CZ20021186A3 - Farmaceutické prostředky obsahující stabilizovaný kapalný polypeptid - Google Patents

Description

Oblast techniky

Přítomný vynález se obecně týká farmaceutických prostředků, obzvláště farmaceutických prostředků obsahujících polypeptidy, které jsou obvykle nestabilní v kapalných farmaceutických prostředcích.

Dosavadní stav techniky

Nedávné pokroky ve vývoji technologie genetického inženýrství poskytly značné množství biologicky aktivních polypeptidu v dostatečně velkých množstvích pro použití jako léčiva. Polypeptidy však mohou ztratit svou biologickou aktivitu v důsledku fyzikálních nestabilit zahrnujících denaturaci a tvorbu rozpustných a nerozpustných agregátů a varietu chemických nestabilit, jako je hydrolýza, oxidace a deaminace. Stabilita polypeptidu v kapalných farmaceutických prostředcích můžejbýt ovlivněna například faktory, jako jsou pH, iontová síla, teplota, opakované cykly zmrazování a rozmrazování a vystavení mechanickým střižným silám, ke kterým dochází v průběhu zpracovávání. Tvorba agregátů a ztráta biologické aktivity může být rovněž důsledkem fyzikálního promíchávání, interakcí polypeptidových molekul v roztoku a na rozhraní kapalina-vzduch ve skladovacích nádobách. K dalším konformačním změnám může dojít v polypeptidech adsorbovaných na rozhraní vzduch-kapalina a pevná látka-kapalina v průběhu komprese a extenze povrchů v důsledku míšení/během transportu a podobně. Takovéto promíchávání může zapříčinit, že se protein svine, agreguje, • · • fc • · · fcfc fcfc « • · · · · ·· fcfc· · 4 • · ···· ·· · ··· fcfc ·· fc· ·· ···· vytváří jednotlivé částice a nakonec se sráží s ostatními adsorbovanými proteiny. Všeobecný přehled stability proteinových farmaceutických prostředků je uveden například v publikacích Manning a kol., Pharm. Res., 5, 903 až 918 (1989) a Wang a Hanson, J. Parenteral Sci. Tech., 42 . S14 (1988) .

Nestabilita kapalných farmaceutických prostředků obsahujících polypeptidy vyústila v balení těchto prostředků v lyofilizovaných formách společně s vhodným kapalným mediem pro rekonstituci. Ačkoliv lyofilizace zlepšuje skladovací stabilitu příslušného prostředku, mnoho polypeptidů vykazuje sníženou aktivitu, buď během skladování v suchém stavu (Pikal, Biopharm., 27, 26 až 30 (1990)) nebo jako důsledek tvorby agregátů nebo ztráty katalytické aktivity při rekonstituci do kapalné formulace (viz například Carpenter a kol., Develop. Biol. Standard 74 , 225 až 239 (1991),

Broadhead a kol., Drug Devel. Ind. Pharm., 18, 1169 až 1206 (1992), Mumenthaler a kol., Pharm. Res., H, 12 až 20 (1994) , Carpenter a Crowe, Cryobiology, 25. 459 až 470 (1988) a Roser, Biopharm., 4, 47 až 53 (1991)). Zatímco použití přídatných přípravků zlepšilo stabilitu vysušených proteinů, mnoho r^hydratovaných formulací stále má nepřijatelné nebo nežádoucí množství inaktivních, agregovaných proteinů (viz například Townsend a DeLuca, J. Pharm. Sci., 80 . 63 až 66 (1983), Hora a kol., Pharm. Res., 8, 33 až 36 (1992), Yoshiaka a kol., Pharm. Res., 15, 687 až 691 (1993)). Rovněž potřeba rekonstituce je nepohodlná a vnáší možnost nesprávného dávkování.

Zatímco mnoho kapalných farmaceutických prostředků bylo formulováno tak, aby stabilizovalo biologickou aktivitu • · • · · 4 4 44 ·· φ • ··· 4 · · · · · · 4 >

• · · 4 · 4 4 · 4 ··· ·· ·· *· ·· ···· obsažených polypeptidu, degradace polypeptidu v kapalných prostředcích stále představuje pro lékaře problémy. Z toho vyplývá, že je potřeba vyvinout další farmaceutické prostředky obsahující fyziologicky přijatelné stabilizační přípravky, které indukují stabilitu polypeptidových složek, čímž udrží jejich léčebnou účinnost.

Podstata vynálezu

Přítomný vynález poskytuje prostředky obsahující polypeptid jako terapeuticky aktivní složku a způsoby používané v jejich přípravě. Tyto prostředky jsou stabilizované kapalné farmaceutické prostředky, které obsahují polypeptid, jehož účinnost jako terapeuticky aktivní složky se obvykle snižuje v průběhu skladování v kapalných prostředcích jako důsledek agregace polypeptidu. Stabilizované kapalné farmaceutické prostředky podle přítomného vynálezu zahrnují, kromě polypeptidu, který vykazuje tvorbu agregátu během skladování v kapalné formulaci, množství aminokyselinové báze dostatečné pro snížení tvorby agregátu polypeptidu v průběhu skladování, a aminokyselinová báze je aminokyselina nebo kombinace aminokyselin, kde jakákoli aminokyselina je přítomna buď ve formě její volné báze nebo ve formě její soli. Prostředky dále obsahují pufrovací přípravek pro uchování pH kapalného prostředku v rozmezí přijatelném pro stabilitu polypeptidu, kde pufrovací přípravek je kyselina v podstatě zbavená své soli, kyselina ve formě své soli nebo směs kyseliny a její soli.

Aminokyselinová báze slouží ke stabilizaci polypeptidu proti formaci jeho agregátů v průběhu skladování kapalného farmaceutického prostředku, zatímco použití kyseliny v • · ·· · * · * · * · ♦ 0 ·

0 0 0 0 0 0 0 · « • 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 · 0 • · 0000 000 ··· ·· ·· 00 00 0000 podstatě očištěné její soli, kyseliny ve formě její soli nebo směsi kyseliny a její soli jako pufrovacího přípravku vede k tomu, že kapalný prostředek má osmolaritu takovou, že je téměř izotonický. Kapalný farmaceutický prostředek může dále obsahovat jiné stabilizační přípravky, konkrétněji methionin, neionický surfaktant, jako je polysorbát 80 a

EDTA, pro další zvýšení stability polypeptidu. Takovéto kapalné farmaceutické prostředky jsou považovány za stabilizované, jelikož přidání aminokyselinové báze v kombinaci s kyselinou v podstatě zbavenou své soli, kyselinou ve formě své soli nebo se směsí kyseliny a její soli, má za následek vznik prostředků, které mají zvýšenou skladovací stabilitu vzhledem ke kapalným farmaceutickým prostředkům formulovaným za nepřítomnosti kombinace těchto dvou složek.

Přítomný vynález dále poskytuje způsoby zvyšování stability polypeptidu v kapalném farmaceutickém prostředku a způsoby zvyšování skladovací stability tohoto farmaceutického prostředku. Zmíněné způsoby zahrnují včlenění určitého množství aminokyselinové báze dostatečného k potlačení, tvorby agregátu polypeptidu v průběhu skladování prostředku a pufrovacího přípravku, kde pufrovací přípravek je kyselina v podstatě zbavená soli, kyselina ve formě soli nebo směs kyselin a jejich solí do kapalného farmaceutického prostředku. Tyto způsoby nalézají použití při přípravě kapalných farmaceutických prostředků podle přítomného vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech to to • · * · ·« ♦ · ·♦·♦ • · ···♦ ····· ·· · • · · · · • · ·· · ·

Obr. 1 znázorňuje procento zbývajícího rozpustného IL2 ve vzorcích stability skladovaných při teplotě 40 °C, při analýze RP-HPLC. Prostředky obsahují 0,2 mg/ml IL-2, 10 mmol sukcinatu sodného o pH 6, a 270 mmol sorbitolu, sacharózy nebo mannitolu.

Obr. 2 znázorňuje procento zbývajícího rozpustného IL2 ve vzorcích stability skladovaných při teplotě 50 °C, při analýze pomocí RP-JíPLC. Prostředky obsahují 0,1 mg/ml IL-2, 10 mmol sukcinatu sodného o pH 6 a 150 mmol různých aminokyselin jak jsou uvedeny na obrázku.

Obr. 3 znázorňuje procento zbývajícího rozpustného IL2 ve vzorcích stability skladovaných při teplotě 40 °C, při analýze RP-HPLC. Prostředky obsahují 0,2 mg/ml IL-2, 10 mmol sukcinatu sodného o pH 6; a 50, 100 nebo 270 mmol sorbitolu.

Obr. 4 znázorňuje procento zbývajícího rozpustného IL-2 ve vzorcích stability skladovaných při teplotě 50 °C, při analýze RP-HPLC. Prostředky obsahují 0,2 mg/ml IL-2, 10 mmol sukcinatu sodného o pH 6; a 50, 100 nebo 150 mmol argininu.

Obr. 5 znázorňuje poločas (t_1/2 ve dnech) zbývajícího rozpustného IL-2 analyzováno pomocí RP-HLCP, jako funkci pH při teplotě 50 °C. Prostředky obsahují 0,2 mg/ml IL-2, 10 mmol pufru (glycin, octan sodný, citrát sodný, sukcinat sodný, fosfát sodný, borát sodný) a 150 mmol NaCI, 270 mmol sorbitolu nebo 150_ř mmol argininu.

Obr. 6 znázorňuje Ln-Ln křivku poločasu (t_1/2) oproti počáteční koncentraci proteinů ve vzorcích stability fe· » * · ·· « · · · * fe · · · » · · · · • · · · · ·· · · · · fe • · fefefe fe fefe fefefe fefe fefe ♦ · ·· ···· skladovaných při 50 °C. Prostředky obsahují 0,1; 0,2 nebo

0,5 mg/ml IL-2 v 4.0 mmol sukcinatu sodného o pH 6 a 150 mmol

L-argininu.

Obr. 7 znázorňuje procento zbývajícího rozpustného IL2, analyzované pomocí RP-HPLC, · ve vzorcích zpracovaných jedním, třemi a pěti cykly zmrazení/rozmražení při teplotách od -70 °C do teploty místnosti. Prostředky obsahují 0,2 mg/ml IL-2, 10 mmol sukcinatu sodného o pH 6, 150 mmol argininu a od 0 do 0,1 % polysorbatu 80.

Obr. 8 znázorňuje procento zbývajícího rozpustného IL2, analyzované pomocí RP-HPLC, ve vzorcích, které byly zaslány na ledu z Emeryvílle v Kalifornii do St. Louis v Missouri a ze St. Louis zpět do Emeryville. Byly použity dva prostředky obsahující různá množství polysorbatu 80: argininový prostředek, obsahující 0,2 mg/ml IL-2 v 10 mmol sukcinatu sodného o pH 6 a 150 mmol argininu; a prostředek s NaCl obsahující 0,2 mg/ml IL-2 v 10 mmol citrátu sodného o pH 6,5 a 200 mmol NaCl.

Obr. 9 znázorňuje poločas (t_1/2, ve dnech) zbývajícího rozpustného TFPI ve čtyřech prostředcích analyzovaných pomocí IEX-HPLC jako funkce koncentrace argininu při 50 °C.

Všechny prostředky obsahují 0,15 mg/ml TFPI a buď Largininovou bázi nebo hydrochlorid L-argininu, pufrované na pH 5,5 buď kyselinou citrónovou nebo 10 mmol kyseliny citrónové a citrátu sodného. Specifické TFPI prostředky obsahovaly:

a) 20 až 150 mmol hydrochloridu L-argininu, 10 mmol kyseliny citrónové a citrátu sodného jako pufru;

— »99 «· ·· ·· 9« ••»••*•••999 ^/ ··········

9*9·· 99 9 9 9 9 φ ····· ·· *9 9 · ·9 9 9

b) 20 až 150 mmol L-argininové báze titrované kyselinou citrónovou;

c) 100 až 300 mmol hydrochloridu L-argininu, 10 mmol kyseliny citrónové a citrátu sodného jako pufru nebo

d) 100 až 300 mmol L-argininové báze titrované kyselinou citrónovou.

Obr. 10 znázorňuje poločas (t_1/2, ve dnech) zbývajícího rozpustného TFPI ve čtyřech prostředcích analyzovaných pomocí IEX-HPLC jako funkce koncentrace argininu při teplotě 50 °C. Všechny prostředky obsahují 0,15 mg/ml TFPI a bud' L-argininovou bázi nebo hydrochlorid L-argininu, pufrované na pH 5,5 buď kyselinou jantarovou nebo 10 mmol kyseliny jantarové a sukcinátu sodného. Specifické prostředky obsahující TFPI zahrnují:

a) 20 až 150 mmol hydrochloridu L-argininu, 10 mmol kyseliny jantarové a sukcinátu sodného jako pufru;

b) 20 až 150 mmol L-argininové báze titrované kyselinou jantarovou;

c) 100 až 300 mmol hydrochloridu L-argininu, 10 mmol kyseliny jantarové a sukcinátu sodného jako pufru; a

d) 100 až 300 mmol L-argininové báze titrované kyselinou j antarovou.

Obr. 11 znázorňuje poločas (t_1/2, ve dnech) zbývajícího rozpustného TFPI ve čtyřech prostředcích analyzovaných pomocí IEX-HPLC jako funkce koncentrace argininu při teplotě 50 °C. Všechny prostředky obsahují 0,15 mg/ml TFPI a buď L-argininovou bázi nebo hydrochlorid L-argininu, pufrované na pH 5,5 buď kyselinou jantarovou nebo s kyselinou citrónovou. Specifické TFPI prostředky obsahují:

9 9 · 9 · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 '99 9 • 9 9 9 9 9 · · 9 9 9 · e * · 9··9 999

9 · 99 9 9 · 9 ·· 9999

a) 20 až 150 mmol L-argininové báze titrované kyselinou citrónovou;

b) 20 až 150 mmol L-argininové báze titrované kyselinou j antarovou;

c) 100 až 300 mmol L-argininové báze titrované kyselinou citrónovou nebe

d) 100 až 300 mmol L-argininové báze titrované kyselinou j antarovou.

Podrobný popis vynálezu

Přítomný vynález je zaměřen na kapalné farmaceutické prostředky obsahující polypeptid jako terapeuticky aktivní složku a způsoby jejich přípravy. Pro účely přítomného vynálezu termín kapalný týkající se farmaceutických prostředků nebo formulaci zahrnuje také pojem vodný.

Termín polypeptid, jak je zde dále užíván, zahrnuje přirozeně se vyskytující (nativní), syntetické a rekombinantní polypeptidy a proteiny a jejich biologicky aktivní varianty, jak jsou kvalifikovány dále. Pojem terapeuticky aktivní složka znamená, že je polypeptid specificky začleněn do prostředku, aby navodil požadovanou léčebnou odpověď týkající se léčby, prevence nebo diagnózy onemocnění nebo chorobného stavu u subjektu, v případě, že je subjektu podán tento farmaceutický prostředek.

Konkrétněji, prostředky přítomného vynálezu jsou stabilizované kapalné farmaceutické prostředky, jejichž terapeuticky aktivní složky zahrnují polypeptid, který obvykle vykazuje tvorbu agregátu v průběhu skladování v kapalných farmaceutických prostředcích. Termín tvorba agregátu znamená fyzikální interakci mezi polypeptidovými

4* ·· ·· · 4 4 4 4

4 · 4 *

4 4 4 · · • 4 4 4 4 •4 44 444· a ·· 4«

4 4 4 · * • 4 4 · ·

4 4 4 *· »

4 · · · · · » * * molekulami, při které dochází k tvorbě oligomerů, které mohou zůstat rozpustné, nebo větších viditelných agregátů, které se vysrážejí z roztoku. Termín během skladování znamená, že kapalný farmaceutický prostředek nebo formulace, která je jednou připravena, není ihned podána subjektu. Namísto toho je po přípravě zabalena k skladování, buď v kapalné formě, vp zmrazeném stavu nebo ve vysušené formě k pozdější rekonstituci do kapalné formy nebo jiné formy vhodné pro podání subjektu. Termín sušená forma znamená, že kapalný farmaceutický prostředek nebo formulace je vysušen buď vysoušením za mrazu (tj. lyofilizací; viz například Williams a Polli, J. Parenteral Sci. Technol., 38, 48 až 59 (1984), vysoušením rozprašováním (viz Masters, Spray-Drying Handbook, 5. edice, Longman Scientific and Technical, Essex, Spojené království, str. 491 až 676 (1991)), Broadhead a kol., Drug Devel. Ind. Pharm., 18.

1169 až 1206 (1992/) a Mumenthaler a kol., Pharm. Res. , 11.

až 20 (1994), nebo vysoušením na vzduchu (Carpenter a Crowe, Cryobiology, 25, 459 až 470 (1988) a Roser, Biopharm, 4, 47 až 53 (1991)). Tvorba agregátů polypeptidu v průběhu skladování kapalného farmaceutického prostředku může nepříznivě ovlivnit biologickou aktivitu zmíněného polypeptidu, s následkem ztráty léčebné účinnosti farmaceutického prostředku. Navíc, tvorba agregátů může zapříčinit další problémy, jako je blokáda kanyl, membrán nebo pump, pokud je farmaceutický prostředek obsahující polypeptid podán ihfuzním systémem.

Stabilizované kapalné farmaceutické prostředky podle přítomného vynálezu dále zahrnují takové množství aminokyselinové báze dostatečné ke snížení tvorby agregátu polypeptidu v průběhu skladování tohoto prostředku. Termín * * ♦ · · · · · · · · ♦ · ♦ ♦· · · · ··♦ · · · * · « · · · ·· ·· ·· ·· ···· aminokyselinová báze vyjadřuje aminokyselinu nebo kombinaci aminokyselin, kde jakákoliv daná aminokyselina je přítomna buď ve formě své volné báze nebo ve formě své soli.

V případě, kdy se použije kombinace aminokyselin, mohou být všechny tyto aminokyseliny přítomny jako volné báze, všechny aminokyseliny mohou být přítomny ve formě své soli, nebo mohou být některé přítomny jako volná baze zatímco ostatní mohou být přítomny ve formě své soli. Aminokyseliny výhodné pro použití pro přípravu prostředků přítomného vynálezu jsou takové, které nesou nabitý vedlejší řetězec, například arginin, lysin, kyselina asparagová a kyselina glutamová.

Jakýkoliv stereoisomer (tj. L, D nebo DL isomer) konkrétní aminokyseliny nebo kombinace stereoisomerů, mohou být přítomny ve farmaceutických prostředcích přítomného vynálezu, a to do té míry, dokud je příslušná aminokyselina přítomna buď ve jako volná báze nebo ve formě své solí. S výhodou se použije L-stereoisomer. Prostředky podle přítomného vynálezu mohou být také formulovány s analogy těchto výhodných aminokyselin. Termín analog aminokyseliny znamená derivát přirozeně se vyskytující aminokyseliny, který vyvolá požadovaný účinek poklesu tvorby agregátu polypeptidu v průběhu skladování kapalných farmaceutických prostředků podle přítomného vynálezu. Vhodná analoga argininu zahrnují, například, aminoguanidin a N-monoethyl-L-arginin. Stejně jako v případě výhodných aminokyselin, se analoga aminokyselin inkorporují do prostředků, buď jako volné báze nebo ve formě své soli.

V případě kombinace s aminokyselinovou bází, jak je zde definováno, obsahují stabilizované kapalné farmaceutické prostředky podle přítomného vynálezu dále kyselinu v podstatě zbavenou své soli, kyselinu ve formě své soli nebo ♦ *· ·· ·· · · · · • · ♦ * · · to t · t · to • •««••to toto to • toto··· toto · · · · · to · tto·· ··· ··· ·* ·« ·· ·· ···· směs kyseliny a je,j£ soli, a to za účelem- udržení určitého pH roztoku. S výhodou je pH udržováno pomocí aminokyselinové báze v kombinaci s kyselinou v podstatě zbavenou její soli.

Taková kombinace má nižší osmolaritu roztoku než v případě, kdy se použije jako pufrovací přípravek kyselina a její sůl v kombinaci s aminokyselinovou bázi, toto vše za účelem formulace stabilizovaného farmaceutického prostředku.

Výhodou této kombinace je, že lze do farmaceutického prostředku bez přílišného překročení izotonicity roztoku začlenit vyšší koncentraci stabilizátoru, tedy aminokyselinovou bázi, do. Termín kyselina v podstatě zbavená své soli znamená, že kyselina fungující jako pufrovací přípravek je uvnitř kapalného farmaceutického prostředku přítomna v nepřítomnosti jakýchkoliv svých forem soli. Obvykle, pokud se ve farmaceutickém prostředku použije pufr zahrnující kyselinu, připraví se pomocí soli kyseliny nebo kombinací kyseliny a soli kyseliny. Například je tedy pufr připraven za použití kyseliny s jejím protějškem, jako je sodík, draslík, amonium, vápník nebo hořčík. Proto se obvykle sukcinatový pufr skládá ze soli jantarové kyseliny, jako je sukcinát sodný, nebo směsi jantarové kyseliny a sukcinatu sodného. Ačkoliv kyselina použitá jako pufrovací přípravek ve stabilizovaných kapalných prostředcích podle přítomného vynálezu může být ve formě soli příslušné kyseliny nebo směsi kyseliny a její soli, kyselina je s výhodou fungující jako pufrovací přípravek pouze ve formě čisté kyseliny. Kyseliny vhodné k použití pro formulování stabilizovaných kapalných prostředků obsahujících polypeptid podle přítomného vynálezu zahrnují, avšak nejsou limitovány na, kyselinu jantarovou, kyselinu citrónovou, kyselinu fosforečnou, kyselinu glutamovou, kyselinu maleinovou, kyselinu jablečnou, kyselinu octovou, kyselinu vinnou a * ·· 9· 99 ·4 ♦ ·♦ * · 9 9 · » «4 » * · · · · · * · · « • 9*199 19 991 · 9 · 9 9 11 111

111 99 9 1 9 1 11 1111 kyselinu asparagovou; výhodněji zahrnují kyselinu jantarovou a kyselinu citrónqvou, nejvýhodněji zahrnují kyselinu j antarovou.

Kapalné farmaceutické prostředky obsahujících polypeptid podle přítomného vynálezu jsou stabilizované prostředky. Termín stabilizovaný znamená, že kapalné prostředky mají zvýšenou skladovací stabilitu při porovnání s prostředky připravenými v nepřítomnosti kombinace aminokyselinové báze a pufrovacího přípravku, jak je zde popisováno. Tato zvýšená skladovací stabilita se pozoruje u kapalného prostředku, at skladované přímo v této formě pro pozdější použití, nebo ve zmrazeném stavu a rozmražené před použitím, nebo připravené ve vysušené formě, jako je lyofilizovaná, vzduchem vysušená nebo rozprašováním vysušená forma, pro pozdější rekonstituci na kapalnou nebo jinou formu těsně před použitím. Prostředky podle přítomného vynálezu se s výhodou skladují přímo v jejich kapalné formě, čímž se plně využije výhody zvýšené skladovací stability v kapalné formě, pohodlí při podávání bez rekonstituce a možnosti dodání prostředku v předem naplněných, k okamžitému použití', připravených stříkačkách nebo vícedávkových přípravcích, pokud je prostředek kompatibilní s bakteriostatickými činidly.

