JP5816550B2 - 蛋白質の修飾剤 - Google Patents
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Description
すなわち、本発明は以下の通りである。
(2)前記システインが前記ポリアルギニンのカルボキシル基末端にペプチド結合していることを特徴とする(1)に記載の修飾剤;
(3)前記ポリアルギニンが、6〜12個のアルギニンで構成されていることを特徴とする(1)又は(2)に記載の修飾剤;
(4)前記ポリアルギニンが8個のアルギニンで構成されることを特徴とする(1)〜(3)のいずれか一つに記載の修飾剤;
(5)前記ポリペプチドが、カルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする(1)〜(4)のいずれか一つに記載の修飾剤;
(6)前記ポリペプチドがオクタアルギニンのカルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする(1)〜(5)のいずれか一つに記載の修飾剤;
(7)前記修飾剤が蛋白質の可溶性を向上させることを特徴とする(1)〜(6)のいずれか一つに記載の修飾剤;
(8)前記修飾剤の細胞内導入効率を向上させることを特徴とする(1)〜(7)のいずれか一つに記載の修飾剤;
(9)前記蛋白質がシステイン残基を2つ以上有していることを特徴とする、(1)〜(8)のいずれか一つに記載の修飾剤。
(11)前記システインが前記ポリアルギニンのカルボキシル基末端にペプチド結合していることを特徴とする(10)に記載の蛋白質の可溶化方法;
(12)前記ポリアルギニンが、6〜12個のアルギニンで構成されていることを特徴とする(10)又は(11)に記載の蛋白質の可溶化方法;
(13)前記ポリアルギニンが、8個のアルギニンで構成されていることを特徴とする(10)〜(12)のいずれか一つに記載の可溶化方法;
(14)前記ポリペプチドが、カルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする(10)〜(13)のいずれか一つに記載の蛋白質の可溶化方法;
(15)前記ポリペプチドがオクタアルギニンのカルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする(10)〜(14)のいずれか一つに記載の蛋白質の可溶化方法;
(16)前記蛋白質が、天然由来の蛋白質、遺伝子組換え技術によって作製される蛋白質、又は化学合成した蛋白質であることを特徴とする(10)〜(15)のいずれか一つに記載の蛋白質の可溶化方法;
(17)前記変性剤が、尿素及び/又はグアニジン塩酸であることを特徴とする(10)〜(16)のいずれか一つに記載の蛋白質の可溶化方法;
(18)前記蛋白質と変性剤を同一の溶液中で混合する工程において、さらに還元剤を添加することを特徴とする(10)〜(17)のいずれか一つに記載の蛋白質の可溶化方法;
(19)前記還元剤が、ジチオスレイトール又は2−メルカプトエタノールであることを特徴とする(10)〜(18)のいずれか一つに記載の蛋白質の可溶化方法;
(20)前記蛋白質がシステイン残基を2つ以上有していることを特徴とする、(10)〜(19)のいずれか一つに記載の蛋白質の可溶化方法;
(21)前記ポリペプチドの使用量が前記不溶性タンパク質に含まれるシステイン残基に対して、1モル倍以上であることを特徴とする(20)に記載の蛋白質の可溶化方法。
(23)前記システインが前記ポリアルギニンのカルボキシル基末端にペプチド結合していることを特徴とする(22)に記載の蛋白質の細胞内への導入方法;
(24)前記ポリアルギニンが、6〜12個のアルギニンで構成されていることを特徴とする(22)又は(23)に記載の蛋白質の細胞内への導入方法;
(25)前記ポリアルギニンが8個のアルギニンで構成されていることを特徴とする(22)〜(24)のいずれか一つに記載の蛋白質の細胞内への導入方法;
(26)前記ポリペプチドが、カルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする(22)〜(25)のいずれか一つに記載の蛋白質の細胞内への導入方法;
