JP2004083591A - タンパク質の可溶化、精製、および再生の方法 - Google Patents
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Abstract
【手段】 ポリイオンポリマーを用いたタンパク質の溶解度の修飾方法が開示される。ポリイオンポリマーは、タンパク質、特に誤って折りたたまれたタンパク質や凝集したタンパク質の可溶化、製剤、精製、および再生を促進する。TFPIの製剤に適した組成が開示されている。この組成を用いると0.2 mg/ml以上および10mg/ml以上の濃度の医薬品として許容可能なTFPI組成の調製が可能である。
【選択図】 なし
Description
本発明はタンパク質の再生方法を提供することを目的とする。
本発明はTFPIの水溶性製剤を提供することも目的とする。
本発明は荷電ポリマーを使用してタンパク質の溶解度を修飾する方法を提供することも目的とする。
本発明はTFPIを再生させる前に変性TFPI溶液に荷電ポリマーを添加するステップを含む、TFPIの再生方法を記載することも目的とする。
さらに、本発明はカラム上に荷電ポリマーを固定化し、変性TFPI溶液をこのカラムに通し、再生が起きた後に再生したTFPIを溶出するステップを含むTFPIの再生方法を記載することも目的とする。
本発明者は、ポリエチレンイミンおよびポリリン酸塩のようなポリイオンポリマーが、タンパク質内のイオン性相互作用を修飾することができることを見出した。ポリイオンを用いて、タンパク質内の荷電密度の高い特定の領域を覆うと、数多くの効果が現われることがある。反対の電荷を持つ領域が分子内や分子間で中和されるために溶解度が低下しているタンパク質は、荷電領域の1つをポリ陽イオンまたはポリ陰イオンで覆うと、溶解度が改善することがある。再生過程に干渉するような、立体構造の柔軟性への障害、ならびに特異的な引力または反発力も、修飾することができる。精製操作中に、可溶化し可溶性を維持するために、尿素や塩酸グアニジンのような強力な変性剤を必要とするタンパク質は、ポリイオンを使用すると効果的に可溶化し加工処理することができる。
組換えDNA技術によって、通常は天然源から認められるほどの量が単離できなかった多くのタンパク質を、高レベルで発現することが可能になった。大腸菌およびその他の数種類の発現系では、タンパク質はしばしば不活性な変性した状態で発現され、アミノ酸の1次配列は正しいものの、2次構造と3次構造、ならびにシステインのジスルフィド結合は存在しない。封入体に存在する変性タンパク質は、通常は接触しないアミノ酸バックボーンの、異なる部分の荷電残基が相互作用し、正の電荷を持つアミノ酸残基と負の電荷を持つアミノ酸残基の間に強いイオン結合が形成されるような立体構造になっているのかもしれない。これらのイオン結合の形成は、封入体の溶解のために必要な水和を制限することがある。また、封入体中のタンパク質は、膜成分および核酸のような他の細胞成分と複合体を作り、これにより、電荷を持ち通常は水和している残基に溶媒(水)が接近するのが制限されるのかもしれない。また、変性した状態では、通常はタンパク質の内部に埋まっている疎水性の残基が、極性を持つ水性環境に、より露出している。これらのために、封入体は、尿素もしくはグアニジンのような強いカオトロピック剤、またはSDSのような界面活性剤以外の溶媒に溶解しないのかもしれない。
組換えDNA技術によって、通常は天然源から認められるほどの量が単離できなかった多くのタンパク質を高レベルで発現することが可能になった。大腸菌およびその他の数種類の発現系では、タンパク質はしばしば不活性な変性した状態で発現され、アミノ酸の1次配列は正しいものの、2次構造と3次構造、ならびにシステインのジスルフィド結合は存在しない。変性したタンパク質は、活性を持つ正しい立体構造に再生されなくてはならないが、このためにはしばしば、イオン性の引力と反発力、結合の回転の制限、および立体構造に誘導される他の種類のストレスにより強いられる、著しいエネルギー障壁を克服する必要がある。反対の電荷の間の特異的なイオン性の引力や、同様な電荷の間の反発力は、変性タンパク質が利用できる再生経路を著しく制限し、再生過程の効率を低下させる場合がある。
