WO2004028557A1 - 安定化されたタンパク組成物 - Google Patents

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WO2004028557A1
WO2004028557A1 PCT/JP2003/012142 JP0312142W WO2004028557A1 WO 2004028557 A1 WO2004028557 A1 WO 2004028557A1 JP 0312142 W JP0312142 W JP 0312142W WO 2004028557 A1 WO2004028557 A1 WO 2004028557A1
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sugar
ifn
interferon
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PCT/JP2003/012142
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Kaori Ikeda
Mariko Tayasu
Yasuhiro Miyako
Hideaki Tai
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Shionogi & Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention does not include a stable protein composition, specifically, serum albumin and carnitine derived from a warm-blooded animal, and at least interleukin-12, interferon- ⁇ , and interferon.
  • a protein composition containing 1 / ?, interferon, one of epidermal growth factor, sugar and / or sugar alcohol (excluding sorbitol), and amino acid (excluding glycine and histidine) (provided that alanine and
  • the present invention relates to a protein composition containing a composition containing sucrose, excluding a composition containing lysine hydrochloride and sucrose), an acid and a base if necessary, and a surfactant if necessary.
  • Background art
  • Inulin-I-leukin-12 (hereinafter abbreviated as IL-2) is a protein that has biological activity to proliferate ⁇ cells and natural killer cells, and can be used for various cancers, especially angiosarcoma ⁇ renal cancer and immune There is great expectation as a remedy for insufficiency. It is also expected to be a therapeutic drug for acquired immunodeficiency syndrome (AIDS).
  • IFN interferon
  • IFN interferon
  • EGF epidermal growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • IL-12 protein components such as IL-12, IFN, and EGF are unstable under ordinary storage conditions.
  • a solution containing IL-12 containing human serum albumin as a stabilizing agent is added to a base and Formulated with a composition of IL-12 by adding an acid to make it neutral (eg, JP-A-62-164630), a reducing substance, and human serum albumin
  • an IL-12 composition is obtained by this process (eg, Japanese Patent Application Laid-Open No. Sho 60-215563).
  • an IL-12 composition containing the amino acid glycine and the sugar sucrose, and adjusted to a pH of 5 to 6.5 with either histidine (base) or citric acid (acid) has been obtained.
  • IL-12 eg, WO 90 Z 0 0 3 9 7
  • Some of the above-mentioned preparations containing proteins other than IL-12, IFN, and EGF are obtained by stabilizing the protein with sugars and amino acids to obtain the preparation (eg, JP-A-8-50447) 8 4, W096 / 4 1 6 4 2, Special table 2 0 0 1 — 5 0 3 7 8 1) o
  • serum albumin derived from warm animals such as the above-mentioned human serum albumin (HSA) has recently been pointed out as a risk of viral infection and mad cow disease. It is desired not to be included in the pharmaceutical formulation.
  • IL-2 is relatively insoluble in water, and usually causes an agglutination reaction near neutrality and lowers the solubility, once a base or acid is added to dissolve IL-12, the acid or It is necessary to add a base to near neutrality. Therefore, if only an acid or a base is blended as described in the above WO 02/002 43, an agglutination reaction may occur and the solubility of IL-12 may be reduced. .
  • carnitine as a stabilizer disclosed in the above-mentioned WO 90/03997 is a thyroid inhibitor, and may cause side effects depending on the amount of carnitine added.
  • the method for stabilizing a protein it has been described in literature that generally, it is not always possible to stabilize a protein if the type of protein is different [Int. J. Pharma. 1_]. 85, 129-188 (19999), Int. J. Pharm. 203, 1-60 (200)), different from the above IL-12 and IFN Even a composition that can stabilize a protein component does not always stabilize the protein component. Thus, Tan As a park component, a composition that is highly safe and has good storage stability has been desired. Disclosure of the invention
  • the present inventors have found that pharmaceutically acceptable sugars and / or sugar alcohols, amino acids, and, if necessary, acids and bases that do not contain serum albumin and carnitine derived from warm-blooded animals. If necessary, a composition that enhances the stability of IL-12, IFN-IFN-a, IFN- / ?, IFN- ⁇ , or EGF by incorporating a surfactant or the like was found. The present invention described below has been completed.
  • Interleukin-2 Interleukin-2, Interferon-1, Inuferon-1 / 5, Interferon-1 or any one of epidermal growth factor,
  • a protein composition (excluding a composition containing alanine and sucrose, and a composition containing lysine hydrochloride and sucrose).
  • composition according to the above (1) further comprising an acid and a base.
  • composition according to the above (1) further comprising a surfactant.
  • composition according to the above (6), wherein the amino acid is arginine.
  • the sugar and / or sugar alcohol is maltose and / or sucrose
  • the concentration of any of interleukin-1, interferon one, inferior ⁇ , no ⁇ ⁇ interferon or epidermal growth factor is 1-220.
  • sugars and / or sugar alcohols excluding sorbitol
  • amino acids excluding glycine and histidine
  • a method for producing a protein composition (excluding a composition containing alanine and sucrose and a composition containing lysine hydrochloride and sucrose), which comprises a step of freeze-drying a solution containing
  • the concentration of any one of interleukin-1, 2, interferon, interferon-1, interferon-a or epidermal growth factor in the solution is 1 to 220 g. / mL, the production method according to the above (14).
  • the solution contains interleukin-12, and after adding a base to the solution to adjust the pH to 8 to 11, immediately add an acid to neutralize the solution, or Acid
  • Serum albumin and carnitine derived from warm-blooded animals must not be used, and at least sugar and no or sugar alcohols (excluding sorbitol) and amino acids (excluding glycine and histidine) must be used.
  • a method for stabilizing any of interleukin-1, interferon, interferon-3, interferon y, and epidermal growth factor must be used.
  • IL-12 in the case of IL-12, all of natural or recombinant IL-12 can be used, and particularly, recombinant human IL-12 is preferable.
  • IF ⁇ - ⁇ , ⁇ - ⁇ all of natural or recombinant human IF ⁇ - ⁇ - ⁇ - ⁇ can be used. Is preferred.
  • EGF any of natural or recombinant human EGF can be used, but recombinant human EGF is particularly preferred.
  • a major feature of the composition is that even if the concentration of IL-12, IFN-H, ⁇ - ⁇ , or EGF in the composition is low, the adsorption of the drug on the wall of the container is small.
  • IL-2, IL-2, IFN-a ⁇ fa, and EGF 0.5 to 500 g, preferably 0.5 to 300 g, and more preferably 1 to 22 O ⁇ g.
  • the amount of IL-12, IFN- ⁇ , ⁇ ⁇ and EGF relative to the total amount of the solid preparation is preferably 0.001 to 5 wZ w%, preferably Is preferably 0.002 to 2.5 w / w%, more preferably 0.003 to 1 w / w%. If the content of IL-12, IFN-H, ⁇ - ⁇ , and EGF is less than the above-mentioned amounts, the pharmacological effects may not be sufficiently exhibited. If the amount is larger than the above amount, drugs such as IL-12 may not be completely dissolved in the solution.
  • sugars and / or sugar alcohols mean monosaccharides, disaccharides, polysaccharides or water-soluble glucans, and can be used as long as they are physiologically acceptable.
  • Sugar and ⁇ or sugar alcohols are added to stabilize IL-2, IFN-, ⁇ - ⁇ , and EGF, but also as solubilizers, excipients or isotonic agents. sell.
  • Specific examples of sugars include glucose, mannose, sorbose, xylose, maltose, lactose, fructos, sucrose, dextran, pullulan, dextrin, and cyclodextrin.
  • a C4 to C8 sugar alcohol is preferred, and specific examples thereof include mannitol, inositol, dulcitol, xylitol, arabitol, and rafitol. Nose, erythritol, maltitol, lactitol, no. Examples include ratnit, treno, and mouth.
  • sugars and / or sugar alcohols preferably maltose, mannitol, lactose, sucrose and sorbitol, more preferably maltose, mannitol, lactose and sucrose. Yes, especially preferred are maltose and sucrose.
  • the above sugars and / or sugar alcohols can be used alone or in a mixture.
  • the amount is not particularly limited, and may be any amount that can be dissolved in the composition solution and enhances the stability of IL-12.
  • the mixing ratio of sugar and / or sugar alcohol to IL-2, IFN-, ⁇ , ⁇ , and EGF is 1 to 2000 times by weight, preferably 5 to 1750 times, and more. More preferably, it should be 20 to 1500 times.
  • 5 to 500 mg of a sugar and / or a sugar alcohol is contained in 1 mL of the solution of the composition, preferably 10 to 25001, More preferably, 20 to 200 mg may be added.
  • IL-12, IFN- ⁇ , ⁇ - ⁇ , and EGF may not be stabilized, and if the amount is too large, the IL-12 content relative to the total amount of the composition is relatively reduced. Unless a large amount of the composition of IL-12, IFN-, ⁇ - ⁇ , EGF is administered, there is a possibility that the drug effect will not be obtained.
  • the amino acid is added for stabilizing IL-12, IFN-, ⁇ , ⁇ , and EGF, but may also be added as an excipient.
  • Amino acid refers to a compound having an amino group and a hydroxyl group in the molecule, but also includes imino acids such as proline and hydroxyproline, and is physiologically acceptable. Anything can be used.
  • Amino acids include neutral amino acids, acidic amino acids and basic amino acids. Specifically, neutral amino acids include alanine, norin, norvalin, leucine, norleucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, jodotyrosine, sulnamine, threonine, and serine.
  • Proline Proline, hydroxyproline, tryptophan, thyroxine, methionine, cystine, cystine, and hy-aminoaminobutyric acid.
  • acidic amino acid include aspartic acid, glutamic acid, asparagine, and glutamine.
  • basic amino acid include lysine, lysine hydrochloride, arginine, hydroxy lysine and the like.
  • amino acids preferred are alanine, lysine hydrochloride, and arginine, and more preferred is arginine.
  • the above amino acids can be used alone or in a mixture.
  • the amount of addition is not particularly limited, and may be any amount that can be dissolved in the composition solution and enhances the stability of IL-12, IFN-a, ⁇ , ⁇ , and EGF.
  • the ratio of amino acid to IL-1, 2, IFN-, ⁇ , ⁇ , EGF is 1 to 1000 times by weight, preferably 10 to 7500 times, more preferably 2 times. It should just be 0-50000 times.
  • amino acids may be contained in 0.1 mL / mL of the composition solution. 250 mg, preferably 0.5 to 125 mg, more preferably l to 100 mg may be added. If the amount is less than the above amount, IL-12, IFN-, ⁇ a, and EGF may not be stabilized.
  • IFN- ⁇ , ⁇ a, EGF content is relatively reduced, and unless a composition containing a large amount of IL-12, IFN, ⁇ a, or EGF is administered, there is a possibility that the drug effect will not occur .
  • the composition of the present invention contains a sugar and / or a sugar alcohol and an amino acid
  • a Maillard reaction may occur in a solid state or a liquid state in some cases.
  • the Maillard reaction is the reaction of amino acids, peptides and protein amino groups with ketones and aldehydes, especially reducing sugars, to produce brown pigments.
  • the sugar and / or sugar alcohol is maltose, mannitol, lactose, sucrose, preferably maltose, sucrose, and the amino acid is alanine, hydrochloric acid.
  • the Maillard reaction is unlikely to occur even when the composition is stored, for example, at 40 ° C. for about 30 days, and IL-2, IFN — It is unlikely that the ⁇ , EGF content will decrease.
  • the freeze-dried product of the composition containing alanine and sucrose and the composition containing lysine hydrochloride and sucrose could not be produced.
  • the ratio of the content of the sugar and / or sugar alcohol to the amino acid is 0.01 to 4 times, preferably 0.025 to 3 times by weight the sugar and / or the sugar alcohol. And more preferably 0.05 to 2 times.
  • the presence or absence of the Maillard reaction will differ if the main ingredient, even if the additive is the same, has different Maillard reactions. Therefore, it is necessary to consider the type and amount of additives in the drug product.
  • an acid may be blended.
  • the acid all physiologically acceptable acids can be used.
  • organic acids such as acetic acid, lactic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, aspartic acid, glutamic acid, asparagine, and glutamin And inorganic acids such as hydrochloric acid and phosphoric acid. They may be used alone or in a mixture of two or more, and are preferably citric acid and tartaric acid. Also, these pharmacologically acceptable salts may be used.
  • the amount of the acid to be added varies depending on the type of the acid to be used, but a necessary amount that can be adjusted to a desired pH may be added.
  • the mixing ratio of acid to IL-2, IFN- ⁇ ,?, ⁇ , EGF is 5 to 1200 times by weight, preferably 10 to 600 times, and more. Preferably, it should be 25 to 300 times.
  • 0.25 to 50 mg, preferably 0.5 to 20 mg, more preferably l to 50 mg of acid is added to 1 mL of the solution of the composition. Just add 10 mg.
  • the amount is less than the above amount, PH becomes basic, and if it is more than this, pH becomes acidic, and there is a possibility that IL-2, IFN-, ⁇ , ⁇ , and EGF cannot be stabilized in any state. is there.
  • the acidic amino acids aspartic acid, glutamic acid, asparagin, and glutamine are not only acids in the constituents but also amino acids.
  • a base may be blended if necessary.
  • any physiologically acceptable base can be used.
  • alcoholamines such as N-methyldalcamin, monoethanolamine, diethanolamine and triethanolamine, alkylamines such as mono, di or triethylamine, arginine, lysine, lysine hydrochloride, etc.
  • Amino acids, inorganic bases such as sodium carbonate and the like are used, and these may be used alone or in a mixture of two or more.
  • an inorganic base such as sodium carbonate is used, it is preferable to use it together with the above-mentioned amine and the like.
  • Preferred bases are N-methylglucamine, diethanolamine, triethanolamine and arginine, more preferably diethanolamine and arginine.
  • the bases may be used alone or in a mixture of two or more.
  • the amount of the base to be added depends on the type of the base used, but it is sufficient to add a necessary amount that can be adjusted to a desired pH.
  • the mixing ratio of the base to IL-12, IFN- ⁇ , ⁇ -fa and EGF is 2 to 1000 times by weight, preferably 5 to 500 times, and more preferably. More preferably, it should be 10 to 450 times.
  • composition of the present invention When the composition of the present invention is used as a solution, 0.1 to 100 mg, preferably 0.25 to 100 mg, more preferably acid is contained in 1 mL of the solution of the composition. May be added in an amount of 1 to 50 mg.
  • the composition of the present invention is used as a solid agent, if the amount is less than the above-mentioned amount, the pH of the solution becomes acidic, and if it is larger, the pH of the solution becomes basic. — 2, IFN-1, ⁇ , ⁇ , EGF may not be stabilized.
  • basic amino acids such as arginine, lysine, lysine hydrochloride, etc.
  • amino acids can be amino acids as well as bases of the constituent components.
  • a surfactant can be added. Any surfactant may be used as long as it is a physiologically acceptable surfactant.
  • the solid agent can be reconstituted in the preparation of the composition solution before drying or the solid agent can be reconstituted in distilled water.
  • Improved solubility of IL-12, IFN-c, ⁇ , ⁇ , EGF when dissolved, and IL-12, IFN-, ⁇ , E when the liquid medium of the composition solution was dried Improves the stability of GF (especially by preventing adsorption of IL-2, IFN-, ⁇ -fa, and EGF on the container wall during drying, and suppressing the decrease in IL-2 content in the composition) The effect is obtained.
  • the surfactant may be any one that can be dissolved or suspended in the solution of the composition and enhances the stability of IL-12, IFN-, ⁇ , ⁇ , and EGF, but is preferably a nonionic surfactant.
  • Agents specifically, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, sucrose fatty acid ester, polyethylene glycol (PEG), polyoxyethylene polypropylene glycol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, and the like.
  • polyoxyethylene hydrogenated castor oil include polyoxyethylene hydrogenated castor oil 5, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 10, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 20, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 40, and polyoxyethylene hydrogenated.
  • Castor oil 50 polyoxetylene hardened castor oil 60 and the like.
  • Specific examples of polyethylene glycol calls are Macrogol 2000, Macrogol 300, Macrogol 400, Macrogol 600, Macrogol 100, Macrogol 150, Macrogol1 54 0, Macrogol 2 00 0, Macrogol 40 00, Macrogol Rules, macro goals, macro goals, etc.
  • polyoxyethylene polypropylene glycol examples include polyoxyethylene (105) polypropylene (5) glycol, polyoxyethylene (120) polyoxypropylene (40) glycol [pluronic acid] F87], polyoxyethylene (160) polyoxypropylene (30) glycol [pull nick F68], polyoxyethylene (42) polyoxypropylene (67) glycol [pull nick P12 3], polyoxyethylene (54) polyoxypropylene (39) glycol [pluronic F85], polyoxyethylene (196) polyoxypropylene (67) glycol [pull nick F1 27], polyoxyethylene (20) polyoxypropylene (20) glycol [pull nick L44].
  • polysorbate 20 As polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, specifically, polysorbate 20 [Tween 20], polysorbate 40 [Tween 40], polysorbate 60 [Tween 60], polysorbate There are 66.5 [Tween 65], polysorb 80 [Tween80], and the like. More preferred are polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, and particularly preferred is polysorbate 80 [Tween 80].
  • the amount of the surfactant varies depending on the type of the surfactant used, the mixing ratio of the surfactant to IL-12, IFN-, ⁇ , ⁇ , and EGF is preferably 1 to 300 times by weight, and is preferable. Should be 2.5 to 250 times, more preferably 5 to 200 times.
  • the composition of the present invention is used as a solution, 0.05 to 15 mg, preferably 0.075 to 7.5 mg, and more preferably 0 to 1 mg / mL of the solution of the composition. lmg to 4mg may be added.
  • composition of the present invention When the composition of the present invention is used as a solid agent, if the amount is less than the above-mentioned amount, the solubility of IL-12, IFN-, ⁇ - ⁇ , and EGF will not be improved. — The stability of ⁇ , ⁇ , ⁇ , and EGF may be reduced. Conversely, if the amount is large, foaming may cause difficulty in preparing the composition solution during preparation.
