ES2248818T3 - Metodo de solubilizacion, purificacion y replegamiento de proteinas. - Google Patents
Metodo de solubilizacion, purificacion y replegamiento de proteinas.Info
- Publication number
- ES2248818T3 ES2248818T3 ES96924269T ES96924269T ES2248818T3 ES 2248818 T3 ES2248818 T3 ES 2248818T3 ES 96924269 T ES96924269 T ES 96924269T ES 96924269 T ES96924269 T ES 96924269T ES 2248818 T3 ES2248818 T3 ES 2248818T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- tfpi
- folded
- protein
- mutein
- refolding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L19/00—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof
- A23L19/09—Mashed or comminuted products, e.g. pulp, purée, sauce, or products made therefrom, e.g. snacks
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L19/00—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof
- A23L19/10—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof of tuberous or like starch containing root crops
- A23L19/12—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof of tuberous or like starch containing root crops of potatoes
- A23L19/18—Roasted or fried products, e.g. snacks or chips
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L21/00—Marmalades, jams, jellies or the like; Products from apiculture; Preparation or treatment thereof
- A23L21/10—Marmalades; Jams; Jellies; Other similar fruit or vegetable compositions; Simulated fruit products
- A23L21/15—Marmalades; Jams; Jellies; Other similar fruit or vegetable compositions; Simulated fruit products derived from fruit or vegetable juices
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
- A23L29/20—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents
- A23L29/206—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of vegetable origin
- A23L29/212—Starch; Modified starch; Starch derivatives, e.g. esters or ethers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
- A23L29/20—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents
- A23L29/206—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of vegetable origin
- A23L29/212—Starch; Modified starch; Starch derivatives, e.g. esters or ethers
- A23L29/219—Chemically modified starch; Reaction or complexation products of starch with other chemicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
- A23L7/10—Cereal-derived products
- A23L7/109—Types of pasta, e.g. macaroni or noodles
- A23L7/111—Semi-moist pasta, i.e. containing about 20% of moist; Moist packaged or frozen pasta; Pasta fried or pre-fried in a non-aqueous frying medium, e.g. oil; Packaged pasta to be cooked directly in the package
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
- A23L7/10—Cereal-derived products
- A23L7/161—Puffed cereals, e.g. popcorn or puffed rice
- A23L7/165—Preparation of puffed cereals involving preparation of meal or dough as an intermediate step
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L9/00—Puddings; Cream substitutes; Preparation or treatment thereof
- A23L9/10—Puddings; Dry powder puddings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L9/00—Puddings; Cream substitutes; Preparation or treatment thereof
- A23L9/20—Cream substitutes
- A23L9/22—Cream substitutes containing non-milk fats but no proteins other than milk proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23P—SHAPING OR WORKING OF FOODSTUFFS, NOT FULLY COVERED BY A SINGLE OTHER SUBCLASS
- A23P20/00—Coating of foodstuffs; Coatings therefor; Making laminated, multi-layered, stuffed or hollow foodstuffs
- A23P20/10—Coating with edible coatings, e.g. with oils or fats
- A23P20/12—Apparatus or processes for applying powders or particles to foodstuffs, e.g. for breading; Such apparatus combined with means for pre-moistening or battering
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/55—Protease inhibitors
- A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/02—Inorganic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
- A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
- A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA MODIFICAR LA SOLUBILIDAD DE UNA PROTEINA QUE EMPLEA POLIMEROS POLI - IONICOS. ESTOS FACILITAN LA SOLUBILIZACION, LA FORMULACION, LA PURIFICACION Y EL REPLEGAMIENTO DE PROTEINAS, EN ESPECIAL DE PROTEINAS PLEGADAS DE FORMA INCORRECTA Y PROTEINAS AGREGADAS. SE DESCRIBEN COMPOSICIONES QUE RESULTAN ADECUADAS PARA FORMULAR TFPI. LAS COMPOSICIONES PERMITEN LA PREPARACION DE COMPOSICIONES FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLES DE TFPI A UNAS CONCENTRACIONES POR ENCIMA DE 0,2 MG/ML Y POR ENCIMA DE 10 MG/ML.
Description
Método de solubilización, purificación y
replegamiento de proteínas.
Esta invención se refiere a los métodos útiles
para replegar, solubilizar, formular y purificar proteínas. Estos
métodos son particularmente útiles para proteínas que se han
modificado mediante recombinación genética y producido en bacterias,
levaduras u otras células en una forma que tiene una estructura
terciaria no nativa.
Para comprender por completo el proceso total de
la expresión génica, es tan importante comprender el proceso para el
plegamiento de la cadena peptídica en una proteína biológicamente
activa como comprender la síntesis de la secuencia primaria. Las
actividades biológicas de las proteínas dependen no sólo de sus
secuencias de aminoácidos sino también de las conformaciones
diferenciadas de las proteínas en cuestión y ligeras perturbaciones
en la integridad conformacional de una proteína puede destruir su
actividad. Tsou et al. (1998) Biochemistry
27:1809-1812.
En las condiciones adecuadas, el replegamiento
in vitro de proteínas desnaturalizadas purificadas para
obtener la estructura secundaria y terciaria nativa es un proceso
espontáneo. Para evitar la formación de estructuras estables pero no
deseadas, es necesario utilizar las interacciones terciarias (que se
forman después en el plegamiento) con su alto grado de poder de
selectividad para seleccionar y estabilizar adicionalmente esas
estructuras locales iniciales que se encuentran en la ruta de
plegamiento correcta. Por lo tanto, la estabilidad finita pero muy
baja de las estructuras locales podría ser el mecanismo cinético de
"corrección de lectura" del plegamiento de proteínas. El estado
activado de plegamiento con la mayor energía es una forma
distorsionada de la proteína nativa y la etapa más lenta, limitante
de la velocidad, del desplegamiento y replegamiento parece estar
próxima al estado nativo en cuanto a la estructura ordenada. Además,
el replegamiento de muchas proteínas no es completamente reversible
in vitro, y frecuentemente se observan rendimientos de
reactivación inferiores al 100%, lo cual es válido en particular
para experimentos con alta concentración de proteínas, y la
agregación competitiva de moléculas de proteína desplegadas o
parcialmente replegadas puede ser la razón principal para una
reversibilidad reducida, tal como se describe en Fischer y Schmid,
(1990) Biochemistry 29: 2205-2212.
En el caso de moléculas de proteína
suficientemente largas, la cadena polipeptídica naciente adquiere su
estructura tridimensional nativa mediante el ensamblaje modular de
microdominios. Se han probado variables que incluyen la temperatura
y codisolventes tales como polioles, urea y cloruro de guanidinio
para determinar su papel en la estabilización y desestabilización de
conformaciones de las proteínas. La acción de los codisolventes
puede ser el resultado de la unión directa o de alteraciones de las
propiedades físicas del agua, tal como se describe en Jaenicke et
al. (1991) Biochemistry 30
(13):3147-3161.
Las observaciones experimentales de cómo se
repliegan las proteínas desplegadas en sus estructuras
tridimensionales nativas se oponen a muchas teorías populares sobre
los mecanismos de plegamiento de proteínas. En condiciones que
permitan el replegamiento, las moléculas de proteína desplegadas se
equilibran rápidamente entre diferentes conformaciones antes del
replegamiento completo. El rápido equilibrio previo al plegamiento
favorece ciertas conformaciones compactas que tienen energías libres
algo más bajas que las demás conformaciones desplegadas. La etapa
limitante de la velocidad tiene lugar después en la ruta e involucra
a una forma distorsionada de alta energía de la conformación nativa.
Esto parece ser una única transición a través de la cual se pliegan
esencialmente todas las moléculas, tal como se describe en Creighton
et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA
85:5082-5086.
Se han utilizado diversos métodos de
replegamiento de proteínas purificadas producidas por recombinación.
Por ejemplo, puede producirse la proteasa codificada por el virus de
la inmunodeficiencia humana tipo I (VIH-I) en
Escherichia coli, produciendo cuerpos de inclusión que
albergan la proteasa de VIH-I recombinante, tal como
se describe en Hui et al. (1993) J. Prot. Chem.
12:323-327. Se replegó la proteasa de
VIH-I purificada para dar una enzima activa
diluyendo una disolución de la proteína en ácido acético al 50% con
25 volúmenes de tampón a pH 5,5. Se encontró que se obtenía una
actividad específica de proteasa superior si se disolvía la proteína
purificada a aproximadamente 2 mg/ml en ácido acético al 50% seguido
de una dilución con 25 volúmenes de acetato de sodio frío 0,1 M, pH
5,5, que contenía un 5% de etilenglicol y un 10% de glicerol. La
exclusión del glicerol y del etilenglicol condujo a una pérdida
gradual de proteína debido a precipitación. Se obtuvieron
aproximadamente 85 mg de proteasa VIH-I
correctamente plegada por litro de un cultivo celular de
Escherichia coli y la enzima tenía una alta actividad
específica.
Otro ejemplo de replegamiento de una proteína
recombinante es el aislamiento y replegamiento de
H-ras a partir de cuerpos de inclusión de E.
coli, tal como se describe en DeLoskey et al. (1994)
Arch. Biochem and Biophys. 311:72-78. En este
estudio, se variaron la concentración de proteína, la temperatura, y
la presencia de un 10% de glicerol durante el replegamiento. El
mayor rendimiento de H-ras correctamente plegada se
produjo cuando la proteína se replegó a concentraciones inferiores o
iguales a 0,1 mg/ml y fue independiente de la presencia de un 10% de
glicerol. El rendimiento fue ligeramente superior a 4º que a
25ºC.
El replegamiento del inhibidor de la ruta del
factor tisular (también conocido de forma diversa como inhibidor de
la coagulación asociado a lipoproteínas (LACI), inhibidor de la ruta
extrínseca (EPI) e inhibidor del factor tisular (EFI) y denominados
más adelante en el presente documento "TFPI") se produce en un
sistema de expresión bacteriano que se ha descrito por Gustafson
et al. (1994) Protein Expression and Purification
5:233-241. En este estudio, el alto nivel de
expresión del TFPI en E. coli recombinante dio como resultado
la acumulación de TFPI en los cuerpos de inclusión. Se produjo
proteína activa mediante la solubilización de los cuerpos de
inclusión en urea 8 M, y la purificación de la molécula de longitud
completa se logró mediante cromatografía de intercambio catiónico y
renaturalización en urea 6 M. Se fraccionó entonces la mezcla
replegada para producir un TFPI no glucosilada purificada que tiene
actividad biológica in vitro, tal como se midió en el ensayo
del tiempo de coagulación de protrombina comparable al TFPI
purificado a partir de células de mamíferos.
También se ha producido y aislado a partir de
células de Escherichia coli (E. coli) una forma no
glucosilada de TFPI, tal como se describe en la patente de los
EE.UU. número 5.212.091. La invención descrita en la patente de los
EE.UU. número 5.212.091. sometía los cuerpos de inclusión que
contenían TFPI a una sulfitólisis para formar
TFPI-S-sulfonato, purificaba el
TFPI-S-sulfonato mediante
cromatografía de intercambio aniónico, replegaba el
TFPI-S-sulfonato mediante
intercambio de disulfuro utilizando cisteína, y purificaba el TFPI
activo mediante cromatografía de intercambio catiónico. Se ha
demostrado que la forma de TFPI descrita en la patente de los EE.UU.
número 5.212.091. es activa en la inhibición del factor bovino Xa y
en la inhibición de la coagulación inducida por el factor tisular
humano en plasma. En algunos ensayos, el TFPI producido por E.
coli ha mostrado ser más activo que el TFPI nativo derivado de
células de hepatoma SK. Sin embargo, el TFPI producido en células de
E. coli está modificado de manera que aumenta la
heterogeneidad de la proteína.
En la técnica del replegamiento de proteínas
producidas por recombinación existe la necesidad de incrementar la
cantidad de TFPI correctamente plegado durante el proceso de
replegamiento. También existe la necesidad de incrementar la
solubilidad del TFPI. Actualmente los rendimientos de TFPI producido
mediante recombinación han sido menores de lo deseado y existe una
necesidad en la técnica de producir TFPI correctamente plegado.
Véase por ejemplo Gustafuson et al. (1994) Protein
Expression and Purification 5:233-241.
El TFPI inhibe la cascada de coagulación al menos
de dos formas: evitando la formación del complejo de factor
VIIa/factor tisular y uniéndose al sitio activo del factor Xa. La
secuencia primaria de TFPI, deducida a partir de la secuencia de
ADNc, indica que la proteína contiene tres dominios inhibidores de
enzima de tipo Kunitz. Se requiere el primero de estos dominios para
la inhibición del complejo de factor VIIa / factor tisular. El
segundo dominio de tipo Kunitz es necesario para la inhibición del
factor Xa. Se desconoce la función del tercer dominio de tipo
Kunitz. El TFPI no presenta actividad enzimática conocida y se cree
que inhibe sus dianas para proteasa de manera estequiométrica;
concretamente, uniéndose un dominio de tipo Kunitz del TFPI al sitio
activo de una molécula de proteasa. Se cree que el extremo
carboxi-terminal del TFPI desempeña un papel en la
localización en la superficie celular a través de la unión con
heparina o mediante interacción con un fosfolípido. También se
conoce al TFPI como inhibidor de la coagulación asociado a
lipoproteínas (LACI), inhibidor del factor tisular (TFI) e inhibidor
de la ruta extrínseca (EPI).
El TFPI maduro tiene una longitud de 276
aminoácidos con un extremo amino-terminal cargado
negativamente y un extremo carboxi-terminal cargado
positivamente. El TFPI contiene 18 residuos de cisteína y forma 9
puentes disulfuro cuando se pliega correctamente. La secuencia
primaria también contiene tres sitios consenso de glucosilación de
unión a N Asn-X-Ser/Thr,
localizándose los residuos de asparagina en las posiciones 145, 195
y 256. El componente de hidrato de carbono del TFPI maduro
representa aproximadamente el 30% de la masa de la proteína. Sin
embargo, los datos obtenidos a partir del mapeo proteolítico y los
datos de los espectros de masas implican que los restos de hidrato
de carbono son heterogéneos. Se ha encontrado también que el TFPI
está fosforilado en el residuo de serina en la posición 2 de la
proteína en grados variables. La fosforilación parece no afectar la
función del TFPI.
Se ha aislado TFPI a partir de plasma humano y de
células en cultivos tisulares humanos que incluyen células HepG2,
hepáticas Chang y de hepatoma SK. Se ha expresado TFPI recombinante
en células C127 de ratón, en células renales de cría de hámster, en
células de ovario de hámster chino y en células de hepatoma SK
humano. Se ha demostrado que el TFPI recombinante procedente de
células de ratón C127 inhibe en modelos animales la coagulación
inducida por el factor tisular.
Se produjo y aisló una forma no glucosilada de
TFPI recombinante a partir de células de E. coli tal como se
describe en la patente de los EE.UU. Número 5.212.091. Esta forma de
TFPI ha demostrado ser activa en la inhibición del factor Xa bovino
y en la inhibición de la coagulación inducida por el factor tisular
humano en el plasma. También se han descrito métodos para la
purificación de TFPI a partir de medio de cultivo de células de
levadura, tal como en Petersen et al., J. Biol. Chem.
18:13344-13351 (1993).
Recientemente, se ha identificado otra proteína
con un alto grado de identidad estructural con TFPI. Sprecher et
al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 91:3353-3357
(1994). La estructura secundaria prevista para esta proteína,
denominada TFPI-2, es prácticamente idéntica a la
del TFPI con 3 dominios de tipo Kunitz, 9 enlaces
cisteína-cisteína un extremo
amino-terminal ácido y una cola
carboxi-terminal básica. Los tres dominios de tipo
Kunitz del TFPI-2 muestran el 43%, 35% y 53% de
identidad de la secuencia primaria con los dominios de tipo Kunitz
1, 2 y 3, respectivamente. El TFPI-2 recombinante
inhibe fuertemente la actividad amidolítica del factor VIIa/factor
tisular. Por el contrario, el TFPI-2 es un inhibidor
débil de la actividad amidolítica del factor Xa.
Se ha demostrado que el TFPI evita la mortalidad
en un modelo de babuino de choque séptico con Escherichia coli
(E. coli) letal. Creasey et al. J. Clin. Invest.
91:2850-2860. (1993). La administración de TFPI a 6
mg/kg de peso corporal poco después de la infusión de una dosis
letal de E. coli dio como resultado la supervivencia de los
cinco animales tratados con TFPI con una mejoría significativa en la
calidad de vida en comparación con el tiempo medio de supervivencia
de los cinco animales control de 39,9 horas. La administración de
TFPI también dio como resultado una atenuación significativa de la
respuesta de coagulación, de varias medidas del daño celular y una
reducción significativa en la patología que se observa normalmente
en los órganos diana de una sepsis por E. coli, que incluyen
riñones, glándulas suprarrenales y pulmones.
Debido a sus propiedades inhibidoras de coágulos,
el TFPI también puede usarse para prevenir la trombosis durante
cirugía microvascular. Por ejemplo, el documento U.S. 5.276.015
describe el uso del TFPI en un método para reducir la
trombogenicidad de anastomosis microvasculares en las que se
administra TFPI en la zona de las anastomosis microvasculares de
manera contemporánea a la reconstrucción microvascular.