V prostředcích podle přítomného vynálezu je využito zjištění, že přidání aminokyseliny argininu, lysinu, kyseliny asparagové nebo kyseliny glutamové jako volné báze nebo ve formě soli v kombinaci s kyselinou v podstatě zbavenou její soli, kyselinou ve formě soli nebo směsi kyseliny a její soli, má za následek vznik kapalného farmaceutického prostředku obsahujícího polypeptid, který má

9· 44 ** 94 94 • 4 · 4 · 4 *444

4 9 4 4 «9 9

4 · 4 « «4 4 4 4 « « • 44*4 499

444 ·4 »· ·· 4« 9999 zvýšenou skladovací stabilitu; ve srovnání s kapalným farmaceutickým prostředkem obsahujícím polypeptid připraveným bez kombinace těchto dvou složek. Zvýšená skladovací stabilita prostředku je dosažena pomocí vlivu aminokyseliny na stabilitu terapeuticky aktivního polypeptidu, zvláště jejího vlivu na agregaci polypeptidu v průběhu skladování v kapalných prostředcích. Navíc, včlenění aminokyselinově báze, jak je zde definováno, a kyseliny v podstatě zbavené její soli do kapalných polypeptid obsahujících prostředků, vede ke vzniku kapalných farmaceutických prostředků, které jsou téměř izotonické, aniž by bylo nutné začlenění dalších izotonizujících činidel, jako je qhlorid sodný. Termín téměř izotonický znamená takový kapalný prostředek, který má osmolaritu přibližně od 240 mmol/kg do asi 360 mmol/kg, s výhodou přibližně od 240 mmol/kg do asi 340 mmol/kg, výhodněji přibližně od asi 250 mmol/kg do asi 330 mmol/kg, ještě výhodněji přibližně od asi 260 mmol/kg do asi 320 mmol/kg, a nejvýhodněji přibližně od asi 270 mmol/kg do asi 310 mmol/kg.

Aminokyselinová báze včleněná do stabilizovaných farmaceutických kapalných prostředků podle přítomného vynálezu ochraňuje terapeuticky aktivní polypeptid před agregací, čímž zvyšuje stabilitu polypeptidu během skladování prostředku. Termín zvyšování stability znamená, že tvorba agregátu polypeptidu v průběhu skladování kapalného farmaceutického prostředku je nižší než tvorba agregátu polypeptidu v průběhu skladování v nepřítomnosti tohoto jednotlivého stabilizujícího činidla. Ke snížené tvorbě agregátu pomocí přidání aminokyselinové báze dochází způsobem závislým na koncentraci. To znamená, že zvyšující *· ·· ·· ·· fcfc • · fcfcfcfc fcfcfcfc ♦ ♦♦·♦· fcfc 9 • fcfc fcfc fcfc fcfc· · fc • fcfcfcfc fcfc· • fcfc ·« «· fc· fcfcfcfc se koncentrace aminokyselinové báze vede ke zvýšení stability polypeptidu v kapalném farmaceutickém prostředku, v případě, kdy tento polypeptid obvykle vykazuje tvorbu agregátu během skladování v kapalné formulaci za nepřítomnosti cřminokyselinové báze. Stanovení množství Λ každé jednotlivé aminokyselinové báze, které má být přidáno do kapalného farmaceutického prostředku za účelem snížení tvorby agregátu a tedy pro zvýšení stability polypeptidu, a tudíž zvýšení skladovací stability prostředku,, může být snadno určeno pro každý jednotlivý polypeptid, aniž by bylo nutné provádět neobvyklé experimenty, za použití postupů, které jsou odborníkovi v oboru známé.

Proto například účinek konkrétní aminokyselinové báze na agregaci polypeptidu v průběhu skladováni v kapalném prostředku, může být snadno stanoven měřením změny rozpustného polypeptidu v roztoku v čase. Množství rozpustného polypeptidu v roztoku může být kvantifikováno různými analytickými zkouškami adaptovanými na detekci příslušného polypeptidu. Takové zkoušky zahrnují například chromatografii s reverzní fází (RP)-HLCP, chromatografii metodou vylučování dle velikosti (SEC)-HLCP a absorbanci UV záření; jak jsou popsány níže uvedených příkladech. Pokud příslušný polypeptid vytváří v průběhu skladování v kapalných prostředků oba - jak rozpustné, tak nerozpustné agregáty, může být k rozlišení poměrné části rozpustného polypeptidu, který je přítomen jako rozpustné agregáty a poměrné části která je přítomna v neagregované, biologicky aktivní molekulární formě, jak je popsáno v příkladu 1, použita kombinace RP-HPLC a SEC-HPLC.

• · »9 ·» 99 «9 9999 9999

99 99 99 9 •999999 999 9 9

9 99 9 9 99

999 ·9 99 ·9 99 9999

V případě agregace bude účinné množství aminokyselinové báze, které má být začleněno do kapalného farmaceutického prostředku obsahujícího polypeptid za účelem zisku stabilizovaného farmaceutického prostředku <

podle přítomného vynálezu, posuzováno jako takové množství, které vede ke snížení tvorby agregátu v čase, čímž navozuje vyšší retenci rozpustného polypeptidů v roztoku v jeho neagregované, biologicky aktivní molekulární formě. Z toho vyplývá, že například v případě, kdy je polypeptid monomerní protein, jako je například interleukin-2 (IL-2) nebo inhibitor působení tkáňového faktoru (TFPI) popsaný níže v příkladech, bude účinné množství stabilizujícího činidla pro použití v přípravě stabilizovaného prostředku podle přítomného vynálezu takové množství, které má za výsledek vyšší retenci IL-2 nebo TFPI ve své mnonomerní molekulární formě.

Zvýšená skladovací stabilita stabilizovaných kapalných prostředků obsahujících polypeptid podle přítomného vynálezu mohou též během skladování vykazovat inhibiční účinky aminokyselinové báze na deamidaci glutaminových a/nebo asparagových zbytků uvnitř terapeuticky aktivního polypeptidů. Účinek jednotlivé aminokyselinové báze na deamidaci příslušných zbytků v průběhu skladování v kapalném prostředku může být snadno určen monitorováním množství polypeptidů přítomného v jeho deaminované formě v čase.

Postupy pro měření molekulárních druhů, tj. nativního nebo deamidováného, konkrétního polypeptidů přítomného v kapalné fázi, jsou všeobecně v oboru známy. Takovéto postupy zahrnují chromatografickou separaci molekplárních druhů a identifikaci pomocí standardů molekulární hmotnosti, «to » to ♦ * toto ► to » to ··· • · • to ·» ► ·· · > to · i · to i · to •to ··*· například prostřednictvím RP-HPLC, jak je popsáno v příkladech uvedených níže.

Použití nové kombinace aminokyselinové báze pufrované kyselinou v podstatě zbavenou své soli pro zvýšení stability polypeptidu ve stabilizovaných kapalných farmaceutických prostředcích podle vynálezu poskytuje výhody oproti například použití aminokyseliny v pufrovacím systému kyseliny jantarové a sukcinátu sodného. Tato nová kombinace umožňuje přípravu téměř izotonických formulací, které mají vyšší koncentraci stabilizující aminokyseliny, než může být dosaženo použitím pufrovacího systému, který je směsí kyseliny a její soli. Vyšší koncentrace stabilizující aminokyseliny umožňuje dokonce větší zvýšení stability polypeptidu, a tím zvýšenou skladovací stabilitu prostředku.

Pokud je například použita kyselina jantarová pro pufrování argininově báze přidané do kapalného prostředku obsahující protein interleukin-2 (IL-2) a mající optimální pH pro tento protein (pH = 5,8), může být koncentrace argininu zvýšena na 230 mmol, zatímco je stále zachována izotonicita prostředku. Tímto se dosáhne zdvojnásobení skladovací doby IL-2 při teplotě 50 °C, která je měřítkem proteinové stability.

Ačkoliv podobné skladovací doby IL-2 může být dosaženo prostřednictvím stejné koncentrace argininu a směsi kyseliny jantarové a sukcinátu sodného jako pufrovacího přípravku, musí být arginin, aby bylo dosaženo obdobného pH, přidán ve své kyselé formě, a výsledný prostředek je hypertonický (viz příklad 1, tabulka 1).

e ♦ · ·· «9 ·* ··

0*0 · 0 00 9 9 99 9 • 0 » f99« 9« 9 » ·0· 0· 00 «00 0 0 0 0 0909 999

090 99 9« «9 90 9909

Podobně, pokud se pro pufrování argininovou bází přidané ke kapalné; formulaci obsahující inhibitor působení tkáňového faktoru (TFPI) a mající pH vhodné pro tento protein (pH 5,5) použije kyselina citrónová, může být koncentrace argininu zvýšena na 300 mmol, zatímco je stále udržována izotonicita prostředku. Tímto se dosáhne téměř 50% vzestupu skladovací doby TFPI při 50 °C. Ačkoliv podobné skladovací doby TFPI může být dosaženo použitím stejné koncentrace argininu a směsi kyseliny citrónové a „citrátu sodného jako pufrovacího přípravku, musí být pro dosažení podobného pH arginin přidán ve své kyselé formě, a výsledný prostředek je hypertonický (viz příklad 8, tabulka 18).

Možnost použít vyšší koncentrace aminokyselin jako primárních stabilizujících činidel eliminuje potřebu tradičnějších stabilizátorů polypeptidů, jako je hovězí sérový albumin nebo lidský sérový albumin, které jsou méně žádoucími stabilizujícími činidly kvůli možné virové kontaminaci.

Izotonicita kapalných farmaceutických prostředků je navíc žádoucí, protože redukuje bolest během podávání a minimalizuje možné- hemolytické účinky spojené s hypertonickými nebo hypotonickými prostředky. Z toho vyplývá, že stabilizované prostředky podle přítomného vynálezu nejenom že mají vyšší skladovací stabilitu, ale jsou též výhodné v tom smyslu, že podstatně snižují bolest v průběhu podávání při porovnání s prostředky, které používají tradičnější pufrovací systémy sestávající z kyseliny a její soli. Například, v jednom provedení přítomného vynálezu, vykazuje stabilizovaný kapalný farmaceutický prostředek při injekčním podání nižší aplikační bolestivost spojenou • 4 w w

9 9 «» • 4 4 4 • 4

9 9 * • 4 4 ·

9· 4· • 4 44

4 4 4

4 4

4 4

4 4

4494 s pálením a bodáním, ve srovnání s injekcí normálního fyziologického roztoku (viz příklad 7).

Poté co byly/ identifikovány výhody přípravy kapalných polypeptidových prostředků podle přítomného vynálezu obsahující aminokyselinovou bázi jako primární stabilizační činidlo a kyselinu v podstatě zbavenou její soli jako pufrující přípravek, je v možnostech odborníka oboru stanovit bez nevhodných pokusů, výhodné koncentrace -každé z těchto složek pro začlenění do kapalného farmaceutického prostředku obsahujícího příslušný terapeuticky aktivní polypeptid, který vykazuje tvorbu agregátu, jak je zde popsáno, za účelem zvýšení stability polypeptidu v průběhu i

skladování tohoto prostředku. Při následování popsaných protokolů, například níže v příkladu 1, může kvalifikovaný odborník v oboru stanovit rozmezí vhodných koncentrací aminokyselinové báze a různých pufrovacích kyselin pro použití ve zde popisovaných kapalných farmaceutických prostředcích. Množství aminokyselinové báze začleněné do prostředku je s výhodou v rozmezí koncentrace přibližně od 100 mmol do asi 400 mmol, výhodněji přibližně od 130 mmol do asi 375 mmol, ještě výhodněji přibližně od 150 do asi 350 mmol, ještě výhodněji přibližně od 175 mmol do asi 325 mmol, mnohem výhodněji přibližně od 180 mmol do asi 300 mmol, ještě mnohem výhodněji přibližně od 190 mmol do 280 mmol, a nejvýhodněji přibližně od 200 mmol do asi 260 mmol, v závislosti na proteinu přítomném v prostředku. Ačkoliv pufrovací přípravek může být kyselina ve formě solí nebo směs kyseliny a její soli, je pufrovací přípravek s výhodou kyselina v podstatě zbavená její soli, a to z výhodných důvodů zde popsaných. Kyselina použitá jako pufrovací přípravek se s výhodou přidá v koncentračním • fcfcfc · fc · fc · ·· · • fcfc · fc fcfcfc ·· *· · · · · · fc · · · · · fcfcfc • fcfc fcfc fcfc fcfc fc· fcfcfc· rozmezí od přibližně 40 mmol do asi 250 mmol, od přibližně mmol do asi 240 mmol, od přibližně 60 mmol do asi 230 mmol, od přibližně 70 mmol do asi 220 mmol, výhodněji od přibližně 80 mmol do asi 210 mmol, nejvýhodnějí od 90 mmol do asi 200 mmol, v závislosti na kyselině použité jako pufrovací přípravek a optimálním pH pro polypeptid, který se stabilizuje proti tvorbě agregátu.

V jednom provedení je aminokyselinovou bází argininová báze přítomná v koncentraci přibližně 230 mmol a kyselinou použitou jako pufrovací přípravek je kyselina jantarová v koncentraci přibližně 128 mmol. Toto umožňuje přípravu kapalného polypeptid obsahujícího farmaceutického prostředku, který má osmolaritu téměř izotonickou a pH přibližně 5,8. V jiném provedení je aminokyselinovou bází argininová báze přítomná v koncentraci přibližně 300 mmol a kyselinou použitou jako pufrovací činidlo je kyselina citrónová v koncentraci přibližně 120 mmol. Toto umožňuje přípravu kapalného polypeptid obsahujícího farmaceutického prostředku, který má osmolaritu téměř izotonickou a pH přibližně 5,5. V ještě dalším provedení je aminokyselinovou bází argininová báze přítomná v koncentraci přibližně 200 mmol až asi 300 mmol a kyselinou použitou jako pufrovací přípravek je kyselina jantarová v koncentraci přibližně 120 mmol až asi 180 mmol. Toto umožňuje přípravu kapalného polypeptid obsahujícího farmaceutického prostředku, který má osmolaritu od přibližně 256 mmol/kg až asi 363 mmol/kg a pH přibližně 5,5.

Proto v dalším provedení přítomného vynálezu obsahuje stabilizovaný kapalný farmaceutický prostředek IL-2 nebo jeho variantu jako polypeptid, argininovou bázi fc β* fc · ' · · • fcfc · • ·· te ·* fcfcfc · • > ·· • » · » · « fcfc · fcfc • 9 *» • · fc · * · · fcfcfc • fc· •fc fc»·· v koncentraci přibližně od 150 mmol do přibližně 350 mmol a kyselinu jantarovou v koncentraci od přibližně 80 mmol do asi 190 mmol. Ve výhodném provedení přítomného vynálezu, je argininová báze přítomna v kapalném farmaceutickém prostředku obsahujícím IL-2 v koncentraci přibližně 230 mmol a kyselina jantarová je přítomna v koncentraci přibližně 128 mmol. Tento výhodný prostředek obsahující IL-2 má pH přibližně 5,8 a osmolaritu od přibližně 250 mmol/kg do asi 330 mmol/kg. Koncentrace IL-2 nebo jeho varianty v těchto prostředcích je od přibližně 0,01 mg/ml do asi 2,0 mg/ml, s výhodou od přibližně 0,02 mg/ml do asi 1,0 mg/ml, výhodněji od přibližně 0,03 mg/ml do asi 0,8 mg/ml, nejvýhodněji od přibližně 0,03 mg/ml do asi 0,5 mg/ml.

V dalším provedení přítomného vynálezu, obsahuje stabilizovaný kapalný farmaceutický prostředek TFPI nebo i

jeho variantu jako, polypeptid, argininovou bázi v koncentraci přibližně od 100 mmol do přibližně 400 mmol a kyselinu jantarovou v koncentraci od přibližně 80 mmol do asi 190 mmol. Ve výhodném provedení je argininová báze přítomna v kapalném farmaceutickém prostředku obsahujícím TFPI v koncentraci od přibližně 200 mmol do asi 300 mmol a kyselina jantarová je přítomna v koncentraci od přibližně 120 mmol do asi 180 mmol. Tento výhodný prostředek obsahující TFPI má pH přibližně 5,5 a osmolaritu od přibližně 240 mmol/kg do asi 360 mmol/kg. Koncentrace TFPI nebo jeho varianty, v těchto prostředcích je od přibližně 0,01 mg/ml do asi 5,0 mg/ml, s výhodou od přibližně 0,05 mg/ml do asi 2,0 mg/ml, výhodněji od přibližně 0,10 mg/ml do asi 1,0.mg/ml, nejvýhodněji od přibližně 0,10 mg/ml do asi 0,60 mg/ml.

·« • · β · ·«· · ·· » · * · » · ?· • · · · · • · · · ·« ·· «* 09 • · · · > · * • · · • · · «4 ·<·’

V dalším provedení přítomného vynálezu, obsahuje stabilizovaný kapalný farmaceutický prostředek TFPI nebo . jeho variantu jako polypeptid, argininovou bázi, v koncentraci přibližně od 175 mmol do přibližně 400 mmol a kyselinu citrónovou v koncentraci od přibližně 40 mmol do asi 200 mmol. Ve výhodném provedení je argininová báze přítomna v kapalném farmaceutickém prostředku obsahujícím TFPI v koncentraci od přibližně 250 mmol do asi

350 mmol a kyselina citrónová je přítomna v koncentraci qd přibližně 100 mmol do asi 150 mmol. Tento výhodný prostředek s TFPI má pH přibližně 5,0 až 6,5 a osmolaritu od přibližně

240 mmol/kg do asi 360 mmol/kg. V dalším provedení vynálezu je argininová báze přítomna v koncentraci přibližně 300 mmol a kyselina citrónová je přítomna v koncentraci přibližně 120 mmol. Tento prostředek obsahující TFPI má pH přibližně 5,5 a osmolaritu od přibližně 240 mmol/kg do asi 360 mmol/kg.

Koncentrace TFPI nebo jeho varianty v těchto prostředcích je od přibližně 0,01 mg/ml do asi 5,0 mg/ml, s výhodou od ř přibližně 0,05 mg/ml do asi 2,0 mg/ml, výhodněji od přibližně 0,10 mg/ml do asi 1,0 mg/ml, nejvýhodněji od přibližně 0,10 mg/ml do asi 0,60 mg/ml.

Jak je ilustrováno v níže uvedených příkladech, ovlivňuje pH kapalného farmaceutického prostředku obsahujícího polypeptid stabilitu příslušného polypeptidu v něm obsaženého, a to primárně prostřednictvím účinku pH na tvorbu polypeptidového agregátu. Z toho vyplývá, že množství pufrující kyseliny přítomné ve farmaceutických prostředcích podle přítomného vynálezu se bude měnit v závislosti na pH optimálním pro stabilitu každého příslušného polypeptidu. Stanovení optimálního pH může být provedeno pomocí způsobů v oboru všeobecně známých, a je dále ilustrováno na příkladech • · ······♦ / 9 9 · · · ········ • · · · · ··· 99 ·· uvedených níže. Výhodné rozmezí hodnot pH pro prostředky podle přítomného vynálezu je od přibližně 4,0 do asi 9,0, konkrétněji od přibližně 5,0 do asi 6,5, v závislosti na příslušném polypeptidu. Proto v jednom provedeni je hodnota pH přibližně 5,8, konkrétněji v případě, kdy polypeptidem je IL-2 nebo jeho varianta. V jiném provedení, je hodnota pH přibližně 5,5, konkrétněji se jedná o případ, kdy je polypeptidem TFPI nebo jeho varianta.

Stabilizované farmaceutické prostředky obsahující aminokyselinovou bázi pufrovanou kyselinou v podstatě zbavenou její soli, kyselinou ve formě své soli nebo směsí kyseliny a její soli, mohou také obsahovat další stabilizující přípravky, které dále zvýší stabilitu terapeuticky aktivního polypeptidu obsaženého ve zmíněných prostředcích. Stabilizující přípravky v zájmu přítomného vynálezu zahrnují, avšak bez omezení na, methionin a EDTA, které ochraňují polypeptid před oxidací methioninu, a dále neionický surfaktant, který ochraňuje polypeptid před agregací spojenou se zmrazováním a rozmrazováním nebo mechanickými střižnými silami.

Tímto způsobem lze za účelem inhibice oxidace methioninových zbytků na methionin-sulfoxid přidat aminokyselinu methionin, a to v případě, pokud je polypeptidem působícím jako terapeutický přípravek polypeptid obsahující nejméně jeden zbytek methioninu, který je citlivý k takové oxidaci. Termín inhibovat znamená minimální akumulační oxidovaných druhů methioninu v čase. Inhibice oxidace methioninu má za důsledek vyšší retenci polypeptidu v jeho vlastní molekulární formě. Použit může být jakýkoliv stereoisomer methioninu (L, D nebo DL isomer) nebo jejich kombinace. Přidané množství by mělo být množství dostatečné pro inhibici oxidace methioninových zbytků tak, že množství methionin-sulfoxidu je přijatelné pro příslušné instituce. Toto obvykle znamená, že prostředek neobsahuje více než přibližně 10 %· až asi 30 % methionin-sulfoxidu. Tohoto lze obecně dosáhnout přidáním methioninu takovým způsobem, že poměr methioninu přidaného k methioninovým zbytkům je v rozmezí od přibližně 1:1 do asi 1000:1, nejvýhodněji od přibližně 10:1 do asi 100:1.

Výhodné množství methioninu, které má být přidáno, může být snadno empiricky určeno přípravou prostředku obsahujícího příslušný polypeptid a různé koncentrace methioninu a stanovením relativního účinku na tvorbu oxidované sloučeniny polypeptidů pomocí například chromatografické separace molekulárních druhů a identifikace za použití polypeptidových molekulárních hmotnostních standardů, jako pomocí RP-HLCP, jak je popsáno níže v příkladu 2. Taková koncentrace methioninu, která maximalizuje inhibici oxidace methioninových zbytků bez nepříznivých účinkp na inhibici agregace polypeptidů vyvolanou aminokyselinou, representuje výhodné množství methioninu, které má být přidáno do prostředku, za účelem dalšího zlepšení stability polypeptidů.

Degradace polypeptidů následkem cyklu zmrazování a rozmrazování nebo mechanických střižných sil v průběhu zpracovávání kapalného prostředku podle přítomného vynálezu může být inhibována inkorporací surfaktantů do kapalných polypeptid obsahujících prostředků podle přítomného vynálezu, a to za účelem snížení povrchového napětí na rozhraní roztok-vzduch. Obvykle používané surfaktanty jsou • · ···· ··· ····· ·· · · ·♦··.·· neionické surfaktanty, včetně esterů polyoxyethylensorbitolu, jako je polysorbát 80 (Tween 80) a polysorbát 20 (Tween

20); esterů polyoxypropylen-polyoxyethylenu jako je Pluronic t

F68; alkoholů polyoxyethylenu jako je Brij 35; simethikonu;

polyethylen-glykolů jako je PEG400; lysofosfatidylcholinu a polyoxyethylen-para-terč.-oktylfenolu jako je Triton X-100.

Klasickou stabilizaci farmaceutických prostředků surfaktanty nebo emulgátory popisuje například Levine a kol, J.

Parenteral Sci. Technol. , 45(3) . 160 až 16.5 (1991), ve zde citované referenci. Výhodný surfaktant používaný v postupech podle přítomného vynálezu je polysorbát 80.

Vedle přípravků uvedených výše, mohou být přidány další stabilizační přípravky, jako je albumin, kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA) nebo některá z jejích solí jako je dinatrium-EDTA, a to pro další zvýšení stability kapalných farmaceutických prostředků. Množství albuminu, které může být přidáno, se pohybuje v koncentracích přibližně 1,0 % hmot./objem nebo méně. EDTA působí jako lapač kovových iontů, které jsou známy jako katalyzátory mnoha oxidačních reakcí, čímž působí jako další stabilizační přípravek.

