JP2938074B2 - 表皮生長因子含有安定化組成物 - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明はポリペプチド、特に、たとえば表皮生長因子
のような、ポリペプチド生長因子、の安定化のための手
段に関するものである。 ヒトの表皮生長因子（EGF）は、表皮及び間充組織細
胞を包含する、多くの種類の細胞に対する有糸分裂促進
活性を有する、53アミノ酸ポリペプチド生長因子であ
る。たとえば、52アミノ酸ガンマ−ウロガストロンのよ
うな、ヒトのEGFポリペプチドの変種が報告されてい
る。表皮生長因子は、表皮生長促進活性及び胃酸分泌抑
制活性を示し、それ故、薬物として有用である。表皮生
長因子は、水分の存在において生物学的活性を失なうこ
とが認められている。このような活性の低下は、表皮生
長因子の水性の調製剤を長期間にわたって保存すること
を不可能ならしめることから、不利である。本発明は、
表皮生長因子を包含するポリペプチド生長因子の水分の
存在における活性の低下を減ずるための手段を提供す
る。 本発明は、水分の存在における生物学的活性の低下に
対して生長因子含有医薬組成物を安定化するための方法
を提供する。この方法は、該組成物中に水溶性の多糖、
たとえばセルロース誘導体、を混入することから成って
いる。 セルロース誘導体を含有する製薬及び化学組成物は既
に記載がある。たとえば、エレーデらは米国特許第4,37
3,519号中で、たとえばセルロース材料（これはカルボ
キシメチル−セルロースとすることができる）のような
吸収剤を包含する、傷の手当用品を開示しているが、こ
の場合に傷の手当用品は、たとえば表皮生長因子のよう
な、種々の薬物を含有していてもよい。 ヘスらは、米国特許第3,923,599号において、セルロ
ース誘導体を含有していてもよい植物酵素配合剤を開示
している。ストローブは、米国特許第3,927,209号にお
いて、分散剤としてメチルセルロースを含有していても
よいパラ−インフルエンザ−３−ウイルス組成物を開示
している。ドーシヤツクらは、米国特許第3,933,588号
において、安定剤として第四アンモニウムを含有するセ
ルロース誘導体（DEAEセルロース）上に固定化した酵素
を開示している。デイールらは、米国特許第4,011,169
号において、安定剤としてアミノ化殿粉又はセルロース
を含有する酵素含有洗剤組成物を開示している。 ストローブは、米国特許第4,188,375号において、分
散剤としてメチルセルロースを含有することができる水
性ワクチン製剤を開示している。“安定剤”として“多
糖類”が開示されているが、どのような不安定性問題の
ために安定剤を添加しているかは、開示していない。 アカギらは、ヨーロツパ特許公開第0150067号におい
て、デキストラン又はヒドロキシエチル殿粉で安定化し
たガンマ−インターフエロンを開示している。 ジヤコブセンらは、米国特許第4,540,506号におい
て、シツクナーとしてヒドロキシエチルセルロースを含
有することができる、酵素含有排水浄化配合剤を開示し
ている。 アラカワ及びチマシエフは、ビオケミストリー、198
2、第21巻、6536〜6544頁において、水性の媒体中の蛋
白質の安定化のための糖の使用を開示している。ゲツコ
ー,K.らは、ジヤーナルオブビオケミストリー（1981）9
0:30〜60中で、たとえば、グリセリン、ソルビトール及
びマンニトールのような、糖アルコールが蛋白質のため
の安定剤であることを開示している。 ヨーロツパ特許公開第140,998号は、ヒトの表皮生長
因子及び、たとえば、緩衝液又は軟膏基剤のような希釈
剤を含有する眼科用製剤を記している。この製剤は角膜
炎、角膜のただれ、角膜の浸潤又は角膜の潰瘍の治療の
ために有効であると記している。 発明の要約 本発明は、ヒトの有糸分裂促進活性を有するポリペプ
チド生長因子及びポリペプチド生長因子を生物学的活性
の低下に対して安定化するために十分な水溶性多糖を含
有する水性の医薬組成物を提供する。好適実施形態にお
いては、生長因子は表皮生長因子である。多糖はセルロ
ース重合体であることが好ましい。活性成分としてポリ
ペプチド生長因子を含有する水性の医薬組成物を安定化
するための方法は、生長因子を水の存在における生物学
的活性の低下に対して安定化するために十分な量の水溶
性多糖を組成物中に混入することから成っている。 本発明は眼用の製薬組成物をも提供する。この眼用組
成物は約1.0乃至約1,000ミクログラム/mlの濃度の表皮
生長因子及び粘度を１〜5000センチポアズ（cps）内に
保つための水溶性の、眼科的に適合する重合体を包含し
ている。粘度は１〜100cpsの範囲内であることが好まし
い。患者の眼中の傷の回復の速度を増大させるための方
法は、傷を効果的な傷治療量の本発明の眼用組成物と接
触させることから成っている。 発明の詳細な説明 本発明は、ポリペプチド生長因子、好ましくは、ヒト
の表皮生長因子（hEGF）を含有する安定化組成物を提供