タンパク質はアミノ酸の鎖から構成され、その正確な組成と配列がタンパク質の構造の主要決定因子の1つになる。タンパク質構造の2次的決定因子は、個々のアミノ酸結合がタンパク質の立体構造に対して与える、立体構造の誘導の結果である。第3に、特定のアミノ酸配列は、βシートやαヘリックスのような3次構造の形成を誘導する。タンパク質の立体構造の3次元的性質は、ポリペプチド鎖の直接の配列では通常近接していないアミノ酸残基を、しばしば近付けることになる。タンパク質の機能的な形は、一般に、システインのジスルフィド結合、イオン結合、ならびに疎水性およびファン・デル・ワールスの相互作用の組み合わせにより、ある程度安定な立体構造を持つ。
本明細書に使用される「加工処理」という用語は、医薬品として許容可能な量のタンパク質の精製と調製を意味する。加工処理には、可溶化、再生、クロマトグラフ分離、沈殿、および製剤のような1つまたは複数のステップが含まれることがある。
本明細書に使用される「患者」は、ヒトおよび家畜の患者を意味する。
TFPIは、米国特許第5,212,091号(この開示は参照として本明細書に組み入れられる)に開示の組換え法によって製造することができる。簡単に説明すると、TFPIは大腸菌細胞で発現され、TFPI含有封入体は残余の細胞物質から単離される。封入体を亜硫酸処理し、イオン交換クロマトグラフィを用いて生成し、ジスルフィド交換反応により再生して、カチオン交換クロマトグラフィにより再生した活性TFPIを精製した。TFPIはまた、同時継続中の米国特許出願第08/286,530号に開示される酵母で産生してもよい。
試薬はすべてU.S.P.(米国薬局法)またはA.C.S.(米国化学協会)グレードである。供給元にはJ. T. BakerおよびSigma Co. (St. Louis, MO)が含まれる。
以下の実施例は、原液の製造、HICカラム製造、再生に先立って行うTFPIの最初の回収及び精製、TFPIの再生、そして活性TFPIの回収を説明する。
TFPI試料を0.5 mg/mL TFPI、0.6 mg/mL硫酸デキストラン、3.0 M尿素、200 mM NaClおよび50 mMトリス(pH 5.5)の濃度で再生した。HICカラムは、1.66 mLのスラリー中HIC用のTosohaas Butylビーズ、4.6 mmD/100 mLから作った。HICカラムに流す前に、3.0 M尿素および3.0 M NH4SO4を用い2:3 の割合で最終pH が5.68になるよう試料を希釈しておき、2 mLの試料を流した。勾配開始は、33 mM MES/33 mM HEPES/33 mM酢酸ナトリウム、1.0 M NH4SO4 および3.0 M尿素、pH 6.0であった。勾配終点は、33 mM MES/33 mM HEPES/33 mM酢酸ナトリウムおよび3.0 M尿素、pH 6.0であった。勾配容量は5.0 CVであった。このカラムから、天然本来のTFPIが68%回収された。結果を図2に示す。
2M尿素中約10 mg/mLのTFPIを以下に記載する物質のうちの一つに対して透析した:前述の20 mMリン酸塩、20 mMクエン酸塩、20 mMグリシン、20 mM L-グルタミン酸塩または20 mMコハク酸塩、150 mM NaCl 中の 20 mM酢酸塩。6 〜 10 mg/mLのTFPIバルク原液をSpec/Pro 7透析チューブ(MW cutoff 3,500)に流した。透析は4℃または周囲温度で行った。12〜24 時間にわたる透析中に、1 〜50-100のタンパク質溶液:緩衝液比で緩衝液を三段階に変化させた。TFPI溶液をCostar 0.22 ミクロンフィルターで濾過して可溶性TFPIからTFPI沈殿を分離した。次いで、278 nmにおける吸光係数を0.68 (mg/mL)-1と推定して、UV/可視吸光度によりTFPIの溶解性を測定した。HClまたはNaOHを用いる滴定により、種々のpHレベルの溶液を作った。
