ES2248818T3 - Metodo de solubilizacion, purificacion y replegamiento de proteinas. - Google Patents

Metodo de solubilizacion, purificacion y replegamiento de proteinas.

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ES2248818T3
ES2248818T3 ES96924269T ES96924269T ES2248818T3 ES 2248818 T3 ES2248818 T3 ES 2248818T3 ES 96924269 T ES96924269 T ES 96924269T ES 96924269 T ES96924269 T ES 96924269T ES 2248818 T3 ES2248818 T3 ES 2248818T3
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tfpi
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protein
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refolding
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Glenn J. Dorin
Bo H. Arve
Gregory L. Pattison
Robert F. Halenbeck
Kirk Johnson
Bao-Lu Chen
Rajsharan K. Rana
Maninder S. Hora
Hassan Madani
Mark E. Gustafson
Michael Tsang
Gary S. Bild
Gary V. Johnson
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GD Searle LLC
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GD Searle LLC
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Abstract

SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA MODIFICAR LA SOLUBILIDAD DE UNA PROTEINA QUE EMPLEA POLIMEROS POLI - IONICOS. ESTOS FACILITAN LA SOLUBILIZACION, LA FORMULACION, LA PURIFICACION Y EL REPLEGAMIENTO DE PROTEINAS, EN ESPECIAL DE PROTEINAS PLEGADAS DE FORMA INCORRECTA Y PROTEINAS AGREGADAS. SE DESCRIBEN COMPOSICIONES QUE RESULTAN ADECUADAS PARA FORMULAR TFPI. LAS COMPOSICIONES PERMITEN LA PREPARACION DE COMPOSICIONES FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLES DE TFPI A UNAS CONCENTRACIONES POR ENCIMA DE 0,2 MG/ML Y POR ENCIMA DE 10 MG/ML.

Description

Método de solubilización, purificación y replegamiento de proteínas.
Campo técnico de la invención
Esta invención se refiere a los métodos útiles para replegar, solubilizar, formular y purificar proteínas. Estos métodos son particularmente útiles para proteínas que se han modificado mediante recombinación genética y producido en bacterias, levaduras u otras células en una forma que tiene una estructura terciaria no nativa.
Antecedentes de la invención
Para comprender por completo el proceso total de la expresión génica, es tan importante comprender el proceso para el plegamiento de la cadena peptídica en una proteína biológicamente activa como comprender la síntesis de la secuencia primaria. Las actividades biológicas de las proteínas dependen no sólo de sus secuencias de aminoácidos sino también de las conformaciones diferenciadas de las proteínas en cuestión y ligeras perturbaciones en la integridad conformacional de una proteína puede destruir su actividad. Tsou et al. (1998) Biochemistry 27:1809-1812.
En las condiciones adecuadas, el replegamiento in vitro de proteínas desnaturalizadas purificadas para obtener la estructura secundaria y terciaria nativa es un proceso espontáneo. Para evitar la formación de estructuras estables pero no deseadas, es necesario utilizar las interacciones terciarias (que se forman después en el plegamiento) con su alto grado de poder de selectividad para seleccionar y estabilizar adicionalmente esas estructuras locales iniciales que se encuentran en la ruta de plegamiento correcta. Por lo tanto, la estabilidad finita pero muy baja de las estructuras locales podría ser el mecanismo cinético de "corrección de lectura" del plegamiento de proteínas. El estado activado de plegamiento con la mayor energía es una forma distorsionada de la proteína nativa y la etapa más lenta, limitante de la velocidad, del desplegamiento y replegamiento parece estar próxima al estado nativo en cuanto a la estructura ordenada. Además, el replegamiento de muchas proteínas no es completamente reversible in vitro, y frecuentemente se observan rendimientos de reactivación inferiores al 100%, lo cual es válido en particular para experimentos con alta concentración de proteínas, y la agregación competitiva de moléculas de proteína desplegadas o parcialmente replegadas puede ser la razón principal para una reversibilidad reducida, tal como se describe en Fischer y Schmid, (1990) Biochemistry 29: 2205-2212.
En el caso de moléculas de proteína suficientemente largas, la cadena polipeptídica naciente adquiere su estructura tridimensional nativa mediante el ensamblaje modular de microdominios. Se han probado variables que incluyen la temperatura y codisolventes tales como polioles, urea y cloruro de guanidinio para determinar su papel en la estabilización y desestabilización de conformaciones de las proteínas. La acción de los codisolventes puede ser el resultado de la unión directa o de alteraciones de las propiedades físicas del agua, tal como se describe en Jaenicke et al. (1991) Biochemistry 30 (13):3147-3161.
Las observaciones experimentales de cómo se repliegan las proteínas desplegadas en sus estructuras tridimensionales nativas se oponen a muchas teorías populares sobre los mecanismos de plegamiento de proteínas. En condiciones que permitan el replegamiento, las moléculas de proteína desplegadas se equilibran rápidamente entre diferentes conformaciones antes del replegamiento completo. El rápido equilibrio previo al plegamiento favorece ciertas conformaciones compactas que tienen energías libres algo más bajas que las demás conformaciones desplegadas. La etapa limitante de la velocidad tiene lugar después en la ruta e involucra a una forma distorsionada de alta energía de la conformación nativa. Esto parece ser una única transición a través de la cual se pliegan esencialmente todas las moléculas, tal como se describe en Creighton et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:5082-5086.
Se han utilizado diversos métodos de replegamiento de proteínas purificadas producidas por recombinación. Por ejemplo, puede producirse la proteasa codificada por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo I (VIH-I) en Escherichia coli, produciendo cuerpos de inclusión que albergan la proteasa de VIH-I recombinante, tal como se describe en Hui et al. (1993) J. Prot. Chem. 12:323-327. Se replegó la proteasa de VIH-I purificada para dar una enzima activa diluyendo una disolución de la proteína en ácido acético al 50% con 25 volúmenes de tampón a pH 5,5. Se encontró que se obtenía una actividad específica de proteasa superior si se disolvía la proteína purificada a aproximadamente 2 mg/ml en ácido acético al 50% seguido de una dilución con 25 volúmenes de acetato de sodio frío 0,1 M, pH 5,5, que contenía un 5% de etilenglicol y un 10% de glicerol. La exclusión del glicerol y del etilenglicol condujo a una pérdida gradual de proteína debido a precipitación. Se obtuvieron aproximadamente 85 mg de proteasa VIH-I correctamente plegada por litro de un cultivo celular de Escherichia coli y la enzima tenía una alta actividad específica.
Otro ejemplo de replegamiento de una proteína recombinante es el aislamiento y replegamiento de H-ras a partir de cuerpos de inclusión de E. coli, tal como se describe en DeLoskey et al. (1994) Arch. Biochem and Biophys. 311:72-78. En este estudio, se variaron la concentración de proteína, la temperatura, y la presencia de un 10% de glicerol durante el replegamiento. El mayor rendimiento de H-ras correctamente plegada se produjo cuando la proteína se replegó a concentraciones inferiores o iguales a 0,1 mg/ml y fue independiente de la presencia de un 10% de glicerol. El rendimiento fue ligeramente superior a 4º que a 25ºC.
El replegamiento del inhibidor de la ruta del factor tisular (también conocido de forma diversa como inhibidor de la coagulación asociado a lipoproteínas (LACI), inhibidor de la ruta extrínseca (EPI) e inhibidor del factor tisular (EFI) y denominados más adelante en el presente documento "TFPI") se produce en un sistema de expresión bacteriano que se ha descrito por Gustafson et al. (1994) Protein Expression and Purification 5:233-241. En este estudio, el alto nivel de expresión del TFPI en E. coli recombinante dio como resultado la acumulación de TFPI en los cuerpos de inclusión. Se produjo proteína activa mediante la solubilización de los cuerpos de inclusión en urea 8 M, y la purificación de la molécula de longitud completa se logró mediante cromatografía de intercambio catiónico y renaturalización en urea 6 M. Se fraccionó entonces la mezcla replegada para producir un TFPI no glucosilada purificada que tiene actividad biológica in vitro, tal como se midió en el ensayo del tiempo de coagulación de protrombina comparable al TFPI purificado a partir de células de mamíferos.
También se ha producido y aislado a partir de células de Escherichia coli (E. coli) una forma no glucosilada de TFPI, tal como se describe en la patente de los EE.UU. número 5.212.091. La invención descrita en la patente de los EE.UU. número 5.212.091. sometía los cuerpos de inclusión que contenían TFPI a una sulfitólisis para formar TFPI-S-sulfonato, purificaba el TFPI-S-sulfonato mediante cromatografía de intercambio aniónico, replegaba el TFPI-S-sulfonato mediante intercambio de disulfuro utilizando cisteína, y purificaba el TFPI activo mediante cromatografía de intercambio catiónico. Se ha demostrado que la forma de TFPI descrita en la patente de los EE.UU. número 5.212.091. es activa en la inhibición del factor bovino Xa y en la inhibición de la coagulación inducida por el factor tisular humano en plasma. En algunos ensayos, el TFPI producido por E. coli ha mostrado ser más activo que el TFPI nativo derivado de células de hepatoma SK. Sin embargo, el TFPI producido en células de E. coli está modificado de manera que aumenta la heterogeneidad de la proteína.
En la técnica del replegamiento de proteínas producidas por recombinación existe la necesidad de incrementar la cantidad de TFPI correctamente plegado durante el proceso de replegamiento. También existe la necesidad de incrementar la solubilidad del TFPI. Actualmente los rendimientos de TFPI producido mediante recombinación han sido menores de lo deseado y existe una necesidad en la técnica de producir TFPI correctamente plegado. Véase por ejemplo Gustafuson et al. (1994) Protein Expression and Purification 5:233-241.
El TFPI inhibe la cascada de coagulación al menos de dos formas: evitando la formación del complejo de factor VIIa/factor tisular y uniéndose al sitio activo del factor Xa. La secuencia primaria de TFPI, deducida a partir de la secuencia de ADNc, indica que la proteína contiene tres dominios inhibidores de enzima de tipo Kunitz. Se requiere el primero de estos dominios para la inhibición del complejo de factor VIIa / factor tisular. El segundo dominio de tipo Kunitz es necesario para la inhibición del factor Xa. Se desconoce la función del tercer dominio de tipo Kunitz. El TFPI no presenta actividad enzimática conocida y se cree que inhibe sus dianas para proteasa de manera estequiométrica; concretamente, uniéndose un dominio de tipo Kunitz del TFPI al sitio activo de una molécula de proteasa. Se cree que el extremo carboxi-terminal del TFPI desempeña un papel en la localización en la superficie celular a través de la unión con heparina o mediante interacción con un fosfolípido. También se conoce al TFPI como inhibidor de la coagulación asociado a lipoproteínas (LACI), inhibidor del factor tisular (TFI) e inhibidor de la ruta extrínseca (EPI).
El TFPI maduro tiene una longitud de 276 aminoácidos con un extremo amino-terminal cargado negativamente y un extremo carboxi-terminal cargado positivamente. El TFPI contiene 18 residuos de cisteína y forma 9 puentes disulfuro cuando se pliega correctamente. La secuencia primaria también contiene tres sitios consenso de glucosilación de unión a N Asn-X-Ser/Thr, localizándose los residuos de asparagina en las posiciones 145, 195 y 256. El componente de hidrato de carbono del TFPI maduro representa aproximadamente el 30% de la masa de la proteína. Sin embargo, los datos obtenidos a partir del mapeo proteolítico y los datos de los espectros de masas implican que los restos de hidrato de carbono son heterogéneos. Se ha encontrado también que el TFPI está fosforilado en el residuo de serina en la posición 2 de la proteína en grados variables. La fosforilación parece no afectar la función del TFPI.
Se ha aislado TFPI a partir de plasma humano y de células en cultivos tisulares humanos que incluyen células HepG2, hepáticas Chang y de hepatoma SK. Se ha expresado TFPI recombinante en células C127 de ratón, en células renales de cría de hámster, en células de ovario de hámster chino y en células de hepatoma SK humano. Se ha demostrado que el TFPI recombinante procedente de células de ratón C127 inhibe en modelos animales la coagulación inducida por el factor tisular.
Se produjo y aisló una forma no glucosilada de TFPI recombinante a partir de células de E. coli tal como se describe en la patente de los EE.UU. Número 5.212.091. Esta forma de TFPI ha demostrado ser activa en la inhibición del factor Xa bovino y en la inhibición de la coagulación inducida por el factor tisular humano en el plasma. También se han descrito métodos para la purificación de TFPI a partir de medio de cultivo de células de levadura, tal como en Petersen et al., J. Biol. Chem. 18:13344-13351 (1993).
Recientemente, se ha identificado otra proteína con un alto grado de identidad estructural con TFPI. Sprecher et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 91:3353-3357 (1994). La estructura secundaria prevista para esta proteína, denominada TFPI-2, es prácticamente idéntica a la del TFPI con 3 dominios de tipo Kunitz, 9 enlaces cisteína-cisteína un extremo amino-terminal ácido y una cola carboxi-terminal básica. Los tres dominios de tipo Kunitz del TFPI-2 muestran el 43%, 35% y 53% de identidad de la secuencia primaria con los dominios de tipo Kunitz 1, 2 y 3, respectivamente. El TFPI-2 recombinante inhibe fuertemente la actividad amidolítica del factor VIIa/factor tisular. Por el contrario, el TFPI-2 es un inhibidor débil de la actividad amidolítica del factor Xa.
Se ha demostrado que el TFPI evita la mortalidad en un modelo de babuino de choque séptico con Escherichia coli (E. coli) letal. Creasey et al. J. Clin. Invest. 91:2850-2860. (1993). La administración de TFPI a 6 mg/kg de peso corporal poco después de la infusión de una dosis letal de E. coli dio como resultado la supervivencia de los cinco animales tratados con TFPI con una mejoría significativa en la calidad de vida en comparación con el tiempo medio de supervivencia de los cinco animales control de 39,9 horas. La administración de TFPI también dio como resultado una atenuación significativa de la respuesta de coagulación, de varias medidas del daño celular y una reducción significativa en la patología que se observa normalmente en los órganos diana de una sepsis por E. coli, que incluyen riñones, glándulas suprarrenales y pulmones.
Debido a sus propiedades inhibidoras de coágulos, el TFPI también puede usarse para prevenir la trombosis durante cirugía microvascular. Por ejemplo, el documento U.S. 5.276.015 describe el uso del TFPI en un método para reducir la trombogenicidad de anastomosis microvasculares en las que se administra TFPI en la zona de las anastomosis microvasculares de manera contemporánea a la reconstrucción microvascular.
