JP4937269B2

JP4937269B2 - 上皮細胞成長因子を含む創傷治療用の徐放性フィルム製剤

Info

Publication number: JP4937269B2
Application number: JP2008539915A
Authority: JP
Inventors: キム，スンヒー; リー，サンキル; リー，ミンスク; ホン，ジュンピョ
Original assignee: ダエウォンカンパニーリミテッド
Priority date: 2005-11-14
Filing date: 2006-10-27
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2026-10-27
Also published as: ES2453567T3; EP1951328A4; WO2007055481A1; CN101316618B; KR100748390B1; EP1951328A1; CN101316618A; KR20070051009A; EP1951328B1; US20090047331A1; JP2009515873A

Description

本発明は、上皮細胞成長因子；キトサン；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ジェランガム及びプルランよりなる群から選択される一つ以上の粘度調節剤；グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドンよりなる群から選択される一つ以上の可塑剤；並びにＥＤＴＡ及びビタミンＣよりなる群から選択される一つ以上の抗酸化剤；を含む創傷治療用の徐放性フィルム製剤に関するものである。

上皮細胞成長因子は、ウロガストロンとして知られる５３個のアミノ酸と３個のジスルフィド結合を有する、分子量６０４５のポリペプチドである。上記因子は、上皮細胞と間葉細胞を含有する各種細胞に対して、有糸分裂の促進、細胞増殖の促進、及び胃酸分泌の抑制のような活性を有し、そのことから、皮膚や角膜の創傷治療、または胃潰瘍治療に効果があることが知られている（非特許文献１：Carpenter, Experimental Cell Research, 164:1-10, 1986）。

しかし、上皮細胞成長因子は、常温、特に、水分の存在下で非常に不安定である。創傷部位で、細胞がＤＮＡを合成するように誘導するためには、８〜１２時間程度の潜伏期間が必要とされる。しかし、上皮細胞成長因子の潜伏期間は、約１時間以内と非常に短く、目的とする効果を得ることが難しい。上皮細胞成長因子はまた、皮膚に適用したとき、創傷部位に存在するタンパク質分解酵素によって、変性、分解、凝集及び沈澱し、生物学的活性を喪失するため、皮膚の外傷に適用することは難しい（非特許文献２：Manning et al., Pharmaceutical Res., :903-917, 1989）。

上記のような上皮細胞成長因子の短所のうち、生物学的不安定性の問題を克服し、十分な治療効果を維持するためには、創傷部位で上皮細胞成長因子の有効濃度が継続して保持されなければならないことが報告されている（非特許文献３：Franklin et al., J. Lab. Clin. Med., 108:103-108, 1986）。それ故に、現在、上皮細胞成長因子を創傷部位に持続的に供給しうる形態の徐放製剤に関する研究開発が行われている。米国特許第４，９４４，９４８号（特許文献１）では、中性リン脂質、負に帯電したリン脂質、及びコレステロールを使用して、上皮細胞成長因子を創傷部位に持続的に供給する上皮細胞成長因子／リポソームゲル製剤が開示されている。特に、上記発明は、上皮細胞成長因子を１２時間以上持続して放出する方法を提示しているが、保管安定性の実現に制限を有するので、産業的に応用することが困難である。従って、上皮細胞成長因子が、薬剤として十分な治療効果を示すためには、長期保管条件で、生物学的活性を維持すると同時に純度及び含量の保持に関連する物理化学的安定性を維持しながら、持続した薬剤放出特性を保持しなければならない。

また、ヨーロッパ特許第２６７０１５号（特許文献２）では、上皮細胞成長因子を親水性セルロースポリマー、特に、本発明で使用するヒドロキシプロピルメチルセルロースと共に用いて製造することを特徴とするフィルムを開示しているが、上皮細胞成長因子の創傷治療効果が十分でないという問題点がある。