(27)前記ポリペプチドがオクタアルギニンのカルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする(22)〜(26)のいずれか一つに記載の蛋白質の細胞内への導入方法;
(28)前記蛋白質が、天然由来蛋白質、遺伝子組換え技術によって作製される蛋白質、又は化学合成した蛋白質であることを特徴とする(22)〜(27)のいずれか一つに記載の蛋白質の細胞内への導入方法;
(29)前記蛋白質がシステイン残基を2つ以上有していることを特徴とする(22)〜(28)のいずれか一つに記載の蛋白質の細胞内への導入方法。
(30)細胞への導入を25℃〜4℃の温度範囲で実施する(22)〜(29)の一つに記載の蛋白質の細胞内への導入方法;
(31)前記細胞が生体由来動物細胞又は培養細胞由来動物細胞である(22)〜(30)の一つに記載の蛋白質の細胞内への導入方法。
(33)前記システインが前記ポリアルギニンのカルボキシル基末端にペプチド結合していることを特徴とする(32)に記載のポリペプチド;
(34)前記ポリアルギニンが6〜12個のアルギニンから構成されることを特徴とする(32)又は(33)に記載のポリペプチド;
(35)前記ポリアルギニンが8個のアルギニンから構成されることを特徴とする(32)〜(34)のいずれか一つに記載のポリペプチド;
(36)前記ポリペプチドがカルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする(32)〜(35)のいずれか一つに記載のポリペプチド;
(37)前記ポリペプチドがオクタアルギニンのカルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする(32)〜(36)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(39)前記細胞が樹状細胞であり、治療もしくは予防対象ががん及び/又は感染症である、(38)に記載の治療もしくは予防方法;
(40)前記樹状細胞が単球由来である、(39)に記載の治療もしくは予防方法。
(42)前記細胞が樹状細胞であり、治療もしくは予防対象ががん及び/又は感染症である、(41)に記載の医薬組成物;
(43)前記樹状細胞が単球由来である、(42)に記載の医薬組成物。
反応後に残存している可能性のある単量体と酸化剤を除去する為には、一般的なゲル濾過や透析を行うことで可能である。
本発明の可溶化方法は、不溶性蛋白質と変性剤とを同一の溶液内で混合して蛋白質の溶液を作製する工程と、該溶液にポリアルギニンとシステインで構成されるポリペプチドを含む蛋白質の修飾剤を添加する工程と、該溶液から変性剤を除去する工程と、からなる。
また、本発明の可溶化方法においては、ポリアルギニンとシステインで構成されるポリペプチドの使用量はポリアルギニンを不溶性タンパク質に多く結合させるために、不溶性タンパク質よりも多いことが好ましく、具体的には該ポリペプチドを、可溶化するタンパク質に含まれるシステイン残基数に対して、1モル倍比以上、より好ましくは2モル倍比以上である。
本発明の導入方法は、蛋白質とポリアルギニンとシステインで構成されるポリペプチドを含む蛋白質の修飾剤とを混合する工程と、得られた蛋白質溶液を、蛋白質を導入したい細胞と接触させる工程と、からなる。この混合する工程により、不溶性タンパク質はポリアルギニン化されて可溶化する。接触させる工程は通常in vitroで行われる。ここでいう「細胞」とは動物細胞を指し、生体由来動物細胞又は培養細胞株由来動物細胞のいずれであってもよい。
また、細胞に導入する際には、37℃−4℃の範囲で実施するのが好ましく、特に25℃−4℃の範囲が好ましい。
さらに細胞として、リンパ球や樹状細胞等の抗原提示細胞、より好ましくは単球由来の樹状細胞を用い、導入するタンパク質として抗原蛋白質を用いた場合は、このようにして作製された抗原提示細胞は、導入された抗原を細胞内で分解し、MHCクラスIに提示するため、その抗原に対する特異的なCTLを誘導することができる。特に蛋白質を導入した場合には配列中に含まれる複数のエピトープが提示されるため、その抗原に対する複数のタイプのCTLを活性化することができる。また、MHCクラスIIのエピトープも提示されるため、Th1細胞が活性化され、さらにCTLの活性化を促進することができる。