種々のpH条件で保存したTFPIの溶解性を調べた。10 mMリン酸ナトリウム、150 mM NaClおよび0.005% (w/v) ポリソルベート80中、上記のように透析してTFPIを作った。150 mg/mL TFPIを含有する溶解性試料を40℃で20日間インキュベーションした。カチオン交換クロマトグラムの主ピーク減少を追跡することによって、残留する可溶性TFPIの動力学的速度係数を分析した。図5からわかるように、崩壊レート定数はpH 6.0を超えるレベルで上昇し、これより高いpH条件ではさらに凝集することを示している。
ポリイオン性化合物を使用するクロマトグラフィ樹脂から置換モードにおけるTFPIの溶出
まず低塩緩衝液中の樹脂にTFPIを結合させる。次に置換モードにおいてTFPIを溶出するのに使われるポリイオン性化合物をポンプでカラムに通す。この化合物はTFPIよりも樹脂の方に強く結合してTFPIを置換する。陽性荷電樹脂(アニオン交換剤)に対しては陰性荷電化合物を使用し、陰性荷電樹脂(カチオン交換剤)に対しては陽性荷電化合物を使用する。
ポリイオン性化合物を使用するイオン交換樹脂からのTFPIの選択的溶出
TFPIの荷電末端のために、反対に荷電したポリイオン性化合物はそれら末端に結合する。ポリイオン性化合物が樹脂に対してよりもTFPIの方に強い結合性を持つ場合には、TFPIをクロマトグラフィ樹脂から選択的に溶出することができる。
TFPIのクロマトグラフィ分離に先立つポリイオン性化合物の中和
TFPIは荷電したポリマーと相互作用することができる。この相互作用は、クロマトグラフィ樹脂に対する結合および精製を妨げることがある。荷電したポリマーを反対荷電のポリマーで中和することにより、TFPIを樹脂と結合させることができる。ポリリン酸(Glass H)を含有する緩衝液において、TFPIはExpress Ion S(Whatman)と結合しないので精製することができない。PEIをカラムロードに混ぜることによってTFPIを樹脂に結合させTFPIを精製することができる。
ポリリン酸(Glass H)による促進再生プロセスを用いるリコンビナントヒトTFPI(rhTFPI)の再生および精製
約40 gのrhTFPIを含有する封入体は、-20℃のフリーザーからその容器を取り出し、これを4〜10℃の冷室に約196時間おいて解凍した。次いで、凍結中に起こる凝集を減少させるため、解凍した封入体を高せん断ミキサーで分散させた。オーバーヘッド撹拌器を備えた100 Lのポリエチレン製タンクに入れた、3 M 尿素、50 mMトリス-Cl、pH 10.5の緩衝液80 Lに、2 g/L Glass Hを含有する解凍した封入体を添加した。内容物を約15分間混合した後、溶液の吸光度を280 nmで測定した。吸光度がより大きい場合には、280 nmで1.0〜1.1の吸光度を得るのに十分な溶解緩衝液で混液を希釈した。穏やかにかき混ぜながら、溶液は15 〜30分間インキュベーションした。次いで0.1 mMのシステイン濃度を与えるに十分なシステインを添加した。固体のL-システインを約50 mlの精製水に溶解して再生物混液に添加した。pHをチェックし、必要なら、pH 10.2に調整した。穏やかにかき混ぜながら、再生物混液を96 〜120時間インキュベーションした。
ポリエチレンイミン(PEI)による促進再生プロセスを用いるrhTFPIの再生および精製
約40 gのrhTFPIを含有する封入体は、-20℃のフリーザーからその容器取り出し、これを4〜10℃の冷室に約96時間おいて解凍した。次いで、凍結中に起こる凝集を減少させるため、解凍した封入体を高せん断ミキサーで分散させた。ポリトロンホモジナイザー(Brinkman model PT45/80)を使って、この封入体スラリーを約1分間激しく混合した。または、オーバーヘッド撹拌器を備えた100 Lのポリエチレン製タンクに入れた、300 mM NaClおよび0.4 g/L PEIを含有する6 M 尿素、100 mM Tris/HCl緩衝液、pH 9.8の40 Lに、この封入体を添加するまで激しく混合した。混液は20〜30分間激しく混合した。