El TFPI es una proteína hidrófoba y como tal, presenta una solubilidad muy limitada en disoluciones acuosas. Esta solubilidad limitada ha hecho difícil de fabricar la preparación de formulaciones farmacéuticamente aceptables, especialmente para las indicaciones clínicas que pueden beneficiarse de la administración de altas dosis de TFPI. Por tanto, existe la necesidad en la técnica de composiciones farmacéuticamente aceptables que contengan concentraciones de TFPI que puedan administrarse a los pacientes en cantidades aceptables.
Breve descripción de la figuras
La figura 1 es un análisis mediante SDS-PAGE con tinción de Coomassie de las fracciones de pico de TFPI procedentes del procedimiento de replegamiento mediante Phenyl Sepharose-HIC (cromatografía de interacción hidrófoba).
La figura 2 es una representación gráfica de la recuperación de TFPI nativo a partir de la columna de HIC.
La figura 3 es una representación gráfica de la recuperación de TFPI nativo a partir de una segunda columna de HIC.
La figura 4 es la secuencia de aminoácidos de TFPI.
La figura 5 muestra la solubilidad del TFPI en diferentes condiciones de pH. Se dializaron aproximadamente 10 mg/ml de TFPI en urea 2 M frente a acetato, fosfato, citrato, glicina, L-glutamato y succinato 20 mM en NaCl 150 mM. Se midió la concentración del TFPI soluble restante después de la diálisis mediante la absorbancia UV después de separar por filtración los precipitados a través de unidades de filtración de 0,22 mm.
La figura 6 muestra la solubilidad del TFPI como una función de la concentración de citrato en presencia de fosfato de Na 10 mM a pH 7. La solubilidad del TFPI aumenta con las concentraciones crecientes de citrato.
La figura 7 muestra la solubilidad del TFPI como una función de la concentración de NaCl. La solubilidad del TFPI aumenta con las concentraciones crecientes de sal, lo que indica que la sal potencia la solubilidad del TFPI.
La figura 8 muestra el efecto del pH sobre la estabilidad del TFPI preparado en fosfato de Na 10 mM, NaCl 150 mM y 0,005% (p/v) de polisorbato-80. Se incubaron a 40ºC muestras para estabilidad que contenían TFPI 150 mg/ml durante 20 días. Se analizó la constante cinética de velocidad del TFPI soluble restante mediante el seguimiento de la disminución del pico principal en cromatogramas de intercambio catiónico.
La figura 9 muestra el porcentaje de TFPI soluble restante medido mediante HPLC de intercambio catiónico (A) y el TFPI activo restante mediante el ensayo del tiempo de protrombina (B) como una función de la concentración de fosfato. La formulación contiene TFPI 150 mg/ml en NaCl 150 mM y 0,005% (p/v) de polisorbato-80 a pH 7 con concentraciones variables de fosfato.
La figura 10 muestra la pérdida de TFPI soluble a 40ºC medida mediante HPLC de intercambio catiónico (triángulos) y el ensayo del tiempo de protrombina (círculos) para TFPI 0,5 mg/ml formulado en citrato de Na 10 mM, pH 6 y NaCl 150 mM.
La figura 11 muestra la pérdida de TFPI soluble a 40ºC medida mediante HPLC de intercambio catiónico (símbolos en blanco) y el ensayo del tiempo de protrombina (símbolos rellenos) para TFPI 0,5 mg/ml formulado en fosfato de Na 10 mM, pH 6 y o bien NaCl 150 mM (triángulos) o bien NaCl 500 mM (círculos).
La figura 12 muestra la pérdida de TFPI soluble a 40ºC medida mediante HPLC de intercambio catiónico (símbolos en blanco) y el ensayo del tiempo de protrombina (símbolos rellenos) para TFPI 0,5 mg/ml formulado en acetato de Na 10 mM y pH 5,5 que contiene NaCl 150 mM (triángulos) o un 8% (p/v) de sacarosa (cuadrados) o un 4,5% de manitol (círculos).
La figura 13 muestra dos geles de SDS no reductores para las muestras de formulación de TFPI a pH de 4 a 9 almacenados a 40ºC durante de 0 a 20 días.
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La figura 14 muestra el transcurso con el tiempo de un replegamiento de rhTFPI (TFPI recombinante humana) facilitado con polifosfato monitorizado utilizando SDS-PAGE.
La figura 15 muestra la absorbancia a 280 nm durante la carga y la elución de la columna S-Sepharose-HP utilizada para purificar rhTFPI procedente de un replegamiento facilitado con polifosfato.
La figura 16 muestra el análisis mediante SDS-PAGE de las fracciones recogidas durante la elución de la columna S-Sepharose HP utilizada para purificar rhTFPI procedente de un replegamiento facilitado con polifosfato.
La figura 17 muestra la absorbancia a 280 nm durante la carga y la elución de la columna Q-Sepharose HP utilizada para purificar rhTFPI de una combinación procedente de la columna S-Sepharose, preparada a partir de un replegamiento facilitado con polifosfato.
La figura 18 muestra el análisis mediante SDS-PAGE de las fracciones recogidas durante la elución de la columna Q-Sepharose HP utilizada para purificar rhTFPI de una combinación procedente de la columna Q-Sepharose, preparada a partir de un replegamiento facilitado con polifosfato.
La figura 19 muestra el transcurso con el tiempo de un replegamiento de rhTFPI facilitado con polietilenimina monitorizado utilizando SDS-PAGE.
La figura 20 muestra la absorbancia a 280 nm durante la carga y la elución de la columna S-Sepharose HP utilizada para purificar rhTFPI procedente de un replegamiento facilitado con polietilenimina.
La figura 21 muestra el análisis mediante SDS-PAGE de las fracciones recogidas durante la elución de la columna S-Sepharose HP utilizada para purificar rhTFPI procedente de un replegamiento facilitado con polietilenimina.
La figura 22 muestra la absorbancia a 280 nm durante la carga y la elución de la columna Q-Sepharose HP utilizada para purificar rhTFPI de una combinación procedente de la columna S-Sepharose, preparada a partir de un replegamiento facilitado con polietilenimina.
La figura 23 muestra el análisis mediante SDS-PAGE de las fracciones recogidas durante la elución de la columna Q-Sepharose HP utilizada para purificar rhTFPI de una combinación procedente de la columna Q-Sepharose, preparada a partir de un replegamiento facilitado con polifosfato.
La figura 24 muestra el análisis mediante HPLC de intercambio catiónico de un replegamiento de rhTFPI facilitado con polifosfato al 0,4% en ausencia de urea.
La figura 25 muestra los resultados del análisis mediante HPLC de intercambio catiónico de una evaluación de diferentes niveles de cisteína en un replegamiento de rhTFPI en polifosfato al 0,4%, Tris 50 mM en ausencia de urea.
La figura 26 muestra el efecto de la longitud de la cadena de polifosfato sobre el transcurso de un replegamiento facilitado con polifosfato de los cuerpos de inclusión de rhTFPI monitorizado mediante HPLC de intercambio catiónico.
La figura 27 muestra el efecto de la concentración de polifosfato (Glass H) sobre el replegamiento del rhTFPI procedente de cuerpos de inclusión tal como se monitoriza mediante HPLC de intercambio catiónico.
La figura 28 muestra el análisis mediante HPLC de intercambio catiónico del replegamiento facilitado con polifosfato y polietilenimina de rhTFPI purificado y reducido.
Sumario de la invención
Es un objeto de la invención proporcionar formulaciones acuosas de rhTFPI.
Es otro objeto de la presente invención describir un método de replegamiento de TFPI que incluye las etapas de añadir polímeros cargados a una disolución de TFPI desnaturalizado antes de permitir que el TFPI se repliegue.
Además, es otro objeto de la presente invención describir un método de replegamiento del TFPI que incluya la etapa de inmovilizar polímeros cargados en una columna y hacer pasar una disolución de TFPI desnaturalizado a través de la columna y eluir el TFPI replegado una vez que se ha producido el replegamiento.
Se ha encontrado ahora que la solubilidad del TFPI depende fuertemente del pH y, sorprendentemente, que los polianiones tales como citrato, isocitrato y sulfato tienen profundos efectos solubilizantes sobre el TFPI. Este hallazgo es sorprendente a la luz de la naturaleza hidrófoba del TFPI y del carácter hidrófilo de estos antagonistas. Por tanto, pueden utilizarse citrato, isocitrato, sulfato así como otros solubilizantes descritos anteriormente en el presente documento para producir composiciones farmacéuticamente aceptables que tengan concentraciones suficientes de TFPI para la administración a pacientes. También se ha demostrado que otras moléculas orgánicas pueden actuar como solubilizantes secundarios. Estos solubilizantes secundarios incluyen PEG, sacarosa, manitol y sorbitol.
La invención se refiere a disoluciones acuosas que comprenden TFPI replegado, una muteína de TFPI replegado o un TFPI-2 replegado y un polímero cargado, en el que el TFPI replegado está presente en una concentración superior a 1 mg/ml de agentes solubilizantes. Los agentes solubilizantes pueden ser ion acetato, cloruro de sodio, ion citrato, ion isocitrato, glicina, glutamato, ion succinato, histidina, imidazol y dodecilsulfato de sodio (SDS) así como polímeros cargados. En algunas composiciones, el TFPI puede estar presente en concentraciones superiores a 10 mg/ml. La composición puede tener además uno o más solubilizantes. El solubilizante o solubilizantes secundarios pueden ser polietilenglicol (PEG), sacarosa, manitol o sorbitol. Finalmente, la composición puede contener fosfato de sodio a una concentración superior a 20 mM.
Aunque la solubilidad del TFPI es bastante baja entre pH 5 y 10, se ha encontrado que la L-arginina puede aumentar la solubilidad en un factor de 100. La solubilidad depende mucho de la concentración de arginina, ya que 300 mM es aproximadamente 30 veces más eficaz que 200 mM. La urea es también muy eficaz en la solubilización del TFPI.
Además, se ha encontrado que la agregación del TFPI parece ser la ruta de degradación principal en condiciones de pH neutro y básico y que la fragmentación tiene lugar en condiciones de pH ácido.
También se ha encontrado que los monómeros activos de TFPI pueden separarse de los oligómeros de TFPI que se producen durante el procedimiento de plegamiento del TFPI recombinante producido por E. coli. Algunas formas monoméricas con plegamiento erróneo/modificadas de TFPI se eliminan también durante este procedimiento. La separación emplea la cromatografía de interacción hidrófoba. Las especies oligoméricas del TFPI se unen más estrechamente a una resina hidrófoba que lo que lo hacen los monómeros activos de TFPI. Las resinas tales como Pharmacia^{TM} Octyl-Sepharose y Toyopearl^{TM} Butyl 650-M han resultado satisfactorias. El procedimiento se lleva a cabo en presencia alto contenido en sal, tal como sulfato de amonio 1 M o citrato de sodio 0.5 M.
Descripción detallada de la invención
Es un descubrimiento de los presentes inventores que los polímeros poliiónicos tales como la polietilenimina y el polifosfato, pueden modificar las interacciones iónicas dentro de las proteínas. El enmascaramiento de ciertas zonas de alta densidad de carga dentro de las proteínas usando poliiones puede tener numerosos efectos. Las proteínas cuya solubilidad se reduce a través de la neutralización intra y/o intermolecular de zonas cargadas de manera opuesta pueden ver mejorada su solubilidad enmascarando una de las regiones cargadas con policationes o poliiones. También pueden modularse las barreras frente a la flexibilidad conformacional y a fuerzas específicas atractivas o repulsivas que interfieren en el procedimiento de replegamiento. Las proteínas que requieren desnaturalizantes fuertes tales como urea o clorhidrato de guanidina para solubilizarse y mantener la solubilidad durante las operaciones de purificación pueden solubilizarse y procesarse de manera eficaz utilizando poliiones.
Muchas proteínas que carecen de una región clara de localización de carga en la secuencia primaria pueden mostrar aún zonas de localización de carga debido a su estructura secundaria. Por lo tanto, muchas proteínas pueden ver modificadas sus características de solubilidad, replegamiento y purificación a través de la interacción con moldes poliméricos cargados. La naturaleza de la modificación dependerá de la estructura de la proteína, la longitud de cadena, la carga y la densidad de carga del polímero iónico específicos.
Se ha caracterizado el replegamiento del TFPI puro en un tampón de replegamiento a base de urea o guanidina y los resultados indican que las cinéticas y eficacias de replegamiento pueden mejorarse significativamente mediante la adición de polímeros cargados que incluyen heparina, sulfato de dextrano, polietilenimina (PEI) y polifosfatos. Estos polímeros aumentan la solubilidad del TFPI y mejoran el replegamiento a través de interacciones iónicas con el extremo C-terminal o el N-terminal. Además de los aditivos poliméricos, el replegamiento del TFPI puro requiere un tampón redox cisteína/cistina en el que pueda completarse la reacción de replegamiento en un plazo de 8 horas. Los rendimientos de replegamiento son una fuerte función del pH, de la concentración redox, y de los aditivos poliméricos; sin embargo pueden conseguirse eficacias de replegamiento para TFPI puro de hasta el 60% en condiciones de replegamiento óptimas.
Los inventores de esta invención han encontrado que la adición de glucosaminoglucanos o polisacáridos sulfatados tales como, por ejemplo, heparina y sulfato de dextrano, a una disolución que contenga una proteína desnaturalizada antes del replegamiento aumenta la cantidad de proteína activa, correctamente plegada, en la que la proteína puede unirse al glucosaminoglucano o polisacárido sulfatado y se somete a condiciones renaturalizantes.
Disolución
La tecnología del ADN recombinante ha permitido la expresión a un alto nivel de muchas proteínas que normalmente no podían aislarse a partir de fuentes naturales en cantidades apreciables. En E. coli y otros diversos sistemas de expresión, la proteína se expresa frecuentemente en estado inactivo, desnaturalizado, en el que la secuencia primaria de aminoácidos es correcta, pero la estructura secundaria y terciaria y algunos puentes disulfuro de cisteína no están presentes. Las proteínas desnaturalizadas presentes en un cuerpo de inclusión pueden estar en una conformación tal que los residuos cargados de las diferentes partes de la estructura principal de aminoácidos que normalmente no están en contacto, pueden interaccionar para formar enlaces iónicos fuertes entre residuos de aminoácidos cargados positivamente y cargados negativamente. La formación de estos enlaces iónicos puede limitar la hidratación que debe producirse para que se lleve a cabo la disolución del cuerpo de inclusión. La proteína en un cuerpo de inclusión también puede complejarse con otros componentes celulares tales como los componentes de membrana y el ácido nucleico, lo que también puede limitar el acceso del disolvente (agua) a los residuos cargados y normalmente hidratados. También se encontró en el estado desplegado que estos residuos hidrófobos que normalmente se encuentran ocultos en el interior de una proteína, están más expuestos al entorno acuoso polar. Tales apariciones pueden funcionar para evitar la disolución de los cuerpos de inclusión en disolventes distintos a los agentes caotrópicos fuertes, tales como urea o guanidina o detergentes tales como SDS.