  • a buffering agent in order to minimize the fluctuation of ⁇ ⁇ during the preparation of the composition solution before drying in the preparation of the solid preparation or when the solid preparation is redissolved in distilled water.
  • the buffer may be any physiologically acceptable buffer, such as a phosphate or citrate buffer.
  • the amount of the buffer added depends on the type of the buffer used, but if the desired pH, i.e., the amount necessary to maintain the pH of the solution of the composition at 6.1 to 9, is used. Good. Specifically, the mixing ratio of the buffer to IL-12, IFN-, ⁇ -a, and EGF is 20 to 1000 times, preferably 50 to 800 times, by weight. Preferably, it should be 100-600 times. When the composition of the present invention is used as a solution, 1 to 100 mg, preferably 2.5 to 75 mg, more preferably 5 to 5 mg of buffer is contained in 1 mL of the solution of the composition. What is necessary is just to add 0 mg.
  • the amount is less than the above amount, there is a possibility that the pH fluctuation at the time of producing the composition solution or re-dissolving the solid agent in distilled water becomes large. If the amount is too large, IL-12 and IFN relative to the total amount of the composition are increased. — The contents of ⁇ , ⁇ a, and EGF are relatively reduced, and unless a large amount of IL-12, IFN- ⁇ , ⁇ a, EGF composition is administered, there is a possibility that the drug effect will not be produced.
  • the preparation of the present invention may contain pharmaceutically acceptable additives depending on the form of the preparation.
  • preservatives such as phenol and cresol
  • antioxidants such as sulfite, sodium pyrosulfite, ascorbic acid, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), thioglycolic acid, and benzyl
  • a soothing agent such as alcohol and chlorobutanol
  • a tonicity agent such as sodium chloride and glycerin
  • serum albumin derived from a warm-blooded animal such as human serum albumin, pepsin serum albumin, or bush serum albumin
  • side effects may occur as described above.
  • the albumin is a recombinant albumin, it is unlikely to cause the above-mentioned side effects, and may be added as an additive to the composition.
  • the addition of recombinant albumin is useful for preventing a decrease in the stability of IL-12, IFN- ⁇ , ⁇ a, and EGF.
  • the ratio of recombinant albumin to IL-2, IFN- ⁇ , ⁇ a, and EGF is 1 to 400 times by weight, preferably 2.5 to 2000 times, and more.
  • composition of the present invention is used as a solution, 0.1 mg to 1 mg per 1 mL of the solution of the composition is used. OO mg, preferably 0.25 mg to 50 mg, more preferably 0.5 mg to 25 mg may be added.
  • the composition of the present invention comprises at least one of IL-12, IFN-, ⁇ , ⁇ , and EGF, a sugar and / or a sugar alcohol, an amino acid, an acid and a base if necessary, and an interface if necessary.
  • IL-12 a sugar and / or a sugar alcohol
  • an amino acid an acid and a base if necessary
  • an interface if necessary.
  • IL-12 a sugar and / or a sugar alcohol
  • an amino acid an acid and a base if necessary
  • an interface if necessary Contains activator and compounding ingredients such as buffering agents to control ⁇ .
  • IL-12 1, IL-2, maltose, arginine, cunic acid, diethanolamine (in some cases, no diethanolamine is added) In some cases), if necessary, polysorbate 80 and phosphate buffer, and 2) IL-2, sucrose, arginine, citric acid, diethanolamine (in some cases, diethanolamine).
  • IL-12 is 0.001 to 5 w / w%, preferably 0.05 to 22.5 w / w%, based on the total amount of the solid agent. More preferably, the ratio of maltose or sucrose to IL-12 is 0.01 to 1 times, preferably 1 to 1000 times, preferably 5 to 500 times by weight. More preferably 20 to 400 times, the mixing ratio of arginine to IL-12 is 1 to 500 times by weight, preferably 10 to 2500 times, more preferably.
  • the mixing ratio of citric acid to IL-12 is 5 to 2000 times by weight, preferably 10 to 1000 times, more preferably 2 5 to 500 times, the mixing ratio of jetanolamine to IL-12 is 10 to 500 times by weight, preferably 25 to 2500 times, more preferably 50 times. ⁇ 20000 times (In some cases, if you do not mix ),
  • the ratio of polysorbate 80 to IL-12 is 1 to 300 times by weight, preferably 2.5 to 250 times, more preferably 5 to 200 times. If a phosphate buffer is added, it may be added at a mixing ratio necessary to maintain the pH at 6.1 to 9. Specifically, the mixing ratio of the buffer to IL-12 is as follows.
  • the weight ratio may be 20 to 2000 times, preferably 50 to 1500 times, and more preferably 100 to 100 times.
  • IL-12 is 0.1 to 500 g, preferably 0.5 to 250 g, and more preferably 1 to 100 g in 1 mL of the solution of the composition.
  • Maltose or sucrose is 5 to 500 mg, preferably 10 to 250 mg, more preferably 20 to 200 001 in I mL of the solution of the composition, and arginine is the composition 0.1 to 250 mg, preferably 0.5 to 125 mg, and more preferably 1 to 100 mg / mL of citrate solution I mL 0.25 to 50 mg, preferably 0.5 to 20 mg, more preferably 1 to 10 mg / mL, and diethanolamine is contained in 0 mL / mL of the composition solution.
  • l to 100 mg preferably 0 to 25 to 100 mg, more preferably 1 to 50 mg (sometimes not containing diethanolamine), polysorbate
  • 80 is added, 0.05-5 mg per mL of solution of the composition, preferably 0.075 mg to 7.5 mg, more preferably 0.1 mg to 4 mg, to maintain pH 6.1 to 9 if phosphate buffer is added It may be added in a required mixing ratio, but specifically, 1 to 100 mg, preferably 2.5 to 75 mg, more preferably 5 to 50 mg per 1 mL of the composition solution. mg may be added.
  • the content ratio of maltose to arginine and sucrose to arginine is such that the ratio of arginine to maltose or sucrose is 0 by weight. 0.1 to 4 times, preferably 0.05 to 3 times, more preferably 0.1 to 2 times.
  • IFN-hi preferred combinations of the components of the composition include: 1) IFN-hi, maltose, arginine, if necessary hydrochloric acid and phosphate buffer, and if necessary polysorbate 8 0, 2) IFN-a composition of a combination of spikes, sucrose, arginine, optionally hydrochloric and phosphate buffers, and optionally polysorbate 80.
  • IFN- ⁇ is 0.001 to 5 wZw%, preferably 0.005 to 2.5 w / w%, based on the total amount of the solid agent.
  • the mixing ratio of maltose or sucrose to IFN- ⁇ is 1 to 20000 times by weight, preferably 5 to 1 75 0 times, more preferably 20 to: L 300 times, arginine for IF ⁇ - ⁇
  • the mixing ratio is 1 to 500 times by weight, preferably 10 to 450 times, more preferably 20 to 400 times, and if necessary, hydrochloric acid to IFN- ⁇ .
  • the mixing ratio is 5 to 600 times by weight, preferably 10 to 300 times, more preferably 25 to 1500 times, and if a phosphate buffer is added.
  • ⁇ ⁇ 6.1 to 9 may be added at a mixing ratio necessary to maintain the specific mixing ratio.
  • the mixing ratio of the buffer solution to IF IF is 20 to 100 by weight. It is a factor of 0.00, preferably 50 to 800 times, and more preferably a factor of 100 to 600 times. Further, if polysorbate 80 is required, the mixing ratio of polysorbate 80 to IFN-I is 1 to 300 times by weight, preferably 2.5 to 25 times. It should be 0 times, more preferably 5 to 200 times.
  • the amount of IFN- is 0.1 to 500 fg, preferably 0.5 to 250 g, in lmL of the composition solution.
  • maltose or sucrose is between 5 and 500 mg, preferably between 10 and 250 mg, more preferably between 20 and 50 mg in lmL of the composition solution. 2200 mg, arginine, 0.1-250 mg, preferably ⁇ .125-125 mg, more preferably l-100 mg, in lm L of composition solution
  • hydrochloric acid is added, 0.25 to 100 mg, preferably 0.5 to 40 mg, more preferably 1 to 20 mg, per 1 mL of solution of the composition, phosphoric acid
  • a buffer solution it may be added at the mixing ratio necessary to maintain ⁇ ⁇ 6 ⁇ 1 to 9; specifically, 1 to 100 mg in 1 mL of the composition solution Preferably, 2.5 to 75 mg, more preferably, 5 to 50 mg may be added.
  • the content ratio of maltose to arginine and sucrose to arginine is such that the content ratio of arginine to maltose or sucrose is 0. 0.1 to 4 times, preferably 0.05 to 3 times, more preferably 0.1 to 2 times.
  • the preferred combination of components of the composition is: 1) IFN- ?, maltose, arginine, if necessary hydrochloric acid and phosphate buffer, and more 80, 2) IFN- ?, sucrose, arginine, if necessary hydrochloric acid and phosphate buffer, and, if necessary, a composition of polysorbate 80 .
  • IFN ⁇ /? Is 0.001 to 5 w / w%, preferably 0.05 to 2.5, based on the total amount of the solid preparation.
  • the mixing ratio of maltose or sucrose to IFN-? is 1 to 20000 times by weight, preferably 5 times. 11750 fold, more preferably 20 210000 fold, the mixing ratio of arginine to IFN ⁇ /? Is 1 ⁇ 500 fold by weight, preferably 10 ⁇ Up to 450 times, more preferably 20 to 400 times, if necessary, the mixing ratio of hydrochloric acid to IFN- /? Is 5 to 600 times by weight, preferably 10 to 100 If the phosphate buffer is added at 300,000 times, more preferably 25 to 150 times, add at the ratio required to maintain pH 6.1 to 9.
  • the mixing ratio of the buffer to IFN- /? Is 20 to 100% by weight. 0 times, preferably 50 to 800 times, and more preferably 100 to 600 times. Further, if polysorbate 80 is required, the mixing ratio of polysorbate 80 to IFN- ⁇ is 1 to 300 times by weight, preferably 2.5 to 250 times, and more preferably What is necessary is just 5 to 200 times.
  • IF ⁇ /? Is 0.1 to 500 mg, preferably 0.5 to 25, g in 1 mL of the solution of the composition.
  • 0 zg more preferably 1 to 100 mg, maltose or sucrose, 5 to 500 mg, preferably 10 to 250 mg, more preferably 1 mL of solution of the composition 20 to 200 mg, arginine is 0.1 to 250 mg, preferably 0.5 to 125 mg, more preferably 1 to 1 in 1 mL of the composition solution 100 mg, if hydrochloric acid is added, 0.25 to 100 mg, preferably 0.5 to 40 mg, more preferably 1 to 2 in 1 mL of the composition solution If 0 mg phosphate buffer is added, it may be added at the mixing ratio necessary to maintain pH 6.1 to 9, but specifically, in 1 mL of the composition solution.
  • the composition of the present invention may be added in an amount of 1 to 100 mg, preferably 2.5 to 75 mg, more preferably 5 to 50 mg. If more polysorbate 80 is required, 0.05 mg to 1 mL of solution of the composition 15 mg, preferably 0.075 mg to 7.5 mg, more preferably 0.1 mg to 4 mg may be added.
  • the content ratio between maltose and arginine and between sucrose and arginine is such that arginine is in a weight ratio of 0.01 to maltose or sucrose. ⁇ 4 times, preferably 0.05 to 3 times, more preferably 0.1 to 2 times.
  • preferred combinations of the components of the composition include: 1) IFN- ⁇ , maltose, arginine, L-cystine, if necessary hydrochloric acid and phosphate buffer, and if necessary Polysorbate 80, 2) A composition of a combination of IFN- ⁇ , sucrose, arginine, L-cystine, hydrochloric acid and phosphate buffer if needed, and polysorbate 80 if needed.
  • IFN-a is 0.001 to 5 w / w%, preferably 0.005 to 2.5 w / w%, More preferably 0.01 to: L w / w%, the blending ratio of maltose or sucrose to IFN-A is 1 to 500 times, preferably 5 to 2500 times by weight. More preferably, it is 20 to 100 times, and the mixing ratio of arginine to IFN- is 1 to 250 times by weight, preferably 10 to 100 times, more preferably 10 to 100 times. 20 to 500 times, L-cystine is added to IFN-a by 0.1 to 5 times, preferably 0.2 to 4 times, more preferably 0.3 to 3 times by weight.
  • the mixing ratio of hydrochloric acid to IFN-a is 5 to 2000 times, preferably 10 to 100 times, more preferably 25 to 500 times by weight, and polysolvent to IFN-a is used.
  • the mixing ratio of 100 is 1 to 300 times by weight, Or 2.5 to 250 times, more preferably 5 to 200 times, if phosphate buffer is added, the mixing ratio required to maintain pH 6.1 to 9 More specifically, the mixing ratio of the buffer to IFN- ⁇ is 10 to 2000 times by weight, preferably 20 to 1500 times by weight, and more preferably. In other words, it may be 40 to 1000 times.
  • the mixing ratio of polysorbate 80 to IFN-a is 1 to 300 times by weight, preferably 2.5 to 250 times, and more.
  • IFN- ⁇ is 0.1 to 1 in 1 mL of the solution of the composition.
  • 0.000 g, preferably 0.5-750 g, more preferably l-500 g, maltose or sucrose is 5-50000 in lmL of a solution of the composition.
  • mg, preferably 10 to 250 mg, more preferably 20 to 200 mg, arginine is 0.1 to 250 mg, preferably 0.5 to 50 mg in 1 mL of a solution of the composition.
  • L-cystine is 0.01-5 mg, preferably 0.05-5 mg, more preferably 1 mL in a solution of the composition.
  • 0.1 to 2.5 mg if hydrochloric acid is added, 0.25 to 100 mg, preferably 0.5 to 40 mg, more preferably 0.5 mL per mL of solution of the composition If l-20 mg, polysorbate 80 is added, then 0.05-5 mg, preferably 0-07 5 mg-7.5 mg, in 1 mL of the solution of the composition, More preferably, 0.1 mg to 4 mg, if phosphate buffer is added, the formulation required to maintain pH 6.1 to 9 But more specifically, 1 to 100 mg, preferably 2.5 to 75 mg, and more preferably 5 to 50 mg, in 1 mL of the composition solution. .
  • the content ratio of maltose to arginine and sucrose to arginine is such that the ratio of arginine to maltose or sucrose is 0.01 to 1 by weight. It is 4 times, preferably 0.05 to 3 times, and more preferably 0.1 to 2 times.
  • the preferred combination of ingredients of the composition is 1) EGF, maltose, arginine, if necessary hydrochloric acid and phosphate buffer, and if necessary polysorbate 80, 2) It is a composition of a combination of EGF, sucrose, arginine, optionally hydrochloric and phosphate buffers, and optionally polysorbate 80.
  • EGF is 0.001 to 5 w / w%, preferably 0.05 to 2.5 w / w%, based on the total amount of the solid preparation.
  • blending ratio of maltose or sucrose to EGF is 10-500 times, preferably 50-450 times by weight. More preferably, it is 100 to 400 times, and the mixing ratio of arginine to EGF is 1 to 2 by weight. 500 times, preferably 10 to 2000 times, more preferably 20 to 170 times, if necessary, the mixing ratio of hydrochloric acid to EGF is 5 to 2000 by weight.
  • the buffer may be added in a necessary mixing ratio.
  • the mixing ratio of the buffer to EGF is 10 to 300 times by weight, preferably 20 to 250 times, and more preferably. Preferably, it should be 40 to 2000 times.
  • the mixing ratio of polysorbate 80 to EGF is 1 to 300 times by weight, preferably 2.5 to 250 times, and so on. More preferably, it should be 5 to 200 times.
  • EGF When the composition of the present invention is used as a solution, EGF may be present in an amount of 0.1 to 1000 zg, preferably 0.5 to 500 zg, more preferably 1 mL of the solution of the composition.
  • 1 to 100 g, maltose or sucrose is 5 to 500 mg, preferably 10 to 250 mg, more preferably 20 to 20 mg / mL of the solution of the composition.
  • 0 mg, arginine is 0.1 to 250 mg, preferably 0.5 to 125 mg, more preferably 1 to 100 mg, hydrochloric acid in 1 mL of the composition solution.
  • the content ratio of maltose to arginine and sucrose to arginine is such that the content ratio of arginine to maltose or sucrose is 0. 0 1 to 4 times, preferably 0.05 to 3 times, more preferably 0.1 to 2 times.
  • a method for drying a solution for producing a solid preparation from the solution of the present invention it is sufficient to dry the liquid medium of the composition solution, but preferably, freeze drying method, fluidized bed drying method, spray drying There is a drying method, more preferably a freeze-drying method.
  • the freeze-dried product solidified by the freeze-drying method is stable without heat or other stress in the case of preparations containing protein components such as IL-12, IFN-H, ⁇ , ⁇ , and EGF. It is possible to produce a novel protein preparation.
  • IL-12, IFN- ⁇ , ⁇ , ⁇ , and EGF are kept stable, and during the drying operation of the liquid medium and the re-dissolution of the solid preparation.
  • the liquid state can also be kept transparent.
  • the final ⁇ ⁇ adjustment is ⁇ ⁇ 6.1-9 in solution.
  • the composition of the present invention is used as an injection, it is preferable to adjust the composition near the physiological region, and in this case, the final ⁇ region is adjusted to ⁇ 6 1 to 8, more preferably ⁇ ⁇ 6.5 to 7.5.
  • the reasons why the stability of IL-2, IFN-, ⁇ - ⁇ , and EGF are increased are not necessarily clear, but 1) degradation of IL-12, IFN- ⁇ , ⁇ - ⁇ , EGF, It is considered that 2) aggregation of IL-2, IFN-hi, ⁇ - ⁇ , and EGF, and 3) adsorption of IL-2, IFN- ⁇ , ⁇ , ⁇ , and EGF to the container were suppressed.
