JPS63152324A - 表皮生長因子含有安定化組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｌ」へ１順 本発明はポリペプチド、特に、たとえば表皮生長因子の
ような、ポリペプチド生長因子、の安定化のための手段
に関するものである。

ヒトの表皮生長因子（ＥＧＦ）は、表皮及び開光組繊細
胞を包含する、多くの種類の細胞に対する有糸分裂促進
活性を有する、５３アｔノ酸ポリペプチド生長因子であ
る。たとえば、５２アミノ酸ガンマーウロがストロンの
ような、ヒトのＥＧＦポリペプチドの変種が報告されて
いる。表皮生長因子は、表皮生長促進活性及び胃酸分泌
抑制活性を示し、それ故、薬物として有用である。表皮
生長因子は、水分の存在において生物学的活性を失なう
ことが認められている。このような活性の低下は、表皮
生長因子の水性の調製剤を長期間にわたって保存するこ
とを不可能ならしめることから、不利である。本発明は
、表皮生長因子を包含するポリペプチド生長因子の水分
の存在における活性の低下を減するための手段を提供す
る。

本発明は、水分の存在における生物学的活性の低下に対
して生長因子含有医薬組成物を安定化するための方法を
提供する。この方法は、該組成物中に水溶性の多糖、た
とえばセルロース誘導体、を混入することから成ってい
る。

セルロース誘導体を含有する製薬及び化学組成物は既に
記載がある。たとえば、エレーデらは米国特許第４，３
７３，５１９号中で、たとえばセルロース材料（これは
カルボキシメチル−セルロースとすることがでｂる）の
ような吸収剤を包含する、傷の手当用品を開示しでいる
が、この場合に傷の手当用品は、たとえば表皮生長因子
のような、種々の薬物を含有していてもよい。

ヘスらは、米国特許第３，９２３，５９９号において、
セルロース誘導体を含有していてもよい植物酵素配合剤
を開示している。ストローブは、米国特許第３，９２７
，２０９号において、分散剤としてメチルセルロースを
含有していてもよいバラ−インフルエンザ−３−ウィル
ス組成物を開示している。ドーシャツクらは、米国特許
＄３．９３３．５８８号において、安定剤として第四ア
ンモニウムを含有するセルロース誘導体（Ｄ　Ｅ　Ａ　
Ｅセルロース）上に固定化した酵素を開示している。

ディールらは、米国特許第４，０１１，１６９号におい
て、安定剤としてアミン化殿粉又はセルロースを含有す
る酵素含有洗剤組成物を開示している。

ストローブは、米国特許第４，１８８，３７５号におい
て、分散剤としてメチルセルロースを含有することがで
きる水性ワクチン製剤を開示している。“安定剤”とし
て“多糖類”が開示されているが、どのような不安定性
問題のために安定剤を添加しているかは、開示していな
い。

アカギらは、ヨーロッパ特許公開第０１５００６７号に
おいて、デキストラン又はヒドロキシエチル殿粉で安定
化したガンマ−インターフェロンを開示している。

ジャコブセンらは、米国特許第４，５４０，５０６号に
おいて、シックナーとしてヒドロキシエチルセルロース
を含有することができる、酵素含有排水浄化配合剤を開
示している。

アラカワ及びチマシエ７は、ビオケミストリー、１９８
２、第２１巻、６５３６〜６５４４真において、水性の
媒体中の蛋白質の安定化のための糖の使用を開示してい
る。デツコー、に、らは、ジャーナルオブビオケミスト
リー（１９８１）９０：３０〜６０中で、たとえば、グ
リセリン、ソルビトール及びマンニトールのような、糖
アルコールが蛋白質のための安定剤であることを開示し
ている。

ヨーロッパ特許公開第１４０，９９８号は、ヒトの表皮
生長因子及び、たとえば、緩衝液又は軟膏基剤のような
希釈剤を含有する眼科用製剤を記している。この製剤は
角膜炎、角膜のただれ、角膜の浸潤又は角膜の潰瘍の治
療のために有効であると記している。

ｉ弧へ」法 本発明は、ヒトの有糸分裂促進活性を有するポリペプチ
ド生長因子及びポリペプチド生長因子を生物学的活性の
低下に対して安定化するために十分な水溶性多糖を含有
する水性の医薬組成物を提供する。好適実施形態におい
ては、生長因子は表皮生長因子である。多糖はセルロー
ス重合体であることが好ましい。活性成分としてポリペ
プチド生長因子を含有する水性の医薬組成物を安定化す
るための方法は、生長因子を水の存在における生物学的
活性の低下に対して安定化するために十分な量の水溶性
多糖を組成物中に混入することから成っている。

本発明は服用の製薬組成物をも提供する。この眼用組成
物は約１．０乃至約１．００（ｌクログラム／ＴＡＡの
濃度の表皮生長因子及び粘度を１〜５０００センチポア
ズ（ｃｐｓ）内に保つための水溶性の、眼科的に適合す
る重合体を包含している。

粘度は１〜１００ｃｐｓの範囲内であることが好ましい
。患者の眼中の傷の回復の速度を増大させるための方法
は、傷を効果的な傷治療量の本発明の眼用組成物と接触
させることから成っている。

明の−　な９明 本発明は、ポリペプチド生長因子、好ましくは、ヒトの
表皮生長因子（ｈＥＧＦ）を含有する安定化組成物を提
供するものである。表皮生長因子（ＥＧＦ）及びｈＥＧ
Ｆは、自然源から単離するか又は組換えＤＮＡ法を用い
て製造される公知の組成物である。以下の文献は表皮生
長因子、ｈＥＧＦ。

