KR20230059777A - 요산산화효소-알부민 접합체, 그 제조방법 및 용도 - Google Patents

요산산화효소-알부민 접합체, 그 제조방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 명세서는 요산산화효소-알부민 접합체 및 그 제조방법, 및 상기 요산산화효소-알부민 접합체에 포함된 요산산화효소 변이체 및 그 제조방법을 개시한다. 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체에 3개 이상의 알부민이 링커를 통해 접합된 것을 특징으로 하며, 이에 따라 반감기의 향상, 면역원성의 감소 효과가 나타난다. 또한 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산이 원인이 되는 다양한 질병, 질환 및/또는 적응증의 예방 또는 치료 용도로 사용할 수 있다.

Description

요산산화효소-알부민 접합체, 그 제조방법 및 용도{URATE OXIDASE-ALBUMIN CONJUGATE, PREPARATION METHOD THEREOF, AND USE THEREOF}
본 명세서에서는 위치 특이적으로 비천연 아미노산이 도입된 요산산화효소 변이체 및 그 제조방법, 및 상기 요산산화효소 변이체 및 알부민을 링커로 접합시킨 접합체 및 그 제조방법에 대해 개시한다. 또한, 본 명세서에서는 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 용도를 개시한다.
요산산화효소(Urate oxidase; Uricase)는 인간을 비롯한 영장류는 자체 합성이 불가능한 효소의 일종으로, 요산을 알란토인(Allantoin)으로 분해하는 기능을 한다. 상기 요산산화효소는 통풍 발생의 주 원인인 요산을 배설가능한 형태로 분해하는 직접적인 치료기전을 가지며, 따라서 강력한 요산 강하 효과가 있다는 장점이 있으나, 1) 체내 반감기가 짧아 주사제로만 사용이 가능하고, 2) 외부 유래 단백질이기 때문에 체내에 투여되는 경우 면역반응이 발생하고, 이로 인한 부작용이 발생한다는 단점이 있어 통풍 치료제로 사용되는 데 제한이 있다.
한편, 치료용 단백질(therapeutic protein)은 다양한 질병의 치료에 효과가 있음이 보고되어 왔으며, 제약분야의 중요한 성장 동기 중 하나이다. 하지만, 치료용 단백질은 환자 체내에서 사구체의 여과(glomerular filtration), 세포흡수작용(pinocytosis), 및 면역반응에 의해 지속적으로 제거된다는 문제점이 있다. 따라서, 치료용 단백질의 개발 시 상기 현상으로 인해 환자 체내에서 제거되는 속도를 완화시켜 약효의 지속시간을 연장시키는 것이 매우 중요하다. 이러한 문제점을 개선하기 위해, 상기 치료용 단백질에 알부민을 물리적으로, 또는 화학적으로 결합시켜 반감기의 개선을 꾀하는 기술을 알부미네이션(albumination)이라 한다.
본 명세서에서는 상기한 요산산화효소의 치료제로서의 문제점을 해결하기 위해, 요산산화효소를 알부미네이션시킨 요산산화효소-알부민 접합체를 개시한다.
본 명세서에서는 요산산화효소-알부민 접합체를 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 상기 요산산화효소-알부민 접합체에 포함된 요산산화효소 변이체를 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 상기 요산산화효소 변이체의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 상기 요산산화효소-알부민 접합체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 용도를 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 다음 [화학식 1]로 표현되는, 요산산화효소-알부민 접합체를 제공한다: [화학식 1] Uox-[J1-A-J2-HSA]n 여기서, 상기 Uox는 요산산화효소 변이체, 상기 J1은 요산산화효소-링커 접합부, 상기 A는 앵커, 상기 J2는 알부민-링커 접합부, 및, 상기 HSA는 인간 혈청 알부민 (Human Serum Albumin)을 의미하며, 상기 요산산화효소 변이체는 디엔 작용기(dien functional group)를 가지는 비천연 아미노산을 3개 이상 포함하고, 상기 요산산화효소-링커 접합부는 상기 비천연 아미노산의 디엔 작용기 및 상기 앵커에 연결된 디에노필 작용기(dienophile functional group)가 역 전자 요구 디엘스-알더(Inverse Electron Demand Diels-Alder; IEDDA) 반응을 통해 결합된 것이고, 상기 n은 3 또는 4임.