V jednom provedení přítomného vynálezu, obsahuje stabilizovaný kapalný farmaceutický prostředek IL-2 nebo jeho variantu jako polypeptid, argininovou bázi v koncentraci od přibližně 150 mmol do asi 350 mmol, kyselinu jantarovou v koncentraci od přibližně 80 mmol do asi 190 mmol, methionin v koncentraci od přibližně 0,5 mmol do asi 10 mmol, EDTA v koncentraci od přibližně 0,1 mmol do asi 5,0 mmol a polysorbát 80 od přibližně 0,001 % do asi 0,2

%. Ve výhodném provedení, je argininová báze přítomna ·· ·· ·· ·· ·· ··· · · ·· · · · · « «·· · · to · · · · • ····· to· ··· · · « · ···· «toto ··· ·· toto « · ·· ···· v tomto kapalném farmaceutickém prostředku obsahujícím IL-2 v koncentraci přibližně 230 mmol a kyselina jantarová je přítomna v koncentraci přibližně 128 mmol. Tento výhodný prostředek obsahující IL-2 má pH přibližně 5,8 a osmolaritu od přibližně 250 mmol/kg do asi 330 mmol/kg. Koncentrace IL2 nebo jeho varianty je v těchto prostředcích od přibližně

0,01 mg/ml do asi 2,0 mg/ml, s výhodou od přibližně 0,02 mg/ml do asi 1,0 mg/ml, výhodněji od přibližně 0,03 mg/ml do asi 0,8 mg/ml,. nej výhodně ji od přibližné 0,03 mg/ml do asi

0,5 mg/ml.

Pokud je to žádoucí, mohou být do stabilizovaných kapalných farmaceutických prostředků obsahujících polypeptid podle přítomného vynálezu začleněny, sacharidy nebo cukrové alkoholy. Může být použit jakýkoliv sacharid jako jsou mono, di-, nebo polysacharidy nebo ve vodě rozpustné glukany, včetně například fruktózy, glukózy, mannózy, sorbózy, xylózy, maltózy, laktózy, sacharózy, dextranu, pullulanu, dextrinu, cyklodextrinu, rozpustného škrobu, hydroxyethylškrobu a natriumkarboxymethylcelulózy. Nejvýhodnějšim sacharidovým přídatným přípravkem je sacharóza. Cukrový alkohol je definován jako uhlovodík se 4 až 8 atomy uhlíku, který má skupinu -OH, a zahrnuje například mannitol, sorbitol, inozitol,, galacititol, dulcitol, xylitol a arabitol, přičemž nejvýhodnějšim přídatným přípravkem ze skupiny cukrových alkoholů je mannitol. Sacharidy nebo cukrové alkoholy zmíněné výše mohou být použity jednotlivě nebo v kombinaci. Pro množství, které má být použito, neexistuje žádný stálý limit, za předpokladu, že je sacharid nebo cukrový alkohol rozpustný v kapalném prostředku a neovlivňuje nepříznivě stabilizační účinky dosažené metodami podle přítomného vynálezu. Koncentrace sacharidu nebo • 9 · · * • 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 9 9 9999 cukrového alkoholu se s výhodou pohybuje v rozmezí přibližně od 1,0 % hmot./objem do asi 15,0 % hmot./objem, výhodněji v rozmezí přibližně od 2,0 % hmot./objem do asi 10,0 % hmot./obj em.

Stabilizované kapalné farmaceutické prostředky podle přítomného vynálezu mohou obsahovat další sloučeniny, které zvyšují účinnost nebo podporují žádoucí kvality příslušného polypeptidu, kt.erý působí jako terapeuticky aktivní složka, pokud není primární stabilizační účinek dosažený aminokyselinovou bází nepříznivě ovlivněn. Prostředek musí být bezpečný pro podání zvolenou cestou, musí být sterilní a musí si uchovávat požadovanou léčebnou aktivitu.

Prostředky podle přítomného vynálezu se s výhodou

Z připraví přípravným míšením stabilizačních a pufrovacích přípravků a jakýkoliv jiných excipientů, před inkorporací příslušného polypeptidu. Jakékoliv další přídatné excipienty, které mohou být přidány pro další stabilizaci prostředků podle přítomného vynálezu, nesmí nepříznivě ovlivňovat stabilizační účinky primárních stabilizačních přípravků, tj. aminokyselinové báze, v kombinaci s pufrovacím přípravkem, tedy kyselinou v podstatě zbavenou své soli, ve formě své soli nebo směsí kyseliny a její soli, jež jsou používány pro přípravu nových prostředků zde popisovaných. Po přidání výhodného množství aminokyselinové báze k dosažení snížené tvorby agregátu příslušného polypeptidu, upraví se pH kapalného prostředku pomocí pufrovacího přípravku, s výhodou v rozmezí pH zde uvedeném, výhodněji na optimální pH pro příslušný polypeptid. Ačkoliv může být pH upraveno až po přidání příslušného polypeptidu do prostředku, upraví se s výhodou ještě před přidáním ··♦··· · : ’ ··· « · · · ··· · · • ·«·· · · ♦ ·· ·« · · ·· ···· tohoto polypeptidu, čímž se může snížit riziko denaturace polypeptidu. Poté jsou použita příslušná mechanická zařízení pro dosažení řádného promísení složek.

Zatímco specifická provedení přítomného vynálezu se zaměřují na stabilizované prostředky obsahující interleukin2 (IL-2) nebo jeho, variantu, nebo inhibitor působení £

tkáňového faktoru (TFPI) nebo jeho variantu, příklady proteinů, které jsou obzvláště citlivé k degradaci cestou tvorby agregátu, použitelnost přítomného vynálezu všeobecně dosahuje k jakémukoliv'farmaceutickému prostředku, který obsahuje polypeptid nebo jeho variantu vykazující tvorbu agregátu během skladování v kapalné formulaci. Proto polypeptidy vhodné pro použití v praxi podle přítomného vynálezu zahrnují například, interleukiny (například IL-2), interferony včetně β-interferonu (IFN-β) a jeho můteiny jako je IFN-^_serl7 (jak je popsáno v evropské patentové přihlášce č. 185459B1 a v US patentu č. 4 588 585, jenž jsou zde zahrnuty do odkazů), inhibitor působení tkáňového faktoru (TFPI), lidský růstový hormon (hGH), insulin a jiné podobné polypeptidy, které vykazují tvorbu agregátů v kapalné formulaci, stejně jako jakékoliv jejich biologicky aktivní varianty.

Polypeptidy přítomné ve stabilizovaných kapalných farmaceutických prostředcích podle přítomného vynálezu mohou být nativní nebo získané rekombinantními technikami a mohou být z jakéhokoliv zdroje, včetně savčího zdroje, jako je například myš, krysa, králík, primát, prase a člověk, za předpokladu, že splňují zde uvedená kriteria, to znamená za předpokladu, že tvoří agregáty v průběhu skladování v kapalných prostředcích. S výhodou jsou tyto polypeptidy , , * ·« · · ♦ · · • · · · ·· * J »* ·· ti ti · ti ti · titititi získány z lidského zdroje a výhodněji se jedná o rekombinantní lidské proteiny získané z mikrobiálních hostitelů.

Biologicky aktivní varianty příslušného polypeptidu, který působí jako terapeuticky aktivní složka ve farmaceutických podle přítomného vynálezu, jsou také obsaženy v pojmu polypeptid, jak je v tomto spisu užíváno.

Takové varianty by si měly uchovávat požadovanou biologickou aktivitu nativního polypeptidu na takové úrovni, že farmaceutický prostředek obsahující variantu polypeptidu má stejný léčebný účinek jako farmaceutický prostředek obsahující nativní polypeptid, pokud je podán subjektu. To znamená, že varianta polypeptidu bude působit jako terapeuticky aktivní složka farmaceutického prostředku způsobem podobným tomu, který je pozorován u nativního polypeptidu. Pro stanovení, zda-li si varianta příslušného polypeptidu uchovává požadovanou biologickou aktivitu, a tak působí jako terapeuticky aktivní složka farmaceutického prostředku, jsou v oboru k dispozici různé způsoby.

Biologická aktivita může být měřena pomocí analýz specificky navržených pro měření aktivity nativního polypeptidu nebo proteinu včetně analýz popsaných v přítomném vynálezu. Navíc je možné testovat protilátky vytvořené proti biologicky aktivnímu nativnímu polypeptidu na jejich schopnost navázat variantu polypeptidu, přičemž účinné navázání je indikátorem, že polypeptid má podobnou konformaci jako nativní polypeptid.

Vhodné biologicky aktivní varianty nativního nebo přirozeně se vyskytujícího příslušného polypeptidu mohou být fragmenty, analogy a deriváty tohoto polypeptidu. Termín • ·

fragment znamená polypeptid obsahující pouze část intaktní polypeptidové sekvence a struktury a může vzniknout deleci na C-konci nebo deleci na N-konci nativního polypeptidu. Termín analog vyjadřuje analog bud' nativního polypeptidu nebo analog fragmentu nativního polypeptidu, kdy analog obsahuje nativní polypeptidovou sekvenci a strukturu s jednou nebo více, substitucemi aminokyselin, insercemi nebo delecemi. Termín analog zahrnuje též název muteiny, jak je zde popsáno, a peptidy obshaující jeden či více peptoidů (peptidových napodobenin), viz mezinárodní patentová přihláška č. WO 91/04282. Termín derivát znamená jakoukoliv vhodnou modifikaci příslušného nativního polypeptidu, nebo fragment nativního polypeptidu nebo jejich analog, jako jsou glykosylované, fosforylované nebo jiné další adiční cizí skupiny, za předpokladu, že je zachována požadovaná biologická aktivita nativního polypeptidu.

Postupy pro přípravu polypeptidových fragmentů, analog a derivátů jsou v oboru všeobecně známé.

jř

Například, varianty aminokyselinové sekvence polypeptidu mohou být připraveny mutacemi v sekvenci klonované DNA kódující nativní polypeptid našeho zájmu. Postupy mutageneze a alterace nukleotidové sekvence jsou v oboru dobře známy. Viz například, Walker a Gaastra, vyd. , Techniques in Molecular Biology, MacMillan Publishing Company, New York, (1983); Kunkel, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82. 488 až 492 (1985); Kunkel a kol., Methods Enzymol. , 154, 367 až 382 (1987), Sambrook a kol., Molecular Cloning:

A Laboratory Manuál (Cold Spring Harbor, New York) (1989) ; US patent č. 4 873 192 a reference citované tamtéž; jsou zde začleněny v odkazech. Návod pro příslušné aminokyselinové substituce, které neovlivňují biologickou aktivitu • · · fc · • fcfc · fc · · · « • « · ♦ · · fc·· ·· ·fc fcfc příslušného polypeptidu lze nalézt v modelu, který popisuje Dayhoff a kol., Atlas of Protein Sequence and Structure,

Nati. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., (1987), zde začleněný do obsahu. Konzervativní substituce, jako je výměna jedné aminokyseliny jinou mající podobné vlastnosti, může být výhodnější. Příklady konzervativních substitucí zahrnují Gly<=>Ala, Val <=>Ile<=>Leu, Asp<B>Glu, Lys<=>Arg,

AsnéBGln a Phe<=>Trp<=>Tyr.

Při vytvářený variant příslušného polypeptidu, jsou modifikace prováděny tak, že varianty stále mají požadovanou aktivitu. Samozřejmě, jakékoliv mutace vzniklé v DNA, která kóduje variantu polypeptidu, nesmí umístit sekvenci mimo čtecí rámec a s výhodou nevytváří komplementární oblasti, které by mohly vytvořit sekundární mRNA strukturu. Viz publikace EP patentové přihlášky č. 75 444.

Biologicky aktivní varianty příslušného polypeptidu mají všeobecně nejméně 70%, s výhodou nejméně 80%, výhodněji přibližně od 90% č/o asi 95% nebo více, a nejvýhodněji r

přibližně 98% a více, shodu v aminokyselinové sekvenci s aminokyselinovou sekvencí referenční polypeptidové molekuly, která slouží jako základ pro srovnání. Biologicky aktivní varianta příslušného nativního polypeptidu se může lišit od nativního polypeptidu v tak málo jako v 1 až 15 aminokyselinových zbytcích, v 1 až 10 aminokyselinových zbytcích, v 6 až 10 aminokyselinových zbytcích, v 5 aminokyselinových zbytcích, ve 4, 3, 2, nebo dokonce 1 aminokyselinovém zbytku. Termín shoda v sekvenci znamená, že se vyskytují stejné aminokyselinové zbytky ve variantě polypeptidu a polypeptidové molekule, která slouží jako molekula referenční, pokud je specifický, přiléhající • « · fcfc * • · ··

4 ·

4 4 * 444 * ·

444 44 • 4 ·

♦

4

9 * ·

• 4 · ·

· 4 •

•

444 segment aminokyselinové sekvence varianty přiložen a ¥

porovnán s aminokyselinovou sekvencí referenční molekuly. Procentuální shoda v sekvenci mezi dvěmi aminokyselinovými sekvencemi se vypočte určením počtu poloh, ve kterých se nacházejí identické aminokyselinové zbytky v obou sekvencích, čímž se získá počet shodujících se poloh, dále vydělením počtu shodujících se poloh celkovým počtem poloh v segmentu, který je porovnáván s referenční molekulou, a vynásobením výsledku 10..0x, čímž se získá procento identity v sekvenci.

Pro- optimální seřazení dvou sekvencí, přiléhající segment aminokyselinové sekvence varianty polypeptidu může mít další aminokyselinové zbytky s ohledem na aminokyselinovou sekvenci referenční molekuly. Přiléhající segment použitý pro porovnání referenční aminokyselinové sekvence bude obsahovat nejméně dvacet (20) přiléhajících aminokyselinových zbytků a možná 30, 40, 50, 100 nebo více zbytků. Opravy zvýšené sekvenční identity spojené s včleněním mezer do aminokyselinové sekvence varianty mohou být provedeny přiřazením tzv. gap penalties (mezerových penalt). Způsoby seřazení sekvence jsou v oboru dobře známé, jak pro aminokyselinové sekvence, tak pro sekvence nukleotidů kódujících aminokyselinové sekvence.

Proto stanovení procentuální identity mezi jakýmikoliv dvěma sekvencemi může být provedeno použitím matematického algoritmu. Jedním z výhodných, neomezujících příkladů matematického algoritmu používaného pro srovnání sekvencí je algoritmus dle publikace Meyers a Miller, CABIOS 4, 11 až 17 (1988). Tento algoritmus se použije v programu ALIGN (verze 2.0), který je součástí softwarového systému pro řazení • ·· ·· ** ·· »· «· » · * * · · * * * · ··«·· 9 1 111 1 1

119 9 « · · • · ·» 4 · · · 4 · 9 sekvencí GCG. Tabulka hmotnostních zbytků APAM 120, délka mezerové penalty 12, a mezerová penalta 4 mohou být použity společně s programem ALIGN pro porovnání aminokyselinových sekvencí. Jiným výhodným neomezujícím příkladem matematického algoritmu pro použití při porovnávání dvou sekvencí je algoritmus popsaný v publikaci Karlin a

Altschul, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87. 2264 (1990), modifikováno podle Karlina a Altschula, Proč. Nati. Acad.

Sci. USA 90, 5873 až 5877 (1993) . Tento algoritmus je včleněn do programů NBLAST a XBLAST, které zavádí Altschul a kol., J. Mol. Biol., 215. 403 (1990). Nukleotidové vyhledávání BLAST může být provedeno programem NBLAST, skóre = 100, délka slova, =12, za účelem zisku nukleotidových sekvencí homologních k nukleotidové sekvenci kódující polypeptid našeho zájmu. Vyhledávání proteinů systémem BLAST může být provedeno za použití programu XBLAST, skóre = 50, délka slova = 3, za účelem získání aminokyselinových sekvencí homologních s příslušným polypeptidem. K přiložení mezerových penalt pro účely srovnání, může být použit Gapped

BLAST, jak popsal Altschul a kol., Nucleic Acids Res., 25,

3389 (1997) . Alternativně může být použit PSI-Blast k provedení opakovaného vyhledání, který detekuje vzdálené vztahy mezi molekulami. Viz Altschul a kol., reference uvedená výše (1997). Pokud jsou použity programy BLAST,

Gapped BLAST a PSI-Blast, lze použít parametry prodlení příslušných programů (například XBLAST a NBLAST). Viz http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Viz také program ALIGN (Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure 5: dodatek

3, National Biomedical Research Foundation, Washington,

D.C., (1978)) a programy uvedené ve Wisconsin Sequence

Analysis Package, verze 8 (dostupné od Genetics Computer • 4 • 4 ·« • · · 4

9·«

9 9 · • 944 • 4 ·*

Group, Madison, Wisconsin), například program GAP, kde jsou použity parametry prodlení uvedených programů.

Pokud uvážíme procento identity v aminokyselinové sekvenci, některé polohy aminokyselinových zbytků se mohou lišit následkem konzervativních aminokyselinových substitucí, které neovlivňují vlastnosti proteinové funkce. V těchto případech může být procentuální sekvenční identita upravena na vyšší hodnoty,' aby byla započítána podobnost v konzervativně substituovaných aminokyselinách. Takové úpravy jsou v oboru dobře známy. Viz například Myers a Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4, 11 až 17 (1988).

Přesná chemická struktura polypeptidů závisí na mnoha faktorech. Jelikož jsou v molekule přítomny ionizovatelné aminoskupiny a karboxylové skupiny, může být daný polypeptid získán jako kyselá nebo bazická sůl nebo v neutrální formě. Všechny takovéto preparáty uchovávající si svou biologickou aktivitu za určitých podmínek okolního prostředí jsou zahrnuty do definice polypeptidů podle přítomného vynálezu, která je zde užívána. Navíc primární aminokyselinová sekvence polypeptidů může být posílena derivatizací pomocí cukrových částí (glykosylace) nebo jinými suplementárními molekulami jako jspu lipidy, fosfát, acetylové skupiny a podobné. Může být také posílena konjugací se sacharidy. Určité aspekty takového rozšíření jsou provedeny posttranslační systémy zpracování produkujícího hostitele; další takovéto modifikace mohou být zavedeny in vitro. V každém případě jsou takovéto modifikace zahrnuty do definice polypeptidů podle přítomného vynálezu, která je zde užívána, za předpokladu, že aktivita polypeptidů není alterována. Očekává se, že takové modifikace mohou kvantitativně nebo

	β 4 • 4	44 4	•	• 4'	44 4 *	94 4 ·
«	4
	• 44	4 4	•	4	- 4	4 4 4	4
• 4	4 4 9'	4 »4	•	4	4 4 4	4 4 49	4 4444

kvalitativně ovlivnit aktivitu, buď zvýšením nebo snížením aktivity polypeptidu, v různých zkouškách. Navíc mohou být jednotlivé aminokyselinové zbytky v řetězci modifikovány oxidací, redukcí nebo jinou derivatizací a polypeptid může být štěpen pro zisk fragmentů, které si uchovávají aktivitu. Tyto změny, které nealterují aktivitu polypeptidových sekvencí, není nutno exkludovat z definice polypeptidu, která je zde užívána.

Dosavadní stav techniky poskytuje dostatečný dohled co se týká přípravy a použití polypeptidových variant.

Při přípravě polypeptidových variant může odborník v oboru snadno určit, které modifikace nativního proteinového nukleotidu nebo aminokyselinové sekvence budou mít za následek vznik varianty, která je vhodná pro použití jako terapeuticky aktivní složka farmaceutického prostředku podle přítomného vynálezu, a u které se tvorba agregátu sníží přítomností aminokyselinové báze a kyseliny v podstatě zbavené její soli, přítomností soli kyseliny nebo směsí kyseliny a její soli, jak je zde popsáno.

V jednom provedení přítomného vynálezu, polypeptidem přítomným jako terapeuticky aktivní složka v kapalném farmaceutickém prostředku podle přítomného vynálezu je interleukin-2 (IL-,2) nebo jeho varianta, s výhodou rekombinantní IL-2. Interleukin-2 je lymfokin, který je produkován normálními periferními krevními lymfocyty a je v těle přítomen v malých koncentracích. Indukuje proliferaci T-buněk stimulovaných antigenem nebo mitogenem po expozici rostlinným lektinům, antigenům nebo jiným stimulům. IL-2 poprvé popsal Morgan a kol., Science, 193. 1007 až 1008 (1976) a původně byl nazýván růstovým faktorem T-buněk díky • *· to* toto ·· ·» • to·· · · to · * · * » _ _ ·····»···* · ··· ♦ to ♦· ·*· · · toto·····*· •toto ·« ♦· ·· ♦· ···· své schopnosti vyvolat proliferaci stimulovaných Tlymfocytů. Jedná se o protein s uváděnou molekulární hmotností v rozmezí od 13 000 do 17 000 (Gillis a Watson, J.

Exp. Med. 159, 1709 (1980)), který má izoelektrický bod v rozmezí 6 - 8,5. Nyní bylo.zjištěno, že kromě vlastností růstového faktoru také moduluje různé funkce imunitního systému in vitro a in vivo. IL-2 je jeden z několika lymfocyty produkovaných molekul fungující jako messengers (poslové), které zprostředkovávají buněčné interakce a funkce. Bylo prokázáno, že tento přirozeně se vyskytující lymfokin má antitumorosní aktivitu proti různým malignitám bud' jako takový nebo v kombinaci s LAK buňkami (lymphokineactivated killer, lymfokiny aktivované zabiječské buňky) nebo tumor infiltrujícími lymfocyty (viz, například Rosenberg a kol., N. Engl. J. Med., 316, 889 až 897 (1987),

Rosenberg, Ann. Surg., 208, 121 až 135 (1988), Topalian a kol., J. Clin. Oncol., £, 839 až 853 (1988), Rosenberg a kol, N. Engl. J. Med., .319, 1676 až 1680 (1988) a Weber a kol., J. Clin. Oncol., 10. 33 až 40 (1992). Ačkoliv antitumorosní aktivita IL-2 byla popsána u pacientů s metastatickým melanomem a renálním karcinomem, zdá se, že také jiné chorobné stavy, především lymfom, též odpovídají na léčbu IL-2.

Pojem rekombinantní IL-2 znamená interleukin-2, který má srovnatelnou biologickou aktivitu s IL-2 s nativní sekvencí, a který byl připraven metodami s rekombinantní DNA, jak popisuje například Taniguchi a kol.,

Nátuře, 302. 305 až 310 (1983) a Devos, Nucleic Acíds

Research, 11, 4307 až 4323 (1983), nebo s mutačně alterovaným IL-2, jak popisuje Wang a kol., Science 224,

1431 až 1433 (1984) . Obvykle se nakloňuje gen kódující IL-2 '

444 ♦ 4 *» 44 44 • 4 4 4 4 44 »

4 4« 4 4 4

44 444 4 4

4 4 4 4 4 4

44 44 49*4 a poté je exprimován transformovanými organismy, s výhodou mikroorganismem a nejvýhodněji E.coli, jak je zde popsáno. Hostitelský organismus exprimuje cizí gen, a tak produkuje IL-2 při expresních podmínkách. Syntetický rekombinantní IL2 může být také vytvářen eukaryotními organismy, jako jsou kvasinkové nebo lidské buňky. Způsoby pěstování, sběru, disrupci nebo extrakci IL-2 z buněk jsou v podstatě popsány například v US patentech č. 4 604 377, č.4 738 927, č.4

656 132, č. 4 569 790, 4 748 234, č. 4 530 787, č.4

572 298 ač. 4 931 543, které jsou zde v celém znění začleněny do odkazů.