pHをモニターし必要ならばpH 9.8に調整した。溶解した封入体混合液の吸光度を280 nmで測定した。吸光度が2.1より大きい場合には、2.0〜2.1のA280値が得られるよう、上記の溶解緩衝液10リットルで試料を希釈した。さらに15〜30分間穏やかな撹拌を続けた。次いで溶解した封入体溶液を等量の1.0 M尿素、300 mM NaCl溶液で希釈した。最後に、0.25 mMの最終濃度になるまでL-システインを添加した。固体のL-システインを50 mlのWFIに溶解し、溶液として希釈した再生物混液に添加した。pHをチェックし、必要なら調整した。定期的にpHをチェックしてpH 9.8に調整すると共に、穏やかにかき混ぜながら、96〜120時間再生を継続した。再生の過程は、Mon-Sカチオン交換およびプロトロンビンタイムアッセイでモニターした。
尿素のようなカオトロプの不存在下ポリリン酸を使用する、封入体からのrhTFPIの可溶化、再生および精製(GDS 5327089,92)
混合しながら、4 g/lポリリン酸(Glass H, FMC Corportaion)を含有する50 mM Tris緩衝液、pH 10.5に約2 gのrhTFPI(46 mg/mlのrhTFPIを含有する43 mlの封入体スラリー)を2〜8℃で溶解した。0.1 mMおよび0.05 mMの各溶液を作るのに十分なシステインおよびシスチンを添加した。溶液のpHを1 N NaOH でpH 10.5に維持した。穏やかに撹拌しながら、再生物溶液を72〜96時間、2〜8℃でインキュベーションした。
TFPIとポリリン酸の複合体形成による改善されたrhTFPIの溶解性(GDS 5327046-47)
2 M尿素、125 mM塩化ナトリウム、20 mMリン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.4の約1リットル中精製したrhTFPI約10 gを2〜8℃で18〜36時間インキュベーションすることによって解凍した。十分乾燥した尿素を添加して6 M尿素溶液を作った。次いでこの溶液を0.2ミクロンフィルターで濾過した。ポリリン酸ガラス(Glass H, FMC)5 gを6 M尿素50 mlに溶解し、1 N NaOHでpH 7に調整した後、これをタンパク質溶液に加えた。次いで限外濾過により、 1スクエアフィートの膜(Amicon S1Y3)を使って約400 ml(〜25 mg/ml)になるまで濃縮し、精製水10容量(約4リットル)に対して膜濾過し、残っている尿素を除いた。膜濾過後、溶液を約250 mlになるまで濃縮し、限外濾過ユニットから除いた。限外濾過ユニットを約150 mlの精製水で洗浄し、タンパク質濃縮液に加えた。最終タンパク質濃縮液は400 mlの水中ほとんど10 gのタンパク質を含んでいた(約24 mg/mlタンパク質)。
TFPI細胞ライセートおよび折れ曲がり体から大腸菌汚染物を除去するためのカチオン性ポリマーの使用
粗TFPI中間体(ライセート、折れ曲がり体)から大腸菌不純物を沈殿除去するためにカチオン性ポリマーを使用すると、以下のプロセス操作(再生、クロマトグラフィなど)を有意に改善することができる。カチオン性ポリマーの無作為スクリーニングによって、TFPIは溶液に残すが菌の汚染物は選択的に沈殿させる候補が同定された。特に、ベッツ(Betz)ポリマー624は、水性環境における溶液にTFPIを残す一方、実質的な量の細菌汚染物を沈殿させた。
ポリエチレングリコール(PEG)、ポリリン酸塩、尿素系での水性二相抽出を使用すると、TFPI精製の処理に有利である。典型的な水性二相抽出系は、二つのポリマー系(例えば、PEGとデキストラン)または一つのポリマーと塩(例えば、PEGと硫酸塩)からなる。本明細書に記載されているシステムは、分離に対してポリリン酸塩鎖の長さを最適化できること、安価であること、そして問題となっている汚染物を再生およびクロマトグラフィに干渉することが知られているTFPIの折りたたみ体から除くことに特異的であるという点で優れている(天然のリン酸塩および関連二価金属類)。