従って、このように作製された抗原提示細胞は、細胞傷害性T細胞誘導方法、細胞傷害性T細胞誘導剤、がん及び/又は感染症予防もしくは治療方法、がん及び/又は感染症予防もしくは治療剤に用いることができる。より具体的には、例えば、がん患者から採取した腫瘍組織または腫瘍細胞の破砕物から不溶性画分を取得し、あるいは、ウイルス感染症患者と同じウイルスの破砕物から不溶性画分を取得し、または病原性細菌感染症患者と同じ病原性細菌の破砕物から不溶性画分を取得し、それらの不溶性画分を、本発明の可溶化方法に付して、可溶化させ、可溶化させたものを、同じ患者から採取したリンパ球や樹状細胞などの抗原提示細胞に添加して培養して抗原提示細胞を誘導し、誘導した抗原提示細胞を同じ患者に投与することによって、腫瘍細胞、ウイルスまたは病原性細菌に特異的な細胞傷害性T細胞を誘導するこができ、それによって、がんやウイルス感染症などの疾患の予防もしくは治療を行うことができる。また、組換え蛋白質や合成蛋白質などを、本発明の可溶化方法に付して、可溶化させ、可溶化させたものを、患者から採取したリンパ球や樹状細胞などの抗原提示細胞に添加して培養して抗原提示細胞を誘導し、誘導した抗原提示細胞を、同じ患者に投与することもできる。誘導された抗原提示細胞は、通常の方法によって患者に投与すればよく、例えば、そのまま患者に投与してもよく、通常の注射剤などの製剤の形態にして投与してもよく、また、通常のワクチン製剤として投与してもよい。また、抗原提示細胞の投与量は、患者の症状や疾患の種類などにより、予防のためには、予防しようとする疾患、対象者などに応じて任意に決めることができる。また、作製した抗原提示細胞を利用して、患者から採取したリンパ球と抗原提示細胞を培養し、体外でCTLを誘導することもできる。
<オクタアルギニン(R8)融合蛋白質の溶解度>
C末端にR8が融合した緑色蛍光蛋白質(Green Fluorescent Protein;GFP)(図1下、GFP−R8と記す;配列番号2)と、R8をもたないGFP(図1上;配列番号1)を組換え蛋白質として大腸菌(Rosetta−gami2(DE3)pLysS:Novagen社製、#71352−3)で発現させた。
大腸菌で発現させたGFP及びGFP−R8の可溶性画分から、AKTA explorer液体クロマトグラフィーシステム(Amersham Pharmasia Biotech社)を用いて、ニッケルアフィニティ(His Trap HPカラム、Amersham Pharmasia Biotech、#17−5247−01)とゲルろ過クロマトマトグラフィー(Superose12 HRカラム、Aamersham Pharmasia Biotech、#17−0538−01)を利用し、夫々の精製を行った。
〔1〕Cos−7細胞
10%牛胎児血清(FBS)を含むDulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM、Invitrogen社、#11885−084)で継代培養をしておいたCos7を1×105Cells/mL/wellで24穴プレート(SUMILON社、#MS−08240)に播種した。
健常人ボランティアから末梢血を採取し、比重遠心法にて末梢血単核球(PBMC)を得た。このPBMCから、MACS及びCD14マイクロビーズ(Milteny BIOTECH社、130−050−2)を利用して、CD14陽性(CD14+)画分を分取した。CD14+細胞をGM−CSF(500 IU/mL、BERLEX社、87−895)とIL−4(500 IU/mL、Osteogenetics GmbH社)を含むCellGro DC Medium(CellGenix社製、2001)で5日間培養し、5日目にGM−CSF、IL−4、TNF−α(10ng/mL、CellGenix社、1006)及びプロスタグランジンE2(1μg/mL、Sigma社、P6532)を含むCellGro DC Mediumへ交換し、培養を継続して成熟樹状細胞(mature Dendritic Cell:mDC)に分化誘導した。