Příklady variant IL-2 proteinů jsou uvedeny v Evropské patentové žádosti č. 136 489, Evropské patentové žádosti č. 83101035.0 podané 3. února 1983 (publikované 19. října 1983 pod publikačním č. 91539); Evropské patentové žádosti č. 82307036.2, podané 22. prosince 1982 (publikované 14. září 1983 pod publikačním č. 88195), příklady rekombinantních muteinů IL-2 jsou popsány v Evropské patentové žádosti č. 83306221.9, podané 13. října 1983 (publikované 30. května 1984 pod č. 109748), která je ekvivalentem belgického patentu č. 893 016, obecně uznaným US patentem č. 4 518 584; muteiny popsané v US patentu č. 4 752 585 a WO 99/60128; a IL-2 mutein používaný zde v příkladech popsané v US patentu č. 4 931 543; veškeré příklady jsou zde začleněny do odkazů. Navíc, IL-2 lze modifikovat polyethylenglykolem pro zvýšení rozpustnosti a odlišný farmakokinetický profil (viz US patent č.

766 106, který je zde jako celek začleněn referencí).

V jiném provedení přítomného vynálezu, je polypeptid přítomen jako terapeuticky aktivní složka v kapalném fc* fcfc • fcfc* • I *

♦ fcfcfc « » • ·

• · • fc fc · • fcfc · fc farmaceutickém prostředku podle přítomného vynálezu interferon, konkrétněji fibroepiteliální β-interferon (IFNβ) nebo jeho varianta, s výhodou se jedná o rekombinantní IFN-β připravený metodami s rekombinantní DNA, které již byly v oboru popsány. Interferony jsou produkovány savčími buňkami jako odpověď na expozici mnoha indukčním signálům, jako jsou mitogeny, polypeptidy, viry a jim podobné. Tyto relativně malé druhově specifické polypeptidy s jednoduchých řetězcem vykazuj i^:imunoregulačníy antivirové a antiproliferativní vlastnosti. Interferony jsou ve středu zájmu jako léčebné prostředky pro léčbu virových onemocnění a kontrolu rakoviny.

DNA sekvence kódující lidské geny pro IFN-β jsou v oboru již popsány (viz Goeddel a kol., Nucleic Acids Res. 8., 4057 (1980) a Taniguchi a kol., Proč. Japan acad. Sci., 855. 464 (1979)) a příslušné geny byly exprimovány E. coli (Taniguchi a kol, Gene, 10., 11 až 15 (1980)) a ovariálními buňkami čínských křečků (viz například US patenty č.

966 843 ač. 5 376 567). Varianty IFN-β jsou popsány v Evropské patentové žádosti č. 185459B1 a US patenty č.

518 584 , č. 4 588 585 a č. 4 737 462 popisují muteiny jako je IFN^_serl7 exprimované E. coli, všechny jsou zde inkorporovány do odkazů.

Ještě v dalším provedení je polypeptid přítomný jako terapeuticky aktivní složka v kapalném farmaceutickém prostředku vynalezu inhibitor působení tkáňového faktoru (TFPI) nebo jeho varianta, s výhodou rekombinantní TFPI. Tento polypeptid, který je inhibitorem koagulační kaskády je také znám jako inhibitor koagulace spojené s lipoproteiny ·· 9« 9« • 9 0 9·«

9 · 0·

999 99 99 9 · 9 9 9

9« 9 9

9« 99

9 9 9 ♦ · ·

9 9 9

9 9

9« 99*9 (LÁCI), inhibitor tkáňového faktoru (TFI) a inhibitor extrinsické cesty (EPI). TFPI byl poprvé purifikován z buněk lidského hepatomu, Hep G2 (Brože a Miletich, Proč. Nati. Acad. Sci USA, 84 . 1886 až 1890 (1987)) a následně z lidské plazmy (Novotný a kol., J. Biol. Chem., 264, 18832 až 18837 (1989)); a jaterních buněk typu Chang a buněk SK hepatomu (Wun a kol., J. Biol. Chem., 265, 16096 až 16101 (1990)). TFPI cDNA byla izolována z placentárních a endoteliálních bank cDNA (Wun a l|ol. , J. Biol. Chem., 263. 6 001 až 6 0 04 (1988); Girard a kol., Thromb. Res., 55. 37 až 50 (1989) .

Pro reakce viz Rapaport, Blood, 73., 359 až 365 (1989); Brože a kol., Biochemistry, 2 9 . 7539 až 7546 (1990)). Klonování TFPI cDNA, která kóduje 276 aminokyselinových zbytků proteinu TFPI, je dále popsáno v U. S. patentu č. 4 966 852; viz také U. S. patenty č. 5 773 251 a 5 849 875; všechny jsou zde začleněny do referencí.

Varianty TFPI jsou v oboru známé. Viz například US patent č. 5 212 OSl, kde je popsána produkce neglykosylované formy rekombinantního TFPI a izolována z E. coli; US patent č. 5 106 833 popisuje analoga a fragmenty a US patent č. 5 378 614, kde je popsána produkce analog TFPI u kvasinek; přičemž všechny výše uvedené publikace jsou zde začleněny referencí.

Subjektu se podá farmaceuticky účinné množství stabilizovaného kapalného farmaceutického prostředku obsahujícího polypeptid podle přítomného vynálezu. Pojem farmaceuticky účinné množství znamená množství, které je účinné v léčbě, prevenci nebo pro diagnózu onemocnění nebo chorobného stavu. Typické cesty podání zahrnují, avšak nejsou omezeny na, perorální podání a parenterální podání, • ti* ·* titi ·· ti· ti·· · · · * · · ·· ti _or. tititi titi titi ti· ·

S9 · ··· ♦ · * · ··· · · · »«·«···· ··· ·· ·· ·« ·· ·♦·· včetně intravenózní, intramuskulární, subkutánní, intraarteriální a intraperitoneální injekci nebo infuzi.

V jednom provedení přítomného vynálezu, je podání provedeno injekcí, s výhodou subkutánní injekcí. Injekční formy prostředků podle vynálezu zahrnují, bez omezení na, roztoky, suspenze a emulze.

Stabilizovaný kapalný farmaceutický prostředek obsahující příslušný polypeptid by měly být formulovány v jednotkové dávce a pokud možno v injekční nebo infuzní formě, jako je roitok, suspenze nebo emulze. Dále, mohou být skladovány zmrazené nebo připraveny ve vysušené formě, jako je lyofilizovaný pudr, který může být rekonstituován na kapalný roztok, suspenzi nebo emulzi před podáním jakoukoliv cestou včetně perorální nebo parenterální cesty podání. S výhodou je zmíněný prostředek skladován ve formě kapalného prostředku, čímž se využije výhody zvýšené skladovací stability získané v souladu s způsoby podle přítomného vynálezu, jež jsou vysvětleny níže. Stabilizovaný farmaceutický prostředek se s výhodou sterilizuje membránovou filtrací a je skladován v jednodávkových nebo vícedávkových nádobách, jako jsou uzavřené nádoby nebo ampule. Dále mohou být použity další postupy formulování farmaceutického prostředku v oboru všeobecně známé, za účelem dalšího zvýšení skladovací stability kapalných farmaceutických prostředků zde uvedených, za předpokladu že tyto postupy nepříznivě neovlivní prospěšné účinky výhodných stabilizačních a pufrovacích přípravků popsaných ve způsobech podle přítomného vynálezu. Důkladná diskuse týkající se formulace a výběru farmaceuticky přijatelných nosičů, stabilizátorů atd. lze najít publikaci v Remington's • »*» ·» »* fcfc fcfc • fc · fc fcfc·· fcfcfcfc • •fc fcfc fcfc fcfc ·

AA * ♦·♦ ·· fcfc fcfcfc · fc

4V · · fcfcfc <» fcfcfc • fcfc fcfc fcfc fcfc fcfc ····

Pharmaceutical Sciences (18. vydání, Mack Pub. Co., Eaton,

Pensylvánie) (1980), která je zde zahrnuta do odkazů.

Pojem subjekt zahrnuje jakékoliv zvíře. S výhodou je subjekt savec, nejvýhodněji je subjektem člověk. Savci obzvláště důležití zahrnují, kromě člověka, psy, kočky, krávy, koně, ovce a prasata, avšak bez omezení na uvedené.

Pokud je podání učiněno za účelem léčby, může mít profylaktický nebo léčebný cíl. Pokud je poskytnuto profylakticky, látka je poskytnuta před výskytem jakéhokoliv příznaku. Profylaktické podání látky slouží k prevenci nebo oslabení příznaku, který by se mohl objevit. Pokud se jedná o léčebné podání, je látka poskytnuta při nástupu (nebo krátce po nástupu) příznaku. Léčebné podáni látky slouží k oslabení jakéhokoliv aktuálního příznaku.

Tudíž, například, prostředky obsahující účinné množství farmaceutického prostředku podle přítomného vynálezu zahrnujícího nativní sekvenci IL-2. nebo její variantu mohou být použity k léčení, prevenci a ke stanovení diagnózy v mnoha klinických indikacích, které reagují na léčbu tímto polypeptidem. Biologicky aktivní varianty nativní sekvence IL-2, jako jsou muteiny IL-2, které si uchovaly aktivitu IL-2, obzvláště mutein IL-2.sub.serl25 a jiné muteiny, ve kterých je cystein v poloze 125 nahrazen jinou aminokyselinou, mohou být formulovány a použity stejným způsobem jako nativní sekvence IL-2. Následně, prostředky podle přítomného vynálezu zahrnující nativní sekvenci IL-2 nebo její variantu jsou užitečné pro diagnózu, prevenci a terapii (lokální nebo systémovou) bakteriálních, virových, parazitárních, protozoárních a mykotických • t 90 • · ·

»

• » · • · · · ··· · · infekcí; pro augmentaci cytotoxity zprostředkované buňkami; pro stimulaci aktivity lymfokiny aktivovaných žabíječských buněk (LAK - lymphokine activated killer cell); pro zprostředkování obnovení imunitní funkce lymfocytů; pro zvýšení odpovědi pa alloantigen (cizorodý antigen) ; pro povzbuzení obnovení imunitní funkce u stavů získané imunodeficience; pro rekonstituci normální imunitní funkce u starších lidí a zvířat; pro vývoj diagnostických testů, například těch, které zahrnují amplifikaci enzymu, radioaktivní označení, radioaktivní zobrazení a jiné postupy známé v oboru pro monitorování hladin IL-2 u chorobných stavů; pro podporu proliferace T-buněk in vitro pro terapeutické a diagnostické účely; pro blokování receptorových míst pro lymfQkiny; a pro různé jiné léčebné, diagnostické nebo.-výzkumné aplikace. Různé léčebné a diagnostické možnosti použití lidského IL-2 nebo jeho variant, jako jsou muteiny IL-2, byly zkoumány a uveřejněny v publikacích Rosenberg a kol., N. Engl. J. Med., 316. 889 až 897 (1987); Rosenberg, Ann. Surg., 208. 121 až 135 (1988); Topalian a kol., J. Clin. Oncol., 6, 839 až 853 (1988); Rosenberg a kol., N. Engl. J. Med., 319, 1676 až 1680 (1988); Weber a kol., J. Clin. Oncol., IQ, 33 až 40 (1992); Grimmol a kol, Cell. Immolunol, 70(2). 248 až 259 (1982); Mazumder, Cancer J. Sci. Am., Q (dodatek 1), 37 až 42 (1997); Mazumder a Rosenberg, J. Exp. Med., 159 (2) . 495 až 507 (1984) a Mazumder a kol., Cancer Immolunol. Immolunother., 15 (1) . 1 až 10 (1983) . Prostředky podle přítomného vynálezu obsahující IL-2 nebo jeho variantu mohou být použity jako jediný terapeutický přípravek nebo mohou být použity v kombinaci s dalšími imunologicky relevantními B- či T-buňkami nebo v kombinaci s jinými terapeutickými přípravky. Příklady vhodných (relevantních, odpovídajících)

444 44 44 44 44 4444 buněk jsou B-buňky či T-buňky, přirozené zabiječské buňky,

LAK buňky a jim podobné, a příklady terapeutických činidel, která lze použít v kombinaci s IL-2 nebo jeho variantou, jsou rozličné interferony, obzvláště interferon gama, růstový faktor B-buněk, IL-1 a protilátky, například antiHER2 nebo anti-CD20 protilátky. Prostředky podle přítomného vynálezu obsahujígí IL-2 nebo jeho variantu mohou být podány člověku či zvířeti perorálně, intraperitoneálně, intramuskulárně, subkutánně, intravenózně, intranazálně nebo do plic, jak je vyžadováno indikujícím lékařem. Podané množství IL-2 (buď v nativní sekvenci nebo jako varianta nativní sekvence se Zachovalou biologickou účinností IL-2, jako jsou například muteiny popsané v tomto spisu) se může pohybovat v rozmezí přibližně 0,1 do přibližně 15 mIU/m².

V indikacích, jako je karcinom ledviny nebo metastatický melanom, může být IL-2 nebo jeho biologicky účinná varianta podána jako intravenózní bolus ve vysoké dávce 300 000 až

800 000 IU/kg na 8 hodin.

Formulace obsahující účinné množství farmaceutických prostředků podle přítomného vynálezu, které obsahují nativní sekvenci inhibitoru působení tkáňového faktoru (TPFI) nebo jeho varianty, jsou vhodné pro diagnózu, prevenci a terapii (místní nebo systémovou) klinických stavů, které odpovídají na terapii tímto polypeptidem. Tyto klinické stavy zahrnují například onemocnění související se zvýšenou syntézou a uvolňováním neutrofilové elastázy, jako jsou zánětlivá onemocnění včetně těžké akutní pankreatitidy, emfyzému, revmatoidní artritidy, mnohočetněho orgánového selhání, cystické fibrózy, syndromu dechové tísně dospělých (ARDS) a sepse; a pro diagnózu a terapii chorob souvisejících se zvýšenou syntézou a uvolňováním IL-8, které zahrnují

to · zánětlivá onemocnění jako ARDS, reperfuzní trauma (včetně pulmonálního reperfuzního traumatu), sepsi a artritidu. Podrobněji viz dokument WO 96/40224, který je v tomto spisu zahrnut v odkazech. Podání IFN-β nebo jeho muteinů člověku či zvířeti může být provedeno cestou perorální, intraperitoneální, intramuskulární, intranazální, subkutánní, intravenózní, intranazální nebo intrapulmonální dle úmyslu indikujícího lékaře.

Prostředky obsahující účinné množství farmaceutických prostředků podle přítomného vynálezu, které obsahují interferon-β (INF-β) nebo jeho variantu, například INF-p_serl7, jsou vhodné pro diagnózu, prevenci a terapii (místní nebo systémovou) klinických stavů, které odpovídají na terapii tímto polypeptidem. Tyto klinické stavy zahrnují například onemocnění centrálního nervového systému (CNS), mozku a/nebo páteře včetně Alzheimerovy nemoci, Parkinsonovy nemoci, demence s Lewyho tělísky, roztroušené sklerózy, epilepsie, cerebellární ataxie, progresivní supranukleární obrny, amyotrofické laterální sklerózy, afektivních poruch, anxiozních poruch, obsedantně kompulzivních poruch, poruchy osobnosti, poruchy s deficitem pozornosti, poruchy s deficitem pozornosti a hyperaktivitou, Tourettova syndromu, Tay-Sachsovy choroby, Niemann-Pickovy choroby a schizofrenie; dále zahrnují poškození nervu v důsledku cerebrovaskulárních příhod, jako je mozková či míšní mrtvice, poškození nervu v důsledku infekcí CNS zahrnující meningitidu a HIV/ poškození nervu zapříčiněného tumory mozku a míchy, nebo poškození nervu v důsledku prionových infekcí; dále zahrnují autoimunní choroby včetně získané imunodeficience, revmatoidní artritidy, psoriázy, Crohnovy choroby, Sjorgenova syndromu, amyotrofní laterální sklerózy fe fefe · · · · fefe fefe ·· ···· a lupusu; a dále zahrnují maligní nádory včetně nádorů prsu, prostaty, močového měchýře, ledvin a tlustého střeva. Podání

IFN-β nebo jeho muteinů člověku nebo zvířeti může být provedeno cestou perorální, intraperitoneální, intramuskulární, subkutánní, intravenózní, intranazální nebo intrapulmonální dle potřeby indikujícího lékaře.

Přítomný vynález též poskytuje způsob zvyšování stability polypetidu v kapalné farmaceutické formulaci, ve kterém polypeptid představující terapeuticky účinnou složku, vykazuje v průběhu skladování v kapalné formulaci tvorbu agregátů. Zmíněný způsob zahrnuje inkorporací aminokyselinové báze do kapalného farmaceutického prostředku v množství dostatečném pro snížení tvorby agregátů polypeptidu v průběhu skladování kapalného farmaceutického prostředku, a dále inkorporací kyseliny v podstatě zbavené její soli, kyseliny ve formě své soli, nebo směsi kyseliny a její soli, přičemž kyselina funguje jako pufrovací přípravek udržující pH kapalného prostředku v přijatelném rozmezí, jak bylo popsáno výše.

Zvyšování stability polypeptidu nebo jeho varianty prostřednictvím inkorporace aminokyselinové báze nebo aminokyselinové báze s jedním či více přídatnými stabilizačními přípravky zde popsanými, v kombinaci s pufrovacím přípravkem zde popsaným, například s kyselinou v podstatě zbavenou její soli, kyselinou ve formě své soli, nebo se směsí kyseliny a její soli, vede ke zvýšení stability kapalného farmaceutického prostředku obsahujícího polypeptid v průběhu jeho skladování. Proto přítomný vynález také popisuje způsob zvyšování skladovací stability kapalného farmaceutického prostředku v takovém případě, kdy * to • to • · · * · · • · · · ' to » · to to to · to . „ -toto········

4s · ··· ·· ·· ··· · · •-s · · to to to to tototo • toto toto ·· ·· ·· toto·· tento farmaceutický prostředek zahrnuje polypeptid, který vykazuje v průběhu skladování v kapalné formulaci tvorbu agregátů. Termín zvyšování skladovací stability vyjadřuje, že farmaceutický prostředek vykazuje v průběhu skladování vyšší retencí polypeptidu či jeho varianty v příslušné neagregované biologicky aktivní konformaci, a tím také menší pokles terapeutické účinnosti, pří porovnání s kapalným farmaceutickým prostředek připraveným v nepřítomnosti aminokyselinové báze nebo aminokyselinové báze s jedním či více přídatnými stabilizačními přípravky zde popsanými, v kombinaci s pufrovacim přípravkem zde popsaným.

Skladovací stabilita farmaceutických prostředků obsahujících polypeptidy připravených v souladu s postupy podle přítomného vynálezu může být stanovena za použití standardních postupů v oboru známých. Skladovací stabilita takovýchto prostředků se obvykle stanoví použitím profilů skladovací stability. Tyto profily se získají monitorováním změn v množství polypeptidu přítomného v jeho neagregované biologicky aktivní molekulární formě a jeho potence v čase odpovídat na různé proměnné, například pH, koncentraci, přítomnost stabilizačního přípravku, koncentrací stabilizačního přípravku, atd., jak je například demonstrováno v příkladech uvedených dále. Tyto profily stability mohou být sestrojeny při několika teplotách, které jsou reprezentativní pro možné skladovací podmínky, například pro skladování za mrazu, v lednici, při teplotě místnosti či při zvýšené teplotě, například 40 až 50 °C.

Skladovací stabilita se poté srovná s jednotlivými profily tím způsobem, že se například stanoví poločas neagregované biologicky účinné molekulární formy zkoumaného polypeptidu.

Termínem poločas se míní čas potřebný pro pokles množství • · · · · · · • · · · ♦ ♦ • · · · · · * • · · · · · ··« ·· · ·· ·· ·· ·· ···· neagregované biologicky účinné molekulární formy zkoumaného polypeptidu o 50 L Prostředky podle přítomného vynálezu . obsahující arginirpvou bázi a kyselinu v podstatě zbavenou její soli připravené v souladu se způsoby podle přítomného vynálezu budou mít poločas, který je alespoň dvakrát až přibližně desetkrát vyšší, s výhodou alespoň třikrát až přibližně desetkrát vyšší, výhodněji alespoň čtyřikrát až přibližně desetkrát vyšší, nejvýhodněji alespoň pětkrát až přibližně desetkrát vyšší než je poločas kapalného prostředku připraveného v nepřítomnosti aminokyselinové báze, nebo aminokyselinové báze v kombinaci s jedním či více stabilizačními přípravky zde popsanými, v kombinaci s kyselinou v podstatě zbavenou její soli, kyselinou ve formě své soli, nebo jako směsi kyseliny a její soli. Pro účely přítomného vynálezu se farmaceutický prostředek mající zvýšenou skladovací stabilitu v důsledku přípravy v souladu s postupy podle přítomného vynálezu považuje za stabilizovaný farmaceutický prostředek. Takovýto stabilizovaný prostředek má s výhodou skladovací životnost alespoň 18 měsíců, výhodněji alespoň 20 měsíců, ještě výhodněji alespoň 22 měsíců a nejvýhodněji alespoň 24 měsíců při skladování při teplotě 2 až 8 °C.

Následující příklady ilustrují přítomný vynález, avšak v žádném případě ho nevymezují.

Příklady provedení vynálezu

Experimentální část

IL-2 je potentní mitogen, který stimuluje proliferaci T-buněk. Má široké terapeutické využití, například při • ·· ·· ·· 44 4 4 • 4* 4 4 ·· 4 4 44 · • 44 4 4 · 4 44 ♦ • 44444 44 444 4 4

4 4444 444

444 44 44 ·4 44 4444 léčení metastáz maligních nádorů, jako adjuvantní přípravek při léčbě maligních nádorových onemocnění a jako přídatný přípravek při terapii infekčních onemocnění.

S postupem různých klinických experimentů využívajících terapii IL-2 bylo pozorováno, že příprava stabilního kapalného prostředku takového proteinu je vysoce žádoucí. Takovýto prostředek by byl univerzálněji použitelný, nežli tradiční lyofilizované prostředky, protože by mohl být dodán v různých koncentracích v závislosti na rozličných dávkovačích režimech. Kapalný prostředek by též byl pohodlnější co se podávání týká a nebylo by třeba žádné rekonstituce. Takovýto prostředek může být dodán v předem naplněných stříkačkách připravených k přímému použití, nebo ve formě vícedávkových prostředků, pokud budou prohlášeny za kompatibilní s bakteriostatickými přípravky.

Bylo oznámeno, že IL-2 v kapalných prostředcích v průběhu skladování degraduje alespoň třemi způsoby: agregací, oxidací methioninu a deaminací (Kunitami a spol. ,

J. Chromatography, 359, 391 až 401 (1986); Kenney a kol.,

Lymphokine Res., 5, 523 až 527 (1986)). Navíc IL-2 je susceptibilní k akutnímu poškození zapříčiněnému zmrazováním a rozmrazováním a mechanickým střihovým silám. Proto je nutné, aby prostředek obsahující IL-2 odolával jak akutnímu poškození, tak i chronické degradaci.

Následně byl vyvinut nový stabilní prostředek obsahující monomerní rhIL-2. V tomto prostředku jsou proteinové molekuly přítomné v roztoku v jejich monomerní formě, ne ve formě agregované. Takže nejsou přítomny kovalentní či hydrofobní oligomery nebo agregáty rhIL-2.

• * • « 9 · ♦ '4 · 4*4 ·· «··· 4 · ·

4·· ·· 4 4 4*4 4 « • 4 4 4 4 4 4 · 4

444 ·4 ·· ·4 44 4494

Tento prostředek obsahuje několik stabilizačních přípravků, zejména arginin a methionin, a to pro stabilizaci proteinu proti fyzikálním a chemickým poškozením, jako jsou například agregace, oxidace methioninu a deaminace, ke kterým dochází v průběhu dlouhodobého skladování. Navíc je do prostředku zahrnut neionický,,surfaktant, polysorbát 80, za účelem ochránění proteinu před akutním poškozením zapříčiněným cykly zmrazování a tání a mechanickými střižnými silami. Jak je demonstrováno v následujících příkladech, přidání stabilizačních přípravků podle přítomného vynálezu k formulaci obsahující rhIL-2 zvyšuje její skladovací stabilitu.