及び／又は自然源からそれらを単離するための方法、あ
るいはｒＤ　Ｎ　Ａ法によりそれらを製造するための方
法を記している： キャンプルら、米国特許第３，９１７，８２４号。

ローエンら、米国特許第３，９４８，８７５号。

画材ら、米国特許第４，５２８，１８６号。

ベル、公開ＰＣＴ特許明細書、ＷＯ３５１００３６９゜ ウルデアら、プロシーディング、ナショナルアカデミー
オブサイエンスＵＳＡ８０．７４６１〜７４６５（１９
８３）。

ホーレンバーグ、１表皮生長因子−ウロガストロン、ポ
リペプチド獲得ホルモンの現状”アカデミ−プレス社、
ニューヨーク（１９７９）、９０〜１３２頁。

カーベンター、“表皮生長因子”、実験薬理学ハンドブ
ック中、第５７巻、バセル〃ｌ１ｉｉ、。

ローエンら、′セル”（１９７８）１５：１１５７〜１
１７４゜ サベージら、“ジャーナルオブビオロジカルケミ　ス　
ト　リ　−”（１９７２）２４７：７６１２　〜７６２
１゜ 本明細書中で用いる場合には、“表皮生長因子”とは、
たとえば以下に記すＥＧＦ受容器結合検定法のような、
認知された生物学的検定方法において測定するときに、
天然のヒトの表皮生長因子ボリペプチドが示すものと同
様な生物学的活性を有し且つカーベンターらが“表皮生
長因子、その受容器及び関連蛋白質”、実験的細胞研究
、１６４（１９８６０〜１０．中に記しているように、
いくつかの保護したアミノ酸残基及び通常のノスルフイ
ド結合の一般的な位置付けを有している、ポリペプチド
の部類を包含するものとする。かくして、“表皮生長因
子”は、ベル（前記文献）によって記された岨換えＤＮ
Ａ法によって生じたｈＥＧＦ。

マウスの顎下腺から単離したマウスＥＧＦ（ｍＥＧＦ″
）（たとえば、ローエンら、前記文献参照）、ラツ）　
ＥＧＦ、及び画材ら（前記文献）が記すようにヒトの尿
から単離することがで外る天然のヒトの表皮生長因子、
及び蛋白質加水分解処理によってその場で活性表皮生長
因子に変換させる前駆体を包含する、前記の何れかの生
物活性誘導体及び関連するポリペプチドを包含する。岨
換えＤＮＡ法によって生じたｈＥＧＦを含む、ヒトの表
皮生長因子が、本発明における使用に対して好適である
。

形質転換生長因子−アルフア（ＴＧＦ−α）、５０アミ
ノ酸ポリペプチド、及びワクシニアウィルス生長因子（
Ｖ　Ｇ　Ｆ　）、１４０アミノ酸ポリペプチド、は共に
分裂促進性であり且つ表皮生長因子に対する実質的な配
列相同を有しており、三種はすべて共通のチロシンキナ
ーゼ受容器に結合し且つ活性化するものと思われる。そ
れらのポリペプチドとしての本質、分裂促進活性及びこ
れらの分子間の実質的な配列相同のために、ＴＧＦ−α
及びＶＧＦもまた本発明の組成物中で安定化させること
がでべろものと思われる、その上、分裂促進活性を有す
るその他のポリペプチド生長因子もまた本発明の組成物
中で安定化するものと思われる。

その他のこのようなポリペプチド生長因子は、塩基性線
維芽細胞生長因子（ｂ−ＦＧＦ）、酸性線維芽細胞生長
因子（ａ−ＦＧＦ）、形質転換生長因子−ベータ（ＴＧ
Ｆ−β）、アンギオゲニン、神経生長因子（ＮＧＦ）、
インシュリン類似生長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インシ
ュリン類似生長因子ｎ（ＩＧＦ−Ｉｆ）及び血小板誘導
生長因子（Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　）を包含する。線維芽細胞
生長因子及びアンギオゲニン、並びに形質転換生長因子
及び表皮生長因子は脈管形成活性をも有している。生長
因子は組換えＤＮＡ法によって製造することが好ましい
。本明細書中で用いる場合に、“生長因子”という用語
は、たとえば、エリトロボイエチン及びコロニー刺激因
子のような、いわゆる造血生長因子は包含しなし１゜ 本発明において使用することができる水溶性多糖類は、
セルロース誘導体、殿粉、寒天、アルギン酸、アラビア
ゴム、デキストラン、フルクタン、イヌリン、マンナン
、キシラン、アラビナン、キトサン、グリコーゲン及び
グルカンを包含する。

セルロース誘導体を使用することが好ましい。

本発明において使用するセルロース誘導体は、たとえば
、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース
、及びアルキルヒドロキシアルキルセルロースのような
エーテル化セルロース誘導体、たとえば、メチルセルロ
ース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチル
セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及
びヒドロキシプロピルセルロースである。メチルセルロ
ース及び、たとえばヒドロキシプロピルセルロース、ヒ
ドロキシエチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチ
ルセルロースのような、ヒドロキシアルキルセルロース
誘導体が好適である。

セルロース誘導体の溶解性はエーテル基の置換度（Ｄ、
Ｓ、）によって決定され、本発明において有用な安定化
誘導体は、その誘導体を水溶性ならしめるために十分な
量のがかるエーテル基をセルロース鎖中のアンヒドログ
ルコース単位当りに有していなければならない。アンヒ
ドログルコース単位当りに少なくとも０．３５のエーテ
ル置換度（Ｄ、Ｓ、）が一般に十分である。その上、セ
ルロース誘導体はアルカリ＊属塩、たとえばＬｉ、Ｎａ
。