米国特許第４９４４９４８号ヨーロッパ特許第２６７０１５号 Carpenter, Experimental Cell Research, 164:1-10, 1986 Manning et al., Pharmaceutical Res., :903-917, 1989 Franklin et al., J. Lab. Clin. Med., 108:103-108, 1986

（技術的項目）
本発明は、上記のような問題点を解決するために案出されたものであり、本発明の目的は、上皮細胞成長因子の創傷治療効果を極大化するために、主基剤として抗菌力を有するキトサン；任意に、上皮細胞成長因子の安定性を保持しながら、主要成分を持続して放出するために、フィルム基剤としてヒドロキシプロピルメチルセルロース、ジェランガム、プルランなど；安定化剤としてＥＤＴＡまたはビタミンＣなどの抗酸化剤；可塑剤としてグリセリン、プロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリエチレングリコールなど；を用いることによって、上皮細胞成長因子の生物学的活性と物理化学的安定性を保持しながら、主要成分を１日間、持続的に放出することができる上皮細胞成長因子を包有する創傷治療用の徐放性フィルム製剤を提供することにある。

本発明に係るフィルムを創傷部位に適用する場合、乾燥したフィルムが滲出物を吸収してヒドロゲルに変わり、生体に容易に接着され得る。また、主基剤である、キトサンが、抗菌作用を有しているので、上皮細胞成長因子の治療効果を極大化することができ、１日１回の使用だけでも有効治療濃度を保持することができる。

（本発明の実施態様）
本発明は、上皮細胞成長因子；キトサン；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ジェランガム及びプルランよりなる群から選択される一つ以上の粘度調節剤；グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドンよりなる群から選択される一つ以上の可塑剤；及びＥＤＴＡ及びビタミンＣよりなる群から選択される一つ以上の抗酸化剤；を含む創傷治療用の徐放性フィルム製剤に関するものである。
また、本発明は、上記徐放性のフィルム製剤に、さらに、フォーム型ドレッシング剤またはハイドロコロイド型ドレッシング剤を含むことを特徴とするフィルム製剤に関するものである。

本発明の徐放性フィルム製剤の有効成分である上皮細胞成長因子は、天然型または組換えタンパク質のどちらかに適用可能である。本発明のフィルム製剤中の上皮細胞成長因子の含量は、薬理学的に有効な濃度である、０．１〜１０，０００μｇ／ｇ、より好ましくは１〜５，０００μｇ／ｇである。上皮細胞成長因子の含量が０．１μｇ／ｇ未満の場合は、フィルム製剤は薬効がない。１０，０００μｇ／ｇを超えると、毒性の恐れがありうる。この時、フィルム製剤のｐＨは、上皮細胞成長因子の安定性が保持される範囲である、５〜７に調整されることが好ましい。

本発明の主基剤である、キトサンは、分子量が１０〜１５０ｋＤａのポリマーであることが好ましい。分子量が１０ｋＤａ未満のキトサンは、ヒドロゲルとしての粘性を保持することができない。分子量が１５０ｋＤａを超えるキトサンを使用した場合には、高分子溶液の粘度が非常に高くなるため、製造が非常に難しくなる。また、キトサンは、好ましくは全重量に対して、１．０〜１０．０ｗ／ｗ％の量で使用され、この範囲を外れた場合には、粘度が非常に低くなるため、製造が難しくなる。

上皮細胞成長因子の安定化のために添加する抗酸化剤は、ＥＤＴＡ及びビタミンＣよりなる群から選択される一つ以上を使用することが好ましい。本発明において、抗酸化剤は、全重量に対して、好ましくは０．０１〜１０ｗ／ｗ％の量で、より好ましくは０．０５〜５ｗ／ｗ％の量を使用する。この範囲を外れた場合、上皮細胞成長因子の安定性を確保することは難しい。また好ましくは、本発明のフィルム製剤は、安定化のために、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム及びクエン酸ナトリウムよりなる群から選択される一つ以上の緩衝剤、またはＬ−ヒスチジン、Ｌ−リジン及びＬ−アルギニンよりなる群から選択される一つ以上のアミノ酸を更に含んでいてもよい。