본 명세서에서는 다음을 포함하는 요산산화효소-알부민 접합체를 제공한다: 3개 또는 4개의 알부민-서브유닛 접합체, 이때, 각각의 상기 알부민-서브유닛 접합체는 다음 [화학식 2]로 표현됨: [화학식 2] p'-J1-A-J2-HSA, 여기서, 상기 p'은 요산산화효소 변이체 서브유닛이며, 상기 J1은 요산산화효소-링커 접합부이고, 상기 A는 앵커, 상기 J2는 알부민-링커 접합부, 및 상기 HSA는 인간 혈청 알부민 (Human Serum Albumin)을 의미하고, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 야생형 요산산화효소 서브유닛의 서열 중 하나 이상의 아미노산이 테트라진 작용기(tetrazin functional group) 또는 트리아진 작용기(triazine functional group)를 포함하는 비천연 아미노산으로 치환된 것이며, 상기 요산산화효소-링커 접합부는 상기 비천연 아미노산의 테트라진 작용기 또는 트리아진 작용기, 및 상기 앵커에 연결된 trans-cyclooctene 작용기가 역 전자 요구 디엘스-알더(Inverse Electron Demand Diels-Alder; IEDDA) 반응을 일으켜 형성된 것임; 및 선택적으로, 1개의 요산산화효소 변이체 서브유닛, 여기서, 상기 요산산화효소-알부민 접합체가 알부민-서브유닛 복합체를 3개 포함하는 경우, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체 서브유닛을 1개 포함하고, 각각의 알부민-서브유닛 복합체에 포함된 요산산화효소 변이체 서브유닛 및 1개의 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화하여 사량체를 이루며, 상기 요산산화효소-알부민 접합체가 알부민-서브유닛 복합체를 4개 포함하는 경우, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체 서브유닛을 포함하지 않으며, 각각의 알부민-서브유닛 복합체에 포함된 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화하여 사량체를 이룸.
본 명세서에서는 다음을 포함하는, 요산 관련 질병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다: 치료학적 유효량의, 상기 요산산화효소-알부민 접합체; 및 약학적으로 허용되는 담체.
일 실시예로, 상기 요산 관련 질병은 고요산혈증, 급성 통풍성 관절염, 간헐기 통풍, 만성 결절성 통풍, 만성 신장 질환(Chronic Kidney Disease) 및 종양 용해 증후군(Tumor Lysis Syndrome; TLS)중 어느 하나이다.
일 실시예로, 상기 약학적으로 허용되는 담체는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유; 감미제; 방향제; 시럽제; 지방유와 같은 액체 담체; 멸균된 수용액; 프로필렌글리콜; 폴리에틸렌글리콜; 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르; 현탁제; 유제; 동결 건조 제제; 외용제; 안정제; 완충제; 동물성 유; 식물성 유; 왁스; 파라핀; 전분; 트라칸트; 셀룰로오스 유도체; 폴리에틸렌 글리콜; 실리콘; 벤토나이트; 실리카; 탈크; 산화 아연.
본 명세서에서는 상기 요산산화효소-알부민 접합체를 요산 관련 질병 치료제 제조에 사용하는 용도를 제공한다.
본 명세서에서는 다음을 포함하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법을 제공한다: 알부민 및 링커를 반응시키는 것, 여기서, 상기 링커는 디에노필 작용기(dienophile functional group), 앵커, 및 티올 반응성기(thiol reactive moiety)를 포함하며, 상기 링커의 티올 반응성기 및 상기 알부민의 티올기가 반응을 통해 결합하여 알부민-링커 접합체가 생성됨; 및 상기 알부민-링커 접합체 및 요산산화효소 변이체를 반응시키는 것, 여기서, 상기 요산산화효소 변이체는 야생형 요산산화효소의 서열에서 3개 이상의 아미노산이 디엔 작용기(dien functional group)를 포함하는 비천연 아미노산으로 치환된 것이며, 상기 요산산화효소 변이체의 상기 디엔 작용기 및 상기 알부민-링커 접합체의 링커에 포함된 상기 디에노필 작용기가 역 전자 요구 디엘스-알더 (Inverse Electron Demand Diels-Alder; IEDDA) 반응을 통해 결합하여 요산산화효소-알부민 접합체가 생성되고, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체에 3개 이상의 알부민이 링커를 통해 접합된 것을 특징으로 함.
본 명세서에서는 다음을 포함하는 요산산화효소 변이체를 제공한다: 서열 내 3개 이상의 비천연 아미노산을 포함하고, 여기서, 각각의 상기 비천연 아미노산은 테트라진 작용기(tetrazine functional group) 또는 트리아진 작용기(triazine functional group)를 포함하는 것을 특징으로 함.