  • the drug concentration in the drug product is low, the effect of drug adsorption on the container wall is large, but in the case of the present prescription, IL-12, IFN- ⁇ , ⁇ , It is possible to suppress the adsorption of EGF and the like.
  • the contents of IL-12, IFN- ⁇ , ⁇ fa, and EGF immediately after the production of the composition hardly decrease even after storage over time, for example, for about 40 or 30 days.
  • Various methods can be considered to further suppress the adsorption of IL-12 to the container.
  • One of the methods is to apply IL-2 and IFN-H to a container whose inner wall is coated with silicone. What is necessary is just to contain a composition containing, ⁇ - ⁇ and EGF.
  • the production method of the IL-12 composition of the present invention is not particularly limited, but is preferably as follows: Manufacture by the method. To a solution of the required amount of sugar and / or sugar alcohol and the stabilizing amino acid in distilled water, add an appropriate amount of IL-12 stock solution and, if necessary, a surfactant. Then, an appropriate amount of a base (when a basic amino acid is added as an amino acid, the base may not be added sometimes) is added to the mixture to adjust the pH to about 8 to 11, preferably about 9 to 11, more preferably about 9 to 11. After adjusting the pH to about 9.5 to 10.5 and adding a buffer solution, add acid immediately to adjust the pH to about 7 to 7.5.
  • the remaining amount of distilled water is added to adjust the amount of the solution, a solution of the composition is produced, sterile-filtered, dispensed into containers, and then lyophilized.
  • an appropriate amount of IL-12 and, if necessary, a surfactant is added to a solution of the required amount of sugar and / or sugar alcohol and an amino acid as a stabilizer in distilled water.
  • an appropriate amount of an acid (when an acidic amino acid is added as an amino acid, the acid may not be added) is added, and the pH is once about 2 to 6, preferably about 2 to 4, more preferably about 2 to 4. Is about pH 2 to 3, and after adding a buffer solution, immediately add a base and adjust pH to about?
  • the composition is produced in the same manner as described above.
  • the former production method is preferred from the viewpoint of the stability of IL-2. Freeze-drying is required after rapidly freezing the solution of the composition prepared above at about 160 ° C to about 110 ° C, preferably about 150 ° C to about 140 ° C. Then, while supplying sublimation heat, sublimate and remove water until the water content reaches a predetermined level, preferably at 48 to 72 hours, at 0.005 to 1 mb, and if necessary, inert such as nitrogen. Fill with gas or dry air and seal.
  • the method for producing the IFN- ⁇ , ⁇ a, and EGF composition of the present invention is not particularly limited, but is preferably produced by the following method.
  • To a solution of the required amount of sugar and / or sugar alcohol and the amino acid as a stabilizer in distilled water add an undiluted solution of IFN-H, ⁇ a, and GF and, if necessary, an appropriate amount of a surfactant. .
  • a base when a basic amino acid is added as an amino acid, a base may not be added
  • an acid is added, a buffer is added, and the pH is increased. ?
  • the remaining amount of distilled water is added to adjust the amount of the solution.
  • a solution of the required amount of sugar and Z or sugar alcohol and an amino acid as a stabilizer in distilled water may be added to IFN- ⁇ , ⁇ fa, EGF and, if necessary, an appropriate surfactant. Add the amount.
  • an acid an acidic amino acid is added as an amino acid, the acid may not be added
  • a base is added, a buffer is added, and ⁇ about?
  • the composition is manufactured in the same manner as described above.
  • the former production method is preferable from the viewpoint of the stability of IFN- ⁇ , ⁇ -fa and EGF.
  • Freeze-drying is required after rapidly freezing the solution of the composition prepared above at about 160 ° C to about ⁇ 10 ° C, preferably about 150 ° C to about 140 ° C.
  • the composition of the present invention does not contain serum albumin and carnitine derived from a warm-blooded animal, and at least one of IL-2, IFN-, ⁇ -fa, and EGF, sugar and / or sugar alcohol. , Amino acids, and, if necessary, acids and bases, and, if necessary, surfactants and buffers, etc., to provide IL-12, IFN- ⁇ , ⁇ , ⁇ , and EGF for a long time. For example, it can be stored stably even at about 40 ° C. for about 30 days. Furthermore, the preparation of the present invention makes it possible to suppress the adsorption of IL-2, IFN-, ⁇ , ⁇ , and EGF on the container wall.
  • composition of the present invention is not particularly limited, but parenteral use is preferred.
  • the lyophilized composition is dissolved in distilled water for injection, physiological saline, dextrose, an appropriate infusion solution, or the like, and then intravenously, intramuscularly, subcutaneously or Administer intradermally.
  • the composition may be added to an appropriate carrier, excipient and the like to prepare a preparation for topical administration such as oral, nasal and otic administration.
  • IL-1 2 It is 350,000 to 1.4 million 111 per day; (domestic standard unit).
  • the titer of IL-12 used in the present invention is a method of calculating the unit of IL-2 using the proliferation of NK cells (derived from mouse cells) that proliferate in a manner dependent on IL-12 as an index for quantification. And measured.
  • NK-7 cells a type of NK cell, proliferate in proportion to the amount of substance having IL-12 activity.
  • MTT becomes NK— 7Dye is taken up by cells and reduced by cytochrome b and cytochrome c, two electron mediators related to the respiratory chain located in the inner mitochondrial membrane.
  • Formazan is produced.
  • the IL-12 titer is determined from the relationship between the amount of formazan produced and the dilution factor of the sample.
  • the generated formazan was eluted from NK-7 cells with isopropanol, and the purple-colored liquid was subjected to absorbance measurement (wavelength 56 O nm) to measure the IL-12 titer.
  • IFN-, ⁇ -, and EGF were measured by high performance liquid chromatography (HPLC).
  • Example 1 Investigation of Amino Acids and Sugars that Allow Freeze-Drying (Excluding IL-2) According to the following production method, a composition of the components shown in Table 1 was produced. Observed the view. The present composition does not contain IL-12, which is the main drug. (Example 1 Manufacturing Method of Formulation)
  • Maltose, mannitol, lactose and sucrose were used as sugars or sugar alcohols.
  • amino acids alanine, lysine hydrochloride, and arginine were used.
  • Polysorbate 80 was used as a surfactant, diethanolamine was used as a base, citric acid was used as an acid, and a phosphate buffer was used as a buffer.
  • Tables 3 and 4 show the appearance of the freeze-dried product immediately after freeze-drying and the freeze-dried product after storage at 40 ° C for 10 days.
  • the amino acid is a combination of alanine, lysine hydrochloride, and arginine
  • the sugar or sugar alcohol is mannitol
  • the amino acid is amino.
  • the amino acid is a combination of alanine, lysine hydrochloride, and arginine
  • the sugar or sugar alcohol is lactose
  • the amino acid is a combination of alanine, lysine hydrochloride, and arginine
  • the sugar or sugar alcohol is sucrose
  • the amino acid is arginine
  • formulations containing glycine, most compositions containing sorbitol, compositions containing alanine and sucrose, and compositions containing lysine hydrochloride and sucrose were stored at 40 ° C for 10 days. In the above, no freeze-dried cake was formed.
  • Table 4 Appearance of freeze-dried product combining amino acid and sugar or sugar alcohol after storage at 40 ° C for 0 days
  • Example 2 Light yellow color (Example 2) Investigation of amino acids and sugars that can be freeze-dried (including IL-12) In Example 1, the preparation of a combination of amino acids and sugars or sugar alcohols having a good appearance of the freeze-dried product was used. Each composition was produced according to the following production method, and immediately after the production, the IL-12 content after storage over time and the appearance of the freeze-dried product were observed. This drug formulation contains the main drug, IL-2.
  • Table 5 shows the components of the composition.
  • Maltose, mannitol, lactose and sucrose were used as sugars or sugar alcohols.
  • amino acids alanine, lysine hydrochloride, and arginine were used.
  • Polysorbate 80 was used as a surfactant, diethanolamine was used as a base, citric acid was used as an acid, and a phosphate buffer was used as a buffer.
  • API solution containing 0.04 mg (700,000 JRU) of IL-2 0.6 mL of 12 Omg / mL sugar or sugar alcohol aqueous solution 5 mL, 1 Omg / mL polysol 0.5 mL of a base 80 aqueous solution and 2 mL of a 100 mg / mL amino acid aqueous solution were mixed and dissolved. About 0.3 mL of a 10 mg / mL aqueous solution of genoaluminamine was added to the solution.
  • the unit is mg
  • the unit is mg
  • the content of IL-12 in the freeze-dried product of IL-2 was measured by an HPLC method.
  • the lyophilized product was redissolved in 1 mL of water for injection and used as a sample for HPLC analysis.
  • the column used was COS MO SIL 5 C18-300 (150 x 4.6 mm, average particle size of resin in the column 5 m, manufactured by Nacalai Tesque), and the wavelength 22 2 was used to detect IL-12. 0 nm UV was used.
  • the mobile phases are A) water / acetonitrile (95/5) containing 0.1% trifluoroacetic acid, B) 0.07% acetonitril containing trifluoroacetic acid.
  • a and B mobile phase solutions were flowed at a ratio as shown in Fig. 6 (gradient method).
  • the osmotic pressure was measured according to the Japanese Pharmacopoeia No. 14 Revised General Test Method “Osmotic Pressure Measurement Method”. Table 6
  • the content% of IL-2 was calculated by the following equation.
  • Table 5 IL-2 content of freeze-dried product immediately after freeze-dried and freeze-dried product after storage at 40 ° C for 14 days, appearance of freeze-dried product (after storage at 40 ° C for 14 days in freeze-dried product)
  • Table 7 shows the osmotic pressure and pH of the solution when the lyophilized product was dissolved in water (volume of dissolved distilled water: 1 mL).
  • the IL-12 content of the composition was determined by Bioassay.
  • Example 2 the freeze-dried products in which the IL-12 content was small even after storage over time, that is, as sugars or sugar alcohols, such as maltose, mannitol, lactose, sucrose, IL-2 in freeze-dried products containing arginine as an amino acid (prescriptions 5 to 8 in Example 2) was measured by Bioassay.
  • the lyophilized product was produced using the formulation and production method of Example 2, except that IL-12 was 0.02 mg (350,000 JRU).
  • the freeze-dried products used were the freeze-dried product immediately after freeze-drying and the freeze-dried product after storage at 40 ° C for 30 days.
  • the bioassay was performed by the following method. This method uses NK-7 cells (derived from mouse) that proliferate in an IL-2-dependent manner and measures the titer based on their proliferative ability. IL NK-7 cells proliferate in proportion to the amount of the substance having one or two activities.
  • NK—7 cells are fed with MTT [3- (4,5-dimethylthiazolu-2-yl) 1-2,5—difluoro-2H—tetrazolium]
  • MTT becomes NK-7 It is taken up by cells and reduced by two electron carriers involved in the respiratory chain, cytochrome b and cytochrome c, present in the inner mitochondrial membrane. Is generated.
  • the IL-2 titer is determined.
  • the generated formazan was eluted from NK_7 cells with isopropanol, and the purple colored liquid was quantified by measuring absorbance (wavelength: 560 nm).
  • a IL-12 activity (%) immediately after drying
  • b IL-12 activity (%) after storage at 40 ° C for 30 days
  • the container containing the composition was changed from a glass vial to a vial whose inner wall surface was coated with silicone, and the IL-12 content was measured.
  • Example 2 the freeze-dried product in which the content of IL-12 was small even after storage over time, that is, maltose, mannitol, lactose, sucrose and amino acids as sugars or sugar alcohols Freeze-dried containing arginine as The IL-2 content in the dried product (Formulations 5 to 8 in Example 2) was measured.
  • the lyophilized product was produced in the same manner as in Example 2, except that 0.02 mg (350,000 JRU) of IL-2 was used. I mL of the solution containing the ingredients was dispensed into a 3 mL silicon-coated vial and a 3 mL glass vial, and lyophilized.
  • the content of IL-12 in the freeze-dried product was measured after freeze-drying once and freeze-drying twice (after the first freeze-drying, redissolved in 1 mL of distilled water for injection and freeze-dried).
  • the method for measuring the content is as described in Example 2.
  • Table 9 shows the contents of IL-12 in JRU units per mL.
  • the amount of IL-12 in the composition was adsorbed on the glass vial wall.
  • the residual ratio of IL-2 was examined using the preparation before lyophilization.
  • a composition containing human serum albumin (HSA) was used as a control.
  • Table 10 shows the components of the composition. Maltose was used as the sugar or sugar alcohol, arginine was used as the amino acid, hydrochloric acid was used as the acid, and a phosphate buffer was used as the buffer. In order to see the effect of the stabilizer, no surfactant was added.
  • the unit is mg
  • the IL-12 concentration in the aqueous solution was measured.
  • the remaining IL-12 ratio after transferring the vial to the content of the initial IL-12 composition solution was examined.
  • the measurement conditions for IL-2 are the same as in Example 2.
  • Residual% (concentration of IL-12 after transfer of liquid [JRU] / concentration of IL-12 immediately after preparation of liquid [JRU]) X 100
  • Table 11 shows the residual ratio (%) of IL-12 in Formulation 9 and Comparative Formulation 1.
  • the residual ratio of IL-12 was almost the same in the formulation 9 containing maltose and arginine as compared to the comparative formulation 1 containing HSA. Therefore, it was possible to suppress the adsorption on the container wall surface by adding the amino acid and the sugar.
  • Example 6 Container wall adsorption test using protein components other than IL-2
  • the prepared solution before freeze-drying was added to a glass vial, and the residual ratio of the drug was determined to determine how much the drug was adsorbed to the container .
  • Table 10 shows the components of the composition. Maltose was used as the sugar or sugar alcohol, arginine was used as the amino acid, citric acid was used as the acid, and a phosphate buffer was used as the buffer.
  • the drugs used were IFN- ⁇ and IFN- ⁇ . In order to see the effect of the stabilizer, no surfactant was added.
  • a method for producing the composition of IF F- ⁇ will be described.
  • phosphate buffer dissolved in 0.4 ml of phosphate buffer 0.4 ml of 131.5 mg / ml sugar or sugar alcohol aqueous solution 0.4 mL and water 0.2 mL or 25 mg / mL 113 aqueous solution 0.2 mL or an appropriate amount of hydrochloric acid was added to adjust the pH to about 7.0, and 0.2 mL of 100 mg / mL arginine aqueous solution was added.
  • a test solution was prepared.
  • the unit is mg
  • IFN—H 240 nm
  • IFN— ? 220 nm
  • IFNA could not be measured by HPLC.
  • the residual ratio of each drug was calculated by the following equation.
  • Persistence% (Each evening after transfer of the solution 5 times, concentration of the component of each evening / Evening immediately after the solution preparation Park concentration) X 1 0 0
  • Table 14 shows the residual ratio of each protein component.
  • the residual ratio of IFN- ⁇ was almost the same when HSA and arginine were added.
  • the residual ratio was 80% or more. Therefore, even in the case of protein components such as IFN- ⁇ and ⁇ , the adsorption of arginine and sugar to the container could be suppressed.
  • composition solution containing IFN-, ⁇ -, ⁇ -, and EGF shown in Table 15 was freeze-dried, and the IFN- ⁇ , ⁇ , ⁇ and EGF contents were measured.
  • the lyophilized product was redissolved in 1 mL of water for injection and used as a measurement sample.
  • Example 6 Each drug content was measured by HPLC in the same manner as in Example 6, but only in the case of IFN- ⁇ , the measurement wavelength was 240 nm. Also, as in Example 6, in the case of the preparation in which IFN- ⁇ and HSA were combined, IFN- ⁇ could not be measured by HPLC.
  • the content% of each protein component was calculated by the following equation.
  • the unit is mg
  • the unit is mg
  • Table 15 shows the content of each protein component.
  • the present invention provides a solution containing IL-2, IFN-a, ⁇ , ⁇ , and GF obtained as described above, a freeze-dried preparation obtained by freeze-drying the obtained solution, and the freeze-dried preparation.
  • the present invention provides various forms of IL-12 compositions such as a solution preparation having a required concentration by adding an appropriate reconstituting agent such as distilled water for injection to the preparation.
  • These compositions of the present invention can be used for the production of IL-2, IFN-a, ⁇ , EGF during the manufacturing process and during storage without containing serum albumin derived from warm blood animals or carnitine as a thyroid inhibitor. The actual loss is small.
  • freeze-dried preparations of IL-12, IFN-hi, ⁇ - ⁇ , and EGF have excellent characteristics such as a transparent liquid when redissolved and little adsorption to the container wall. Have. Moreover, since the composition of the present invention can be adjusted to around physiological ⁇ , undesirable local effects such as pain upon injection and inflammation at the injection site can be avoided.