Los polímeros cargados preferiblemente en disolución acuosa pueden interferir con y romper las interacciones iónicas no deseadas que se producen dentro de una cadena polipeptídica tal como se encuentran en un cuerpo de inclusión u otro entorno. Los polímeros cargados también pueden ayudar a romper las interacciones iónicas no deseadas y a facilitar la solvatación de los residuos iónicos y polares, potenciando la disolución sin necesidad de detergentes o caótropos fuertes. La carga, la densidad de carga y el peso molecular (longitud de la cadena) del polímero cargado pueden variar dependiendo de la proteína específica. Los polímeros adecuados incluyen: polisacáridos sulfatados, heparinas, sulfatos de dextrano, agaropeptinas, polisacáridos de ácido carboxílico, ácidos algínicos, carboximetilcelulosas, compuestos poliinorgánicos, polifosfatos, poliaminoácidos, poliaspartatos, poliglutamatos, polihistidinas, compuestos poliorgánicos, polisacáridos, dextranos DEAE, poliaminas poliorgánicas, polietileniminas, polietileniminocelulosas, poliaminas, poliaminoácidos, polilisinas y poliargininas.
Las proteínas con pI mayor de 7 pueden beneficiarse más de las interacciones con los polímeros cargados negativamente, ya que estas proteínas tendrán una carga positiva a pH 7. Las proteínas con pI inferior a 7 pueden interaccionar más fuertemente con polímeros cargados positivamente a pH neutro. El cambio del pH de la disolución modificará la carga total y la distribución de carga de cualquier proteína, y es otra variable que debe evaluarse.
Replegamiento
La tecnología del ADN recombinante ha permitido la expresión a un alto nivel de muchas proteínas que normalmente no podían aislarse a partir de fuentes naturales en cantidades apreciables. En E. coli y otros diversos sistemas de expresión, la proteína se expresa frecuentemente en estado inactivo, desnaturalizado, en el que la secuencia primaria de aminoácidos es correcta, pero la estructura secundaria y terciaria y algunos puentes disulfuro de cisteína no están presentes. La proteína desnaturalizada debe replegarse en la conformación activa apropiada, lo que a menudo requiere vencer significativas barreras de energía impuestas por la atracción y la repulsión iónicas, restricciones en la rotación de los enlaces y otros tipos de tensiones inducidas conformacionalmente. La atracción iónica específica entre cargas opuestas y/o la repulsión entre las cargas iguales puede limitar enormemente las rutas de replegamiento disponibles para la proteína desnaturalizada y reducir la eficacia del proceso de replegamiento.
Algunas proteínas tienen zonas específicas de carga cuyas interacciones pueden limitar la flexibilidad conformacional o potenciar la agregación. Muchas proteínas que carecen de una región clara de localización de carga en la secuencia primaria pueden demostrar todavía zonas de localización de carga debido a su estructura secundaria encontradas en los productos intermedios de replegamiento, plegamientos erróneos y proteína plegada de manera incorrecta. Proteínas para su uso en la presente invención son TFPI, muteínas de TFPI y TFPI-2. En el caso del TFPI, así como para otras proteínas, dos dominios cargados opuestamente interaccionan entre sí para impedir el plegamiento adecuado y para producir la oligomerización y la agregación.
Los polímeros cargados pueden utilizarse para modificar la carga, la densidad de carga y reducir o eliminar las limitaciones mediadas iónicamente a la conformación que pueden surgir en el estado desplegado. La yuxtaposición de grupos cargados que no están normalmente en proximidad puede dar como resultado rutas de replegamiento que no llevan a nada a partir de las cuales pueden no recuperarse nunca los procesos de replegamiento.
La introducción de cargas extras positivas o negativas mediante la complejación con polímeros cargados puede permitir que el replegamiento continúe fácilmente por diversos motivos: en primer lugar, diferentes tipos de distribuciones de carga pueden satisfacer mejor los procesos de replegamiento; en segundo lugar, la adición del polímero cargado puede potenciar la solubilidad de la proteína desplegada, reduciendo o eliminando la necesidad de caótropos que tienen un efecto negativo sobre la conformación de la proteína.
Debido a la estructura frecuentemente única asociada con la mayoría de las proteínas, puede variar el polímero cargado que demuestras las características preferidas. La evaluación del pH isoeléctrico (pI) de la proteína puede servir como punto de partida. A pH neutro, una proteína con un pI inferior a 7 tendrá una carga neta negativa y, por tanto, será más probable que se una a un polímero cargado positivamente. La proteína con un pI superior a 7 tendrá una carga neta positiva a pH neutro y tendrá una tendencia más fuerte a unirse a un polímero cargado negativamente. Sin embargo, está bien establecido que las cargas se distribuyen de manera no uniforme en una proteína y puede producirse una localización de carga significativa. La posibilidad de concentraciones localizadas de cargas reduce la capacidad para predecir qué tipo de polímero cargado puede ser más eficaz para cualquier aplicación. Teóricamente, para cualquier proteína con una distribución de cargas que interaccionan y requisitos conformacionales específicos, existe un polímero cargado de composiciones apropiadas en lo que se refiere al peso molecular, la carga y la distribución de la carga, lo que maximizaría la eficacia del replegamiento. También se evaluarían otras variables, tales como el pH y la fuerza iónica del disolvente. La selección inicial incluiría polietilenimina, DEAE dextrano, sulfato de dextrano y polifosfato a diferentes concentraciones y pesos moleculares. El trabajo con el rhTFPI ha demostrado el efecto significativo que pueden tener la longitud de la cadena de polifosfato y la concentración en el transcurso de la reacción de replegamiento del TFPI. Una longitud de cadena relativamente corta (n = 5) produce altos niveles de agregado. La longitud de cadena de polifosfato óptima para replegar el rhTFPI fue aproximadamente de 25 unidades de repetición. Los polifosfatos de longitud de cadena más larga (n = 75) también produjeron más agregados y menos monómeros plegados apropiadamente.
Formulación
Las proteínas consisten en cadenas de aminoácidos, cuya composición y secuencia exactas constituye uno de los primeros determinantes de la estructura primaria de la proteína. El determinante secundario de la estructura de la proteína es el resultado de la orientación conformacional que los enlaces entre aminoácidos individuales tienen en la conformación de la proteína. En tercer lugar, la secuencia de aminoácidos específica dirige la formación de las estructuras terciarias tales como láminas \beta y hélices \alpha. La naturaleza tridimensional de la conformación de la proteína a menudo aproxima residuos de aminoácidos que normalmente no están cerca entre sí basándose en la secuencia directa de la cadena polipeptídica. La forma funcional de una proteína generalmente es una conformación modestamente estable que se mantiene junta mediante una combinación de enlaces disulfuro de cisteína, enlaces iónicos e interacciones hidrófobas y de Van der Waals.
En general, la solubilidad de la proteína puede estar relacionada con el número de aminoácidos cargados y, en menor grado, polares, que constituyen la proteína. Estos grupos cargados y polares llegan a solvatarse con moléculas de agua en la disolución acuosa y esta interacción mantiene la cadena polipeptídica en disolución. Los polipéptidos con un número insuficiente de aminoácidos cargados positiva o negativamente pueden tener solubilidad acuosa limitada. En algunos casos, los grupos cargados positiva y negativamente en una proteína pueden interaccionar entre sí, desplazando el agua de solvatación y conduciendo a una reducción de la solubilidad en agua. Muchas proteínas que carecen de una región clara de localización de carga en la secuencia primaria pueden demostrar todavía zonas de localización de carga debido a su estructura secundaria. Por tanto, muchas proteínas pueden tener la solubilidad modificada mediante la interacción con moldes poliméricos cargados. La naturaleza de la modificación dependerá de la estructura específica de la proteína, la longitud de la cadena, la carga y la densidad de la carga del polímero iónico.
La complejación con polímeros cargados con densidad de carga relativamente alta representa un enfoque para aumentar la densidad de carga de una proteína. Una proteína con un menor número de residuos cargados positivamente (lisina o arginina) puede complejarse con un polímero cargado negativamente, tal como polifosfato. Algunos de los grupos cargados negativamente del polímero interaccionarán con los grupos cargados positivamente presentes en la proteína. Los grupos cargados restantes en el polímero estarán libres para interaccionar con el disolvente, en la mayoría de los casos agua, y aumentan eficazmente la densidad de carga y la solvatación de la proteína. Alternativamente, puede utilizarse un polímero cargado positivamente, tal como polietilenimina, para formar complejos con los residuos cargados negativamente de la proteína. En algunos casos, ambos tipos de polímeros cargados pueden funcionar con igual eficacia, en otros casos, un tipo de carga puede ser más eficaz que otras. La eficacia de cualquier polímero cargado particular, dependerá de la composición de aminoácidos de la proteína, de la distribución de aminoácidos en la proteína, de la conformación de la proteína, de la densidad de carga del polímero cargado, de la longitud de la cadena del polímero cargado, del pH de la disolución y de otras variables. Sin embargo, es probable que para cualquier proteína dada pueda encontrarse un polímero cargado complementario que se unirá a la proteína y aumentará esencialmente la densidad de carga de la proteína, lo que mejorará las características de solubilidad de esa proteína en el medio acuoso.
Definiciones
El término "tratamiento", tal como se usa en el presente documento, se refiere a las etapas incluidas en la purificación y la preparación de cantidades farmacéuticamente aceptables de proteínas. El tratamiento puede incluir una o más etapas tales como solubilización, replegamiento, separación cromatográfica, precipitación y formulación.
El término "polímero cargado" y "molde polimérico cargado" se refiere a cualquier compuesto constituido por una estructura principal de unidades estructurales de repetición unidas de forma lineal o no lineal, conteniendo algunas de dichas unidades de repetición grupos químicos cargados positiva o negativamente. Las unidades estructurales de repetición pueden ser de naturaleza de polisacárido, hidrocarbonada, orgánica o inorgánica. Las unidades de repetición pueden oscilar desde n = 2 hasta n = varios millones.
El término "polímero cargado positivamente", tal como se usa en el presente documento, se refiere a polímeros que contienen grupos químicos que llevan, pueden llevar, o pueden modificarse para que lleven, una carga positiva tales como amonio, alquilamonio, dialquilamonio, trialquilamonio y amonio cuaternario.
El término "polímero cargado negativamente", tal como se usa en el presente documento, se refiere a polímeros que contienen grupos químicos que llevan, pueden llevar, o pueden modificarse para que lleven, una carga negativa tales como derivados de ácido fosfórico y otros ácidos que contienen fósforo, ácido sulfúrico y otros ácidos que contienen azufre, nitrato y otros ácidos que contienen nitrógeno, ácido fórmico y otros ácidos carboxílicos.
El término "polietilenimina", tal como se usa en el presente documento, se refiere a polímeros que consisten en unidades de repetición de etilenimina (H_{3}N^{+}-(CH_{2}-CH_{2}-NH_{2}^{+})_{x}-CH_{2}-CH_{2}-NH_{3}^{+}). El peso molecular puede variar desde 5.000 hasta superior a 50.000.
El término "polifosfato", tal como se usa en el presente documento, se refiere a polímeros que consisten en unidades de repetición de ortofosfato unidas en un enlace fosfo-anhídrido. El número de unidades de repetición puede oscilar desde 2 (pirofosfato) hasta varios miles. El polifosfato se denomina frecuentemente hexametafosfato de sodio (SHMP). Otros nombres comunes incluyen sal de Grahams, Calgon, vidrio al fosfato, tetrametafosfato de sodio, y Glass H.
El término "replegamiento", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la renaturalización de la proteína. Normalmente, el objetivo del replegamiento es producir una proteína que tiene un nivel de actividad superior al que tendría la proteína si se produjera sin una etapa de replegamiento. Una molécula de proteína plegada es más estable en la conformación que tiene la menor energía libre. La mayoría de las proteínas solubles en agua se pliegan de manera que la mayor parte de los aminoácidos hidrófobos estén en la parte interior de la molécula, lejos del agua. Los enlaces débiles que mantienen una proteína junta pueden romperse mediante varios tratamientos que hacen que un polipéptido se despliegue, es decir, se desnaturalice. Una proteína plegada es el producto de varios tipos de interacciones entre los propios aminoácidos y su entorno, incluyendo enlaces iónicos, interacciones de Van der Waals, enlaces de hidrógeno, enlaces disulfuro y enlaces covalentes.
El término "desnaturalizar", tal como se usa en el presente documento, se refiere al tratamiento de una proteína o polipéptido que da como resultado la rotura de los enlaces iónicos y covalentes y las interacciones de Van der Waals que existen en la molécula en su estado nativo o renaturalizado. La desnaturalización de una proteína puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el tratamiento con urea 8 M, agentes reductores tales como mercaptoetanol, calor, pH, temperatura y otros compuestos químicos. Reactivos tales como urea 8 M rompen tanto los enlaces de hidrógeno como los hidrófobos, y si también se añade mercaptoetanol, los puentes disulfuro (S-S) que se forman entre las cisteínas se reducen a dos grupos -S-H. El replegamiento de las proteínas que contienen enlaces disulfuro en su estado nativo o renaturalizado también pueden incluir la oxidación de los grupos -S-H presentes en los residuos de cisteína para que la proteína vuelva a formar los enlaces disulfuro.
El término "glucosaminoglucano", tal como se usa en el presente documento, se refiere a polisacáridos que contienen residuos alternos de ácido urónico y hexosamina y normalmente contienen sulfato. La unión de una proteína en una reacción de replegamiento tal como se describe en el presente documento, a un glucosaminoglucano, es mediante interacciones iónicas.
El término "sulfato de dextrano", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un derivado polianiónico del dextrano, que oscila en peso molecular desde 8.000 hasta 500.000 Dalton. Los dextranos son polímeros de glucosa en los que los residuos de glucosa se unen mediante enlaces \alpha-1,6.
El término "heparina", tal como se usa en el presente documento, se refiere a 2 glucosaminoglucanos o heparinoides que están basados en un disacárido de repetición (-4DGlcA(p)\beta1, 4GlcNAc\alpha1-)_{n} pero que se someten a amplia modificación tras la unión. La heparina se almacena con histamina en gránulos de mastocitos y de esta forma se encuentra en la mayor parte del tejido conjuntivo. En general, las heparinas tienen cadenas mas cortas que la
heparina.