Ｋ又はＣｓ塩の形態であってもよい。

本発明の安定化組成物及び眼科用処方剤は、ＥＧＦとの
混合物として他の生長因子を含有していてもよい。特に
、ＥＧＦは、以下のものの一つ以上と併用することがで
きる：塩基性線維芽細胞生艮因子、酸性線維芽細胞生長
因子、形質転換生長因子−ベータ、形質転換生長因子−
アルフア、ワクシニア生長因子、アンギオゲニン、神経
生長因子、インシュリン類似生長因子及び血小板誘導生
長因子。また、組成物及び処方剤は、生長因子を生物学
的活性の低下に対して安定化するために一つ以上の水溶
性多糖を含有することができる。

本発明に従って安定化させる組成物は、効果的な量の、
たとえばセルロース誘導体のような、水溶性多糖が溶解
させである、たとえば、ゲル、溶液、懸濁液又は分散液
のような、水性の医薬組成物中に、たとえばＥＧＦのよ
うな、ポリペプチド生長因子を含有する組成物である。

特定の場合に使用すべき多糖の正確な量は、たとえば、
処方剤中における他の物質の存在又は不在、使用する当
該生長因子の特定的な性質、生長因子の濃度、処方剤の
種類などのような要因に依存して変化する。

ＥＧＦ及びセルロース誘導体を含有する水性の処方剤（
初期処方物又は脱水後にもどした処方物のいずれか）に
ついていえば、セルロース誘導体の効果的な量は通常は
、全組成物に基づいて、少なくとも０．０５重量パーセ
ントである。使用する最大量は全く限定的ではないが、
部分的には処方物の種類によってきまる。たとえば、水
性の点眼処方剤ｌこおいては、通常は約０，０５乃至約
３重量パーセントの範囲内の量のセルロース誘導体を用
いる。比較的小量の水が用いられるものと思われるゲル
剤においては、セルロース誘導体は処方物の主成分であ
ってもよく、場合によっては、たとえば、処方物の約９
０重量パーセントの程度の高率を占めることができる。

ゲル処方物中のセルロース誘導体は重量で１〜２０％の
範囲であることが好ましい。重要な因子は安定化効果を
有する少なくとも最低量のセルロース誘導体を使用する
ことである。

本発明の安定化組成物は、点眼処方剤、傷の治療のため
の軟膏、ゲル処方剤、フオーム剤などにおいて、有用で
ある。緩衝剤、防腐剤、張度調節剤、酸化防止剤、他の
重合体（たとえば、粘度を調節するため又は増量剤とし
て用いる）及び賦形剤のような追加の物質を、本発明の
安定化組成物において使用することができる。このよう
な他の物質の特定的な代表例は、りん酸塩、くえん酸塩
又はほう酸塩緩衝剤、チメロサール、ソルビン酸、メチ
ル又はプロピルパラベン、及びクロロブタメール防腐剤
、張度を調節するための塩化ナトリウム及び／又は糖類
、ポリビニルアルコール、ポリ（アクリル酸）又はその
塩、ポリビニルピロリドン、マンニトール、ラクトース
、スクロース、エチレンジアミン四酢酸などを包含する
。

本発明の安定化組成物中の生長因子の濃度は、水性の処
方物（すなわち、最初の水性処方物又は脱水したのちに
もどした処方物のいずれか）の１ミリリツトル当りに約
０．０１〜約１０００ミクログラムの範囲内にある効果
的な傷の治療量である。生長因子濃度は１〜５００ミク
ログラム／ａ＋ｊｌであることが好ましく、１〜１００
ミクログラム／ｌの範囲が一層好ましい。

生長因子製剤を安定化するために本発明の多糖安定剤を
包含することができる製品は、点眼薬、服用デル剤、服
用クリーム、リポソーム又はミセル処方剤、たとえば火
傷のような傷の治療のためのヒドロデル及びクリーム、
含浸したガーゼ手当用品のための水性ビヒクル、人工皮
膚、縫合糸被覆及び、たとえば胃酸分泌の抑制における
使用のような、胃腸の症状のための製品を包含する。

本発明の組成物を含有することができる別の製品は、ヒ
トの母乳処方物である。母乳処方物は乳児に授乳するた
めの母乳の代用物として用いることができる。ヒトの母
乳は高濃度のＥＧＦを含有するということが報告されて
いる（Ｌ、Ｃ，リードら、ペドロジーリサーチ、１８：
１３３〜１３９（１９８４））。組換えヒト　ＥＧＦは
母乳中の天然に生じるＥＧＦと区別することができない
ということも報告されている（Ｌ、Ｃ，リードら、ジャ
ーナルオブエンドクリノロジー、１０９：２４５〜２５
０（１９８６））。母乳中に存在するＥＧＦは乳児の細
胞生長及び分化を促進するものと思われる。

素側用の牛乳補足物又は乳児用母乳代用物は、母乳処方
物への組換え誘導ヒトＥＧＦの混入によっで調製するこ
とが期待されている。処方物は液状であっても乾燥粉末
状であってもよい。液体処方物中のＥＧＦの濃度は０．
０１〜１００ミクログラム／ｍｌ、好ましくは０．１〜
１０ミクログラム／ｌａｌの範囲とすることがでｂる。

処方物は栄養補給量の蛋白質、炭水化物及び脂肪をも含
有することができる。蛋白質はヒトの栄養として必須の
２０のアミノ酸を提供することができなければならない
。蛋白質は牛乳、たとえばカゼイン、から又は大豆から
誘導することができる。