Abstract

ヒト、ブタ、ウシ血清アルブミン等の温熱生物由来の成分やカルニチンを含有しない安定なＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γまたはＥＧＦを含む組成物を製造する。　少なくともＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γまたはＥＧＦいずれか１種、糖および／または糖アルコール、アミノ酸、要すれば酸および塩基、さらに要すれば界面活性剤を含むＩＬ−２、ＩＦＮ−α、β、γまたはＥＧＦいずれか１種の組成物であれば、経時保存しても当該薬物の含量はほとんど低下しない。さらに組成物をシリコーンコーティングされた容器に収容することによって、当該薬物含量の低下をさらに抑制することができる。

Description

明細書 安定化された夕ンパク組成物 技術分野
本発明は、 安定なタンパク組成物、 詳しくは温血動物由来の血清アルブミ ンお よびカルニチンを配合せず、 かつ少な く とも、 イ ンターロイキン一 2、 イ ンタ一 フエロン一 α、 イ ンタ一フエロン一 /?、 イ ンターフェロン一ァ、 上皮増殖因子の いずれか 1種、 糖および/または糖アルコール （ソルビトールを除く） 、 ァミノ 酸 （グリシンおよびヒスチジンを除く ） を含むタンパク組成物 （但し、 ァラニン およびスクロースを配合した組成物、 塩酸リ ジンおよびスクロースを配合した組 成物を除く ） 、 要すれば酸および塩基、 さらに要すれば界面活性剤を含んだタン パク組成物に関するものである。 背景技術
イ ン夕一ロイキン一 2 (以下、 I L— 2 と略す） は、 Τ細胞やナチュラルキラ —細胞を増殖させる生理活性を有するタンパク質であり、 種々の癌、 特に血管肉 腫ゃ腎癌、 また免疫不全の治療薬と して大きな期待が寄せられている。 また、 後 天性免疫不全症候群 （A I D S ) の治療薬と しても大きな期待が持たれている。 また、 I L— 2 と同様に抗腫瘍作用を有するタンパクとして、 イ ンタ一フエロン (以下、 I F Nと略す） があり、 ウィルス . 二本鎖 R N A . レクチンなどによつ て動物細胞から誘発される抗ウィルス作用も有する。 さらに、 上皮増殖因子 （以 下、 E G F と略す） は、 上皮細胞の分化'増殖を促進させる作用をもち、 細胞内夕 ンパク質のリ ン酸化を亢進させる。
上記、 I L一 2、 I F N、 E G Fのようなタンパク成分は、 通常の保存状態で は不安定な物質であるために、 種々の安定化方法が試みられている。 例えば、 安 定化剤としてヒ ト血清アルブミ ンを配合した I L一 2 を含む溶液に、 塩基および 酸を加え、 中性とするこ とにより I L一 2の組成物を得ているもの （例 ： 特開昭 6 2 - 1 6 4 6 3 1 ) や還元物質さらにはヒ ト血清アルブミ ンを配合するこ とに よって I L一 2組成物を得ているもの （例 ：特開昭 6 0 — 2 1 5 6 3 1 ) がある。 また、 アミノ酸であるグリシンおよび糖であるスクロースを含み、 ヒスチジン（塩 基） またはクェン酸 （酸） のいずれかで p H 5〜 6 . 5 に調整された I L一 2組 成物を得ているもの （例 ： WO 0 2 / 0 0 2 4 3 ) やアルギニンとカルニチン （ 4 — ト リ メチルァミ ノ - 3 —ヒ ドロキシ酪酸、 別名ビタ ミ ン B τ) の混合物、 スク ロースおよびクェン酸を含んだ I L一 2組成物を得ているもの （例 ： WO 9 0 Z 0 0 3 9 7 ) がある。 上記、 I L一 2、 I F N、 E G F以外のタンパクを含む製 剤には、 糖およびアミノ酸でタンパク質を安定化させて製剤を得ているものがあ る （例 ： 特表平 8 — 5 0 4 7 8 4、 W0 9 6 /4 1 6 4 2 , 特表 2 0 0 1 — 5 0 3 7 8 1 ) o
しかしながら、 上記ヒ ト血清アルブミ ン （H S A) 等の温熱動物由来の血清ァ ルブミ ンは、 最近、 ウィルス感染や狂牛病などの危険性が指摘されており、 H S Aのような特定生物由来製品は製剤処方に含まれないことが望まれている。また、 I L - 2は水に比較的難溶性であり、 通常中性付近で凝集反応が生じ溶解度が低 下するために、 一旦塩基または酸を添加して I L一 2を溶解した後、 酸または塩 基を添加して中性付近にする必要がある。 このため、 上記 WO 0 2 / 0 0 2 4 3 に記載されているように、 酸または塩基のいずれかしか配合しなければ、 凝集反 応が生じ、 I L一 2の溶解度が低下する恐れがある。 さらに、 上記 WO 9 0 / 0 0 3 9 7 に開示されている安定化剤と してのカルニチンは、甲状腺阻害剤であり、 その添加量によっては、 副作用を生じる恐れがある。 また、 タンパク質の安定化 方法については、 一般的にタ ンパク質の種類が異なれば、 必ずしも同様に安定化 できるとは限らないことが文献に記載されており [ I n t . J . P h a r m . 1_ 8 5、 1 2 9 - 1 8 8 ( 1 9 9 9 ) 、 I n t . J . P h a r m. 2 0 3、 1 - 6 0 ( 2 0 0 0 ) ] 、 上記 I L一 2や I F Nと異なるタンパク成分を安定化できる 組成物でも、 当該タンパク成分を安定化できるとは限らない。 このように、 タン パク成分と して、 安全性が高く、 しかも保存性のよい組成物が望まれていた。 発明の開示
上記事情に鑑み、 本発明者らは、 温血動物由来の血清アルブミンおよびカルニ チンを含まず、 医薬上許容されうる糖および/または糖アルコール、 アミノ酸な らびに要すれば、 酸および塩基、 さらに要すれば、 界面活性剤等を配合するこ と によって、 I L一 2、 I F Nである I FN— a、 I FN— /?、 I F N—ァ、 また は E G Fの安定性を高めた組成物を見出し、 以下に示す本発明を完成した。
( 1 ) 温血動物由来の血清アルブミ ンおよびカルニチンを配合せず、 かつ少なく とも以下の成分
1 ) イ ンターロイ キン一 2、 イ ンタ一フエロ ン一ひ、 イ ン夕一フエロ ン一 /5、 イ ンタ一フエロン一ァまたは上皮増殖因子のいずれか 1種、
2 ) 糖および Ζまたは糖アルコール （ソルビ トールを除く） 、 ならびに、
3 ) アミノ酸 （グリシンおよびヒスチジンを除く）
を含むことを特徴とする、 タンパク組成物 （但し、 ァラニンおよびスクロースを 配合した組成物、 塩酸リ ジンおよびスクロースを配合した組成物を除く ） 。
( 2 ) 更に酸および塩基を含むことを特徴とする、 上記 （ 1 ) に記載の組成物。
( 3 ) 更に界面活性剤を含むことを特徴とする、 上記 （ 1 ) に記載の組成物。
( 4 ) 糖および Ζまたは糖アルコールがマルト一ス、 マンニ トール、 ラク トース およびスクロースから選ばれる 1または 2以上である上記 （ 1 ) から （ 3 ) のい ずれかに記載の組成物。
( 5 ) 糖および Ζまたは糖アルコールがマル ト一スおよび/またはスクロースで ある上記 （ 4 ) に記載の組成物。
( 6 ) アミノ酸がァラニン、 塩酸リジンおよびアルギニンから選ばれる 1 または 2以上である上記 （ 1 ) から （ 3 ) のいずれかに記載の組成物。
( 7 ) アミノ酸がアルギニンである上記 （ 6 ) に記載の組成物。
( 8 ) 糖および/または糖アルコールがマルトースおよび/またはスクロースで あり、 アミ ノ酸がアルギニンである上記 （ 1 ) から （ 3 ) のいずれかに記載の組 成物。
( 9 ) 糖および/または糖アルコールとアミノ酸の組合せがメイラ一ド反応を生 じないものである上記 （ 1 ) から （ 3 ) のいずれかに記載の組成物。
( 1 0 ) 凍結乾燥品である上記 （ 1 ) から （ 3 ) のいずれかに記載の組成物。
( 1 1 ) 溶液状態でィ ンタ一ロ イキン一 2、 インタ一フエロン一ひ、 イ ン夕一フエ Ό、ノー βヽ インターフヱロンーァまたは上皮増殖因子のいずれかの濃度が 1〜 2 2 0 /gZmLとなるように調製された上記 （ 1 ) から （3 ) のいずれかに記載の組 成物。
( 1 2 )溶液状態で p Hが 6. 1 ~ 9を示すように調製された上記（ 1 )力 ら （ 3 ) のいずれかに記載の組成物。
( 1 3 ) シリコーンコーティ ングされた容器に収容された上記 （ 1 ) から （ 3 ) のいずれかに記載の組成物。
( 14) 温血動物由来の血清アルブミンおよびカルニチンを配合せず、 かつ少な く とも以下の成分
1 ) イ ン夕一ロイキン一 2、 イ ンタ一フエロン一ひ、 イ ン夕一フエロン一 ?、 イ ンターフェロ ン一ァまたは上皮増殖因子のいずれか 1種、
2 ) 糖および/または糖アルコール （ソルビ トールを除く） 、 ならびに、 3 ) アミノ酸 （グリシンおよびヒスチジンを除く ）
を含んだ溶液を凍結乾燥する工程を含むことを特徴とする、 タンパク組成物 （但 し、 ァラニンおよびスクロースを配合した組成物、 塩酸リ ジンおよびスクロース を配合した組成物を除く） の製造方法。
( 1 5 ) 該溶液のイ ンタ一ロイキン一 2、 イ ン夕一フエロン一 ひ、 イ ンタ一フエ ロン一 5、 イ ンターフェロンー ァまたは上皮増殖因子のいずれかの濃度が 1〜 2 20 g/m Lである上記 （ 1 4 ) に記載の製造方法。
( 1 6 ) 該溶液がイ ンタ一ロイキン一 2を含むものであり、 該溶液に塩基を加え て p H 8〜 1 1 と した後、 速やかに酸を加えて中和するか、 または該溶液に酸を 加えて p H 2〜 6 と した後、 速やかに塩基を加えて中和する工程を含むことを特 徴とする、 上記 （ 1 4 ) または （ 1 5 ) に記載の製造方法。
( 1 7 ) 該溶液が更に界面活性剤を含むことを特徴とする、 上記 （ 1 6 ) に記載 の製造方法。
( 1 8 ) 温血動物由来の血清アルブミ ンおよびカルニチンを配合せず、 かつ少な く とも糖およびノまたは糖アルコール （ソルビトールを除く） 、 ならびにアミ ノ酸 (グリシンおよびヒスチジンを除く） を配合することを特徴とする、 イ ンターロイキ ン一 2、 イ ンタ一フ エロン一 ひ、 イ ンタ一フ エロ ン一 3、 イ ンタ一フ エロ ン一 y または上皮増殖因子のいずれかを安定化する方法。
( 1 9 ) 更に酸および塩基、 ならびに界面活性剤を配合するこ とを特徴とする、 上記 （ 1 8 ) に記載の方法。 発明を実施するための最良の形態
本発明の I L— 2、 I F N— ひ 、 β、 ァまたは E G Fを含む組成物は、 I L— 2、 I F N— ひ 、 βヽ ァまたは E G Fのいずれか一種および下記の添加物を溶解 した溶液 （例 ：注射剤） として用いることができるが、 該溶液の液媒体を乾燥し、 固形剤 （例 ： 凍結乾燥製剤） にする場合もある。 固形剤であるならば、 組成物を 長期保存するこ とも可能である。
本発明では、 I L一 2の場合、 天然由来または遺伝子組換え I L一 2の全てを 用いることができるが、 特に遺伝子組換えヒ ト I L一 2が好ま しい。 I F Ν— ひ 、 β、 ァの場合、 天然由来または遺伝子組換えヒ ト I F Ν— ひ、 βヽ ァの全てを用 いるこ とができるが、 特に遺伝子組換えヒ ト I F N— α、 β、 ァが好ま しい。 ま た、 E G Fの場合、 天然由来または遺伝子組換えヒ ト E G Fの全てを用いるこ と ができるが、 特に遺伝子組換えヒ ト E G Fが好ま しい。
組成物中の I L一 2、 I F N— ひ、 βヽ ァ、 E G Fの濃度が低くても、 当該薬 物の容器壁面への吸着が少ないこ とが大きな特徴であり、 本発明の組成物を溶液 と して使用する場合、 溶液 l mL中に I L— 2、 I F N - a βヽ ァ、 E G Fは、 0. l〜 5 0 0〃 g、 好ま しくは 0. 5〜 3 0 0〃 g、 よ り好ま しくは 1〜 2 2 O ^ g配合すればよい。 また、 本発明の組成物を固形剤と して使用する場合、 固 形剤全量に対し I L一 2、 I F N— ひ、 βヽ 、 E G Fは、 0. 0 0 1〜 5 wZ w%、 好ま しくは 0. 0 0 2 5〜 2. 5 w/w%、 よ り好ま しくは 0. 0 0 3〜 1 w/w%配合すればよい。 I L一 2、 I F N— ひ、 βヽ ァ、 E G F含量が前記 配合量よ り も少なければ、 薬効が十分に発揮されない可能性がある。 前記配合量 より も多ければ、 溶液中に I L一 2等の薬物が完全に溶解しない恐れがある。 本発明において、 糖および/または糖アルコールは、 単糖類、 二糖類、 多糖類 あるいは水溶性グルカン類を意味し、 生理的に許容されるものであれば使用でき る。 糖および Ζまたは糖アルコールは、 I L— 2、 I F N— ひ、 βヽ ァ、 E G F の安定化のために添加されるが、 溶解補助剤、 賦形剤あるいは等張化剤と しても 添加されうる。 糖と して、 具体的にはグルコース、 マンノース、 ソルボース、 キ シロース、 マル ト一ス、 ラク ト一ス、 フルク ト一ス、 スク ロース、 デキス ト ラン、 プルラン、 デキス ト リ ン、 シクロデキス ト リ ン、 可溶性デンプン、 ヒ ドロキシェ チルデンプン、 カルボキシメチルセルロース一 N a等が挙げられる。 また、 糖ァ ルコールと しては C 4〜 C 8の糖アルコールが好ま しく、 具体的には、 マンニ ト —ル、 イ ノ シ トール、 ズルシ トール、 キシ リ トール、 ァラ ビ トール、 ラフ イ ノ一 ス、 エリス リ トール、 マルチ トール、 ラクチ トール、 ノ、。ラチニッ ト、 ト レノ、口一 ス等が挙げられる。 前記糖および/または糖アルコールの中で、 好ま しくはマル トース、 マンニ トール、 ラク ト一ス、 スクロースおよびソルビ トールであり、 さ らに好ま しくはマル トース、 マンニトール、 ラク ト一スおよびスクロースであり、 特に好ま しくはマル ト一ス、 スクロースである。
前記の糖および/または糖アルコールは、 単独または混合物で用いることがで きる。 配合量は特に限定されるものではなく、 組成物の溶液に溶解可能で I L一 2の安定性を高める量であればよい。 I L— 2、 I F N— ひ、 β、 ァ、 E G Fに 対する糖および/または糖アルコールの配合割合は重量比で 1〜 2 0 0 0 0倍、 好ま しくは 5〜 1 7 5 0 0倍、よ り好ましくは 2 0〜 1 5 0 0 0倍であればよい。 また、 本発明組成物を溶液と して使用する場合、 組成物の溶液 1 m L中に糖およ び/または糖アルコールを 5〜 5 0 0 m g、 好ま しくは 1 0〜 2 5 001 、 よ り 好ましくは 2 0〜 2 0 0 m g添加すればよい。 前記配合量より も少なければ、 I L一 2、 I F N— α、 βヽ ァ、 E G Fを安定化することができない恐れがあ り、 多ければ、 組成物全量に対する I L一 2含量が相対的に低下し、 多量の I L一 2、 I FN— 、 β、 ァ、 E G Fの組成物を投与しなければ、 薬効が生じない可能性 がある。
本発明において、 アミ ノ酸は、 I L一 2、 I F N— ひ、 β、 ァ、 E G Fの安定 化のために添加されるが、 賦形剤としても添加されうる。 アミ ノ酸とは、 分子内 にァミノ基と力ルポキシル基とをもつ化合物を意味するが、 プロ リ ンおよびヒ ド ロキシプロ リ ンのようなィ ミ ノ酸も含まれ、 生理的に許容されるものであれば使 用できる。 アミノ酸と しては、 中性アミノ酸、 酸性アミノ酸および塩基性ァミノ 酸が挙げられる。 具体的には中性アミノ酸と して、 ァラニン、 ノ リ ン、 ノルバリ ン、 ロイ シン、 ノルロイ シン、 イ ソロイ シン、 フエ二ルァラニン、 チロシン、 ジ ョ一 ドチロシン、 スルナ ミ ン、 ト レオニン、 セ リ ン、 プロ リ ン、 ヒ ドロキシプロ リ ン、 ト リ プト フ ァン、 チロキシン、 メチォニン、 シスチン、 システィ ン、 ひ 一 ァミノ酪酸等が挙げられる。 酸性アミノ酸と して、 ァスパラギン酸、 グルタ ミ ン 酸、 ァスパラギン、 グルタ ミ ン等が挙げられる。 塩基性アミノ酸と しては、 リ ジ ン、 塩酸リ ジン、 アルギニン、 ヒ ドロキシリ ジン等が挙げられる。 前記アミ ノ酸 のうち、 好ま しくはァラニン、 塩酸リ ジン、 アルギニンであり、 よ り好ま し くは アルギニンである。