本発明において、粘度調節剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ジェランガム及びプルランよりなる群から選択される一つ以上を使用することが好ましい。この時、ヒドロキシプロピルメチルセルロースは、粘度によって低粘度及び高粘度のヒドロキシプロピルメチルセルロースに分けられる。低粘度のヒドロキシプロピルメチルセルロースは、フィルム補助基剤の役割を果たし、高粘度のヒドロキシプロピルセルロースは、持続放出を制御する役割を果たす。従って、１０〜１００ｃｐｓの低粘度のヒドロキシプロピルメチルセルロース及び１，０００〜１００，０００ｃｐｓの高粘度のヒドロキシプロピルメチルセルロースを混合して使用することが好ましい。粘度調節剤の使用量は、好ましくは０．０１〜２０．０ｗ／ｗ％であり、より好ましくは、０．０１〜５ｗ／ｗ％である。上記範囲を外れたとき、乾燥前の基剤の粘度に影響を与えて、製造上の問題を引き起こす。

本発明の徐放性フィルム製剤は、さらに、グリセリン、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン及びポリエチレングリコールよりなる群から選択される一つ以上の可塑剤を含む。可塑剤の含量は、好ましくは１〜４０ｗ／ｗ％であり、より好ましくは、１〜２０ｗ／ｗ％である。可塑剤の含量が１ｗ／ｗ％未満の場合は、フィルムにコーティング紙からの浮きが生じるようになり、４０ｗ／ｗ％を超える場合には、乾燥時間及び全重量が大きくなるため、ゲル化が促進されて工程時に問題が発生しうる。

本発明の徐放性フィルム製剤に、水を添加して、全重量を１００ｗ／ｗ％に調節する。
本発明に係るフィルム製剤に、当該技術分野で公知のフォーム型ドレッシング剤またはハイドロコロイド型ドレッシング剤を加えてもよい。また、フィルム形態の保持、外部汚染の防止のために、さらに、フォーム型またはハイドロコロイド型のドレッシング剤に、銀またはアルギネートを包有するドレッシング剤を加えてもよい。

本発明に係る創傷治療用の徐放性フィルム製剤は、下記の方法により製造することができる。
適切な容器内に、キトサン、粘度調節剤及び可塑剤を入れ、精製水と混合して完全に均質になるまで攪拌する。ここに、安定化剤である抗酸化剤と上皮細胞成長因子を加え、均一に混合し、本発明のフィルム製造用組成物を製造する。このとき、組成物の粘度は、好ましくは１，０００〜１５０，０００ｃｐｓであり、より好ましくは４，０００〜１２０，０００ｃｐｓである。上記範囲を外れた場合、成型（casting）が難しいため、製造が難しくなる。

上記のように製造された組成物を、４〜１０℃の冷蔵庫で一日程度放置した後、これをコーティング処理された紙上に成型（cast）し、乾燥させ、創傷治療用の徐放性フィルム製剤を製造する。製造されたフィルムの厚さは、好ましくは、製造及び取り扱いが容易な範囲である０．００１〜１ｍｍであり、より好ましくは０．０１〜０．５ｍｍである。フィルム内の水分含量は、上皮細胞成長因子の安定性とフィルムの製造条件に影響を与える重要な要素であり、好ましくは１〜３０％、より好ましくは１０〜２５％である。

本発明は、以下の実施例によって具体的に説明する。しかし、実施例は、本発明を説明するためのものであり、どのような方法によっても本発明の範囲が制限されるものではない。