本発明の水性組成物は、傷の治療のための方法において
使用することができる。このような方法は、クリーム処
方剤中への安定化水性組成物の混入又はガーゼ手当用品
の水溶液による含浸及びその後の、たとえば火傷、ドナ
ーサイ）　（ｄｏｎｏｒ　　５ｉｔｅ）傷、潰瘍又はあ
らゆる種類の皮膚の傷のような、傷の部位へのクリーム
剤又は含浸ガーゼの付与を包含する。さらに、縫合糸を
安定化水性組成物で被覆又は含浸して開いた傷を閉じる
ために用いることもできる。

本発明は安定なＥＧＦ含有服用処方物を提供する。ＥＧ
Ｆは約１乃至約１０００ミクログラム／ｌの濃度で服用
処方物中に存在させる。ＥＧＦ濃度は１０〜５００ミク
ログラム／ＬＩＩＮの範囲であることが好ましく、１〜
１００ミクログラム／ｌであることが一層好ましい。加
うるに、処方物は処方物の粘度を１〜１０００ｃｐｓの
範囲内に保つために眼科的に適合する水溶性重合体をも
含有する。処方物の粘度は重合体、重合体濃度、溶剤系
及び剪断速度に依存する。これらの因子の操作を行なっ
て容易に望ましい粘度を達成することができる。粘度は
ブルックフィールド粘度計によって測定することができ
るが、これは液体を“剪断”するために要する力を測定
する。ブルックフィールド法は重合体間相互作用（たと
えば連鎖のからみ合い）を許し且つ通常は重合体間相互
作用が測定すべき粘度に顕者な役割を果す粘稠な重合体
溶液の測定に対して用いられる。このような測定の結果
は一般に、所定の剪断速度（３ｅｃ−’　）におり１て
報告される。速度が粘度値に対して特定してないときは
、一般に速度がゼロに外挿しであるものと認められる。

これは本明細書中で１〜１０００ｃｐＳの値において行
なわれる。本明細書中に記載の粘度値は室温、たとえば
２２〜２５℃におけるものである。

ＥＧＦを含有する単純な水溶液は患者の眼中に入れると
外に鼻涙管を通じて急速に流れ去るから、服用処方物中
ではＥＧＦの高い濃度を用いることが重要である。高濃
度のＥＧＦの使用は眼中の傷の部位におけるＥＧＦの有
効濃度の滞留時間を増大させる。また、処方物の粘度を
増大させるための重合体の使用は、排液速度を低下させ
ることによって眼中のＥＧＦの滞留時間又は接触時間を
増大させる。粘度増大重合体は一種以上の本発明の安定
化多糖でもよいし、あるいは粘度上昇性を有する他の水
溶性の眼科的に適合する重合体であってもよい。セルロ
ース誘導体を１〜５０００ｃｐｓの範囲内の粘度を与え
るために使用する場合には、分子量は８０，０００〜２
４０，０００の範囲でなければならない。

重合体は処方物中で約０．０５％乃至約３．０％（Ｗ／
Ｖ）の濃度で存在させることができる。処方物の粘度を
１〜１０００ｃｐｓの範囲内に保つことができる任意の
水溶性の眼科的に適合する重合体を使用することができ
る。適当な重合体は、たとえばセルロース誘導体のよう
な多糖、たとえばポリビニルアルコール及びポリビニル
ピロリドンのようなビニル重合体、たとえばポリリジン
のようなポリアミ／酸、及びポリエチレングリコールを
包含する。重合体は本発明の安定化多糖の一つであるこ
とが好ましく、その上にポリビニルアルコール又はポリ
ビニルピロリドンを含有することができる。しかしなが
ら、処方物を生物学的活性の低下に対して安定化すべき
場合ｌこは、重合体は本発明の安定化多糖の一つでなけ
ればならない。

服用処方物は、加うるに、約０．０００２％乃至約２．
５％（Ｗ／Ｖ）の濃度で、防腐剤をも含有することがで
きる。適当な防腐剤はチメロサール（０，０００２〜０
．０１％）、ソルビン酸（０゜０５〜２．５％）、クロ
ロブタノール（０，０５〜０．６％）及びＥＤＴＡ（０
，０１〜０．１％）である。

服用処方物は、凍結乾燥のための、一つ以上の増量剤を
も、約０．１〜６．０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含有するこ
とができる。適当な増量剤はマンニトール、スクロース
、ラクトース及びグリシンである。ＥＧＦは結晶化せず
且つ凍結乾燥形態において、それ自体で十分に固まらな
いから、凍結乾燥したＥＧＦの固体の“ケーキ”として
の充填を増進するために増量剤を添加することができる
。

服用処方物は、約５．０乃至約８．０、好ましくは７．
０〜８．０の点眼液のｐＨを保つために緩衝剤を含有す
ることができる。適当な緩衝剤は、りん酸塩緩衝剤、く
えん酸塩緩衝剤、ほう酸塩緩衝剤及び酢酸塩緩衝剤から
選んだものである。

服用処方物に対する任意的な成分は、水溶液を等張性と
するための張度調節剤である。張度調節剤は約１．８％
（Ｗ／Ｖ）までの濃度で存在させることができる。適当
な張度調節剤は、たとえば塩化ナトリウムと塩化カリウ
ムのような、塩化物塩類である。たとえばマンニトール
のような、前記の増量剤は、張度調節剤としても作用す
ることができ、それ故、張度調節剤を処方から省いて、
望ましい張度効果を達成するために増量剤の添加を増大
させてもよい。