するものである。表皮生長因子（EGF）及びhEGFは、自
然源から単離するか又は組換えDNA法を用いて製造され
る公知の組成物である。以下の文献は表皮生長因子、hE
GF、及び／又は自然源からそれらを単離するための方
法、あるいはrDNA法によりそれらを製造するための方法
を記している： キヤンブルら、米国特許第3,917,824号。 コーエンら、米国特許第3,948,875号。 西村ら、米国特許第4,528,186号。 ベル、公開PCT特許明細書、WO85/00369。 ウルデアら、プロシーデイング、ナシヨナルアカデミ
ーオブサイエンスUSA80、7461〜7465（1983）。 ホーレンバーグ、“表皮生長因子−ウロガストロン、
ポリペプチド獲得ホルモンの現状”アカデミープレス
社、ニユーヨーク（1979）、90〜132頁。 カーペンター、“表皮生長因子”、実験薬理学ハンド
ブツク中、第57巻、バセルガ編。 ローエンら、“セル”（1978）15:1157〜1174。 サベージら、“ジヤーナルオブビオロジカルケミスト
リー”（1972）247:7612〜7621。 本明細書中で用いる場合には、“表皮生長因子”と
は、たとえば以下に記すEGF受容器結合検定法のよう
な、認知された生物学的検定方法において測定するとき
に、天然のヒトの表皮生長因子ポリペプチドが示すもの
と同様な生物学的活性を有し且つカーペンターらが“表
皮生長因子、その受容器及び関連蛋白質”、実験的細胞
研究、164（1986）１〜10,中に記しているように、いく
つかの保護したアミノ酸残基及び通常のジスルフイド結
合の一般的な位置付けを有している、ポリペプチドの部
類を包含するものとする。かくして、“表皮生長因
子、”はベル（前記文献）によって記された組換えDNA
法によって生じたhEGF、マウスの顎下腺から単離したマ
ウスEGF（“mEGF"）（たとえば、コーエンら、前記文献
参照）、ラツトEGF、及び西村ら（前記文献）が記すよ
うにヒトの尿から単離することができる天然のヒトの表
皮生長因子、及び蛋白質加水分解処理によってその場で
活性表皮生長因子に変換させる前駆体を包含する、前記
の何れかの生物活性誘導体及び関連するポリペプチドを
包含する。組換えDNA法によって生じたhEGFを含む、ヒ
トの表皮生長因子が、本発明における使用に対して好適
である。 形質転換生長因子−アルフア（TGF−α）、50アミノ
酸ポリペプチド、及びワクシニアウイルス生長因子（VG
F）、140アミノ酸ポリペプチド、は共に分裂促進性であ
り且つ表皮生長因子に対する実質的な配列相同を有して
おり、三種はすべて共通のチロシンキナーゼ受容器に結
合し且つ活性化するものと思われる。それらのポリペプ
チドとしての本質、分裂促進活性及びこれらの分子間の
実質的な配列相同のために、TGF−α及びVGFもまた本発
明の組成物中で安定化させることができるものと思われ
る、その上、分裂促進活性を有するその他のポリペプチ
ド生長因子もまた本発明の組成物中で安定化するものと
思われる。その他のこのようなポリペプチド生長因子
は、塩基性線維芽細胞生長因子（ｂ−FGF）、酸性線維
芽細胞生長因子（ａ−FGF）、形質転換生長因子−ベー
タ（TGF−β）、アンギオゲニン、神経生長因子（NG
F）、インシユリン類似生長因子−Ｉ（IGF−Ｉ）、イン
シユリン類似生長因子II（IGF−II）及び血小板誘導生
長因子（PDGF）を包含する。線維芽細胞生長因子及びア
ンギオゲニン、並びに形質転換生長因子及び表皮生長因
子は脈管形成活性をも有している。生長因子は組換えDN
A法によって製造することが好ましい。本明細書中で用
いる場合に、“生長因子”という用語は、たとえば、エ
リトロポイエチン及びコロニー刺激因子のような、いわ
ゆる造血生長因子は包含しない。 本発明において使用することができる水溶性多糖類
は、セルロース誘導体、殿粉、寒天、アルギン酸、アラ
ビアゴム、デキストラン、フルクタン、イヌリン、マン
ナン、キシラン、アラビナン、キトサン、グリコーゲン
及びグルカンを包含する。セルロース誘導体を使用する
ことが好ましい。 本発明において使用するセルロース誘導体は、たとえ
ば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロー
ス、及びアルキルヒドロキシアルキルセルロースのよう
なエーテル化セルロース誘導体、たとえば、メチルセル
ロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチ
ルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、
及びヒドロキシプロピルセルロースである。メチルセル
ロース及び、たとえばヒドロキシプロピルセルロース、
ヒドロキシエチルセルロース及びヒドロキシプロピルメ
チルセルロースのような、ヒドロキシアルキルセルロー
ス誘導体が好適である。 セルロース誘導体の溶解性はエーテル基の置換度（D.