本発明に係る徐放性フィルム製剤の製造
上皮細胞成長因子、キトサン、粘度調節剤、可塑剤及び安定化剤を含有する、本発明の徐放性フィルム製剤は、下記の方法によって製造される。
適切な容器内に、キトサン；ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ジェランガム及びプルランよりなる群から選択される一つ以上の粘度調節剤；並びにグリセリン、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）よりなる群から選択される一つ以上の可塑剤を入れ、精製水と混合して、完全に均質になるまで攪拌した。ここに、安定化剤としてＥＤＴＡ及びビタミンＣよりなる群から選択される一つ以上の抗酸化剤と、組換え上皮細胞成長因子である上皮細胞成長因子の凍結乾燥製剤（ＤａｅｗｏｏｎｇＣｏ．）を加え、均一に混合した後、４〜１０℃の冷蔵庫で一日程度放置し、その後、これをコーティング処理された紙上で成型し、送風または凍結乾燥し、本発明に係る創傷治療用の徐放性フィルム製剤を製造した。

本発明に係る徐放性フィルム製剤の構成成分による物理化学的特性の分析
本発明に係る徐放性フィルム製剤の構成成分による物理化学的特性を分析するために、下記の表１に記載された物質を構成成分とし、実施例１と同様にして、上皮細胞成長因子を含有するフィルム（ＤＷＦ１〜ＤＷＦ６）を製造した。但し、成型時、フィルムの厚さは１．０ｍｍとし、乾燥方法は４０℃で、１時間、送風乾燥した。

このように製造されたＤＷＦ１〜ＤＷＦ６中の上皮細胞成長因子の純度を、逆相ＨＰＬＣを利用して分析し、製造されたフィルムの性状、厚さ及び水分含量を確認し、その結果を表２に示した。

上記の表２より明らかなように、製造されたフィルムの性状を確認すれば、単純にキトサンで製造されたフィルムＤＷＦ１に比べて、ＨＰＭＣ、グリセリン、ＰＥＧ、ＰＶＰなどの別の高分子を混合して製造したフィルム（ＤＷＦ２〜ＤＷＦ６）が優れていることがわかる。但し、高分子としてゼラチンを使用した場合（ＤＷＦ４）、フィルム基剤製造時に、温度を上げる工程で、上皮細胞成長因子の分解が生じ、純度が低下する結果が導き出された。特に、粘度調節剤としてヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）を使用した時、上皮細胞成長因子は、性状だけでなく、純度の面で最も優れていた。

フィルムの粘度と厚さによる上皮細胞成長因子の放出特性
フィルムの粘度と主成分の含量による上皮細胞成長因子の放出特性を確認するために、下記の表３に記載された物質を構成成分とし、実施例１及び実施例２と同様の方法で、ＤＷＦ７〜ＤＷＦ１２のフィルムを製造した。成型する厚さを異にしたＤＷＦ１３〜ＤＷＦ１４のフィルムを製造し、その後、各フィルム別に粘度及び厚さを測定し、表３に示した。

上記で製造されたＤＷＦ７〜ＤＷＦ１２フィルムの主成分である、上皮細胞成長因子の各放出量を測定するために、放出試験を実施し、その結果を表４と図１及び２に示した。
放出試験は、フランツ拡散装置（Franz diffusion apparatus）を用いて行った。放出媒体はリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．０２％のツイーン（Tween）２０）で充填し、３２±０．５℃に保持し、膜無しで直接緩衝液と接触するように設置した。製造されたフィルムを供与部のサイズに合うように切断し、１、３、６、９、１５、１８、２４時間の指定された時間に、それぞれ３００μＬを取って、ＨＰＬＣ法でＥＧＦ放出量を定量した。定量した値は、初期値に対比した放出％で示した。

表４と図１より明らかなように、フィルムの粘度が高いほど上皮細胞成長因子の放出が遅延することが確認された。また図２で示されるように、主成分の含量が最も少ないＤＷＦ１２（１．０ｍｇ）の上皮細胞成長因子の放出量が、ＤＷＦ１１（５．０ｍｇ）に比べて、少ないことが確認され、主成分の含量が少ないほど放出が遅延することが分かった。このことから、上皮細胞成長因子の粘度及び含量によってその放出速度が制御され、上皮細胞成長因子は２４時間、直線的な放出を示すことを確認した。