Molekula IL-2 používaná v uvedených příkladech je rekombinantní humánní mutein IL-2, aldesleukin s cysteinem v poloze 125 nahrazeným serinem (des-alanyl-1, serin-125 humánní interleukin-2). Tato molekula je exprimována E. coli a následně je čištěna diafiltrací a kationtovou výměnnou chromatografii, jak je popsáno v US patentu č. 4 931 543. Očištěné množství pro použití v experimentu je přibližně 3 mg/ml interleukinu-2 a je formulováno buď v podobě 10 mmol citrátu sodného o pH - 6 ve 200 až 250 mmol NaCl (CM pufr), nebo v podobě pufru obsahujícího 10 mmol sukcinátu sodného o pH = 6 a 150 mmol L-argininu.

Inhibitor působení tkáňového faktoru (TFPI) je další protein, který vykazuje degradaci agregací v průběhu skladování při skladování kapalného farmaceutického prostředku (Chen a kol., J. Pharm. Sci., 88. 881 až 888 (1999)). Příklad 8 uvedený níže se týká kapalných formulací, které vykazují účinnost použití kyseliny ve formě její volné • •9 « 9 99 9 9 9« 9

99« 9 * · · 9 · ·

99999 99 999 9 9

9 9999 999 • 99 99 ·· ·9 99 999 9 báze za účelem snížení tvorby agregátů a pufrovacího systému obohaceného kyselinou v podstatě očištěnou její soli.

V příkladech se pro stanovení účinku konkrétního stabilizačního přípravku na degradaci IL-2 nebo TPFI, použijí následující protokoly, čímž se též stanoví stabilita tohoto proteinu v průběhu skladování ve formě kapalných formulací. ř

Měření absorbance UV záření

UV absorbance proteinových roztoků se měří za použití spektrometru Hewlett Packard Diodě Array Spectrometer (Model 8452). Přístroj se kalibruje pufrem příslušného prostředku. Zaznamená se absorbance při 280 nm za použití 1,0 cm dlouhé quartzové kyvety. Pro konverzi údajů o absorbanci na koncentraci IL-2 v mg/ml se použije extinkční koeficient 0,7 0 (mg/ml) 'tm'¹. '

RP-HPLC

RP-HPLC se provede na Waters 626 LC systému vybaveném 717 automatickým děličem (Waters Corporation, Milford,

Maine) za použití Vydac 214BTP54 C₄ sloupce a Vydac 214GCC54 C54 iniciálního sloupce (Separation Group, Hesparia, California). Sloupce se nejdříve ekvilibrují mobilní fází A (10% acetonitril, 0,1% TFA). Poté se naloží 20 gg vzorku IL2 a protein se poté eluuje aplikací mobilní fáze B (100% acetonitril, 0,1% TFA) od 0 do 100 % v průběhu 50 minut při rychlosti průtoku 1,0 ml/min. Hlavní solubilní vzorek IL-2 se eluuje přibližně 32 minut a detekuje se prostřednictvím UV vln o vlnové délce 214 nm za použití detektoru Waters ·· ·· 44 44 44 © © · »· 9 · 4» 4 •4 44 ·· 4 4 4 • 44 ·· 44 444 4 4 • 4 · · 4 444 ·· ·· ·* 44 4444

486. Zisk údajů a jejich zpracování se provede Perkins-Elmer Turbochrom systémem (PE Nelson, Cupertino, California).

Tento RP-HPLC způsob detekuje hlavní monomerní sloučeninu IL-2 jako pík B, methioninovou oxidativní sloučeninu (zejména oxidovaný methionin v poloze 104) jako pík A a deaminovanou sloučeninu (pravděpodobné Asn v poloze 88) jako pík B, a další neznámé sloučeniny, které eluují bud', dříve či později než uvedené píky.

Λ

SEC-HPLC

HPLC metodou vylučování dle velikosti (size exclusion HPLC) se provede na TOSOHAAS G2000SWxl sloupci a TSK SWxl ochranném sloupci (TOSOHAAS, Montgomeryville, Pensylvania). Jediná mobilní fáze obsahující 10 mmol fosfátu sodného o pH = 7 a 200 mmol síranu amonného se aplikuje rychlostí toku 1,0 ml/min. Monomer sloučeniny IL-2 se eluuje přibližně ve 14 minutě a je detekován UV o vlnové délce 214 nm prostřednictvím Waters 486 detektoru. Zisk údajů a jejich zpracování se provede za použití systému Perkin-Elmer Turbochrom.

Při použití nativního SEC-HPLC protokolu specielně vyvinutého pro monitoraci IL-2, eluuje rhIL-2 převážně jako samostatná sloučenina, pravděpodobněji jako monomerní forma, protože přidání agregačních disociačních přípravků, jako je například SDS, urea a DTT, neovlivní eluování této sloučeniny. »

IEX-HPLC • · * 44 9 4 • « · • ··· 0 · « · · · · • ·· • · • ·

4

44

4 4 • ft • · 4

4 4

4444

9

HPLC metodou iontové výměny (Ion Exchange HPLC) se provede ve Pharmacia Mono-S HR 5/5 skleněném sloupci za použití Waters 626 LC systému s 717 automatickým vzorkovačem se zahřivačem/chladičem, jak je popsáno v publikaci Chen a kol., J. Pharm. Sci., 88 . 881 až 888 (1999). Sloupec se ekvilibruje z 80 % mobilní fází A (70:30 objem/objem, 20 mmol směsi octanu sodného a acetonitrilu o pH = 5,4) a z 20% mobilní fází B (70:30 objem/objem, 20 mmol octanu sodného a. 1 M směsi chloridu amonného a acetonitrilu o pH = 5,4). Po injekci se rekombinantní humánní (rh) TFPI eluuje zvyšováním podílu ^mobilní fáze B na 85 % v průběhu 21 minut rychlostí průtoku 0,7 ml za minutu. rhTFPI eluuje přibližně za 16,5 minuty jako jediný pík a je detekován při UV absorbanci 280 nm Waters 486 detektorem absorbance.

Získávání údajů a jejich zpracování se provede Perkin-Elmer Turbochrom systémem. Koncentrace proteinu se stanoví integrací plochy píku a jejím porovnáním se standardní křivkou generovanou vzorky se známou koncentrací.

SDS-PAGE

SDS-PAGE se provede podle Laemmlliho protokolu. Přibližně 5 ptg IL-2 se naloží do každé linie iniciálního sloupce z 18% Norvex-Tris-glycinového gelu a při napětí 100 Voltů se provede elektroforéza. Proteinové proužky se obarví Coomassie modří a analyzují se denzitometrem Molecular Dynamics vybaveným systémem Imagequan T (Molecular Dynamics, Sunnyvale, California).

Proliferace buněk HT-2 a jejich MTT barvení pro prokázání £

biologické aktivity IL-2 > ·♦ « 44 44 «4 94 4 · 4 4 4 • 44 4 · 4 · 44 4 • 444 44 ·· ··· 4 4

4 4 · * 4 ···

444 44 44 44 44 4444

Potence IL-2 se určí biologickou analýzou in vitro za použití proliferace HT-2 buněk a jejich barvení MTT (Gillis a kol., J. Immolunol., 120, 2027 až 2032 (1978), Watson, J.

Exp. Med., 150(6). 1510 (1979)). Pouze ve stručnosti, 1 x 10⁴ myších HT-2 buněk, které jsou růstově dependendní na IL2 se naloží do jamek kultivační plotny, která obsahuje standardy, kontroly a vzorky. Po 22 až 26 hodinách inkubace při teplotě 37 °C se do jamek přidá MTT barvivo a v inkubaci se pokračuje při teplotě 37 °C po dobu 3 až 4 hodin. Potom se přidá 20% SDS pro odbarvení, které probíhá při teplotě místnosti přes noc. Absorbance jamek se odečítá při vlnové délce 570 nm a konvertuje se na biologickou aktivitu IL-2 podle WHO standarciů.

Měření pH a osmolarity

Hodnoty pH různých formulací se měří pH-metrem od firmy Orion (model 611, Orion Research Incorporated Laboratory Products Group, Boston, Massachusetts). pH-metr se zkalibruje kalibračním způsobem využívající dva pufry, který je navržen výrobcem, a použije se standardu pH 4 (Fisher Scientific, Cat. No SB 101-500) a standardu pH 7 £

(Fisher Scientific, Cat. No SB 107-500).

Osmolarita roztoků těchto formulací se změří osmometrem Vapor Pressure Osmometer od výrobce Wescor (model 5500, Wescor Inc., Logan, Utah). Osmometr se zkalibruje prostřednictvím dvou standard dodaných výrobcem: standarda o osmolaritě 290 mmol/kg (Wescor, Reorder No. OA-010) a standarda o osmolaritě 1000 mmol/kg (Wescor, Reorder No. OA029) .

Tyto protokoly se použijí pro kvantifikaci účinků různých stabilizačních přípravků co se degradace rhIL-2 týká, a ta se určí prostřednictvím agregace proteinů, oxidace methioninQ a deaminace.

Příklad 1: Účinky různých rozpouštšcích přípravků na agregaci proteinů a skladovací stabilitu IL-2

Agregace proteinů je hlavní cestou degradace rhIL-2 v kapalných médiích s hodnotami pH v rozmezí od slabě kyselých až po alkalické. V roztocích rhIL-2 formulovaných tak, aby měly zmíněné podmínky pH, dochází při skladování za zvýšených teplot rychle k agregaci proteinů, která vyústí k viditelné precipitaci. Viditelně precipitovány protein je odstranitelný filtrací přes filtr s velikostí ok filtru 0,2 /xm. Zbývající rozpustný protein v roztoku je možné kvantifikovat četnými analytickými stanoveními, jako jsou například RP-HPLC, SEC-HPLC a UV absorbance. Agregace též zapříčiňuje snížení biologické aktivity, které může být stanoveno in vitro biologickým stanovením, které je zde popsáno.

Za použití analytických postupů zde popsaných je stanovení skladove/cí stability rhIL-2 v různých podmínkách následováno monitorací změn v množství rozpustného rhIL-2 jako funkce inkubačního času při zvýšených teplotách.

l.A. Účinky cukrů a aminokyselin

Účinek cukrů na skladovací stabilitu rhIL-2 se stanoví pro sorbitol, sacharózu a mannitol, v roztocích obsahujících 0,2 mg/ml rhIL-2, 10 mmol sukcinatu sodného o pH = 6 a

9

9 9 *

fc fc • fc •fc fcfcfcfc množství jednotlivého cukru. 270 mmol. Množství rozpustného rhIL-2, které zůstane ve vzorcích pro určování stability se vynese oproti inkubačnímu času, jak je znázorněno na ilustraci 1. Křivky sacharózy a mannitolu vynesené nad sebou značí jejich účinky na skladovací stabilitu IL-2 a jsou si navzájem podobné. Křivka pro sorbitol je o něco vyšší než křivky pro ostatní zkoumané cukry a značí, že sorbitol má mírně vyšší stabilizační účinek než mají ostatní cukry.

Účinek aminokyselin na skladovací stabilitu je znázorněn na ilustraci 2. Prostředky obsahují 0,1 mg/ml IL2, 10 mmol sukcinatu sodného o pH = 6 a 150 mmol jedné z devíti vybraných aminokyselin. Jak ukazuje ilustrace 2, rozsah stability je následující: Arg > Asp > Lys > Met > Asn > Leu = Ser = Pro ,= Gly.

Stabilizační účinek sorbitolu a argininu byl potvrzen dalšími studiemi, které ukázaly, že skladovací stabilita rhIL-2 je ovlivněna koncentrací. Z toho vyplývá, že skladovací stabilita rhIL-2 je vyšší, pokud se koncentrace sorbitolu zvýší z 50 mmol na 150 mmol a konečně na 270 mmol (ilustrace 3). Obdobně se skladovací stabilita rhIL-2 zvýši, pokud se zvýší koncentrace ve formulaci (ilustrace 4).

l.B Účinky pH prostředku

Zjišťují se profily skladovací stability pH formulací rhIL-2 obsahujících NaCl, sorbitol a arginin. Poločasy zbývajícího rozpustného IL-2 se při teplotě 50 °C oproti pH, jak je znázorněno na ilustraci 5. Poločas (t_1/2) se definuje jako čas potřebný pro 50% snížení množství rozpustného ·· ·· ttt t • · · · • · · · · • · · · t

proteinu ve vzorcích pro určování stability. Vyšší poločas značí vyšší skladovací stabilitu.

Jak je znázorněno na ilustraci 5, optimální hodnoty pH pro stabilizaci roztoků rhIL-2 proti agregaci proteinů závisí na stabilizačním přípravku, který je v roztoku přítomen. Maximální skladovací stabilita rhIL-2 v NaCl se dosáhne při pH = 4, kdy rhIL-2 má poločas při teplotě 50 °C přibližně 23 dnů. Prostředek rhIL-2 v sorbitolu vykazuje zvýšenou stabilitu se snižováním pH s maximální stabilitou okolo hodnot pH = 5, kdy poločas při teplotě 50 °C je přibližně 26 dnů. Nejvyšší stabilita (tedy nejdelší poločas) je dosažena v případě použití argininu jako stabilizačního přípravku ve formulaci o hodnotě pH přibližně 6,0, kdy poločas proteinu při teplotě 50 °C přibližně 32 dnů. Tyto výsledky naznačují, že arginin je s výhodoujším stabilizačním přípravkem než sorbitol a NaCl, protože optimální pH pro stabilizaci proteinu je při fyziologicky přijatelnější hodnotě pH.

I.C Účinek pufrovacího systému

Použití 10 mmol pufrovacího systému ve formulaci je vcelku běžné, a to pro poskytnutí vhodného pH a pro uchování určitého vhodného stupně pufrovací kapacity. Například pH prostředku 5,8 je možné dostat použitím 10 mmol směsi kyseliny jantarový a její soli, například sukcinatu sodného. Pokud je vybrán takovýto pufrovací systém, je možné jako primární stabilizační přípravek prostředku použít 150 mmol hydrochloridu argininu, ale není možné použít 150 mmol argininové báze, jelikož 150 mmol argininové báze by ti ti* titi ·« ti* titi tititi ti ti titi ti ti titi ti • titi titititi titi ti ti tititi titi titi tititi ti ti • ti titititi tititi tititi titi ti* titi titi titititi neumožnilo upraveni pH na hodnotu 5,8 použitím 10 mmol pufru.

Nicméně hydrochlorid argininu zapříčiňuje vyšší vzestup osmolarity než argininová báze. Z toho vyplývá, že prostředek obsahující 150 mmol hydrochloridu argininu, jehož pH je upraveno na 5,8 prostřednictvím 10 mmol pufru sestávajícího z kyseliny jantarové a sukcinátu sodného, je téměř izotonický, neboť, má osmolaritu přibližně.253 mmol/kg a poločas při teplotě 50 °C je přibližně 8 dnů (tabulka 1) .

Nicméně vyšší koncentrace argininu v formulaci'je žádoucí, jelikož skladovací stabilita vzrůstá se zvyšováním podílu tohoto stabilizačního přípravku. Pokud se koncentrace argininu zvýší na 230 mmol přidáním hydrochloridu argininu a pH se upraví na 5,8 prostřednictvím 10 mmol pufru sestávajícího z kyseliny jantarové a sukcinátu sodného, potom se poločas při teplotě 50 °C zdvojnásobí (přibližně na dnů), nicméně roztok je hypertonický a jeho osmolarita je přibližně 372 mmol/kg.

V případě, kdy kyselina jantarová funguje jako pufrovací systém pro přizpůsobení pH roztoku na hodnotu 5,8 a arginin je přítomen ve formě své báze, potom zvyšování koncentrace argininové báze na 230 mmol vede k obdobnému zdvojnásobení poločasu při teplotě 50 °C na přibližně 16 dnů. Nicméně toto zvýšení skladovací stability se dosáhne zatímco roztok zůstane téměř izotonický, s tím, že prostředek má osmolaritu přibližně 271 mmol/kg (viz tabulka

1). Tímto způsobem lze ve formulaci použít 230 mmol argininové báze za účelem zvýšení skladovací stability rhlL2, aniž by byla porušena izotonicita prostředku.

Tabulka 1

Osmolarita roztoku a skladovací stabilita formulací obsahujících rhIL-2

Skladovací stabilita je vyjádřena v poločasech (t_1/2) zbývajícího rozpustného rhIL-2 naměřených prostřednictvím RP-HPLC po skladování při teplotě 50 °C. Prostředek obsahující hydrochlorid argininu obsahuje 0,5 mg/ml rhIL-2, 1 mmol EDTA a 150 mmol nebo 230 mmol hydrochloridu Largininu a 10 mmol kyseliny jantarové a sukcinatu sodného pro upravení pH na 5,8. Prostředek obsahující argininovou bázi obsahují 0,5 mg/ml rhIL-2, 1 mmol EDTA a 150 mmol nebo 230 mmol L-argininové báze a 81 mmol nebo 128 mmol kyseliny jantarové pro upravení pH na 5,8.

Prostředky „	Osmolarita		t1/2 při
(všechny obsahují 1 mmol EDTA a maj í pH = 5,8)	(mmol/kg)	teplotě 50 °C (den)
150 mmol ArgHCl, 10 mmol sukcinatu sodného a kyseliny jantarové	253		8,0
150 mmol báze Arg, 81 mmol kyseliny jantarové	192		9,2
230 mmol ArgHCl, 10 mmol sukcinatu 51 sodného a kyseliny jantarové	372		16,9
230 mmol báze Arg, 128 mmol kyseliny jantarové	271		16,0.

·«» · * ·# »9 ·

F >99 ·· «9 999 ·>

• · 0999 9 9 9 rn h t* *» <· «·«·

Popsané dva způsoby úpravy pH byly prověřeny jinými pufrovacími systémy (tabulka 2). V případě, kdy se ve formulaci použije 150 mmol hydrochloridu argininu a pH se upraví na 5,8 přidáním 10 mmol kyseliny a její sodné soli, jsou všechny prostředky méně než izotonické, tedy s osmolaritou menší než 290 mmol/kg. Poločas rhIL-2 pro tyto prostředky při teplotě 50 °C se pohybuje v rozmezí přibližně 15 až 20 dnů. V případě, kdy se ve formulaci použije 230 itimol argininové býze a pH se upraví na 5,8 použitým pufru sestávajícího z kyseliny v podstatě zbavené její soli, zůstává prostředek s pH upraveným kyselinou citrónovou nebo kyselinou jantarovou stále nižší než izotonická, zatímco ostatní prostředky jsou bud' lehce hypertonické, jako v případě kyseliny fosforečné; nebo hypertonické, jak je tomu v případě kyseliny glutamové nebo kyseliny octové.

Nicméně poločas při teplotě 50% se pro všechny prostředky zvyšuje na více než 30 dnů. Proto při použití kyseliny citrónové nebo kyseliny jantarové, obě ve formě v podstatě očištěné od soli, jako pufrovacího systému, může být koncentrace argininu zvýšena na 230 mmol, přičemž se použije argininové báze, a tím se docílí lepší skladovací stability rhIL-2.

Tabulka 2

Osmolarita roztoku a skladovací stabilita formulací obsahujících rhIL-2

Skladovací stabilita je vyjádřena v poločasech (t_1/2) zbývajícího rozpustného rh.IL-2 naměřených prostřednictvím RP-HPLC po skladování při teplotě 50 °C. Všechny prostředky obsahují 0,2 mg/ml rhIL-2, 5mmol methioninu, 1 mmol ·· ···· binatrium-EDTA, 0,1 % polysorbatu 80 a 150 mmol hydrochloridu L-argininu s pH upraveným na 5,8 přidáním 10 mmol kyseliny a její sodné soli nebo 230 mg L-argininové báze s pH upraveným na 5,8 titrací kyselinou v její čisté formě.

Prostředek	Osmolarita (mmol/kg)	^1/2 (den)
150 mmol ArgHCl, 10 mmol citrátu sodného a kyseliny citrónové	24 8	20,5
230 mmol báze Arg, 86 mmol kyseliny citrónové	228	36,1
150 mmol ArgHCl, 10 mmol sukcinatu sodného a kyseliny jantarové	257	19,1
230 mmol báze Arg, 128 mmol kyseliny jantarové	285	29,2
150 mmol ArgHCl, 10 mmol fosfátu sodného a kyseliny fosforečné	260	15,6
230 mmol báze Arg, 193 mmol kyseliny fosforečné	329	29,9
150 mmol ArgHCl, 10 mmol glutamatu sodného a kyseliny glutamové	264	14,6
230 mmol báze Arg, 225 mmol kyseliny glutamové	407	47,5
150 mmol ArgHCl, t?0 mmol octanu sodného a kyseliny octové	259	20,8
230 mmol báze Arg, 250 mmol kyseliny octové	408	31,9

• « • · to to to · to · to ♦ to to ··· ···· ·· « • to·· ·· ·· ··· to · • · ···· · · · ··· ·· ·· ·· ·· ····

l.D Účinek koncentrace proteinu

Účinek koncentrace proteinu na skladovací stabilitu se zjišťuje na formulaci obsahující 10 mmol sukcinátu sodného o pH - 6 a 150 mmol argininu. Jak je ukázáno na ilustraci 6, kde se poločas rozpustného rhIL-2 při teplotě 50 °C vynese proti původní koncentraci proteinu, zvyšuje se skladovací stabilita rhIL-2 s poklesem koncentrace proteinu. Tento nález je v souladu s experimentálním poznatkem, že agregace je hlavní degradační cestou rhIL-2 v kapalných prostředcích.

l.E Účinek neionického surfaktantu polysorbátu 80

Účinek polysorbátu 80 (Tween 80 nebo Tw 80) na skladovací stabilitu rhIL-2 se testuje na formulaci obsahující 0,5 mg/ml IL-2, 230 mmol argininově báze, 128 mmol kyseliny jantarové pro upravení pH na 5,8, 1 mmol EDTA a 0%, 0,02% a 0,1% polysorbát 80. Jak je znázorněno v tabulce 3, oba prostředky obsahující polysorbát 80 vykazují redukci poločasu rozpustného IL-2 při teplotě 50 °C, ze 16 dnů na 9 dnů, pří měření RP-HPLC. Z toho vyplývá, že zahrnutí polysorbátu 80 do prostředku by mohlo být bylo pouze z hlediska jeho účinku na agregaci proteinu vnímáno jako nevýhodné. Nicméně tento přípravek má stabilizační efekt působící proti akutnímu poškození proteinových molekul, ke kterému dochází při zmrazení a tání a působení mechanických střižných sil, a je výhodný v průběhu výroby kapalných formulací obsahujících tento protein, jak je odhaleno v příkladech uvedených dále.

• to · to· ·· toto toto • · · · · »· to · » · · • toto · · · · toto · • to to to to to · to tototo · to to · ··· ··· ··· ·· ·« ·· ·· ♦···

Dále se testuje skladovací stabilita dvou formulací obsahujících sorbitol. I když jejich poločasy stanovené RPHPLC a biologická aktivita jsou srovnatelné s prostředky obsahujícími arginin, poločasy stanovené SEC-HPLC jsou mnohem nižší, z čehož vyplývá, že větší část proteinu rhIL-2 v těchto prostředcích je patrně přítomna v rozpustných agregovaných formách.