前記のアミノ酸は、 単独または混合物で用いるこ とができる。 添加量は特に限 定されるものではなく、 組成物の溶液に溶解可能で I L一 2、 I F N— a、 β、 ァ、 E G Fの安定性を高める量であればよい。 I L一 2、 I F N— ひ、 β、 ァ、 E G Fに対するァミノ酸の配合割合は重量比で 1 ~ 1 0 0 0 0倍、 好ま しく は 1 0〜 7 5 0 0倍、 よ り好ま しくは 2 0〜 5 0 0 0倍であればよい。 また、 本発明 組成物を溶液と して使用する場合、 組成物の溶液 1 m L中にアミノ酸を 0. 1〜 2 5 0 mg、 好ま しくは 0. 5 ~ 1 2 5 mg、 より好ま しくは l ~ 1 0 0 m g添 加すればよい。 前記添加量よ り も少なければ、 I L一 2、 I F N— 、 β ァ 、 E G Fを安定化できない恐れがあり、 多ければ、 組成物全量に対する I L一 2、
I F N— α、 β ァ、 E G Fの含量が相対的に低下し、 多量の I L一 2、 I F N 一ひ、 β ァ、 E G Fを含有する組成物を投与しなければ、 薬効が生じない可能 性がある。
本発明組成物は、 前記したように、 糖および/または糖アルコール、 ならびに ァミ ノ酸を配合しているために、 固体状態でも液体状態でもメイ ラー ド反応を生 じる場合がある。 メイラ一ド反応とは、 アミノ酸、 ペプチ ド、 タンパク質のアミ ノ基とケト ン、 アルデヒ ド、 特に還元糖が反応して褐色色素を生成するものであ る。 しかし、 本発明の組成物においては、 特に糖および/または糖アルコールが マルト一ス、 マンニ トール、 ラク ト一ス、 スクロース、 好ま しくはマルト一ス、 スクロースであり、 アミ ノ酸がァラニン、 塩酸リジン、 アルギニン、 好ま しくは アルギニンとの組合せの場合には、 例えば 4 0 °Cで 3 0日間程度、 該組成物を保 存してもメイラード反応は生じる恐れが少な く、 I L— 2、 I F N— ひ、 β ァ、 E G Fの含量が低減する可能性も少ない。 但し、 ァラニンおよびスクロースを配 合した組成物、 塩酸リジンおよびスクロースを配合した組成物は、 凍結乾燥品が融 解し、 当該乾燥品は製造することができなかった。
上記、 糖および/または糖アルコールとアミノ酸の含量の比率は、 糖および Ζま たは糖アルコールに対し、 重量比でアミノ酸が 0. 0 1〜 4倍、 好ましくは 0. 0 2 5 ~ 3倍、 より好ましくは 0. 0 5〜 2倍である。 なお、 夕ンパク質製剤の場合、 添加物が同じでも主薬である夕ンパク質が異なれば、 メイラード反応の有無も異な るので、 メイラ一ド反応を生じないようにするためには、 タンパク質の種類によつ て製剤中の添加物の種類、 量等を検討する必要がある。
本発明において、 要すれば酸を配合してもよい。 酸としては、 生理的に許容さ れる酸を全て用いることができる。 例えば、 酢酸、 乳酸、 コハク酸、 酒石酸、 ク ェン酸、 ァスパラギン酸、 グルタ ミ ン酸、 ァスパラギン、 グルタ ミ ン等の有機酸 や、 塩酸、 リ ン酸等の無機酸が挙げられ、 単独でも、 2種以上の混合物で用いて もよ く、 好ま しくはクェン酸、 酒石酸である。 また、 これらの薬理学的に許容さ れる塩であってもよい。 酸の添加量は用いる酸の種類によっても異なるが、 所望 の p Hに調整できる必要量を添加すればよい。 一般的には、 I L— 2、 I F N— α、 ?、 ァ、 E G Fに対する酸の配合割合は重量比で 5〜 1 2 0 0 0倍、 好ま し くは 1 0 ~ 6 0 0 0倍、 より好ま しくは 2 5 ~ 3 0 0 0倍であればよい。 本発明 組成物を溶液と して使用する場合、 組成物の溶液 l mL中に酸を 0. 2 5〜 5 0 mg、 好ま しく は 0. 5〜 2 0 m g、 よ り好ま しくは l〜 1 0 m g添加すればよ い。 また、 前記量よ り も少なければ P Hは塩基性となり、 また多ければ p Hが酸 性となり、 いずれの状態でも I L— 2、 I F N—ひ、 β、 γ、 E G Fを安定化で きない恐れがある。
なお、 有機酸のうち、 酸性アミノ酸であるァスパラギン酸、 グルタ ミ ン酸、 ァ スパラギン、 グルタ ミ ンは、 構成成分中の酸であると同時にアミノ酸でもあり う る。
本発明において、 要すれば塩基を配合してもよい。 塩基としては、 生理的に許 容される塩基を全て用いることができる。 例えば、 N—メチルダルカミ ン、 モノ エタノールアミ ン、 ジエタノールアミ ンおよびト リエ夕ノールアミ ン等のアルコ ールァミ ン、 モノ、 ジまたは ト リェチルァミ ン等のアルキルァミ ン、 アルギニン、 リ ジン、 塩酸リ ジン等の塩基性アミノ酸、 ならびに炭酸ナ ト リ ウム等の無機塩基 等が用いられ、 これらは単独でも、 2種以上の混合物で用いてもよい。 炭酸ナ ト リ ウム等の無機塩基を用いる際には、 上記アミ ン等との併用が好ま しい。 好ま し い塩基と しては、 N—メチルグルカミ ン、 ジエタノールァミ ン、 ト リエタノール ァミ ン、 アルギニンであ り、 よ り好ま しくは、 ジエタノールァミ ン、 アルギニン である。 前記塩基は、 単独でも、 2種以上の混合物で用いてもよい。 塩基の添加 量は用いる塩基の種類によっても異なるが、 所望の P Hに調整できる必要量を添 加すればよい。 一般的には、 I L一 2、 I F N— α、 βヽ ァ、 E G Fに対する塩 基の配合割合は重量比で 2 ~ 1 0 0 0 0倍、 好ましくは 5〜 5 0 0 0倍、 よ り好 ましくは 1 0〜 4 5 0 0倍であればよい。 本発明組成物を溶液と して使用する場 合、 組成物の溶液 1 m L中に酸を 0. l〜 1 0 0 m g、 好ま しくは 0. 2 5〜 1 0 0 m g、 より好ま しくは 1 ~ 5 0 m g添加すればよい。 また、 本発明組成物を 固形剤と して使用する場合、 前記量よ り も少なければ、 溶液の p Hが酸性となり、 また多ければ、 溶液の p Hが塩基性となり、 いずれの状態でも I L— 2、 I F N 一 、 β、 ァ、 E G Fを安定化できない恐れがある。
なお、 塩基性アミ ノ酸であるアルギニン、 リ ジン、 塩酸リジン等は、 構成成分 の塩基であると同時にアミノ酸でもあり うる。
本発明において、 更に要すれば界面活性剤を添加することも可能である。 界面活 性剤としては、 生理的に許容される界面活性剤であればよ く、 該界面活性剤の添加 により、 固形剤調製における乾燥前の組成物溶液調製時または固形剤を蒸留水に再 溶解する時の I L一 2、 I FN— c、 β、 ァ、 E GFの溶解性改善ならびに、 組成 物溶液の液媒体を乾燥した時における I L一 2、 I FN— ひ、 βヽ ァ、 E GFの安 定性を向上 （特に乾燥時における I L— 2、 I F N— 、 βヽ ァ、 E G Fの容器壁 面の吸着を防止して、 組成物中の I L— 2含量の低下を抑制する） するなどの効果 が得られる。 界面活性剤として、 組成物の溶液に溶解または懸濁でき、 I L一 2、 I FN— ひ、 β、 ァ、 E G Fの安定性を高めるものであればよいが、 好ま しくは非 イオン性界面活性剤であり、 具体的にはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、 ショ糖 脂肪酸エステル、 ポリエチレングリコール （P E G) 、 ポリオキシエチレンポリオ キシプロピレングリコール、 ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等が挙 げられる。 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油として具体的には、 ポリオキシェチレ ン硬化ヒマシ油 5、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 1 0、 ポリオキシエチレン硬 化ヒマシ油 2 0、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 40、 ポリオキシエチレン硬化 ヒマシ油 5 0、 ポリォキシェチレン硬化ヒマシ油 6 0等がある。 ポリェチレングリ コールと して具体的には、 マクロゴール 2 00、 マクロゴール 3 0 0、 マクロゴ一 ル 40 0、 マクロゴール 6 0 0、 マクロゴール 1 0 0 0、 マクロゴール 1 5 0 0、 マクロゴール 1 54 0、 マクロゴール 2 0 0 0、 マクロゴール 40 00、 マクロゴ ール 6 0 0 0、 マクロゴール 2 0 0 0 0等がある。 ポリオキシエチレンポリ才キシ プロピレングリコールと して具体的には、 ポリオキシエチレン （ 1 0 5 ) ポリオキ シプロピレン （ 5 ) グリコール、 ポリオキシエチレン （ 1 2 0 ) ポリオキシプロピ レン （40 ) グリコール [プルロニヅク F 8 7 ] 、 ポリオキシエチレン （ 1 6 0 ) ポリオキシプロピレン （ 3 0) グリコール [プル口ニック F 6 8] 、 ポリオキシェ チレン （42 ) ポリオキシプロピレン （ 6 7) グリコール [プル口ニック P 1 2 3 ] 、 ポリオキシエチレン （ 5 4) ポリオキシプロピレン （ 3 9 ) グリコール [プルロニ ック F 8 5 ] 、 ポリオキシエチレン （ 1 9 6 ) ポリオキシプロピレン （ 6 7 ) グリ コール [プル口ニック F 1 2 7 ] 、 ポリオキシエチレン （ 2 0) ポリオキシプロピ レン （ 2 0 ) グリコール [プル口ニック L 44] 等がある。 ポリオキシエチレンソ ルビ夕ン脂肪酸エステルとして具体的には、 ポリソルべ一ト 2 0 [Twe e n 2 0 ]、 ポリソルベート 40 [Twe e n 40 ] 、 ポリソルべ一ト 6 0 [Twe e n 6 0] 、 ポリソルべ一ト 6 5 [Twe e n 6 5 ] 、 ポリソルべ一ト 8 0 [ T w e e n 8 0 ] 等がある。 より好ましくはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、 特に好 ましくはポリソルべ一ト 8 0 [T w e e n 8 0 ] である。
界面活性剤の配合量は用いる界面活性剤の種類によっても異なるが、 I L一 2、 I F N— 、 β、 ァ 、 E G Fに対する界面活性剤の配合割合は重量比で 1 ~ 3 0 0倍、 好ま しくは 2. 5〜 2 5 0倍、 より好ま しくは 5〜 2 0 0倍であればよい。 本発明組成物を溶液として使用する場合、 組成物の溶液 l mL中に 0. 0 5 m g 〜 1 5 mg、 好ま しくは 0. 0 7 5 m g〜 7. 5 m g、 よ り好ま しくは 0. l m g〜 4 m gを添加すればよい。 また、 本発明組成物を固形剤として使用する場合、 前記添加量よ り も少なければ、 I L一 2、 I F N—ひ、 β、 ァ、 E G Fの溶解性 が改善せず、 また I L一 2、 I F N— α、 β、 ァ、 E G Fの安定性が低下する恐 れがあり、 逆に多ければ、 調製の際、 泡立ちにより組成物溶液の調製が困難とな る可能性がある。
本発明では、 固形剤調製における乾燥前の組成物溶液製造時または固形剤を蒸留 水に再溶解する時の ρ Η変動を最小限にするために緩衝剤を用いることが好ま しい。 緩衝剤と しては、 生理的に許容される緩衝剤であればよく、 例えば、 リ ン酸系また はクェン酸系の緩衝剤が挙げられる。
緩衝剤の添加量は用いる緩衝剤の種類によっても異なるが、 所望の p H、 すな わち、 組成物の溶液の p Hを 6. 1〜 9に保持するのに必要な量を用いればよい。 具体的には、 I L一 2、 I F N— 、 β ァ、 E G Fに対する緩衝剤の配合割合 は重量比で 2 0〜 1 0 0 0 0倍、 好ま しくは 5 0〜 8 0 0 0倍、 よ り好ま しく は 1 0 0 - 6 0 0 0倍あればよい。 本発明組成物を溶液と して使用する場合、 組成 物の溶液 l mL中に緩衝剤を l ~ 1 0 0 mg、 好ま しくは 2. 5〜 7 5 mg、 よ り好ま しくは 5 ~ 5 0 m g添加すればよい。 前記量よ り も少なければ、 組成物溶 液製造時または固形剤を蒸留水に再溶解する時の p H変動が大き くなる恐れがあ り、 多ければ、 組成物全量に対する I L一 2、 I F N— α、 β ァ、 E G Fの含 量が相対的に低下し、 多量の I L一 2、 I F N— α、 β ァ、 E G Fの組成物を 投与しなければ、 薬効が生じない可能性がある。
本発明の製剤は、 製剤の形態に応じ、 製剤学上許容される添加物を含有しうる。 例えば、 注射剤の場合、 フヱノール、 クレゾ一ル等の保存剤、 亜硫酸塩、 ピロ亜 硫酸ナ ト リ ウム、 ァスコルビン酸、 エチレンジァミ ン四酢酸 （E D TA) 、 チォ グリコール酸等の酸化防止剤、 ベンジルアルコール、 クロロブ夕ノール等の無痛 化剤、 塩化ナ ト リ ウム、 グリセリ ン等の等張化剤を添加してもよい。
安定化剤と して、 温血動物由来の血清アルブミ ン、 例えばヒ ト血清アルブミ ン、 ゥシ血清アルブミ ン、 ブ夕血清アルブミ ン等を配合した場合、 前述した様に副作 用を生じる可能性があるが、 アルブミ ンであっても遺伝子組換えアルブミ ンであ れぱ、 上記副作用を生じる可能性が低く、 組成物の添加剤と して配合する場合も あ り うる。 遺伝子組換えアルブミ ンの添加は、 I L一 2、 I F N— α、 β ァ、 E G Fの安定性低下の防止に有用である。 I L— 2、 I F N— α、 β ァ、 E G Fに対する遺伝子組換えアルブミ ンの配合割合は、 重量比で 1〜 4 0 0 0倍、 好 ま しくは 2. 5〜 2 0 0 0倍、 よ り好ま しく は 5〜 1 0 0 0倍であればよい。 本 発明組成物を溶液と して使用する場合、 組成物の溶液 1 m L中に 0. l mg~ l O O m g、 好ま しくは 0. 2 5 m g〜 5 0 m g、 よ り好ま しくは 0. 5 mg〜 2 5 m gを添加すればよい。