また、ＤＷＦ１３及びＤＷＦ１４からの上皮細胞成長因子の放出量を測定し、下記の表５及び図３に示した。表５より明らかなように、フィルムの厚さの増加につれて、上皮細胞成長因子の放出速度が遅くなることがわかる。このような結果を総合すると、フィルムの粘度と厚さを調節することによって、上皮細胞成長因子の放出速度の制御が可能であることが確認された。

安定化剤の添加によるフィルム内の上皮細胞成長因子の安定性
安定化剤の添加による、本発明の徐放性フィルム製剤内での上皮細胞成長因子の安定性を確認するために、安定化剤を添加しない場合（ＤＷＦ１５）、抗酸化剤のみを添加した場合（ＤＷＦ１７及び１８）、アミノ酸のみを添加した場合（ＤＷＦ１６）、抗酸化剤とアミノ酸を添加した場合（ＤＷＦ１９）及び抗酸化剤と緩衝剤を添加した場合（ＤＷＦ２０）において、時間の経過に伴う上皮細胞成長因子の含量と活性を、上皮細胞成長因子、キトサン、粘度調節剤及び可塑剤を包含するフィルムで測定した。
この実験に使用するために、下記の表６に記載された物質を構成成分とし、実施例１及び実施例２と同様の方法で、ＤＷＦ１５〜ＤＷＦ２０のフィルムを製造した。

上記で製造されたＤＷＦ１５〜ＤＷＦ２０のフィルムをアルミニウム包装紙で気密包装し、常温（２５℃）で３ケ月間、及び冷温（２〜８℃）で１年間保管した。時間経過に伴う各フィルム内の上皮細胞成長因子の含量と活性を確認し、その値を表７と図４に示した。

上記の表７に示されるように、安定化剤を含まないＤＷＦ１５に比べて、他のフィルムでは、不純物の生成率が非常に低いことを確認した。また、アミノ酸を添加したフィルム（ＤＷＦ１６）と抗酸化剤を添加したフィルム（ＤＷＦ１７及びＤＷＦ１８）の安定性が多少優れており、アミノ酸と抗酸化剤を共に含むフィルム（ＤＷＦ１９）、又は抗酸化剤と緩衝剤の両方を含むフィルム（ＤＷＦ２０）の安定性が最も優れていた。

動物薬効試験
本発明に係る徐放性フィルム製剤での上皮細胞成長因子の薬効を確認するために、ヒドロキシプロピルセルロースで製造された上皮細胞成長因子フィルムを対照群とし、実施例１と同様の方法で製造した、実施例４の表６に記載されたＤＷＦ２０フィルムを試験群とし、両者を比較試験した。比較試験の条件を下記の表８に示した。

創傷発生から１日経過後の創傷部位を撮影した写真を図５に、上記対照群及び試験群で創傷部位を処理して４日経過後の創傷部位を撮影した写真を図６に示した。上記図からわかるように、対照群で処理した場合よりも、上皮細胞成長因子、キトサン、粘度調節剤、可塑剤、抗酸化剤及び緩衝剤を含有した本発明のフィルムで処理した時、マウスの創傷が非常に早く治癒したことを確認した。これは、対照群を１日２回処置することと比較して、本発明の創傷治療用徐放性フィルム製剤を１回処置することによって、ＥＧＦが創傷部位に持続的に放出され、患部での有効治療濃度が保持される効果が現れたためと考えられる。また、キトサンを添加することによって、抗菌効果が増進され、創傷治癒に更なる効果が現れたためと考えられる。