S.）によって決定され、本発明において有用な安定化誘
導体は、その誘導体を水溶性ならしめるために十分な量
のかかるエーテル基をセルロース鎖中のアンヒドログル
コース単位当りに有していなければならない。アンヒド
ログルコース単位当りに少なくとも0.35のエーテル置換
度（D.S.）が一般に十分である。その上、セルロース誘
導体はアルカリ金属塩、たとえばLi、Na、Ｋ又はCs塩の
形態であってもよい。 本発明の安定化組成物及び眼科用処方剤は、EGFとの
混合物として他の生長因子を含有していても良い。特
に、EGFは、以下のものの一つ以上と併用することがで
きる：塩基性線維芽細胞生長因子、酸性線維芽細胞生長
因子、形質転換生長因子−ベータ、形質転換生長因子−
アルフア、ワクシニア生長因子、アンギオゲニン、神経
生長因子、インシユリン類似生長因子及び血小板誘導生
長因子。また、組成物及び処方剤は、生長因子を生物学
的活性の低下に対して安定化するために一つ以上の水溶
性多糖を含有することができる。 本発明に従って安定化させる組成物は、効果的な量
の、たとえばセルロース誘導体のような、水溶性多糖が
溶解させてある、たとえば、ゲル、溶液、懸濁液又は分
散液のような、水性の医薬組成物中に、たとえばEGFの
ような、ポリペプチド生長因子を含有する組成物であ
る。特定の場合に試用すべき多糖の正確な量は、たとえ
ば、処方剤中における他の物質の存在又は不在、使用す
る当該生長因子の特定的な性質、生長因子の濃度、処方
剤の種類などのような要因に依存して変化する。 EGF及びセルロース誘導体を含有する水性の処方剤
（初期処方物又は脱水後にもどした処方物のいずれか）
についていえば、セルロース誘導体の効果的な量は通常
は、全組成物に基づいて、少なくとも0.05重量パーセン
トである。使用する最大量は全く限定的ではないが、部
分的には処方物の種類によってきまる。たとえば、水性
の点眼処方剤においては、通常は約0.05乃至約３重量パ
ーセントの範囲内の量のセルロース誘導体を用いる。比
較的少量の水が用いられるものと思われるゲル剤におい
ては、セルロース誘導体は処方物の主成分であってもよ
く、場合によっては、たとえば、処方物の約90重量パー
セントの程度の高率を占めることができる。ゲル処方物
中のセルロース誘導体は重量で１〜20％の範囲であるこ
とが好ましい。重要な因子は安定化効果を有する少なく
とも最低量のセルロース誘導体を使用することである。 本発明の安定化組成物は、点眼処方剤、傷の治療のた
めの軟膏、ゲル処方剤、フオーム剤などにおいて、有用
である。緩衝剤、防腐剤、張度調節剤、酸化防止剤、他
の重合体（たとえば、粘度を調節するため又は増量剤と
して用いる）及び賦形剤のような追加の物質を、本発明
の安定化組成物において使用することができる。このよ
うな他の物質の特定的な代表例は、りん酸塩、くえん酸
塩又はほう酸塩緩衝剤、チメロサール、ソルビン酸、メ
チル又はプロピルパラペン、及びクロロブタノール防腐
剤、張度を調節するための塩化ナトリウム及び／又は糖
類、ポリビニルアルコール、ポリ（アクリル酸）又はそ
の塩、ポリビニルピロリドン、マンニトール、ラクトー
ス、スクロース、エチレンジアミン四酢酸などを包含す
る。 本発明の安定化組成物中の生長因子の濃度は、水性の
処方物（すなわち、最初の水性処方物又は脱水したのち
にもどした処方物のいずれか）の１ミリリツトル当りに
約0.01〜約1000ミクログラムの範囲内にある効果的な傷
の治療量である。生長因子濃度は１〜500ミクログラム/
mlであることが好ましく、１〜100ミクログラム/mlの範
囲が一層好ましい。 生長因子製剤を安定化するために本発明の多糖安定剤
を包含することができる製品は、点眼薬、眼用ゲル剤、
眼用クリーム、リポソーム又はミセル処方剤、たとえば
火傷のような傷の治療のためのヒドロゲル及びクリー
ム、含浸したガーゼ手当用品のための水性ビヒクル、人
工皮膚、縫合糸被覆及び、たとえば胃酸分泌の抑制にお
ける使用のような、胃腸の症状のための製品を包含す