荷電ポリマーは大腸菌封入体から得られたリコンビナント組織プラスミノーゲン活性化因子の再生を促進した。
荷電ポリマーは大腸菌封入体から得られたウシソマトトロピンの再生を促進した。
Claims (70)
- TFPIの濃度が1 mg/mlより大きい、TFPIおよび荷電されたポリマーからなる水性組成物。
- TFPIの濃度が5 mg/mlより大きい請求項1の水性組成物。
- TFPIの濃度が10 mg/mlより大きい請求項1の水性組成物。
- TFPIの濃度が20 mg/mlより大きい請求項1の水性組成物。
- 薬学的に許容される請求項1の水性組成物。
- 荷電されたポリマーが硫酸化ポリサッカライドである請求項1の水性組成物。
- 荷電されたポリマーがヘパリンである請求項1の水性組成物。
- 荷電されたポリマーが硫酸デキストランである請求項1の水性組成物。
- 荷電されたポリマーがポリリン酸塩である請求項1の水性組成物。
- 実効正電荷をもつ第一ドメインおよび実効負電荷をもつ第二ドメインを有するタンパク質の溶解性を改変する方法であって、以下の:
前記タンパク質に荷電されたポリマーの溶液を加えて正および負に荷電されたドメイン間の分子間または分子内相互作用を減少させる工程
を含む方法。 - 第一ドメインが一連の連続する10個のアミノ酸中少なくとも5個のカチオン性アミノ酸の電荷濃度をもつ請求項10の方法。
- 第一ドメインが5個の連続するカチオン性アミノ酸からなる請求項10の方法。
- 第二ドメインが5個の連続するアニオン性アミノ酸からなる請求項10の方法。
- 第二ドメインが一連の連続する10個のアミノ酸中5個のアニオン性アミノ酸からなる請求項10の方法。
- タンパク質がTFPIである請求項10の方法。
- タンパク質がTFPI ムテイン(mutein)である請求項10の方法。
- タンパク質がTFPI-2である請求項10の方法。
- タンパク質が添加前は不溶性の型である請求項10の方法。
- カオトロピック物質もまたタンパク質に添加される請求項10の方法。
- タンパク質の特異的活性が添加工程によって上昇する請求項10の方法。
- 荷電されたポリマーが固体支持体に固定化される請求項10の方法。
- 荷電されたポリマーを添加する前にタンパク質を固体支持体に適用することをさらに含む請求項10の方法。
- 荷電されたポリマーを添加した後にタンパク質を固体支持体に適用することをさらに含む請求項10の方法。
- 固体支持体がイオン交換樹脂である請求項22の方法。
- 固体支持体がイオン交換樹脂である請求項23の方法。
- タンパク質がTFPIである請求項20の方法。
- 樹脂およびポリマーが反対の実効電荷をもっている請求項24の方法。
- 樹脂およびポリマーが反対の実効電荷をもっている請求項25の方法。
- 樹脂およびポリマーが同じ実効電荷をもっている請求項24の方法。
- 樹脂およびポリマーが同じ実効電荷をもっている請求項25の方法。
- 固体支持体から選択的溶出をおこなうため荷電されたポリマーが濃度勾配で添加される請求項24の方法。
- タンパク質を折りたたむ前に、荷電されたポリマーを前記タンパク質を含む溶液に添加する工程からなる、不正確に折りたたまれた、または変性されたタンパク質を再生する方法。
- ポリマーが硫酸化ポリサッカライドである請求項32の方法。
- 硫酸化ポリサッカライドが硫酸デキストランである請求項33の方法。
- 硫酸化ポリサッカライドがヘパリンである請求項33の方法。
- タンパク質を折りたたむ前に、荷電されたポリマーを不正確に折りたたまれた、または変性されたタンパク質を含む溶液に添加する工程からなる、
タンパク質を再生する方法。 - ポリマーが硫酸デキストランである請求項36の方法。
- ポリマーがヘパリンである請求項36の方法。
- ヘパリンが溶液中に添加される請求項38の方法。
- 溶液をインキュベーションして該TFPIを折りたたませ、塩を加えてポリマーをTFPIから分離し、前記溶液をHICカラムに通し、そしてTFPIを回収する工程をさらに含む請求項36の方法。
