KR930004598B1 - 단백질 수용액 - Google Patents

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내용 없음.

Description

단백질 수용액

본 발명은 단백질 수용액, 단백질 농도 증대법 및 단백질 제제, 및 생리활성 단백질을 사용하는 임상용 약제에 적용 가능한 기술에 관한 것이다.

균일 성분의 단백질 사용시는 단백질을 용매 중에 용해시키는 것이 매우 중요하다. 예를들면, 일정량의 단백질을 함유한 조성물로부터 분취하거나 단백질에 대해 분석할 경우, 단잭질을 함유하는 조성물은 반드시 균일해야 한다. 또한, 단백질을 물에 용해시켜 주사제등의 약제로 투연할 경우, 단백질은 완전히 용해되어야 한다.

일반적으로, 수성 용매중의 단백질의 용해도는 단백질 표면에 존재하는 친수성 또는 수소성 잔기, 및 전하의 영향을 강력히 받는다. 단백질 표면의 소수성 잔기의 존재로 인해 단백질이 약간만 용해될 경우는 계면 활성제를 첨가하여 용해도를 증가시킬 수 있다.

한편, 수성 용매의 pH가 단백질의 등전점 부근인 단백질이 등전점 침전을 일으키기 쉬운 상태에 있는 경우는 수성 용매중의 염 농도를 증가시켜 이온강도를 증가시킴으로써 단백질의 용해도를 증가시킬 수 있다. 이 경우에, 계면 활성제는 단백질 용해도 증가에 기여하지 못한다. 또한, 수성 용매의 pH가 단백질의 등전점 부근이고 염 농도가 낮을 경우는 비교적 저 농도로만 단백질을 용해시킬 수 있다. 따라서, 비교적 고 농도로 단백질을 용해시키기 위해서는 등전점 부근의 pH를 피하거나 염 농도를 높이는 방법이 일반적으로 사용된다.

그러나, 등전점 부근의 pH에서 염 농도를 높이지 않고 충분히 높은 농도로 단백질을 용해시킬 필요가 생기는 경우가 있다. 예를들면, 염 흡수량이 가능한 적어야 하는 환자에게 중성 pH부근에 등전점을 갖는 생리 활성 단백질을 중성 부근의 pH 용액으로 투여하는 경우가 있다. 이러한 경우에는, 단백질 농도를 낮추거나 부득이 염을 투여할 수밖에 없는데, 이것은 단백질 활성 약제의 의료에 대한 실용화에 있어서 큰 문제점이다.

본 발명의 목적은 고 농도의 단백질 수용액을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 하나의 목적은 단백질을 수성 용매 중에 고농도로 용해시키는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 하나의 목적은 용해성이 우수한 단백질 제제를 제공하는 것이다.

단백질 농축액 제조시, 본 발명자들은 단백질이 적당한 pH에서 이온 교환체에 결합할 때 단백질과 이온 교환체와의 결합은 저 염농도로 일어나기 쉬우며, 소수성 단백질을 용해시키기 위해 사용하는 계면 활성제의 소수성 잔기를 음이온성 잔기로 친환하여 계면 활성제 사용시와 동일한 기작으로 단백질을 용해시킬 수 있음을 발견하였다.

상기 발견에 의거하여, 본 발명자들은 음이온성 중합체 또는 그의 염이 상기의 유리한 효과를 나타냄을 더 조사하여 밝혀 내어 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 음이온성 중합체 또는 그의 염의 공존하는 단백질 수용액, 음이온성 중합체 또는 그의 염이 공존하는 단백질 수용액 중의 단백질 농도의 증대법, 및 음이온성 중합체 또는 그의 염 및 단백질을 함유하는 제제를 제공하는 것이다.

일본국 특허 공개 제 236730/1986호에는 음이온성 중합체의 일종인 폴리술페이트 또는 황산화 당과 같은 당류 및 t-PA(조직형 플라스미노겐 활성제)를 함유하는 약제가 기재되어 있다. 그러나, 기재된 기술은 t-PA 활성을 개선시키려는 것으로서 단백질의 용해성을 개선시키려는 본 발명과는 그 기술사상 면에서 근본적으로 다른 것이다.