参考例1の細胞内導入〔2〕DCの場合には、GFPの細胞内導入量の増加が観察されなかった。蛋白質1分子あたりR8ペプチドが1分子付加されただけでは、細胞内の取り込みに影響しないのではないかと考え、複数のR8分子を1分子の蛋白質に付加させる技術を確立することとした。
乾燥BSA(Roche社、#10 735 086 001)を秤量し、5mg/mLの濃度で6M Urea−PBSに溶解させ、Dithiothreitol(DTT、Sigma社、#D−9779)を5mMになるように加えて穏やかに攪拌した後、1時間静置することで還元を行った。この反応液を6M Urea−PBSで透析して、余分なDTTを除いて還元型変性BSAとした。BSAのアミノ酸配列中には35個のシステインが含まれている。
乾燥OVA(ImmunoO、MP Biomedicals社、#95051)を秤量し、2.5mgを8M Urea−PBSに溶解させ、OVA溶液を500μL作製した(5mg/mL)。そこに終濃度10mMでDTTを加え混和し、室温で1時間還元を行った。その後6M Urea−PBSで透析を行い、余分なDTTを除いて変性OVAとした。OVAのアミノ酸配列中には6残基のシステインが含まれている。
〔1〕付着性の細胞
10%FBSを含んだDMEM(10%FBS−DMEM)で継代培養していたHeLa細胞を7×104cells/mL/dishで35mm培養用シャーレ(SUMILON、#10350)に播種し、37℃、5%CO2存在下で一晩培養して付着させた。
10%FBS−RPMI1640(Invitrogen社、#11875−093)培地で継代培養していたU937細胞をPBSで3回洗浄し、1×105cells/50μL/wellで24穴プレートに播種した。そこにR8−OVAまたは乾燥OVAをPBSに溶解させたものをBCA法の定量値で6.25μg(50μL)ずつ、2穴ずつに加え、さらにFBSを含んでいないRPMI1640を0.2mLずつ加えて37℃、5%CO2存在下で1時間または2時間静置した。その後10%FBS−RPMI1640を0.5mLずつ加え、37℃、5%CO2存在下で15分間静置した。
R8−OVAが細胞内に導入されるという現象を確実に証明する目的で、さらに実験を追加した。〔1〕の実験と同様に、10%FBS−F12倍地で継代培養しておいたCHO細胞をシャーレ4枚に播種した。すべてのシャーレにつき、細胞が付着した後に培地を除き、PBSで洗浄した。洗浄後、表5のように条件検討を行った。
β−D−ガラクトシダーゼ(Wako、#072−04141、以下βGalとも記す)を用いて、実施例3及び4と同様にR8−βGalを作製した。β−Galのアミノ酸配列中には16残基のシステインが含まれている。
この結果より、変性βGalはR8化することにより細胞内に導入可能で、かつ細胞内でリフォールディングされることが確認された。
1)PAP cDNAのクローニング
LNcap細胞株(ヒト前立腺がん)からtotal RNAを調製し、oligo dTプライマーを用いてcDNAの鋳型を調製した。このcDNAと配列番号3および4に記載の合成DNAオリゴマーを用いてPCR反応を行い、1.2kbpのDNA断片を得た。このDNA断片をBamHIとSphIで消化し、pQE32ベクターのBamHIとSphIサイトに挿入し、大腸菌JM109に導入した。コロニーPCRにより1.2kbpのDNA断片が挿入されているクローンを選択した後、シークエンスを確認し、全長PAP cDNA(配列番号5)が挿入されているクローンをpQE/PAPとした。
5’−TAAGCATGCACACTAATCTGTACTGTCC−3’(hPAP/R;配列番号4)
pQE32/PAPを鋳型にPCRを行い、再びPAP cDNAの断片を得た。また、それとは別にユビキチン(以下、Ubとも記す)cDNA断片として配列番号6のアミノ酸配列をコードするcDNAを単離した。これらのcDNA断片をpET19bベクター(Novagen社)に挿入し、His tag−Ub−PAPというユビキチン融合型組換え蛋白質(rUb−PAP;配列番号7)を発現するプラスミドDNA(pET19b/Ub−PAP)を構築した。また同様にユビキチン断片が融合していないHis tag−PAPという組換え蛋白質(rPAP;配列番号8)を発現するプラスミドDNA(pET19b/PAP)を構築した。rUb−PAPとrPAPのアミノ酸配列中には、夫々6残基のシステインが含まれている。ユビキチン断片のアミノ酸配列中にはシステインは含まれていない。