일 실시예로, 상기 요산산화효소 변이체는 1개의 야생형 요산산화효소 서브유닛 및 3개의 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화하여 형성된 사량체이고, 상기 각각의 요산산화효소 변이체 서브유닛은 야생의 요산산화효소 서브유닛 서열에서 1개 이상의 아미노산이 테트라진 작용기(tetrazine functional group) 또는 트리아진 작용기(triazine functional group)를 포함하는 비천연 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 한다.
일 실시예로, 상기 요산산화효소 변이체는 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화하여 형성된 사량체이고, 상기 각각의 요산산화효소 변이체 서브유닛은 야생의 요산산화효소 서브유닛 서열에서 1개 이상의 아미노산이 테트라진 작용기(tetrazine functional group) 또는 트리아진 작용기(triazine functional group)를 포함하는 비천연 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서는 상기 요산산화효소 변이체를 발현할 수 있는 벡터를 제공한다.
본 명세서에서는 다음을 포함하는 요산산화효소 변이체의 제조방법을 제공한다: 직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현시킬 수 있는 벡터, 및 요산산화효소 변이체 발현 벡터를 포함하는 세포주를 준비하는 것, 이때, 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현시킬 수 있는 벡터는 외래 유래 suppressor tRNA 및 외래 유래 tRNA 합성효소를 발현시킬 수 있는 것이고, 상기 외래 유래 suppressor tRNA는 특정 종결 코돈을 인식할 수 있는 것이고, 상기 외래 유래 tRNA 합성효소는 테트라진 작용기 및/또는 트리아진 작용기를 포함하는 비천연 아미노산을 인식하여 상기 외래 유래 suppressor tRNA에 연결시킬 수 있는 것이고, 상기 요산산화효소 변이체 발현 벡터는 상기 요산산화효소 변이체를 발현시킬 수 있는 것으로, 상기 요산산화효소 변이체 내에 포함된 비천연 아미노산에 대응하는 위치가 상기 특정 종결 코돈으로 암호화된 것을 특징으로 함; 및 상기 세포주를 테트라진 작용기 및/또는 트리아진 작용기를 포함하는 한 종류 이상의 비천연 아미노산이 포함된 배지에서 배양하는 것.
본 명세서에 개시된 상기 기술적 과제 및 그 해결방법에 따라, 요산산화효소-알부민 접합체가 제공된다. 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 야생형의 요산산화효소에 비해 반감기가 향상되고, 면역원성이 낮아지는 효과가 있어 효과적인 요산 관련 질병의 치료제로 사용할 수 있다.
도 1은 알부민-서브유닛 접합체를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2 내지 도 3은 요산산화효소-알부민 접합체의 예시를 모식적으로 나타낸 것이다. 도 2는 알부민 단백질 4개가 접합된 요산산화효소-알부민 접합체를 예시적으로 나타낸 모식도이고, 도 3은 알부민 단백질 3개가 접합된 요산산화효소-알부민 접합체를 예시적으로 나타낸 모식도이다.
도 4는 pTAC-Uox-W174amb의 enzyme digestion 전기 영동 결과를 나타낸다.
도 5는 pTAC-Uox-W174amb의 cloning 서열을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 Uox-frTet 발현을 확인하기 위한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7 및 도 8은 DEAE 컬럼을 통한 Uox-frTet의 1차 분리 정제 및 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9 및 도 10은 Phenyl Fast Flow 컬럼을 통한 Uox-frTet의 2차 분리 정제 및 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 Uox-frTet 및 Fasturtec의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 2차 정제한 Uox-frTet의 SEC-HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 형광 표지 염료(TCO-Cy3)를 통한 Uox 내 frTet 도입 여부 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 2차 정제 완료한 Uox-HSA의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 Uox-HSA의 SEC-HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 Fasturtec 및 Uox-HSA의 투여 경로 별 PK profile 결과를 나타낸 것이다. 여기서, 1) Fasturtec_IV는 야생형의 요산산화효소를 정맥투여(IV) 한 것을, 2) Uox-HSA_IV는 요산산화효소-알부민 접합체를 정맥투여(IV) 한 것을, 3) Uox-HSA_IP는 요산산화효소-알부민 접합체를 복강투여(IP) 한 것을, 4) Uox-HSA_IM은 요산산화효소-알부민 접합체를 근육투여(IM)한 것을 나타낸다.