El término "HIC", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cromatografía de interacción hidrófoba que emplea una interacción hidrófoba entre la columna y la molécula de interés para separar los polisacáridos sulfatados y otros contaminantes del producto replegado A.
Los polímeros cargados negativamente incluyen polisacáridos sulfatados, tales como heparinas, sulfatos de dextrano y agaropectinas, así como polisacáridos de ácido carboxílico tales como ácidos algínicos y carboximetilcelulosas. También se incluyen compuestos poliinorgánicos, tales como polifosfonatos. También pueden utilizarse poliaminoácidos tales como poliaspartato, poliglutamato y polihistidina.
Los polímeros cargados positivamente incluyen polisacáridos tales como DEAE dextrano, aminas poliorgánicas tales como polietileniminas, polietileniminocelulosas y poliaminas, así como poliaminoácidos, polilisina y poliarginina. Pueden utilizarse combinaciones de polímeros, de cualquier polaridad de carga. Además, también pueden utilizarse copolímeros anfóteros.
Tal como se usa en el presente documento, "TFPI" se refiere al inhibidor de la ruta del factor tisular maduro. Tal como se observó anteriormente, el TFPI también se conoce en la técnica como inhibidor de la coagulación asociado a lipoproteínas (LACI), inhibidor de la ruta extrínseca (EPI) e inhibidor del factor tisular (TFI). Las muteínas de TFPI que mantienen la actividad biológica de TFPI se engloban en esta definición. Además, también se engloba en la definición el TFPI que se ha modificado ligeramente para la producción en células bacterianas. Por ejemplo, se ha producido un análogo de TFPI que tiene un residuo de alanina en el extremo amino-terminal del polipéptido TFPI en Escherichia coli. Véase el documento U.S. 5.212.091.
Tal como se usa en el presente documento, "composición farmacéuticamente aceptable" se refiere a una composición que no invalida ni reduce la actividad biológica del TFPI formulado y que no tiene ningún efecto biológico adverso cuando se administra TFPI formulado a un paciente.
Tal como se usa en el presente documento, "paciente" engloba pacientes humanos y veterinarios.
Tal como se usa en el presente documento, el término "solubilizante" se refiere a sales, iones, hidratos de carbono, aminoácidos y otras moléculas orgánicas. Debe observarse que los solubilizantes pueden actuar como agentes estabilizantes. Los agentes estabilizantes conservan la actividad unitaria del TFPI en almacenamiento y pueden actuar evitando la formación de agregados o evitando la degradación de la molécula de TFPI (por ejemplo, mediante reacciones catalizadas por ácido).
Tal como se usa en el presente documento, el término "solubilizantes secundarios" se refiere a sales orgánicas, iones, hidratos de carbono, aminoácidos y otras moléculas orgánicas, que presentes en disolución con un solubilizante, aumentan adicionalmente la solubilidad del TFPI. Los solubilizantes secundarios también pueden tener otros efectos. Por ejemplo, los estabilizantes secundarios pueden ser útiles ajustando la tonicidad (por ejemplo, hasta la isotonicidad).
La secuencia de aminoácidos de TFPI se describe en la patente de los EE.UU. número 5.106.833 y en la figura 4. Las muteínas del TFPI y del TFPI-2 se describen en el documento de los EE.UU. con número de serie 08/286.530. También se describe en el documento de los EE.UU. con número de serie 08/286.530, que pueden prepararse muteínas del TFPI y el TFPI-2, con mutaciones puntuales individuales o múltiples, y moléculas quiméricas del TFPI y el TFPI-2. Por ejemplo, el residuo de lisina en el sitio P1 del primer dominio tipo Kunitz del TFPI puede sustituirse con arginina. Las muteínas que contienen de una a cinco sustituciones de aminoácidos, pueden prepararse mediante mutagénesis apropiada de la secuencia del vehículo de clonación recombinante que codifica para el TFPI o el TFPI-2. Las técnicas para la mutagénesis incluyen, sin limitación, mutagénesis específica de sitio. La mutagénesis específica de sitio puede llevarse a cabo utilizando cualesquiera de varios procedimientos conocidos en la técnica. Estas técnicas se describen por Smith (1985) Annual Review of Genetics, 19:423, y modificaciones de algunas de estas técnicas se describen en METHODS IN ENZYMOLOGY, 154, parte E, (eds.) Wu y Grossman (1987), capítulos 17, 18, 19 y 20. Un procedimiento preferido cuando se utiliza mutagénesis específica de sitio es una modificación del método de mutagénesis dirigida al sitio de Gapped Duplex (ADN dúplex discontinuo). El procedimiento general se describe por Kramer, et al., en el capítulo 17 de Methods in Enzymology, citado anteriormente. Otra técnica para generar mutaciones puntuales en una secuencia de ácido nucleico es PCR de solapamiento. El procedimiento para utilizar PCR de solapamiento para generar mutaciones puntuales se describe por Higuchi en el capítulo 22 de PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, (eds.) Innis, Gelfand, Sninsky y White (Academic Press, 1990).
Alternativamente, podrían producirse proteínas híbridas que contienen el primer dominio tipo Kunitz del TFPI-2 y el segundo y tercer dominios tipo Kunitz del TFPI. Un experto en la técnica de la clonación de ADN que posea el ADN que codifica para TFPI y TFPI-2 podría preparar moléculas de ADN adecuadas para la producción de tal proteína quimérica utilizando procedimientos de clonación conocidos. Alternativamente, pueden prepararse moléculas de ADN sintético que codifican para parte o todo de cada uno de los dominios de tipo Kunitz y las secuencias peptídicas que se unen a los dominios tipo Kunitz. Como otra alternativa, la técnica de PCR de solapamiento también puede utilizarse para preparar ADN que codifica para moléculas quiméricas que contienen secuencias del TFPI y el TFPI-2.
El TFPI puede prepararse en sistemas de expresión de levaduras tal como se describe en el documento de los EE.UU. número de serie 08/286.530 que se incorpora al presente documento como referencia. También se han descrito métodos para la purificación del TFPI a partir de medio de cultivo celular de levaduras, tal como en Petersen et al, J. Biol. Chem. 18:1334.4-13351 (1993). En estos casos, el TFPI recombinante se secreta de la célula de levadura. El TFPI recuperado en tales protocolos también es frecuentemente heterogéneo, debido a la modificación en el extremo N-terminal, a la degradación proteolítica y a la glucosilación variable. Por tanto, existe una necesidad en la técnica para producir TFPI maduro que sea auténtico, (es decir, que tenga la secuencia correcta de aminoácidos en el extremo N-terminal), de longitud completa y homogéneo.
El TFPI puede producirse en E. coli tal como se describe en la patente de los EE.UU. número 5.212.091 que describe un método de producir TFPI mediante la expresión de una forma no glucosilada de TFPI en un huésped de E. coli.
En un aspecto de la invención, se repliegan el TFPI, la muteína de TFPI o el TFPI-2 que pueden unirse a polímeros de polisacáridos sulfatados tales como, por ejemplo, heparina o sulfato de dextrano. La invención proporciona un método que facilita el replegamiento del TFPI, muteína de TFPI o TFPI-2 desnaturalizados, utilizando polímeros de polisacáridos sulfatados que actúan como moldes para replegar la proteína. Sin limitarse a ninguna teoría particular, los inventores creen que las interacciones entre la proteína en replegamiento y el molde polimérico puede minimizar la agregación de los productos intermedios de replegamiento y proporcionar un entorno para que la proteína se repliegue en su conformación nativa. El polímero que actúa como molde puede unirse a un dominio o región de la proteína para estabilizar el producto intermedio y permitir que se produzca el plegamiento adicional sin agregación. Los agregados de proteína, si se forman, son generalmente menos activos que la proteína replegada no agregada y generalmente dan como resultado un rendimiento general reducido de la proteína replegada activa. La concentración de NaCl de las condiciones de replegamiento se considera importante y se selecciona para lograr la eficacia máxima del replegamiento maximizando la interacción entre el molde polimérico y la proteína de replegamiento. Por ejemplo, los inventores han encontrado que una concentración de aproximadamente 0,2 M de NaCl o inferior potencia la unión del extremo C-terminal y/o el tercer dominio Kunitz del TFPI a heparina u otro polímero de polisacárido sulfatado. Se supone que la unión del polímero al producto intermedio facilita la solubilidad del producto intermedio y proporciona un entorno para que el resto de la proteína se repliegue reduciendo la agregación de los productos intermedios de replegamiento.
Métodos generales
El TFPI puede prepararse mediante métodos recombinantes, tal como se describe en el documento U.S. 5.212.091, cuya descripción se incorpora al presente documento como referencia. En resumen, el TFPI se expresa en células de Escherichia coli y los cuerpos de inclusión que contienen el TFPI se aíslan del resto del material celular. Los cuerpos de inclusión se someten a sulfitólisis, se purifican utilizando cromatografía de intercambio iónico, se repliegan mediante reacción con intercambio de disulfito y el TFPI replegado y activo se purifica mediante cromatografía de intercambio catiónico. El TFPI también puede producirse en levaduras, tal como se describe en el documento U.S.S.N. 08/286.530 en tramitación junto con la presente.
La actividad del TFPI puede probarse mediante el ensayo de tiempo de protrombina (ensayos TTP). Se midió la bioactividad de TFPI mediante el tiempo de coagulación de protrombina usando un modelo RA4 Coag-A-Mate de Organon Teknika Corporation (Oklahoma City, OK). Las muestras de TFPI se diluyeron primero a de 9 a 24 ug/mL con un tampón TBSA (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, BSA 1 mg/mL, pH 7,5). A continuación se mezclaron 10 uL de Varify 1 (plasma normal combinado de Organon Teknika Corp.) con 90 uL de muestras de TFPI diluido en una bandeja de muestra y se calentó a 37ºC en el instrumento. Finalmente se añadió Simplastin Excell (tromboplastina de Organon Teknika Corp.) para comenzar la coagulación. Se midió el retraso de tiempo en la coagulación debido a la actividad anticoagulante del TFPI y se convirtió en concentración de TFPI en las muestras medidas por comparación con una curva patrón de TFPI.
La cantidad de TFPI soluble también puede cuantificarse midiendo el área del pico principal en un cromatograma de intercambio catiónico. Se realizó el análisis de HPLC de las muestras de TFPI utilizando un sistema Waters 626 LC (Waters Corporation, Milford, MA) equipado con un inyector automático de calentamiento/enfriamiento Waters 717 plus. La obtención de los datos se trató mediante un sistema Turbochrom^{MR} de Perkin-Elmer.
El método de intercambio catiónico (IEX) utilizó una columna de vidrio de Pharmacia Mono S HR 5/5. La columna se equilibró en 80% de tampón A (disolución de acetato de sodio trihidratado 20 mM: acetonitrilo (70:30 v/v) a pH 5,4) y 20% tampón B (disolución de acetato de sodio trihidratado 20 mM - cloruro de amonio 1,0 M: acetonitrilo (70:30 v/v) a pH 5,4). Una vez inyectada una muestra, se aplicó un gradiente para eluir el TFPI a una velocidad de flujo de 0,7 mL/min desde el 20% de tampón B hasta el 85% de tampón B en 21 minutos. Las muestras de TFPI en elución se detectaron mediante absorbancia a 214 nm. Se encontró que el pico principal (TFPI monomérico) eluía a aproxima-
damente 18 minutos. La pérdida de TFPI soluble se cuantificó integrando el área de pico restante del pico principal.
Todos los reactivos son de calidad U.S.P. o A.C.S. Los proveedores incluyen J.T. Baker y Sigma Co. (St. Louis, MO).
La presente invención se ilustrará ahora haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que exponen ciertas realizaciones. Sin embargo, debe observarse que estas realizaciones son ilustrativas y no se interpretan como limitativas de la invención en modo alguno.
Ejemplos Ejemplo 1 Replegamiento de TFPI desnaturalizado
El siguiente ejemplo describe la preparación de disoluciones madre, la preparación de la columna de HIC, la recuperación inicial y la purificación del TFPI antes del replegamiento, el replegamiento del TFPI y la recuperación de TFPI activo.
La reserva de TFPI se preparó a partir de cuerpos refringentes resultantes de la expresión de TFPI recombinante en bacterias. Se solubilizaron los cuerpos refringentes a 10 mg/ml en urea 8 M, Tris 50 mM, pH 8,5 que contenía DTT 10 mM, y se aclaró esta disolución por centrifugación a 10,000 x g durante 10 minutos.
La preparación de la columna para la purificación inicial del TFPI disuelto se preparó con perlas de S-Sepharose mezcladas en urea 7,5 M, Tris 10 mM y fosfato de sodio 10 mM (pH 6,5) que contenía DTT 5 mM y EDTA 1 mM. Se pasó entonces el TFPI solubilizado a una concentración de 5 mg/ml por la columna de S-Sepharose y se eluyó con un gradiente de cloruro de sodio de 0 a 1 M. El TFPI purificado tenía una absorbancia a una longitud de onda de 280 nm de 3,2 (lo que es equivalente a 4,1 mg/ml usando un coeficiente de extinción de 0,78).
La reserva de sulfato de dextrano consistía en sulfato de dextrano de 8.000 Dalton de peso molecular disponible de Sigma, artículo número D-4911, preparado a 50 mg/ml (6,25 mM) en Tris 50 mM (pH 8,8) en cloruro de sodio 0,1 M, y almacenado a -20 grados centígrados entre usos.
La reserva de heparina, si se usó heparina para llevar a cabo el replegamiento, tenía un peso molecular de 6.000 a 30.000 Dalton, (con un peso molecular promedio de 18.000 Dalton) preparada como sal de sodio disponible de Sigma Co. (St. Louis, MO), artículo número H-3393, preparada a 60 mg/ml (3,33 mM) en Tris 50 mM (pH 8,8) en cloruro de sodio 0,1, y almacenado a -20ºC entre usos.
Se puede añadir o bien disolución madre de sulfato de dextrano o bien disolución madre de heparina al TFPI purificado con S-Sepharose. Se añadió dextrano o heparina al TFPI en condiciones desnaturalizantes en urea de 6 a 8 M. Con los reactivos a 4ºC, la disolución desnaturalizante que contenía el TFPI se diluyó con urea 3 M, Tris 50 mM (pH 8,8), cloruro de sodio 0,2 M, y TFPI 0,5 mg/ml, y hasta una concentración final de sulfato de dextrano de 0,6 mg/ml (75 \muM) o una concentración final de heparina de 1,5 mg/ml (83 \muM), dependiendo de cuál se usó para facilitar el replegamiento. Se añadió cisteína a la disolución de replegamiento hasta una concentración final igual a la concentración final de DTT. Se incubó la disolución de replegamiento a 4ºC con suave agitación durante desde 4 hasta 6 días, preferiblemente 5 días.