患者の眼中の傷の回復速度を増大させるための方法は、
傷を効果的な治療量の本発明の眼科用処方物と接触させ
ることから成っている。適当な対象は、たとえばヒトの
ような霊長目である。服用処方物は、点眼剤の形態で使
用して角膜上皮細胞の回復と成熟の速度を増大させるこ
とができる。

処方物は眼中の中皮細胞の生長促進のためにも使用する
ことができる。点眼剤としての眼科用処方物の局所使用
は上角膜固着術、角膜潰瘍、放射的角膜切開術、角膜移
植及びその他の手術によって生じる眼中の傷の治療のた
めに用いることができる。

後記実施例１において、安定化及び非安定化水性表皮生
長因子処方物の生物学的活性を、サベージら、アナリテ
イカル　ビオケミストリー、１１１．１９５頁以下（１
９８１）の受容器結合分析法によって検定した。別法と
して、適当なＨＰＬＣ法によって安定性をも測定した。

略述すれば、受容器結合検定法は次のようなものである
：受容器結合検定法は、ヒトの細胞上の結合部位に対し
て１２５ニー標識付はマウス表皮生長因子と競争するヒ
トのＥＧＦの能力に基づいている。結合は、他の大部分
の細胞種よりも１０〜５０倍も多くのＥＧＦ受容器を表
面上に有しているホルマリン固定ヒト表皮癌腫Ａ４３１
細胞の融合性単分子層に対して行なわれる［参考文献−
７アプリカントら、プロシージング　ナショナル　アカ
デミ−オプ　サイエンス、ＵＳＡ、第７４巻、５６５頁
（１９７７）、ハイグラ−ら、プロシージングナショナ
ル　アカデミ−オブ　サイエンス、ＵＳＡ、第７５巻、
３３１７頁（１９７８）、及びウルリツヒら、ネーチャ
ー、第３０９巻、４１８頁（１９８４）］、、アマース
ハムから入手した標識付はマウス表皮生長因子（’２５
Ｉ−ＥＧＦ）を用いた。

多数のくぼみを有するマルチざらを用いた。各くぼみは
底に付着させたホルマリン固定ヒト表皮癌腫Ａ４３１細
胞の融合性単分子層を有していた。

最初に、各くばみ中に既知の標準表皮生長因子、検定す
べき試料、又は表皮生長因子を含有しない対照試料の何
れかを含有する８０ミクロリツトルのＰＢＳ希釈剤（０
，１重量パーセントのウシ血清アルブミン及び０６２Ｍ
のグリシンを含有するりん酸塩緩衝食塩水）を加えた。

通常は標準及び試料試薬の系列的希釈物を使用した。次
いで、ＰＢＳ中の既知活性及び濃度の２０ミクロリツト
ルの１２５Ｉ−ＥＧＦを各くぼみに加えた。（試薬の添
加は所定の順序で行なうことが重要である）。くぼみに
ふたをして３７℃において約１　　’／＜〜２−１／２
時間温置した。

装くぼみ中の反応混合物を吸引して液体を捨て、各くぼ
みをＰＢＳで２回洗い且つ洗液を捨てた。

１００ミクロリツトルのＯ，ＩＮ　ＮａＯＨ，１重量パ
ーセントのドデシル硫酸ナトリウムを各くぼみに加えた
。くぼみを３７℃で１０分間温装したのち、試料を個々
にガンマ線計数瓶に移した。試料を含有する瓶をガンマ
線計数器中に置き、ガンマ線量を１分間計数した。ある
いは、取り除くことができるくぼみを有するマルチざら
を使用することもでき、その場合には、洗浄段階後に、
全くぼみを取り出して、計数のためにガンマ線計数器中
に入れた。

新しく調製した既知のＥＧＦ楳準の系列的な希釈物から
の計数値を、対数一対数グラフ上に、１分当りの計数を
Ｙ軸とし、濃度をＸ軸として、ＥＧＦ濃度の関数として
プロットした。１分当りの計数は既知表皮生長因子の濃
度に逆比例する。既知の希釈度における未知試料に対し
て得た曲線を新しく調製した標準に対する曲線と比較す
ることによって、各未知試料中の活性ＥＧＦの濃度（ミ
クログラム／ミクロリットルとして）を決定した。

二回の反復と系列的な希釈によって得た値の平均をとる
ことによって精度を向上させた。

実施例１ え壓１攻１ 下記の出所から医薬品級の重合体を入手した：ポリ（ビ
ニルアルコール）−デルイトール４０／２０−モンサン
ト（“ＰＶＡ″） メチルセルロース−メトセルＡ４Ｍ−ダウ（“ＭＣ″） ヒドロキシプロピルメチルセルロース−メトセルＥ４Ｍ
−ダウ（“ＨＰＭＣ″） ポリ（ビニルピロリドン）−プラストンＣ１５−ＧＡＦ
（”ＰＶＰ”） 服用の処方物において一般に用いられているものと同様
な粘度を与えるように４重合体溶液を調製した。これら
の溶液は細菌の生長を抑制するための０．０１重量％の
チメロサール及び等張とするための０．９重量％のＮａ
Ｃｌをも含有した。溶液を滅菌するために０．２ミクロ
ンのポリスルホンフィルターを用いて濾過した。濾過し
た溶液を無菌のガラス瓶中で保存した。ベル、ＷＯ３５
１００３６９に記すようにして製造した表皮生長因子を
各瓶中に加えて１２ミクログラム／ｍｊ＋の溶液を与え
た。２対照溶液をも用いた。その一つは純蒸留水中に表
皮生長因子を含有し、他方はチメロサールとＮａＣｌの
みを含有する蒸留水中に表皮生長因子を含有していた。