El TFPI es una proteína hidrófoba y como tal,
presenta una solubilidad muy limitada en disoluciones acuosas. Esta
solubilidad limitada ha hecho difícil de fabricar la preparación de
formulaciones farmacéuticamente aceptables, especialmente para las
indicaciones clínicas que pueden beneficiarse de la administración
de altas dosis de TFPI. Por tanto, existe la necesidad en la técnica
de composiciones farmacéuticamente aceptables que contengan
concentraciones de TFPI que puedan administrarse a los pacientes en
cantidades aceptables.
La figura 1 es un análisis mediante
SDS-PAGE con tinción de Coomassie de las fracciones
de pico de TFPI procedentes del procedimiento de replegamiento
mediante Phenyl Sepharose-HIC (cromatografía de
interacción hidrófoba).
La figura 2 es una representación gráfica de la
recuperación de TFPI nativo a partir de la columna de HIC.
La figura 3 es una representación gráfica de la
recuperación de TFPI nativo a partir de una segunda columna de
HIC.
La figura 4 es la secuencia de aminoácidos de
TFPI.
La figura 5 muestra la solubilidad del TFPI en
diferentes condiciones de pH. Se dializaron aproximadamente 10 mg/ml
de TFPI en urea 2 M frente a acetato, fosfato, citrato, glicina,
L-glutamato y succinato 20 mM en NaCl 150 mM. Se
midió la concentración del TFPI soluble restante después de la
diálisis mediante la absorbancia UV después de separar por
filtración los precipitados a través de unidades de filtración de
0,22 mm.
La figura 6 muestra la solubilidad del TFPI como
una función de la concentración de citrato en presencia de fosfato
de Na 10 mM a pH 7. La solubilidad del TFPI aumenta con las
concentraciones crecientes de citrato.
La figura 7 muestra la solubilidad del TFPI como
una función de la concentración de NaCl. La solubilidad del TFPI
aumenta con las concentraciones crecientes de sal, lo que indica que
la sal potencia la solubilidad del TFPI.
La figura 8 muestra el efecto del pH sobre la
estabilidad del TFPI preparado en fosfato de Na 10 mM, NaCl 150 mM y
0,005% (p/v) de polisorbato-80. Se incubaron a 40ºC
muestras para estabilidad que contenían TFPI 150 mg/ml durante 20
días. Se analizó la constante cinética de velocidad del TFPI soluble
restante mediante el seguimiento de la disminución del pico
principal en cromatogramas de intercambio catiónico.
La figura 9 muestra el porcentaje de TFPI soluble
restante medido mediante HPLC de intercambio catiónico (A) y el TFPI
activo restante mediante el ensayo del tiempo de protrombina (B)
como una función de la concentración de fosfato. La formulación
contiene TFPI 150 mg/ml en NaCl 150 mM y 0,005% (p/v) de
polisorbato-80 a pH 7 con concentraciones variables
de fosfato.
La figura 10 muestra la pérdida de TFPI soluble a
40ºC medida mediante HPLC de intercambio catiónico (triángulos) y el
ensayo del tiempo de protrombina (círculos) para TFPI 0,5 mg/ml
formulado en citrato de Na 10 mM, pH 6 y NaCl 150 mM.
La figura 11 muestra la pérdida de TFPI soluble a
40ºC medida mediante HPLC de intercambio catiónico (símbolos en
blanco) y el ensayo del tiempo de protrombina (símbolos rellenos)
para TFPI 0,5 mg/ml formulado en fosfato de Na 10 mM, pH 6 y o bien
NaCl 150 mM (triángulos) o bien NaCl 500 mM (círculos).
La figura 12 muestra la pérdida de TFPI soluble a
40ºC medida mediante HPLC de intercambio catiónico (símbolos en
blanco) y el ensayo del tiempo de protrombina (símbolos rellenos)
para TFPI 0,5 mg/ml formulado en acetato de Na 10 mM y pH 5,5 que
contiene NaCl 150 mM (triángulos) o un 8% (p/v) de sacarosa
(cuadrados) o un 4,5% de manitol (círculos).
La figura 13 muestra dos geles de SDS no
reductores para las muestras de formulación de TFPI a pH de 4 a 9
almacenados a 40ºC durante de 0 a 20 días.
\newpage
La figura 14 muestra el transcurso con el tiempo
de un replegamiento de rhTFPI (TFPI recombinante humana) facilitado
con polifosfato monitorizado utilizando
SDS-PAGE.
La figura 15 muestra la absorbancia a 280 nm
durante la carga y la elución de la columna
S-Sepharose-HP utilizada para
purificar rhTFPI procedente de un replegamiento facilitado con
polifosfato.
La figura 16 muestra el análisis mediante
SDS-PAGE de las fracciones recogidas durante la
elución de la columna S-Sepharose HP utilizada para
purificar rhTFPI procedente de un replegamiento facilitado con
polifosfato.
La figura 17 muestra la absorbancia a 280 nm
durante la carga y la elución de la columna
Q-Sepharose HP utilizada para purificar rhTFPI de
una combinación procedente de la columna
S-Sepharose, preparada a partir de un replegamiento
facilitado con polifosfato.
La figura 18 muestra el análisis mediante
SDS-PAGE de las fracciones recogidas durante la
elución de la columna Q-Sepharose HP utilizada para
purificar rhTFPI de una combinación procedente de la columna
Q-Sepharose, preparada a partir de un replegamiento
facilitado con polifosfato.
La figura 19 muestra el transcurso con el tiempo
de un replegamiento de rhTFPI facilitado con polietilenimina
monitorizado utilizando SDS-PAGE.
La figura 20 muestra la absorbancia a 280 nm
durante la carga y la elución de la columna
S-Sepharose HP utilizada para purificar rhTFPI
procedente de un replegamiento facilitado con polietilenimina.
La figura 21 muestra el análisis mediante
SDS-PAGE de las fracciones recogidas durante la
elución de la columna S-Sepharose HP utilizada para
purificar rhTFPI procedente de un replegamiento facilitado con
polietilenimina.
La figura 22 muestra la absorbancia a 280 nm
durante la carga y la elución de la columna
Q-Sepharose HP utilizada para purificar rhTFPI de
una combinación procedente de la columna
S-Sepharose, preparada a partir de un replegamiento
facilitado con polietilenimina.
La figura 23 muestra el análisis mediante
SDS-PAGE de las fracciones recogidas durante la
elución de la columna Q-Sepharose HP utilizada para
purificar rhTFPI de una combinación procedente de la columna
Q-Sepharose, preparada a partir de un replegamiento
facilitado con polifosfato.
La figura 24 muestra el análisis mediante HPLC de
intercambio catiónico de un replegamiento de rhTFPI facilitado con
polifosfato al 0,4% en ausencia de urea.
La figura 25 muestra los resultados del análisis
mediante HPLC de intercambio catiónico de una evaluación de
diferentes niveles de cisteína en un replegamiento de rhTFPI en
polifosfato al 0,4%, Tris 50 mM en ausencia de urea.
La figura 26 muestra el efecto de la longitud de
la cadena de polifosfato sobre el transcurso de un replegamiento
facilitado con polifosfato de los cuerpos de inclusión de rhTFPI
monitorizado mediante HPLC de intercambio catiónico.
La figura 27 muestra el efecto de la
concentración de polifosfato (Glass H) sobre el replegamiento del
rhTFPI procedente de cuerpos de inclusión tal como se monitoriza
mediante HPLC de intercambio catiónico.
La figura 28 muestra el análisis mediante HPLC de
intercambio catiónico del replegamiento facilitado con polifosfato y
polietilenimina de rhTFPI purificado y reducido.
Es un objeto de la invención proporcionar
formulaciones acuosas de rhTFPI.
Es otro objeto de la presente invención describir
un método de replegamiento de TFPI que incluye las etapas de añadir
polímeros cargados a una disolución de TFPI desnaturalizado antes de
permitir que el TFPI se repliegue.
Además, es otro objeto de la presente invención
describir un método de replegamiento del TFPI que incluya la etapa
de inmovilizar polímeros cargados en una columna y hacer pasar una
disolución de TFPI desnaturalizado a través de la columna y eluir el
TFPI replegado una vez que se ha producido el replegamiento.
Se ha encontrado ahora que la solubilidad del
TFPI depende fuertemente del pH y, sorprendentemente, que los
polianiones tales como citrato, isocitrato y sulfato tienen
profundos efectos solubilizantes sobre el TFPI. Este hallazgo es
sorprendente a la luz de la naturaleza hidrófoba del TFPI y del
carácter hidrófilo de estos antagonistas. Por tanto, pueden
utilizarse citrato, isocitrato, sulfato así como otros
solubilizantes descritos anteriormente en el presente documento para
producir composiciones farmacéuticamente aceptables que tengan
concentraciones suficientes de TFPI para la administración a
pacientes. También se ha demostrado que otras moléculas orgánicas
pueden actuar como solubilizantes secundarios. Estos solubilizantes
secundarios incluyen PEG, sacarosa, manitol y sorbitol.
La invención se refiere a disoluciones acuosas
que comprenden TFPI replegado, una muteína de TFPI replegado o un
TFPI-2 replegado y un polímero cargado, en el que el
TFPI replegado está presente en una concentración superior a 1 mg/ml
de agentes solubilizantes. Los agentes solubilizantes pueden ser ion
acetato, cloruro de sodio, ion citrato, ion isocitrato, glicina,
glutamato, ion succinato, histidina, imidazol y dodecilsulfato de
sodio (SDS) así como polímeros cargados. En algunas composiciones,
el TFPI puede estar presente en concentraciones superiores a 10
mg/ml. La composición puede tener además uno o más solubilizantes.
El solubilizante o solubilizantes secundarios pueden ser
polietilenglicol (PEG), sacarosa, manitol o sorbitol. Finalmente, la
composición puede contener fosfato de sodio a una concentración
superior a 20 mM.
Aunque la solubilidad del TFPI es bastante baja
entre pH 5 y 10, se ha encontrado que la L-arginina
puede aumentar la solubilidad en un factor de 100. La solubilidad
depende mucho de la concentración de arginina, ya que 300 mM es
aproximadamente 30 veces más eficaz que 200 mM. La urea es también
muy eficaz en la solubilización del TFPI.
Además, se ha encontrado que la agregación del
TFPI parece ser la ruta de degradación principal en condiciones de
pH neutro y básico y que la fragmentación tiene lugar en condiciones
de pH ácido.
También se ha encontrado que los monómeros
activos de TFPI pueden separarse de los oligómeros de TFPI que se
producen durante el procedimiento de plegamiento del TFPI
recombinante producido por E. coli. Algunas formas
monoméricas con plegamiento erróneo/modificadas de TFPI se eliminan
también durante este procedimiento. La separación emplea la
cromatografía de interacción hidrófoba. Las especies oligoméricas
del TFPI se unen más estrechamente a una resina hidrófoba que lo que
lo hacen los monómeros activos de TFPI. Las resinas tales como
Pharmacia^{TM} Octyl-Sepharose y Toyopearl^{TM}
Butyl 650-M han resultado satisfactorias. El
procedimiento se lleva a cabo en presencia alto contenido en sal,
tal como sulfato de amonio 1 M o citrato de sodio 0.5 M.
Es un descubrimiento de los presentes inventores
que los polímeros poliiónicos tales como la polietilenimina y el
polifosfato, pueden modificar las interacciones iónicas dentro de
las proteínas. El enmascaramiento de ciertas zonas de alta densidad
de carga dentro de las proteínas usando poliiones puede tener
numerosos efectos. Las proteínas cuya solubilidad se reduce a través
de la neutralización intra y/o intermolecular de zonas cargadas de
manera opuesta pueden ver mejorada su solubilidad enmascarando una
de las regiones cargadas con policationes o poliiones. También
pueden modularse las barreras frente a la flexibilidad
conformacional y a fuerzas específicas atractivas o repulsivas que
interfieren en el procedimiento de replegamiento. Las proteínas que
requieren desnaturalizantes fuertes tales como urea o clorhidrato de
guanidina para solubilizarse y mantener la solubilidad durante las
operaciones de purificación pueden solubilizarse y procesarse de
manera eficaz utilizando poliiones.
Muchas proteínas que carecen de una región clara
de localización de carga en la secuencia primaria pueden mostrar aún
zonas de localización de carga debido a su estructura secundaria.
Por lo tanto, muchas proteínas pueden ver modificadas sus
características de solubilidad, replegamiento y purificación a
través de la interacción con moldes poliméricos cargados. La
naturaleza de la modificación dependerá de la estructura de la
proteína, la longitud de cadena, la carga y la densidad de carga del
polímero iónico específicos.
Se ha caracterizado el replegamiento del TFPI
puro en un tampón de replegamiento a base de urea o guanidina y los
resultados indican que las cinéticas y eficacias de replegamiento
pueden mejorarse significativamente mediante la adición de polímeros
cargados que incluyen heparina, sulfato de dextrano, polietilenimina
(PEI) y polifosfatos. Estos polímeros aumentan la solubilidad del
TFPI y mejoran el replegamiento a través de interacciones iónicas
con el extremo C-terminal o el
N-terminal. Además de los aditivos poliméricos, el
replegamiento del TFPI puro requiere un tampón redox
cisteína/cistina en el que pueda completarse la reacción de
replegamiento en un plazo de 8 horas. Los rendimientos de
replegamiento son una fuerte función del pH, de la concentración
redox, y de los aditivos poliméricos; sin embargo pueden conseguirse
eficacias de replegamiento para TFPI puro de hasta el 60% en
condiciones de replegamiento óptimas.
Los inventores de esta invención han encontrado
que la adición de glucosaminoglucanos o polisacáridos sulfatados
tales como, por ejemplo, heparina y sulfato de dextrano, a una
disolución que contenga una proteína desnaturalizada antes del
replegamiento aumenta la cantidad de proteína activa, correctamente
plegada, en la que la proteína puede unirse al glucosaminoglucano o
polisacárido sulfatado y se somete a condiciones
renaturalizantes.
La tecnología del ADN recombinante ha permitido
la expresión a un alto nivel de muchas proteínas que normalmente no
podían aislarse a partir de fuentes naturales en cantidades
apreciables. En E. coli y otros diversos sistemas de
expresión, la proteína se expresa frecuentemente en estado inactivo,
desnaturalizado, en el que la secuencia primaria de aminoácidos es
correcta, pero la estructura secundaria y terciaria y algunos
puentes disulfuro de cisteína no están presentes. Las proteínas
desnaturalizadas presentes en un cuerpo de inclusión pueden estar en
una conformación tal que los residuos cargados de las diferentes
partes de la estructura principal de aminoácidos que normalmente no
están en contacto, pueden interaccionar para formar enlaces iónicos
fuertes entre residuos de aminoácidos cargados positivamente y
cargados negativamente. La formación de estos enlaces iónicos puede
limitar la hidratación que debe producirse para que se lleve a cabo
la disolución del cuerpo de inclusión. La proteína en un cuerpo de
inclusión también puede complejarse con otros componentes celulares
tales como los componentes de membrana y el ácido nucleico, lo que
también puede limitar el acceso del disolvente (agua) a los residuos
cargados y normalmente hidratados. También se encontró en el estado
desplegado que estos residuos hidrófobos que normalmente se
encuentran ocultos en el interior de una proteína, están más
expuestos al entorno acuoso polar. Tales apariciones pueden
funcionar para evitar la disolución de los cuerpos de inclusión en
disolventes distintos a los agentes caotrópicos fuertes, tales como
urea o guanidina o detergentes tales como SDS.
Los polímeros cargados preferiblemente en
disolución acuosa pueden interferir con y romper las interacciones
iónicas no deseadas que se producen dentro de una cadena
polipeptídica tal como se encuentran en un cuerpo de inclusión u
otro entorno. Los polímeros cargados también pueden ayudar a romper
las interacciones iónicas no deseadas y a facilitar la solvatación
de los residuos iónicos y polares, potenciando la disolución sin
necesidad de detergentes o caótropos fuertes. La carga, la densidad
de carga y el peso molecular (longitud de la cadena) del polímero
cargado pueden variar dependiendo de la proteína específica. Los
polímeros adecuados incluyen: polisacáridos sulfatados, heparinas,
sulfatos de dextrano, agaropeptinas, polisacáridos de ácido
carboxílico, ácidos algínicos, carboximetilcelulosas, compuestos
poliinorgánicos, polifosfatos, poliaminoácidos, poliaspartatos,
poliglutamatos, polihistidinas, compuestos poliorgánicos,
polisacáridos, dextranos DEAE, poliaminas poliorgánicas,
polietileniminas, polietileniminocelulosas, poliaminas,
poliaminoácidos, polilisinas y poliargininas.
Las proteínas con pI mayor de 7 pueden
beneficiarse más de las interacciones con los polímeros cargados
negativamente, ya que estas proteínas tendrán una carga positiva a
pH 7. Las proteínas con pI inferior a 7 pueden interaccionar más
fuertemente con polímeros cargados positivamente a pH neutro. El
cambio del pH de la disolución modificará la carga total y la
distribución de carga de cualquier proteína, y es otra variable que
debe evaluarse.