る。 本発明の組成物を含有することができる別の製品は、
ヒトの母乳処方物である。母乳処方物は乳児に授乳する
ための母乳の代用物として用いることができる。ヒトの
母乳は高濃度のEGFを含有するということが報告されて
いる（L.C.リードら、ペドロジーリサーチ、18:133〜13
9（1984））。組換えヒトEGFは母乳中の天然に生じるEG
Fと区別することができないということも報告されてい
る（L.C.リードら、ジヤーナルオブエンドクリノロジ
ー、109:245〜250（1986））。母乳中に存在するEGFは
乳児の細胞生長及び分化を促進するものと思われる。食
飼用の牛乳補足物又は乳児用母乳代用物は、母乳処方物
への組換え誘導ヒトEGFの混入によって調製することが
期待されている。処方物は液状であっても乾燥粉末状で
あってもよい。液体処方物中のEGFの濃度は0.01〜100ミ
クログラム/ml、好ましくは0.1〜10ミクログラム/mlの
範囲とすることができる。処方物は栄養補給量の蛋白
質、炭水化物及び脂肪をも含有することができる。蛋白
質はヒトの栄養として必須の20のアミノ酸を提供するこ
とができなければならない。蛋白質は牛乳、たとえばカ
ゼイン、から又は大豆から誘導することができる。 本発明の水性組成物は、傷の治療のための方法におい
て使用することができる。このような方法は、クリーム
処方剤中への安定化水性組成物の混入又はガーゼ手当用
品の水溶液による含浸及びその後の、たとえば火傷、ド
ナーサイト（donor site）傷、潰瘍又はあらゆる種類の
皮膚の傷のような、傷の部位へのクリーム剤又は含浸ガ
ーゼの付与を包含する。さらに、縫合糸を安定化水性組
成物で被覆又は含浸して開いた傷を閉じるために用いる
こともできる。 本発明は安定なEGF含有眼用処方物を提供する。EGFは
約１乃至約1000ミクログラム/mlの濃度で眼用処方物中
に存在させる。EGF濃度は10〜500ミクロングラム/mlの
範囲であることが好ましく、１〜100ミクログラム/mlで
あることが一層好ましい。加うるに、処方物は処方物の
粘度を１〜1000cpsの範囲内に保つために眼科的に適合
する水溶性重合体をも含有する。処方物の粘度は重合
体、重合体濃度、溶剤系及び剪断速度に依存する。これ
らの因子の操作を行なって容易に望ましい粘度を達成す
ることができる。粘度はブルツクフイールド粘度計によ
って測定することができるが、これは液体を“剪断”す
るために要する力を測定する。ブルツクフイールド法は
重合体間相互作用（たとえば連鎖のからみ合い）を許し
且つ通常は重合体間相互作用が測定すべき粘度に顕著な
役割を果す粘稠な重合体溶液の測定に対して用いられ
る。このような測定の結果は一般に、所定の剪断速度
（sec^-1）において報告される。速度が粘度値に対して
特定してないときは、一般に速度がゼロに外挿してある
ものと認められる。これは本明細書中で１〜1000cpsの
値において行なわれる。本明細書中に記載の粘度値は室
温、たとえば22〜25℃におけるものである。 EGFを含有する単純な水溶液は患者の眼中に入れると
きに鼻涙管を通じて急速に流れ去るから、眼用処方物中
ではEGFの高い濃度を用いることが重要である。高濃度
のEGFの使用は眼中の傷の部位におけるEGFの有効濃度の
滞留時間を増大させる。また、処方物の粘度を増大させ
るための重合体の使用は、排液速度を低下させることに
よって眼中のEGFの滞留時間又は接触時間を増大させ
る。粘度増大重合体は一種以上の本発明の安定化多糖で
もよいし、あるいは粘度上昇性を有する他の水溶性の眼
科的に適合する重合体であってもよい。セルロース誘導
体を１〜5000cpsの範囲内の粘度を与えるために使用す
る場合には、分子量は80,000〜240,000の範囲でなけれ
ばならない。 重合体は処方物中で約0.05％乃至3.0％（W/V）の濃度
で存在させることができる。処方物の粘度を１〜1000cp
sの範囲内に保つことができる任意の水溶性の眼科的に