본 발명은 종래에는 달할 수 없던 고 단백질 농도의 단백질 수용액, 특히 등전점 부근의 pH에서 저 염농도를 갖는 단백질 수용액을 제공한다.

통상적으로 단백질의 등전점 부근의 pH에서 단백질을 용해시키기 위해서는 (1) 단백질 농도를 감소시키거나 (2) 염 농도를 증가시키는 것이 필수적이다. 생성되는 용액은 염 흡수량이 제한된 환자에게 생리 활성 단백질을 단백질의 등전점 부근의 pH에서 용액 형태로 투여해야 할 경우에는 매우 불만족스러운 것이다. 염 농도를 증가시키지 않고 단백질을 용해시키기 위해서는 선택된 pH가 주사 또는 기타 비경구 투여형과 같은 약제용으로 바람직하지 않아도 단백질의 등전점 부근의 pH를 피하여 pH를 선택해야 한다.

대조적으로, 본 발명에 따르면 단백질은 단백질의 등전점 부근의 pH에서 염 농도를 증가시키지 않고 용해되어 단백질의 등전점 부근의 pH에서 저 염농도를 갖는 단백질 수용액이 제공될 수 있다. 본 발명은 종래 기술에 비하여 유사한 기술을 제공하는 것이다.

본 발명은 특히 중성 부근에 등전점을 갖는 생리 활성 단백질의 주사용 저 염농도 약제 제조용으로 적합하다.

본 발명에 사용되는 단백질로는 물리 화합적으로 간단한 단백질, 공역 단백질 및 유도 단백질, 및 비교적 다량의 소수성기를 갖는 단백질이 있다. 특히, 본 발명은 등전점 부근의 pH에서 용해도가 급격히 감소하는 t-PA 또는 글로블린과 같은 단백질에 적합하게 사용된다. 예를들면, 등전점이 강산성 영역에 존재하지 않는 단백질, 바람직하게는 pH 4이상, 보다 바람직하게는 pH 5이상인 단백질이다. 이들 단백질은 천연 생물체 또는 그의 일부로 부터 추출 정제되거나 화학적으로 합성되거나 유전자 재조합 DNA기술을 사용하여 배양세포로 부터 수득될 수 있다. 이렇게 수득된 단백질을 변성시켜 사용할 수 있다. 이들 단백질의 예로는 γ-글로불린(예. 면역글로불린 A, G 및 E), 락토글로불린, 우로키나제, 프로우로키나제 및 조직 플라스키노겐 활성제(t-PA)가 있다. 특히, 본 발명은 생리활성 단백질에 적합하다.

단백질은 단독으로 또는 2이상의 단백질 또는 이종 단백질의 혼합물로 사용될 수 있다.

본 발명에 사용되는 음이온성 중합체의 음이온 잔기의 예로는 카르복실기, 카르복시메틸기, 황산기 및 인산기가 있다. 음이온성 중합체 골격으로는 당 알코올, 셀룰로스 및 아밀로스등의 당류, 아미노산류 및 핵산 염기류가 있으며, 바람직한 것은 음이온성 중합체의 분자량이 1,000∼1,000,000인 것이다. 음이온 잔기 및 중합체 골격을 전부 갖는 음이온성 중합체의 예로는 카르복시메틸 이온 교환체(예. 카르복시메틸아밀로스 및 카르복시메틸셀룰로스), 산성 다당류(예. 아르긴산), 황산무코다당류(예. 덱스트란 황산, 콘드로이틴 황산, 콘드로이틴 황산 A, 콘드로이틴 황산 B, 콘드로이틴 황상, 콘드로이틴 황산 A, 콘드로이틴 황산 B, 콘드로이틴 황산 C, 콘드로이틴 황산 D, 콘드로이틴 황산 E, 헤파린, 케라토 황산, 케라탄 황산 및 헤파리틴 황산), 산성폴리아미노산(예. 폴리-L-글루탐산) 및 핵산이다. 이들 음이온성 중합체의 염으로는 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 등이 있다.

음이온성 중합체는 단독으로 또는 2종 이상의 조합으로 사용될 수 있다.