La tecnología del ADN recombinante ha permitido
la expresión a un alto nivel de muchas proteínas que normalmente no
podían aislarse a partir de fuentes naturales en cantidades
apreciables. En E. coli y otros diversos sistemas de
expresión, la proteína se expresa frecuentemente en estado inactivo,
desnaturalizado, en el que la secuencia primaria de aminoácidos es
correcta, pero la estructura secundaria y terciaria y algunos
puentes disulfuro de cisteína no están presentes. La proteína
desnaturalizada debe replegarse en la conformación activa apropiada,
lo que a menudo requiere vencer significativas barreras de energía
impuestas por la atracción y la repulsión iónicas, restricciones en
la rotación de los enlaces y otros tipos de tensiones inducidas
conformacionalmente. La atracción iónica específica entre cargas
opuestas y/o la repulsión entre las cargas iguales puede limitar
enormemente las rutas de replegamiento disponibles para la proteína
desnaturalizada y reducir la eficacia del proceso de
replegamiento.
Algunas proteínas tienen zonas específicas de
carga cuyas interacciones pueden limitar la flexibilidad
conformacional o potenciar la agregación. Muchas proteínas que
carecen de una región clara de localización de carga en la secuencia
primaria pueden demostrar todavía zonas de localización de carga
debido a su estructura secundaria encontradas en los productos
intermedios de replegamiento, plegamientos erróneos y proteína
plegada de manera incorrecta. Proteínas para su uso en la presente
invención son TFPI, muteínas de TFPI y TFPI-2. En el
caso del TFPI, así como para otras proteínas, dos dominios cargados
opuestamente interaccionan entre sí para impedir el plegamiento
adecuado y para producir la oligomerización y la agregación.
Los polímeros cargados pueden utilizarse para
modificar la carga, la densidad de carga y reducir o eliminar las
limitaciones mediadas iónicamente a la conformación que pueden
surgir en el estado desplegado. La yuxtaposición de grupos cargados
que no están normalmente en proximidad puede dar como resultado
rutas de replegamiento que no llevan a nada a partir de las cuales
pueden no recuperarse nunca los procesos de replegamiento.
La introducción de cargas extras positivas o
negativas mediante la complejación con polímeros cargados puede
permitir que el replegamiento continúe fácilmente por diversos
motivos: en primer lugar, diferentes tipos de distribuciones de
carga pueden satisfacer mejor los procesos de replegamiento; en
segundo lugar, la adición del polímero cargado puede potenciar la
solubilidad de la proteína desplegada, reduciendo o eliminando la
necesidad de caótropos que tienen un efecto negativo sobre la
conformación de la proteína.
Debido a la estructura frecuentemente única
asociada con la mayoría de las proteínas, puede variar el polímero
cargado que demuestras las características preferidas. La evaluación
del pH isoeléctrico (pI) de la proteína puede servir como punto de
partida. A pH neutro, una proteína con un pI inferior a 7 tendrá una
carga neta negativa y, por tanto, será más probable que se una a un
polímero cargado positivamente. La proteína con un pI superior a 7
tendrá una carga neta positiva a pH neutro y tendrá una tendencia
más fuerte a unirse a un polímero cargado negativamente. Sin
embargo, está bien establecido que las cargas se distribuyen de
manera no uniforme en una proteína y puede producirse una
localización de carga significativa. La posibilidad de
concentraciones localizadas de cargas reduce la capacidad para
predecir qué tipo de polímero cargado puede ser más eficaz para
cualquier aplicación. Teóricamente, para cualquier proteína con una
distribución de cargas que interaccionan y requisitos
conformacionales específicos, existe un polímero cargado de
composiciones apropiadas en lo que se refiere al peso molecular, la
carga y la distribución de la carga, lo que maximizaría la eficacia
del replegamiento. También se evaluarían otras variables, tales como
el pH y la fuerza iónica del disolvente. La selección inicial
incluiría polietilenimina, DEAE dextrano, sulfato de dextrano y
polifosfato a diferentes concentraciones y pesos moleculares. El
trabajo con el rhTFPI ha demostrado el efecto significativo que
pueden tener la longitud de la cadena de polifosfato y la
concentración en el transcurso de la reacción de replegamiento del
TFPI. Una longitud de cadena relativamente corta (n = 5) produce
altos niveles de agregado. La longitud de cadena de polifosfato
óptima para replegar el rhTFPI fue aproximadamente de 25 unidades de
repetición. Los polifosfatos de longitud de cadena más larga (n =
75) también produjeron más agregados y menos monómeros plegados
apropiadamente.
Las proteínas consisten en cadenas de
aminoácidos, cuya composición y secuencia exactas constituye uno de
los primeros determinantes de la estructura primaria de la proteína.
El determinante secundario de la estructura de la proteína es el
resultado de la orientación conformacional que los enlaces entre
aminoácidos individuales tienen en la conformación de la proteína.
En tercer lugar, la secuencia de aminoácidos específica dirige la
formación de las estructuras terciarias tales como láminas \beta y
hélices \alpha. La naturaleza tridimensional de la conformación de
la proteína a menudo aproxima residuos de aminoácidos que
normalmente no están cerca entre sí basándose en la secuencia
directa de la cadena polipeptídica. La forma funcional de una
proteína generalmente es una conformación modestamente estable que
se mantiene junta mediante una combinación de enlaces disulfuro de
cisteína, enlaces iónicos e interacciones hidrófobas y de Van der
Waals.
En general, la solubilidad de la proteína puede
estar relacionada con el número de aminoácidos cargados y, en menor
grado, polares, que constituyen la proteína. Estos grupos cargados y
polares llegan a solvatarse con moléculas de agua en la disolución
acuosa y esta interacción mantiene la cadena polipeptídica en
disolución. Los polipéptidos con un número insuficiente de
aminoácidos cargados positiva o negativamente pueden tener
solubilidad acuosa limitada. En algunos casos, los grupos cargados
positiva y negativamente en una proteína pueden interaccionar entre
sí, desplazando el agua de solvatación y conduciendo a una reducción
de la solubilidad en agua. Muchas proteínas que carecen de una
región clara de localización de carga en la secuencia primaria
pueden demostrar todavía zonas de localización de carga debido a su
estructura secundaria. Por tanto, muchas proteínas pueden tener la
solubilidad modificada mediante la interacción con moldes
poliméricos cargados. La naturaleza de la modificación dependerá de
la estructura específica de la proteína, la longitud de la cadena,
la carga y la densidad de la carga del polímero iónico.
La complejación con polímeros cargados con
densidad de carga relativamente alta representa un enfoque para
aumentar la densidad de carga de una proteína. Una proteína con un
menor número de residuos cargados positivamente (lisina o arginina)
puede complejarse con un polímero cargado negativamente, tal como
polifosfato. Algunos de los grupos cargados negativamente del
polímero interaccionarán con los grupos cargados positivamente
presentes en la proteína. Los grupos cargados restantes en el
polímero estarán libres para interaccionar con el disolvente, en la
mayoría de los casos agua, y aumentan eficazmente la densidad de
carga y la solvatación de la proteína. Alternativamente, puede
utilizarse un polímero cargado positivamente, tal como
polietilenimina, para formar complejos con los residuos cargados
negativamente de la proteína. En algunos casos, ambos tipos de
polímeros cargados pueden funcionar con igual eficacia, en otros
casos, un tipo de carga puede ser más eficaz que otras. La eficacia
de cualquier polímero cargado particular, dependerá de la
composición de aminoácidos de la proteína, de la distribución de
aminoácidos en la proteína, de la conformación de la proteína, de la
densidad de carga del polímero cargado, de la longitud de la cadena
del polímero cargado, del pH de la disolución y de otras variables.
Sin embargo, es probable que para cualquier proteína dada pueda
encontrarse un polímero cargado complementario que se unirá a la
proteína y aumentará esencialmente la densidad de carga de la
proteína, lo que mejorará las características de solubilidad de esa
proteína en el medio acuoso.
El término "tratamiento", tal como se usa en
el presente documento, se refiere a las etapas incluidas en la
purificación y la preparación de cantidades farmacéuticamente
aceptables de proteínas. El tratamiento puede incluir una o más
etapas tales como solubilización, replegamiento, separación
cromatográfica, precipitación y formulación.
El término "polímero cargado" y "molde
polimérico cargado" se refiere a cualquier compuesto constituido
por una estructura principal de unidades estructurales de repetición
unidas de forma lineal o no lineal, conteniendo algunas de dichas
unidades de repetición grupos químicos cargados positiva o
negativamente. Las unidades estructurales de repetición pueden ser
de naturaleza de polisacárido, hidrocarbonada, orgánica o
inorgánica. Las unidades de repetición pueden oscilar desde n = 2
hasta n = varios millones.
El término "polímero cargado positivamente",
tal como se usa en el presente documento, se refiere a polímeros que
contienen grupos químicos que llevan, pueden llevar, o pueden
modificarse para que lleven, una carga positiva tales como amonio,
alquilamonio, dialquilamonio, trialquilamonio y amonio
cuaternario.
El término "polímero cargado negativamente",
tal como se usa en el presente documento, se refiere a polímeros que
contienen grupos químicos que llevan, pueden llevar, o pueden
modificarse para que lleven, una carga negativa tales como derivados
de ácido fosfórico y otros ácidos que contienen fósforo, ácido
sulfúrico y otros ácidos que contienen azufre, nitrato y otros
ácidos que contienen nitrógeno, ácido fórmico y otros ácidos
carboxílicos.
El término "polietilenimina", tal como se
usa en el presente documento, se refiere a polímeros que consisten
en unidades de repetición de etilenimina
(H_{3}N^{+}-(CH_{2}-CH_{2}-NH_{2}^{+})_{x}-CH_{2}-CH_{2}-NH_{3}^{+}).
El peso molecular puede variar desde 5.000 hasta superior a
50.000.
El término "polifosfato", tal como se usa en
el presente documento, se refiere a polímeros que consisten en
unidades de repetición de ortofosfato unidas en un enlace
fosfo-anhídrido. El número de unidades de repetición
puede oscilar desde 2 (pirofosfato) hasta varios miles. El
polifosfato se denomina frecuentemente hexametafosfato de sodio
(SHMP). Otros nombres comunes incluyen sal de Grahams, Calgon,
vidrio al fosfato, tetrametafosfato de sodio, y Glass H.
El término "replegamiento", tal como se usa
en el presente documento, se refiere a la renaturalización de la
proteína. Normalmente, el objetivo del replegamiento es producir una
proteína que tiene un nivel de actividad superior al que tendría la
proteína si se produjera sin una etapa de replegamiento. Una
molécula de proteína plegada es más estable en la conformación que
tiene la menor energía libre. La mayoría de las proteínas solubles
en agua se pliegan de manera que la mayor parte de los aminoácidos
hidrófobos estén en la parte interior de la molécula, lejos del
agua. Los enlaces débiles que mantienen una proteína junta pueden
romperse mediante varios tratamientos que hacen que un polipéptido
se despliegue, es decir, se desnaturalice. Una proteína plegada es
el producto de varios tipos de interacciones entre los propios
aminoácidos y su entorno, incluyendo enlaces iónicos, interacciones
de Van der Waals, enlaces de hidrógeno, enlaces disulfuro y enlaces
covalentes.
El término "desnaturalizar", tal como se usa
en el presente documento, se refiere al tratamiento de una proteína
o polipéptido que da como resultado la rotura de los enlaces iónicos
y covalentes y las interacciones de Van der Waals que existen en la
molécula en su estado nativo o renaturalizado. La desnaturalización
de una proteína puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el
tratamiento con urea 8 M, agentes reductores tales como
mercaptoetanol, calor, pH, temperatura y otros compuestos químicos.
Reactivos tales como urea 8 M rompen tanto los enlaces de hidrógeno
como los hidrófobos, y si también se añade mercaptoetanol, los
puentes disulfuro (S-S) que se forman entre las
cisteínas se reducen a dos grupos -S-H. El
replegamiento de las proteínas que contienen enlaces disulfuro en su
estado nativo o renaturalizado también pueden incluir la oxidación
de los grupos -S-H presentes en los residuos de
cisteína para que la proteína vuelva a formar los enlaces
disulfuro.
El término "glucosaminoglucano", tal como se
usa en el presente documento, se refiere a polisacáridos que
contienen residuos alternos de ácido urónico y hexosamina y
normalmente contienen sulfato. La unión de una proteína en una
reacción de replegamiento tal como se describe en el presente
documento, a un glucosaminoglucano, es mediante interacciones
iónicas.
El término "sulfato de dextrano", tal como
se usa en el presente documento, se refiere a un derivado
polianiónico del dextrano, que oscila en peso molecular desde 8.000
hasta 500.000 Dalton. Los dextranos son polímeros de glucosa en los
que los residuos de glucosa se unen mediante enlaces
\alpha-1,6.
El término "heparina", tal como se usa en el
presente documento, se refiere a 2 glucosaminoglucanos o
heparinoides que están basados en un disacárido de repetición
(-4DGlcA(p)\beta1, 4GlcNAc\alpha1-)_{n} pero que
se someten a amplia modificación tras la unión. La heparina se
almacena con histamina en gránulos de mastocitos y de esta forma se
encuentra en la mayor parte del tejido conjuntivo. En general, las
heparinas tienen cadenas mas cortas que la
heparina.
heparina.
El término "HIC", tal como se usa en el
presente documento, se refiere a cromatografía de interacción
hidrófoba que emplea una interacción hidrófoba entre la columna y la
molécula de interés para separar los polisacáridos sulfatados y
otros contaminantes del producto replegado A.
Los polímeros cargados negativamente incluyen
polisacáridos sulfatados, tales como heparinas, sulfatos de dextrano
y agaropectinas, así como polisacáridos de ácido carboxílico tales
como ácidos algínicos y carboximetilcelulosas. También se incluyen
compuestos poliinorgánicos, tales como polifosfonatos. También
pueden utilizarse poliaminoácidos tales como poliaspartato,
poliglutamato y polihistidina.
Los polímeros cargados positivamente incluyen
polisacáridos tales como DEAE dextrano, aminas poliorgánicas tales
como polietileniminas, polietileniminocelulosas y poliaminas, así
como poliaminoácidos, polilisina y poliarginina. Pueden utilizarse
combinaciones de polímeros, de cualquier polaridad de carga. Además,
también pueden utilizarse copolímeros anfóteros.
Tal como se usa en el presente documento,
"TFPI" se refiere al inhibidor de la ruta del factor tisular
maduro. Tal como se observó anteriormente, el TFPI también se conoce
en la técnica como inhibidor de la coagulación asociado a
lipoproteínas (LACI), inhibidor de la ruta extrínseca (EPI) e
inhibidor del factor tisular (TFI). Las muteínas de TFPI que
mantienen la actividad biológica de TFPI se engloban en esta
definición. Además, también se engloba en la definición el TFPI que
se ha modificado ligeramente para la producción en células
bacterianas. Por ejemplo, se ha producido un análogo de TFPI que
tiene un residuo de alanina en el extremo
amino-terminal del polipéptido TFPI en
Escherichia coli. Véase el documento U.S. 5.212.091.
Tal como se usa en el presente documento,
"composición farmacéuticamente aceptable" se refiere a una
composición que no invalida ni reduce la actividad biológica del
TFPI formulado y que no tiene ningún efecto biológico adverso cuando
se administra TFPI formulado a un paciente.
Tal como se usa en el presente documento,
"paciente" engloba pacientes humanos y veterinarios.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "solubilizante" se refiere a sales, iones, hidratos de
carbono, aminoácidos y otras moléculas orgánicas. Debe observarse
que los solubilizantes pueden actuar como agentes estabilizantes.
Los agentes estabilizantes conservan la actividad unitaria del TFPI
en almacenamiento y pueden actuar evitando la formación de agregados
o evitando la degradación de la molécula de TFPI (por ejemplo,
mediante reacciones catalizadas por ácido).
Tal como se usa en el presente documento, el
término "solubilizantes secundarios" se refiere a sales
orgánicas, iones, hidratos de carbono, aminoácidos y otras moléculas
orgánicas, que presentes en disolución con un solubilizante,
aumentan adicionalmente la solubilidad del TFPI. Los solubilizantes
secundarios también pueden tener otros efectos. Por ejemplo, los
estabilizantes secundarios pueden ser útiles ajustando la tonicidad
(por ejemplo, hasta la isotonicidad).
La secuencia de aminoácidos de TFPI se describe
en la patente de los EE.UU. número 5.106.833 y en la figura 4. Las
muteínas del TFPI y del TFPI-2 se describen en el
documento de los EE.UU. con número de serie 08/286.530. También se
describe en el documento de los EE.UU. con número de serie
08/286.530, que pueden prepararse muteínas del TFPI y el
TFPI-2, con mutaciones puntuales individuales o
múltiples, y moléculas quiméricas del TFPI y el
TFPI-2. Por ejemplo, el residuo de lisina en el
sitio P1 del primer dominio tipo Kunitz del TFPI puede sustituirse
con arginina. Las muteínas que contienen de una a cinco
sustituciones de aminoácidos, pueden prepararse mediante mutagénesis
apropiada de la secuencia del vehículo de clonación recombinante que
codifica para el TFPI o el TFPI-2. Las técnicas para
la mutagénesis incluyen, sin limitación, mutagénesis específica de
sitio. La mutagénesis específica de sitio puede llevarse a cabo
utilizando cualesquiera de varios procedimientos conocidos en la
técnica. Estas técnicas se describen por Smith (1985) Annual
Review of Genetics, 19:423, y modificaciones de algunas de estas
técnicas se describen en METHODS IN ENZYMOLOGY, 154, parte E, (eds.)