適合する重合体を使用することができる。適当な重合体
は、たとえばセルロース誘導体のような多糖、たとえば
ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドンのよう
なビニル重合体、たとえばポリリジンのようなポリアミ
ノ酸、及びポリエチレングリコールを包含する。重合体
は本発明の安定化多糖の一つであることが好ましく、そ
の上にポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドン
を含有することができる。しかしながら、処方物を生物
学的活性の低下に対して安定化すべき場合には、重合体
は本発明の安定化多糖の一つでなければならない。 眼用処方物は、加うるに、約0.0002％乃至約2.5％（W
/V）の濃度で、防腐剤をも含有することができる。適当
な防腐剤はメチロサール（0.0002〜0.01％）、ソルビン
酸（0.05〜2.5％）、クロロブタノール（0.05〜0.6％）
及びEDTA（0.01〜0.1％）である。 眼用処方物は、凍結乾燥のための一つ以上の増量剤を
も、約0.1〜6.0％（W/V）の濃度で含有することができ
る。適当な増量剤はマンニトール、スクロース、ラクト
ース及びグリシンである。EGFは結晶化せず且つ凍結乾
燥形態において、それ自体で十分に高まらないから、凍
結乾燥したEGFの固体の“ケーキ”としての充填を増進
するために増進を添加することができる。 眼用処方物は、約5.0乃至約8.0、好ましくは7.0〜8.0
の点眼液のpHを保つために緩衝剤を含有することができ
る。適当な緩衝剤は、りん酸塩緩衝剤、くえん酸塩緩衝
剤、ほう酸塩緩衝剤及び酢酸塩緩衝剤から選んだもので
ある。 眼用処方物に対する任意的な成分は、水溶液を等張性
とするための張度調節剤である。張度調節剤は約1.8％
（W/V）までの濃度で存在させることができる。適当な
張度調節剤は、たとえば塩化ナトリウムと塩化カリウム
のような、塩化物塩類である。たとえばマンニトールの
ような、前記の増量剤は、張度調節剤としても作用する
ことができ、それ故、張度調節剤を処方から省いて、望
ましい張度効果を達成するために増量剤の添加を増大さ
せてもよい。 患者の眼中の傷の回復速度を増大させるための方法
は、傷を効果的な治療量の本発明の眼科用処方物と接触
させることから成っている。適当な対象は、たとえばヒ
トのような霊長目である。眼用処方物は、点眼剤の形態
で使用して角膜上皮細胞の回復と成熟の速度を増大させ
ることができる。処方物は眼中の中皮細胞の生長促進の
ためにも使用することができる。点眼剤としての眼科用
処方物の局所使用は上角膜固着術、角膜潰瘍、放射的角
膜切開術、角膜移植及びその他の手術によって生じる眼
中の傷の治療のために用いることができる。 後記実施例１において、安定化及び非安定化水性表皮
生長因子処方物の生物学的活性を、サベージら、アナリ
テイカル ビオケミストリー、111,195頁以下（1981）
の受容器結合分析法によって検定した。別法として、適
当なHPLC法によって安定性をも測定した。略述すれば、
受容器結合検定法は次のようなものである： 受容器結合検定法は、ヒトの細胞上の結合部位に対し
て¹²⁵I−標識付けマウス表皮生長因子と競争するヒトの
EGFの能力に基づいている。結合は、他の大部分の細胞
種よりも10〜50倍も多くのEGF受容器を表面上に有して
いるホルマリン固定ヒト表皮癌腫A431細胞の融合性単分
子層に対して行なわれる［参考文献−フアブリカント
ら、プロシージング、ナシヨナル アカデミー オブ
サイエンス、USA、第74巻、565頁（1977）、ハイグラー
ら、プロシージングナシヨナル アカデミー オブ サ
イエンス、USA、第75巻、3317頁（1978）、及びウルリ
ツヒら、ネーチヤー、第309巻、418頁（1984）］。アマ
ースハムから入手した標識付けマウス表皮生長因子（
¹²⁵I−EGF）を用いた。 多数のくぼみを有するマルチざらを用いた。各くぼみ