pET19b/Ub−PAP若しくはpET19b/PAP夫々で大腸菌Rosetta−gami2(DE3)pLysS(Novagen社)を形質転換し、各々の組換え大腸菌を作製した。
各組換え大腸菌を4クローンずつ選択し、小スケールの50μg/mLアンピシリン(Amp)と12.5μg/mLテトラサイクリン(Tet)を含むLB培地で培養し、IPTG添加で組換え蛋白質の誘導を試みた。夫々の組換え大腸菌から最も発現量の多いクローンを選択し、グリセロールストック(マスターストック)を作製した。各々の組換え蛋白質が発現していることは、抗His−tag抗体(CALBIOCHEM社、#OB05)と抗PAP抗体(Sigma社、Clone:PAP−12、#P5687)を用いたウエスタンブロッティングで確認した。
各組換え体マスターストックを50μg/mL Ampと15μg/mL Tetを含むLB培地100mLで培養し、ODが0.1になるように600mLの同培地に植菌した。ODが0.5から0.6の間で終濃度が0.5mMとなるようにIPTGを添加し、3時間の発現誘導を行った。
回収した大腸菌をPBSに懸濁させ、超音波で破砕した後、15,100×g、4℃、1時間の遠心分離(以下、遠心)を行い、上清と沈殿に分画した。両分画をSDS−PAGEで解析したところ、rUb−PAPとrPAPはいずれも沈殿画分に回収されていた。
沈殿は、3M尿素/PBSに溶解し、15,100×g、4℃、1時間の遠心を行い、上清と沈殿に分画した。沈殿を、更に8M尿素/PBSに溶解し、15,100×g、4℃、1時間の遠心を行い、上清と沈殿に分画した。上清は、MILLEX−HV PVDF 0.45μm 33mm(ミリポア社、#SLHV033RS)を通した後、20mMイミダゾール含有8M尿素/PBSから500mMイミダゾール含有8M尿素/PBS濃度勾配を利用したHisTrap HPニッケルカラム(GE Healthcare社、#17−5248−02)を使って分画した。更に、6M尿素/PBSを利用したSuperose 6 10/300 GLゲルろ過カラム(GE Healthcare社、#17−5172−01)を使って分画した。以上の工程により、rUb−PAP蛋白質は2.1gの大腸菌から5220μgを、rPAP蛋白質は3.0gの大腸菌から972μgを、6M尿素/PBSに溶解している精製蛋白質として取得した。
6M尿素/PBSに溶解している精製rUb−PAP蛋白質に、R8C−CR8をR8Cペプチドとしての混合モル比で1:10から1:100となるように加え(以降、混合モル比についてはR8Cペプチドとしての比率で記す)、室温で1時間反応させた後、各反応液の等容積をSDS−PAGEで解析した(図12a)。その結果、還元条件下ではいずれの混合モル比でも同等のrUb−PAPのバンドが検出され、非還元条件下では混合モル比が高いほど高分子側にシフトしたバンドが高濃度で検出された。また、同じサンプルを用いて等電点電気泳動(IEF)で解析を試みたところ、混合モル比が高いほど塩基性側にシフトしたバンドの割合が増加することが確認された(図12b)。以上より、R8化蛋白質を作製する為にはR8C−CR8の混合モル比を高くする方が効率がよいと判断された。
またrPAPについても同様に1:100の混合モル比で作製したところ、遠心後、可溶性画分にほとんど回収された。可溶性画分に回収されたものをR8−Ub−PAP若しくはR8−PAPとして以下の実験を行った。
2×105個のCHO−K1細胞(以下、CHOとも記す)あたり、R8−Ub−PAPをPAPの重量で15μg培養液中に添加し、37℃で2時間静置することで導入を行った。その後PBSで3回洗浄し、セルスクレーパーで細胞を剥がし、PBS懸濁液として回収した。回収した細胞は2xSDSサンプル処理液で溶解させ、SDS−PAGEで蛋白質を分離して、抗PAP抗体(PAP−12、SIGMA、P−5687)によるWestern blottingを行った。その結果、R8−Ub−PAPを加えていない細胞抽出液からはUb−PAPのバンドは検出されず(Sol)、R8−Ub−PAPを加えたそれからはUb−PAPのバンドが検出された(R8−Ub−PAP)(図14)。