第１表は４重合体溶液の濃度と２５℃における固有粘度
を示す。固有粘度は希薄溶液の粘度を規定するために用
い、通常はウベローデ粘度計中で測定する。固有粘度は
重合体の分子量と溶剤に依存する。

ＰＶＡ　　　　　１．４　　　　　　０．２４ＭＣＯ，
２５６，８６ ＨＰＭＣ００２５６，２０ ＰＶＰ　　　　　１，４　　　　　　０．１６６溶液の
表皮生長因子活性を、調製したばかり、及び調製の６．
２１．４８日後の溶液に対して、前記の受容器結合検定
法によって測定した。溶液は試験の間に瓶中で３７℃に
おいて保存した。

下記第２表は、調製したばかり及びその後６゜２１．４
８日の間隔において、６溶液に対する活性（１ミリリッ
トル当りの活性表皮生長因子のミリグラム数として表わ
す）及び４８日後に残留する当初の活性の百分率を示す
。

いくつかの重合体は、不自然に高い測定ＥＧＦ濃度値を
生じた。それ故、異なる重合体間で濃度値を比較すべき
ではない。濃度値を各重合体それぞれに対して０日と４
８日の間で比較しなければならない。上表の結果から明
らかなように、２種のセルロース誘導体を含有する水性
の表皮生長因子溶液は、４８日の保存後に、それらの生
物学的活性を全く失なわない（実験誤差内で）のに対し
て、その他のものは同じ期間後に、それらの生物学的活
性のほぼ半分を失なった。

実施例２ における　　ＥＧＦ処　斉の この実施例は霊長口の角膜の表皮再生の促進に対するヒ
ト　ＥＧＦの効果を実証する。使用した試験処方剤は組
換え法によって製造したヒトＥＧＦ（チロン社、カリホ
ルニア州、エマ−ビル）を１００ミクログラム／船βの
濃度で含有していた。使用した処方剤は、防腐剤として
クロロブタノール（クロロブタノール８Ａ）を用い、以
下の処方によりｐＨ５，５で調製した： 虞４と　　　　　　　　　　　　−忽工■／バリーＮａ
Ｃｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，４６
クロロブタノール　　　　　　　０．５０（えん酸　　
　　　　　　　　　　０．２６くえん酸Ｎａ−Ｈ２００
，５７ マンニトール　　　　　　　　　１．０ＨＰＭＣＯ，２
５ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００体重５
〜７ｋｇの３匹の成熟しためすのサル、マカカ　７アシ
クラリス（Ｍａｃｎｃａ　　ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ
）、を用いた。霊長口とヒトの角膜の解剖学上の構造は
ほぼ同一であり、霊長口は上皮再生の研究に対して十分
に許容できるモデルである。

各動物をケタミン（５ｍｇ／Ｉｂ）とロンパム（ＩＢ／
１ｂ）で麻酔した。唾液過多を低下させるために硫酸ア
トロビン（０、５ｍｇ／　Ｉｂ）をも用いた。眼中に開
眼器を挿入し、直径８ＩＤＩＩｌのステンレス鋼の真空
トレフイン（ｔｒｅｆ　１ｎｅ）を角膜に取り付けた。

トレフインの中心をｎ−へブタメールで４５秒間満して
表皮を除去した。次いで吸引によってｎ−へブタノール
を除いたのち、角膜を３０ｉのりん酸塩緩衝食塩水で洗
った。表面を綿棒で穏やかにぬぐうことによって表皮を
ｌｌｌ縁までずらした。表皮の除去をフルオレセイン染
色で確認した。動物を１日に４回、すなわち、９時、１
２時、１５時及び１８時に、２滴の溶液で処理した。左
眼は対照として用い、賦形剤のみ（すなわち、ＥＧＦを
除く全成分）を与えたのに対して、右限はＥＧＦを含有
する賦形剤を投与した。霊長口に前記のようにして毎日
麻酔をかけ、その角膜をフルオレセインで染色したのち
、カラースライドフィルムを用いて写真をとった。

シグマ−スキャンプログラムを用いるカラースライドの
拡大した投影の計算機利用面積測定によって表皮再生の
程度を測定して、表皮が再生した各角膜の百分率として
表わした。その結果を、対−丁試験（ｐａｉｒ　−Ｔ　
ｔｅｓｔ）により統計的有意差について解析した。試験
の終りに霊長口を人手により安楽死させて、角膜を通常
のように組織学的に処理した。

拡大したカラースライドの計算機利用面積測定の結果を
第３表に示す。同表から明らかなように、処方剤は障害
の２４時間後に表皮再生の面積の増大を与えた。ワンテ
ィルト対−Ｔ試験（ｏｎｅ　　ｔａｉｌｅｄ　　ｐａｉ
ｒ　−Ｔ　ｔｅｓｔ）を用いる２４時間の結果の統計的
解析は０．１０＞ｐ＞ｏ、ｏ５の小さなｐ−値を示した
。Ｎｏ、１１３１６のＩＮ目は４８−７２時間に表皮再
生面積の僅かな逆転を示したが、それは続く２４時間の
開に刺し傷程度まで回復した。

ＥＧＦ含有処方剤で処理したＮｏ、１１３１４と１０６
６８の霊長目動物からの角膜の組織学的評価は、約５〜
７細胞層の厚さの、厚い連続的な上皮を示した。基底層
を含む細胞は立方形で緻密であった。基底層の上にある
細胞は扁平上皮への漸進的な層形成を示した。