は底に付着させたホルマリン固定ヒト表皮癌腫A431細胞
の融合性単分子層を有していた。最初に、各くぼみ中に
既知の標準表皮生長因子、検定すべき試料、又は表皮生
長因子を含有しない対照試料の何れかを含有する80ミク
ロリツトルのPBS希釈剤（0.1重量パーセントのウシ血清
アルブミン及び0.2Mのグリシンを含有するりん酸塩緩衝
食塩水）を加えた。通常は標準及び試料試薬の系列的希
釈物を使用した。次いで、PBS中の既知活性及び濃度の2
0ミクロリツトルの¹²⁵I−EGFを各くぼみに加えた。（試
薬の添加は所定の順序で行なうことが重要である）。く
ぼみにふたをして37℃において約１−1/4〜２−1/2時間
温置した。 各くぼみ中の反応混合物を吸引して液体を捨て、各く
ぼみをPBSで２回洗い且つ洗液を捨てた。100ミクロリツ
トルの0.1N NaOH、１重量パーセントのドデシル硫酸ナ
トリウムを各くぼみに加えた。くぼみを37℃で10分間温
置したのち、試料を個々にガンマ線計数瓶に移した。試
料を含有する瓶をガンマ線計数器中に置き、ガンマ線量
を１分間計数した。あるいは、取り除くことができるく
ぼみを有するマルチざらを使用することもでき、その場
合には、洗浄段階後に、全くぼみを取り出して、係数の
ためにガンマ線計数器中に入れた。 新しく調製した既知のEGF標準の系列的な希釈物から
の計数値を、対数−対数グラフ上に、１分当りの計数を
Ｙ軸とし、濃度をＸ軸として、EGF濃度の関数としてプ
ロツトした。１分当りの計数は既知表皮生長因子の濃度
に逆比例する。既知の希釈度における未知試料に対して
得た曲線を新しく調製した標準に対する曲線と比較する
ことによって、各未知試料中の活性EGFの濃度（ミクロ
グラフ／ミクロリツトルとして）を決定した。二回の反
復と系列的な希釈によって得た値の平均をとることによ
って精度を向上させた。 実施例１ 安定性試験 下記の出所から医薬品級の重合体を入手した： ポリ（ビニルアルコール）−ゲルバトール（Gelvato
l:商標）40/20−モンサンド（“PVA"） メチルセルロース−メトセル（Methocel:商標）A4M−
ダウ（“MC"） ヒドロキシプロピルメチルセルロース−メトセル（Me
thocel:商標）E4M−ダウ（“HPMC"） ポリ（ビニルピロリドン）−プラスドン（Plasdone:
商標）C15−GAF（“PVP"） 眼用の処方物において一般に用いられているものと同
様な粘度を与えるように４重合体溶液を調製した。これ
らの溶液は細菌の生長を抑制するための0.01重量％のチ
メロサール及び等張とするための0.9重量％のNaClをも
含有した。溶液を滅菌するために0.2ミクロンのポリス
ルホンフイルターを用いて過した溶液を無菌のガラス
瓶中で保存した。ベル、WO85/00369に記すようにして製
造した表皮生長因子を各瓶中に加えて12ミクログラム/m
lの溶液を与えた。２対照溶液をも用いた。その一つは
純蒸留水中に表皮生長因子を含有し、他方はチメロサー
ルとNaClのみを含有する蒸留水中に表皮生長因子を含有
していた。第１表は４重合体溶液の濃度と25℃における
固有粘度を示す。固有粘度は希薄溶液の粘度を規定する
ために用い、通常はウベローデ粘度計中で測定する。固
有粘度は重合体の分子量と溶剤に依存する。 ６溶液の表皮生長因子活性を、調製したばかり、及び
調製の6,21,48日後の溶液に対して、前記の受容器結合
検定法によって測定した。溶液は試験の間に瓶中で37℃
において保存した。 下記第２表は、調製したばかり及びその後6,21,48日
の間隔において、６溶液に対する活性（１ミリリツトル
当りの活性表皮生長因子のミリグラム数として表わす）
及び48日後に残留する当初の活性の百分率を示す。 いくつかの重合体は、不自然に高い測定EGF濃度値を
生じた。それ故、異なる重合体間で濃度値を比較すべき
ではない。濃度値を各重合体それぞれに対して０日と48
日の間で比較しなければならない。上表の結果から明ら