rUb−PAPを使用した実験(実施例7)により、R8化蛋白質の作製に適したR8C−CR8との混合モル比が解ったが、それが細胞導入への効率に影響するかを確認することとした。この検討には、実験系を確立しておいたOVAを利用した。
このように可溶性で回収された複合体をR8−OVAとして以下の実験で使用した。
実施例8と同様に37℃(CO2インキュベータ内)と4℃(冷蔵庫内)の条件で、培養CHO細胞にNative OVAまたはR8−OVA(混合モル比1:100)の導入を行った。導入した後、洗浄操作を行い、その後、細胞を10%パラホルムアルデヒド、0.01%グルタルアルデヒドPBS溶液で固定した。その後10mMグリシンを含むPBS(PBS−G)で2回洗浄し、0.1%Triton X−100を含むPBSの処理を室温で5分間行った。その後PBS−Gで3回洗浄し、SuperBlock Blocking Buffer(37535 Thermo SCIENTIFIC)を加えて30分間静置することで、抗体反応の為のブロッキングを行った。ブロッキング後、1%BSA−PBSで一回洗浄し、抗OVA抗体(6C8、abcam、#ab17293)を加えて室温で60分間静置した。洗浄後、Alexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgG抗体(Invitrogen社、#A11001)を加えて室温で60分間静置した。洗浄後、スライドガラス上にカバーガラスを使用し細胞を封入してプレパラートを作製した。
また、導入した蛋白質が細胞内で機能することを目的とした場合でも、導入した蛋白質が細胞質内へ移行することが重要である。
従って、蛋白質を導入する場合には37℃よりも低い温度、好ましくは室温(25度)以下、より好ましくは4℃で導入することが望ましい。細胞質への移行と温度の関係については、先行技術文献(J Biol Chem.276,5836−5840,2001、及びBiochem. J. 403, 335−342, 2007)の報告と同様であり、本技術についても4℃だけでなく室温においても反応を行うことができることが推察される。
不溶性蛋白質として組換え型マウスTyrosinase−Related Protein−2(以下、TRP−2とも記す)を用いて、R8化による可溶化方法の検討を行った。
先ず、組換え型マウスTRP−2(rTRP−2;配列番号9)を作製した。rTRP−2はSWISS−PROTデータベースのAC No.P29812に記載のアミノ酸配列に基づき、N末端から56残基目のグルタミン酸(E)から472残基目のセリン(S)までをコードするcDNAを単離し、pET19bベクター(Novagen社)に挿入し発現プラスミドとした(pET19b/mdT)。このrTRP−2のアミノ酸配列中には12個のシステインが含まれている。pET19b/mdTで大腸菌(Rosetta−gami2(DE3)pLysS:Novagen社、#71352−3)を形質転換し、発現させるとN末端にヒスチジンタグ(His−tag)を有する組換え蛋白質が得られる。この組換え蛋白質は大腸菌内でインクルージョンボディ(封入体)を形成し、不溶性であった。
この遠心分離後の不溶性画分(沈殿)を
1)8M尿素/150mM NaCl/5mM DTT/20mMリン酸ナトリウム(pH8.5)に溶解し、
2)AKTA explorer 液体クロマトグラフィーシステム(amersham pharmasia biotech社)を用いて、ニッケルアフィニィティー(His Trap HPカラム、amersham pharmasia biotech、#17−5247−01)と、
3)6M尿素/150mM NaCl/5mM DTT/20mMリン酸ナトリウム(pH8.5)を使用して、ゲルろ過クロマトマトグラフィー(Superose12 HRカラム、amersham pharmasia biotech、#17−0538−01)で組換え蛋白質の部分精製を行った。精製したサンプルの溶媒を生理的な緩衝液に置換する為PBSで透析したが、遠心後、ほぼ全量が沈殿した。
rTRP−2とrUb−TRP−2のアミノ酸配列中には、夫々12残基のシステインが含まれている。