Lo siguiente es un detalle de un protocolo para el replegamiento de 5 ml de una disolución de TFPI en sulfato de dextrano o heparina, como una ilustración de este procedimiento.
Se añadieron o bien 60 \mul de sulfato de dextrano con 65 \mul de Tris 50 mM (pH 8,8) en NaCl 0,1 M o bien 125 \mul de disolución madre de heparina con Tris 50 mM (pH 8,8) o NaCl 0,1 M a 610 \mul de reserva de TFPI. Se mezcló la disolución de replegamiento y se dejó incubar durante 10 minutos en hielo. Después, se añadieron 4,2 ml de tampón de replegamiento que contenía urea 2,5 M, Tris 50 mM (pH 8,8) y cloruro de sodio 165 mM a la disolución de replegamiento y se mezcló. Finalmente, se añadieron 61 \mul de cisteína 50 mM preparada en hidróxido de sodio 120 mM y la disolución total se incubó a 4ºC con suave agitación durante 4 días. Se comprobó el contenido en sulfhidrilo libre con reactivo de Ellman (también denominado DTNB). Se añadió yodoacetamida, hasta 20 mM, preparada a 1 M en etanol al 100% para su almacenamiento a -20ºC.
Se preparó la columna de interacción hidrófoba (HIC) a partir de la resina Butyl-650M Tosohaas Toyopearl de tamaño de partícula 40-90, pieza nº 014702. Se lavó la resina de butilo en urea 3 M, sulfato de amonio 1 M, Tris 50 mM, fosfato de sodio 10 mM, pH 6,5 y se resuspendió en una suspensión al 50%.
Las muestras de replegamiento, almacenadas a -20ºC permanecieron en el tampón de replegamiento habitual que contiene urea 3 M, Tris 50 mM, pH 8,8, redox 1-4 mM, TFPI 0,5 mg/ml y NaCl 0,2-0,6 M dependiendo en las condiciones. Las muestras replegadas con dextrano o heparina tenían sal 0,2 M, y las muestras sin dextrano o heparina tenían NaCl 0,6 M.
Se llevaron a cabo las siguientes etapas a temperatura ambiente para efectuar una purificación adicional del TFPI replegado. Se añadió un volumen igual de sulfato de amonio 2 M, urea 3 M, Tris 50 mM y fosfato de sodio 10 mM (pH 6,5) a 300 \mul de muestra replegada. Después, se añadieron 100 \mul de perlas Butyl-650M lavadas a la muestra de replegamiento diluida. Se incubó la disolución con las perlas con oscilación o mezclado suave durante 30 minutos a temperatura ambiente. Entonces, se centrifugó la mezcla en una centrífuga Ependorf durante 5 segundos, y se puso en un soporte y se dejó reposar durante un minuto para que las perlas se depositasen en el tubo. Se aspiró cuidadosamente el sobrenadante, para no alterar las perlas.
Para lavar las perlas con el TFPI unido, se añadió 1 ml de tampón de lavado compuesto por sulfato de amonio 1 M, urea 3 M, Tris 50 mM, fosfato de sodio 10 mM (pH 6,5) a las perlas para eliminar el sulfato de dextrano o la heparina restantes. Se volvió a centrifugar la mezcla lavada en una centrífuga Ependorf durante 5 segundos, y se dejó reposar durante un minuto para que las perlas se depositasen como anteriormente. Se retiró el sobrenadante, y entonces se lavaron las perlas con el tampón de lavado una última vez, y se centrifugaron y dejaron reposar como anteriormente. Tras el último lavado y la sedimentación, el sobrenadante se retiró muy cuidadosamente con una pipeta Pasteur con la punta modelada a la llama.
Para eluir el TFPI replegado, se añadieron 300 \mul de tampón de elución compuesto por urea 3 M, sulfato de amonio 0,1 M, Tris 50 mM y fosfato de sodio 10 mM (pH 6,5) a la suspensión de perlas y se osciló durante más de 10 minutos. Se sedimentaron las perlas por centrifugación en una centrifuga Ependorf, y se recuperó el sobrenadante que contenía el TFPI replegado. Para evitar la contaminación de las perlas con el producto, se dejó parte del sobrenadante.
Ejemplo 2 HIC de replegamiento con sulfato de dextrano
Se renaturalizó la muestra de TFPI a una concentración de 0,5 mg/ml de TFPI, 0,6 mg/ml de sulfato de dextrano, urea 3 M, NaCl 200 mM y Tris 50 mM (pH 5,5). Se preparó la columna de HIC a partir de perlas de TosoHaas Butyl para HIC, 4,6 mmD/100 mml en una suspensión de 1,66 ml. La velocidad de flujo se ajustó a 1,0 ml/min. Antes de cargar la columna de HIC, se diluyó la muestra 2:3 con urea 3,0 M y NH_{4}SO_{4} 3,0 M a un pH final de 5,68; se cargaron 2 ml de muestra. El inicio del gradiente era MES 33 mM/HEPES 33 mM/acetato de sodio 33 mM, NH_{4}SO_{4} 1,0 M, y urea 3,0 M, pH 6,0; el final del gradiente era MES 33 mM/HEPES 33 mM/acetato de sodio 33 mM, urea 3,0 M a pH 6,0. El volumen del gradiente fue de 5,0 VC (volúmenes de columna). A partir de esta columna, la recuperación de TFPI nativo fue del 68%. Los resultados de esta serie se muestran en la figura 2.
También se realizó una serie con una segunda columna de HIC. Se diluyó 2:3 la muestra de TFPI desnaturalizado con urea 3,0 M, NH_{4}SO_{4} 1,5 M y se cargaron dos ml. El inicio del gradiente era MES 33 mM/HEPES 33 mM/acetato de sodio 33 mM, NH_{4}SO_{4} 0,5 M, y urea 3,0 M, pH 6,0; el final del gradiente era MES 33 mM/HEPES 33 mM / acetato de sodio 33 mM, urea 3,0 M a pH 6,0. El volumen del gradiente fue de 5,0 VC. La recuperación de TFPI nativo a partir de esta segunda columna fue del 74%. Los resultados de esta serie se muestran en la figura 3.
Se analizaron las mezclas por SDS-PAGE no reductora tal como se ilustra en la figura 1. Se ven especies de TFPI activas, correctamente replegadas (banda principal) en el gel.
Ejemplo 3
Se dializaron aproximadamente 10 mg/ml de TFPI en urea 2 M frente a uno de los siguientes: acetato 20 mM, fosfato 20 mM, citrato 20 mM, glicina 20 mM, L-glutamato 20 mM o succinato 20 mM en NaCl 150 mM, tal como se describió anteriormente. Se cargó TFPI 6-10 mg/ml de la reserva a granel en tubos de diálisis Spec/Por 7 (punto de corte de PM de 3.500). Se llevó a cabo la diálisis o bien a 4ºC o bien a temperatura ambiente. Se realizaron tres cambios de tampón en una disolución de proteína hasta una razón de tampón de 1 a 50-100 durante el transcurso de la diálisis a lo largo de un periodo de tiempo de 12 a 24 h. Tras la diálisis, se filtró la disolución de TFPI mediante unidades de filtración Costar de 0,22 micras para separar el TFPI precipitado del TFPI soluble. Entonces, se midió la solubilidad del TFPI mediante su absorbancia UV/Vis asumiendo una absortividad de 0,68 (mg/ml)^{-1} cm^{-1} a 278 nm. Se prepararon las disoluciones a varios niveles de pH mediante valoración con HCl o NaOH.
Tras completarse la diálisis, se filtraron los precipitados a través de unidades de filtración de 0,22 \mum. Se midió la concentración del TFPI soluble restante tras la diálisis mediante su absorbancia UV. La figura 1 muestra los resultados de estos experimentos. La solubilidad del TFPI aumentaba enormemente en disoluciones que contenían acetato 20 mM, fosfato 20 mM, L-glutamato 20 mM y succinato 20 mM a niveles de pH inferiores a 7 y particularmente a pH 4,5 o inferior. También aumentó sustancialmente la solubilidad del TFPI en disoluciones que contenían glicina 20 mM por encima de pH 10. La figura 2 muestra la solubilidad del TFPI como una función de la concentración de ion citrato en presencia de fosfato de Na 10 mM a pH 7. La solubilidad del TFPI aumenta al aumentar la concentración de citrato. La figura 3 muestra la solubilidad del TFPI como una función de la concentración de NaCl a pH 7,0. La solubilidad del TFPI aumenta al aumentar la concentración de sal, lo que indica que la sal fomenta la solubilidad del TFPI.
Se estudió la solubilidad del TFPI usando varios solubilizantes y solubilizantes secundarios diferentes. La tabla 1 muestra la solubilidad del TFPI en varias disoluciones tampón medida mediante su absorbancia UV tras diálisis de TFPI de 6 a 10 mg/ml en estas disoluciones tampón.
TABLA 1
Efecto de la sal Solubilidad
Contenido pH c (mg/ml) uv
NaPO_{4} 10 mM 7 0,21
NaPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM 7 0,72
NaPO_{4} 20 mM, NaCl 150 mM 7 0,85
NaPO_{4} 20 mM, NaCl 0,5 M 7 6,71
NaPO_{4} 20 mM, NaCl 1 M 7 8,24
Efecto del pH
Contenido pH C (mg/ml) uv
NaOAc 20 mM, NaCl 150 mM 3 10,27
NaOAc 20 mM, NaCl 150 mM 3,5 10,25
NaOAc 20 mM, NaCl 150 mM 4 7,54
NaOAc 20 mM, NaCl 150 mM 4,5 1,75
NaOAc 20 mM, NaCl 150 mM 5 1,15
NaOAc 20 mM, NaCl 150 mM 5,5 0,85
TABLA 1 (continuación)
Efecto del pH Solubilidad
Contenido pH C (mg/ml) uv
NaPO_{4} 20 mM, NaCl 150 mM 5,5 0,89
NaPO_{4} 20 mM, NaCl 150 mM 6 0,78
NaPO_{4} 20 mM, NaCl 150 mM 6,5 0,79
NaPO_{4} 20 mM, NaCl 150 mM 7 0,95
NaPO_{4} 20 mM, NaCl 150 mM 7,5 0,82
NaPO_{4} 20 mM, NaCl 150 mM 8 0,86
Citrato de Na 20 mM, NaCl 150 mM 4 2,17
Citrato de Na 20 mM, NaCl 150 mM 4,5 1,19
Citrato de Na 20 mM, NaCl 150 mM 5 1,1
Citrato de Na 20 mM, NaCl 150 mM 5,5 1,84
Citrato de Na 20 mM, NaCl 150 mM 6 2,09
Citrato de Na 20 mM, NaCl 150 mM 6,5 2,12
Citrato de Na 20 mM, NaCl 150 mM 7 1,92
Glicina 20 mM, NaCl 150 mM 9 0,32
Glicina 20 mM, NaCl 150 mM 10 0,9
Glicina 20 mM, NaCl 150 mM 11 13,94
L-Glutamato 20 mM, NaCl 150 mM 4 9,07
L-Glutamato 20 mM, NaCl 150 mM 5 1,21
Succinato 20 mM, NaCl 150 mM 4 8,62
Succinato 20 mM, NaCl 150 mM 5 1,21
Succinato 20 mM, NaCl 150 mM 6 1,07
Citrato
Contenido pH c (mg/ml) uv
NaPO_{4} 10 mM, Citrato de Na 20 mM 7 1,16
NaPO_{4} 10 mM, Citrato de Na 50 mM 7 5,81
TABLA 1 (continuación)
Citrato Solubilidad
Contenido pH c (mg/ml) uv
NaPO_{4} 10 mM, Citrato de Na 100 mM 7 12,7
NaPO_{4} 10 mM, Citrato de Na 200 mM 7 15,9
NaPO_{4} 10 mM, Citrato de Na 300 mM 7 8,36
Mg^{2+}, Ca^{2+} y polifosfato
Contenido pH c (mg/ml) uv
NaPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 1 mM 7 0,66
NaPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 10 mM 7 1,02
NaPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 0,1 mM 7 0,67
NaPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 1 mM 7 0,71
NaPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM, trifosfato 10 mM 7 3,64
NaPO_{4} 10 mM, 5% de PEG-400 7 0,07
NaPO_{4} 10 mM, EDTA 10 mM 7 0,36
NaPO_{4} 10 mM, Na_{2}SO_{4} 100 mM 7 5,08
NaPO_{4} 10 mM, ácido L-aspártico 100 mM 7 0,4
NaPO_{4} 10 mM, ácido succínico 100 mM 7 2,33
NaPO_{4} 10 mM, ácido tartárico 100 mM 7 2,56
NaPO_{4} 10 mM, ácido maleico 100 mM 7 0,11
NaPO_{4} 10 mM, ácido málico 100 mM 7 1,87
NaPO_{4} 10 mM, ácido L-Glutámico 100 mM 7 0
NaPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM 7 0,25
NaPO_{4} 10 mM, isocitrato 100 mM 7 10,83
NaOAc, NaPO_{4} y NaCl
Contenido pH c (mg/ml) uv
NaOAc 10 mM, NaCl 150 mM 4,5 1,76
NaOAc 10 mM 4,5 4,89
NaOAc 10 mM 5,5 4,95
NaOAc 10 mM 6,5 5,1
TABLA 1 (continuación)
NaOAc, NaPO_{4} y NaCl Solubilidad
Contenido pH c (mg/ml) uv
NaOAc 10 mM 7 5,87
NaPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM 4,5 0,14
NaPO_{4} 10 mM 4,5 4,97
NaPO_{4} 10 mM 5,5 0,79
NaPO_{4} 10 mM 6,5 0,091
NaPO_{4} 10 mM 7 0,94
NaOAc 50 mM 5 5,24
NaOAc 5 mM 5,5 4,59
NaOAc 10 mM 5,5 5,05
NaOAc 20 mM 5,5 5,04
NaOAc 50 mM 5,5 5,71
NaOAc 100 mM 5,5 1,4
NaOAc 200 mM 5,5 1,32
NaOAc 5 mM, NaCl 5 mM 5,5 4,85
NaOAc 5 mM, NaCl 10 mM 5,5 5,04
NaOAc 5 mM, NaCl 50 mM 5,5 0,56
NaOAc 5 mM, NaCl 100 mM 5,5 0,43
NaOAc 5 mM, NaCl 200 mM 5,5 0,8
NaOAc 5 mM 4,5 7,27
NaOAc 10 mM 4,5 6,5
NaOAc 20 mM 4,5 8,32
NaOAc 50 mM 4,5 9,17
NaOAc 5 mM 5,5 8,98
NaOAc 10 mM 5,5 8,08
NaOAc 20 mM 5,5 8,99
NaOAc 50 mM 5,5 2,92
NaOAc 5 mM, NaCl 150 mM 4,5 2,6
TABLA 1 (continuación)
NaOAc, NaPO_{4} y NaCl Solubilidad
Contenido pH c (mg/ml) uv
NaOAc 10 mM, NaCl 150 mM 4,5 2,59
NaOAc 20 mM, NaCl 150 mM 4,5 2,55
NaOAc 50 mM, NaCl 150 mM 4,5 2,1
NaOAc 5 mM, NaCl 150 mM 5,5 0,65
NaOAc 10 mM, NaCl 150 mM 5,5 0,69
NaOAc 20 mM, NaCl 150 mM 5,5 0,74
NaOAc 50 mM, NaCl 150 mM 5,5 0,91
Longitud de la cadena hidrófoba
Contenido pH c (mg/ml) uv