음이온성 중합체 또는 그의 염의 양은 용해될 단백질과의 중량비로 1/40이상(w/w)인 것이 바람직하고, 1/10∼100인 것이 보다 바람직하다. 음이온성 중합체의 양이 부족하면 바람직한 단백질 용해량을 수득할 수 없으며, 그 양이 과다하면 용해되는 단백질의 상대량이 감소하여 단백질 수용액이 유용하게 사용되지 못한다. 음이온성 중합체 및 그의 염은 음이온성 잔기의 종류, 양이온 교환능, 분자량 등의 견지에서 상이하므로, 음이온성 중합체 및 그의 염의 양은 제형되는 단백질의 물성에 따라 결정된다.

본 발명의 단백질 수용액 중의 단백질 농도는 용해될 단백질의 용해도에 따라 결정되면 각 단백질에 독특하므로 일반화될 수 없다. 그러나, 특히 등전점 부근의 pH에서 용해도는 종래 단백질 수용액의 용해도에 비해 고도로 개선되므로 통상 0.1mg/ml이상의 단백질 농도를 갖는 수용액을 수득하는 것이 가능하다. 물론, 본 발명은 그 미만의 단백질 농도를 갖는 용액도 배제하지 않는다. 실질적으로 본 발명에 의하면 희석액에서도 단백질 침전 현상은 일어나지 않는다. 본 발명에 의하면 통상 약 0.01∼10mg/ml의 단백질 농도를 갖는 단백질 수용액을 제조할 수 있다.

본 발명에서 수용액의 pH범위는 특별히 한정되지는 않는다. 그러나, 본 발명의 특징은 염 농도를 증가시키지 않고 단백질의 등전점 부근의 pH에서 단백질의 용해도를 증가시킬 수 있다는 것이며, 단백질의 등전점은 대부분 약산성에서 부터 알칼리성 pH범위에 있음을 고려할 때 본 발명은 수용액의 pH가 약산성, 중성, 약 알칼리성 또는 알칼리성 영역에 있는 경우 특히 의의가 크다. 구체적으로, 수용액의 pH는 단백질의 등전점에서 -2∼+2pH단위 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는 11∼+1pH단위이다.

본 발명에서 제형되는 단백질의 등전점은 전기영동법으로 측정된 것이다. 또한, 단백질의 경우, 전기영동법으로 측정된 등전점은 한 점으로 나타나지 않고 일정 pH범위의 밴드로 나타나는 경우가 있다(이런 경우에는 그 pH범위를 등전점으로 한다). 또, 각각 상이한 등전점을 갖는 둘 이상의 단백질의 혼합물의 경우는 각각의 단백질의 등전점을 모두 포함하는 pH범위를 단백질 혼합물의 등전점으로 한다.

본 발명에 따른 단백질 및 음이온성 중합체 또는 그의 염을 함유하는 수용액의 이온 강도는 바람직하게는 0.05몰/ℓ이하, 보다 바람직하게는 0.02몰/ℓ이하, 특히 바람직하게는 0.01몰/ℓ이하이다. 이온 강도가 0.05몰/ℓ초과일 경우는 본 발명의 효과가 저하되는 경향이 있다. 이것은 음이온성 중합체의 음이온성 잔기와 단백질과의 상호작용이 이온강도가 높은 용액 중에서 중화되기 때문이다.

또한, 음이온성 중합체 또는 그의 염 이외의 염 함량은 단백질 1mg 당 0.1몰 미만인 것이 바람직하다. 예를들면, 염화나트륨 함량이 높은 용액 중에서 음이온성 중합체에 의한 효과가 저해될 수 있다.

본 발명의 용해법을 수행하기 위해서는 하기 방법이 사용될 수 있다. 먼저, 단백질을 등전점을 피한 pH 영역에서 용해시키고, 생성되는 단백질 용액에 음이온성 중합체 또는 그의 염을 함유하는 용액을 가하고, pH를 등전점 부근으로 조정하여 단백질 및 음이온성 중합체 또는 그의 염이 공존하는 용액을 제조한다.

또는, 처음에 단백질 및 음이온성 중합체 또는 그의 염을 함유하는 수용액을 단백질의 등전점을 피한 pH에서 제조한 후 용액의 pH를 단백질의 등전점 부근으로 조정하는 방법도 사용가능하다.

