu od 0,03 mg/ml do 0,8 mg/ml.

18. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że zawiera interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę w stężeniu od 0,03 mg/ml do 0,5 mg/ml.

19. Stabilizowana ciekła kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę w stężeniu od 0,01 mg/ml do 2,0 mg/ml, przy czym odmiana ma sekwencję aminokwasów co najmniej w 90% identyczną z interleukiną-2 (IL-2), argininę w formie wolnej zasady i kwas bursztynowy wolny od jego soli, przy czym arginina w formie wolnej zasady występuje w kompozycji w stężeniu od 150 mM do

350 mM, a kwas bursztynowy w stężeniu od 80 mM do 190 mM, przy czym wartość pH kompozycji wynosi od 4,0 do 9,0.

20. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że zawiera argininę w formie wolnej zasady w stężeniu 230 mM i kwas bursztynowy w stężeniu 128 mM.

21. Kompozycja według zastrz. 19 albo 20, znamienna tym, że sekwencja aminokwasów odmiany polipeptydu jest co najmniej w 95% identyczna z ludzką IL-2 i zachowuje aktywność biologiczną IL-2.

22. Kompozycja według zastrz. 19 albo 20, znamienna tym, że polipeptyd stanowi IL-2, lub des-alanylo-1, seryno-125 ludzka interleukina-2.

23. Kompozycja według któregokolwiek z zastrz. od 19 do 22, znamienna tym, że zawiera interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę w stężeniu od 0,02 mg/ml do 1,0 mg/ml.

PL 211 886 B1

24. Kompozycja według zastrz. 23, znamienna tym, że zawiera interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę w stężeniu od 0,03 mg/ml do 0,8 mg/ml.

25. Kompozycja według zastrz. 24, znamienna tym, że zawiera interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę w stężeniu od 0,03 mg/ml do 0,5 mg/ml.

26. Sposób zwiększania trwałości polipeptydu lub jego odmiany w ciekłej kompozycji farmaceutycznej, przy czym polipeptyd lub jego odmiana występuje w stężeniu od 0,01 mg/ml do 2,0 mg/ml i tworzy agregaty w ciekłym preparacie podczas przechowywania, przy czym polipeptyd ten stanowi interleukina-2 (IL-2), a sekwencja aminokwasów odmiany polipeptydu jest co najmniej w 90% identyczna z interleukiną-2 (IL-2), znamienny tym, że obejmuje wprowadzenie do kompozycji aminokwasu zasadowego oraz środka buforującego przy czym środek buforujący stanowi kwas wolny od jego soli, i przy czym aminokwas zasadowy obejmuje co najmniej jeden aminokwas wybrany z grupy obejmującej argininę, lizynę, kwas asparaginowy i kwas glutaminowy i występuje w stężeniu od 100 mM do

400 mM i przy czym środek buforujący jest kwasem wolnym od jego soli występującym w stężeniu od 40 mM do 250 mM, wybranym z grupy obejmującej kwas octowy, kwas bursztynowy, kwas cytrynowy, kwas fosforowy, kwas glutaminowy, kwas maleinowy, kwas jabłkowy, kwas winowy, kwas asparaginowy, przy czym wartość pH kompozycji wynosi od 4,0 do 9,0.

27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że stosuje się kompozycję o osmolarności od 240 mmol/kg do 360 mmol/kg.

28. Sposób według zastrz. 25 albo 26, znamienny tym, że stosuje się środek buforujący wybrany z grupy obejmującej kwas octowy, kwas bursztynowy, kwas cytrynowy, kwas fosforowy i kwas glutaminowy.

29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że jako środek buforujący stosuje się kwas bursztynowy.

30. Sposób według któregokolwiek z zastrz. od 26 do 29, znamienny tym, że sekwencja aminokwasów odmiany polipeptydu jest co najmniej w 95% identyczna z ludzką IL-2 i zachowuje aktywność biologiczną IL-2.