ゲルろ過精製後の6M尿素に溶解しているサンプルの蛋白濃度をブラッドフォード法で定量したところ、rTRP−2は452μg/mLでrUb−TRP−2は217μg/mLであった。これらのA280nmを測定した後、5mMになるようにDTTを添加して1時間反応後、6M尿素/PBSで透析を行い、未反応のDTTを除いた。そこにR8C−CR8を蛋白質:R8C=1:50のモル比となるように加え、一時間反応させたのち、実施例7と同様に透析、遠心を行った。上清(可溶性画分:S)と沈殿(不溶性画分:P)を分画し、上清のA280nmから蛋白濃度を見積もったところ、R8−TRP−2は200μg/mLで、R8−Ub−TRP−2は172μg/mLであった。各画分の等容積をSDS−PAGEで解析した結果、いずれの蛋白質においても明らかに可溶性画分に回収される蛋白質の方が多く(図19a)、R8化によって可溶性が付与されたことが確認された。またR8−TRP−2をIEFで解析したところ、塩基性側にシフトしたバンドが確認された(図19b)。
2×105個のCHOあたり、R8−Ub−TRP−2及びR8−TRP−2をTRP−2の重量で10μg、または溶媒のみを等容積で培養液中に添加し4℃で2時間静置することで導入を試みた。その後PBSで3回洗浄し、セルスクレーパーで細胞を剥がし、PBS懸濁液として回収した。この細胞懸濁液を1,000×g、5分間、4℃で遠心し、沈殿として回収した。回収した細胞は2xSDSサンプル処理液で溶解させ、SDS−PAGEで蛋白質を分離して、抗TRP−2抗体(rabbit polyclonal、abcam社、#ab74073)によるWestern blottingを行った。またこの時、抗原の陽性対象として6M尿素/PBSに溶解しているrUb−TRP−2を同時に電気泳動させた。その結果、溶媒のみ(Sol)ではTRP−2由来のバンドは検出されず、陽性対照ではUb−TRP−2のバンドが、R8−Ub−TRP−2を添加した場合にはUb−TRP−2のバンドが、R8−TRP−2を添加した場合にはTRP−2のバンドが検出された(図20)。本実験の結果から、マウスTRP−2でもR8化することによって、効率よく細胞に導入されると考えられた。
R8化蛋白質を細胞内に取り込ませる際に、遊離状態で存在しているR8C−CR8が導入効率に影響を及ぼすか確認する為、R8Cまたは、R8C−CR8と蛋白質を混合させ、細胞導入を試みた。
以上のことから、R8Cペプチドを蛋白質に共有結合させるには蛋白質を還元型に変性させておき、R8C−CR8で反応させてジスルフィド結合を形成させるのが好ましく、また蛋白質とR8Cの間でジスフィド結合(共有結合)を形成させることにより、効率のよい細胞導入が行い得ると考察される。
8週齢で購入したC57BL/6の雄をSPF(Specific Pathogen Free)環境で飼育しておき、9週目以降に骨髄細胞を採取した。採取した骨髄細胞をAIM−V(Invitrogen、087−0112DK)培地で培養用フラスコに播種し、10ng/mLマウスIL−4(Peprotech、#214−14)と20ng/mLマウスGM−CSF(Peprotech、#315−03)を添加し、37℃、5%CO2下で培養した。培養開始から3日後、新鮮な同培地を等容積加えた。その後一日おきに半量の培地交換を行った。培養を開始してから9日目に0.2%正常C57BL/6血清を含んだ培地に交換し、LPSを1.0μg/mLになるよう加えた。さらに一日培養し、浮遊した細胞を成熟DCとして使用した。回収したDCは毎回CD11b、CD11c、CD80及びCD86の発現量を確認した。
Claims (25)
- ポリアルギニンとシステインとで構成されるポリペプチドを含む、蛋白質の修飾剤で、前記システインが前記ポリアルギニンのカルボキシル基末端にペプチド結合しており、前記ポリペプチドがポリアルギニンのカルボキシル基末端に有するシステイン同士でジスルフィド結合して二量体を形成していることを特徴とする蛋白質の修飾剤。
- 前記ポリアルギニンが、6乃至12個のアルギニンで構成されていることを特徴とする請求項1に記載の修飾剤。
- 前記ポリアルギニンが8個のアルギニンで構成されることを特徴とする請求項1又は2に記載の修飾剤。