또 하나의 방법으로는, 단백질 및 음이온성 중합체를 함유하는 제제를 제조한 후 제제를 용해시킨다. 이 제제를 제조하기 위해서는 통상적인 방법을 사용할 수 있다. 예를들면, 등전점을 피한 pH에서 단백질을 희석액 중에 용해시키고, 이 용액에 음이온성 중합체 수용액을 가한다. pH를 조정한 후 부형제등을 가하고, 생성 용액을 여과하고 바이알로 분배하여 동결 건조함으로써 주사용 약제를 제조한다. 또는, 단백질 수용액에 음이온성 중합체를 가하여 단백질 및 음이온성 중합체의 복합체를 형성한다. 생성된 복합체를 pH를 복합체의 등전점으로 조정하여, 침전시키고 건조시킨 후 재형화용 첨가물을 가하고, 바이알로 분배하여 제제를 제조한다. 제제의 단백질 함량은 통상 0.01∼50중량%이다.

필요에 따라, 단백질의 중합 및 용기에의 부착을 방지할 목적으로 계면 활성제(예. 트윈 80), 금속 이온의 단백질에 대한 영향을 배제할 목적으로 킬레이트제(예. EDTA), 생리 활성 단백질의 안정화제, 및 부형제(동격건조제제로 사용되는 경우 유효함 ; 예, 만니톨 및 락토스)를 음이온성 중합체 또는 그의 염외에 단백질 용액 또는 동격건조물에 가할 수 있다.

본 발명에 따르면, 등전점 부근의 pH에서 염 농도 또는 이온 강도를 증가시키지 않고 단백질을 효과적으로 용해시킬 수 있다. 이것은 종래 기술로는 불가능한 것이다. 그 용해효과 기작은 완전히 밝혀지지는 않았지만, 단백질 단독으로는 매우 용해성이 낮은 단백질 등전점 부근의 pH에서 음이온성 중합체 또는 그의 염을 용액에 가할 경우 특히 이온강도가 낮을때 단백질과 음이온성 중합체는 상호작용하고, 결과적으로 용해성이 현저하게 향상되는 것으로 생각된다.

[실시예]

하기 실시예로 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

[실시예 1]

유전자 제조합 기술을 사용하여 배양세포로 t-PA의 구조 유전자를 발현시킨 후 그 배양액에서 추출 및 농축시켜 인간 유래 조직 플라스미노겐 활성제(t-PA)를 단백질로 사용한다. t-PA를 60mM인산 나트륨 용액중에 용해시켜 그 pH4.2로 부터 인산 이수소 나트륨으로 간주한다. 셀룰로스제 투석 튜브에 t-PA 1mg 및 헤파린의 칼슘염 0∼1mg을 넣고 증류수를 사용하여 총 부피를 1.0ml로 만든다. 이것을 1,000ml의 1mM시트르산 완충액에 대해 3시간 투석한다. 투석 튜브중의 액을 폴리프로필렌제의 작은 시험관으로 옮기고, 15,000rpm으로 10분간 원심분리후 상층액의 280nm에서의 흡광도를 측정하여 t-PA의 용해도를 측정한다. t-PA의 등전점은 약 6.5∼7.5이다. 결과를 하기 표 1에 제시한다. 표 1에서, t-PA의 용해성은 특히 등전점 부근의 pH에서 헤파린 칼슘을 가함으로써 향상됨을 명백히 알 수 있다.

[표 1]

기입된 수치는 t-PA의 용해도(mg/ml)이다.

a) t-PA 1mg당 첨가량

b) t-PA의 등전점에 상응하는 pH

[실시예 2]

헤파린 0.1∼0.2mg 대신에 표 2에 제시한 각종 음이온성 중합체 및 양이온성 중합체를 상용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 t-PA의 용해도를 측정한다. 용액의 pH를 약 7로 조정한다. 결과를 하기 표 2에 제시한다.

음이온성 중합체를 사용한 경우는 t-PA의 용해성이 급격히 향상되지만, 양이온성 중합체를 사용한 경우는 용해성이 전혀 향상되지 않는다. 또한, 염화 나트륨을 고농도로 첨가한 경우에도 충분한 용해성이 수득되지 않는다.

[표 2]

[실시예 3]

표 3에 제시한 소정량의 콘드로이틴 황산 A 및 헤파란 황산을 헤파린 대신에 pH 약 7에서 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 t-PA의 용해도를 측정한다. 결과를 하기 표 3에 제시한다.