本発明の組成物は、 少なく とも I L一 2、 I F N—ひ、 β、 ァ、 E G Fのうち いずれか 1種、 糖および/または糖アルコール、 アミノ酸、 要すれば酸ならびに 塩基、 さらに要すれば界面活性剤、 また ρ Ηの調節のために緩衝剤等の配合成分 を含む。 これら組成物の配合成分の好ま しい組合せとして、 I L一 2の場合、 1 ) I L— 2、 マル ト一ス、 アルギニン、 クェン酸、 ジエタノールァミ ン （場合によ つては、 ジエタノールアミ ンを配合しない場合もある） 、 要すればポリ ソルべ一 ト 8 0およびリ ン酸緩衝液、 および 2 ) I L— 2、 スクロース、 アルギニン、 ク ェン酸、 ジエタノールァミ ン （場合によっては、 ジエタノールアミ ンを配合しな い場合もある） 、 要すればポリソルべ一卜 8 0およびリ ン酸緩衝液の組合せの組 成物である。 これら好ま しい組合せの配合成分の配合量について、 I L一 2は、 固形剤全量に対し 0 · 0 0 1 ~ 5 w/w%、 好ま しくは 0. 0 0 5 2. 5 w/ w%、 よ り好ま しくは 0. 0 1 ~ l wZw%、 I L一 2に対するマルト一スまた はスクロースの配合割合は重量比で 1〜 1 0 0 0 0倍、 好ま しくは 5 ~ 5 0 0 0 倍、 よ り好ま しくは 2 0 ~ 4 0 0 0倍、 I L一 2に対するアルギニンの配合割合 は重量比で 1〜 5 0 0 0倍、 好ま しくは 1 0〜 2 5 0 0倍、 よ り好ま しくは 2 0 〜 2 0 0 0倍、 I L一 2に対するクェン酸の配合割合は重量比で 5 ~ 2 0 0 0倍、 好ま しくは 1 0〜 1 0 0 0倍、 よ り好ま しく は 2 5〜 5 0 0倍、 I L一 2に対す るジェタノールァミ ンの配合割合は重量比で 1 0 ~ 5 0 0 0倍、 好ま しくは 2 5 〜 2 5 0 0倍、 よ り好ま しくは 5 0 ~ 2 0 0 0倍 （場合によっては、 ジェタノ一 ルァミ ンを配合しない場合もある） 、 I L一 2に対するポリソルベート 8 0の配 合割合は、 重量比で 1〜 3 0 0倍、 好ま しくは 2. 5〜 2 5 0倍、 よ り好ま しく は 5 ~ 2 0 0倍、 リ ン酸緩衝液を添加するならば、 p H 6. 1〜 9に保持するの に必要な配合割合で添加すればよいが、 具体的には I L一 2に対する緩衝剤の配 合割合は、 重量比で 2 0 ~ 2 0 0 0倍、 好ま しくは 5 0〜 1 5 0 0倍、 より好ま しくは 1 0 0〜 1 0 0 0倍であればよい。 本発明の組成物を溶液と して使用する 場合、 I L一 2は、 組成物の溶液 1 m L中に 0. l〜 5 0 0 z g、 好ま しく は 0. 5 ~ 2 5 0〃 g、 よ り好ま しくは 1〜 1 0 0〃 g、マルト一スまたはスクロース は、 組成物の溶液 I mL中に 5〜 5 0 0 m g、 好ま しくは 1 0〜 2 5 0 m g、 よ り好ま しくは 2 0〜 2 0 001 、 アルギニンは、 組成物の溶液 I mL中に 0 . 1 ~ 2 5 0 m g、 好ま しくは 0. 5 ~ 1 2 5 m g、 よ り好ま しくは 1〜 ： 1 0 0 m g、 クェン酸は、 組成物の溶液 I mL中に 0. 2 5〜 5 0 m g、 好ま しくは、 0 . 5 〜 2 0 m g、 よ り好ま しくは l〜 1 0 mg、 ジエタノールアミ ンは、 組成物の溶 液 I m L中に 0. l ~ 1 0 0 mg、 好ましくは 0 · 2 5〜 1 0 0 m g、 よ り好ま しくは 1 ~ 5 0 m g (場合によってはジエタノールアミ ンを配合しない場合もあ る） 、 ポリ ソルべ一 ト 8 0を添加するならば、 組成物の溶液 1 mL中に 0. 0 5 m g〜 1 5 mg、 好ま しくは 0. 0 7 5 m g〜 7. 5 m g、 よ り好ま しくは 0. l mg〜 4 m g、 リ ン酸緩衝液を添加するならば、 p H 6. 1〜 9に保持するの に必要な配合割合で添加すればよいが、 具体的には組成物の溶液 1 m L中に 1 ~ 1 0 0 m g、 好ましくは 2. 5〜 7 5 mg、 よ り好ま しく は 5 ~ 5 0 m g添加す ればよい。 本発明の組成物を固形剤と して使用する場合、 また、 マル ト一スとァ ルギニン、 およびスクロースとアルギニンとの含量の比率は、 マルト一スまたは スクロースに対し、 重量比でアルギニンが 0. 0 1〜 4倍、 好ま しくは 0. 0 5 〜 3倍、 よ り好ましくは 0. 1〜 2倍である。
I F N— ひの場合、 組成物の配合成分の好ま しい組合せとして、 1 ) I F N— ひ、 マルト一ス、 アルギニン、 要すれば塩酸およびリ ン酸緩衝液、 さらに要すれ ばポリ ソルべ一 ト 8 0、 2 ) I F N— ひ、 スクロース、 アルギニン、 要すれば塩 酸およびリ ン酸緩衝液、 さらに要すればポリ ソルベート 8 0の組合せの組成物で ある。 これら好ま しい組合せの配合成分の配合量について、 I F N— αは、 固形 剤全量に対し 0. 0 0 0 1〜 5wZw%、 好ま しくは 0. 0 0 0 5 ~ 2. 5 w/ w%、 よ り好ま しくは 0. 0 0 1〜 l w/w%、 I F N— αに対するマル ト一ス またはスクロースの配合割合は重量比で 1 ~ 2 0 0 0 0倍、 好ま しくは 5〜 1 7 5 0 0倍、 よ り好ま しくは 2 0〜 ： L 3 0 0 0倍、 I F Ν— αに対するアルギニン の配合割合は重量比で 1 ~ 5 0 0 0倍、 好ま しくは 1 0〜 4 5 0 0倍、 よ り好ま しくは 2 0 〜 4 0 0 0倍、 要すれば I F N— αに対する塩酸の配合割合は重量比 で 5 ~ 6 0 0 0倍、 好ま しく は 1 0〜 3 0 0 0倍、 よ り好ま しくは 2 5 〜 1 5 0 0倍、 リ ン酸緩衝剤を添加するならば、 ρ Η 6 . 1 〜 9に保持するのに必要な配 合割合で添加すればよいが、具体的には I F Ν— ひに対する緩衝液の配合割合は、 重量比で 2 0〜 1 0 0 0 0倍、 好ま しくは 5 0 〜 8 0 0 0倍、 よ り好ま しくは 1 0 0〜 6 0 0 0倍である。 さらにポリ ソルべ一 ト 8 0を要すれば、 I F N— ひ に 対するポリ ソルべ一ト 8 0の配合割合は、 重量比で 1 ~ 3 0 0倍、 好ま し くは 2 . 5〜 2 5 0倍、 より好ま しくは 5〜 2 0 0倍であればよい。 本発明の組成物を溶 液と して使用する場合、 I F N— は、 組成物の溶液 l m L中に 0 . 1 〜 5 0 0 f g 好ま しくは 0 · 5〜 2 5 0 〃 g、 よ り好ま しくは 1 〜 1 0 0 g、マル ト —スまたはスクロースは、 組成物の溶液 l m L中に 5〜 5 0 0 m g、 好ま しく は 1 0 ~ 2 5 0 m g、 より好ま しくは 2 0〜 2 0 0 m g、 アルギニンは、 組成物の 溶液 l m L中に 0 . l 〜 2 5 0 m g、 好ま しくは◦ . 5〜 1 2 5 m g、 よ り好ま しくは l ~ 1 0 0 m g、 塩酸を添加するならば、 組成物の溶液 1 m L中に 0 . 2 5〜 1 0 0 m g、 好ましくは、 0 . 5 〜 4 0 m g、 より好ま しくは l〜 2 0 m g、 リ ン酸緩衝液を添加するならば、 ρ Η 6 · 1 〜 9に保持するのに必要な配合割合 で添加すればよいが、 具体的には組成物の溶液 1 m L中に 1 ~ 1 0 0 m g、 好ま しくは 2 . 5〜 7 5 m g、 よ り好ま しくは 5 〜 5 0 m g添加すればよい。 さらに ポリ ソルべ一ト 8 0 を要すれば、 組成物の溶液 l m L中に 0 . 0 5 m g ~ l 5 m g、 好ま しくは 0 . 0 7 5 m g〜 7 . 5 m g、 より好ましくは 0 . l m g ~ 4 m g添加すればよい。 本発明の組成物を固形剤と して使用する場合、 また、 マル ト —スとアルギニン、 およびスクロースとアルギニンとの含量の比率は、 マル トー スまたはスクロースに対し、 重量比でアルギニンが 0 . 0 1 〜 4倍、 好ま しく は 0 . 0 5〜 3倍、 よ り好ま しくは 0 . 1 ~ 2倍である。
I F N— /?の場合、 組成物の配合成分の好ま しい組合せと して、 1 ) I F N— ?、 マルト一ス、 アルギニン、 要すれば塩酸およびリ ン酸緩衝液、 さらに要すれ ばポリ ソルべ一 ト 8 0、 2 ) I F N- ?, スクロース、 アルギニン、 要すれば塩 酸およびリ ン酸緩衝液、 さらに要すればポリ ソルべ一ト 8 0の組合せの組成物で ある。 これら好ま しい組合せの配合成分の配合量について、 I FN— /?は、 固形 剤全量に対し 0. 0 0 0 1〜 5 w/w%、 好ま しく は 0 · 0 0 0 5〜 2. 5 w/ w%、 よ り好ま しくは 0. 0 0 1〜 l w/w%、 I FN— ?に対するマルト一ス またはスクロースの配合割合は重量比で 1〜 2 0 0 0 0倍、 好ましくは 5〜 1 7 5 0 0倍、 よ り好ま しく は 2 0〜 1 0 0 0 0倍、 I FN— /?に対するアルギニン の配合割合は重量比で 1〜 5 0 0 0倍、 好ま しくは 1 0〜 4 5 0 0倍、 より好ま しくは 2 0 ~4 0 0 0倍、 要すれば I F N— /?に対する塩酸の配合割合は重量比 で 5〜 6 0 0 0倍、 好ま しくは 1 0〜 3 0 0 0倍、 より好ま しくは 2 5〜 1 5 0 0倍、 リ ン酸緩衝剤を添加するならば、 p H 6. 1〜 9に保持するのに必要な配 合割合で添加すればよいが、具体的には I F N— /?に対する緩衝液の配合割合は、 重量比で 2 0 ~ 1 0 0 0 0倍、 好ま しくは 5 0 ~ 8 0 0 0倍、 より好ま しくは 1 0 0 ~ 6 0 0 0倍であればよい。 さらにポリ ソルベート 8 0を要すれば、 I F N - βに対するポリ ソルベート 8 0の配合割合は、 重量比で 1〜 3 0 0倍、 好ま し くは 2. 5〜 2 5 0倍、 より好ま しくは 5〜 2 0 0倍であればよい。 本発明の組 成物を溶液と して使用する場合、 I F Ν— /?は、 組成物の溶液 1 m L中に 0. 1 〜 5 0 0〃 g、 好ま しくは 0. 5〜 2 5 0 z g、 よ り好ま しくは 1〜 1 0 0〃 、 マルトースまたはスクロースは、 組成物の溶液 1 m L中に 5〜 5 0 0 m g、 好ま しくは 1 0〜 2 5 0 m g、 よ り好ま しくは 2 0〜 2 0 0 m g、 アルギニンは、 組 成物の溶液 l mL中に 0. l〜 2 5 0 mg、 好ま しくは 0. 5〜 1 2 5 mg、 よ り好ま しくは 1 ~ 1 0 0 m g、 塩酸を添加するならば、 組成物の溶液 1 mL中に 0. 2 5〜 1 0 0 m g、 好ま しくは、 0. 5〜 4 0 mg、 よ り好ま しく は 1〜 2 0 mg、 リ ン酸緩衝液を添加するならば、 p H 6. 1〜 9に保持するのに必要な 配合割合で添加すればよいが、 具体的には組成物の溶液 1 m L中に 1〜 1 0 0 m g、 好ま しくは 2. 5〜 7 5 mg、 よ り好ま しくは 5〜 5 0 m g添加すればよい。 さ らにポリソルべ一 ト 8 0を要すれば、 組成物の溶液 l mL中に 0. 0 5 m g~ 1 5 m g、 好ま しく は 0. 0 7 5 mg〜 7. 5 mg、 より好ま しくは 0 . l m g 〜 4 m g添加すればよい。 本発明の組成物を固形剤と して使用する場合、 また、 マルト一スとアルギニン、 およびスクロースとアルギニンとの含量の比率は、 マ ルトースまたはスクロースに対し、 重量比でアルギニンが 0. 0 1 ~ 4倍、 好ま しくは 0. 0 5〜 3倍、 よ り好ま しくは 0. 1〜 2倍である。
I F N - rの場合、 組成物の配合成分の好ましい組合せとして、 1 ) I F N—ァ、 マルト一ス、 アルギニン、 L一システィ ン、 要すれば塩酸およびリ ン酸緩衝液、 さ らに要すればポリソルべ一ト 8 0、 2 ) I FN—ァ、 スクロース、 アルギニン、 L —システィン、 要すれば塩酸およびリン酸緩衝液、 さらに要すればポリソルべ一ト 8 0の組合せの組成物である。これら好ましい組合せの配合成分の配合量について、 I F N—ァは、 固形剤全量に対し 0. 0 0 1〜 5 w/w%、 好ま しくは 0. 0 0 5 〜2. 5 w/w%、 より好ましくは 0. 0 1〜： L w/w%、 I FN—ァに対するマ ルト一スまたはスクロースの配合割合は重量比で 1 ~ 5 0 0 0倍、 好ま しくは 5〜 2 50 0倍、 より好ま しくは 2 0〜 1 0 0 0倍、 I FN—ァに対するアルギニンの 配合割合は重量比で 1〜 2 5 0 0倍、 好ましくは 1 0〜 1 0 0 0倍、 より好ま しく は 20〜 5 0 0倍、 I FN—ァに対する L—システィ ンの配合割合は重量比で 0. 1〜5倍、 好ましくは 0. 2〜4倍、 より好ましくは 0. 3~ 3倍、 要すれば I F N—ァに対する塩酸の配合割合は重量比で 5~2 0 0 0倍、 好ましくは 1 0~ 1 0 0 0倍、 より好ましくは 2 5〜 5 00倍、 I F N—ァに対するポリソルべ一ト 8 0 の配合割合は、 重量比で 1〜3 0 0倍、 好ましくは 2. 5~ 2 5 0倍、 よ り好ま し くは 5~ 2 0 0倍、 リ ン酸緩衝液を添加するならば、 pH 6. 1〜 9に保持するの に必要な配合割合で添加すればよいが、 具体的には I F N—ァに対する緩衝液の配 合割合は、 重量比で 1 0〜 2 0 0 0倍、 好ましくは 2 0~ 1 5 0 0倍、 よ り好ま し くは 4 0〜 1 0 0 0倍であればよい。 さらにポリ ソルベート 8 0を要すれば、 I F N—ァに対するポリ ソルべ一ト 8 0の配合割合は、 重量比で 1〜 3 0 0倍、 好ま し くは 2. 5〜 2 5 0倍、 より好ま しくは 5〜 2 0 0倍であればよい。 本発明の組成 物を溶液として使用する場合、 I F N—ァは、 組成物の溶液 1 m L中に 0. 1〜 1 0 0 0〃 g、 好ましくは 0. 5〜 7 5 0 g、 より好ま しくは l ~ 5 0 0〃 g、マル ト一スまたはスクロースは、 組成物の溶液 l mL中に 5~ 5 0 0 mg、 好ましくは 1 0 ~ 2 5 0 m g, より好ましくは 2 0〜 2 0 0 mg、 アルギニンは、 組成物の溶 液 l mL中に 0. l〜 2 5 0 mg、 好ましくは 0. 5 ~ 1 2 5 mg、 よ り好ましく は l〜 1 0 0 mg、 L一システィ ンは、 組成物の溶液 l mL中に 0. 0 1 ~ 5 mg、 好ましくは 0. 0 5 ~ 3 mg、 よ り好ましくは 0. 1〜2. 5 mg、 塩酸を添加す るならば、 組成物の溶液 l mL中に 0. 2 5〜 1 0 0 mg、 好ま しくは、 0. 5 ~ 40 mg、 より好ましくは l〜2 0 mg、 ポリソルべ一ト 8 0を添加するならば、 組成物の溶液 l mL中に 0. 0 5 mg~ 1 5 mg、 好ましくは 0 · 07 5 mg〜 7. 5 mg、 よ り好ま しくは 0. l m g〜 4 mg、 リ ン酸緩衝液を添加するならば、 p H 6. 1〜 9に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、 具体的には組成 物の溶液 l mL中に l〜 1 0 0 m g、 好ましくは 2. 5 ~ 7 5 mg、 よ り好ま しく は 5〜 5 0 m g添加すればよい。 さらにポリソルべ一ト 80を要すれば、 組成物の 溶液 l mL中に 0. 0 5 mg〜 1 5 mg、 好ましくは 0. 0 7 5 mg~ 7. 5 mg、 より好ま しくは 0. 1 m g~ 4 m g添加すればよい。 本発明の組成物を固形剤と し て使用する場合、 また、 マルトースとアルギニン、 およびスクロースとアルギニン との含量の比率は、 マルト一スまたはスクロースに対し、 重量比でアルギニンが 0. 0 1〜 4倍、 好ましくは 0. 0 5 ~ 3倍、 より好ましくは 0. 1〜 2倍である。