도 17은 Fasturtec 및 Uox-HSA의 투여 경로 별 PK profile 결과 데이터를 나타낸다. 여기서, Fasturtec_IV, Uox-HSA_IV, Uox-HSA_IP, 및 Uox-HSA_IM은 도 16에서 설명한 바와 같고, AVG는 각 ICR 마우스 데이터의 평균값(n=5), SD는 표준편차를 나타내며, AUC는 상기 PK profile 결과의 Area Under Curve, T1/2은 시간 단위로 표시한 반감기, Tmax는 약물의 혈중 농도가 가장 높았던 시간, 및 Cmax는 약물의 혈중 농도가 가장 높았을 때의 농도를 나타낸다.
도 18은 반복 고요산혈증 동물모델에서 Uox-HSA의 투여에 따른 혈중 요산 감소 효과의 약력학 평가 시험 결과를 나타낸 것이다. 여기서, 1) Negative control은 음성 대조군, 2) Uox-HSA 1mg/kg은 요산산화효소-알부민 접합체를 1mg/kg 용량으로 정맥 투여한 것, 3) Uox-HSA 4mg/kg은 요산산화효소-알부민 접합체를 4mg/kg 용량으로 정맥 투여한 것, 4) Uox-HSA 10mg/kg은 요산산화효소-알부민 접합체를 10mg/kg 용량으로 정맥 투여한 것, 5) Fasturtec 1.33mg/kg은 야생형의 요산산화효소(Fasturtec)를 1.33mg/kg 용량으로 정맥 투여한 것, 6) Febuxostat 10mg/kg은 Febuxostat 1mg/kg 용량으로 경구 투여한 것을 나타낸다.
도 19는 반복 고요산혈증 동물모델에서 Uox-HSA의 투여에 따른 혈중 요산 감소 효과의 약력학 평가 시험 결과 데이터를 나타낸다. 여기서, Negative control, Uox-HSA 1mg/kg, Uox-HSA 4mg/kg, Uox-HSA 10mg/kg, Fasturtec 1.33mg/kg, Febuxostat 10mg/kg은 도 18에서 설명한 바와 같고, AVG는 각 동물모델 데이터의 평균값, SD는 표준편차를 나타낸다.
도 20은 Human FcRn TG 마우스에서 Uox-HSA의 투여에 따른 PK profile 결과를 나타낸 것이다. 여기서, 1) Uox-HSA (Tetra)는 하나의 요산산화효소 당 4개의 알부민이 접합된 요산산화효소-알부민 접합체, 2) Uox-HSA (tri/di)는 하나의 요산산화효소 당 2개 내지 3개의 알부민이 접합된 요산산화효소-알부민 접합체를 의미하고, AUC는 상기 PK profile 결과의 Area Under Curve, T1/2은 시간 단위로 표시한 반감기, Range는 약동학 평가 시간 범위를 나타낸다.
도 21은 PBMC를 통한 Uox-HSA의 면역원성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 PBMC를 통한 Uox-HSA의 면역원성 분석 결과 데이터를 나타낸 것이다. 여기서, 1) CD4는 CFSE-CD4+ T세포에 대한 데이터, 2) CD8은 CFSE-CD8+ T세포에 대한 데이터를 나타낸다. 각 표에서 #1 내지 #3의 데이터는 각 개체 별 값을, Mean은 모든 개체의 평균값을 나타낸다.
도 23 내지 도 27은 요산산화효소 변이체에 도입할 수 있는 비천연 아미노산의 예시를 나타낸 것이다.
도 28은 요산산화효소-링커 접합부 구조의 예시, 및 이와 관련된 비천연 아미노산의 예시를 나타낸 것이다. 여기서, (1) 부분은 비천연 아미노산의 나머지 잔기 부분에 연결되고, (2) 부분은 앵커에 연결된다.
도 29는 앵커 구조의 예시를 나타낸 것이다.
도 30은 알부민-링커 접합부 구조의 예시를 나타낸 것이다. 여기서, J1은 요산산화효소-링커 접합부, J2는 알부민-링커 접합부를 의미한다.
도 31은 링커 구조의 예시를 나타낸 것이다.
도 32는 AgUox-WT 및 AgUox-frTet의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다. (A) AgUox 변이체의 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue; CBB) 염색 결과로, Mw는 분자량 마커, BI는 유도 전, AI는 유도 후를 나타낸다. (B) 정제된 AgUox 변이체의 CBB 염색 단백질 겔을 나타낸다. (C) TCO-Cy3의 존재, 또는 부존재 하 배양된 AgUox 변이체의 형관 이미지 및 CBB 염색 단백질 겔을 나타낸다.