Wu y Grossman (1987), capítulos 17, 18, 19 y 20. Un procedimiento
preferido cuando se utiliza mutagénesis específica de sitio es una
modificación del método de mutagénesis dirigida al sitio de Gapped
Duplex (ADN dúplex discontinuo). El procedimiento general se
describe por Kramer, et al., en el capítulo 17 de Methods in
Enzymology, citado anteriormente. Otra técnica para generar
mutaciones puntuales en una secuencia de ácido nucleico es PCR de
solapamiento. El procedimiento para utilizar PCR de solapamiento
para generar mutaciones puntuales se describe por Higuchi en el
capítulo 22 de PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS,
(eds.) Innis, Gelfand, Sninsky y White (Academic Press, 1990).
Alternativamente, podrían producirse proteínas
híbridas que contienen el primer dominio tipo Kunitz del
TFPI-2 y el segundo y tercer dominios tipo Kunitz
del TFPI. Un experto en la técnica de la clonación de ADN que posea
el ADN que codifica para TFPI y TFPI-2 podría
preparar moléculas de ADN adecuadas para la producción de tal
proteína quimérica utilizando procedimientos de clonación conocidos.
Alternativamente, pueden prepararse moléculas de ADN sintético que
codifican para parte o todo de cada uno de los dominios de tipo
Kunitz y las secuencias peptídicas que se unen a los dominios tipo
Kunitz. Como otra alternativa, la técnica de PCR de solapamiento
también puede utilizarse para preparar ADN que codifica para
moléculas quiméricas que contienen secuencias del TFPI y el
TFPI-2.
El TFPI puede prepararse en sistemas de expresión
de levaduras tal como se describe en el documento de los EE.UU.
número de serie 08/286.530 que se incorpora al presente documento
como referencia. También se han descrito métodos para la
purificación del TFPI a partir de medio de cultivo celular de
levaduras, tal como en Petersen et al, J. Biol. Chem.
18:1334.4-13351 (1993). En estos casos, el TFPI
recombinante se secreta de la célula de levadura. El TFPI recuperado
en tales protocolos también es frecuentemente heterogéneo, debido a
la modificación en el extremo N-terminal, a la
degradación proteolítica y a la glucosilación variable. Por tanto,
existe una necesidad en la técnica para producir TFPI maduro que sea
auténtico, (es decir, que tenga la secuencia correcta de aminoácidos
en el extremo N-terminal), de longitud completa y
homogéneo.
El TFPI puede producirse en E. coli tal
como se describe en la patente de los EE.UU. número 5.212.091 que
describe un método de producir TFPI mediante la expresión de una
forma no glucosilada de TFPI en un huésped de E. coli.
En un aspecto de la invención, se repliegan el
TFPI, la muteína de TFPI o el TFPI-2 que pueden
unirse a polímeros de polisacáridos sulfatados tales como, por
ejemplo, heparina o sulfato de dextrano. La invención proporciona un
método que facilita el replegamiento del TFPI, muteína de TFPI o
TFPI-2 desnaturalizados, utilizando polímeros de
polisacáridos sulfatados que actúan como moldes para replegar la
proteína. Sin limitarse a ninguna teoría particular, los inventores
creen que las interacciones entre la proteína en replegamiento y el
molde polimérico puede minimizar la agregación de los productos
intermedios de replegamiento y proporcionar un entorno para que la
proteína se repliegue en su conformación nativa. El polímero que
actúa como molde puede unirse a un dominio o región de la proteína
para estabilizar el producto intermedio y permitir que se produzca
el plegamiento adicional sin agregación. Los agregados de proteína,
si se forman, son generalmente menos activos que la proteína
replegada no agregada y generalmente dan como resultado un
rendimiento general reducido de la proteína replegada activa. La
concentración de NaCl de las condiciones de replegamiento se
considera importante y se selecciona para lograr la eficacia máxima
del replegamiento maximizando la interacción entre el molde
polimérico y la proteína de replegamiento. Por ejemplo, los
inventores han encontrado que una concentración de aproximadamente
0,2 M de NaCl o inferior potencia la unión del extremo
C-terminal y/o el tercer dominio Kunitz del TFPI a
heparina u otro polímero de polisacárido sulfatado. Se supone que la
unión del polímero al producto intermedio facilita la solubilidad
del producto intermedio y proporciona un entorno para que el resto
de la proteína se repliegue reduciendo la agregación de los
productos intermedios de replegamiento.
El TFPI puede prepararse mediante métodos
recombinantes, tal como se describe en el documento U.S. 5.212.091,
cuya descripción se incorpora al presente documento como referencia.
En resumen, el TFPI se expresa en células de Escherichia coli
y los cuerpos de inclusión que contienen el TFPI se aíslan del resto
del material celular. Los cuerpos de inclusión se someten a
sulfitólisis, se purifican utilizando cromatografía de intercambio
iónico, se repliegan mediante reacción con intercambio de disulfito
y el TFPI replegado y activo se purifica mediante cromatografía de
intercambio catiónico. El TFPI también puede producirse en
levaduras, tal como se describe en el documento U.S.S.N. 08/286.530
en tramitación junto con la presente.
La actividad del TFPI puede probarse mediante el
ensayo de tiempo de protrombina (ensayos TTP). Se midió la
bioactividad de TFPI mediante el tiempo de coagulación de
protrombina usando un modelo RA4
Coag-A-Mate de Organon Teknika
Corporation (Oklahoma City, OK). Las muestras de TFPI se diluyeron
primero a de 9 a 24 ug/mL con un tampón TBSA (Tris 50 mM, NaCl 100
mM, BSA 1 mg/mL, pH 7,5). A continuación se mezclaron 10 uL de
Varify 1 (plasma normal combinado de Organon Teknika Corp.) con 90
uL de muestras de TFPI diluido en una bandeja de muestra y se
calentó a 37ºC en el instrumento. Finalmente se añadió Simplastin
Excell (tromboplastina de Organon Teknika Corp.) para comenzar la
coagulación. Se midió el retraso de tiempo en la coagulación debido
a la actividad anticoagulante del TFPI y se convirtió en
concentración de TFPI en las muestras medidas por comparación con
una curva patrón de TFPI.
La cantidad de TFPI soluble también puede
cuantificarse midiendo el área del pico principal en un cromatograma
de intercambio catiónico. Se realizó el análisis de HPLC de las
muestras de TFPI utilizando un sistema Waters 626 LC (Waters
Corporation, Milford, MA) equipado con un inyector automático de
calentamiento/enfriamiento Waters 717 plus. La obtención de los
datos se trató mediante un sistema Turbochrom^{MR} de
Perkin-Elmer.
El método de intercambio catiónico (IEX) utilizó
una columna de vidrio de Pharmacia Mono S HR 5/5. La columna se
equilibró en 80% de tampón A (disolución de acetato de sodio
trihidratado 20 mM: acetonitrilo (70:30 v/v) a pH 5,4) y 20% tampón
B (disolución de acetato de sodio trihidratado 20 mM - cloruro de
amonio 1,0 M: acetonitrilo (70:30 v/v) a pH 5,4). Una vez inyectada
una muestra, se aplicó un gradiente para eluir el TFPI a una
velocidad de flujo de 0,7 mL/min desde el 20% de tampón B hasta el
85% de tampón B en 21 minutos. Las muestras de TFPI en elución se
detectaron mediante absorbancia a 214 nm. Se encontró que el pico
principal (TFPI monomérico) eluía a aproxima-
damente 18 minutos. La pérdida de TFPI soluble se cuantificó integrando el área de pico restante del pico principal.
damente 18 minutos. La pérdida de TFPI soluble se cuantificó integrando el área de pico restante del pico principal.
Todos los reactivos son de calidad U.S.P. o
A.C.S. Los proveedores incluyen J.T. Baker y Sigma Co. (St. Louis,
MO).
La presente invención se ilustrará ahora haciendo
referencia a los siguientes ejemplos, que exponen ciertas
realizaciones. Sin embargo, debe observarse que estas realizaciones
son ilustrativas y no se interpretan como limitativas de la
invención en modo alguno.
El siguiente ejemplo describe la preparación de
disoluciones madre, la preparación de la columna de HIC, la
recuperación inicial y la purificación del TFPI antes del
replegamiento, el replegamiento del TFPI y la recuperación de TFPI
activo.
La reserva de TFPI se preparó a partir de cuerpos
refringentes resultantes de la expresión de TFPI recombinante en
bacterias. Se solubilizaron los cuerpos refringentes a 10 mg/ml en
urea 8 M, Tris 50 mM, pH 8,5 que contenía DTT 10 mM, y se aclaró
esta disolución por centrifugación a 10,000 x g durante 10
minutos.
La preparación de la columna para la purificación
inicial del TFPI disuelto se preparó con perlas de
S-Sepharose mezcladas en urea 7,5 M, Tris 10 mM y
fosfato de sodio 10 mM (pH 6,5) que contenía DTT 5 mM y EDTA 1 mM.
Se pasó entonces el TFPI solubilizado a una concentración de 5 mg/ml
por la columna de S-Sepharose y se eluyó con un
gradiente de cloruro de sodio de 0 a 1 M. El TFPI purificado tenía
una absorbancia a una longitud de onda de 280 nm de 3,2 (lo que es
equivalente a 4,1 mg/ml usando un coeficiente de extinción de
0,78).
La reserva de sulfato de dextrano consistía en
sulfato de dextrano de 8.000 Dalton de peso molecular disponible de
Sigma, artículo número D-4911, preparado a 50 mg/ml
(6,25 mM) en Tris 50 mM (pH 8,8) en cloruro de sodio 0,1 M, y
almacenado a -20 grados centígrados entre usos.
La reserva de heparina, si se usó heparina para
llevar a cabo el replegamiento, tenía un peso molecular de 6.000 a
30.000 Dalton, (con un peso molecular promedio de 18.000 Dalton)
preparada como sal de sodio disponible de Sigma Co. (St. Louis, MO),
artículo número H-3393, preparada a 60 mg/ml (3,33
mM) en Tris 50 mM (pH 8,8) en cloruro de sodio 0,1, y almacenado a
-20ºC entre usos.
Se puede añadir o bien disolución madre de
sulfato de dextrano o bien disolución madre de heparina al TFPI
purificado con S-Sepharose. Se añadió dextrano o
heparina al TFPI en condiciones desnaturalizantes en urea de 6 a 8
M. Con los reactivos a 4ºC, la disolución desnaturalizante que
contenía el TFPI se diluyó con urea 3 M, Tris 50 mM (pH 8,8),
cloruro de sodio 0,2 M, y TFPI 0,5 mg/ml, y hasta una concentración
final de sulfato de dextrano de 0,6 mg/ml (75 \muM) o una
concentración final de heparina de 1,5 mg/ml (83 \muM),
dependiendo de cuál se usó para facilitar el replegamiento. Se
añadió cisteína a la disolución de replegamiento hasta una
concentración final igual a la concentración final de DTT. Se incubó
la disolución de replegamiento a 4ºC con suave agitación durante
desde 4 hasta 6 días, preferiblemente 5 días.
Lo siguiente es un detalle de un protocolo para
el replegamiento de 5 ml de una disolución de TFPI en sulfato de
dextrano o heparina, como una ilustración de este procedimiento.
Se añadieron o bien 60 \mul de sulfato de
dextrano con 65 \mul de Tris 50 mM (pH 8,8) en NaCl 0,1 M o bien
125 \mul de disolución madre de heparina con Tris 50 mM (pH 8,8) o
NaCl 0,1 M a 610 \mul de reserva de TFPI. Se mezcló la disolución
de replegamiento y se dejó incubar durante 10 minutos en hielo.
Después, se añadieron 4,2 ml de tampón de replegamiento que contenía
urea 2,5 M, Tris 50 mM (pH 8,8) y cloruro de sodio 165 mM a la
disolución de replegamiento y se mezcló. Finalmente, se añadieron 61
\mul de cisteína 50 mM preparada en hidróxido de sodio 120 mM y la
disolución total se incubó a 4ºC con suave agitación durante 4 días.
Se comprobó el contenido en sulfhidrilo libre con reactivo de Ellman
(también denominado DTNB). Se añadió yodoacetamida, hasta 20 mM,
preparada a 1 M en etanol al 100% para su almacenamiento a
-20ºC.
Se preparó la columna de interacción hidrófoba
(HIC) a partir de la resina Butyl-650M Tosohaas
Toyopearl de tamaño de partícula 40-90, pieza nº
014702. Se lavó la resina de butilo en urea 3 M, sulfato de amonio 1
M, Tris 50 mM, fosfato de sodio 10 mM, pH 6,5 y se resuspendió en
una suspensión al 50%.
Las muestras de replegamiento, almacenadas a
-20ºC permanecieron en el tampón de replegamiento habitual que
contiene urea 3 M, Tris 50 mM, pH 8,8, redox 1-4 mM,
TFPI 0,5 mg/ml y NaCl 0,2-0,6 M dependiendo en las
condiciones. Las muestras replegadas con dextrano o heparina tenían
sal 0,2 M, y las muestras sin dextrano o heparina tenían NaCl 0,6
M.
Se llevaron a cabo las siguientes etapas a
temperatura ambiente para efectuar una purificación adicional del
TFPI replegado. Se añadió un volumen igual de sulfato de amonio 2 M,
urea 3 M, Tris 50 mM y fosfato de sodio 10 mM (pH 6,5) a 300 \mul
de muestra replegada. Después, se añadieron 100 \mul de perlas
Butyl-650M lavadas a la muestra de replegamiento
diluida. Se incubó la disolución con las perlas con oscilación o
mezclado suave durante 30 minutos a temperatura ambiente. Entonces,
se centrifugó la mezcla en una centrífuga Ependorf durante 5
segundos, y se puso en un soporte y se dejó reposar durante un
minuto para que las perlas se depositasen en el tubo. Se aspiró
cuidadosamente el sobrenadante, para no alterar las perlas.
Para lavar las perlas con el TFPI unido, se
añadió 1 ml de tampón de lavado compuesto por sulfato de amonio 1 M,
urea 3 M, Tris 50 mM, fosfato de sodio 10 mM (pH 6,5) a las perlas
para eliminar el sulfato de dextrano o la heparina restantes. Se
volvió a centrifugar la mezcla lavada en una centrífuga Ependorf
durante 5 segundos, y se dejó reposar durante un minuto para que las
perlas se depositasen como anteriormente. Se retiró el sobrenadante,
y entonces se lavaron las perlas con el tampón de lavado una última
vez, y se centrifugaron y dejaron reposar como anteriormente. Tras
el último lavado y la sedimentación, el sobrenadante se retiró muy
cuidadosamente con una pipeta Pasteur con la punta modelada a la
llama.
Para eluir el TFPI replegado, se añadieron 300
\mul de tampón de elución compuesto por urea 3 M, sulfato de
amonio 0,1 M, Tris 50 mM y fosfato de sodio 10 mM (pH 6,5) a la
suspensión de perlas y se osciló durante más de 10 minutos. Se
sedimentaron las perlas por centrifugación en una centrifuga
Ependorf, y se recuperó el sobrenadante que contenía el TFPI
replegado. Para evitar la contaminación de las perlas con el
producto, se dejó parte del sobrenadante.
Se renaturalizó la muestra de TFPI a una
concentración de 0,5 mg/ml de TFPI, 0,6 mg/ml de sulfato de
dextrano, urea 3 M, NaCl 200 mM y Tris 50 mM (pH 5,5). Se preparó la
columna de HIC a partir de perlas de TosoHaas Butyl para HIC, 4,6
mmD/100 mml en una suspensión de 1,66 ml. La velocidad de flujo se
ajustó a 1,0 ml/min. Antes de cargar la columna de HIC, se diluyó la
muestra 2:3 con urea 3,0 M y NH_{4}SO_{4} 3,0 M a un pH final de
5,68; se cargaron 2 ml de muestra. El inicio del gradiente era MES
33 mM/HEPES 33 mM/acetato de sodio 33 mM, NH_{4}SO_{4} 1,0 M, y
urea 3,0 M, pH 6,0; el final del gradiente era MES 33 mM/HEPES 33
mM/acetato de sodio 33 mM, urea 3,0 M a pH 6,0. El volumen del
gradiente fue de 5,0 VC (volúmenes de columna). A partir de esta
columna, la recuperación de TFPI nativo fue del 68%. Los resultados
de esta serie se muestran en la figura 2.
También se realizó una serie con una segunda
columna de HIC. Se diluyó 2:3 la muestra de TFPI desnaturalizado con
urea 3,0 M, NH_{4}SO_{4} 1,5 M y se cargaron dos ml. El inicio
del gradiente era MES 33 mM/HEPES 33 mM/acetato de sodio 33 mM,
NH_{4}SO_{4} 0,5 M, y urea 3,0 M, pH 6,0; el final del gradiente
era MES 33 mM/HEPES 33 mM / acetato de sodio 33 mM, urea 3,0 M a pH
6,0. El volumen del gradiente fue de 5,0 VC. La recuperación de TFPI
nativo a partir de esta segunda columna fue del 74%. Los resultados
de esta serie se muestran en la figura 3.
Se analizaron las mezclas por
SDS-PAGE no reductora tal como se ilustra en la
figura 1. Se ven especies de TFPI activas, correctamente replegadas
(banda principal) en el gel.