31. Sposób według któregokolwiek z zastrz. od 26 do 29, znamienny tym, że polipeptyd stanowi IL-2, lub des-alanylo-1, seryno-125 ludzka interleukina-2 i zachowuje aktywność biologiczną IL-2.

32. Sposób według któregokolwiek z zastrz. od 26 do 31, znamienna tym, że zawiera interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę w stężeniu od 0,02 mg/ml do 1,0 mg/ml.

33. Sposób według zastrz. 32, znamienna tym, że zawiera interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę w stężeniu od 0,03 mg/ml do 0,8 mg/ml.

34. Kompozycja według zastrz. 33, znamienna tym, że zawiera interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę w stężeniu od 0,03 mg/ml do 0,5 mg/ml.

35. Sposób zwiększenia trwałości podczas przechowywania kompozycji farmaceutycznej zawierającej polipeptyd lub jego odmianę w stężeniu od 0,01 mg/ml do 2,0 mg/ml, i polipeptyd lub jego odmiana tworzy agregaty w ciekłym preparacie podczas przechowywania, przy czym polipeptyd ten stanowi interleukina-2 (IL-2), a sekwencja aminokwasów odmiany polipeptydu jest co najmniej w 90% identyczna z interleukiną-2 (IL-2), znamienny tym, że obejmuje wprowadzenie do kompozycji aminokwasu zasadowego oraz środka buforującego, przy czym środek buforujący stanowi kwas wolny od jego soli, przy czym aminokwas zasadowy zawiera co najmniej jeden aminokwas wybrany z grupy obejmującej argininę, lizynę, kwas asparaginowy i kwas glutaminowy i występuje w stężeniu od 100 mM do 400 mM i przy czym środek buforujący jest kwasem wolnym od jego soli występującym w stężeniu od 40 mM do 250 mM, wybranym z grupy obejmującej kwas octowy, kwas bursztynowy, kwas cytrynowy, kwas fosforowy, kwas glutaminowy, kwas maleinowy, kwas jabłkowy, kwas winowy, kwas asparaginowy, a wartość pH kompozycji wynosi od 4,0 do 9,0.

36. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że jako środek buforujący stosuje się kwas bursztynowy.

37. Sposób według zastrz. 35 albo 36, znamienny tym, że sekwencja aminokwasów odmiany polipeptydu jest co najmniej w 95% identyczna z ludzką IL-2 i zachowuje aktywność biologiczną IL-2.

PL 211 866 B1

38. Sposób według zastrz. 35 albo 36, znamienny tym, że polipeptyd stanowi IL-2, lub des-alanylo-1, seryno-125 ludzka interleukina-2.

39. Sposób według któregokolwiek z zastrz. od 35 do 38, znamienny tym, że zawiera interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę w stężeniu od 0,02 mg/ml do 1,0 mg/ml.

40. Sposób według zastrz. 39, znamienny tym, że zawiera interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę w stężeniu od 0,03 mg/ml do 0,8 mg/ml.

41. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że zawiera interleukinę-2 (IL-2) lub jej odmianę w stężeniu od 0,03 mg/ml do 0,5 mg/ml.

42. Sucha postać kompozycji określonej w zastrz. 1 wybrana z grupy obejmującej postać liofilizowaną i postać suszoną rozpyłowo.

43. Sucha postać kompozycji określonej w zastrz. 19 wybrana z grupy obejmującej postać liofilizowaną i postać suszoną rozpyłowo.

44. Preparat do diagnozowania, zapobiegania lub leczenia chorób wrażliwych na leczenie interleukiną-2 (IL-2), który zawiera kompozycję farmaceutyczną określoną w zastrz. 1, przy czym polipeptyd stanowi IL-2, lub des-alanylo-1, seryno-125 ludzka interleukina-2.

45. Preparat do diagnozowania, zapobiegania lub leczenia chorób wrażliwych na leczenie interleukiną-2 (IL-2), który zawiera kompozycję farmaceutyczną określoną w zastrz. 19, przy czym polipeptyd stanowi IL-2, lub des-alanylo-1, seryno-125 ludzka interleukina-2.