- 前記修飾剤が蛋白質の可溶性を向上させることを特徴とする請求項1乃至3のいずれか一項に記載の修飾剤。
- 前記修飾剤の細胞内導入効率を向上させることを特徴とする請求項1乃至4のいずれか一項に記載の修飾剤。
- 前記蛋白質がシステイン残基を2つ以上有していることを特徴とする、請求項1乃至5のいずれか一つに記載の修飾剤。
- 不溶性蛋白質の可溶化方法であって、
不溶性蛋白質と変性剤とを同一の溶液内で混合して蛋白質の溶液を作製する工程と、
該溶液にポリアルギニンとシステインとで構成され、前記システインが前記ポリアルギニンのカルボキシル基末端にペプチド結合しており、ポリアルギニンのカルボキシル基末端に有するシステイン同士でジスルフィド結合して二量体を形成していることを特徴とするポリペプチドを含む蛋白質の修飾剤を添加する工程と、
該溶液から変性剤を除去する工程と、
を含む蛋白質の可溶化方法。 - 前記ポリアルギニンが、6乃至12個のアルギニンで構成されていることを特徴とする請求項7に記載の蛋白質の可溶化方法。
- 前記ポリアルギニンが、8個のアルギニンで構成されていることを特徴とする請求項7又は8に記載の可溶化方法。
- 前記蛋白質が、天然由来の蛋白質、遺伝子組換え技術によって作製される蛋白質、又は化学合成した蛋白質であることを特徴とする請求項7乃至9のいずれか一項に記載の蛋白質の可溶化方法。
- 前記変性剤が、尿素及び/又はグアニジン塩酸であることを特徴とする請求項7乃至10のいずれか一項に記載の蛋白質の可溶化方法。
- 前記蛋白質と変性剤を同一の溶液中で混合する工程が、さらに還元剤で蛋白質を還元する工程を含むことを特徴とする請求項7乃至11のいずれか一項に記載の蛋白質の可溶化方法。
- 前記還元剤が、ジチオスレイトール又は2−メルカプトエタノールであることを特徴とする請求項12に記載の蛋白質の可溶化方法。
- 前記蛋白質がシステイン残基を2つ以上有していることを特徴とする、請求項7乃至13のいずれか一つに記載の蛋白質の可溶化方法。
- 前記ポリペプチドの使用量が前記不溶性タンパク質に含まれるシステイン残基に対して、1モル倍以上であることを特徴とする請求項14に記載の蛋白質の可溶化方法。
- 蛋白質の細胞内への導入方法であって、
蛋白質と、ポリアルギニンとシステインとで構成され、前記システインが前記ポリアルギニンのカルボキシル基末端にペプチド結合しており、ポリアルギニンのカルボキシル基末端に有するシステイン同士でジスルフィド結合して二量体を形成していることを特徴とするポリペプチドを含む蛋白質の修飾剤とを混合する工程と、
得られた蛋白質溶液を、蛋白質を導入したい細胞と接触させる工程と、
を含む蛋白質の細胞内への導入方法。 - 前記ポリアルギニンが、6乃至12個のアルギニンで構成されていることを特徴とする請求項16に記載の蛋白質の細胞内への導入方法。
- 前記ポリアルギニンが8個のアルギニンで構成されていることを特徴とする請求項16又は17に記載の蛋白質の細胞内への導入方法。
- 前記蛋白質が、天然由来蛋白質、遺伝子組換え技術によって作製される蛋白質、又は化学合成した蛋白質であることを特徴とする請求項16乃至18のいずれか一項に記載の蛋白質の細胞内への導入方法。
- 前記蛋白質がシステイン残基を2つ以上有していることを特徴とする請求項16乃至19のいずれか一項に記載の蛋白質の細胞内への導入方法。
- 細胞への導入を25℃〜4℃の温度範囲で実施する請求項16乃至20の一項に記載の蛋白質の細胞内への導入方法。
- 前記細胞が生体由来動物細胞又は培養細胞由来動物細胞である請求項16乃至21の一項に記載の蛋白質の細胞内への導入方法。
- ポリアルギニンとシステインとで構成され、前記システインが前記ポリアルギニンのカルボキシル基末端にペプチド結合しており、ポリアルギニンのカルボキシル基末端に有するシステイン同士でジスルフィド結合して二量体を形成していることを特徴とするポリペプチド。
- 前記ポリアルギニンが6乃至12個のアルギニンから構成されることを特徴とする請求項23に記載のポリペプチド。
- 前記ポリアルギニンが8個のアルギニンから構成されることを特徴とする請求項23又は24に記載のポリペプチド。
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