Se dializaron aproximadamente 10 mg/ml de TFPI en
urea 2 M frente a uno de los siguientes: acetato 20 mM, fosfato 20
mM, citrato 20 mM, glicina 20 mM, L-glutamato 20 mM
o succinato 20 mM en NaCl 150 mM, tal como se describió
anteriormente. Se cargó TFPI 6-10 mg/ml de la
reserva a granel en tubos de diálisis Spec/Por 7 (punto de corte de
PM de 3.500). Se llevó a cabo la diálisis o bien a 4ºC o bien a
temperatura ambiente. Se realizaron tres cambios de tampón en una
disolución de proteína hasta una razón de tampón de 1 a
50-100 durante el transcurso de la diálisis a lo
largo de un periodo de tiempo de 12 a 24 h. Tras la diálisis, se
filtró la disolución de TFPI mediante unidades de filtración Costar
de 0,22 micras para separar el TFPI precipitado del TFPI soluble.
Entonces, se midió la solubilidad del TFPI mediante su absorbancia
UV/Vis asumiendo una absortividad de 0,68 (mg/ml)^{-1}
cm^{-1} a 278 nm. Se prepararon las disoluciones a varios niveles
de pH mediante valoración con HCl o NaOH.
Tras completarse la diálisis, se filtraron los
precipitados a través de unidades de filtración de 0,22 \mum. Se
midió la concentración del TFPI soluble restante tras la diálisis
mediante su absorbancia UV. La figura 1 muestra los resultados de
estos experimentos. La solubilidad del TFPI aumentaba enormemente en
disoluciones que contenían acetato 20 mM, fosfato 20 mM,
L-glutamato 20 mM y succinato 20 mM a niveles de pH
inferiores a 7 y particularmente a pH 4,5 o inferior. También
aumentó sustancialmente la solubilidad del TFPI en disoluciones que
contenían glicina 20 mM por encima de pH 10. La figura 2 muestra la
solubilidad del TFPI como una función de la concentración de ion
citrato en presencia de fosfato de Na 10 mM a pH 7. La solubilidad
del TFPI aumenta al aumentar la concentración de citrato. La figura
3 muestra la solubilidad del TFPI como una función de la
concentración de NaCl a pH 7,0. La solubilidad del TFPI aumenta al
aumentar la concentración de sal, lo que indica que la sal fomenta
la solubilidad del TFPI.
Se estudió la solubilidad del TFPI usando varios
solubilizantes y solubilizantes secundarios diferentes. La tabla 1
muestra la solubilidad del TFPI en varias disoluciones tampón medida
mediante su absorbancia UV tras diálisis de TFPI de 6 a 10 mg/ml en
estas disoluciones tampón.
Efecto de la sal | Solubilidad | |
Contenido | pH | c (mg/ml) uv |
NaPO_{4} 10 mM | 7 | 0,21 |
NaPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM | 7 | 0,72 |
NaPO_{4} 20 mM, NaCl 150 mM | 7 | 0,85 |
NaPO_{4} 20 mM, NaCl 0,5 M | 7 | 6,71 |
NaPO_{4} 20 mM, NaCl 1 M | 7 | 8,24 |
Efecto del pH | ||
Contenido | pH | C (mg/ml) uv |
NaOAc 20 mM, NaCl 150 mM | 3 | 10,27 |
NaOAc 20 mM, NaCl 150 mM | 3,5 | 10,25 |
NaOAc 20 mM, NaCl 150 mM | 4 | 7,54 |
NaOAc 20 mM, NaCl 150 mM | 4,5 | 1,75 |
NaOAc 20 mM, NaCl 150 mM | 5 | 1,15 |
NaOAc 20 mM, NaCl 150 mM | 5,5 | 0,85 |
Efecto del pH | Solubilidad | |
Contenido | pH | C (mg/ml) uv |
NaPO_{4} 20 mM, NaCl 150 mM | 5,5 | 0,89 |
NaPO_{4} 20 mM, NaCl 150 mM | 6 | 0,78 |
NaPO_{4} 20 mM, NaCl 150 mM | 6,5 | 0,79 |
NaPO_{4} 20 mM, NaCl 150 mM | 7 | 0,95 |
NaPO_{4} 20 mM, NaCl 150 mM | 7,5 | 0,82 |
NaPO_{4} 20 mM, NaCl 150 mM | 8 | 0,86 |
Citrato de Na 20 mM, NaCl 150 mM | 4 | 2,17 |
Citrato de Na 20 mM, NaCl 150 mM | 4,5 | 1,19 |
Citrato de Na 20 mM, NaCl 150 mM | 5 | 1,1 |
Citrato de Na 20 mM, NaCl 150 mM | 5,5 | 1,84 |
Citrato de Na 20 mM, NaCl 150 mM | 6 | 2,09 |
Citrato de Na 20 mM, NaCl 150 mM | 6,5 | 2,12 |
Citrato de Na 20 mM, NaCl 150 mM | 7 | 1,92 |
Glicina 20 mM, NaCl 150 mM | 9 | 0,32 |
Glicina 20 mM, NaCl 150 mM | 10 | 0,9 |
Glicina 20 mM, NaCl 150 mM | 11 | 13,94 |
L-Glutamato 20 mM, NaCl 150 mM | 4 | 9,07 |
L-Glutamato 20 mM, NaCl 150 mM | 5 | 1,21 |
Succinato 20 mM, NaCl 150 mM | 4 | 8,62 |
Succinato 20 mM, NaCl 150 mM | 5 | 1,21 |
Succinato 20 mM, NaCl 150 mM | 6 | 1,07 |
Citrato | ||
Contenido | pH | c (mg/ml) uv |
NaPO_{4} 10 mM, Citrato de Na 20 mM | 7 | 1,16 |
NaPO_{4} 10 mM, Citrato de Na 50 mM | 7 | 5,81 |
Citrato | Solubilidad | |
Contenido | pH | c (mg/ml) uv |
NaPO_{4} 10 mM, Citrato de Na 100 mM | 7 | 12,7 |
NaPO_{4} 10 mM, Citrato de Na 200 mM | 7 | 15,9 |
NaPO_{4} 10 mM, Citrato de Na 300 mM | 7 | 8,36 |
Mg^{2+}, Ca^{2+} y polifosfato | ||
Contenido | pH | c (mg/ml) uv |
NaPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 1 mM | 7 | 0,66 |
NaPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 10 mM | 7 | 1,02 |
NaPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 0,1 mM | 7 | 0,67 |
NaPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 1 mM | 7 | 0,71 |
NaPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM, trifosfato 10 mM | 7 | 3,64 |
NaPO_{4} 10 mM, 5% de PEG-400 | 7 | 0,07 |
NaPO_{4} 10 mM, EDTA 10 mM | 7 | 0,36 |
NaPO_{4} 10 mM, Na_{2}SO_{4} 100 mM | 7 | 5,08 |
NaPO_{4} 10 mM, ácido L-aspártico 100 mM | 7 | 0,4 |
NaPO_{4} 10 mM, ácido succínico 100 mM | 7 | 2,33 |
NaPO_{4} 10 mM, ácido tartárico 100 mM | 7 | 2,56 |
NaPO_{4} 10 mM, ácido maleico 100 mM | 7 | 0,11 |
NaPO_{4} 10 mM, ácido málico 100 mM | 7 | 1,87 |
NaPO_{4} 10 mM, ácido L-Glutámico 100 mM | 7 | 0 |
NaPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM | 7 | 0,25 |
NaPO_{4} 10 mM, isocitrato 100 mM | 7 | 10,83 |
NaOAc, NaPO_{4} y NaCl | ||
Contenido | pH | c (mg/ml) uv |
NaOAc 10 mM, NaCl 150 mM | 4,5 | 1,76 |
NaOAc 10 mM | 4,5 | 4,89 |
NaOAc 10 mM | 5,5 | 4,95 |
NaOAc 10 mM | 6,5 | 5,1 |
NaOAc, NaPO_{4} y NaCl | Solubilidad | |
Contenido | pH | c (mg/ml) uv |
NaOAc 10 mM | 7 | 5,87 |
NaPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM | 4,5 | 0,14 |
NaPO_{4} 10 mM | 4,5 | 4,97 |
NaPO_{4} 10 mM | 5,5 | 0,79 |
NaPO_{4} 10 mM | 6,5 | 0,091 |
NaPO_{4} 10 mM | 7 | 0,94 |
NaOAc 50 mM | 5 | 5,24 |
NaOAc 5 mM | 5,5 | 4,59 |
NaOAc 10 mM | 5,5 | 5,05 |
NaOAc 20 mM | 5,5 | 5,04 |
NaOAc 50 mM | 5,5 | 5,71 |
NaOAc 100 mM | 5,5 | 1,4 |
NaOAc 200 mM | 5,5 | 1,32 |
NaOAc 5 mM, NaCl 5 mM | 5,5 | 4,85 |
NaOAc 5 mM, NaCl 10 mM | 5,5 | 5,04 |
NaOAc 5 mM, NaCl 50 mM | 5,5 | 0,56 |
NaOAc 5 mM, NaCl 100 mM | 5,5 | 0,43 |
NaOAc 5 mM, NaCl 200 mM | 5,5 | 0,8 |
NaOAc 5 mM | 4,5 | 7,27 |
NaOAc 10 mM | 4,5 | 6,5 |
NaOAc 20 mM | 4,5 | 8,32 |
NaOAc 50 mM | 4,5 | 9,17 |
NaOAc 5 mM | 5,5 | 8,98 |
NaOAc 10 mM | 5,5 | 8,08 |
NaOAc 20 mM | 5,5 | 8,99 |
NaOAc 50 mM | 5,5 | 2,92 |
NaOAc 5 mM, NaCl 150 mM | 4,5 | 2,6 |
NaOAc, NaPO_{4} y NaCl | Solubilidad | |
Contenido | pH | c (mg/ml) uv |
NaOAc 10 mM, NaCl 150 mM | 4,5 | 2,59 |
NaOAc 20 mM, NaCl 150 mM | 4,5 | 2,55 |
NaOAc 50 mM, NaCl 150 mM | 4,5 | 2,1 |
NaOAc 5 mM, NaCl 150 mM | 5,5 | 0,65 |
NaOAc 10 mM, NaCl 150 mM | 5,5 | 0,69 |
NaOAc 20 mM, NaCl 150 mM | 5,5 | 0,74 |
NaOAc 50 mM, NaCl 150 mM | 5,5 | 0,91 |
Longitud de la cadena hidrófoba | ||
Contenido | pH | c (mg/ml) uv |
NaPO_{4} 10 mM, ácido fórmico 50 mM | 7 | 0,12 |
NaPO_{4} 10 mM, ácido acético 50 mM | 7 | 0,16 |
NaPO_{4} 10 mM, ácido propanoico 50 mM | 7 | 0,16 |
NaPO_{4} 10 mM, ácido butanoico 50 mM | 7 | 0,13 |
NaPO_{4} 10 mM, ácido pentanoico 50 mM | 7 | 0,14 |
NaPO_{4} 10 mM, ácido hexanoico 50 mM | 7 | 0,11 |
Otros | ||
Contenido | pH | c (mg/ml) uv |
NaOAC 20 mM, 3% de manitol, 2% de sacarosa, 5% de PEG-400 | 4 | 19,9 |
Citrato de Na 20 mM, 3% de manitol, 2% de sacarosa, 5% de PEG-400 | 6,5 | 0,72 |
Citrato de Na 20 mM, NaCl 150 mM, 5% de PEG-400 | 6,5 | 2,18 |
NaOAc 20 mM, NaCl 150 mM, 5% de PEG-400 | 4 | 19,8 |
Citrato de Na 20 mM, NaCl 130 mM, 1% de glicina, 0,25% de Tween-80, | ||
5% de PEG-400 | 6,5 | 1,48 |
Citrato de Na 20 mM, NaCl 130 mM, 1% de glicina, 0,25% de Tween-80 | 6,5 | 1,32 |
Contenido | Solubilidad | |
Acetato de Na 5 mM | 5,5 | 8,9 |
Acetato de Na 5 mM, 8% de sacarosa | 5,5 | 11 |
Acetato de Na 5 mM, 0,01% de polisorbato-80 | 5,5 | 7 |
Acetato de Na 5 mM, 8% de sacarosa, 0,01% de polisorbato-80 | 5,5 | 12 |
Acetato de Na 10 mM | 5,5 | 7,6 |
Acetato de Na 10 mM, 8% de sacarosa | 5,5 | 10 |
Acetato de Na 10 mM, 8% de sacarosa, 0,01% de polisorbato-80 | 5,5 | 12,1 |
Acetato de Na 5 mM, 5% de sorbitol | 5,5 | 7,8 |
Acetato de Na 5 mM, 4,5% de manitol | 5,5 | 9,2 |
Histidina 5 mM | 6 | 5,5 |
Histidina 5 mM | 6,5 | 1 |
Citrato de Na 5 mM | 5 | 0,1 |
Citrato de Na 5 mM | 6 | 0,1 |
Citrato de Na 5 mM | 6,5 | 0,1 |
Succinato de Na 5 mM | 5 | 0,6 |
Succinato de Na 5 mM | 6 | 0,3 |
Succinato de Na 5 mM | 6,5 | 0,2 |
Imidazol 10 mM | 6,5 | 2,5, 10,8 |
Imidazol 10 mM | 7 | 0,8 |
Imidazol 10 mM, 8% de sacarosa | 6,5 | 12,2 |
Acetato de Na 5 mM | 6 | 8,2 |
Imidazol 10 mM, Acetato de Na 5 mM | 6,5 | 12,8 |
Citrato de Na 10 mM | 6 | 0,2 |
Citrato de Na 100 mM | 6 | 8,1 |
Citrato de Na 100 mM | 7 | 9,3 |
Fosfato de Na 10 mM, Na_{2}SO_{4} 260 mM | 6 | 9,1 |
Fosfato de Na 10 mM, citrato de Na 100 mM | 8 | 8,8 |
Citrato de Na 10 mM, 1% de ácido L-glutámico | 6 | 4,6 |
Citrato de Na 10 mM, 2% de L-lisina | 6 | 1,1 |
Contenido | Solubilidad | |
Citrato de Na 10 mM, 0,5% de ácido L-aspártico | 6 | 0,4 |
Citrato de Na 10 mM, 0,1% de vidrio de fosfato | 7 | 5,9 |
Tris 10 mM, citrato de Na 100 mM | 8 | 8,5 |
Citrato de Na 10 mM, glicina 1 M | 6 | 0,3 |
Citrato de Na 10 mM, glicina 300 mM | 6 | 0,3 |
Citrato de Na 10 mM, glicerol 280 mM | 6 | 0,3 |
Citrato de Na 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,5 M | 6 | 8,3 |
Citrato de Na 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 120 mM | 6 | 8,8 |
Citrato de Na 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 260 mM | 6 | 9,4 |
NaPO_{4} 10 mM, 0,1% de vidrio de fosfato | 7 | 15,8 |
Citrato de Na 10 mM, 0,1% de SDS | 6 | 11,2 |
Citrato de Na 10 mM, 0,02% de SDS | 6 | 7,8 |
Acetato de Na 10 mM, 8% de PEG-400 | 5,5 | 13,7 |
Acetato de Na 10 mM, NaCl 150 mM, 8% de PEG-400 | 5,5 | 0,6 |
Acetato de Na 10 mM, 8% de PEG-400 | 6 | 16,2 |
Citrato de Na 10 mM, 8% de PEG-400 | 6 | 0,2 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se probó la estabilidad del TFPI almacenado en
diversas condiciones de pH. Se preparó el TFPI mediante diálisis
como anteriormente en fosfato de Na 10 mM, NaCl 150 mM y 0,005%
(p/v) de polisorbato-80. Se incubaron las muestras
de estabilidad que contenían TFPI 150 mg/ml a 40ºC durante 20 días.
Se analizó la constante cinética de velocidad del TFPI soluble
restante siguiendo la disminución del pico principal en
cromatogramas de intercambio catiónico. Tal como puede observarse en
la figura 5, la constante de la velocidad de degradación aumenta con
pH superior a 6,0, lo que indica más agregación en condiciones de pH
superior.
También se formuló el TFPI a una concentración de
150 mg/ml en NaCl 150 mM y 0,005% (p/v) de
polisorbato-80 a pH 7 con concentraciones variables
de fosfato. La figura 5A muestra el porcentaje de TFPI soluble
restante medido mediante HPLC de intercambio catiónico. Las
concentraciones crecientes de ion fosfato en disolución dieron como
resultado niveles superiores de TFPI disuelto restante tras la
incubación a 40ºC. Niveles superiores de ion fosfato también dieron
como resultado niveles superiores de TFPI activo tal como se ensayó
mediante el ensayo del tiempo de protrombina. Estos resultados se
muestran en la figura 5B.
También se probó la estabilidad del TFPI a una
concentración de 0,5 mg/ml y formulado en citrato de Na 10 mM, pH 6
y NaCl 150 mM, a 40ºC a lo largo de un periodo de 40 días. Tal como
se observa en la figura 6, la HPLC de intercambio catiónico
(triángulos) muestra la presencia de TFPI soluble a niveles
superiores al 60% del inicial, incluso tras 40 días de incubación.
De un modo parecido, el ensayo del tiempo de protrombina (círculos)
muestra la presencia de TFPI activo a niveles superiores al 60% del
inicial, incluso tras 40 días de incubación.