E G Fの場合、 組成物の配合成分の好ま しい組合せとして、 1 ) E G F、 マル ト一ス、 アルギニン、 要すれば塩酸およびリ ン酸緩衝液、 さらに要すればポリ ソ ルベー ト 8 0、 2 ) E G F、 スクロース、 アルギニン、 要すれば塩酸およびリ ン 酸緩衝液、 さらに要すればポリソルべ一ト 8 0の組合せの組成物である。 これら 好ま しい組合せの配合成分の配合量について、 E G Fは、 固形剤全量に対し 0. 0 0 1〜 5 w/w%、 好ま しくは 0. 0 0 5〜 2. 5 w/w%、 よ り好ま しく は 0. 0 0 7 5〜 ； L w/w%、 E G Fに対するマルト一スまたはスクロースの配合 割合は重量比で 1 0〜 5 0 0 0倍、 好ましくは 5 0〜 45 0 0倍、 よ り好ま しく は 1 0 0〜 40 0 0倍、 E G Fに対するアルギニンの配合割合は重量比で 1〜 2 5 0 0倍、 好ま しくは 1 0〜 2 0 0 0倍、 よ り好ま しくは 2 0〜 1 7 5 0倍、 要 すれば E G Fに対する塩酸の配合割合は重量比で 5〜 2 0 0 0倍、 好ま しくは 1 0〜 1 0 0 0倍、 よ り好ま しくは 2 5〜 5 0 0倍、 リ ン酸緩衝液を添加するなら ば、 p H 6. 1 ~ 9に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、 具体的 には E G Fに対する緩衝液の配合割合は、 重量比で 1 0〜 3 0 0 0倍、 好ま しく は 2 0〜 2 5 0 0倍、 よ り好ま しくは 40〜 2 0 0 0倍であればよい。 さらにポ リソルべ一ト 8 0を要すれば、 E G Fに対するポリ ソルべ一 ト 8 0の配合割合は、 重量比で 1 ~ 3 0 0倍、 好ま しくは 2. 5 ~ 2 5 0倍、 よ り好ま しくは 5〜 2 0 0倍であればよい。 本発明の組成物を溶液と して使用する場合、 E G Fは、 組成 物の溶液 l mL中に 0. l〜 1 0 0 0 z g、 好ま しくは 0. 5〜 5 0 0 z g、 よ り好ま しくは 1〜 1 0 0 g、マルト一スまたはスクロースは、 組成物の溶液 1 mL中に 5〜 5 0 0 m g、 好ま しくは 1 0〜 2 5 0 m g、 より好ましくは 2 0 ~ 2 0 0 mg、 アルギニンは、 組成物の溶液 1 m L中に 0. l ~ 2 5 0 m g、 好ま しくは 0. 5 ~ 1 2 5 m g、 よ り好ま しくは l〜 1 0 0 m g、 塩酸を添加するな らば、 組成物の溶液 l mL中に 0. 2 5〜 1 0 0 m g、 好ましくは、 0. 5〜 4 0 mg、 よ り好ま しくは l ~ 2 0 mg、 リ ン酸緩衝液を添加するならば、 p H 6. 1〜 9に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、 具体的には組成物の 溶液 l mL中に ：！〜 l O O m g、 好ま しくは 2. 5〜 7 5 mg、 よ り好ま しくは 5〜 5 0 m g添加すればよい。 さらにポリ ソルべ一 ト 8 0を添加するならば、 組 成物の溶液 l m L中に 0. 0 5 m g~ 1 5 m g、 好ま しくは 0. 0 7 5 m g〜 7. 5 mg、 よ り好ま しくは 0. l m g〜 4 m g添加すればよい。 本発明の組成物を 固形剤と して使用する場合、 また、 マルト一スとアルギニン、 およびスクロース とアルギニンとの含量の比率は、 マル ト一スまたはスクロースに対し、 重量比で アルギニンが 0. 0 1〜 4倍、 好ま しくは 0. 0 5〜 3倍、 よ り好ま しくは 0. 1〜 2倍である。
本発明溶液から固形剤を製造する際の溶液の乾燥法としては、 組成物溶液の液 媒体を乾燥しさえすればよいが、 好ま しくは凍結乾燥法、 流動層乾燥法、 噴霧乾 燥法、 よ り好ま しくは凍結乾燥法がある。 凍結乾燥法によって固形状に した凍結 乾燥品は、 I L一 2、 I FN—ひ、 β、 ァ、 E G Fのようなタンパク成分を含む 製剤の場合、 熱等のス ト レスがかからず、 安定なタンパク製剤を製造するこ とが できる。
組成物溶液の ρ Ηを約 6以上に調節すれば、 I L一 2、 I F N— α、 β、 ァ、 E G Fは安定に保たれ、 かつ液媒体の乾燥操作中及び固形状製剤の再溶解時の液 状も透明に保たれうる。 従って、 本発明目的のためには、 特に ρ Ηの上限はない が、 好ましくは最終的な ρ Η調節は溶液状態で ρ Η 6. 1 ~ 9である。 本発明組 成物を注射剤と して用いる場合には、 該組成物を生理的な Ρ Η領域付近に調整す ることが好ま しく、 この場合には最終的な ρ Η領域を ρ Η 6. 1〜 8、 さらに好 ま しくは ρ Η 6. 5〜 7. 5にすればよい。 前記下限の ρ Ηよ り も酸性側では、 再溶解時の液状を透明に保つことが困難である恐れがあり、 上限の ρ Ηよ り も塩 基性側では、 組成物の安定性および溶液の透明性は満足されても、 皮膚や血管等 への刺激性が増す可能性があり、 必ずしも好ま しいものではない。
本発明において、 I L— 2、 I FN—ひ、 βヽ ァ、 E G Fの安定性が増大した 理由は必ずしも明らかではないが、 1 ) I L一 2、 I F N— α、 βヽ ァ、 E G F の分解、 2 ) I L— 2、 I F N—ひ、 βヽ ァ、 E G F同士の凝集、 3 ) I L— 2、 I FN— α、 β、 ァ、 E G Fの容器への吸着等を抑制したためと考えられる。 特 に、 製剤中の薬物濃度が低い場合、 容器壁への薬物吸着の影響が大きいが、 本発 明処方であれば、 乾燥時における容器への I L一 2、 I F N— α、 βヽ ァ、 E G Fの吸着等を抑制することが可能である。 また、 組成物製造直後の I L一 2、 I F N— α、 βヽ ァ、 E G Fの含量は経時保存後、 例えば 4 0 、 3 0日間程度保 存してもほとんど低下しない。 I L一 2の容器への吸着をさらに抑制するために は、 種々の方法が考えられるが、 その一つの方法と して内壁をシリコーンでコ ー ティ ングされた容器に I L— 2、 I F N— ひ、 βヽ ァ、 E G Fを含む組成物を収 容すればよい。
本発明 I L一 2組成物の製法は、 特に限定されないが、 好ましくは以下のような 方法で製造する。 糖および/または糖アルコールならびに安定化剤であるァミノ酸 の必要量を蒸留水に溶解した溶液に、 I L一 2原液および要すれば更に界面活性剤 の適当量を加える。 次いで塩基の適当量 （アミノ酸として、 塩基性アミノ酸を添加 した場合、 塩基を添加しない場合がある） を添加して p H約 8〜 1 1、 好ましくは p H約 9 ~ 1 1、 さらに好ましくは p H約 9. 5〜 1 0. 5とし、 緩衝液を加えた 後、 速やかに酸を加えて pH約 7〜 7. 5とする。 残りの蒸留水を加えて液量を調 節し、 組成物の溶液を製造後、 無菌濾過、 容器へ分注、 次いで凍結乾燥させる。 ま た、 別法として、 糖および/または糖アルコールならびに安定化剤あるアミノ酸の 必要量を蒸留水に溶解した溶液に、 I L一 2および要すれば更に界面活性剤の適当 量を加える。 次いで酸の適当量 （アミノ酸として、 酸性アミノ酸を添加した場合、 酸を添加しない場合がある） を添加して、 一旦 p H約 2〜 6、 好ま しくは pH約 2 〜4、 さ らに好ましくは p H約 2〜 3とし、 緩衝液を加えた後、 速やかに塩基を加 えて p H約？〜 7. 5と し、 以下上記と同様の方法で組成物を製造する。 該製造法 のうち、 I L— 2の安定性の面から、 前者の製造方法が好ましい。 凍結乾燥は、 上 記調製した組成物の溶液を約一 6 0 °C〜約一 1 0 °C、 好ま しくは約一 5 0 °C〜約一 4 0 °Cで急速凍結した後、 要すれば、 昇華熱を供給しながら、 好ま しくは 48〜 7 2時間、 0. 0 0 5〜 1 mbに保って所定含水量になるまで水分を昇華、 除去し、 要すれば窒素など不活性気体または乾燥空気を充填して、 密栓する。
上記製造法中、 塩基または酸を添加して所要の P Hと した後、 「速やかに」 酸ま たは塩基を添加し p Hを約？〜 7. 5とするが、 この 「速やかに」 酸または塩基を 添加しはじめ、 p Hを約？〜 7. 5とするまでの時間は、 組成物の製造量によって も異なるが、 約 6 0分間、 好ましくは約 4 5分間、 より好ましくは約 3 0分間以内 であればよい。
本発明 I F N— α、 β ァ、 E G F組成物の製法は、 特に限定されないが、 好ま しくは以下のような方法で製造する。 糖および/または糖アルコールならびに安定 化剤であるアミノ酸の必要量を蒸留水に溶解した溶液に、 I FN—ひ、 β ァ、 Ε G Fの原液および要すれば更に界面活性剤の適当量を加える。 I F Ν—ァについて は、 さらに L一システィ ンを添加する。 次いで要すれば塩基 （アミノ酸と して、 塩 基性アミノ酸を添加した場合、 塩基を添加しない場合がある） および塩基を添加し た場合、 酸を添加して、 緩衝液を加え、 p H約？〜 7. 5とした後、 残りの蒸留水 を加えて液量を調節し、 組成物の溶液を製造後、 無菌濾過、 容器へ分注、 次いで凍 結乾燥させる。 また、 別法として、 糖および Zまたは糖アルコールならびに安定化 剤あるアミノ酸の必要量を蒸留水に溶解した溶液に、 I F N— α、 βヽ ァ、 E GF および要すれば更に界面活性剤の適当量を加える。 次いで酸 （アミノ酸と して、 酸 性アミノ酸を添加した場合、 酸を添加しない場合がある） および酸を添加した場合、 塩基を添加して、 緩衝液を加え、 ρΗ約？〜 7. 5とし、 以下上記と同様の方法で 組成物を製造する。 該製造法のうち、 I FN— α、 βヽ ァ、 E G Fの安定性の面か ら、 前者の製造方法が好ましい。 凍結乾燥は、 上記調製した組成物の溶液を約一 6 0°C〜約— 1 0°C、 好ま しくは約一 5 0°C〜約一 4 0°Cで急速凍結した後、 要すれ ば、 昇華熱を供給しながら、 好ま しくは 48〜 7 2時間、 0. 0 0 5 ~ 1 mbに保 つて所定含水量になるまで水分を昇華、 除去し、 要すれば窒素など不活性気体また は乾燥空気を充填して、 密栓する。
本発明組成物は、温血動物由来の血清アルブミ ンおよびカルニチンを配合せず、 かつ少なく とも I L— 2、 I F N— 、 βヽ ァ、 E G Fのいずれか 1種、 糖およ び/または糖アルコール、 アミノ酸、 要すれば酸および塩基の成分を配合し、 さ らに要すれば界面活性剤や緩衝剤等を配合することによって、 I L一 2、 I F N — α、 β、 ァ、 E G Fを長期間、 例えば 4 0 °C 3 0 日間程度にわたっても安定に 保存することが可能である。 さらに、 本発明製剤によって、 I L— 2、 I F N— ひ、 β、 ァ、 E G Fの容器壁面の吸着を抑制するこ とが可能である。
本発明組成物の使用方法は特に限定されるものではないが、 非経口的に用いるこ とが好ま しい。 注射剤と して用いる際には、 凍結乾燥された該組成物を注射用蒸留 水、 生理食塩水、 ブドウ糖液、 適当な点滴用輸液等に用時溶解して静脈内、 筋肉内、 皮下または皮内に投与する。 また、 本組成物に適当な担体、 賦形剤等を加えて口、 鼻、 耳腔内投与等の局所投与製剤としてもよい。 投与量と しては、 例えば I L一 2 として一日あたり、 3 5万〜 1 40万 111； (国内標準単位） である。 実施例
以下に本発明を実施例によ りさ らに具体的に説明するが、 これは単に例示であ つて、 本発明を制限するものではない。
なお、 本発明において用いる I L一 2の力価は、 I L一 2に依存的に増殖する NK細胞 （マウス細胞由来） の増殖を定量化の指標と し、 I L— 2の単位を算出 する方法を用いて、 測定した。 I L一 2活性を有する物質の量に比例して、 N K 細胞の一種である NK— 7細胞は増殖する。 N K— 7細胞に MT T〔臭化 3— (4 , 5—ジメチルチアゾールー 2—ィル）一 2， 5—ジフエ二ルー 2 H—テ トラゾリ ゥ ム〕 を与えると、 MT Tは NK— 7細胞に取り込まれ、 ミ トコン ド リァ内膜に存 在する呼吸鎖に関連する 2つの電子伝達体、 チ トクローム bおよびチ トクローム cによ り還元され、 細胞の増殖能に比例した量の色素ホルマザンが生成する。 こ のホルマザンの生成量と試料の希釈倍数の関係から、 I L一 2の力価を定量する。 生成したホルマザンはイソプロパノールによ り NK— 7細胞から溶出され、 紫色 に呈色した液を吸光度測定 （波長 5 6 O nm) することにより、 I L一 2の力価 を測定した。 また、 I F N—ひ、 β ァ、 E G Fについては、 高速液体クロマ ト グラフィ一 （ H P L C ) にて測定をおこなった。
(実施例 1 )凍結乾燥を可能とするァミノ酸および糖の検討（ I L— 2を含まず） 以下に示す製造方法に準じて、 表 1に示す成分の組成物を製造し、 組成物の外 観を観察した。 なお、 本組成物には、 主薬である I L一 2を配合していない。 (実施例 1製剤の製造方法）
糖または糖アルコールと しては、 マルト一ス、 マンニ トール、 ラク ト一ス、 ス クロースを用いた。 アミノ酸と しては、 ァラニン、 塩酸リ ジン、 アルギニンを用 いた。 界面活性剤と してはポリソルべ一ト 8 0、 塩基としてはジエタノールアミ ン、 酸としてはクェン酸、 緩衝液としてはリ ン酸緩衝液を用いた。
1 2 0 m g/mLの糖または糖アルコール水溶液 5 mL、 1 O m g/mLのポ リ ソルべ一 ト 8 0水溶液 0 . 5 m L、 1 0 0 m g / m Lのアミ ノ酸水溶液 2 m L を混合溶解した。 該溶液に 1 0 0 m g / m 1 のジエタノールァミ ン水溶液約 0 . 3 m Lを加え、 p H約 9 とした。 なお、 アルギニン添加処方では、 ジエタノール アミ ンを添加しない。 次いでリ ン酸緩衝液 1 4 . 6 m gおよびクェン酸約 1 . 4 8 m gを添加して、 該溶液の p Hを約 7に調整し、 注射用水で全量 1 0 m L とな るように調整した。 その後、 上記製造した組成物の溶液 1 m Lおよび上記製造し た組成物の溶液 1 m Lと注射用蒸留水 1 m L を混合した溶液 2 m Lをそれぞれ 3 m L容のガラスバイアルに分注し、 凍結乾燥を行った。 凍結乾燥は表 2の条件で 行った。
表 1
Figure imgf000025_0001
表 2
凍結乾燥条件
Figure imgf000025_0002
(試験方法）
凍結乾燥直後の凍結乾燥品および 4 0 °C 1 0 日間保存後の凍結乾燥品の外観を目 視で観察した。 以下の表 3、 4で外観上問題を認めないとは白色で均質な凍結乾燥 品であり、 融解などを認めないものであることを示し、 また、 ケーキとは、 凍結乾 燥品のマ ト リ ックスであり、 このケーキが形成されていれば、 凍結乾燥品としては 安定である。 (試験結果）
凍結乾燥直後の凍結乾燥品および 4 0 °C 1 0 日間保存後の凍結乾燥品の外観 を表 3および 4に示す。 その結果、 4 0 °C 1 0 日間保存後において、 糖または糖 アルコールがマルト一スの場合、 アミ ノ酸がァラニン、 塩酸リ ジン、 アルギニン の組合せ、 糖または糖アルコールがマンニ トールの場合、 アミ ノ酸がァラニン、 塩酸リ ジン、 アルギニンの組合せ、 糖または糖アルコールがラク ト一スの場合、 アミノ酸がァラニン、 塩酸リ ジン、 アルギニンの組合せ、 糖または糖アルコール がスクロースの場合、 ァミノ酸がアルギニンの組合せの組成物における外観が特 に良好であった。 一方、 グリ シンを配合した製剤、 ソルビ トールを配合したほと んどの組成物、 ァラニンとスクロースを配合した組成物および塩酸リジンとスク ロースを配合した組成物は、 4 0 °C 1 0 日間保存において、 凍結乾燥品のケーキ は形成しなかった。
表 3 ： ァミ ノ酸と糖または糖アルコールを組み合わせた凍結乾燥品の乾燥直後 の外観
Figure imgf000026_0001
〇 ： 外観上問題なし、 X ： ケーキはできず、 融解
表 4 ： アミ ノ酸と糖または糖アルコールを組み合わせた凍結乾燥品の 4 0 °C 0 日間保存後の外観
Figure imgf000026_0002
〇 ： 外観上問題なし、 X ： ケーキはできず、 融解.