결과에서, t-PA용해성은 콘드로이틴 황산 A 및 헤파린 황산이 중량 기준으로 t-PA의 1/40이상일 때 특히 향상됨을 알 수 있다.

[표 3]

[실시예 4]

수용액이 pH를 각 단백질(t-PA 및 β-락토글로불린)의 등전점으로 조정하고, 각 단백질의 1/10양의 콘드로이틴 황산 나트륨의 첨가 유무에 따른 단백질의 용해성을 조사한다. 결과를 하기 표 4에 제시한다.

[표 4]

[실시예 5]

t-PA 100mg

콘드로이틴 황산 나트륨 10 mg

락토스 500mg

상기 성분을 25ml의 5mM 인산완충액(pH 7.0)에 용해시킨다. 여과멸균후 수극한 용액을 각각 2.5ml의 바이알로 분배하고, 동결 건조시켜 t-PA 제제를 제조한다. 이 t-PA 제제를 5% 글루코스 수액 또는 주사용 증류수중에 재용해시킬 수 있다.

[실시예 6]

t-PA 100mg

헤파린(나트륨염) 10 mg

락토스 500mg

상기 성분을 25ml의 5mM 인산완충액(pH 7.0)에 용해시킨다. 여과 멸균 후 수득한 용액을 각각 2.5ml의 바이알로 분해하고, 동결 건조시켜 t-PA 제제를 제조한다. 이 t-PA 제제를 5% 글루코스 수액 또는 주사용 증류수 중에 재용해시킬 수 있다.

[실시예 7]

t-PA 100mg

덱스트린 황산(나트륨염) 10 mg

락토스 500mg

상기 성분을 25ml의 5mM 인산완충액(pH 7.0)에 용해시킨다. 여과 멸균 후 수득한 용액을 각 2.5ml의 바이알로 분배하고, 동결 건조시켜 t-PA 제제를 제조한다. 이 t-PA 제제를 5% 글루코스 수액 또는 주사용 증류수 중에 재용해시킬 수 있다.

Claims (13)

1. 등전점부근의 pH에서 용해도가 급격히 감소하는 단백질 및 카르복실기, 카르복시메틸기, 황산기 및 인산기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 음이온 잔기를 갖는 음이온성 중합체 또는 그의 염을 함유하는 수용액.
2. 제1항에 있어서, 음이온성 중합체 또는 그의 염이 단백질에 대해 1 : 40이상의 중량비로 존재하는 수용액.
3. 제1항에 있어서, 단백질의 등전점 -2∼+2pH 단위의 pH를 갖는 수용액.
4. 제1항에 있어서, 0.05몰/ℓ 이하의 이온강도를 갖는 수용액.
5. 제1항에 있어서, 음이온성 중합체 또는 그의 염 이외의 염 함량이 단백질 1mg당 0.1몰이하인 수용액.
6. 등전점부근의 pH에서 용해도가 급격히 감소하는 단백질을 함유하는 수용액에 음이온성 중합체의 부재시 수득가능한 최대 농도보다 더 큰 농도로 단백질을 충분히 용해시키는 양으로 음이온성 중합체 또는 그의 염을 가하고 상기 음이온성 중합체는 카르복실기, 카르복시메틸기, 황산기 및 인산기로부터 선택된 적어도 하나의 음이온 잔기를 갖는 것을 특징으로 하는 수용액중의 상기 단백질 농도의 증대방법.
7. 카르복실기, 카르복시메틸기, 황산기 및 인산기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 음이온 잔기를 갖는 음이온성 중합체 또는 그의 염 및 등전점부근의 pH에서 용해도가 급격히 감소하는 단백질을 함유하는 약학 조성물.
8. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 생리 활성 단백질인 수용액.
9. 제6항에 있어서, 단백질이 생리 활성 단백질인 수용액 중의 단백질 농도의 증대방법.
10. 제7항에 있어서, 단백질이 생리 활성 단백질인 조성물.
11. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서, 단백질의 등전점이 pH 4이상인 수용액.
12. 제6항에 있어서, 단백질의 등전점이 pH 4 이상인, 수용액 중의 단백질 농도의 증대방법.
13. 제7항에 있어서, 단백질의 등전점이 pH 4 이상인 조성물.