도 33은 AgUox-WT(A) 및 AgUox-frTet(B)의 트립신 분해 단편의 flight mass spectra를 나타낸 것이다. AgUox-WT 단편인 AgUox-WT 단편인 YNTVEVDFDAVYASVR(서열번호 165)의 질량을 AgUox-frTet 단편 YNTVXVDFDAVYASVR(서열번호 166, X는 frTet을 나타냄)의 질량과 비교한 것이다. 단편의 피크인 AVIETHPEIDEIKMSLPNK(서열번호 167)를 대조군으로 사용했다.
도 34는 MAL-HSA(MAL로 표시) 또는 APN-HSA(APN으로 표시)와 AgUox-frTet 반응 혼합물의 단백질 겔을 나타낸 것이다. Mw는 분자량 표준을 나타낸다.
도 35는 AgUox-frTet 및 MAL-HSA (A) 또는 APN-HSA (B)의 콘쥬게이트 혼합물 분획의 크기 배제 크로마토그램 및 단백질 겔을 나타낸다. 용출된 분획을 단백질 겔에 로딩한 후, Coomassie Brilliant Blue로 염색했다.
도 36은 AgUox-WT 및 AgUox-HSA 접합체의 약동학 분석(PK Profile) 결과를 나타낸 것이다. 잔류 AgUox-WT 및 AgUox-HSA 접합체의 혈청 활성은 초기 단계(0~84시간)와 후기(84~120시간)에서 측정되었다. te1/2 및 tl1/2는 각각 초기 및 후기의 혈청 반감기를 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여, 발명의 내용을 특정한 구현예와 예시들을 통해 더욱 상세하게 설명한다. 상기 첨부된 도면은 발명의 일부 구현예를 포함하지만, 모든 구현예를 포함하고 있지는 않다는 점에 유의해야 한다. 본 명세서에 의해 개시되는 발명의 내용은 다양한 형태로 구체화될 수 있으며, 여기에 설명되는 특정 구현예로 제한되지 않는다. 이러한 구현예들은 본 명세서에 적용되는 법적 요건을 만족시키기 위해 제공되는 것으로 보아야 한다. 본 명세서에 개시된 발명이 속한 기술분야에 있어 통상의 기술자라면, 본 명세서에 개시된 발명의 내용에 대한 많은 변형 및 다른 구현예들을 떠올릴 수 있을 것이다. 따라서, 본 명세서에서 개시된 발명의 내용은 여기에 기재된 특정 구현예로 제한되지 않으며, 이에 대한 변형 및 다른 구현예들도 청구범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
용어의 정의
약
본 명세서에서 사용되는 "약"이라는 용어는 어떤 수량에 거의 가까운 정도를 의미하며, 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
클릭화학반응(Click chemistry)
본 명세서에서 사용되는 "클릭화학반응(Click chemistry)"은 두 개의 분자가 빠르고 안정적으로 공유 결합을 형성하도록 설계된 상보적인 화학작용기 및 화학반응을 설명하는 개념으로, Scripps Research Institute의 K. Barry Sharpless에 의해 도입되었다. 상기 클릭화학반응은 특정한 반응을 의미하는 것이 아니라, 빠르고 안정적인 반응의 개념을 의미한다. 클릭화학반응은 모듈화되고, 넓은 범위를 가지며, 높은 수율을 갖고, 부산물이 중대하지 않고, 입체특이적이며, 생리학적으로 안정하고, 열역학적으로 큰 원동력을 가지며 (예를 들어, 84kJ/mol 이상), 높은 원자 경제성을 가진다는 특징이 있다. 클릭화학반응의 예시로, 1) 휴이스겐 1,3-이극성 고리화첨가 (Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition; Tornoe et al.　Journal of Organic Chemistry (2002) 67: 3075-3064 등 참조), 2) 디엘스-알더 반응 (Diels-Alder reaction), 3) 에폭사이드 (epoxide) 및 아지리딘 (aziridine)과 같은 작은 스트레인된 고리 (strained ring)에 대한 친핵성 첨가 반응 (Nucleophilic addition), 4) 활성화된 카르보닐기 (activated carbonyl group)에 대한 친핵성 첨가 반응, 및 5) 탄소-탄소 이중결합 또는 삼중결합에 대한 첨가 반응이 있다. 상기 클릭화학반응의 의미는 문맥에 따라 적절해 해석되어야 하며, 그 외 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함한다.