Tabulka 3

Poločasy (t_1/2) zbývajícího rozpustného rhIL-2 (pík B) naměřené prostřednictvím RP-HPLC, SEC-HPLC a in vitro biologické stanovení pro prostředky obsahující rhIL-2 skladované při teplotě 50 °C

Prostředky (všechny s pH = 5,8 a obsahující 1 mmol EDTA)	t1/2 při teplotě 50 °C (den) RP SEC biol. aktivita
230 mmol báze Arg, 128 mmol kyseliny jantarové, pH = 5,8	16,0	21,3	25,6
230 mmol báze Arg, 128 mmol kyseliny jantarové,E0,02% Tw 80, pH = 5,8	9,7	12,4	NA
230 mmol báze Arg, 128 mmol kyseliny jantarové, 0,01% Tw 80, pH = 5,8	9,1	12,2	24,5
270 mmol sorbitolu, 10 mmol sukcinatu sodného, 0,01% Tw 80, pH = 4,5	31,7	3,6	NA
270 mmol sorbitolu, 10 mmol sukcinatu sodného, 0,01% Tw 80, pH = 5,0	14,4	2,4	21,3

4 • · »4

44

4 4 4

4 ·

4 4

9444

V tabulce 3 je poločas prostředku obsahující rhIL-2 s argininovou bázi a kyselinou jantarovou stanovený metodou RP-HPLC o něco kratší než poločas stanovený metodou SECHPLC, a o mnoho kratší než poločas stanovení in vitro biologickým stanovením. Pro další sledování rozdílností se stanoví eluování hlavní sloučeniny rhIL-2 metodou SEC-HPLC. Vzorky+s a bez zpracování SDS, močovinou a DTT nevykazují žádnou změnu v elučních časech hlavní sloučeniny, což značí, že rhIL-2 je v těchto prostředcích přítomen v monomerní formě. Nicméně SEC-HPLC protokol nemusí být schopen rozlišit další monomerní sloučeniny, například methioninovou oxidovanou sloučeninu reprezentovanou pikem A od hlavní monomerní intaktní sloučeniny reprezentovanou pikem B. Proto se očekává malý rozdíl při určování poločasu.

Biologické stanovení in vitro pro určení biologické aktivity uvedené v údajích prezentovaných v tabulce 3 se provede za použití 0,1 % SDS obsaženého v ředidle experimentálního roztoku. Proto před aplikací vzorků na plotnu s tkáňovými kulturami pro zjištění interakce s myšími

HT-2 buňkami se vzorky zředí ředidlem obsahujícím 0,1 % SDS.

(

Je možné, že ředění SDS zapříčiní disociaci některých agregátů rhIL-2 v těchto vzorcích zpět na monomerní formu, čímž se falešně zvýší biologická aktivita daného prostředku. Proto se vzorky testované na stabilitu analyzují za použití ředidla s (+S) a bez (-S) přidání SDS. Vzorky se též testují s (+F) a bez (-F) zpracování filtrací přes síto s velikostí ok 0,2 jLtm, a to proto, že filtrací se odstraní velké agregáty proteinů, jak lze posoudit zrakem. Hodnoty biologické aktivity naměřené pro jednotlivé vzorky ·· ·· ·· ·· ·· ·» · · » · · 4*4« • · · · · · « · t ····· ·· · f · · · •· · · ·· ·· ···· zpracované uvedeným způsobem jsou znázorněny v tabulce 4 společně s výsledky skladovací stability, které se dostanou použitím protokolu RP-HPLC pro porovnání. Hodnoty jsou uvedeny jako procento hodnot biologické aktivity získaných od obdobných vzorků skladovaných při teplotě -70 °C.

Obecně platí, že.prostředky ředěné SDS a nepřefiltrované před kontaktem s HT-2 buňkami vykazuji vyšší hodnoty biologické aktivity než prostředky ředěné bez SDS v experimentálním roztoku a přefiltrované před spuštěním stanovení. Mezi těmito výsledky biologické aktivity jsou ty, které byly získány při použití filtrace a ředěním bez SDS poměrně srovnatelné s výsledky RP-HPLC. Proto je tento způsob doporučen pro skutečné měření biologické aktivity monomerního rhIL-2.

Tabulka 4

Porovnání výsledků RP-HPLC analýzy pro rozpustný rhIL-2 a in vitro analýzy biologické aktivity vzorků testovaných na stabilitu skladovaných po dobu 2 týdnů při teplotě 40 °C a 50 °C

Všechny výsledky jsou uvedeny jako procenta hodnot získaných pro analogické vzorky při teplotě -70 °C.

Prostředky obsahují 0,5 mg/ml rhIL-2, 230 mmol L-argininové báze, 128 mmol kyseliny jantarové o pH 5,8 a 1 mmol EDTA s (#1) a bez (#2) 0,1% polysorbatem 80. Vzorky pro biologické stanovení se buď přefiltrují nebo se nepřefiltruji přes filtrační membránu s velikostí ok 0,22 μπι a poté se zředí rozpouštědly, která buď obsahují nebo neobsahují 0,1% SDS.

• 9 9 9 * · * 99 99 *99 9 · · 9 » * »» 9

99999 99 9*9 9 9

9 9999 999

999 9 9 9· ·· 99 9999

Vzorek	% biologické aktivity		%RP
HPLC	(procento	aktivity vzorků při	(% vzorků
	teplotě -	70 °C)			při -70 °C)
	-F+Sa	+F+Sa	-F-Sa +F-Sac
#1 při 40 °C	106	100	104	100	101
#1 při 50 °C	92	79	60	53	58
#2 při 40 °C	101	69	106	112	98
#2 při 50 °C	60	38	62	47	42

a -F značí nepřefiltrovaný vzorek +F značí přefiltrovaný vzorek -S značí ředidlo bez obsahu SDS +S značí ředidlo obsahující SDS b znamená, že se jedná o protokol doporučený pro monomerní IL-2

l.F Kompatibilita konzervačního přípravku

Kompatibilita konzervačního přípravku se zjištuje z důvodu potřeby vyvinout vícedávkovou (multidávkovou) formulaci. Účinky konzervačních přípravků na stabilitu IL-2 se stanoví prostřednictvím dvou urychlených (akcelerovaných) studií. Studie č. 1 testuje benzylalkohol, meta-krezol a fenol ve formulaci obsahující 0,2 mg/ml IL-2, 10 mmol sukcinátu sodného .<3 pH = 6 a 160 mmol argininu. Studie č. 2 testuje benzethoníum-chlorid, benzalkonium-chlorid, směs methylparabenu a propylparabenu a chlorbutanol ve formulaci obsahující 0,2 mg/ml IL-2, 230 mmol L-argininové báze, 128 mmol kyseliny jantarové s pH = 5,8, 1 mmol dinatrium-ETDA a 0,1 % polysorbát 80. Poločasy rozpustného IL-2 pro tyto • · • · · · · ·· « 4 4 4 4 4 4 4 9 4 · 4 4

444 4 444

444 44 4 4 «4 44 4444 prostředky skladované při teplotě 40 °C naměřené prostřednictvím RP-HPLC jsou uvedeny v tabulce 5.

Všechny testované konzervační přípravky snižují stabilitu IL-2 při zvýšené teplotě. Ve studii č. 1 je poločas rozpustného IL-2 při teplotě 40 °C přibližně 74 dnů bez jakéhokoliv konzervačního přípravku. Přidání benzylalkoholu nebo meta-krezolu nebo fenolu signifikantně redukuje poločas,(a to pětkrát až desetkrát. Ve studii č. 2 .

jsou účinky konzervačního přípravku mnohem méně vyjádřené.

Poločas rozpustného IL-2 se snižuje méně než dvakrát při použití benzethonium-chloridu a více než dvakrát pro ostatní uvedené konzervační přípravky. Z toho celkově vyplývá, že benzethonium-chlorid zapříčiňuje nejmenší redukci stability IL-2 ze všech testovaných konzervačních přípravků.

Tabulka 5

Poločas (t_1/2) rozpustného IL-2 při teplotě 40 °C pro prostředky obsahující konzervační přípravky

Studie δ. 1: prostředky obsahují 0,2 mg/ml rhIL-2, 10 mmol sukcinatu sodného s pH = 6 a 160 mmol argininu a konzervační přípravky.

Studie č. 2: prostředky obsahují 0,2 mg/ml IL-2, 230 mmol Largininové báze, 128 mmol kyseliny jantarové s pH = 5,8, 1 mmol dinatrium-ETDA a 0,1 % polysorbát 80 a konzervační přípravky.

« to* ·· ·· ·· ·«

9 9 · ♦ · · toto·· • tototo·· toto to»· · ·

9 9 9 · 9 9 9 9

999 toto toto ·· ·« ·»«·

Konzervační přípravek	t1/2 při teplotě 40 °C
Studie č. 1
žádný konzervační přípravek	74,0
0,9% (hmotnost/objem) benzylalkohol	16,0
0,25% (hmotnost/objem) meta-krezol	7,5
0,5% (hmotnost/obiem) fenol	11,0
Studie č. 2
žádný konzervační přípravek	261,0
0,01% (hmotnost/objem) benzethonium-chlorid	185,0
0,01% (hmotnost/objem) benzalkonium-chlorid	67,0
0,18% (hmotnost/objem) methylparaben a propylparaben	113,0
0,5% (hmotnost/objem) chlorbutanol	84,0

Navzdory tomu, že konzervační přípravky mají výrazný destabilizační účinek na stabilitu IL-2 při zvýšené teplotě, testují se také jejich účinky na krátkodobou skladovací stabilitu IL-2 při teplotě 4 °C a 25 °C. Provede se další studie testující šest konzervačních přípravků ve stejné formulaci, která obsahuje 0,2 mg/ml IL-2, 230 mmol Largininové báze, 128 mmol kyseliny jantarové, 1 mmol EDTA, 5 mmol methioninu s 0,1 % polysorbatu 80 při pH = 5,8. Tabulka 6 uvádí výsledné množství rozpustného rHIL-2, který zůstal ve formulaci po jednom roce skladování. Všechny prostředky • · • · · • 9 9 « nevykázaly při porovnání s kontrolní studií signifikantní pokles množství rozpustného rhIL-2 při analýze jak RP-HPLC tak biologickým stanovením, s výjimkou prostředku obsahujícího 0,25 % meta-krezolu, v jehož případě množství rozpustného rhIL-2 signifikantně pokleslo.

• · 9 ·

9 · • 9 9 9 9 • 9

9 9 9 9 β <

• 9 · · 9 9

9* 9999

Tabulka 6

Skladovací stabilita po 1 roce skladování prostředku obsahující konzervační přípravek při teplotě 4 °C a 25 °C prezentovaná jako procento celkového rozpustného rhIL-2, který zůstal ve formulaci a je stanoven prostřednictvím RPHPLC integrovaných ploch piků a biologickou aktivitou in vitro

Kontrolní prostředek obsahuje 0,2 mg/ml IL-2, 230 mmol L-argininové báze, 128 mmol kyseliny jantarové, 1 mmol EDTA, 5 mmol methioninu a 0,1 % polysorbatu 80 o pH = 5,8.

Konzervační přípravek	% počátečního IL-2 biolog. Aktivita stanoveno RP-HPLC in vitro (x 10° IU/ml)
	4°C	25°C	t = 0	lrok 4°C	lrok 25°C
Kontrola	102	93	3,8	3,3	2,5
0,9% benzylalkohol	100	88	4,8	4,0	5,0
0,25% meta-krezol	98	60	5,8	2,6	2,5
0,5% fenol	99	87	4,7	3,9	3,2

• 4

4 4444 444 • •4 44 44 *· 44 44··

0,01% benzalkoniunj- chlorid	102	93	5,5	3,9	4,4
0,01% benzethonium- chlorid	98	89	5,4	3,2	4,7
0,5% chlorbultanol	99	91	5,1	3,6	4,5

Příklad 2

Účinky různých faktorů na oxidaci methioninu a skladovací stabilitu rhIL-2

Oxidace methioninových částí molekuly IL-2 byla popsána již dříve (Kunitani a kol., J. Chromátography, 359. 391 až 402 (1986); Sasaoki a kol., Chem. Pharm. Bull.,

37(8). 2160 až 2164 (1989)). IL-2 obsahuje čtyři methioninové zbytky v polohách 23, 39, 36 a 104 polypeptidového řetězce. Mezi nimi je methionin v poloze 104 lokalizován na povrchu proteinu a vykazuje nejvyšší tendenci k oxidaci. Tuto oxidovanou variantu methioninu lze odlišit jako časně eluující sloučeninu (pík A) od hlavní sloučeniny IL-2 (pík B) na RP-HPLC chromatogramu. Methionin v poloze 23 a methionin v poloze 39 jsou méně náchylné k oxidaci, ke které dochází pouze za extrémně oxidativních podmínek, a to pravděpodobně v důsledku jejich výskytu uvnitř molekuly proteinu. Oxidovaná varianta těchto methioninových zbytků může při RP-HPLC eluuovat časněji než methionin v poloze 104. Methionin v poloze 46 je ukryt hluboko uvnitř molekuly proteinu a k jeho-oxidaci nedochází snadno, až na situaci, kdy se protein kompletně rozvine.

·

4

4 ♦ ·4

4 4 • 4 4

4

444 «4

44

4 4

44 * 4 ♦ • · 4

4 4

4 4

4444

Zjišťování oxidace methioninu v molekule IL-2 je soustředěno na oxidaci methioninu v poloze 104, protože methionin v této poloze je nejnáchylnější vůči oxidaci a zabránění jeho oxidace zabrání též oxidaci ostatních methioninových zbytků.

2.A

Účinek pH

Oxidace methioninu se zjišťuje při hodnotách pH v rozmezí od 3 do*9 v prostředcích obsahujících 0,2 mg/ml IL-2, 150 mmol NaCl a 10 mmol různých pufrovacích sloučenin. Oxidace methioninu v těchto prostředcích se stanoví kvantifikací procenta sloučeniny píku A (například oxidovaného methioninu v poloze 104) ve vzorcích IL-2 v čase t = 0 a t = 3 měsíce. Jak je uvedeno v tabulce 7, efekt pH není zaznamenán v čase t = 0, kromě vzorku pufrovaného citrátem o pH = 6. Při porovnání s ostatními vzorky, které obsahují 5 % sloučeniny píku A vykazuje vzorek obsahující citrát vzestup množství sloučeniny píku A na 6 %.

V čase t - 3 měsíce vzrůstá množství sloučeniny píku A za podmínek s vyšším pH, což značí, že mechanismus oxidace methioninu v poloze 104 je závislý na zásaditém prostředí. Při pH = 6 je sukcinat lepším pufrem než citrát co se minimalizace oxidace methininu týká, protože v případě prostředku obsahující sukcinat jsou zaznamenány nižší hodnoty píku A.

• · · 9 · « 4494

4 4·· 44 4

444· 4 44 944· 4

9 4 · 4 4 44

99 99 44 4« 444444

Tabulka 7

RP-HPLC stanovení oxidace methioninu vyjádřené jako procento celkového množství rozpustného IL-2 (pik A + pík B) přítomné jako methionin-oxidovaná sloučenina reprezentovaná pikem A (% píku A z celkového rozpustného IL-2) ve vzorcích formulací s pH v rozmezí 3 až 9 v čase t = 0 a t = 3 měsíce

Prostředky obsahují 0,2 mg/ml IL-2, 150 mmol NaCI ajejich pH je upraveno použitím 10 mmol rozličných pufrovacích přípravků.

Pufr a pH	% sloučeniny píku A z celkového rozpustného IL-2 t = 0 t = 3 měsíce
		-70°C	4°C	25°C	40°C
10 mmol glycinu, pH 3	5	4	5	6	7
10 mmol acetatu, pH 4	5	5	6	7	6
10 mmol acetatu, pH 5	NA	7	8	9	9
10 mmol citrátu, pH 6	6	6	8	12	14
10 mmol sukcinatu, pH 6	5	6	7	4	9
10 mmol fosfátu, pH 7	5	7	8	11	5
10 mmol borátu, pH 9	5	11	15	14	NA

.B

Účinky EDTA, polysorbátu 20, polysorbátu 80 a MgCl₂

Účinky kovového chelátu, dvou neionických surfaktantů a bivalentního kovového iontu na oxidaci methioninu jsou uvedeny v tabulce 8. Přítomnost polysorbátu 20 nebo • fcfc fc* fcfc, fcfc fcfc rq-l » fc * ♦ «fcfc» fc fcfcfc fcfc fcfc fc fc fc fc fc • · fcfcfcfc fcfcfc fcfcfc fcfc fcfc fcfc fcfc fcfcfc· polysorbatu 80 v prostředcích zvyšuje množství oxidované sloučeniny, jak v čase t = 0, tak v čase t = 1. Naproti tomu EDTA a MgCl₂ redukuje množství oxidované varianty methioninu po 1 měsíci skladování při teplotě 40 a 50 °C.

Tabulka 8

Procento z celkového množství rozpustného IL-2 (pík A + pík B) přítomného jako methionin-oxidovaná sloučenina reprezentovaná pikem A (% píku A) ve vzorcích IL-2 v čase t = 0 a t = 1 měsíc

Kontrolní vzorek obsahuje 0,2 mg/ml IL-2, 10 mmol sukcinatu sodného o pH = 6 a 150 mmol argininu.

Prostředky	% sloučeniny píku A (varianta s oxidovaným methioninem) t = 0 t = 1 měsíc
		-70°C	4°C	40°C	50°C
Kontrola	2,8	3,5	5,1	19,7	36,3
1 mmol EDTA	2,5	3,5	5,0	9,5	14,0
0,1% polysorbat 80	5,8	4,3	6,9	21,5	41,4
1 mmol EDTA + 0,1% polysorbat 80	5,9	4,2	6,9	12,1	19,2
0,1% polysorbat 20	4,1	5,4	9,6	25,3	42,8
5 mmol MgCl2 i	3,9	4,8	5,9	9,7	12,1

♦ · ··· ·· • » *♦ • ♦ · « * * 99 * fefe * * · · · fefe fefe • fe fefe • fefe * • fe » • fefe · • fefe fefe fefefefe .C

Účinek methioninu

Testuje se účinek přidáni methioninu do formulací s cílem zabránit oxidaci methioninu v prostředcích obsahujících IL-2. Tabulka 9 zaznamenává změny v píku A a celkovém množství^rozpustného IL-2 (pík A a pík B) v prostředcích obsahujících variabilní množství methioninu po 2 týdnech při skladování při teplotě 50 °C. Zvyšování koncentrace methioninu v prostředcích signifikantně redukuje hodnotu píku A jak v čase t = 0 tak v čase t = 2 týdny, přičemž množství rozpustného IL-2 zůstává po týdnech neovlivněno. Při množství 5 mmol methioninu je zaznamenán trojnásobný pokles píku A v čase t = 2 týdny. Z toho vyplývá, že přidání methioninu vede k signifikantnímu snížení oxidace methioninu obsaženého v proteinu a má minimální efekt n< agregaci IL-2.

Tabulka 9

Změna píku A a celkového rozpustného proteinu ve vzorcích IL-2 v čase t = 0 a t = 2 týdny při teplotě 50 °C

Prostředky obsahují 0,2 mg/ml IL-2, 230 mmol argininu, 128 mmol kyseliny jantarové o pH = 5,8, 1 mmol EDTA, 0,1 % polysorbatu 80 a 0 až 10 mmol methioninu.

• 00 94 ♦♦ ·· 4· ·< · · 0 · · · 0 0*0

0 4 4 4 ♦· 0 0 ·

444 0 0 44 400 · · « 0 0400 »40

Prostředky	% sloučeniny píku A % zbývajícího (varianta s oxidovaným IL-2 methioninem) t = 0 t = 2 týdny t = 2 týdny při 50 °C při 50 °C
Vzorek neobsahuj ící methionin	2,1	6,3	76
1 mmol methioninu	1,4 . ..	2,7	77
5 mmol methioninu	1,2	2,1	77
10 mmol methioninu	1,2	1,9	76

Dodatečně k ,_svýsledkům pro vyšší teploty, byla též zaznamenávána úroveň oxidace methioninu při teplotě 4 °C a 25 °C po 3 měsících skladování pro prostředky obsahující a neobsahující 5 mmol methioninu. Jak znázorňuje tabulka 10, přítomnost 5 mmol methioninu ve formulaci vede ke trojnásobnému poklesu úrovně píku A, a to jak při teplotě °C, tak při teplotě 25 °C. Z toho vyplývá, že přidání mmol methioninu efektivně zabraňuje oxidaci methioninu v poloze 104.

Tabulka 10

Úroveň oxidace methioninu vyjádřená celkového množství rozpustného IL-2 přítomného jako methionin-oxidovaná jako procento z (pík A + pík B) sloučenina • ·· ·· fc* 99 fcfc • fc# fc fc 9 9 9 9 9 9 9

999 9999 99 9 • fcfcfcfc· fcfc fcfcfc · · fc · fcfcfcfc fc fcfc fcfcfc fcfc fcfcfcfc fcfc fcfcfcfc reprezentovaná pikem A (% píku A z celkového rozpustného IL2) a procento rozpustného IL-2, který zůstává ve vzorcích skladovaných po dobu 3 měsíců při teplotě buď 4 °C nebo 25 °C

Prostředky obsahují 0,2 mg/ml IL-2, 230 mmol argininu, 128 mmol kyseliny jantarové o pH = 5,8, 1 mmol EDTA, 0,1 % polysorbátu 80 a 0 až 5 mmol methioninu.

Prostředky	Procento píku A z % zbývajícího IL-2 Celkového rozpustného IL-2 (hlavní pík)
	4 °C 25 °C 4 °C 25 °C
0 mmol	2,7	4,1	101	97
5 mmol	0,8	1,4	101	100

.D

Účinek odstranění «kyslíku prostřednictvím proplachování dusíkem a odplyňováním

Testuje se účinek odstranění kyslíku z nádob obsahující vzorky IL-2 za účelem minimalizovat oxidaci methioninu. Vzduch nad kapalinou v nádobě o objemu 30 ml obsahující 1 ml vzorku IL-2 se propláchne dusíkem.

Rozpuštěný molekulární kyslík se odstraní způsobem vakuového odplyňování. Tabulka 11 znázorňuje změnu píku A a celkového množství rozpustného IL-2 (pík A + pík B) po 1 týdnu skladování těchto/vzorků. Promývání dusíkem jako takové mírně snižuje procento methionin-oxidované sloučeniny ze 6,7 % na 6,2 %. Kombinace odplyňování roztoku a promývání fc fcfc fcfc ♦» fc* fcfc «♦·· fcfcfcfc ♦♦♦* íj ·#·»»····· fc fcfcfc·· fcfc fcfcfc · · • · fc fcfcfc fcfcfc • fcfc fcfc fcfc fcfc fcfc fcfcfcfc vzduchu nad roztokem dusíkem dále snižuje úroveň píku A o další procento. druhou stranu procento celkového množství rozpustného IL-2 zůstává nezměněno, jak při promývání dusíkem, tak při odplyňování.

Tabulka 11

Účinek na procento z celkového množství rozpustného IL-2 (pík A + pík Β), které je přítomné jako methionin-oxidovaná sloučenina reprezentovaná pikem A (% píku A) a na procento z celkového množství rozpustného IL-2 , který ve vzorcích zůstane pří odběn/ vzorků v čase t = 0 a t = 1 týden při teplotě 50 °C.

Prostředky obsahují 0,3 mg/ml IL-2, 230 mmol argininu,

128 mmol kyseliny jantarové, 1 mmol EDTA a 0,1 % polysorbatu 80.