それに対しで、これらの動物からの対照角膜は、広く間
隔を置き且ついくらか平らになった基底及びその上の細
胞の貧弱な層形成を伴なう、約２〜３細胞の厚さの、き
わめて薄い上皮を有していた。

Ｎｏ、１１３１６の動物からの両角膜の外観はＮｏ。

１１３１４と１０６６８の動物の対照角膜と類似してい
た。

かくして、ＥＧＦ含有処方剤による角膜上皮損傷の処理
は、賦形剤と比較しで、上皮再生の初期速度を増大させ
ることは明白である。さらに、再生した上皮の組織学的
外観はＥＧＦで処理した角膜のほうがすぐれていた。す
なわち、ＥＧＦ処方剤は、この霊長目動物モデルにおい
て上皮再生の速度と質の両方を改善した。

謹ｌ　−匡　！　匡　−閃 ３９一 実施例３ 実施例２に記したクロロブタノール８Ａ処方剤に加えて
、他の２処方剤をも調製した。処方剤６は７．０のｐＨ
″ｃｌｌ製し、防腐剤としてチメロサールを含有した。

ＮａＣ１Ｏ，５１％ チメロサール　　　　　　　　　０．００４ＥＤＴＡ　
　　　　　　　　　　　００ＩＮａＨＰＯ４”Ｈ２Ｏ０
，１８ ＮａＨＰＯ，・Ｈ２Ｏ０，５４ マンニトール　　　　　　　　　１．０ヒドロキシプロ
ピル　　　　　　０．２５メチルセルロ一スＥ４Ｍ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　１００処方剤７
はｐＨ＝６．６５で調製し、防腐剤としてソルビン酸を
含有した。

４Ｏ− ＮａＣＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，５０
ソルビン酸　　　　　　　　　　　０．２０ＥＤＴＡ　
　　　　　　　　　　　　Ｏ，１くえん酸　　　　　　
　　　　　　０．２６くえん酸Ｎａ　・２　Ｈ２Ｏ０、
５７ ７ン二トール　　　　　　　　　１．０ＨＰＭＣＯ，２
５ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　１００これらの
３種の異なる処方剤の安定性を２９２日の期間にわたっ
て異なる４温度において測定した。結果を第４表に示す
。

４　Ｃ７，４９１０，２４ ２２Ｃｏ　　　　　８．１４ ３７ＣＩＩ　　　　　６．２８ ４５Ｃ〃４．４５ １１．３　　　　７．７　　　　　９．９　　　　　９
，３９．８　　　　２．６−−−− ７．０　　　　２．３　　　　　−−　　　　　−−３
．６　　　　２．４　　　　　−−　　　　　　−−実
施例４ ヒトの母乳処方物は、組換えによって製造したヒト　Ｅ
ＤＴＡを混入して調製することができる。

このような処方物は液体として又は乾燥粉末形態で調製
することができる。液状の場合には、本発明の水溶性多
糖安定剤の混入によって生物学的活性の低下に対してＥ
ＧＦを安定化することが望ましい。安定剤は母乳処方物
の保存寿命を延長する。

処方物は、牛乳又は母乳代用物中に一般的に混入してい
る何らかの栄養成分を含有している。このような成分は
、栄養量の蛋白質、炭水化物及び脂肪を含有して、必須
アミノ酸やカロリーを乳児に与える。蛋白質はヒトの栄
養に対して必須の２０のアミノ酸の全部を提供すること
が可能でなければならない。蛋白質は牛乳、たとえばカ
ゼインから、又は、動物蛋白質を含有しない処方物が望
ましい場合には、大豆から、誘導することができる。炭
水化物は、ラクトース、又は、ラクトース非含有製品が
望ましい場合には、その他の適当な炭水化物、たとえば
スクロース又はフルクトース、を使用することができる
。

処方物は、栄養量の下記のビタミン類を提供するための
化合物をも含有することができる：単独又は組合わせと
しての、Ａ、Ｄ、に、Ｅ、Ｃ，Ｂ、。

Ｂ　２ｙＢｇｔＢ＋２ｙナイアシン、葉酸、パントテン
酸、ビオチン、コリン及びイノシトール。

加うるに、処方物は、栄養量の、たとえば、カルシウム
、りん、マグネシウム、鉄、よう素、亜鉛、銅、マンガ
ン、ナトリウム、カリウム又は塩化物のような無機物を
、単独で又は組合わせとして、提供する化合物を含有す
ることができる。

本発明を、いくつかの好適実施形態及び実施例に関して
ここに説明した。しかしながら、この分野の専門家には
明白な変形は明白であると思われるから、本発明は特許
請求の範囲による制限以外は、それらに限定すべ外もの
と考えるべきではなし１゜