생물직교반응(Bioorthogonal reaction)
본 명세서에서 사용되는 "생물직교반응(Bioorthogonal reaction)은 생체 내 고유 분자와는 반응이 일어나지 않으면서, 외부에서 투입된 잔기끼리 선택적으로 반응하는 것을 의미한다. 어떤 반응이"생물직교적(Bioorthogonal)"인 경우, 상기 반응, 또는 반응 산물에 생체 내 고유 분자가 관여하지 않으므로, 체내에서 매우 안정하다는 특성을 가진다.
표준 아미노산(standard amino acid)
본 명세서에서 사용되는 "표준 아미노산(standard amino acid)"이라는 용어는 유기체(organism)의 체내에서 유전자의 전사 및 번역 과정을 통해 합성되는 20종의 아미노산을 통틀어 의미한다. 구체적으로, 상기 표준 아미노산은 알라닌(Alanine; Ala, A), 아르기닌(Arginine; Arg, R), 아스파라긴(Asparagine; Asn, N), 아스파르트산(Aspartic acid; Asp, D), 시스테인(Cysteine; Cys, C), 글루탐산(Glutamic acid; Glu, E), 글루타민(Glutamine; Gln, Q), 글리신(Glycine; Gly, G), 히스티딘(Histidine; His, H), 이소류신(Isoleucine; Ile, I), 류신(Leucine; Leu, L), 리신(Lysine; Lys K), 메티오닌(Methionine; Met, M), 페닐알라닌(Phenylalanine; Phe, F), 프롤린(Proline; Pro, P), 세린(Serine; Ser, S), 트레오닌(Threonine; Thr, T), 트립토판(Tryptophan; Trp, W), 티로신(Tyrosine; Tyr, Y), 및 발린(Valine; Val, V)을 포함한다. 상기 표준 아미노산 각각은 모두 대응하는 DNA 코돈이 존재하며, 일반적인 아미노산 일문자 또는 세문자 표기법으로 나타낼 수 있다. 상기 표준 아미노산이라는 용어가 지칭하는 대상은 문맥에 따라 적절하게 해석되어야 하며, 그 외 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함한다.
비천연 아미노산(nonnatural amino acid)
본 명세서에서 사용되는 "비천연 아미노산(nonnatural amino acid)"이라는 용어는, 체내에서 합성되지 않고 인공적으로 합성한 아미노산을 지칭한다. 상기 비천연 아미노산은 예들 들어, 4-(1,2,3,4-tetrazin-3-yl) phenylalanine, 및 4-(6-methyl-s-tetrazin-3-yl)phenylalanine 등이 있다. 상기 비천연 아미노산은 이에 대응하는 DNA 코돈이 존재하지 않으며, 일반적인 아미노산 일문자 또는 세문자 표기법으로 나타낼 수 없으므로, 다른 문자를 사용하여 표기하며, 추가적으로 보충하여 설명한다. 상기 비천연 아미노산이라는 용어가 지칭하는 대상은 문맥에 따라 적절하게 해석되어야 하며, 그 외 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함한다.
펩타이드 서열 기재
달리 서술하지 않는 한, 본 명세서에서 펩타이드의 서열을 기재할 때는 아미노산 일문자 표기법, 또는 세문자 표기법을 사용하여, N-터미널에서 C-터미널 방향으로 기재한다. 예를 들어, RNVP로 표기하는 경우, N-터미널에서 C-터미널 방향으로 아르기닌(arginine), 아스파라긴(asparagine), 발린(valine), 및 프롤린(proline)이 차례로 연결된 펩타이드를 의미한다. 또 다른 예를 들어, Thr-Leu-Lys로 표기하는 경우, N-터미널에서 C-터미널 방향으로 트레오닌(Threonine), 류신(Leucine), 및 리신(Lysine)이 차례로 연결된 펩타이드를 의미한다. 상기 일문자 표기법, 또는 세문자 표기법으로 나타낼 수 없는 아미노산의 경우, 다른 문자를 사용하여 표기하며, 추가적으로 보충하여 설명한다.
면역원성(immunogenicity)
본 명세서에서 사용되는 "면역원성"이라는 용어는, 사전적으로 "면역 반응을 일으킬 수 있는 항원으로 작용하는 성질"을 의미한다. 특정 항원의 면역원성을 측정하기 위한 다양한 방법들이 있고, 상기 방법은 그 목적에 따라 적절히 채택되거나, 설계될 수 있다. 예를 들어, 1) 상기 항원을 대상의 체내에 투여하는 경우, 대상의 체내에서 IgG, IgA, 및/또는 IgE 타입의 항체가 생성되는지 여부를 확인하는 방법, 2) 투여 주기에 따라, 상기 IgG, IgA, 및/또는 IgE 타입의 항체가 생성되는 시기를 확인하는 방법, 3) 상기 유도된 항체의 상기 항원에 대한 역가를 확인하는 방법, 4) 상기 유도된 항체의 작용기작이 밝혀진 경우, 상기 작용기작에 따른 효과를 측정하는 방법이 있을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 면역원성이라는 용어가 지칭하는 대상은 문맥에 따라 적절하게 해석되어야 하며, 그 외 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함한다.