Prostředky	Procento píku A	% ainu)	zbývajícího IL-2
(oxidace	methioi
	t =?0		t = 1 týden	t = 1 týden
			při 50 °C	při 50 °C
Kontrola	3,1	6,7	81
Promyto dusíkem	3,1	6,2	82
Odplyněno a	3,0		5,8	81
promyto dusíkem

·♦ 19

9 9 ·» * * · · • · · t · · · » 9 • 11 11 11 111 1 1 · 1 1 1 111 ··· 11 11 91 19 9991 .Ξ

Účinek konzervačních přípravků

Zkoumá se účinek konzervačních přípravků na oxidaci methioninu. Tabulka 12 znázorňuje změnu v píku A pro vzorky formulací obsahující a neobsahující jeden ze šesti konzervačních přípravků po 6 a 12 měsících skladování při teplotě 4 °C a 25 °C. Všechny prostředky obsahující konzervační přípravky vykazují obdobnou úroveň píku A jako kontrola, což značí, že konzervační přípravky nemají žádný detekovatelný účinek na oxidaci methioninu kromě prostředku obsahující 0,25 % meta-krezolu, která vykazuje signifikantní vzestup úrovně píku A.

Tabulka 12

Procento celkového množství rozpustného IL-2 (pík A + pík B) přítomného jako methionin-oxidovaná sloučenina reprezentovaná pikem A (% píku A) v různých prostředcích obsahujících konzervační přípravky skladovaných po dobu 6 a 12 měsíců při teplotě 4 °C a 25 °C

Kontrolní prostředek obsahuje 0,2 mg/ml IL-2, 230 mmol L-argininové báze, 128 mmol kyseliny jantarové, 1 mmol EDTA, mmol methioninu, 0,1% polysorbátu 80 s pH = 5,8.

ti titi titi ti· titi titi • tititi ti ti · ti titititi • titi ti · »· titi ti • tititi titi titi tititi ti ti • ti ti··· tititi tititi titi titi titi titi titititi

Konzervační přípravek	% píku A t = 0	(methionin-oxidovaná sloučenina)
6 měsíců	12 měsíců
		4°C	25°C	4°C	25°C
Kontrola	1,5	1,6	1,9	1,8	2,6
0,9% benzylalkohol	1,6	1,7	2,3	1,9	3,3
0,25% meta-krezol	1,6	1,8	6,7	2,1	3,5
0,5% fenol	1,6	1,7	2,4	1,8	3,6
0,01% benzalkonium- i chlorid	1,5	1,6	2,0	1,0	3,0
0,01% benzethonium- chlorid	1,5	1,7	2,0	1,8	2,8
0,5% chlorbultanol	1,5	1,6	2,0	1,8	3,2

Příklad 3

Účinek různých faktorů na deaminaci IL-2

Deaminace IL-2 byla popsána již dříve (Kunitani a kol., J. Chromatography, 359. 391 až 402 (1986)). Aspartat v poloze 88 byl objeven jako primární místo pro deaminaci v molekule IL-2 (Sasaoki a kol., Chem. Pharm. Bull., 40. 976 až 980 (1992)). Deaminovaná sloučenina může být detekována RP-HPLC jako vedlejší pík (pík B') píku hlavní sloučeniny (pík B). Deaminace IL-2 se studuje na prostředcích obsahujících arginin, NaCl a sorbitol. Tabulka 13 znázorňuje, že deaminovaná sloučenina může být detekována pouze v prostředcích obsahujících sorbitol a NaCl, avšak ne ·· • to

• to • · •Φ • · • toto • · * • · • · to • · · • · ·· v prostředcích obsahujících arginin, po inkubaci za zvýšených teplot po dobu 2 týdnů. Z toho vyplývá, že arginin stabilizuje IL-2 a zabraňuje degradaci cestou deaminace.

• · to · • · · ·· ···«

Tabulka 13

Deaminace detekovaná RP-HPLC jako sloučenina reprezentovaná pikem B' v prostředcích obsahujících 0,2 mg/ml IL-2, 10 mmol sukcinátu sodného o pH = 6 a 150 mmol argininu, 150 mmol NaCl nebo 270 mmol sorbitolu

Prostředek	% píku B (deaminace) vt=0at=2 týdny
	t=0	-70°C	40°C	50°C
10 mmol NaSuc, 150 mmol Arg, pH 6	0	0	0	0
10 mmol NaSuc, 150 mmol NaCl, pH 6	0	0	0	3
10 mmol NaSuc, 270 mmol sorbitol, pH 6	0	0	2	2

Příklad 4

Účinek zmrazování a rozmrazování na stabilitu IL-2

Zmrazením indukované poškození proteinu je obvykle zapříčiněno třemi mechanismy:

Ί9 • ··· ·· · · · · · · · ♦ · · ·· 9 9 «· «· ····

1) protein je konformačně nestálý při nízkých teplotách (denaturace chladem);

2) protein je susceptibilní k denaturaci na rozhraní s ledu s vodou ;

3) protein je poškozen změnami v koncentraci solí nebo posunem pH při zmrazení.

V případě IL-2 je ztráta proteinu v průběhu zmrazování a rozmrazování pravděpodobně způsobena denaturaci a agregací na rozhraní s ledu s vodou, protože neionický surfaktant polysorbát 80 efektivně ochraňuje IL-2 od poškození zmrazováním a rozmrazováním. Jak je znázorněno na ilustraci

7, množství rozpustného IL-2 se snižuje v průběhu každého cyklu zmrazení a rozmražení prostředku obsahujícího 0,2 mg/ml IL-2, 10 mmol sukcinatu sodného o pH = 6, a 150 mmol argininu. Přidání polysorbatu 80 do prostředku zvyšuje stabilitu IL-2 a zabraňuje poškození opakovaným zmrazováním a rozmrazováním. V momentě, kdy koncentrace polysorbatu 80 dosáhne 0,05 % a vyšší, je IL-2 plně ochráněn před poškozením v průběhu zmrazování a rozmrazování.

Příklad 5

Účinek mechanických střižných sil na stabilitu IL-2

5.1. Účinek polysorbatu 80, EDTA, koncentrace proteinu a plnícího objemu

Provedou se studie analyzující ztráty rozpustného IL-2 indukované mechanickými střižnými silami. Prověřují se dva typy střižných sil: protřepávání na třepačce Orbital Shaker (VWR Scientific, Cat. No. 57 018 - 754) a víření v míchači « · (Fisher Scientific, model Genie 2, s rychlostí nastavenou na stupeň 4). Různé prostředky IL-2 se naplní v množství 1 ml do 3ml nádob. Tyto nádoby se skladují v lednici (kontrolní vzorky), umístí se na laboratorním stojanu přes noc (statické vzorky), protřepávají se rychlostí 200 cyklů za minutu přes noc (protřepávané vzorky) nebo se míchají ve víru po dobu 1 minuty (vířené vzorky). Tabulka 14 uvádí výsledky změny v množství rozpustného IL-2 v těchto vzorcích.

V porovnání s kontrolními vzorky uloženými v lednici, jak statické, tak protřepávané vzorky nevykazují žádnou ztrátu IL-2. Z toho vyplývá, že IL-2 je stabilní při teplotě místnosti a je stabilní vůči protřepávání. Na druhou stranu, pokud se tyto vzorky podrobí víření po dobu 1 minuty, jsou detekovány různé úrovně ztrát. Prostředky obsahující 0,1 až 0,5 mg/ml IL-2 ne^o 1 a 5 mmol EDTA nebo nižší koncentrace polysorbatu 80 (0,005 až 0,05 %) vykazují všechny 25% až 50% ztrátu rozpustného IL-2. Tedy jedna minuta víření má výraznější poškozující účinek na molekulu IL-2 než protřepávání přes noc. Ztrátě IL-2 může být zabráněno zvyšováním koncentrace polysorbatu 80 obsaženého ve formulaci do množství stejného či vyššího než 0,1 %. Navíc plně naplněné nádoby bez ponechaného vzduchu nad kapalinou vykazují minimální ztrátu rozpustného IL-2 v průběhu 1 minuty víření, což značí, že vzduchem vyplněné rozhraní je hlavním faktorem zapříčiňujícím poškození.

Tabulka 14

Změna v množství rozpustného IL-2 ve vzorcích skladovaných při teplotě místnosti přes noc (statické vzorky), ve ·· ·· ·· • * » · · • · ·· · · · ··· ·· · φ · φ φ φ φ • ···· · φ φ ·· ·· ♦♦ ·· ···· vzorcích protřepávaných rychlostí 200 cyklů za minutu (protřepávané vzorky) a míchaných ve víru (vířené vzorky) při porovnání se vzorky skladovanými při teplotě 4 °C

Kontrolní prostředek obsahuje 0,2 mg/ml IL-2, 10 mmol sukcinatu sodného o pH = 6 a 150 mmol argininu. Prostředek se naplní v množství 1 ml do skleněných nádob o objemu 30 ml, s výjimkou kompletně naplněného vzorku, kdy je kontrolní vzorek naplněn až k okraji nádob o objemu 30 ml, přičemž v hlavě nádoby není ponechán žádný vzduch. Množství rozpustného IL-2 se kvantifikuje prostřednictvím RP-HPLC.

Vzorek (v množství 1 ml do nádoby 30 ml)	% zbývajícího rozpustného IL-2 statický protřepávaný vířený vzorek vzorek vzorek přes noc přes noc po 1 minutu
0,2 mg/ml IL-2 (kontrola)	9S, 6	100,8	74,7
0,1 mg/ml IL-2	100,3	102,7	72,0
0,5 mg/ml IL-2	99,7	101,0	6 8,6
1 mmol EDTA	97,6	101,2	59,6
5 mmol EDTA	99,3	102,7	72,2
0,005 % polysorbátů 80	100,6	100,0	46,5
0,01 % polysorbátů 80	99,7 e	100,4	66,1
0,05 % polysorbátů 80	99,3	100,3	93,9
0,1 % polysorbátů 80	99,2	100,0	89,0
0,2 %	99,3	99,2	99,8

to * ·· ·· ··· · · ·· · to ·♦ · ··· ···· · · · • · · to « to *· ··« to · • · · ··· ··· ··· to· ·· ♦ · ·· ····

polysorbátu 80
0,5% polysorbátu 80	99,1	98,4	99,7
1 mmol EDTA, 0,1 % polysorbátu 80	99,6	100,1	99,8
Kompletně naplněné nádoby	99,4	100,1	96,5

5.2

Účinek argininu

Účinek argininu na stabilitu IL-2 a jeho ochranu před poškozením zapříčiněným vířivými silami je uveden v tabulce 15. Zvyšování koncentrace argininu ze 150 mmol na 230 mmol vede k 3% vzestupu množství rozpustného IL-2 ze 65 % na 69 % po 1 minutě víření. Z toho vyplývá, že arginin má minoritní účinek na IL-2 co se týká ochrany IL-2 před střižnými silami, i když v dřívějších experimentech vykázal výrazný stabilizační účinek na IL-2, neboť zabraňuje degradaci zapříčiněnou formací agregátů.

Zjišťuje se účinek polysorbátu 80 na formulaci obsahující 230 mmol argininu. Přidání nízké koncentrace polysorbátu 80 (0,02 %) vede k destabilizaci IL-2 a přidání vysoké koncentrace polysorbátu 80 (0,02 %) vede ke stabilizaci IL-2 a chrání ho před poškození během víření.

Tabulka 15

Procento zbývajícího rozpustného IL-2 v různých prostředcích po 1 minutě vířeni při analýze RP-HPLC

Prostředky (všechny prostředky obsahují 0,5 mg/ml IL-2, pokud není uvedeno jinak)	% zbývajícího IL-2
150 mmol argininu, 10 mmol NaSuc, 1 mmol EDTA,. pH = 5,8	65,5
150 mmol argininu, 81 mmol kyseliny jantarové, 1 mmol EDTA, pH = 5,8	65,3
230 mmol argininu, 10 mmol NaSuc, 1 mmol EDTA, pH = 5,8	69,0
230 mmol argininu, 128 mmol kyseliny jantarové, 1 mmol EDTA, pH = 5,8	68,9
230 mmol argininu, 128 mmol kyseliny jantarové, 1 mmol EDTA, 0,02 % Tw 80, pH = 5,8	55,1
230 mmol argininu, 128 mmol kyseliny jantarové, 1 mmol EDTA, 0,1 % Tw 80, pH = 5,8	99,5

5.3

Studie analyzující přepravu

Střižné síly působící na IL-2 v průběhu přepravy produktu se testují studií se skutečnou přepravou. IL-2 se připraví jako prostředek obsahující arginin a prostředek obsahující NaCl, přičemž oba obsahují různá množství polysorbatu 80. Tyto IL-2 vzorky se přepravují na ledu letadlem z Emeryville, Kalifornie, do Saint Louis, Missouri, a ze Saint Louis z_fpět do Emeryville. Ilustrace 8 ukazuje RPHPLC analýzu množství rozpustného IL-2 v těchto vzorcích.

Bez přítomnosti polysorbatu 80 v prostředcích je zaznamenána přibližně 10% ztráta IL-2, a to jak v prostředcích • · · · · · · · « ··· ·· ·· ·* ······ obsahujících arginin, tak v prostředcích obsahujících NaCl.

Rozdíly ve stabilitě mezi formulací obsahující arginin a formulací obsahující NaCl jsou zanedbatelné, okolo 1 %. Za přítomnosti polysorbatu 80 v prostředcích je ztráta IL-2 redukována. Za přítomnosti 0,1 % polysorbatu 80 není zaznamenána žádná ztráta, což značí, že IL-2 je plně ochráněn při dané koncentraci surfaktantu. To znamená, že obsažení 0,1 % polysorbatu 80 ve formulaci je účinné pro zabránění akutního poškození IL-2 střižnými silami v průběhu přepravy.

Závěrem lze shrnout, že arginin může fungovat jako primární stabilizační přípravek v kapalných farmaceutických prostředcích obsahujících IL-2 v průběhu dlouhodobého skladování, a to prostřednictvím snížení agregace a deaminace IL-2. Pro další zvýšení koncentrace argininu ve formulaci a pro dosažení vyšší stability IL-2 při zachování izotonicity roztoku, se pro titraci argininovou bází na pH 5,8 s výhodou použije kyselina jantarová. Navíc lze do prostředku zahrnout methionin a EDTA, a to za účelem prevence oxidace proteinu. Nakonec může být do prostředku přidán neionický surfaktant, jako je polysorbát 80, a to pro zabránění poškození IL-2 v průběhu zmrazování a rozmrazování a poškození mechanickými střižnými silami.

Příklad 6

Testování účinnosti konzervačního přípravku

Několik formulací obsahujících antimikrobiální konzervační přípravky se podrobí testu účinnosti konzervačního přípravku dle postupu uvedeného v publikaci · · · 9

99

9 * 9 • 9 «

9 9

9 9

9999

United States Pharmacopoeia (USP). Výsledky tohoto testu jsou uvedeny v tabulce 16. Kontrolní vzorek bez konzervačního přípravku požadavky USP nesplnil, zatímco všechny prostředky obsahující konzervační přípravek požadavky splnily.

Tabulka 16

USP test účinnosti konzervačního přípravku pro prostředky obsahující rhIL-2

Kontrolní prostředek obsahuje 0,1 mg/ml rhIL-2,

230 mmol L-argininové báze, 128 mmol kyseliny jantarové, mmol EDTA, 5 mmol methioninu, 0,1 % polysorbatu 80 s pH = 5,8.

Konzervační přípravek	USP test
Kontrola	nevyhovuj e
0,9% benzylalkohol	vyhovuj e
1,3% benzylalkohol	vyhovuj e
1,7% benzylalkohol	vyhovuj e
0,5% chlorbutanol	vyhovuj e
0,5% fenol *	vyhovuj e

Příklad 7

Schopnosti prostředku produkovat bolest

Pro stanovení schopností produkovat bolest, konkrétněji pálivou a štípavou bolest navozenou prostředky, se použije krysí model vyvinutý na Floridské univerzitě, ·* «· ·· 9· »· 9 9 · 9 999

99999 99 999 9 9 • · · 9 9 99φ ·· ♦· ·· 9« 999 fakultě stomatologie, OMSDS, oddělení neurověd (University of.Florida, College of Dentistry, OMSDS, Division of

Neuroscience). Model je založen na stanovení proudu, který je indukován senzorickými buňkami přenášejícími informace o bolesti. Pro stanovení se v zaznamenávací komoře izolují senzorické buňky (krysí gangliové buňky dorsálních míšních kořenů). Záznamy se učiní pro individuální buňky, které se předem selektují dle nociceptivních (tedy bolest indukujících) kritérií. Pro danou formulací se zaznamená indukce pálivé, štípavé bolesti a standardizovaná skóre pro bolest. Skóre pálivé bolesti se definuje prostřednictvím porovnání odpovědi testovaného prostředku s odpovědí kapsaicinu (500 nmol). Kapsaicin je dobře znám pro svou schopnost produkovat u člověka intensivní pálivou bolest (Cooper a kol., Páin, 24, 93 až 116 (1986)). Pálivá bolest je zaznamenávána jako poměr celkové produkce proudu indukovaného testovanou formulací k proudu produkovanému roztokem pufrovaným na pH = 5. Standardizované skóre bolesti hodnotí formulaci vzhledem k fyziologickému roztoku (0,9 %

NaCI, bez pufru), běžnému parenterálnímu roztoku dostupnému v nemocničních lékárnách, o kterém je známo, že indukuje štípavou bolest.

Kapalný prostředek obsahující L-argininovou bázi a kyselinu jantarovou se podrobí analýze bolesti podle výše popsaného modelu. Výsledky pro dva testované roztoky jsou uvedeny v tabulce 17. Vycházeje ze skóre vypočítaných pro pálivou bolest, štípavou bolest a ze standardizovaných skóre bolesti, vykazuje prostředek obsahující L-argininovou bázi a kyselinu jantarovou výborné vlastnosti v porovnání s běžným fyziologický roztokem. Bylo také zaznamenáno, že testem indukovaný proud se zmenšuje v průběhu aplikace prostředku

4·4 4 4 (časově závislý pokles), zatímco pokles nebyl pozorován v případě běžného fyziologického roztoku. Poznatky vyplývající z provedení popsaného stanovení demonstrují, že zmíněná prostředek je lépe tolerován než běžný fyziologický roztok.

·· 44 »4 4

4 · • 44

4 4

4« 444«

Tabulka 17

Pálení, štípání a standardizovaná skóre bolesti pro kapalnou formulaci a 0,9% NaCl

Kapalný prostředek obsahuje 230 mmol L-argíninové báze, 128 mmol kyseliny jantarové, 1 mmol EDTA, 5 mmol methioninu, 0,1 % polysorbátu 80 o pH = 5,8.

Prostředek	Pčllivá bolest	Štípavá bolest	Standardizované skóre bolesti
0,9% NaCl	0,084 ± 0,0006	2,44 ± 0,62	1,73 ± 0,73
Kapalný prostředek obsahuj ící rhIL-2	0,044 ± 0, 019	0,65 ± 0,23	0,16 ± 0,05

Příklad 8

Studie stability s TFPI

Studie stability a rozpustnosti TFPI obsaženého v různých prostředcích demonstrují, že L-arginin funguje • 4 • · · 4 · · 4 4 4 4 ·*««·« · λ 4 • 44 4 4 44 444 4 4 ·4·4 444 •4 4» 94 44 4444 jako stabilizační přípravek (údaje nejsou uvedeny) na TFPI a pufrovací sloučeniny s nábojem, například reprezentované citratovými ionty, mají hlubší solubilizační (rozpustnost zvyšující) účinek. V této studii se zkoumají účinky koncentrace L-argininu a pufrovaciho systému na stabilitu

TFPI v různých prostředcích. Konkrétně se testuje vliv pufrovaciho systému ve formě kyseliny v podstatě zbavené své soli naproti pufrďvacímu systému směsi kyseliny a její soli, jak bylo dříve zmíněno pro prostředky obsahující IL-2 v předcházejících příkladech.

Materiály a způsoby

Roztok TFPI se formuluje jako 0,6 mg/ml ve 20 mmol citrátu sodného a 300 mmol L-argininu s pH 5,5. Tento roztok se pufruje dialýzou při teplotě 4 °C za použití membrán Spectral Por #7 (MWCO 3,500, ID# 132-110) do různých formulací obsahujících L-arginin pufrovaných na pH = 6,5, a to buď citratovým nebo sukcinatovým pufrovacím systémem. Po dialýze se koncentrace TFPI v každém roztoku měří UV/Vis spektroskopií. Každý roztok se poté zředí na 0,15 mg/ml použitím příslušného pufru. Připravené roztoky se poté rozdělí na alikvoty, každý o objemu 1 ml, do nádob o objemu 30 ml pro stabilní skladování. V tomto bodě se dostatečné množství nádob nechá stranou, a stanoví se výchozí časový moment T = 0. Zbytek nádob se umístí do inkubátoru s teplotou 50 °C pro akcelerovanou studii stability. Vzorky se analyzují v časových bodech 3, 7, 14 a 30 dnů. Pro analýzu v každém časovém momentu se obsah každé nádoby přenese do l,7ml mikrocentrifugační zkumavky a centrifuguje se při frekvenci 10 000 otáček za minutu po dobu přibližně 2 minut. Centrifugovaný supernatant vzorků se ze zkumavky on · *« ·* ·· ··· · to to* · o · · · ♦ ·· • · · · · · toto · • · ♦ · * · • to· · · ·* *· odebere a analyzuje se prostřednictvím IEX-HPLC (popis nutný), známé z předchozích studií jako stanovení vhodné k indikaci stability.

·· toto « ·« to ·« · t · · • toto • · ····

Výsledky a diskuse

TFPI je formulován v konečné koncentraci 0,15 mg/ml do různých formulací, které obsahují bud' L-argininovou bázi nebo hydrochlorid argininu. Prostředky obsahující hydrochlorid argininu se pufrují na pH = 5,5 prostřednictvím lOmmol kyseliny citrónové nebo kyseliny jantarové v kombinaci s příslušnou konjugovanou sodnou solí.

Prostředky obsahující L-argininovou bázi se titrují na pH =

5,5 bud' kyselino citrónovou nebo kyselinou jantarovou. Provede se celkem 8 studií dle následujícího výčtu:

1) 20 až 150 mmol hydrochloridu L-argininu pufrovaného na pH =5,5 prostřednictvím lOmmol kyseliny citrónové a citrátu sodného;

2) 20 až 150 mmol L-argininové báze titrované na pH = 5,5 kyselinou citrónovou;

3) 100 až 300 mmol hydrochloridu L-argininu pufrovaného na pH = 5,5 prostřednictvím lOmmol kyseliny citrónové a citrátu sodného;

4) 100 až 300 mmol L-argininové báze titrované na pH =

5,5 kyselinou citrónovou;

5) 20 až 150 mmol hydrochloridu L-argininu pufrovaného na pH = 5,5 prostřednictvím lOmmol kyseliny jantarové a sukcinátu sodného;

6) 20 až 150 ππηρί L-argininové báze titrované na pH = 5,5 kyselinou jantarovou;

• 0

0000

7) 100 až 3 00 mpol hydrochloridu L-argininu pufrovaného na pH = 5,5 prostřednictvím lOmmol kyseliny, jantarové a sukcinatu sodného; a

8) 100 až 300 mmol L-argininové báze titrované na pH =

5,5 kyselinou jantarovou.

Hlavní cestou degradace TFPI byla již dříve určena agregace a precipitace proteinu (Chen a kol., J- Pharm.

Sci., 88. 881 až 888 (1999)) . Degradace TFPI může být sledována monitorováním zbylého rozpustného proteinu ve vzorcích pro testování stability. Roztoky TFPI formulované s různými koncentracemi L-argininu se skladují při teplotě 50 °C v případě akcelerované studie stability. Vzorky se odebírají v předem určených časových intervalech. Rozpustný protein ve vzorcích se oddělí od proteinu agregovaného/ precipitovaného centrifugací v mikrocentrifugační zkumavce. Množství rozpustného proteinu se stanoví metodou IEX-HPLC (Chen a kol., J. Pharm. Sci, SS, 881 až 888 (1999)). Údaje se poté vynesou jako funkce skladovacího času, přičemž se použije jednoduchá exponenciální kinetická rovnice

Y <= Y (Y₀EXP (-kit) kterou se spočítá poločas zbývajícího rozpustného proteinu, s použitím KaleidaGraph grafického softwaru (Synergy Software, Reading Pennsylvania) .