NaPO_{4} 10 mM, ácido fórmico 50 mM 7 0,12
NaPO_{4} 10 mM, ácido acético 50 mM 7 0,16
NaPO_{4} 10 mM, ácido propanoico 50 mM 7 0,16
NaPO_{4} 10 mM, ácido butanoico 50 mM 7 0,13
NaPO_{4} 10 mM, ácido pentanoico 50 mM 7 0,14
NaPO_{4} 10 mM, ácido hexanoico 50 mM 7 0,11
Otros
Contenido pH c (mg/ml) uv
NaOAC 20 mM, 3% de manitol, 2% de sacarosa, 5% de PEG-400 4 19,9
Citrato de Na 20 mM, 3% de manitol, 2% de sacarosa, 5% de PEG-400 6,5 0,72
Citrato de Na 20 mM, NaCl 150 mM, 5% de PEG-400 6,5 2,18
NaOAc 20 mM, NaCl 150 mM, 5% de PEG-400 4 19,8
Citrato de Na 20 mM, NaCl 130 mM, 1% de glicina, 0,25% de Tween-80,
5% de PEG-400 6,5 1,48
Citrato de Na 20 mM, NaCl 130 mM, 1% de glicina, 0,25% de Tween-80 6,5 1,32
TABLA 1 (continuación)
Contenido Solubilidad
Acetato de Na 5 mM 5,5 8,9
Acetato de Na 5 mM, 8% de sacarosa 5,5 11
Acetato de Na 5 mM, 0,01% de polisorbato-80 5,5 7
Acetato de Na 5 mM, 8% de sacarosa, 0,01% de polisorbato-80 5,5 12
Acetato de Na 10 mM 5,5 7,6
Acetato de Na 10 mM, 8% de sacarosa 5,5 10
Acetato de Na 10 mM, 8% de sacarosa, 0,01% de polisorbato-80 5,5 12,1
Acetato de Na 5 mM, 5% de sorbitol 5,5 7,8
Acetato de Na 5 mM, 4,5% de manitol 5,5 9,2
Histidina 5 mM 6 5,5
Histidina 5 mM 6,5 1
Citrato de Na 5 mM 5 0,1
Citrato de Na 5 mM 6 0,1
Citrato de Na 5 mM 6,5 0,1
Succinato de Na 5 mM 5 0,6
Succinato de Na 5 mM 6 0,3
Succinato de Na 5 mM 6,5 0,2
Imidazol 10 mM 6,5 2,5, 10,8
Imidazol 10 mM 7 0,8
Imidazol 10 mM, 8% de sacarosa 6,5 12,2
Acetato de Na 5 mM 6 8,2
Imidazol 10 mM, Acetato de Na 5 mM 6,5 12,8
Citrato de Na 10 mM 6 0,2
Citrato de Na 100 mM 6 8,1
Citrato de Na 100 mM 7 9,3
Fosfato de Na 10 mM, Na_{2}SO_{4} 260 mM 6 9,1
Fosfato de Na 10 mM, citrato de Na 100 mM 8 8,8
Citrato de Na 10 mM, 1% de ácido L-glutámico 6 4,6
Citrato de Na 10 mM, 2% de L-lisina 6 1,1
TABLA 1 (continuación)
Contenido Solubilidad
Citrato de Na 10 mM, 0,5% de ácido L-aspártico 6 0,4
Citrato de Na 10 mM, 0,1% de vidrio de fosfato 7 5,9
Tris 10 mM, citrato de Na 100 mM 8 8,5
Citrato de Na 10 mM, glicina 1 M 6 0,3
Citrato de Na 10 mM, glicina 300 mM 6 0,3
Citrato de Na 10 mM, glicerol 280 mM 6 0,3
Citrato de Na 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,5 M 6 8,3
Citrato de Na 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 120 mM 6 8,8
Citrato de Na 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 260 mM 6 9,4
NaPO_{4} 10 mM, 0,1% de vidrio de fosfato 7 15,8
Citrato de Na 10 mM, 0,1% de SDS 6 11,2
Citrato de Na 10 mM, 0,02% de SDS 6 7,8
Acetato de Na 10 mM, 8% de PEG-400 5,5 13,7
Acetato de Na 10 mM, NaCl 150 mM, 8% de PEG-400 5,5 0,6
Acetato de Na 10 mM, 8% de PEG-400 6 16,2
Citrato de Na 10 mM, 8% de PEG-400 6 0,2 
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Ejemplo 4
Se probó la estabilidad del TFPI almacenado en diversas condiciones de pH. Se preparó el TFPI mediante diálisis como anteriormente en fosfato de Na 10 mM, NaCl 150 mM y 0,005% (p/v) de polisorbato-80. Se incubaron las muestras de estabilidad que contenían TFPI 150 mg/ml a 40ºC durante 20 días. Se analizó la constante cinética de velocidad del TFPI soluble restante siguiendo la disminución del pico principal en cromatogramas de intercambio catiónico. Tal como puede observarse en la figura 5, la constante de la velocidad de degradación aumenta con pH superior a 6,0, lo que indica más agregación en condiciones de pH superior.
También se formuló el TFPI a una concentración de 150 mg/ml en NaCl 150 mM y 0,005% (p/v) de polisorbato-80 a pH 7 con concentraciones variables de fosfato. La figura 5A muestra el porcentaje de TFPI soluble restante medido mediante HPLC de intercambio catiónico. Las concentraciones crecientes de ion fosfato en disolución dieron como resultado niveles superiores de TFPI disuelto restante tras la incubación a 40ºC. Niveles superiores de ion fosfato también dieron como resultado niveles superiores de TFPI activo tal como se ensayó mediante el ensayo del tiempo de protrombina. Estos resultados se muestran en la figura 5B.
También se probó la estabilidad del TFPI a una concentración de 0,5 mg/ml y formulado en citrato de Na 10 mM, pH 6 y NaCl 150 mM, a 40ºC a lo largo de un periodo de 40 días. Tal como se observa en la figura 6, la HPLC de intercambio catiónico (triángulos) muestra la presencia de TFPI soluble a niveles superiores al 60% del inicial, incluso tras 40 días de incubación. De un modo parecido, el ensayo del tiempo de protrombina (círculos) muestra la presencia de TFPI activo a niveles superiores al 60% del inicial, incluso tras 40 días de incubación.
La figura 7 muestra la pérdida de TFPI soluble a 40ºC medida tanto mediante HPLC de intercambio catiónico (símbolos abiertos) como mediante el ensayo del tiempo de protrombina (símbolos cerrados) para TFPI 0,5
mg/ml formulado en fosfato de Na 10 mM, pH 6 y o bien NaCl 150 mM (triángulos) o bien NaCl 500 mM
(círculos).
La figura 8 muestra la pérdida de TFPI soluble a 40ºC medida tanto mediante HPLC de intercambio catiónico (símbolos abiertos) como mediante el ensayo del tiempo de protrombina (símbolos cerrados) para TFPI 0,5 mg/ml formulado en acetato de Na 10 mM y pH 5,5 que contiene NaCl 150 mM (triángulos) o bien un 8% (p/v) de sacarosa (cuadrados) o bien un 4,5% (p/v) de manitol (círculos).
La figura 9 muestra dos geles de SDS no reductores para muestras de formulación de TFPI en NaPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM y 0,005% de polisorbato-80 a de pH 4 a pH 9 almacenados a 40ºC durante 0 días (inferior) y 20 días (superior). No se observa ninguna pérdida de TFPI a los 0 días. Sin embargo, a los 20 días pueden verse fragmentos de escisión del TFPI en el intervalo de pH inferior (es decir, pH 4 y pH 5). Sin limitarse a ninguna teoría en particular, se cree que estos fragmentos pueden resultar de una reacción catalizada por ácido.
Finalmente, la tabla 2 muestra la semivida del TFPI soluble restante a 40ºC para varias formulaciones. Se formuló TFPI 0,5 mg/ml en estas condiciones de formulación y se incubó a 40ºC. Se retiraron muestras a intervalos de tiempo predeterminados y se examinó la pérdida de TFPI soluble y activo por medio de HPLC-IEX y el ensayo de TP. Se calculó la semivida del TFPI soluble restante llevando a cabo un simple ajuste exponencial de los resultados de HPLC-IEX y el ensayo de TP.
Ejemplo 5 Elución del TFPI en modo de desplazamiento de resinas de cromatografía usando compuestos poliiónicos
En primer lugar, se une el TFPI a la resina en un tampón de bajo contenido en sal. Después, se bombea un tampón que contiene el compuesto poliiónico usado para eluir el TFPI en modo de desplazamiento a través de la columna. Este compuesto se une más fuertemente a la resina que el TFPI y desplaza al TFPI. Se usa un compuesto cargado negativamente para una resina cargada positivamente (intercambiador de aniones) y se usa un compuesto cargado positivamente para una resina cargada negativamente (intercambiador de cationes).
Se usó TFPI parcialmente purificado como material de partida. Se cargó el TFPI, en urea 6 M, Tris 20 mM, pH 8,0 en la columna rellena de una resina de intercambio aniónico, Q Sepharose HP, hasta 20 mg/ml de resina. Tras la carga, se lavó la columna con urea 6 M, Tris 20 mM, pH 9,0. Se eluyó el TFPI en Glass H (polifosfato) en urea 6 M, Tris 10 mM, pH 9,0.
Ejemplo 6 Elución del TFPI de la resina de cromatografía en un tampón acuoso usando compuestos poliiónicos 
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TABLA 2
t ½ (días) a 40ºC
TFPI 0,5 mg/ml formulado en: HPLC-IEX Ensayo TP
\hskip0,3cm Acetato de Na 10 mM, NaCl 150 mM, pH 5,5 10,8 17,2
\hskip0,3cm Citrato de Na 10 mM, NaCl 150 mM, pH 5,5 12,2 24,4
\hskip0,3cm Acetato de Na 10 mM, 8% (p/v) de sacarosa, pH 5,5 43,2 42,2
\hskip0,3cm Acetato de Na 10 mM, 4,5 de manitol %, pH 5,5 47,7 46,6
\hskip0,3cm Succinato de Na 10 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0 7,8 11,0
\hskip0,3cm Citrato de Na 10 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0 13,0 18,8
\hskip0,3cm Fosfato de Na 10 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0 7,8 11,2
\hskip0,3cm Fosfato de Na 10 mM, NaCl 500 mM, pH 6,0 52,2 68,9
\hskip0,3cm Citrato de Na 10 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5 10,0 14,8 
\vskip1.000000\baselineskip
Se usa un compuesto cargado positivamente para una resina cargada positivamente y se usa un compuesto cargado negativamente para una resina cargada negativamente.
Se cargó TFPI, en urea 3,5 M, polifosfato 1 mg/ml, Tris 50 mM, pH 5,9 en una resina de intercambio catiónico, SP Sepharose HP. Tras la carga, se lavó la columna con un tampón que no contiene urea, polifosfato 10 mg/ml, fosfato de sodio 10 mM, pH 5,0. Se eluyó el TFPI en el mismo tampón a pH 7,5, sin urea.
Ejemplo 7 Elución selectiva de TFPI de resinas de intercambio iónico usando compuestos poliiónicos
Debido a los extremos cargados del TFPI, pueden unirse compuestos poliiónicos con carga opuesta a estos extremos. Cuando el compuesto poliiónico tiene una fuerza de unión superior al TFPI que a la resina, puede eluirse selectivamente el TFPI de la resina de cromatografía.
Se cargó TFPI, en urea 3,5 M, polifosfato 1 mg/ml, Tris 50 mM, pH 5,9 en una resina de intercambio catiónico, SP Sepharose HP. Tras la carga, se lavó la columna con urea 6 M, polifosfato 1 mg/ml, fosfato de sodio 10 mM, pH 5,9. Se eluyó el TFPI en un gradiente de 25 volúmenes de columna de polifosfato hasta 20 mg/ml. El TFPI empieza a eluir a aproximadamente 2-3 mg/ml de polifosfato.
Ejemplo 8
Neutralización de compuestos poliiónicos antes de la separación cromatográfica del TFPI. El TFPI puede interaccionar con polímeros cargados. Esta interacción puede impedir la unión y purificación de las resinas cromatográficas. Neutralizando el polímero cargado con un polímero de carga opuesta, el TFPI puede unirse a la resina.
En un tampón que contiene polifosfato (Glass H), el TFPI no se une a Express Ion S (Whatman) y no se obtiene ninguna purificación. Mezclando PEI en la carga de la columna, ahora el TFPI se une a la resina y el TFPI puede purificarse.
Ejemplo 9 Replegamiento y purificación de TFPI recombinante humano (rhTFPI) usando el procedimiento de replegamiento facilitado con polifosfato (Glass H)
Se descongelaron cuerpos de inclusión que contenían aproximadamente 40 g de rhTFPI sacando los contenedores del congelador a -20ºC e incubándolos en una sala fría a 4-10ºC durante aproximadamente 196 horas. Entonces, se dispersaron los cuerpos de inclusión descongelados con una mezcladora de alta cizalladura para reducir la aglutinación que se produce durante la congelación. Se añadieron los cuerpos de inclusión descongelados a 80 l de un tampón de urea 3 M, Tris-Cl 50 mM, pH 10,5 que contenía Glass H 2 g/l contenido en un tanque de polietileno de 100 l equipado con un agitador superior. Se mezcló el contenido durante aproximadamente 15 minutos, y entonces se midió la absorbancia de la disolución a 280 nm. Si la absorbancia es superior entonces la mezcla se diluía con suficiente tampón de disolución para obtener una absorbancia a 280 nm de 1,0-1,1. La disolución se incubó con agitación suave durante 15-30 minutos, y entonces se añadió suficiente cisteína para dar una concentración de cisteína de 0,1 mM. Se disolvió la L-cisteína sólida en aproximadamente 50 ml de agua purificada y se añadió a la mezcla de replegamiento. Se comprobó el pH y se ajustó a pH 10,2 si era necesario. Se incubó la mezcla de replegamiento con agitación suave durante 96-120 horas.