かなように、２種のセルロース誘導体を含有する水性の
表皮生長因子溶液は、48日の保存後に、それらの生物学
的活性を全く失しなわない（実験誤差内で）のに対し
て、その他のものは同じ期間後に、それらの生物学的活
性のほぼ半分を失なった。 実施例２ 霊長目における服用EGF処方剤の評価 この実施例は霊長目の角膜の表皮再生の促進に対する
ヒトEGFの効果を実証する。使用した試験処方剤は組換
え法によって製造したヒトEGF（チロン社、カリホルニ
ア州、エマービル）を100ミクログラム/mlの濃度で含有
していた。使用した処方剤は、防腐剤としてクロロブタ
ノール（クロロブタノール8A）を用い、以下の処方によ
りpH5.5で調製した： 体重５〜7kgの３匹の成熟しためすのサル、マカカ
フアシクラリス（Macaca fascicularis）、を用いた。
霊長目とヒトの解剖学上の構造はほぼ同一であり、霊長
目は上皮再生の研究に対して十分に許容できるモデルで
ある。 各動物をケタミン（5mg/Ib）とロンパム（1mg/Ib）で
麻酔した。唾液過多を低下させるために硫酸アトロピン
（0.5mg/Ib）をも用いた。眼中に開眼器を挿入し、直径
8mmのステンレス鋼の真空トレフイン（trefine）を角膜
に取り付けた。トレフインの中心をｎ−ヘプタノールで
45秒間満して表皮を除去した。次いで吸引によってｎ−
ヘプタノールを除いたのち、角膜を30mlのりん酸塩緩衝
食塩水で洗った。表面を綿棒で穏やかにぬぐうことによ
って表皮を眼縁までずらした。表皮の除去をフルオレセ
イン染色で確認した。動物を１日に４回、すなわち、９
時、12時、15時及び18時に、２滴の溶液で処理した。左
眼は対照として用い、賦形剤のみ（すなわち、EGFを除
く全成分）を与えたのに対して、右眼はEGFを含有する
賦形剤を投与した。霊長目に前記のようにして毎日麻酔
をかけ、その角膜をフルオレセインで染色したのち、カ
ラースライドフイルムを用いて写真をとった。 シグマ−スキヤンプログラムを用いるカラースライド
の拡大した投影の計算機利用面積測定によって表皮再生
の程度を測定して、表皮が再生した各角膜の百分率とし
て表わした。その結果を、対−Ｔ試験（pair−Ttest）
により統計的有意差について解析した。試験の終りに霊
長目を人手により安楽死させて、角膜を通常のように組
織学的に処理した。 拡大したカラースライドの計算機利用面積測定の結果
を第３表に示す。同表から明らかなように、処方剤は障
害の24時間後に表皮再生の面積の増大を与えた。ワンテ
イルド対−Ｔ試験（one−tailed pair−Ttest）を用い
る24時間の結果の統計的解析は0.10＞ｐ＞0.05の小さな
ｐ−値を示した。No.11316の霊長目は48〜72時間に表皮
再生面積の僅かな逆転を示したが、それは続く24時間の
間に刺し傷程度まで回復した。 EGF含有処方剤で処理したNo.11314と10668の霊長目動
物からの角膜の組織学的評価は、約５〜７細胞層の厚さ
の、厚い連続的な上皮を示した。基底層を含む細胞は立
方形で緻密であった。基底層の上にある細胞は扁平上皮
への漸進的な層形成を示した。 それに対して、これらの動物からの対照角膜は、広く
間隔を置き且ついくらか平らになった基底及びその上の
細胞の貧弱な層形成を伴なう、約２〜３細胞の厚さの、
きわめて薄い上皮を有していた。No.11316の動物からの
両角膜の外観はNo.11314と10668の動物の対照角膜と類
似していた。 かくして、EGF含有処方剤による角膜上皮損傷の処理
は、賦形剤と比較して、上皮再生の初期速度を増大させ
ることは明白である。さらに、再生した上皮の組織学的
外観はEGFで処理した角膜のほうがすぐれていた。すな
わち、EGF処方剤は、この霊長目動物モデルにおいて上
皮再生の速度と質の両方を改善した。実施例３ 実施例２に記したクロロブタノール8A処方剤に加え
て、他の２処方剤をも調製した。処方剤６は7.0のpHで
調製し、防腐剤としてチメロサールを含有した。 処方剤７はpH＝6.65で調製し、防腐剤としてソルビン