요산산화효소의 통풍치료기전
통풍의 원인
통풍 관절염은 혈중 요산 농도가 정상범위에 비해 높은 증상인 고요산혈증에 의해 이차적으로 발생하는 요산염결정(monosodium urate monohydrate crystals; MSU)에 대한 염증반응으로 발생한다. 통풍은 간과 소장에서의 요산의 과잉생산 및/또는 요산의 배설 감소가 원인이 되어, 체내에 요산이 축적되어 발병한다. 통풍은 일반적으로 고요산혈증에서 출발하여 급성 통풍성 관절염을 겪은 후, 간헐기 통풍을 거쳐 만성 결절성 통풍으로 진행되게 된다.
요산산화효소의 통풍치료기전
요산산화효소(Urate oxidase; Uricase)는 인간을 비롯한 영장류는 자체 합성이 불가능한 효소의 일종으로, 요산을 알란토인(Allantoin)으로 분해하는 기능을 한다. 상기 알란토인은 요산에 비해 용해도가 5배 내지 10배 높아 신장으로 배설되기 쉽다는 특징이 있다. 따라서, 요산산화효소를 치료제로 사용하는 경우, 통풍 발생의 주 원인인 요산 축적을 방지하고, 요산을 체외로 배설시킴으로써 통풍을 치료할 수 있다.
요산산화효소의 통풍 치료제로서의 한계점
상기 요산산화효소는 통풍 발생의 주 원인인 요산을 배설가능한 형태로 분해하는 직접적인 치료기전을 가지며, 따라서 강력한 요산 강하 효과가 있다는 장점이 있다. 하지만, 상기 요산산화효소는 단백질 약물로써 1) 체내 반감기가 짧아 주사제로만 사용이 가능하고, 2) 외부 유래 단백질이기 때문에 체내에 투여되는 경우 면역반응이 발생하고, 이로 인한 부작용이 발생한다는 단점이 있어 통풍 치료제로 사용되는 데 제한이 있다.
종래기술의 한계점
시판 요산산화효소 기반 약물의 한계점
현재 시판 중인 요산산화효소 기반 약물 (KRYSTEXXA; pegloticase)은 상기 요산산화효소의 한계점인 짧은 반감기를 개선하기 위하여, 요산산화효소에 무작위로 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol; PEG)을 결합시켜 사용한다. 하지만, 1) 상기 요산산화효소가 무작위로 페길레이션(pegylation)됨에 따라 효소의 활성 부위를 가로막아 효능이 떨어지고, 2) 상기 PEG가 체내에서 알러지 반응을 일으키는 부작용이 있다는 한계점이 있다.
종래 요산산화효소-알부민 접합체 기술의 한계점
본 발명자는 종래 선행문헌 등록공보 KR 1637010 B1에서 요산산화효소-알부민 접합체를 개시한 바 있다. 상기 선행문헌에서 개시된 요산산화효소-알부민 접합체는 상기 요산산화효소의 하나 이상의 아미노산을 비천연 아미노산인 AzF(p-Azido-L-phenylalanine)로 치환하고, 디벤조시클로옥틴(dibenzocyclooctyne; DBCO) 반응기를 가진 링커를 사용하여 요산산화효소 및 알부민을 링커를 통해 접합시킨 것이다. 하지만, 상기 선행문헌에서 개시된 요산산화효소-알부민 접합체는, 접합부의 AzF 및 DBCO의 결합 반응인 스트레인 유도 고리화첨가 반응 (Strain-Promoted cycloaddition; SPAAC)의 속도가 느려 수율이 매우 낮다는 문제점이 있다. 따라서, 상기 선행문헌에서 개시된 요산산화효소-알부민 접합체는, 요산산화효소 내 알부민이 접합할 수 있는 부위가 적어도 네 군데 있음에도 불구하고, SPAAC 반응의 비효율성 때문에 요산산화효소 한 단위 당 한개 내지 두개의 알부민이 접합된 요산산화효소-알부민 접합체 밖에 수득할 수 없다는 한계점이 있다. 상기한 한계점으로 인해, 선행문헌에 개시된 요산산화효소-알부민 접합체는 1) 알부민 접합으로 인한 반감기 증대 또는 면역원성 감소 효과가 제한적이고, 2) 알부민이 접합되지 않은 AzF의 잔기가 노출되어 체내에서 의도하지 않은 반응을 일으킬 수 있다는 문제점이 있다.