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトの有糸分裂促進活性を有するポリペプチド生長
   因子及び生物学的活性の低下に対して該生長因子を安定
   化するために十分な量の水溶性多糖を含有することを特
   徴とする水性医薬組成物。 ２、生長因子は表皮生長因子、形質転換生長因子−アル
   フア、形質転換生長因子−ベータ、塩基性線維芽細胞生
   長因子、酸性線維芽細胞生長因子、アンギオゲニン、神
   経繊維生長因子、インシュリン類似生長因子、血小板誘
   導生長因子又はそれらの混合物より成る群から選択され
   る特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ３、生長因子は表皮生長因子である特許請求の範囲第１
   項記載の組成物。 ４、多糖はセルロース誘導体である特許請求の範囲第１
   項記載の組成物。 ５、セルロース誘導体はヒドロキシプロピルセルロース
   、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒ
   ドロキシプロピルセルロース又はそれらの混合物である
   特許請求の範囲第４項記載の組成物。 ６、表皮生長因子はヒトの表皮生長因子である特許請求
   の範囲第３項記載の組成物。 ７、活性成分として有糸分裂促進活性を有するポリペプ
   チド生長因子を含有する水性医薬組成物中に、水の存在
   における生物学的活性の低下に対して該生長因子を安定
   化するために十分な量の水溶性多糖を混入することを特
   徴とする該組成物を安定化するための方法。 ８、生長因子は表皮生長因子、形質転換生長因子−アル
   フア、形質転換生長因子−ベータ、塩基性線維芽細胞生
   長因子、酸性線維芽細胞生長因子、アンギオゲニン、神
   経細胞生長因子、血小板誘導生長因子又はそれらの混合
   物より成る群から選択される特許請求の範囲第７項記載
   の方法。 ９、生長因子は表皮生長因子である特許請求の範囲第７
   項記載の方法。 １０、多糖はセルロース誘導体である特許請求の範囲第
   ７項記載の方法。 １１、該セルロース誘導体はヒドロキシプロピルセルロ
   ース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース
   、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はそれらの混
   合物である特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、該表皮生長因子はヒトの表皮生長因子である特許
   請求の範囲第９項記載の方法。 １３、ａ）約１乃至約１０００ミクログラム／ｍｌの濃
   度における表皮生長因子（ＥＧＦ）；及び ｂ）粘度を１〜５０００ｃｐｓの範囲内に保っための水
   溶性の眼科的に適合する重合体を含有して成ることを特
   徴とする眼用の医薬組成物。 １４、重合体は約０．０５％乃至約３．０％（Ｗ／Ｖ）
   の濃度で存在する特許請求の範囲第１３項記載の組成物
   。 １５、ＥＧＦの濃度は約１０乃至約５００ミクログラム
   ／ｍｌである特許請求の範囲第１３項記載の組成物。 １６、重合体は多糖類、ビニル重合体、ポリアミノ酸、
   ポリエチレングリコール及びヒアルロン酸より成る群か
   ら選択される特許請求の範囲第１３項記載の組成物。 １７、多糖はセルロース誘導体である特許請求の範囲第
   １６項記載の組成物。 １８、ビニル重合体はポリビニルアルコール又はポリビ
   ニルピロリドンである特許請求の範囲第１６項記載の組
   成物。 １９、防腐剤をさらに含有する特許請求の範囲第１３項
   記載の組成物。 ２０、防腐剤の濃度は約０．０００２％乃至約２．５％
   （Ｗ／Ｖ）である特許請求の範囲第１９項記載の組成物
   。 ２１、防腐剤はチメロサル、ソルビン酸、クロロブタノ
   ール及びＥＤＴＡ並びにパラベン類より成る群から選択
   される特許請求の範囲第１９項記載の組成物。 ２２、張度調節剤をさらに含有する特許請求の範囲第１
   ３項記載の組成物。 ２３、張度調節剤濃度は約１．８％（Ｗ／Ｖ）までであ
   る特許請求の範囲第２２項記載の組成物。 ２４、張度調節剤は塩化物塩である特許請求の範囲第２
   ２項記載の組成物。 ２５、ｐＨを約５．０乃至約８．０に保つための緩衝剤
   をさらに含有する特許請求の範囲第１３項記載の組成物
   。 ２６、緩衝剤はりん酸塩緩衝剤、くえん酸塩緩衝剤、ほ
   う酸塩緩衝剤及び酢酸塩緩衝剤より成る群から選択され
   る特許請求の範囲第２５項記載の組成物。 ２７、傷を有効な傷治療量の特許請求の範囲第１３項記
   載の組成物と接触させることを特徴とする患者の眼中の
   傷の回復の速度を増大させるための方法。 ２８、傷は角膜の傷である特許請求の範囲第２７項記載
   の方法。 ２９、特許請求の範囲第１項記載の組成物を包含する製
   薬学的に適合するクリーム剤。 ３０、特許請求の範囲第１項記載の組成物を包含する製
   薬学的に適合するゲル剤。 ３１、特許請求の範囲第１項記載の組成物で被覆又は含
   浸させた縫合糸。 ３２、特許請求の範囲第１項記載の組成物で含浸させた
   吸収性ガーゼ手当用品。 ３３、ａ）吸収性ガーゼ手当用品を特許請求の範囲第１
   項記載の組成物で含浸させ；且つ ｂ）傷を、上記含浸させたガーゼと接触させる、ことを
   特徴とする傷の回復速度を増大させるための方法。 ３４、傷を特許請求の範囲第１項記載の組成物と接触さ
   せることから成る、傷の回復の速度を増大させるための
   方法。 ３５、特許請求の範囲第１項記載の組成物を包含する母
   乳代用物。 ３６、組換えヒトＥＧＦ及びヒトの栄養供給のために必
   須のアミノ酸を提供することができる栄養供給量の蛋白
   質を包含することを特徴とする母乳代用物。 ３７、蛋白質は牛乳から由来する特許請求の範囲第３６
   項記載の母乳代用物。 ３８、蛋白質は大豆から由来する特許請求の範囲第３６
   項記載の母乳代用物。 ３９、栄養供給量の炭水化物をさらに包含する特許請求
   の範囲第３６項記載の母乳代用物。 ４０、特許請求の範囲第３５項記載の凍結乾燥した粉末
   状母乳代用物。 ４１、特許請求の範囲第３６項記載の凍結乾燥した母乳
   代用物。