Después de aproximadamente 96 horas, el procedimiento de replegamiento se terminó ajustando el pH de la mezcla de replegamiento hasta pH 5,9 usando ácido acético glacial. Se continuó la agitación durante 90 minutos y se comprobó el pH. Se añadió más ácido, si era necesario para ajustar el pH hasta 5,9+/-0,1. Se usó un proceso de filtración en dos etapas para retirar los materiales particulados que se formaron durante etapas precedentes y para preparar la mezcla de replegamiento acidificada para cromatografía en SP-Sepharose HP. En primer lugar, se pasa la mezcla de replegamiento acidificada a través de un filtro de profundidad Cuno 60LP (caja de alojamiento del filtro modelo 8ZP1P) usando una bomba peristáltica (tubos de silicio de diámetro interno de 1/4-3/8 de pulgada).
Se lavó el sistema de filtración con 8-10 l de urea 6 M desionizada antes de usarlo. Se recogió el filtrado en un tanque de polietileno de 100 l. Se mantuvo una contrapresión de 20 PSI constantes. La velocidad de flujo inicial para un filtro nuevo era de aproximadamente 5-6 l por minuto. Los filtros se sustituyeron cuando la velocidad de flujo caía por debajo de 1 l por minuto, con el fin de mantener la contrapresión de 20 PSI. La segunda fase de la filtración usó un cartucho de filtro de 0,45 micras (Sartorius Sartobran pH o equivalente) con un sistema de bombeo peristáltico. Tras la filtración, se comprobó el pH, y se ajustó hasta 5,9 si fue necesario.
La mezcla de replegamiento filtrada y acidificada se cargó en la columna de SP Sepharose HP equilibrada con una velocidad de flujo de aproximadamente 80,0 ml/min. Se ajustó la velocidad de flujo para adaptar una carga durante la noche de la mezcla de replegamiento filtrada acidificada. La columna se equilibró con tampón de urea 6 M, fosfato de sodio 20 mM, pH 5,9 antes de la carga. Tras la carga, se lavó la columna con 2 CF (pies cúbicos) de tampón de urea 6 M, NaCl 0,3 M, fosfato de sodio 20 mM, pH 5,9 antes de la etapa de elución por gradiente. Se aumentó la velocidad de flujo de la columna hasta 190-200 ml/min para la etapa de lavado y todas las etapas posteriores (velocidad lineal = -47 cm/h). Se eluyó el producto de la columna usando un gradiente salino lineal de disolución de NaCl desde 0,3 hasta 0,5 M en urea 6 M, fosfato de sodio 20 mM, pH 5,9. El gradiente se formó suministrando tampón de urea 6 M, NaCl 0,5 M,
fosfato de sodio 20 mM en tampón de urea 6 M, NaCl 0,3 M, fosfato de sodio 20 mM. El tampón límite se bombeó con una bomba Masterflex (modelo 7553-20) con un cabezal Masterflex (modelo 7051.21) a una velocidad de flujo de aproximadamente 100 ml/min con mezclado vigoroso usando una mezcladora Paratrol A de Parametrics (modelo 250210). El volumen total del gradiente fue de 71,0 litros o 13,0 VC. El pH de los tampones del gradiente era de 5,92 (+/-0,02). Se evaluaron las fracciones cualitativamente usando SDS-PAGE y se combinaron en base al contenido en SC-59735 replegada correctamente en relación con otros replegamientos erróneos e impurezas. Tras la combinación, la corriente del procedimiento se denomina combinación S.
A continuación, el pH de la combinación S se ajustó hasta pH 8,0 con NaOH 2,5 N. Se concentró la combinación S 2-3 veces hasta aproximadamente 2 l usando una unidad de ultrafiltración Amicon DC-10L que contenía un cartucho espiral Amicon YM10 (membrana de punto de corte de PM de 10.000). Tras la concentración, la combinación S concentrada se sometió a diafiltración frente a 7 volúmenes de tampón de urea 6 M, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. La diafiltración se consideró completa cuando la conductividad del material retenido era inferior a 2 mS. El concentrado diafiltrado se vació de la unidad de ultrafiltración y se lavó la unidad con aproximadamente 1 l de tampón de diafiltración. El lavado se combina con el concentrado de la carga Q.
Se llenó una columna Amicon (diámetro de 7,0 cm) con aproximadamente 700 ml de medio de alta resolución Q-Sepharose (Q-Sepharose HP de Pharmacia). La columna se llenó con etanol al 20% a 20 psi. La altura del lecho tras el llenado era de aproximadamente 18 cm. La columna se equilibró con 5 CF de tampón de urea 6 M, Tris/HCl 0,02 M, pH 8. El objetivo de la carga de proteína es de 8-10 mg de proteína/ml de resina Q-Sepharose. Se aplicó la carga Q a la columna con una velocidad de flujo de 30-35 ml/min (50 cm/h). Tras la carga, se lavó la columna con aproximadamente 5 VC de tampón de urea 6 M, Tris/HCl 20 mM, pH 8, o hasta que la absorbancia a 280 nm regresó a la línea base. El producto se eluyó usando un gradiente de cloruro de sodio de NaCl desde 0-0,15 M en tampón de urea 6 M, Tris/HCl 20 mM, pH 8,0 a lo largo de 25 volúmenes de columna. Los primeros siete volúmenes de columna se recogieron como una única fracción, seguida de 30 fracciones de 0,25 volúmenes de columna cada una.
Las fracciones se analizan de manera rutinaria con SDS-PAGE reductora y no reductora y cromatografía de exclusión por tamaños. Las fracciones se combinan en base al contenido en agregado (<5% mediante el método de HPLC-SEC MSL 13929) y mediante evaluación cualitativa por SDS-PAGE para evaluar la pureza. Las fracciones se almacenan congeladas a -20ºC hasta que se combinan.
Se combinaron las fracciones de Q-Sepharose aceptables, y el pH de la combinación se ajustó hasta 7,2 usando HCl 2 M. Entonces la combinación se concentro aproximadamente 5 veces en un sistema de ultrafiltración Amicon DC-1 que contenía un cartucho S1Y1 Amicon YM-10 (membrana de cartucho espiral de MWCO de 10.000). Entonces, la combinación Q concentrada se sometió a diafiltración frente a 7 volúmenes de tampón de urea 2 M, NaCl 0,15 M, fosfato de sodio 20 mM, pH 7,2. Después de la diafiltración, la disolución se vació del sistema de ultrafiltración. Se hicieron circular aproximadamente 100 ml de tampón de urea 2 M, NaCl 0,15 M, fosfato de sodio 20 mM, pH 7,2 a través del sistema de ultrafiltración durante aproximadamente 5 min. La disolución de aclarado se combinó con el concentrado original y la disolución se filtró a través de una unidad de filtración a vacío de 0,45 micras
(Nalgene).
Ejemplo 10 Replegamiento y purificación de rhTFPI usando el procedimiento de replegamiento facilitado con polietilenimina (PEI)
Se descongelaron cuerpos de inclusión que contenían aproximadamente 40 g de rhTFPI sacando los contenedores del congelador a -20ºC y incubándolos en una sala fría a 4-10ºC durante aproximadamente 96 horas. Entonces se dispersaron los cuerpos de inclusión descongelados con una mezcladora de alta cizalladura para reducir la aglutinación que se produce durante la congelación. La suspensión de cuerpos de inclusión se mezcló vigorosamente durante aproximadamente 1 minuto usando un homogeneizador Polytron (Brinkman modelo PT45/80) o hasta que los cuerpos de inclusión se añadieron entonces a 40 l un tampón de urea 6 M, Tris-Cl 100 mM, pH 9,8 que contenía NaCl 300 mM y PEI 0,4 g/L contenido en un tanque de polietileno de 100 l equipado con un agitador superior. Se agitó la mezcla vigorosamente durante 20-30 min. El pH se monitorizó y ajustó hasta pH 9,8 según fuese necesario. Se midió la absorbancia de la mezcla de cuerpos de inclusión disueltos a 280 nm, y si la absorbancia era superior a 2,1, la mezcla se diluía con 10 l del tampón de disolución descrito anteriormente para obtener un valor de A_{280} de 2,0-2,1. Se continuó con agitación suave durante otros 15-30 minutos. Después, la disolución de cuerpos de inclusión diluidos se diluyó con un volumen igual de disolución de urea 1,0 M, NaCl 300 mM. Finalmente, se añadió L-cisteína para dar una concentración final de 0,25 mM. La L-cisteína sólida se disolvió en 50 ml de WFI (agua para inyección) y se añadió como una disolución a la mezcla de replegamiento diluida. Se comprobó el pH y se ajustó, si fue necesario. El replegamiento continuó con agitación suave durante 96-120 horas con comprobaciones periódicas del pH, y ajuste hasta pH 9,8 si era necesario. El avance del replegamiento se monitorizó mediante ensayos de intercambio catiónico Mon-S y del tiempo de protrombina.
Tras aproximadamente 96 h, se terminó el procedimiento de replegamiento ajustando el pH de la mezcla de replegamiento hasta pH 5,9 usando ácido acético glacial. Se continuó la agitación durante 90 minutos y se comprobó el pH. Se añadió más ácido, si fue necesario para ajustar el pH hasta 5,9+/-0,1.
Se usó un proceso de filtración en dos etapas para retirar los materiales particulados que se formaron durante etapas precedentes y para preparar la mezcla de replegamiento acidificada para el cromatógrafo de SP-Sepharose HP. En primer lugar, se pasa la mezcla de replegamiento acidificada a través de un filtro de profundidad Cuno 60LP (caja de alojamiento del filtro modelo 8ZP1P) usando una bomba peristáltica (tubos de silicio de diámetro interno de 1/4-3/8 de pulgada).
Se lavó el sistema de filtración con 8-10 l de urea 6 M desionizada antes de usarlo. Se recogió el filtrado en un tanque de polietileno de 100 L. Se mantuvo una contrapresión de 20 PSI constantes. La velocidad de flujo inicial para un filtro nuevo era de aproximadamente 5-6 l por minuto. Los filtros se sustituyeron cuando la velocidad de flujo caía por debajo de 1 l por minuto, con el fin de mantener la contrapresión de 20 PSI. La segunda fase de la filtración usó un cartucho de filtro de 0,45 micras (Sartorius Sartobran pH o equivalente) con un sistema de bombeo peristáltico. Tras la filtración, se comprobó el pH, y se ajustó hasta 5,9 si fue necesario.
La mezcla de replegamiento filtrada y acidificada se cargó en la columna de SP Sepharose HP equilibrada con una velocidad de flujo de aproximadamente 80,0 ml/min. Se ajustó la velocidad de flujo para adaptar una carga durante la noche de la mezcla de replegamiento filtrada acidificada. La columna se lavó con 5,5 volúmenes de columna de tampón de urea 6 M, NaCl 0,3 M, fosfato de sodio 20 mM, pH 5,9. Se aumentó la velocidad de flujo de la columna hasta 190-200 ml/min para la etapa de lavado y todas las etapas posteriores (velocidad lineal = -47 cm/h). Se eluyó el producto de la columna usando un gradiente salino lineal de NaCl desde 0,3 hasta 0,5 M en tampón de urea 6 M, fosfato de sodio 20 mM, pH 5,9. El gradiente se formó suministrando tampón de urea 6 M, NaCl 0,5 M, fosfato de sodio 20 mM en tampón de urea 6 M, NaCl 0,3 M, fosfato de sodio 20 mM, en tampón de urea 6 M, NaCl 0,3 M, fosfato de sodio 20 mM. El tampón límite se bombeó con una bomba Masterflex (modelo 7553-20) con un cabezal Masterflex (modelo 7051.21) a una velocidad de flujo de aproximadamente 100 ml/min con mezclado vigoroso usando una mezcladora Paratrol A de Parametrics (modelo 250210). El volumen total del gradiente fue de 71,0 litros o 13,0 VC. El pH de los tampones del gradiente era de 5,92 (+/-0,02).
La recogida de fracciones se empezó cuando la conductividad de entrada de la columna alcanzó los 28,0-28,5 mS/cm medido mediante el conductímetro Radiometer en línea. Se recogieron cuarenta fracciones de 500 ml (0,1 VC). Se usó un colector de fracciones Pharmacia Frac-300 con botellas de polipropileno de 500 ml, numeradas. Cuando se detuvo el colector de fracciones el resto del gradiente se recogió como una combinación.
Las fracciones de la columna se analizaron según su A_{280}, mediante HPLC de exclusión por tamaños, y además, con fines de información, SDS-PAGE, HPLC en fase inversa, y ensayos de TP. Se combinaron las fracciones que cumplían los criterios de combinación de contener el 20% menos de agregado tal como se determinó mediante el procedimiento de HPLC-SEC. Las fracciones de SP Sepharose combinadas se denominan aquí como combinación S.
Después se ajustó el pH de la combinación S hasta pH 8,0 con NaOH 2,5 N. La combinación se concentro 2-3 veces hasta aproximadamente 2 l usando una unidad de ultrafiltración Amicon DC-10L que contenía un cartucho espiral Amicon YM-10 (membrana de punto de corte de PM de 10.000). Tras la concentración, se sometió a diafiltración la combinación S concentrada frente a 7 volúmenes de tampón de urea 6 M, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. La diafiltración se consideró completa cuando la conductividad del material retenido fue inferior a 2 mS. El concentrado diafiltrado se vació de la unidad de ultrafiltración y se lavó la unidad con aproximadamente 1 l de tampón de diafiltración. El lavado se combina con el concentrado para formar la carga Q.