Y： 淡黄色に着色 (実施例 2 ) 凍結乾燥を可能とするアミノ酸および糖の検討 （ I L一 2を含む） 実施例 1において、 凍結乾燥品の外観が良好であったアミノ酸と糖または糖ァ ルコールの組合せの製剤を以下に示す製造方法に準じて、 各組成物を製造し、 製 造直後、 経時保存後の I L一 2含量および凍結乾燥品の外観を観察した。 なお、 本製剤には、 主薬である I L— 2を配合している。
(実施例 2製剤の製造方法）
表 5に本組成物の配合成分を示す。 糖または糖アルコールと しては、 マル ト一 ス、 マンニ トール、 ラク トース、 スクロースを用いた。 アミノ酸と しては、 ァラ ニン、 塩酸リ ジン、 アルギニンを用いた。 界面活性剤としてはポリ ソルベー ト 8 0、 塩基と してはジエタノールァミ ン、 酸と してはクェン酸、 緩衝液と してはリ ン酸緩衝液を用いた。
0. 0 4 m g ( 7 0万 J RU) の I L— 2を含んだ主薬原液 0. 6 m Lに 1 2 O m g/mLの糖または糖アルコール水溶液 5 mL、 1 O mg/mLのポリ ソル ベ一ト 8 0水溶液 0. 5 mL、 1 0 0 m g/m Lのアミノ酸水溶液 2 m Lを混合 溶解した。 該溶液に 1 0 O mg/mLのジェ夕ノールァミ ン水溶液約 0. 3 m L
(アミ ノ酸と してアルギニンを添加する場合は、 ジエタノールアミ ンを添加しな い） を加え、 p H約 9とする。 次いでリ ン酸緩衝液 1 4. 6 m gおよびクェン酸 を約 1 . 4 8 m g添加して、 該溶液の p Hを約 7に調整し、 注射用水を用いて溶 液全量を 1 0 m Lに調整した。 その後、 上記製造した組成物の溶液 1 m Lおよび 上記製造した組成物の溶液 1 m Lと注射用蒸留水 1 m Lを混合した溶液 2 m Lを 3 mL容ガラスバイアルに分注し、 凍結乾燥した。 凍結乾燥は実施例 1の条件と 同様である。 表 5
Figure imgf000028_0001
単位はいずれも m g
Figure imgf000028_0002
単位はいずれも m g
(試験方法）
凍結乾燥直後の凍結乾燥品および 4 0 °C 1 4日間保存後における凍結乾燥品の I L— 2含量を測定するとともに、 凍結乾燥品の外観 （ 4 0 °C 1 4日間保存後の 凍結乾燥品のみ） を目視で観察した。 I L— 2凍結乾燥品中の I L一 2含量は H P L C法にて測定した。 凍結乾燥品を 1 m Lの注射用水で再溶解し H P L C法の 測定検体と した。 カラムは C O S MO S I L 5 C 1 8 - 3 0 0 ( 1 5 0 x 4. 6 mm, カラム中樹脂の平均粒子径 5 m、 ナカライテスク社製） を、 I L一 2 の検出には波長 2 2 0 nmの UVを使用した。 移動相は A) 0. 1 %ト リ フルォ 口酢酸含有水/ァセ トニ ト リル （ 9 5 /5 ) 、 B ) 0. 0 7 % ト リ フルォロ酢酸 含有ァセ トニ ト リルであり、 表 6のような割合で A、 B移動相溶液を流した （グ ラジェン ト法） 。 浸透圧は、 日本薬局方第 1 4改正一般試験法 「浸透圧測定法」 に準じ測定した。 表 6
Figure imgf000029_0001
I L - 2の含量％は以下の式で算出した。
含量％ = (凍結乾燥直後または 4 0 °C 1 4日保存後の I L一 2の濃度 [J R U] ノ調製直後の I L一 2の濃度 [J RU] ) X 1 0 0
(試験結果）
表 5処方の凍結乾燥直後の凍結乾燥品および 4 0 °C 1 4日間保存後における凍結 乾燥品の I L— 2含量、 凍結乾燥品の外観 （凍結乾燥品で 4 0 °C 1 4日間保存後の み） ならびに凍結乾燥品を水で溶解した場合 （溶解した蒸留水の容量 l mL) の 浸透圧、 溶液状態の pHを表 7に示す。
その結果、 糖または糖アルコールがマルトース、 スクロースであり、 アミ ノ酸 がアルギニンの組合せであれば、 凍結乾燥直後および 4 0 °Cで 1 4日間保存後の I L - 2の含量はほぼ同じであり、 I L一 2は安定化していることが明らかとな つた。 また、 上記組合せの組成物であれば、 凍結乾燥品の着色等がないので、 メ イラ一 ド反応が生じていないことが推測された。 さらに、 上記組合せの場合、 浸 透圧はほぼ 1で、 また p Hも約 7付近と生理的 p H付近に調整されており、 注射 剤として適用しても、 肉体等に痛みは生じる恐れはないものと考えられる。 なお、 処方 1〜 8のいずれの凍結乾燥品も蒸留水等で再溶解した場合、 液状は無色澄明 であった。 表 7
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000030_0002
(実施例 3 ) I L— 2組成物のバイオアツセィ
組成物中の I L一 2含量をバイオアツセィによって測定した。
(試験方法）
実施例 2に示す凍結乾燥品のうち、 経時保存後においても I L一 2含量の低下 が少なかった凍結乾燥品、 すなわち糖または糖アルコールと してマルト一ス、 マ ンニ トール、 ラク トース、 スクロース、 アミ ノ酸と してアルギニンを含有した凍 結乾燥品（実施例 2の処方 5〜 8 )中の I L— 2をバイオアツセィにて測定した。 凍結乾燥品の配合成分のうち、 I L一 2を 0. 0 2 m g ( 3 5万 J RU) と した 以外は、 実施例 2の処方成分および製造法で製造した。 供試した凍結乾燥品と し ては、 凍結乾燥直後の凍結乾燥品および 4 0 °Cで 3 0 日間保存後の凍結乾燥品を 用いた。
パイオアッセィは、 以下の方法で行った。 本方法は、 I L— 2に依存的に増殖 する N K— 7細胞 （マウス由来） を用い、 その増殖能から力価を測定する。 I L 一 2活性を有する物質の量に比例して、 N K— 7細胞は増殖する。 N K— 7細胞 に M T T 〔臭化 3—（4， 5 —ジメチルチアゾ一ルー 2 —ィル）一 2 , 5 —ジフ エ二 ルー 2 H —テ トラゾリ ゥム〕 を与える と、 M T Tは N K— 7細胞に取り込まれ、 ミ トコン ド リア内膜に存在する呼吸鎖に関連する 2 つの電子伝達体、 チ トクロ一 ム bおよびチ トクローム cにより還元され、 細胞の増殖能に比例した量の色素ホ ルマザンが生成する。 このホルマザンの生成量と試料の希釈倍数との関係から、 I L - 2の力価を定量する。 生成したホルマザンはイソプロパノールにより N K _ 7細胞から溶出され、 紫色に呈色した液を吸光度測定 （波長 5 6 0 n m ) する ことにより、 定量した。
(試験結果）
4 0 °C、 3 0 日間保存後の凍結乾燥品の外観およびバイオアッセィの結果を凍 結乾燥直後の I L— 2活性と 4 0 °C 3 0 日間経時保存後の I L— 2活性の比と し て表 8 に示す。 その結果、 いずれの処方でも I L— 2の活性の比はほぼ 1であり、 経時保存しても I L 一 2活性はほとんど変化しないことが明らかとなった。 表 8
Figure imgf000031_0001
a: 乾燥直後の I L 一 2活性 （％) 、 b： 4 0 °C , 3 0 日間保存後の I L 一 2活性 ( % )
(実施例 4 ) 組成物の収容容器を変更した場合の I L 一 2の含量測定
組成物を収容した容器をガラスバイアルから容器の内壁面がシリコーンでコ一 ティ ングされたバイアルに変更し、 I L 一 2の含量を測定した。
(試験方法）
実施例 2に示す凍結乾燥品のうち、 経時保存後においても I L 一 2の含量の低下 が少なかった凍結乾燥品、 すなわち糖または糖アルコールとしてマルトース、 マン 二トール、 ラク ト一ス、 スクロース、 アミノ酸としてアルギニンを含有した凍結乾 燥品 （実施例 2の処方 5〜 8) 中の I L— 2含量を測定した。 凍結乾燥品の配合成 分のうち、 I L— 2を 0. 02 m g ( 3 5万 J RU) とした以外は、 実施例 2の配 合成分および製造法で製造した。 該配合成分を含む溶液 I mLを 3 mL容のシリコ —ンコ一ティ ングされたバイアルおよび 3 mL容のガラスバイアルにそれそれ分注 し、 凍結乾燥を行った。 1回凍結乾燥後、 2回凍結乾燥後 （ 1回目の凍結乾燥後に 注射用蒸留水 1 mLで再溶解して凍結乾燥したものである） における凍結乾燥品中 の I L一 2含量を測定した。 含量測定法は、 実施例 2に示す通りである。
(試験結果）
I L一 2の含量を 1 m Lあたりの J R U単位で表 9に示した。 その結果、 いず れの凍結乾燥品においても、 ガラスバイアルにく らべ、 シリコーンコ一ティ ング されたバイアルに収容した凍結乾燥品の I L— 2含量はわずかに高く、 シリ コ一 ンコーティ ングされた容器に組成物を収容することによって、 I L一 2の含量低 下をわずかに抑制することが明らかとなった。
表 9
Figure imgf000032_0001
- ： シリコーンコ一ティ ングなし、 + ： シリ コーンコーティ ングあり
(実施例 5 ) I L— 2の容器壁面吸着性試験
ガラス製バイアルの壁面に、 組成物中の I L一 2がどれほど吸着するのかを調 ベるために、 凍結乾燥する前の調製液を用いて、 I L— 2の残存率を調べた。 な お、 対照例と して、 ヒ ト血清アルブミ ン （H S A) を配合した組成物を用いた。 (実施例 5製剤の製造方法）
表 1 0に本組成物の配合成分を示す。 糖または糖アルコールと してはマル トー スを、 アミノ酸としてはアルギニンを、 酸と しては塩酸を、 緩衝液と してはリ ン 酸緩衝液を用いた。 なお、 安定化剤の影響をみるために、 あえて界面活性剤は配 合しなかった。
0. 0 4 m g ( 7 0万 J R U) の I L一 2を含んだ主薬原液 0. 6 m Lに 1 2 O m gZmLの糖または糖アルコール水溶液 5 mL、 1 0 O m g/mLのアルギ ニン水溶液 2 m Lを混合溶解し、 p H約 9とする。 次いでリ ン酸緩衝液 1 4. 6 m gおよびクェン酸を約 1 . 4 8 mg添加して、 該溶液の p Hを約 7に調整し、 注射用水を用いて溶液全量を 2 O mLに調整した。 表 1 0
Figure imgf000033_0001
単位はいずれも mg
(試験方法）
3 m L容ガラスバイアルに表 1 0の組成物の調製液 2 m Lを移し替えた後、 水 溶液中の I L一 2濃度を測定した。 最初の I L一 2組成物溶液の含量に対するバ ィアルを移し替えた後の I L一 2残存率を調べた。 I L— 2の測定条件は、 実施 例 2と同様である。
I L一 2の残存率は以下の式で算出した。 残存率％= (液を移し替えた後の I L一 2の濃度 [J RU] /液調製直後の I L 一 2の濃度 [ J R U] ) X 1 0 0
(試験結果）
処方 9および比較処方 1の I L一 2の残存率 （％) を表 1 1に示す。 I L一 2 の残存率は、 H S Aを配合した比較処方 1に く らべ、 マル ト一スとアルギニンを 配合した処方 9において、 ほとんど変わらなかった。 したがって、 アミ ノ酸およ び糖を添加することによって、容器壁面への吸着を抑制することが可能であつた。
Figure imgf000034_0001
(実施例 6 ) I L - 2以外のタンパク成分を用いた容器壁面吸着性試験
薬物として、 I L一 2以外のタンパク成分を用いた場合、 容器にどれほど薬物 が吸着するのかを調べるために、 ガラスパイアルに凍結乾燥する前の調製液を加 え、 薬物の残存率を調べた。
(実施例 6製剤の製造方法）
表 1 0に本組成物の配合成分を示す。 糖または糖アルコールと しては、 マル ト ースを、 アミノ酸と しては、 アルギニンを、 酸と してはクェン酸、 緩衝液と して はリ ン酸緩衝液を用いた。 なお、 薬物としては、 I F N— αおよび I F N—ァを 用いた。 なお、 安定化剤の影響をみるために、 あえて界面活性剤は配合しなかつ た。 以下、 I F Ν— αの組成物の製法を示す。
0. 0 1 3 m gの I F Ν—ひを溶解したリ ン酸緩衝液 0. 4 m Lに 1 3 1 . 5 m g/m Lの糖または糖アルコール水溶液 0 · 4 mL、 そして水 0. 2 mLまた は 2 5 mg/m L 113 水溶液 0. 2 m Lまたは適当量の塩酸を加えて p Hを 約 7. 0に調整した 1 0 0 m g/m Lのアルギニン水溶液 0. 2 m Lを添加して、 試験用の溶液を調製した。
(試験方法）
上記で調製した溶液をガラスバイアルに 5回連続で移し替えた後、 水溶液中の 薬物含量を測定した。 最初の薬物の含量に対するバイアルを移し替えた後の薬物 残存率を調べた。
表 1 2
Figure imgf000035_0001
単位はいずれも m g
なお、 I F N— aおよびァの含量測定は、 高速液体ク口マ トグラフィ一 （H P L C) を用い、 以下の条件で測定した。
• カラム ： コスモジル 5 C 1 8— 3 0 0 4. 6 $5 X 1 5 0 m m
• 移動相流量 ： 1 . 0 m L/分
- 検出波長 ： I F N—ひ ： 24 0 nm、 I F N— ? : 2 2 0 n m
' 移動相 ： A) 0. 1 % T F A—水/ァセ トニ ト リル （ 9 5ノ 5 )
B ) 0. 0 7 %T F A-ァセ トニ ト リル
移動相のグラジェン トプログラムは、 表 1 3に示す。 表 13
Figure imgf000035_0002
なお、 I F N—ァ と H S Aを組み合わせた製剤は、 H P L Cで I F N—ァを測 定するこ とはできなかった。
各薬物の残存率は、 以下の式で算出した。
残存率％ = (液を 5回移し替えた後の各夕ンパク成分濃度/液調製直後の各夕ン パク濃度） X 1 0 0
(試験結果）
各タンパク成分の残存率を表 1 4に示す。 I F N— αの残存率は、 H S Aおよび アルギニンを添加した場合においてもほぽ同じであった。 また、 I FN—ァについ て、 アルギニンを添加した場合において、 残存率は 8 0 %以上であった。 したがつ て、 I F N— α、 ァのようなタンパク成分においても、 アルギニンおよび糖の組合 せにおいて、 容器への吸着を抑制することができた。
表 1 4
Figure imgf000036_0001
(実施例 7 ) I L— 2以外のタンパク成分を含有した凍結乾燥品の安定性試験 (試験方法）
表 1 5に示す I F N— ひ、 β、 ァおよび E G Fを含む組成物溶液を凍結乾燥し、 凍結乾燥直後の凍結乾燥品および 4 0 °C 1 4日間保存後における凍結乾燥品の I FN— α、 β、 ァおよび E G Fの含量を測定した。 凍結乾燥品を 1 mLの注射用 水で再溶解し測定検体と した。
なお、 それぞれの薬物含量は、 実施例 6と同様に H P L Cで測定したが、 I F N— αの場合のみ、 測定波長を 2 4 0 nmと した。 また、 実施例 6 と同様、 I F N—ァ と H S Aを組み合わせた製剤は、 H P L Cで I FN—ァを測定するこ とは できなかった。
各タンパク成分の含量％は以下の式で算出した。
含量％ = ( 4 0 °C 1 4日保存後の各タンパク成分濃度/製剤調製直後の各タンパ ク成分濃度） X 1 0 0 表 1 5
Figure imgf000037_0001
単位はいずれも m g
Figure imgf000037_0002
単位はいずれも m g
(試験結果）
各タンパク成分の含量を表 1 5に示す。 I F N— aおよび/?の含量は； H S A より もアルギニンを添加すると増大した。 また、 I F N—ァの含量は、 アルギニ ンを添加した場合、 ほぼ 1 0 0 %であった。 さ らに、 E G Fの含量は、 H S Aお よびアルギニンを添加した場合でもほぼ同じであった。
したがって、 I L— 2以外の夕ンパク成分でも、 糖およびアルギニンの組合せ によって、 安定化できることが明らかとなった。 表 1 6
Figure imgf000038_0001
産業上の利用性
本発明は、 上記のごと く調製して得られた I L— 2、 I F N— a、 β、 ァ、 Ε G F含有溶液、 得られた溶液を凍結乾燥して得た凍結乾燥製剤、 ならびに該凍結 乾燥製剤に注射用蒸留水等の適当な復元剤を添加して所要の濃度と した溶液製剤 等、 種々の形態の I L一 2組成物を提供する。 これらの本発明組成物は、 温血動 物由来の血清アルブミ ンや甲状腺阻害剤であるカルニチンを含有しなくても製造 工程および保存中における I L— 2、 I F N- a, βヽ ァ、 E G Fの実質的な損 失は少ない。 さ らに、 I L一 2、 I F N—ひ、 βヽ ァ、 E G Fの凍結乾燥製剤に おいては、 再溶解時の液状が透明であり、 容器壁への吸着が少ない等の優れた特 徴を有する。 しかも、 本発明組成物は生理的 ρ Η付近に調整され得るので、 注射 時疼痛、 注射部位の炎症等の好ま しくない局所作用も回避し得る。

Claims

請求の範囲
1 . 温血動物由来の血清アルブミ ンおよびカルニチンを配合せず、 かつ少な く と も以下の成分
1 ) イ ン夕一ロイ キン一 2、 イ ンタ一フエロ ン一 ひ、 イ ンターフェロ ン一 、 インタ一フエロン—ァまたは上皮増殖因子のいずれか 1種、
2 ) 糖および/または糖アルコール （ソルビ トールを除く） 、 ならびに、 3 ) アミ ノ酸 （グリシンおよびヒスチジンを除く ）
を含むことを特徴とする、 タンパク組成物 （但し、 ァラニンおよびスクロースを 配合した組成物、 塩酸リ ジンおよびスクロースを配合した組成物を除く ） 。
2 . 更に酸および塩基を含むことを特徴とする、 請求の範囲第 1項に記載の組成 物。
3 . 更に界面活性剤を含むこ とを特徴とする、 請求の範囲第 1項に記載の組成物。
4 . 糖および/または糖アルコールがマルト一ス、 マンニ トール、 ラク ト一スぉ よびスクロースから選ばれる 1 または 2以上である請求の範囲第 1項〜第 3項の いずれかに記載の組成物。
5 . 糖および/または糖アルコールがマルト一スおよび/またはスクロースであ る請求の範囲第 4項に記載の組成物。
6 . アミノ酸がァラニン、 塩酸リ ジンおよびアルギニンから選ばれる 1 または 2 以上である請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載の組成物。
7 . アミノ酸がアルギニンである請求の範囲第 6項に記載の組成物。
8 . 糖および/または糖アルコールがマルト一スおよび/またはスクロースであ り、 アミノ酸がアルギニンである請求の範囲第 1項〜第 3項いずれかに記載の組 成物。
9 . 糖および/または糖アルコールとアミノ酸の組合せがメイ ラ一ド反応を生じ ないものである請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載の組成物。
1 0 . 凍結乾燥品である請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載の組成物。
1 1. 溶液状態でイ ンターロイキン— 2、 イ ンタ一フエロン一 α、 イ ンタ一フエ ロン一 /?、 イ ン夕ーフヱロン一ァまたは上皮増殖因子のいずれかの濃度が 1 ~ 2 2 0 g/mLとなるように調製された請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかに 記載の組成物。
1 2. 溶液状態で p Hが 6. 1〜 9を示すように調製された請求の範囲第 1項〜 第 3項のいずれかに記載の組成物。
1 3. シリコーンコ一ティ ングされた容器に収容された請求の範囲第 1項〜第 3 項のいずれかに記載の組成物。
1 4. 温血動物由来の血清アルブミ ンおよびカルニチンを配合せず、 かつ少な く とも以下の成分
1 ) イ ンターロイ キン一 2、 イ ンタ一フ エロ ン一 ひ、 イ ンタ一フエロ ン一 /?、 インタ一フヱロンーァまたは上皮増殖因子のいずれか 1種、
2 ) 糖および Zまたは糖アルコール （ソルビ トールを除く） 、 ならびに、
3 ) アミ ノ酸 （グリシンおよびヒスチジンを除く ）
を含んだ溶液を凍結乾燥する工程を含むことを特徴とする、 タンパク組成物 （但 し、 ァラニンおよびスクロースを配合した組成物、 塩酸リ ジンおよびスクロース を配合した組成物を除く ） の製造方法。
1 5. 該溶液のイ ンタ一ロイキン一 2、 イ ンターフェロン一ひ、 イ ンタ一フエ口 、ノー β、 イ ンタ一フエロン一ァまたは上皮増殖因子のいずれかの濃度が 1〜 2 2 O z g/mLである請求の範囲第 1 4項に記載の製造方法。
1 6. 該溶液がイ ンタ一ロイキン一 2を含むものであり、 該溶液に塩基を加えて p H 8〜 1 1 と した後、 速やかに酸を加えて中和するか、 または該溶液に酸を加 えて p H 2〜 6 と した後、 速やかに塩基を加えて中和する工程を含むこ とを特徴 とする、 請求の範囲第 1 4項または第 1 5項に記載の製造方法。
1 7. 該溶液が更に界面活性剤を含むことを特徴とする、 請求の範囲第 1 6項に 記載の製造方法。
1 8. 温血動物由来の血清アルブミ ンおよびカルニチンを配合せず、 かつ少なく とも糖および/または糖アルコール （ソルビ トールを除く） 、 ならびにアミ ノ酸 (グリ シンおよびヒスチジンを除く） を配合することを特徴とする、 イ ン夕一口 ィ キン一 2、 イ ンタ一フ エロ ン一 α、 イ ンターフ ェロン一 /5、 イ ンタ一フ エロ ン ーァまたは上皮増殖因子のいずれかを安定化する方法。
1 9 . 更に酸および塩基、 ならびに界面活性剤を配合することを特徴とする、 請 求の範囲第 1 8項に記載の方法。
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