La figura 7 muestra la pérdida de TFPI soluble a
40ºC medida tanto mediante HPLC de intercambio catiónico (símbolos
abiertos) como mediante el ensayo del tiempo de protrombina
(símbolos cerrados) para TFPI 0,5
mg/ml formulado en fosfato de Na 10 mM, pH 6 y o bien NaCl 150 mM (triángulos) o bien NaCl 500 mM
(círculos).
mg/ml formulado en fosfato de Na 10 mM, pH 6 y o bien NaCl 150 mM (triángulos) o bien NaCl 500 mM
(círculos).
La figura 8 muestra la pérdida de TFPI soluble a
40ºC medida tanto mediante HPLC de intercambio catiónico (símbolos
abiertos) como mediante el ensayo del tiempo de protrombina
(símbolos cerrados) para TFPI 0,5 mg/ml formulado en acetato de Na
10 mM y pH 5,5 que contiene NaCl 150 mM (triángulos) o bien un 8%
(p/v) de sacarosa (cuadrados) o bien un 4,5% (p/v) de manitol
(círculos).
La figura 9 muestra dos geles de SDS no
reductores para muestras de formulación de TFPI en NaPO_{4} 10 mM,
NaCl 150 mM y 0,005% de polisorbato-80 a de pH 4 a
pH 9 almacenados a 40ºC durante 0 días (inferior) y 20 días
(superior). No se observa ninguna pérdida de TFPI a los 0 días. Sin
embargo, a los 20 días pueden verse fragmentos de escisión del TFPI
en el intervalo de pH inferior (es decir, pH 4 y pH 5). Sin
limitarse a ninguna teoría en particular, se cree que estos
fragmentos pueden resultar de una reacción catalizada por ácido.
Finalmente, la tabla 2 muestra la semivida del
TFPI soluble restante a 40ºC para varias formulaciones. Se formuló
TFPI 0,5 mg/ml en estas condiciones de formulación y se incubó a
40ºC. Se retiraron muestras a intervalos de tiempo predeterminados y
se examinó la pérdida de TFPI soluble y activo por medio de
HPLC-IEX y el ensayo de TP. Se calculó la semivida
del TFPI soluble restante llevando a cabo un simple ajuste
exponencial de los resultados de HPLC-IEX y el
ensayo de TP.
En primer lugar, se une el TFPI a la resina en un
tampón de bajo contenido en sal. Después, se bombea un tampón que
contiene el compuesto poliiónico usado para eluir el TFPI en modo de
desplazamiento a través de la columna. Este compuesto se une más
fuertemente a la resina que el TFPI y desplaza al TFPI. Se usa un
compuesto cargado negativamente para una resina cargada
positivamente (intercambiador de aniones) y se usa un compuesto
cargado positivamente para una resina cargada negativamente
(intercambiador de cationes).
Se usó TFPI parcialmente purificado como material
de partida. Se cargó el TFPI, en urea 6 M, Tris 20 mM, pH 8,0 en la
columna rellena de una resina de intercambio aniónico, Q Sepharose
HP, hasta 20 mg/ml de resina. Tras la carga, se lavó la columna con
urea 6 M, Tris 20 mM, pH 9,0. Se eluyó el TFPI en Glass H
(polifosfato) en urea 6 M, Tris 10 mM, pH 9,0.
\vskip1.000000\baselineskip
t ½ (días) a 40ºC | ||
TFPI 0,5 mg/ml formulado en: | HPLC-IEX | Ensayo TP |
\hskip0,3cm Acetato de Na 10 mM, NaCl 150 mM, pH 5,5 | 10,8 | 17,2 |
\hskip0,3cm Citrato de Na 10 mM, NaCl 150 mM, pH 5,5 | 12,2 | 24,4 |
\hskip0,3cm Acetato de Na 10 mM, 8% (p/v) de sacarosa, pH 5,5 | 43,2 | 42,2 |
\hskip0,3cm Acetato de Na 10 mM, 4,5 de manitol %, pH 5,5 | 47,7 | 46,6 |
\hskip0,3cm Succinato de Na 10 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0 | 7,8 | 11,0 |
\hskip0,3cm Citrato de Na 10 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0 | 13,0 | 18,8 |
\hskip0,3cm Fosfato de Na 10 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0 | 7,8 | 11,2 |
\hskip0,3cm Fosfato de Na 10 mM, NaCl 500 mM, pH 6,0 | 52,2 | 68,9 |
\hskip0,3cm Citrato de Na 10 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5 | 10,0 | 14,8 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se usa un compuesto cargado positivamente para
una resina cargada positivamente y se usa un compuesto cargado
negativamente para una resina cargada negativamente.
Se cargó TFPI, en urea 3,5 M, polifosfato 1
mg/ml, Tris 50 mM, pH 5,9 en una resina de intercambio catiónico, SP
Sepharose HP. Tras la carga, se lavó la columna con un tampón que no
contiene urea, polifosfato 10 mg/ml, fosfato de sodio 10 mM, pH 5,0.
Se eluyó el TFPI en el mismo tampón a pH 7,5, sin urea.
Debido a los extremos cargados del TFPI, pueden
unirse compuestos poliiónicos con carga opuesta a estos extremos.
Cuando el compuesto poliiónico tiene una fuerza de unión superior al
TFPI que a la resina, puede eluirse selectivamente el TFPI de la
resina de cromatografía.
Se cargó TFPI, en urea 3,5 M, polifosfato 1
mg/ml, Tris 50 mM, pH 5,9 en una resina de intercambio catiónico, SP
Sepharose HP. Tras la carga, se lavó la columna con urea 6 M,
polifosfato 1 mg/ml, fosfato de sodio 10 mM, pH 5,9. Se eluyó el
TFPI en un gradiente de 25 volúmenes de columna de polifosfato hasta
20 mg/ml. El TFPI empieza a eluir a aproximadamente
2-3 mg/ml de polifosfato.
Neutralización de compuestos poliiónicos antes de
la separación cromatográfica del TFPI. El TFPI puede interaccionar
con polímeros cargados. Esta interacción puede impedir la unión y
purificación de las resinas cromatográficas. Neutralizando el
polímero cargado con un polímero de carga opuesta, el TFPI puede
unirse a la resina.
En un tampón que contiene polifosfato (Glass H),
el TFPI no se une a Express Ion S (Whatman) y no se obtiene ninguna
purificación. Mezclando PEI en la carga de la columna, ahora el TFPI
se une a la resina y el TFPI puede purificarse.
Se descongelaron cuerpos de inclusión que
contenían aproximadamente 40 g de rhTFPI sacando los contenedores
del congelador a -20ºC e incubándolos en una sala fría a
4-10ºC durante aproximadamente 196 horas. Entonces,
se dispersaron los cuerpos de inclusión descongelados con una
mezcladora de alta cizalladura para reducir la aglutinación que se
produce durante la congelación. Se añadieron los cuerpos de
inclusión descongelados a 80 l de un tampón de urea 3 M,
Tris-Cl 50 mM, pH 10,5 que contenía Glass H 2 g/l
contenido en un tanque de polietileno de 100 l equipado con un
agitador superior. Se mezcló el contenido durante aproximadamente 15
minutos, y entonces se midió la absorbancia de la disolución a 280
nm. Si la absorbancia es superior entonces la mezcla se diluía con
suficiente tampón de disolución para obtener una absorbancia a 280
nm de 1,0-1,1. La disolución se incubó con agitación
suave durante 15-30 minutos, y entonces se añadió
suficiente cisteína para dar una concentración de cisteína de 0,1
mM. Se disolvió la L-cisteína sólida en
aproximadamente 50 ml de agua purificada y se añadió a la mezcla de
replegamiento. Se comprobó el pH y se ajustó a pH 10,2 si era
necesario. Se incubó la mezcla de replegamiento con agitación suave
durante 96-120 horas.
Después de aproximadamente 96 horas, el
procedimiento de replegamiento se terminó ajustando el pH de la
mezcla de replegamiento hasta pH 5,9 usando ácido acético glacial.
Se continuó la agitación durante 90 minutos y se comprobó el pH. Se
añadió más ácido, si era necesario para ajustar el pH hasta
5,9+/-0,1. Se usó un proceso de filtración en dos etapas para
retirar los materiales particulados que se formaron durante etapas
precedentes y para preparar la mezcla de replegamiento acidificada
para cromatografía en SP-Sepharose HP. En primer
lugar, se pasa la mezcla de replegamiento acidificada a través de un
filtro de profundidad Cuno 60LP (caja de alojamiento del filtro
modelo 8ZP1P) usando una bomba peristáltica (tubos de silicio de
diámetro interno de 1/4-3/8 de pulgada).
Se lavó el sistema de filtración con
8-10 l de urea 6 M desionizada antes de usarlo. Se
recogió el filtrado en un tanque de polietileno de 100 l. Se mantuvo
una contrapresión de 20 PSI constantes. La velocidad de flujo
inicial para un filtro nuevo era de aproximadamente
5-6 l por minuto. Los filtros se sustituyeron cuando
la velocidad de flujo caía por debajo de 1 l por minuto, con el fin
de mantener la contrapresión de 20 PSI. La segunda fase de la
filtración usó un cartucho de filtro de 0,45 micras (Sartorius
Sartobran pH o equivalente) con un sistema de bombeo peristáltico.
Tras la filtración, se comprobó el pH, y se ajustó hasta 5,9 si fue
necesario.
La mezcla de replegamiento filtrada y acidificada
se cargó en la columna de SP Sepharose HP equilibrada con una
velocidad de flujo de aproximadamente 80,0 ml/min. Se ajustó la
velocidad de flujo para adaptar una carga durante la noche de la
mezcla de replegamiento filtrada acidificada. La columna se
equilibró con tampón de urea 6 M, fosfato de sodio 20 mM, pH 5,9
antes de la carga. Tras la carga, se lavó la columna con 2 CF (pies
cúbicos) de tampón de urea 6 M, NaCl 0,3 M, fosfato de sodio 20 mM,
pH 5,9 antes de la etapa de elución por gradiente. Se aumentó la
velocidad de flujo de la columna hasta 190-200
ml/min para la etapa de lavado y todas las etapas posteriores
(velocidad lineal = -47 cm/h). Se eluyó el producto de la columna
usando un gradiente salino lineal de disolución de NaCl desde 0,3
hasta 0,5 M en urea 6 M, fosfato de sodio 20 mM, pH 5,9. El
gradiente se formó suministrando tampón de urea 6 M, NaCl 0,5
M,
fosfato de sodio 20 mM en tampón de urea 6 M, NaCl 0,3 M, fosfato de sodio 20 mM. El tampón límite se bombeó con una bomba Masterflex (modelo 7553-20) con un cabezal Masterflex (modelo 7051.21) a una velocidad de flujo de aproximadamente 100 ml/min con mezclado vigoroso usando una mezcladora Paratrol A de Parametrics (modelo 250210). El volumen total del gradiente fue de 71,0 litros o 13,0 VC. El pH de los tampones del gradiente era de 5,92 (+/-0,02). Se evaluaron las fracciones cualitativamente usando SDS-PAGE y se combinaron en base al contenido en SC-59735 replegada correctamente en relación con otros replegamientos erróneos e impurezas. Tras la combinación, la corriente del procedimiento se denomina combinación S.
fosfato de sodio 20 mM en tampón de urea 6 M, NaCl 0,3 M, fosfato de sodio 20 mM. El tampón límite se bombeó con una bomba Masterflex (modelo 7553-20) con un cabezal Masterflex (modelo 7051.21) a una velocidad de flujo de aproximadamente 100 ml/min con mezclado vigoroso usando una mezcladora Paratrol A de Parametrics (modelo 250210). El volumen total del gradiente fue de 71,0 litros o 13,0 VC. El pH de los tampones del gradiente era de 5,92 (+/-0,02). Se evaluaron las fracciones cualitativamente usando SDS-PAGE y se combinaron en base al contenido en SC-59735 replegada correctamente en relación con otros replegamientos erróneos e impurezas. Tras la combinación, la corriente del procedimiento se denomina combinación S.
A continuación, el pH de la combinación S se
ajustó hasta pH 8,0 con NaOH 2,5 N. Se concentró la combinación S
2-3 veces hasta aproximadamente 2 l usando una
unidad de ultrafiltración Amicon DC-10L que contenía
un cartucho espiral Amicon YM10 (membrana de punto de corte de PM de
10.000). Tras la concentración, la combinación S concentrada se
sometió a diafiltración frente a 7 volúmenes de tampón de urea 6 M,
Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. La diafiltración se
consideró completa cuando la conductividad del material retenido era
inferior a 2 mS. El concentrado diafiltrado se vació de la unidad de
ultrafiltración y se lavó la unidad con aproximadamente 1 l de
tampón de diafiltración. El lavado se combina con el concentrado de
la carga Q.
Se llenó una columna Amicon (diámetro de 7,0 cm)
con aproximadamente 700 ml de medio de alta resolución
Q-Sepharose (Q-Sepharose HP de
Pharmacia). La columna se llenó con etanol al 20% a 20 psi. La
altura del lecho tras el llenado era de aproximadamente 18 cm. La
columna se equilibró con 5 CF de tampón de urea 6 M, Tris/HCl 0,02
M, pH 8. El objetivo de la carga de proteína es de
8-10 mg de proteína/ml de resina
Q-Sepharose. Se aplicó la carga Q a la columna con
una velocidad de flujo de 30-35 ml/min (50 cm/h).
Tras la carga, se lavó la columna con aproximadamente 5 VC de tampón
de urea 6 M, Tris/HCl 20 mM, pH 8, o hasta que la absorbancia a 280
nm regresó a la línea base. El producto se eluyó usando un gradiente
de cloruro de sodio de NaCl desde 0-0,15 M en tampón
de urea 6 M, Tris/HCl 20 mM, pH 8,0 a lo largo de 25 volúmenes de
columna. Los primeros siete volúmenes de columna se recogieron como
una única fracción, seguida de 30 fracciones de 0,25 volúmenes de
columna cada una.
Las fracciones se analizan de manera rutinaria
con SDS-PAGE reductora y no reductora y
cromatografía de exclusión por tamaños. Las fracciones se combinan
en base al contenido en agregado (<5% mediante el método de
HPLC-SEC MSL 13929) y mediante evaluación
cualitativa por SDS-PAGE para evaluar la pureza. Las
fracciones se almacenan congeladas a -20ºC hasta que se
combinan.
Se combinaron las fracciones de
Q-Sepharose aceptables, y el pH de la combinación se
ajustó hasta 7,2 usando HCl 2 M. Entonces la combinación se
concentro aproximadamente 5 veces en un sistema de ultrafiltración
Amicon DC-1 que contenía un cartucho S1Y1 Amicon
YM-10 (membrana de cartucho espiral de MWCO de
10.000). Entonces, la combinación Q concentrada se sometió a
diafiltración frente a 7 volúmenes de tampón de urea 2 M, NaCl 0,15
M, fosfato de sodio 20 mM, pH 7,2. Después de la diafiltración, la
disolución se vació del sistema de ultrafiltración. Se hicieron
circular aproximadamente 100 ml de tampón de urea 2 M, NaCl 0,15 M,
fosfato de sodio 20 mM, pH 7,2 a través del sistema de
ultrafiltración durante aproximadamente 5 min. La disolución de
aclarado se combinó con el concentrado original y la disolución se
filtró a través de una unidad de filtración a vacío de 0,45
micras
(Nalgene).
(Nalgene).
Se descongelaron cuerpos de inclusión que
contenían aproximadamente 40 g de rhTFPI sacando los contenedores
del congelador a -20ºC y incubándolos en una sala fría a
4-10ºC durante aproximadamente 96 horas. Entonces se
dispersaron los cuerpos de inclusión descongelados con una
mezcladora de alta cizalladura para reducir la aglutinación que se
produce durante la congelación. La suspensión de cuerpos de
inclusión se mezcló vigorosamente durante aproximadamente 1 minuto
usando un homogeneizador Polytron (Brinkman modelo PT45/80) o hasta
que los cuerpos de inclusión se añadieron entonces a 40 l un tampón
de urea 6 M, Tris-Cl 100 mM, pH 9,8 que contenía
NaCl 300 mM y PEI 0,4 g/L contenido en un tanque de polietileno de
100 l equipado con un agitador superior. Se agitó la mezcla
vigorosamente durante 20-30 min. El pH se monitorizó
y ajustó hasta pH 9,8 según fuese necesario. Se midió la absorbancia
de la mezcla de cuerpos de inclusión disueltos a 280 nm, y si la
absorbancia era superior a 2,1, la mezcla se diluía con 10 l del
tampón de disolución descrito anteriormente para obtener un valor de
A_{280} de 2,0-2,1. Se continuó con agitación
suave durante otros 15-30 minutos. Después, la
disolución de cuerpos de inclusión diluidos se diluyó con un volumen
igual de disolución de urea 1,0 M, NaCl 300 mM. Finalmente, se
añadió L-cisteína para dar una concentración final
de 0,25 mM. La L-cisteína sólida se disolvió en 50
ml de WFI (agua para inyección) y se añadió como una disolución a la
mezcla de replegamiento diluida. Se comprobó el pH y se ajustó, si
fue necesario. El replegamiento continuó con agitación suave durante
96-120 horas con comprobaciones periódicas del pH, y
ajuste hasta pH 9,8 si era necesario. El avance del replegamiento se
monitorizó mediante ensayos de intercambio catiónico
Mon-S y del tiempo de protrombina.