Se llenó una columna Amicon (diámetro de 7,00 cm) con aproximadamente 700 ml de medio de alta resolución Q-Sepharose (Q-Sepharose HP de Pharmacia). La columna se llenó con etanol al 20% a 20 psi. La altura del lecho tras el llenado era de aproximadamente 18 cm. La columna se equilibró con 5 VC de tampón de urea 6 M, Tris/HCl 0,02 M, pH 8. El objetivo de la carga de proteína es de 8-10 mg de proteína/ml de resina Q-Sepharose. Se aplica la carga Q a la columna con una velocidad de flujo de 30-35 ml/min (50 cm/h). Tras la carga, se lavó la columna con aproximadamente 5 VC de tampón de urea 6 M, Tris/HCl 20 mM, pH 8, o hasta que la absorbancia a 280 nm regresó a la línea base. El producto se eluyó usando un gradiente de cloruro de sodio de NaCl desde 0-0,15 M en tampón de urea 6 M, Tris/HCl 20 mM, pH 8,0 a lo largo de 25 volúmenes de columna. Los primeros siete volúmenes de columna se recogieron como una única fracción, seguida de 30 fracciones de 0,25 volúmenes de columna cada una.
Las fracciones se analizan de manera rutinaria con SDS-PAGE reductora y no reductora y cromatografía de exclusión por tamaños. Las fracciones se combinan en base al contenido en agregado (<5% mediante HPLC-SEC) y mediante evaluación cualitativa por SDS-PAGE para evaluar la pureza. Las fracciones se almacenan congeladas a -20ºC hasta que se combinan.
Las fracciones de Q-Sepharose que iban a combinarse se descongelaron mediante incubación a 2-8ºC, se combinaron y se ajustó el pH de la combinación hasta 7,2 usando HCl 2 M. Entonces la combinación se concentró aproximadamente 5 veces en un sistema de ultrafiltración Amicon DC-1 que contenía un cartucho S1Y1 Amicon YM-10 (membrana de cartucho espiral de MWCO de 10.000). Entonces, la combinación Q concentrada se sometió a diafiltración frente a 7 volúmenes de tampón de urea 2 M, NaCl 0,15 M, fosfato de sodio 20 mM, pH 7,2. Después de la ultrafiltración, la disolución se vació del sistema de ultrafiltración. Se hicieron circular aproximadamente 100 ml de tampón de urea 2 M, NaCl 0,15 M, fosfato de sodio 20 mM, pH 7,2 a través del sistema de ultrafiltración durante aproximadamente 5 min. La disolución de aclarado se combinó con el concentrado original y se filtró a través de una unidad de filtración a vacío de 0,45 micras (Nalgene).
Ejemplo 11 Disolución, replegamiento y purificación de rhTFPI procedente de cuerpos de inclusión usando polifosfato en ausencia de caótropos tales como urea. (GDS 5327089,92)
Se disolvieron aproximadamente 2 g de rhTFPI (43 ml de suspensión de cuerpos de inclusión que contenían 46 mg/ml de rhTFPI) con mezclado en 4 l de tampón Tris 50 mM, pH 10,5 que contenía polifosfato 4 g/l (Glass H, FMC Corporation) a 2-8ºC. Se añadió suficiente cisteína y cistina para preparar las disoluciones 0,1 mM y 0,05 mM respectivamente. Se mantuvo el pH a pH 10,5 con NaOH 1 N. La disolución de replegamiento se incubó a 2-8ºC con mezclado suave durante 72-96 horas.
Después se ajustó la mezcla de replegamiento a pH 6 usando ácido acético glacial y entonces se filtró a través de un filtro de 0,2 micras. Se aplicó una alícuota de la mezcla de replegamiento filtrada a una columna de 200 ml de SP-Sepharose HP (Pharmacia) previamente equilibrada con tampón de 0,4% de Glass H, fosfato de sodio 20 mM, pH 6. Tras la carga, se lavó la columna con 4 volúmenes de columna de tampón de 0,4% de Glass H, fosfato de sodio 20 mM, pH 6. La columna se eluyó usando un gradiente de pH lineal de desde tampón de 0,4% de Glass H, fosfato de sodio 20 mM, pH 6 hasta tampón de 0,4% de Glass H, Tris 50 mM, pH 8. Las fracciones se recogieron y analizaron mediante SDS-PAGE. Pudo replegarse y purificarse rhTFPI relativamente puro de esta manera.
Ejemplo 12 Solubilidad mejorada del rhTFPI en agua mediante la formación de un complejo entre el TFPI y polifosfato (GDS 5327046-47)
Se descongelaron aproximadamente 10 g de rhTFPI purificado en aproximadamente 1 l de tampón de urea 2 M, cloruro de sodio 125 mM, fosfato de sodio 20 mM, pH 7,4 mediante incubación a 2-8ºC durante 18-36 h. Se añadió suficiente urea seca para preparar la disolución 6 M en urea. Entonces se filtró la disolución a través de un filtro de 0,2 micras. Se disolvieron cinco g de vidrio de polifosfato (Glass H, FMC) en 50 ml de urea 6 M, se ajustó hasta pH 7 con NaOH 1 N, y se añadió a la disolución de la proteína. Entonces se concentró la disolución mediante ultrafiltración usando un pie cuadrado de membrana (Amicon S1Y3) hasta aproximadamente 400 ml (-25 mg/ml) y se sometió a diafiltración frente a 10 volúmenes (aproximadamente 4 litros) de agua purificada para eliminar la urea residual. Tras la diafiltración, la disolución se concentró hasta aproximadamente 250 ml y se retiró de la unidad de ultrafiltración. La unidad de ultrafiltración se lavó con aproximadamente 150 ml de agua purificada y se añadió al concentrado de proteínas. El concentrado de proteína final contenía casi 10 g de proteína en 400 ml de agua (aproximadamente 24 mg/ml de proteína). La solubilidad normal del rhTFPI en agua es inferior a 0,5 mg/ml.
Ejemplo 13 Uso de polímeros catiónicos para la eliminación de contaminantes de E. coli de lisados celulares de TFPI y cuerpos refringentes
El uso de polímeros catiónicos para precipitar y eliminar contaminantes de E. coli de productos intermedios de TFPI brutos (lisados, cuerpos refringentes) puede mejorar significativamente las operaciones de procedimiento posteriores (replegamiento, cromatografía, etc.). Una selección aleatoria de polímeros catiónicos identificó candidatos que precipitan selectivamente contaminantes bacterianos mientras que el TFPI permanece en disolución. Específicamente, el polímero Betz 624 precipitó cantidades sustanciales de contaminantes bacterianos, mientras que dejó al TFPI en disolución en un entorno acuoso.
Cuerpos refringentes de TFPI disueltos (en clorhidrato de guanidina 3,5 M, cloruro de sodio 2 M, Tris 50 mM, ditiotreitol 50 mM, pH 7,1) fueron el material de partida usado para un experimento de selección de polímeros. Se diluyó este material 10 veces con una disolución al 0,5% de varios polímeros. Se analizaron los precipitados de este experimento mediante SDS-PAGE para determinar la presencia de TFPI. El polímero Betz 624 precipitó cantidades sustanciales de contaminantes, sin TFPI, y dio como resultado una disolución acuosa transparente.
Ejemplo 14
El uso de extracción en dos fases acuosas con un sistema de polietilenglicol (PEG), polifosfato, urea ofrece ventajas de tratamiento para la purificación de TFPI. Sistemas de dos fases acuosas típicos consisten en dos sistemas poliméricos (por ejemplo, PEG y dextrano) o un polímero y una sal (por ejemplo PEG y sulfato). El sistema descrito en el presente documento tiene ventajas en cuanto a que puede optimizarse la longitud de la cadena de polifosfato para la separación, no es caro y es específico en la eliminación de contaminantes problemáticos de los cuerpos refringentes de TFPI
que se sabe interfieren con el replegamiento y la cromatografía (polifosfatos nativos y metales divalentes asociados).
Se solubilizaron cuerpos refringentes de TFPI en urea 7 M, CAPS 10 mM, 1% de monotioglicerol, pH 10. Se añadieron polifosfato y PEG de diferentes longitudes de cadena para formar las dos fases. Con la separación de fases, el TFPI se repartió en la fase superior rica en PEG, dejando los polifosfatos y contaminantes asociados en la fase inferior. La separación se ve afectada por las longitudes de cadena tanto de de PEG como del polifosfato y puede optimizarse variando ambas.
Ejemplo 15 Replegamiento facilitado con un polímero cargado del activador del plasminógeno tisular (t-PA) recombinante procedente de cuerpos de inclusión de E. coli
Se añaden cinco gramos (peso húmedo) de cuerpos de inclusión que contienen aproximadamente 2 gramos del activador del plasminógeno tisular recombinante a aproximadamente 1 litro de tampón de 0,5% de Glass H, Tris 50 mM, pH 10,8 que contenía glutatión reducido (GSH) 1 mM y disulfuro de glutatión (GSSG) 0,2 mM. La mezcla se combina meticulosamente usando un homogeneizador Polytron (Brinkman) durante 2-3 minutos para dispersar por completo los cuerpos de inclusión. Se incuba la mezcla con mezclado usando un agitador superior durante 15 minutos, mientras se mantiene el pH a 10,5-10,9 usando NaOH 1 N. Entonces, se mezcla suavemente la mezcla durante 48-72 horas a 2-8ºC.
Ejemplo 16 Replegamiento facilitado con un polímero cargado de somatotropina bovina procedente de cuerpos de inclusión de E. coli
Se añaden diez gramos (peso húmedo) de cuerpos de inclusión que contienen 5 gramos de somatotropina bovina a aproximadamente 1 litro de tampón de 1% de Glass H, Tris 50 mM, pH 10,5. La mezcla se combina meticulosamente usando un homogeneizador Polytron (Brinkman) durante 2-3 minutos para dispersar por completo los cuerpos de inclusión. Se incuba la mezcla con mezclado usando un agitador superior durante 15 minutos mientras se mantiene el pH a 10,4-10,6 usando NaOH 1 N. Se añade cisteína sólida (121 mg) para que la reacción sea con cisteína 1 mM, y la reacción de replegamiento se mezcla durante 48-72 horas.

Claims (32)

1. Disolución acuosa que comprende TFPI replegado, muteína de TFPI replegado o TFPI-2 replegado y un polímero cargado, en la que la concentración de TFPI replegado, muteína de TFPI replegado o TFPI-2 replegado es superior a 1 mg/ml.
2. Disolución acuosa según la reivindicación 1, en la que la concentración de TFPI replegado, muteína de TFPI replegado o TFPI-2 replegado es superior a 5 mg/ml.
3. Disolución acuosa según la reivindicación 1, en la que la concentración de TFPI replegado, muteína de TFPI replegado o TFPI-2 replegado es superior a 10 mg/ml.
4. Disolución acuosa según la reivindicación 1, en la que la concentración de TFPI replegado, muteína de TFPI replegado o TFPI-2 replegado es superior a 20 mg/ml.
5. Disolución acuosa según la reivindicación 1, en la que la concentración de TFPI replegado, muteína de TFPI replegado o TFPI-2 replegado es de desde 1 hasta 10 mg/ml.
6. Disolución acuosa según la reivindicación 1, en la que la concentración de TFPI replegado, muteína de TFPI replegado o TFPI-2 replegado es de desde 1 hasta 20 mg/ml.
7. Disolución acuosa según la reivindicación 1, en la que la concentración de TFPI replegado, muteína de TFPI replegado o TFPI-2 replegado es de desde 5 hasta 20 mg/ml.
8. Disolución acuosa según la reivindicación 1, que es farmacéuticamente aceptable.
9. Disolución acuosa según la reivindicación 1, en la que el polímero cargado es un polisacárido sulfatado.
10. Disolución acuosa según la reivindicación 1, en la que el polímero cargado es heparina.
11. Disolución acuosa según la reivindicación 1, en la que el polímero cargado es sulfato de dextrano.
12. Disolución acuosa según la reivindicación 1, en la que el polímero cargado es polifosfato.
13. Método de modificación de la solubilidad de una proteína que tiene un primer dominio que tiene una carga positiva neta y un segundo dominio que tiene una carga negativa neta, que comprende las etapas de:
añadir a la proteína una disolución acuosa de un polímero cargado para reducir las interacciones intermoleculares o intramoleculares entre los dominios cargados positiva y negativamente, en el que la proteína es TFPI replegado, muteína de TFPI replegado o TFPI-2 replegado.
14. Método según la reivindicación 13, en el que la proteína está en una forma insoluble antes de la etapa de adición.
15. Método según la reivindicación 13, en el que también se añade un agente caotrópico a la proteína.
16. Método según la reivindicación 13, en el que se aumenta la actividad específica de la proteína mediante dicha etapa de adición.
17. Método según la reivindicación 13, en el que se inmoviliza el polímero cargado sobre un soporte sólido.
18. Método según la reivindicación 13, que comprende además:
aplicar la proteína a un soporte sólido antes de añadir el polímero cargado.
19. Método según la reivindicación 17, que comprende además:
aplicar la proteína a un soporte sólido después de añadir el polímero cargado.
20. Método según la reivindicación 18, en el que el soporte sólido es una resina de intercambio iónico.
21. Método según la reivindicación 19, en el que el soporte sólido es una resina de intercambio iónico.
22. Método según la reivindicación 20 o la reivindicación 21, en el que la resina y el polímero tienen cargas netas opuestas.
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23. Método según la reivindicación 20 o la reivindicación 21, en el que la resina y el polímero tienen la misma carga neta.
24. Método según la reivindicación 21, en el que se añade el polímero cargado en un gradiente de concentración para llevar a cabo una elución selectiva desde el soporte sólido.
25. Método de replegamiento de TFPI, una muteína de TFPI o TFPI-2, que comprende la etapa de añadir un polímero cargado a una disolución que comprende TFPI, muteína de TFPI o TFPI-2 desnaturalizados o replegados de manera inadecuada antes de permitir que se repliegue dicho TFPI, muteína de TFPI o TFPI-2.
26. Método según la reivindicación 25, en el que el polímero es sulfato de dextrano.
27. Método según la reivindicación 25, en el que el polímero es heparina.
28. Método según la reivindicación 25, en el que la heparina se añade en disolución.
29. Método según la reivindicación 25, que comprende además las etapas de:
incubar dicha disolución para permitir que se repliegue dicho TFPI, muteína de TFPI o TFPI-2, añadir sal para disociar el polímero del TFPI, muteína de TFPI o TFPI-2, hacer pasar la disolución por una columna de HIC y recuperar el TFPI, muteína de TFPI o TFPI-2.
30. Método de replegamiento de TFPI, una muteína de TFPI o TFPI-2, que comprende la etapa de inmovilizar polímeros de polisacáridos sulfatados en una columna y hacer pasar una disolución de TFPI, muteína de TFPI o TFPI-2 desnaturalizado a través de la columna y eluir el TFPI, muteína de TFPI o TFPI-2 replegado después de que se haya producido el replegamiento.
31. Método según la reivindicación 30, en el que el polisacárido sulfatado es sulfato de dextrano.
32. Método según la reivindicación 30, en el que el polisacárido sulfatado es heparina.
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