Hodnoty poločasů (t_1/2) pro zbývající rozpustný TFPI pro prostředky pufrované kyselinou citrónovou či citrátem sodným jsou uvedeny v tabulce 18. Hodnoty pro prostředky pufrované kyselinou jantarovou či sukcinatem sodným jsou uvedeny v tabulce 19. Tyto údaje demonstrují, že hodnota poločasu se zvyšuje se vzestupem koncentrace L-argininu v těchto prostředcích. Tyto údaje jsou dále vyneseny

v ilustracích 9 a 10 pro citratové a sukcinatové pufrovací systémy. Křivky propojující hodnoty poločasů mají tvar paraboly a rostou s koncentrací argininu. Toto znamená, že L-arginin je stabilizátorem TFPI.

Rozdíl v TFPI stabilitě mezi dvěma zmíněnými pufrovacími systémy se zdá zanedbatelný. Ačkoliv citratový pufrovací systém vykazuje větší variabilitu (ilustrace 9), jsou dvě křivky poločasu vynesené proti koncentraci argininu pro sukcinatový pufrovací systém prakticky superimponované (ilustrace 10). TFPI dosahuje obdobné stability při podobné koncentraci L-argininu, bez závislosti na tom, jaký pufrovací systém se použije pro úpravu pH. Ilustrace 11 také porovnává dvě křivky poločasu vynesené proti koncentraci argininu pro pufrovací systém obsahující kyselinu jantarovou a pufrovací systém obsahující kyselinu citrónovou. Tato ilustrace také znázorňuje, že v TFPI stabilitě nedochází k žádným důležitým odchylkám, pokud zůstává koncentrace argininu ve formulaci stabilní. Tyto údaje demonstrují, že stabilizační účinek je zajištěn zejména argininem.

Nicméně titrace kyseliny buď kyselinou jantarovou nebo citrónovou umožňuje zvyšovat koncentraci argininu ve formulaci (a tím umožňuje zvyšovat stabilitu prostředku), zatímco je zachována izotonicita. Proto například oba prostředky, 3-3 a 4-3 v tabulce 18 obsahují 300 mmol Largininu, a jejich hodnoty poločasů jsou podobné. Prostředek 3-3 však obsahuje·10 mmol kyseliny citrónové a citrátu sodného pro pufrování 300 mmol hydrochloridu L-argininu na pH = 5,5 a osmolarita roztoku je 497 mOsm/kg. Tento prostředek je tedy hypertonický a není vhodný pro injekční cestu podání. Na druhou stranu, prostředek 4-3 obsahuje 121 fcfc ·· · fc * · fcfcfc· • fcfcfc·· fcfc · fcfcfc fcfc fcfc fcfcfc · · • fcfcfcfc fcfcfc fcfcfc fcfc fcfc *· fcfc fcfcfcfc mmol kyseliny citrónové v kombinaci se 300 mmol L-arginin.ové báze pro upravení pH na 5,5 a osmolarita tohoto roztoku je

295 mOsm/kg. Tento prostředek je tedy osmolaritou velmi blízko izotonickému roztoku (290 mmol/kg) a je vhodnější pro injekční formu podání. Pokud se použije běžný způsob úpravy pH, například přidání 10 mmol kyseliny citrónové a citrátu sodného, je možné do prostředku přidat o něco málo více než

150 mmol L-argininu, aniž by byla porušena izotonicita.

Poločas prostředku obsahující 150 mmol L-argininu (kód 1-6) je 16 dnů v porovnání s 23 dny pro formulaci obsahující 300 mmol L-argininu (kód 4-3) . Z toho vyplývá, že formulování

TFPI s kyselinovou bází (například argininovou bází) jako stabilizátorem a s pufrem sestávajícím z kyseliny v podstatě zbavené její soli (například kyseliny jantarové), poskytuje účinný způsob, jak přidat více stabilizátoru (například argininu) pro maximalizaci stabilizujícího účinku na TFPI.

Závěr

Tento příklad demonstruje, že L-arginin stabilizuje TFPI prostřednictvím prodlužování jeho skladovací doby. Při použití titrace kyselinou je možné pro maximalizaci stabilizačního účinku přidat do prostředku více argininu, aniž by byla porušena izotonicita, která je výhodná v případě inj ikovátelných formulací.

Tabulka 18

Údaje o stabilitě formulací obsahujících TFPI a arginincitrat, o pH = 5,5 • fcfc fc fc

Poločas (t_1/2) se získá proložením dat stability při teplotě 50 °C za použití jednoduché exponenciální kinetické rovnice.

• » fc fc ·· • fc · fc · * · ·· fcfc • fc fcfc 9 9 · · • · · • fcfc • fcfc •fc «···

Kód	Prostředek	Osmolarita (mmol/kg)	1-1/2 (dny)
1-1	20 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny citrónové/citratu sodného	66	9,4
1-2	40 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny citrónové/citratu sodného	81	12,6
1-3	60 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny citrónové/citratu sodného	91	10,7
1-4	80 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny citrónové/citratu sodného	106	10,9
1-5	100 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny citrónové/citratu sodného	190	12,5
1-6	150 mmol LrArgHCl, 10 mmol kyseliny citrónové/citratu sodného	276	16,0
2-1	20 mmol báze L-Arg titrované 8,9 mmol kyseliny citrónové	67	5,7
2-2	40 mmol báze L-Arg titrované 17,8 mmol kyseliny citrónové	84	15,0
2-3	60 mmol báze L-Arg titrované 26,6 mmol kyseliny citrónové	95	17,0

• 4 «· 44 44 • · 4 4 * 4 4 » 4 « ·♦··«· 4 4 4

444 44 44 444 4 4

4 4 4 4 4 4 4

44 4« 44 44 4444

2-4	80 mmol báze L-Arg titrované 34,2 mmol kyseliny citrónové	109	14,6
2-5	100 mmol báze L-Arg titrované 42,6 mmol kyseliny citrónové	119	18,2
2-6	150 mmol báze L-Arg titrované 62,4 mmol kyseliny citrónové	147	20,4
3-1	100 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny citrónové/citratu sodného	239	14,8
3-2	200 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny citrónové/citratu sodného	358	19,6
3-3	300 mmol L ArgHCl, 10 mmol kyseliny citrónové/citratu sodného	497	21,7
4-1	100 mmol báze L-Arg titrované 42,2 mmol kyseliny citrónové	155	16,7
4-2	200 mmol báze L-Arg titrované 81,8 mmol kyseliny citrónové	224	22,5
4-3	300 mmol báze L-Arg titrované 121 mmol kyseliny citrónové	295	23,3

Tabulka 19

Údaje o stabilitě formulaci obsahujících TFPI a arginincitrat, o pH = 5,5

Poločas (t_1/2) se získá proložením dat stability při teplotě 50 °C za použití jednoduché exponenciální rovnice.

• ·· *« fefe fefe fefe ♦ · > 9 fefefefe fefefefe fe·· fefe·· fefe fe fe fefefe fefe fe* fefefe fe * * · fefefefe fefefe * · · · · fefe fefe fefe fefefefe

Kód	Prostředek	Osmolarita (mmol/kg)	^-1/2 (dny)
1-1	20 mmol L-'ÁrgHCl, 10 mmol ) kyseliny jantarové/sukcinatu sodného	66	9,9
1-2	40 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny jantarové/sukcinatu sodného	97	11,5
1-3	60 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny jantarové/sukcinatu sodného	129	15,3
1-4	80 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny jantarové/sukcinatu sodného	163	16,7
1-5	100 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny jantarové/sukcinatu sodného	197	20,5
1-6	150 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny jantarové/sukcinatu sodného	282	21,9
2-1	20 mmol báje L-Arg titrované 12,5 mmol kyseliny jantarové	40	6,7
2-2	40 mmol báze L-Arg titrované 25,2 mmol kyseliny jantarové	62	12,6
2-3	60 mmol báze L-Arg titrované 37,5 mmol kyseliny jantarové	85	16,4
2-4	80 mmol báze L-Arg titrované 49,9 mmol kyseliny jantarové	107	19,6

»to toto toto 9· ·· · to to · to to « · · · » to · to to to to toto to • to·· ···· to 9 « · · • to ···· tototo ··· ·· *· toto toto ··»·

2-5	100 mmol báze L-Arg titrované 62,4 mmol kyseliny jantarové	129	20,9
2-6	150 mmol báze L-Arg titrované 91,4 mmol kyseliny jantarové	192	23,1
3-1	100 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny jantarové/sukcinatu sodného	207	16,5
3-2	200 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny jantarové/sukcinatu sodného	353	21,6
3-3	300 mmol L-ArgHCl, 10 mmol kyseliny jantarové/sukcinatu sodného í	515	21,7
4-1	100 mmol báze L-Arg titrované 61,3 mmol kyseliny jantarové	127	17,0
4-2	200 mmol báze L-Arg titrované 122 mmol kyseliny jantarové	256	21,4
4-3	300 mmol báze L-Arg titrované 180 mmol kyseliny jantarové	363	22,5

Všechny uvedené publikace a patentové přihlášky zmíněné ve specifikacích jsou odborníkům v oboru, kterých se přítomný vynález týká, známé. Všechny publikace a patentové přihlášky jsou zahrnuty v tomto spisu do odkazů ve stejném rozsahu, ve kterém byla každá individuální publikace nebo patentová přihláška specificky a individuálně citována.

Ačkoliv přítomný vynález byl popsán vcelku detailně prostřednictvím ilustrací a příkladů pro objasnění a • ti* < « • · ··· *·

	88		··
•	0	•		•
•	0		··
•	•	•		0
•	•	•		9
	*·		• ti

• t ·· • · · · • · ·

0 9

9 · »· ···· porozumění, modifikace, patentových je jasné, že mohou být aplikovány určité změny a a to ty, které jsou v rozsahu následujících nároků.

ívoz• 4 ·· 4 4 4 4 4*4 4 • 4 4444 44 4

Claims (40)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Stabilizovaný kapalný farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje: polypeptid nebo jeho variantu jako farmaceuticky účinnou komponentu, přičemž zmíněný polypeptid nebo jeho varianta vykazuje v průběhu skladování jako kapalný prostředek tvorbu agregátů;

   takové množství aminokyselinové báze, které je dostatečné ke snížení tvorby agregátů zmíněného polypeptidu nebo jeho varianty v průběhu skladování příslušného prostředku, kde zmíněná aminokyselinová báze zahrnuje alespoň jednu aminokyselinu vybranou ze skupiny sestávající z argininu, lyzinu, kyseliny asparagové a kyseliny glutamové; a pufrovací přípravek, který se vybere ze skupiny sestávající z kyseliny v podstatě zbavené své soli, z kyseliny ve formě své soli a směsi kyseliny a její soli.
2. 2. Prostředek podle nároku 1, vyznačuj íc í se t í m, že se zmíněný polypeptid vybere ze skupiny sestávající z interleukinu 2 (IL-2), inhibitoru působení tkáňového faktoru (TFPI) a β-interferonu (IFN-β).
3. 3. Prostředek podle nároku 1, vyznačuj íc í se t í m, že má osmolaritu přibližně 240 mmol/kg až přibližně 360 mmoT/kg.
4. 4. Prostředek podle nároku 1, vyznačuj íc í se t í m, že má pH v rozmezí přibližně 4,0 až přibližně 9,0.

   • ·· ·· 99 9 9 99

   99 9 9 9 9 9 9 · * · · ····· ·· · · · · · ··· ·· ·· ·· 99 9999
5. 5. Prostředek podle nároku 1, vyznačuj íc £ se t í m, že se příslušná kyselina vybere ze skupiny sestávající z kyseliny octové, kyseliny jantarové, kyseliny citrónové, kyseliny fosforečné a kyseliny glutamové.
6. 6. Prostředek podle nároku 5, vyznačuj ící se t í m, že zmíněná kyselina je kyselina jantarová.
7. 7. Prostředek podle nároku 6, vyznačuj ící se t i m, že zmíněná aminokyselinová báze je arginin ve formě své volné báze, přítomný v koncentraci přibližně 100 mmol až přibližně 400 mmol, a zmíněná kyselina jantarová je v prostředku přítomna v koncentračním rozmezí přibližně 80 mmol až přibližně 190 mmol.
8. 8. Prostředek podle nároku 7, vyznačuj ící se t í m, že zmíněný polypeptid je interleukin-2 (IL-2) nebo jeho varianta, a arginin ve formě své volné báze je přítomen v koncentrací přibližně 150 mmol až přibližně 350 mmol.
9. 9. Prostředek podle nároku 8, vyznačuj ící se t í m, že zmíněný arginin ve formě své volné báze je přítomen v koncentraci přibližně 230 mmol a zmíněná kyselina jantarová je přítomna v koncentraci přibližně 128 mmol.
10. 10. Prostředek podle nároku 9, vyznačuj ící se t í m, že zmíněný IL-2 je rekombinantní lidský IL-2 (rhIL-2) nebo jeh·...· varianta.

    • · · ·· · · ♦ · · ·· to to toto to to · • toto toto toto tototo · · • toto·· tototo • · · · · · · ······

    100
11. 11. Prostředek podle nároku 9, vyznačuj íc í se t £ m, že zmíněný prostředek má pH v rozmezí přibližně 5,0 až asi 6,5 a osmolaritu v rozmezí přibližně 250 až asi 330 mmol/kg.
12. 12. Prostředek podle nároku 7, vyznačuj ic £ se t í m, že zmíněný polypeptid je inhibitor působení tkáňového faktoru (TFPI) nebo jeho varianta a arginin ve formě své volné báze je přítomen v koncentraci přibližně 175 mmol až přibližně 325 mmol.
13. 13. Prostředek podle nároku 12, vyznačuj í cí se t í m, že arginin ve formě své volné báze je přítomen v koncentraci přibližně 200 mmol až přibližně 300 mmol a kyselina jantarová je přítomna v koncentraci přibližně 120 mmol až přibližně 180 mmol.
14. 14. Prostředek podle nároku 13, vyznačující se t í m, že TFPI je rekombinantní lidský TFPI nebo jeho varianta.
15. 15. Prostředek podle nároku 13, vyznačuj ící se t í m, že má pH v rozmezí přibližně 5,0 až asi 6,5 a osmolaritu v rozmezí přibližně 240 až asi 360 mmol/kg.
16. 16. Prostředek podle nároku 5, vyznačuj ící se t í m, že zmíněná kyselina je kyselina citrónová.
17. 17. Prostředek podle nároku 16, vyznačuj ící se t í m, že zmíněná aminokyselinová báze je arginin ve formě své volné báze přítomný v koncentraci přibližně 175 mmol až přibližně 400 mmol, a kde zmíněná kyselina citrónová • ·· ·· ·· ·· ·· ·· · · · · · · · · · · ······· ·· ·

    1 Λ1 · ··· ·· ·· ·♦· · *

    1 Ul · · ···· ··· ··· ·· ·· ·· · · · ··· je přítomna v tomto prostředku v koncentračním rozmezí přibližně 40 až asi 200 mmol.
18. 18. Prostředek podle nároku 17, vyznačuj ící se t i m, že zmíněným polypeptidem je TFPI nebo jeho varianta.
19. 19. Prostředek podle nároku 18, vyznačuj ící se ti m, že TFPI je rekombinantní lidský TFPI (rhTFPI) .
20. 20. Prostředek podle nároku 18, vyznačuj ící se t i m, že arginin ve formě své volné báze je přítomen v koncentraci přibližně 250 až přibližně 350 mmol a kyselina citrónová je přítomna v koncentraci přibližně 100 mmol až přibližně 150 mmol.
21. 21. Prostředek podle nároku 20, vyznačující se t i m, že zmíněný prostředek má pH v rozmezí přibližně 5,0 až asi 6,5 a osmolaritu v rozmezí přibližně 240 až asi 360 mmol/kg.
22. 22. Prostředek podle nároku 1, vyznačuj íc i se t i m, že zmíněný polypeptid nebo jeho varianta v prostředku obsahuje alespoň jeden methioninový zbytek, který při skladování v kapalné formulaci podstupuje oxidaci.
23. 23. Prostředek podle nároku 22, vyznačuj ící se t i m, že dále obsahuje methionin v množství dostatečném pro inhibici oxidace zmíněného alespoň jednoho methioninového zbytku příslušného polypeptidu v průběhu skladování kapalného prostředku.

    102
24. 24. Prostředek podle nároku 1, vyznačuj í c í se tím, že dále obsahuje neionický surfaktant v množství dostatečném pro inhibici agregace zmíněného polypeptidu nebo jeho varianty jako odpovědi na zmrazení a rozmražení nebo působení mechanické střižné síly v průběhu skladování prostředku.
25. 25. Prostředek podle nároku 24, vyznačuj I c I se t i m, že zmíněný neionický surfaktant je polysorbát 80.
26. 26. Stabilizovaný kapalný farmaceutický prostředek obsahující interleukin-2 (IL-2) nebo jeho variantu, arginin ve formě jeho volné báze a kyselinu jantarovou ve formě v podstatě zbavené sgvé soli, vyznačující se tím, že arginin ve formě volné báze je ve zmíněném prostředku přítomen v koncentraci přibližně 150 až přibližně 350 mmol a kyselina jantarová je ve zmíněném prostředku přítomna v koncentraci přibližně 80 až přibližně 190 mmol.
27. 27. Prostředek podle nároku 26, vyz.načující se t i m, že arginin ve formě své volné báze jev prostředku přítomen v koncentraci přibližně 230 mmol, zmíněná kyselina jantarová je přítomna v koncentraci přibližně 128 mmol a tento prostředek má pH v rozmezí přibližně 5,0 až asi 6,5 a osmolaritu v rozmezí přibližně 250 až asi 330 mmol.
28. 28. Stabilizovaný kapalný farmaceutický prostředek obsahující inhibitor působení tkáňoyého faktoru (TFPI) nebo jeho variantu, arginin ve formě jeho volné báze a kyselinu jantarovou v podstatě zbavenou své soli, vyznačuj i·· • ♦ · i · · ···· · · ·

    1 f) 7 · ··· ·· ·· ··· · · lVJ _Λ φ ···· · · · ··· ·· ·· ·· ·· ·♦·· c £ se t ί m, že arginin ve formě volné báze je v tomto prostředku přítomen v koncentraci přibližně 175 až přibližně

    325 mmol a kyselina jantarová je ve zmíněném prostředku přítomna v koncentraci přibližně 80 až přibližně 190 mmol.
29. 29. Prostředek podle nároku 28, vyznačuj i cí se t í m, že árqfinin ve formě své volné báze je v prostředku přítomen v koncentraci přibližně 200 až přibližně 300 mmol, zmíněná kyselina jantarová je přítomna v koncentraci přibližně 120 až přibližně 180 mmol a zmíněný prostředek má pH přibližně 5,0 až asi 6,5 a osmolaritu přibližně 240 mmol/kg až přibližně 360 mmol/kg.
30. 30. Stabilizovaný kapalný farmaceutický prostředek obsahující inhibitor působení tkáňového faktoru (TFPI) nebo jeho variantu, arginin ve formě jeho volné báze a kyselinu citrónovou v podstatě zbavenou její soli, vyznačuj £c i se t í m, že arginin ve formě volné báze je v tomto prostředku přítomen v koncentraci přibližně 175 až asi 400 mmol a kyselina citrónová je ve zmíněném prostředku přítomna v koncentraci přibližně 40 až asi 200 mmol.
31. 31. Prostředek podle nároku 30, vyznačuj £ cí se t £ m, že arginin ve formě své volné báze je v přítomném prostředku přítomen v koncentraci přibližně 250 až přibližně 350 mmol a zmíněná kyselina citrónová je přítomna v koncentraci přibližně 100 až přibližně 150 mmol, a zmíněný prostředek má pH v rozmezí přibližně 5,0 až asi 6,5 a osmolaritu v rozmezí přibližně 240 až přibližně 360 mmol/kg.

    104 • · * · · 4 · 4» 4 4

    44 4 4 4 44 4 4 44 4

    4 4 4 44 44 44 «

    4 44444 44 444 4 4

    4 4 4 444 · 4 4 ··· 44 4< 44 44 4444
32. 32. Způsob zvyšování stability polypeptidů nebo jeho varianty v kapalném farmaceutickém prostředku, vyznačující se tím, že zmíněný polypeptid nebo jeho varianta vykazuje v průběhu skladování jako kapalný prostředku tvorbu agregátů, a zmíněný způsob zahrnuje inkorporaci aminokyselinové báze v množství dostatečném pro snížení tvorby agregátů tohoto polypeptidů nebo jeho varianty a dále inkorporaci pufrovacího přípravku do zmíněného prostředku, kde pufrovací přípravek se vybere ze skupiny sestávající z kyseliny v podstatě zbavené své soli, z kyseliny ve formě své soli nebo ze směsi kyseliny a její soli, a kde aminokyselinová báze zahrnuje alespoň jednu aminokyselinu vybranou z argininu, lyzinu, kyseliny asparagové a kyseliny glutamové.
33. 33 .

    tím, že přibližně

    Způsob podle nároku 32, vyznačuj ící zmíněný prostředek má osmolaritu v rozmezí 240 až asi 360 mmol/kg.
34. 34. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že zmíněný prostředek má pH v rozmezí přibližně 4,0 až asi 9,0.
35. 35. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že zmíněná kyselina se vybere ze skupiny sestávající z kyseliny octové, kyseliny jantarové, kyseliny citrónové, kyseliny fosforečné a kyseliny glutamové.
36. 36. Způsob podle nároku 35, vyznačuj íc í se tím, že zmíněná kyselina je kyselina jantarová.

    105 ti Vti ti • ti ti* »« ti* • ti titititi titi titi · ti ti · ·· • titi titi titi ··· ti • titititi titi • tititi· ·» titi titi
37. 37. Způsob zvyšování skladovací stability farmaceutického prostředku obsahující polypeptid nebo jeho variantu, vyznačuj ící se tím, že zmíněný polypeptid nebo jeho varianta vykazuje v průběhu skladování jako kapalná formulace tvorbu agregátů, a zmíněný způsob zahrnuje inkorporaci aminokyselinové báze v množství dostatečném pro snížení tvorby agregátů tohoto polypeptidu nebo jeho varianty a dále inkorporaci pufrovacího přípravku do zmíněného prostředku, kde pufrovací přípravek se vybere ze skupiny sestávající z kyseliny v podstatě zbavené své soli, z kyseliny ve formě své soli nebo ze směsi kyseliny a její.soli, a kde aminokyselinová báze zahrnuje alespoň jednu aminokyselinu vybranou z argininu, lyzinu, kyseliny asparagové a kyseliny glutamové.
38. 38. Způsob podle nároku 37, vyznačuj ící se tím, že zmíněnou kyselinou je kyselina jantarová.
39. 39. Vysušená forma prostředku podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se t í m, že se tato vysušená forma $

    vybere ze skupiny sestávající z lyofilizované formy nebo formy vysušené rozstřikováním.
40. 40. Prostředek pro diagnózu, prevenci nebo léčení chorob responsivních na terapii interleukinem-2 (IL-2), inhibitorem působení tkáňového faktoru (TFPI) nebo interferonem-β (IFN-β), přičemž zmíněný prostředek obsahuje farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačuj ίο í se t í m, že se polypeptid vybere ze skupiny sestávající z IL-2, TFPI a IFN-β.