Tras aproximadamente 96 h, se terminó el
procedimiento de replegamiento ajustando el pH de la mezcla de
replegamiento hasta pH 5,9 usando ácido acético glacial. Se continuó
la agitación durante 90 minutos y se comprobó el pH. Se añadió más
ácido, si fue necesario para ajustar el pH hasta 5,9+/-0,1.
Se usó un proceso de filtración en dos etapas
para retirar los materiales particulados que se formaron durante
etapas precedentes y para preparar la mezcla de replegamiento
acidificada para el cromatógrafo de SP-Sepharose HP.
En primer lugar, se pasa la mezcla de replegamiento acidificada a
través de un filtro de profundidad Cuno 60LP (caja de alojamiento
del filtro modelo 8ZP1P) usando una bomba peristáltica (tubos de
silicio de diámetro interno de 1/4-3/8 de
pulgada).
Se lavó el sistema de filtración con
8-10 l de urea 6 M desionizada antes de usarlo. Se
recogió el filtrado en un tanque de polietileno de 100 L. Se mantuvo
una contrapresión de 20 PSI constantes. La velocidad de flujo
inicial para un filtro nuevo era de aproximadamente
5-6 l por minuto. Los filtros se sustituyeron cuando
la velocidad de flujo caía por debajo de 1 l por minuto, con el fin
de mantener la contrapresión de 20 PSI. La segunda fase de la
filtración usó un cartucho de filtro de 0,45 micras (Sartorius
Sartobran pH o equivalente) con un sistema de bombeo peristáltico.
Tras la filtración, se comprobó el pH, y se ajustó hasta 5,9 si fue
necesario.
La mezcla de replegamiento filtrada y acidificada
se cargó en la columna de SP Sepharose HP equilibrada con una
velocidad de flujo de aproximadamente 80,0 ml/min. Se ajustó la
velocidad de flujo para adaptar una carga durante la noche de la
mezcla de replegamiento filtrada acidificada. La columna se lavó con
5,5 volúmenes de columna de tampón de urea 6 M, NaCl 0,3 M, fosfato
de sodio 20 mM, pH 5,9. Se aumentó la velocidad de flujo de la
columna hasta 190-200 ml/min para la etapa de lavado
y todas las etapas posteriores (velocidad lineal = -47 cm/h). Se
eluyó el producto de la columna usando un gradiente salino lineal de
NaCl desde 0,3 hasta 0,5 M en tampón de urea 6 M, fosfato de sodio
20 mM, pH 5,9. El gradiente se formó suministrando tampón de urea 6
M, NaCl 0,5 M, fosfato de sodio 20 mM en tampón de urea 6 M, NaCl
0,3 M, fosfato de sodio 20 mM, en tampón de urea 6 M, NaCl 0,3 M,
fosfato de sodio 20 mM. El tampón límite se bombeó con una bomba
Masterflex (modelo 7553-20) con un cabezal
Masterflex (modelo 7051.21) a una velocidad de flujo de
aproximadamente 100 ml/min con mezclado vigoroso usando una
mezcladora Paratrol A de Parametrics (modelo 250210). El volumen
total del gradiente fue de 71,0 litros o 13,0 VC. El pH de los
tampones del gradiente era de 5,92 (+/-0,02).
La recogida de fracciones se empezó cuando la
conductividad de entrada de la columna alcanzó los
28,0-28,5 mS/cm medido mediante el conductímetro
Radiometer en línea. Se recogieron cuarenta fracciones de 500 ml
(0,1 VC). Se usó un colector de fracciones Pharmacia
Frac-300 con botellas de polipropileno de 500 ml,
numeradas. Cuando se detuvo el colector de fracciones el resto del
gradiente se recogió como una combinación.
Las fracciones de la columna se analizaron según
su A_{280}, mediante HPLC de exclusión por tamaños, y además, con
fines de información, SDS-PAGE, HPLC en fase
inversa, y ensayos de TP. Se combinaron las fracciones que cumplían
los criterios de combinación de contener el 20% menos de agregado
tal como se determinó mediante el procedimiento de
HPLC-SEC. Las fracciones de SP Sepharose combinadas
se denominan aquí como combinación S.
Después se ajustó el pH de la combinación S hasta
pH 8,0 con NaOH 2,5 N. La combinación se concentro
2-3 veces hasta aproximadamente 2 l usando una
unidad de ultrafiltración Amicon DC-10L que contenía
un cartucho espiral Amicon YM-10 (membrana de punto
de corte de PM de 10.000). Tras la concentración, se sometió a
diafiltración la combinación S concentrada frente a 7 volúmenes de
tampón de urea 6 M, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. La
diafiltración se consideró completa cuando la conductividad del
material retenido fue inferior a 2 mS. El concentrado diafiltrado se
vació de la unidad de ultrafiltración y se lavó la unidad con
aproximadamente 1 l de tampón de diafiltración. El lavado se combina
con el concentrado para formar la carga Q.
Se llenó una columna Amicon (diámetro de 7,00 cm)
con aproximadamente 700 ml de medio de alta resolución
Q-Sepharose (Q-Sepharose HP de
Pharmacia). La columna se llenó con etanol al 20% a 20 psi. La
altura del lecho tras el llenado era de aproximadamente 18 cm. La
columna se equilibró con 5 VC de tampón de urea 6 M, Tris/HCl 0,02
M, pH 8. El objetivo de la carga de proteína es de
8-10 mg de proteína/ml de resina
Q-Sepharose. Se aplica la carga Q a la columna con
una velocidad de flujo de 30-35 ml/min (50 cm/h).
Tras la carga, se lavó la columna con aproximadamente 5 VC de tampón
de urea 6 M, Tris/HCl 20 mM, pH 8, o hasta que la absorbancia a 280
nm regresó a la línea base. El producto se eluyó usando un gradiente
de cloruro de sodio de NaCl desde 0-0,15 M en tampón
de urea 6 M, Tris/HCl 20 mM, pH 8,0 a lo largo de 25 volúmenes de
columna. Los primeros siete volúmenes de columna se recogieron como
una única fracción, seguida de 30 fracciones de 0,25 volúmenes de
columna cada una.
Las fracciones se analizan de manera rutinaria
con SDS-PAGE reductora y no reductora y
cromatografía de exclusión por tamaños. Las fracciones se combinan
en base al contenido en agregado (<5% mediante
HPLC-SEC) y mediante evaluación cualitativa por
SDS-PAGE para evaluar la pureza. Las fracciones se
almacenan congeladas a -20ºC hasta que se combinan.
Las fracciones de Q-Sepharose que
iban a combinarse se descongelaron mediante incubación a
2-8ºC, se combinaron y se ajustó el pH de la
combinación hasta 7,2 usando HCl 2 M. Entonces la combinación se
concentró aproximadamente 5 veces en un sistema de ultrafiltración
Amicon DC-1 que contenía un cartucho S1Y1 Amicon
YM-10 (membrana de cartucho espiral de MWCO de
10.000). Entonces, la combinación Q concentrada se sometió a
diafiltración frente a 7 volúmenes de tampón de urea 2 M, NaCl 0,15
M, fosfato de sodio 20 mM, pH 7,2. Después de la ultrafiltración, la
disolución se vació del sistema de ultrafiltración. Se hicieron
circular aproximadamente 100 ml de tampón de urea 2 M, NaCl 0,15 M,
fosfato de sodio 20 mM, pH 7,2 a través del sistema de
ultrafiltración durante aproximadamente 5 min. La disolución de
aclarado se combinó con el concentrado original y se filtró a través
de una unidad de filtración a vacío de 0,45 micras (Nalgene).
Se disolvieron aproximadamente 2 g de rhTFPI (43
ml de suspensión de cuerpos de inclusión que contenían 46 mg/ml de
rhTFPI) con mezclado en 4 l de tampón Tris 50 mM, pH 10,5 que
contenía polifosfato 4 g/l (Glass H, FMC Corporation) a
2-8ºC. Se añadió suficiente cisteína y cistina para
preparar las disoluciones 0,1 mM y 0,05 mM respectivamente. Se
mantuvo el pH a pH 10,5 con NaOH 1 N. La disolución de replegamiento
se incubó a 2-8ºC con mezclado suave durante
72-96 horas.
Después se ajustó la mezcla de replegamiento a pH
6 usando ácido acético glacial y entonces se filtró a través de un
filtro de 0,2 micras. Se aplicó una alícuota de la mezcla de
replegamiento filtrada a una columna de 200 ml de
SP-Sepharose HP (Pharmacia) previamente equilibrada
con tampón de 0,4% de Glass H, fosfato de sodio 20 mM, pH 6. Tras la
carga, se lavó la columna con 4 volúmenes de columna de tampón de
0,4% de Glass H, fosfato de sodio 20 mM, pH 6. La columna se eluyó
usando un gradiente de pH lineal de desde tampón de 0,4% de Glass H,
fosfato de sodio 20 mM, pH 6 hasta tampón de 0,4% de Glass H, Tris
50 mM, pH 8. Las fracciones se recogieron y analizaron mediante
SDS-PAGE. Pudo replegarse y purificarse rhTFPI
relativamente puro de esta manera.
Se descongelaron aproximadamente 10 g de rhTFPI
purificado en aproximadamente 1 l de tampón de urea 2 M, cloruro de
sodio 125 mM, fosfato de sodio 20 mM, pH 7,4 mediante incubación a
2-8ºC durante 18-36 h. Se añadió
suficiente urea seca para preparar la disolución 6 M en urea.
Entonces se filtró la disolución a través de un filtro de 0,2
micras. Se disolvieron cinco g de vidrio de polifosfato (Glass H,
FMC) en 50 ml de urea 6 M, se ajustó hasta pH 7 con NaOH 1 N, y se
añadió a la disolución de la proteína. Entonces se concentró la
disolución mediante ultrafiltración usando un pie cuadrado de
membrana (Amicon S1Y3) hasta aproximadamente 400 ml (-25 mg/ml) y se
sometió a diafiltración frente a 10 volúmenes (aproximadamente 4
litros) de agua purificada para eliminar la urea residual. Tras la
diafiltración, la disolución se concentró hasta aproximadamente 250
ml y se retiró de la unidad de ultrafiltración. La unidad de
ultrafiltración se lavó con aproximadamente 150 ml de agua
purificada y se añadió al concentrado de proteínas. El concentrado
de proteína final contenía casi 10 g de proteína en 400 ml de agua
(aproximadamente 24 mg/ml de proteína). La solubilidad normal del
rhTFPI en agua es inferior a 0,5 mg/ml.
El uso de polímeros catiónicos para precipitar y
eliminar contaminantes de E. coli de productos intermedios de
TFPI brutos (lisados, cuerpos refringentes) puede mejorar
significativamente las operaciones de procedimiento posteriores
(replegamiento, cromatografía, etc.). Una selección aleatoria de
polímeros catiónicos identificó candidatos que precipitan
selectivamente contaminantes bacterianos mientras que el TFPI
permanece en disolución. Específicamente, el polímero Betz 624
precipitó cantidades sustanciales de contaminantes bacterianos,
mientras que dejó al TFPI en disolución en un entorno acuoso.
Cuerpos refringentes de TFPI disueltos (en
clorhidrato de guanidina 3,5 M, cloruro de sodio 2 M, Tris 50 mM,
ditiotreitol 50 mM, pH 7,1) fueron el material de partida usado para
un experimento de selección de polímeros. Se diluyó este material 10
veces con una disolución al 0,5% de varios polímeros. Se analizaron
los precipitados de este experimento mediante
SDS-PAGE para determinar la presencia de TFPI. El
polímero Betz 624 precipitó cantidades sustanciales de
contaminantes, sin TFPI, y dio como resultado una disolución acuosa
transparente.
El uso de extracción en dos fases acuosas con un
sistema de polietilenglicol (PEG), polifosfato, urea ofrece ventajas
de tratamiento para la purificación de TFPI. Sistemas de dos fases
acuosas típicos consisten en dos sistemas poliméricos (por ejemplo,
PEG y dextrano) o un polímero y una sal (por ejemplo PEG y sulfato).
El sistema descrito en el presente documento tiene ventajas en
cuanto a que puede optimizarse la longitud de la cadena de
polifosfato para la separación, no es caro y es específico en la
eliminación de contaminantes problemáticos de los cuerpos
refringentes de TFPI
que se sabe interfieren con el replegamiento y la cromatografía (polifosfatos nativos y metales divalentes asociados).
que se sabe interfieren con el replegamiento y la cromatografía (polifosfatos nativos y metales divalentes asociados).
Se solubilizaron cuerpos refringentes de TFPI en
urea 7 M, CAPS 10 mM, 1% de monotioglicerol, pH 10. Se añadieron
polifosfato y PEG de diferentes longitudes de cadena para formar las
dos fases. Con la separación de fases, el TFPI se repartió en la
fase superior rica en PEG, dejando los polifosfatos y contaminantes
asociados en la fase inferior. La separación se ve afectada por las
longitudes de cadena tanto de de PEG como del polifosfato y puede
optimizarse variando ambas.
Se añaden cinco gramos (peso húmedo) de cuerpos
de inclusión que contienen aproximadamente 2 gramos del activador
del plasminógeno tisular recombinante a aproximadamente 1 litro de
tampón de 0,5% de Glass H, Tris 50 mM, pH 10,8 que contenía
glutatión reducido (GSH) 1 mM y disulfuro de glutatión (GSSG) 0,2
mM. La mezcla se combina meticulosamente usando un homogeneizador
Polytron (Brinkman) durante 2-3 minutos para
dispersar por completo los cuerpos de inclusión. Se incuba la mezcla
con mezclado usando un agitador superior durante 15 minutos,
mientras se mantiene el pH a 10,5-10,9 usando NaOH 1
N. Entonces, se mezcla suavemente la mezcla durante
48-72 horas a 2-8ºC.
Se añaden diez gramos (peso húmedo) de cuerpos de
inclusión que contienen 5 gramos de somatotropina bovina a
aproximadamente 1 litro de tampón de 1% de Glass H, Tris 50 mM, pH
10,5. La mezcla se combina meticulosamente usando un homogeneizador
Polytron (Brinkman) durante 2-3 minutos para
dispersar por completo los cuerpos de inclusión. Se incuba la mezcla
con mezclado usando un agitador superior durante 15 minutos mientras
se mantiene el pH a 10,4-10,6 usando NaOH 1 N. Se
añade cisteína sólida (121 mg) para que la reacción sea con cisteína
1 mM, y la reacción de replegamiento se mezcla durante
48-72 horas.
Claims (32)
1. Disolución acuosa que comprende TFPI
replegado, muteína de TFPI replegado o TFPI-2
replegado y un polímero cargado, en la que la concentración de TFPI
replegado, muteína de TFPI replegado o TFPI-2
replegado es superior a 1 mg/ml.
2. Disolución acuosa según la reivindicación 1,
en la que la concentración de TFPI replegado, muteína de TFPI
replegado o TFPI-2 replegado es superior a 5
mg/ml.
3. Disolución acuosa según la reivindicación 1,
en la que la concentración de TFPI replegado, muteína de TFPI
replegado o TFPI-2 replegado es superior a 10
mg/ml.
4. Disolución acuosa según la reivindicación 1,
en la que la concentración de TFPI replegado, muteína de TFPI
replegado o TFPI-2 replegado es superior a 20
mg/ml.
5. Disolución acuosa según la reivindicación 1,
en la que la concentración de TFPI replegado, muteína de TFPI
replegado o TFPI-2 replegado es de desde 1 hasta 10
mg/ml.
6. Disolución acuosa según la reivindicación 1,
en la que la concentración de TFPI replegado, muteína de TFPI
replegado o TFPI-2 replegado es de desde 1 hasta 20
mg/ml.
7. Disolución acuosa según la reivindicación 1,
en la que la concentración de TFPI replegado, muteína de TFPI
replegado o TFPI-2 replegado es de desde 5 hasta 20
mg/ml.
8. Disolución acuosa según la reivindicación 1,
que es farmacéuticamente aceptable.
9. Disolución acuosa según la reivindicación 1,
en la que el polímero cargado es un polisacárido sulfatado.
10. Disolución acuosa según la reivindicación 1,
en la que el polímero cargado es heparina.
11. Disolución acuosa según la reivindicación 1,
en la que el polímero cargado es sulfato de dextrano.
12. Disolución acuosa según la reivindicación 1,
en la que el polímero cargado es polifosfato.
13. Método de modificación de la solubilidad de
una proteína que tiene un primer dominio que tiene una carga
positiva neta y un segundo dominio que tiene una carga negativa
neta, que comprende las etapas de:
añadir a la proteína una disolución acuosa de un
polímero cargado para reducir las interacciones intermoleculares o
intramoleculares entre los dominios cargados positiva y
negativamente, en el que la proteína es TFPI replegado, muteína de
TFPI replegado o TFPI-2 replegado.
14. Método según la reivindicación 13, en el que
la proteína está en una forma insoluble antes de la etapa de
adición.
15. Método según la reivindicación 13, en el que
también se añade un agente caotrópico a la proteína.
16. Método según la reivindicación 13, en el que
se aumenta la actividad específica de la proteína mediante dicha
etapa de adición.
17. Método según la reivindicación 13, en el que
se inmoviliza el polímero cargado sobre un soporte sólido.
18. Método según la reivindicación 13, que
comprende además:
aplicar la proteína a un soporte sólido antes de
añadir el polímero cargado.