- 硫酸化ポリサッカライドのポリマーをカラムに固定化し、変性されたTFPIの溶液を前記カラムに通し、再生されたTFPIを、再生が起こったあとに溶出する工程からなるTFPIを再生する方法。
- 硫酸化ポリサッカライドが硫酸デキストランである請求項41の方法。
- 硫酸化ポリサッカライドがヘパリンである請求項41の方法。
- 0.2 mg/mLより多いTFPIおよび溶解剤からなる薬学的に受容される組成物であって、該溶解剤が(a)酢酸イオン、(b)塩化ナトリウム、(c)クエン酸イオン、(d)イソクエン酸イオン、(e)グリシン、(f)グルタミン酸塩、(g)コハク酸イオン、(h)ヒスチジン、(i)イミダゾールおよび(j)SDSからなる群より選択される組成物。
- TFPIが少なくとも1 mg/mLの濃度で存在する請求項44の組成物。
- TFPIが少なくとも10 mg/mLの濃度で存在する請求項44の組成物。
- 第二溶解剤をさらに含む請求項44の組成物であって、該第二溶解剤が(a)ポリエチレングリコール、(b)ショ糖、(c)マンニトールおよび(d)ソルビトールからなる群より選択される請求項44の組成物。
- 20 mM より大きい濃度でリン酸ナトリウムをさらに含む請求項44の組成物。
- 組成物が高張性である請求項44の組成物。
- 高張組成物が0.5 M NaClを含む請求項49の組成物。
- 高張組成物が0.5 M NaPO4を含む請求項49の組成物。
- 高張組成物が0.5 M クエン酸ナトリウムを含む請求項49の組成物。
- 高張組成物が0.5 Mイソクエン酸ナトリウムを含む請求項49の組成物。
- 組成物が等張性である請求項44の組成物。
- 組成物のpHがpH 7.0より低く溶解剤がグリシンではない請求項44の組成物。
- 組成物のpHがpH 4.5またはそれ以下である請求項55の組成物。
- 溶解剤が酢酸イオンであり、該酢酸イオンが酢酸ナトリウムまたは酢酸カリウムとして5 mMから20 mMの濃度で組成物中に存在する請求項44の組成物。
- 溶解剤が塩化ナトリウムであり、該塩化ナトリウムが少なくとも0.5 mMの濃度で組成物中に存在する請求項44の組成物。
- 溶解剤がクエン酸イオンであり、該クエン酸イオンがクエン酸ナトリウムまたはクエン酸カリウムとして100 mMから500 mMの濃度で組成物中に存在する請求項44の組成物。
- 溶解剤がイソクエン酸イオンであり、該イソクエン酸イオンがイソクエン酸ナトリウムまたはイソクエン酸カリウムとして100 mMから500 mMの濃度で組成物中に存在する請求項44の組成物。
- 溶解剤がグリシンであり、該グリシンが5 mMから20 mMの濃度で組成物中に存在する請求項44の組成物。
- 溶解剤がグルタミン酸塩であり、該グルタミン酸塩が5 mMから20 mMの濃度で組成物中に存在する請求項44の組成物。
- 溶解剤がコハク酸イオンであり、該コハク酸イオンがコハク酸ナトリウムとして5 mMから20 mMの濃度で組成物中に存在する請求項44の組成物。
- 溶解剤がヒスチジンであり、該ヒスチジンが5 mMから20 mMの濃度で組成物中に存在する請求項44の組成物。
- 溶解剤がイミダゾールであり、該イミダゾールが5 mMから20 mMの濃度で組成物中に存在する請求項44の組成物。
- 溶解剤がドデシル硫酸ナトリウムであり、該ドデシル硫酸ナトリウムが0.001%から0.1%(w/v)の濃度で組成物中に存在する請求項44の組成物。
- 第二溶解剤がポリエチレングリコールであり、該ポリエチレングリコールが0.2%から10%(w/v)の濃度で組成物中に存在する請求項47の組成物。
- 第二溶解剤がショ糖であり、該ショ糖が0.2%から10%(w/v)の濃度で組成物中に存在する請求項47の組成物。
- 第二溶解剤がマンニトールであり、該マンニトールが1.0%から5.0%(w/v)の濃度で組成物中に存在する請求項47の組成物。
- 第二溶解剤がソルビトールであり、該ソルビトールが0.2%から10%(w/v)の濃度で組成物中に存在する請求項47の組成物。
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