本発明は、有効成分である上皮細胞成長因子に加えて、キトサン、粘度調節剤、可塑剤及び安定化剤を含む、徐放性フィルム製剤を提供することによって、創傷治療の効果を極大化することができる。また、本発明の持続性フィルム製剤は、１日に２〜３回、創傷部位に塗布しなければならない軟膏／クリーム製剤又はゲル製剤とは違って、創傷部位に１日に１回、貼付することで、有効治療濃度が保持される。従って、薬剤適用のために患部からドレッシングを除去する必要がないので、創傷部位の露出が少なく、患者及び医療従事者などの便宜性が増大する効果を期待することができる。

また、本発明のフィルムは、滲出物を吸収し、ヒドロゲルに変わりながら、創傷部位の湿潤環境を保持して、創傷治療に好ましい環境を提供する。本発明のフィルムは、生体付着性に優れており、冷所保管の条件で１年以上の安定性を示し、抗菌機能を保有し、単純な軟膏／クリーム製剤又はゲル製剤に比べて、より多くの長所を有する。

本発明に係る上皮細胞成長因子及びキトサンを含有する創傷治療用フィルムの１日のインビトロでの放出率推移を示したグラフである。本発明に係る上皮細胞成長因子及びキトサンを含有する創傷治療用フィルムの１日のインビトロでの放出率推移を示したグラフである。本発明に係る上皮細胞成長因子及びキトサンを含有する創傷治療用フィルムの１日のインビトロでの放出率推移を示したグラフである。本発明に係る上皮細胞成長因子及びキトサンを含有する創傷治療用フィルムの冷所保管条件下での、１年の不純物の生成率推移を示したグラフである。本発明に係る上皮細胞成長因子及びキトサンを含有する創傷治療用フィルムと対照群での処理前の創傷部位を撮影した写真である。本発明に係る上皮細胞成長因子及びキトサンを含有する創傷治療用フィルムと対照群での処理後の創傷部位を撮影した写真である。

Claims

上皮細胞成長因子；主基剤としてキトサン；粘度調節剤としてヒドロキシプロピルメチルセルロース；グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドンよりなる群から選択される一つ以上の可塑剤；並びにＥＤＴＡ及びビタミンＣよりなる群から選択される一つ以上の抗酸化剤；
を含み、
該キトサンの含量が、全重量に対して１〜１０ｗ／ｗ％であり、該ヒドロキシプロピルメチルセルロースが、１０〜１００ｃｐｓの低粘度のヒドロキシプロピルメチルセルロース及び１，０００〜１００，０００ｃｐｓの高粘度のヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む、
創傷治療用の徐放性フィルム製剤。
リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム及びクエン酸ナトリウムよりなる群から選択される一つ以上の緩衝剤を更に含む、請求項１に記載のフィルム製剤。
Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リジン及びＬ−アルギニンよりなる群から選択される一つ以上のアミノ酸を更に含む、請求項１に記載のフィルム製剤。
キトサンの分子量が、１０ｋＤａ〜１５０ｋＤａである、請求項１に記載のフィルム製剤。
上皮細胞成長因子の含量が、全重量に対して０．１〜１０，０００μｇ／ｇである、請求項１に記載のフィルム製剤。
粘度調節剤の含量が、全重量に対して０．０１〜２０ｗ／ｗ％である、請求項１に記載のフィルム製剤。
可塑剤の含量が、全重量に対して１〜４０ｗ／ｗ％である、請求項１に記載のフィルム製剤。
抗酸化剤の含量が、全重量に対して０．０１〜１０ｗ／ｗ％である、請求項１に記載のフィルム製剤。
フィルム製剤の粘度が、１，０００〜１５０，０００ｃｐｓである、請求項１に記載のフィルム製剤。
フィルムの厚さが、０．００１〜１ｍｍである、請求項１に記載のフィルム製剤。
フォーム型ドレッシング剤またはハイドロコロイド型ドレッシング剤を更に含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のフィルム製剤。
フォーム型ドレッシング剤又はハイドロコロイド型ドレッシング剤に、銀又はアルギネートを更に加えることを特徴とする、請求項１１に記載のフィルム製剤。