19. Método según la reivindicación 17, que
comprende además:
aplicar la proteína a un soporte sólido después
de añadir el polímero cargado.
20. Método según la reivindicación 18, en el que
el soporte sólido es una resina de intercambio iónico.
21. Método según la reivindicación 19, en el que
el soporte sólido es una resina de intercambio iónico.
22. Método según la reivindicación 20 o la
reivindicación 21, en el que la resina y el polímero tienen cargas
netas opuestas.
\newpage
23. Método según la reivindicación 20 o la
reivindicación 21, en el que la resina y el polímero tienen la misma
carga neta.
24. Método según la reivindicación 21, en el que
se añade el polímero cargado en un gradiente de concentración para
llevar a cabo una elución selectiva desde el soporte sólido.
25. Método de replegamiento de TFPI, una muteína
de TFPI o TFPI-2, que comprende la etapa de añadir
un polímero cargado a una disolución que comprende TFPI, muteína de
TFPI o TFPI-2 desnaturalizados o replegados de
manera inadecuada antes de permitir que se repliegue dicho TFPI,
muteína de TFPI o TFPI-2.
26. Método según la reivindicación 25, en el que
el polímero es sulfato de dextrano.
27. Método según la reivindicación 25, en el que
el polímero es heparina.
28. Método según la reivindicación 25, en el que
la heparina se añade en disolución.
29. Método según la reivindicación 25, que
comprende además las etapas de:
incubar dicha disolución para permitir que se
repliegue dicho TFPI, muteína de TFPI o TFPI-2,
añadir sal para disociar el polímero del TFPI, muteína de TFPI o
TFPI-2, hacer pasar la disolución por una columna de
HIC y recuperar el TFPI, muteína de TFPI o
TFPI-2.
30. Método de replegamiento de TFPI, una muteína
de TFPI o TFPI-2, que comprende la etapa de
inmovilizar polímeros de polisacáridos sulfatados en una columna y
hacer pasar una disolución de TFPI, muteína de TFPI o
TFPI-2 desnaturalizado a través de la columna y
eluir el TFPI, muteína de TFPI o TFPI-2 replegado
después de que se haya producido el replegamiento.
31. Método según la reivindicación 30, en el que
el polisacárido sulfatado es sulfato de dextrano.
32. Método según la reivindicación 30, en el que
el polisacárido sulfatado es heparina.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US47366895A | 1995-06-07 | 1995-06-07 | |
US47767795A | 1995-06-07 | 1995-06-07 | |
US473668 | 1995-06-07 | ||
US477677 | 1995-06-07 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2248818T3 true ES2248818T3 (es) | 2006-03-16 |
Family
ID=27044215
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES96924269T Expired - Lifetime ES2248818T3 (es) | 1995-06-07 | 1996-06-07 | Metodo de solubilizacion, purificacion y replegamiento de proteinas. |
ES05076848T Expired - Lifetime ES2285632T3 (es) | 1995-06-07 | 1996-06-07 | Formulacion acuosa que comprende tfpi y agentes solubilizadores. |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES05076848T Expired - Lifetime ES2285632T3 (es) | 1995-06-07 | 1996-06-07 | Formulacion acuosa que comprende tfpi y agentes solubilizadores. |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US6323326B1 (es) |
EP (2) | EP1602667B1 (es) |
JP (4) | JPH11514334A (es) |
AT (2) | ATE301675T1 (es) |
CA (1) | CA2223745C (es) |
DE (2) | DE69635051T2 (es) |
DK (2) | DK1602667T3 (es) |
ES (2) | ES2248818T3 (es) |
PT (1) | PT1602667E (es) |
WO (1) | WO1996040784A2 (es) |
Families Citing this family (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69635051T2 (de) * | 1995-06-07 | 2006-06-14 | Chiron Corp | Methode zur lösung, reinigung und rückfaltung von protein |
US5914390A (en) * | 1997-05-12 | 1999-06-22 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Methods for increasing yields of recombinant proteins |
EP1220682B1 (en) | 1999-10-04 | 2006-11-22 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Stabilized liquid polypeptide-containing pharmaceutical compositions |
WO2003014736A1 (en) * | 2001-08-10 | 2003-02-20 | Meditech Reserach Limited | Biological molecules comprising glycosaminoglycans |
US7186539B1 (en) | 2001-08-31 | 2007-03-06 | Pharmacia & Upjohn Company | Method for refolding enzymes |
HUP0501111A2 (en) | 2001-10-15 | 2007-12-28 | Chiron Corp | Treatment of severe pneumonia by administration of tissue factor pathway inhibitor |
EP1314739A1 (en) * | 2001-11-22 | 2003-05-28 | Bayer Ag | Process for renaturation of recombinant, disulfide containing proteins at high protein concentrations in the presence of amines |
EP1572904B1 (en) * | 2002-02-21 | 2009-04-15 | Pharmacia & Upjohn Company LLC | Modified bace |
JP2008500942A (ja) * | 2003-01-08 | 2008-01-17 | カイロン コーポレイション | 組織因子経路インヒビターまたは組織因子経路インヒビター改変体を含有する安定化凍結乾燥組成物 |
EP1803445A3 (en) * | 2003-01-08 | 2007-11-21 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Stabilized lyophilized compositions comprising tissue factor pathway inhibitor or tissue factor pathway inhibitor variants |
SI1599222T1 (sl) | 2003-01-08 | 2009-08-31 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Stabilizirani vodni sestavki, ki obsegajo inhibitor poti tkivnega faktorja (TFPI) ali varianto inhibitorja poti tkivnega faktorja |
DE10333317A1 (de) * | 2003-07-22 | 2005-02-17 | Biotecon Therapeutics Gmbh | Formulierung für Proteinarzneimittel ohne Zusatz von humanem Serumalbumin (HSA) |
JP4522997B2 (ja) * | 2003-08-13 | 2010-08-11 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス,インコーポレーテッド | Tfpiおよびtfpiアナログを精製するための改良された方法 |
US20080286279A1 (en) * | 2004-03-17 | 2008-11-20 | Chiron Corporation | Treatment of Severe Community-Acquired Pneumonia by Administration of Tissue Factor Pathway Inhibitor (Tfpi) |
US7148067B2 (en) * | 2004-08-31 | 2006-12-12 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Thromboplastin reagents |
WO2006088741A2 (en) * | 2005-02-16 | 2006-08-24 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Procoagulants based on metal-chelating lipids |
WO2006096345A2 (en) * | 2005-03-04 | 2006-09-14 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Coagulation and fibrinolytic cascades modulator |
KR20080041640A (ko) * | 2005-07-25 | 2008-05-13 | 트루비온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 | 단백질 분산을 위한 조성물과 방법 |
WO2007081534A2 (en) * | 2005-12-22 | 2007-07-19 | Pfizer Products Inc | Method of producing catalytically active bace2 enzymes |
JP5274795B2 (ja) * | 2006-07-27 | 2013-08-28 | 三洋化成工業株式会社 | タンパク質のリフォールディング方法 |
WO2008045948A2 (en) * | 2006-10-10 | 2008-04-17 | Steward Environmental Solutions, Llc | Adsorbent composition and method of making same |
US20080249286A1 (en) * | 2007-04-05 | 2008-10-09 | Seefeldt Matthew B | High-pressure refolding of proteins in the presence of binding partners |
US8821861B2 (en) * | 2007-10-05 | 2014-09-02 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Fibrin sealant |
WO2009061697A1 (en) | 2007-11-09 | 2009-05-14 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Anticoagulant antagonist and hemophilia procoagulant |
WO2010150708A1 (ja) * | 2009-06-22 | 2010-12-29 | 株式会社メディネット | 蛋白質の修飾剤 |
WO2014100302A1 (en) * | 2012-12-21 | 2014-06-26 | Merck Sharp & Dohme Corp. | On-column refolding and purifying of lipoproteins |
KR20190129061A (ko) | 2017-03-31 | 2019-11-19 | 메이지 세이카 파루마 가부시키가이샤 | 수성 제제 및 주사기 내 수성 제제, 및 항체 단백질 탈응집제 및 항체 단백질 탈응집 방법 |
JP2021080169A (ja) * | 2018-02-09 | 2021-05-27 | Spiber株式会社 | 組換えタンパク質の製造方法 |
CN108373494A (zh) * | 2018-02-27 | 2018-08-07 | 武汉伊艾博科技有限公司 | 一种防止重组蛋白质降解的保护技术 |
Family Cites Families (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3325223A1 (de) * | 1983-07-13 | 1985-01-24 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gegen denaturierung bestaendige, waessrige proteinloesungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
US4766224A (en) * | 1985-08-19 | 1988-08-23 | International Minerals & Chemical Corp. | Purification and activation of proteins from insoluble inclusion bodies |
US5276016A (en) | 1986-06-03 | 1994-01-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Small peptides which inhibit binding to T-4 receptors and act as immunogens |
US4966852A (en) | 1987-07-23 | 1990-10-30 | Monsanto Company | DNA clone of human tissue factor inhibitor |
JPH0662666B2 (ja) * | 1988-01-25 | 1994-08-17 | コンソルテイウム・フュア・エレクトロケミッシェ・インドゥストリー・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 不溶蛋白質の可溶化法 |
EP0325691B1 (de) * | 1988-01-25 | 1993-04-07 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur Solubilisierung von unlöslichem Protein |
US5466893A (en) * | 1989-02-21 | 1995-11-14 | Tatsuta Electric Wire & Cable Co., Ltd. | Printed circuit board having enhanced EMI suppression |
US5378614A (en) * | 1989-08-18 | 1995-01-03 | Novo Nordisk A/S | Vector and method for making tissue factor pathway inhibitor (TFPI) analogues in yeast |
JPH0791318B2 (ja) * | 1989-09-21 | 1995-10-04 | 三井東圧化学株式会社 | 蛋白質水溶液、蛋白質水溶液の濃度増大方法および蛋白質製剤 |
PT98779B (pt) * | 1990-08-27 | 1999-06-30 | Monsanto Co | Processo para a preparacao de uma composicao anticoagulante contendo inibidor sulfatados e metodos para a sua utilizacao |
US5849703A (en) * | 1990-08-27 | 1998-12-15 | G. D. Searle & Co. | Pre-formed anticoagulant heparin/TFPI complexes |
DE69116168T2 (de) | 1990-11-28 | 1996-05-30 | Tapco International | Schieber |
DE4126983A1 (de) * | 1991-08-15 | 1993-02-18 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur herstellung von humanprotein-enthaltenden, konservierten arzneimitteln fuer infusions- oder injektionszwecke |
US5212091A (en) | 1992-03-02 | 1993-05-18 | Monsanto Company | Method of producing tissue factor pathway inhibitor |
US5276015A (en) * | 1992-03-18 | 1994-01-04 | Washington University | Method of inhibiting microvascular thrombosis |
KR950701820A (ko) | 1992-06-11 | 1995-05-17 | 로저 에이. 윌리암스 | 패혈증 및 패혈증-연관 옹고장애의 예방 및 치료(prophylaxs and treatment of sepsis and sepsis-associated coagulation disorders) |
US5358708A (en) * | 1993-01-29 | 1994-10-25 | Schering Corporation | Stabilization of protein formulations |
JP3428687B2 (ja) * | 1993-06-30 | 2003-07-22 | 財団法人化学及血清療法研究所 | 組織因子凝固系インヒビターの調製法 |
US5407810A (en) * | 1993-08-20 | 1995-04-18 | Genentech, Inc. | Aqueous multiple-phase isolation of polypeptide |
DK0769962T3 (da) | 1994-07-07 | 2003-06-23 | Univ Washington | Fremgangsmåde til afsvækkelse af arteriel stenose |
JP3779728B2 (ja) * | 1994-08-05 | 2006-05-31 | カイロン コーポレイション | 組織因子活性インヒビターの産生 |
DE69635051T2 (de) * | 1995-06-07 | 2006-06-14 | Chiron Corp | Methode zur lösung, reinigung und rückfaltung von protein |
JP4522997B2 (ja) * | 2003-08-13 | 2010-08-11 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス,インコーポレーテッド | Tfpiおよびtfpiアナログを精製するための改良された方法 |
-
1996
- 1996-06-07 DE DE69635051T patent/DE69635051T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 CA CA002223745A patent/CA2223745C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-07 JP JP9502126A patent/JPH11514334A/ja active Pending
- 1996-06-07 DK DK05076848T patent/DK1602667T3/da active
- 1996-06-07 EP EP05076848A patent/EP1602667B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 AT AT96924269T patent/ATE301675T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 US US08/973,211 patent/US6323326B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-07 EP EP96924269A patent/EP0837883B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 AT AT05076848T patent/ATE358684T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 DK DK96924269T patent/DK0837883T3/da active
- 1996-06-07 ES ES96924269T patent/ES2248818T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 DE DE69637012T patent/DE69637012T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 PT PT05076848T patent/PT1602667E/pt unknown
- 1996-06-07 ES ES05076848T patent/ES2285632T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 WO PCT/US1996/009980 patent/WO1996040784A2/en active IP Right Grant
-
1999
- 1999-11-18 US US09/443,098 patent/US6319896B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-11-30 US US09/996,588 patent/US7022672B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-09-18 JP JP2003326585A patent/JP2004083591A/ja not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-06-23 JP JP2004184539A patent/JP2004315541A/ja not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-01-24 US US11/337,518 patent/US7226757B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-04-05 US US11/697,188 patent/US20080281084A1/en not_active Abandoned
- 2007-10-25 JP JP2007277137A patent/JP2008115176A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69635051T2 (de) | 2006-06-14 |
CA2223745A1 (en) | 1996-12-19 |
EP0837883A2 (en) | 1998-04-29 |
EP1602667A1 (en) | 2005-12-07 |
DE69637012T2 (de) | 2009-01-08 |
US7022672B2 (en) | 2006-04-04 |
ATE358684T1 (de) | 2007-04-15 |
WO1996040784A3 (en) | 1997-03-13 |
CA2223745C (en) | 2004-03-16 |
ES2285632T3 (es) | 2007-11-16 |
JP2004315541A (ja) | 2004-11-11 |
WO1996040784A2 (en) | 1996-12-19 |
US20020137884A1 (en) | 2002-09-26 |
DK0837883T3 (da) | 2005-12-19 |
US6319896B1 (en) | 2001-11-20 |
US20060128947A1 (en) | 2006-06-15 |
PT1602667E (pt) | 2007-07-13 |
EP1602667B1 (en) | 2007-04-04 |
ATE301675T1 (de) | 2005-08-15 |
US20080281084A1 (en) | 2008-11-13 |
US6323326B1 (en) | 2001-11-27 |
DE69635051D1 (de) | 2005-09-15 |
JP2004083591A (ja) | 2004-03-18 |
US7226757B2 (en) | 2007-06-05 |
EP0837883B1 (en) | 2005-08-10 |
DK1602667T3 (da) | 2007-07-23 |
JPH11514334A (ja) | 1999-12-07 |
DE69637012D1 (de) | 2007-05-16 |
JP2008115176A (ja) | 2008-05-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2248818T3 (es) | Metodo de solubilizacion, purificacion y replegamiento de proteinas. | |
ES2531464T3 (es) | Factor VIII, factor de von Willebrand o sus complejos con semivida in vivo prolongada | |
ES2753183T3 (es) | Aplicación terapéutica de inhibidores de la proteasa de serina de tipo Kazal | |
ES2342404T3 (es) | Preparacion farmaceutica de factor viii recombinante liofilizada sin albumina como estabilizante. | |
ES2311789T3 (es) | Composiciones liofilizadas estabilizadas que comprenden inhibidor de la via del factor tisular o variantes del inhibidor de la via del factor tisular. | |
ES2710313A2 (es) | Composicion para la prevencion de la trombogenesis y procedimiento para fabricacion de la misma | |
SE462893B (sv) | Vattenhaltig parenteral loesning av vaevnadsplasminogenaktivator och saett foer framstaellning av den | |
ES2233924T3 (es) | Un procedimiento para preparar fragmentos terapeuticos de factor von willebrand. | |
ES2220673T3 (es) | Factor estimulante de colonias de granulocitos estabilizado. | |
BR112012010392B1 (pt) | composição e kit para o inibidor de alfa-1 proteinase | |
ES2302336T3 (es) | Fragmentos terapeuticos de factor von willebrand. | |
AU2014237111B2 (en) | Recombinant factor VIII formulations | |
RU2740185C2 (ru) | Пептидная композиция | |
AU713338B2 (en) | Method of solubilizing, purifying, and refolding protein | |
AU2003200506B2 (en) | Method of solubilizing, purifying and refolding protein and compositions comprising proteins and solubilizing agents | |
AU759412B2 (en) | Method of solubilizing, purifying and refolding protein and compositions comprising proteins and solubilizing agents | |
AU713338C (en) | Method of solubilizing, purifying, and refolding protein | |
JPH03218399A (ja) | 尿由来の抗血液疑固物質、その製法およびそれを含有する医薬組成物 | |
CA2451969A1 (en) | Method of purifying tissue factor pathway inhibitor | |
JP7142286B2 (ja) | セレン含有アミノ酸を含む糖鎖-ポリペプチド複合体、および、その医薬用途 | |
ES2738550T3 (es) | Composición farmacéutica con estabilidad mejorada que contiene la proteína de fusión de factor VII |