酸を含有した。 これらの３種の異なる処方剤の安定性を292日の期間
にわたって異なる４温度において測定した結果を第４表
に示す。実施例４ ヒトの母乳処方物は、組換えによって製造したヒトED
TAを混入して調製することができる。このような処方物
は液体として又は乾燥粉末形態で調製することができ
る。液状の場合には、本発明の水溶性多糖安定剤の混入
によって生物学的活性の低下に対してEGFを安定化する
ことが望ましい。安定剤は母乳処方物の保存寿命を延長
する。 処方物は、牛乳又は母乳代用物中に一般的に混入して
いる何らかの栄養成分を含有している。このような成分
は、栄養量の蛋白質、炭水化物及び脂肪を含有して、必
須アミノ酸やカロリーを乳児に与える。蛋白質はヒトの
栄養に対して必須の20のアミノ酸の全部を提供すること
が可能でなければならない。蛋白質は牛乳、たとえばカ
ゼインから、又は、動物蛋白質を含有しない処方物が望
ましい場合には、大豆から、誘導することができる。炭
水化物は、ラクトース、又は、ラクトース非含有製品が
望ましい場合には、その他の適当な炭水化物、たとえば
スクロース又はフルクトース、を使用することができ
る。 処方物は、栄養量の下記のビタミン類を提供するため
の化合物をも含有することができる：単独又は組合わせ
としての、A,D,K,E,C,B₁，B₂，B₆，B₁₂ナイアシン、葉
酸、パントテン酸、ビオチン、コリン及びイノシトー
ル。 加うるに、処方物は、栄養量の、たとえば、カルシウ
ム、りん、マグネシウム、鉄、よう素、亜鉛、銅、マン
ガン、ナトリウム、カリウム又は塩化物のような無機物
を、単独で又は組合わせとして、提供する化合物を含有
することができる。 本発明を、いくつかの好適実施形態及び実施例に関し
てここに説明した。しかしながら、この分野の専門家に
は明白な変形は明白であると思われるから、本発明は特
許請求の範囲による制限以外は、それらに限定すべきも
のと考えるべきではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−65020（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−258125（ＪＰ，Ａ) 特表 昭58−501772（ＪＰ，Ａ) 特表 昭59−501905（ＪＰ，Ａ) 宮崎順一、高野正彦著「点眼剤」（昭 37−10−20）南山堂、Ｐ．45 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 38/18 A61K 9/06 A61K 47/38 ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．ヒトの有糸分裂促進活性を有するポリペプチド生長
   因子及び生物学的活性の低下に対して該生長因子を安定
   化するために十分な量の水溶性セルロース誘導体を含有
   し、生長因子が表皮生長因子、形質転換生長因子−アル
   ファ、形質転換生長因子−ベータ、塩基性線維芽細胞生
   長因子、酸性線維芽細胞生長因子、アンギオゲニン、神
   経繊維生長因子、インシユリン類似生長因子、血小板誘
   導生長因子又はそれらの混合物より成る群から選択され
   ることを特徴とする水性医薬組成物。 ２．生長因子が表皮生長因子である特許請求の範囲第１
   項記載の組成物。 ３．セルロース誘導体がヒドロキシプロピルセルロー
   ス、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、
   ヒドロキシプロピルセルロース又はそれらの混合物であ
   る特許請求の範囲第１または２項記載の組成物。 ４．表皮生長因子がヒトの表皮生長因子である特許請求
   の範囲第２項記載の組成物。 ５．製薬学的に適合するクリーム剤である特許請求の範
   囲第１項記載の組成物。 ６．製薬学的に適合するゲル剤である特許請求の範囲第
   １項記載の組成物。