요산산화효소-알부민 접합체(conjugate)
요산산화효소-알부민 접합체 개괄
본 명세서는 요산산화효소-알부민 접합체(conjugate)를 개시한다. 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체 및 알부민이 링커를 통해 연결된 것이다. 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 상기 요산산화효소 변이체에 3개 이상의 알부민이 링커를 통해 접합된 것을 특징으로 한다. 상기 요산산화효소 변이체는 야생형의 요산산화효소 서열에서 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것으로, 상기 비천연 아미노산의 잔기를 통해 링커 및 알부민이 연결된다. 구체적으로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체; 요산산화효소 변이체 및 링커가 접합하여 형성된 요산산화효소-링커 접합부; 링커 내에 포함된 앵커; 알부민 및 링커가 접합하여 형성된 알부민-링커 접합부; 및 알부민을 포함한다. 이하 각 구성요소(요산산화효소 변이체, 알부민, 링커) 및 상기 구성요소가 접합된 결과인 요산산화효소-알부민 접합체의 구조를 더 구체적으로 설명한다.
요산산화효소-알부민 접합체 구성요소 1 - 요산산화효소 변이체
요산산화효소는 체내에서 요산을 알란토인(Allantoin)으로 분해하는 기능을 가지는 효소로, 요산이 축적되어 발생하는 각종 질병이나 질환을 치료하는 용도로 사용할 수 있다. 상기 요산산화효소는 요산산화효소 서브유닛 4개가 올리고머화(oligomerization)되어 형성된 사합체(tetramer)이다. 본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체를 포함하는데, 이는 야생형의 요산산화효소 서열에서 하나 이상의 아미노산을 비천연 아미노산(unnatural amino acid)으로 치환한 것이다. 구체적으로, 상기 요산산화효소 변이체는 사합체 단백질로서, 네 개의 서브유닛 중 세 개 또는 네 개가 요산산화효소 변이체 서브유닛이며, 이때, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛의 서열은 야생형 요산산화효소 서브유닛 서열과 비교해 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것이다. 야생형 요산산화효소에 비천연 아미노산을 삽입하여 요산산화효소 변이체를 만드는 목적은, 상기 비천연 아미노산의 잔기 및 링커를 역 전자-요구 디엘스 엘더 반응(Inverse Electron-Demand Diels-Alder reaction; IEDDA 반응)을 이용하여 연결시키기 위함이다.
요산산화효소-알부민 접합체 구성요소 2 - 알부민
상기 알부민은 인간 혈청 알부민 및/또는 인간 혈청 알부민의 변이체를 지칭하며, 상기 요산산화효소 변이체에 대한 약물전달체 역할을 한다. 상기 알부민은 상기 요산산화효소 변이체가 단독으로 있을 때와 비교하여, 상기 요산산화효소-알부민 접합체가 향상된 체내 반감기 및 낮은 면역원성을 나타내도록 한다.
요산산화효소-알부민 접합체 구성요소 3 - 링커
상기 링커는 상기 요산산화효소 변이체 및 상기 알부민을 연결시키기 위한 것으로, 요산산화효소 변이체와 결합할 수 있는 IEDDA 반응기, 알부민과 결합할 수 있는 티올 반응기, 및 앵커를 포함한다. 상기 요산산화효소-알부민 접합체에서 상기 IEDDA 반응기 및 상기 티올 반응기는 각각 상기 요산산화효소 변이체 및 상기 알부민과 결합하여 있으므로, 링커에 포함된 원형 그대로 있지 않고 요산산화효소-링커 접합부 및 알부민-링커 접합부로 변형되어 있다.
요산산화효소-알부민 접합체 구조 1 - 서브유닛-알부민 접합체
본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체에 포함된 요산산화효소 변이체는 네 개의 서브유닛이 올리고머화되어 형성 된 사량체이며, 상기 서브유닛 중 3개 이상은 링커를 통해 알부민과 접합되어 있는 것을 특징으로 한다. 상기 요산산화효소 변이체를 이루는 서브유닛 중 링커를 통해 알부민과 접합되어 있는 것을 서브유닛-알부민 접합체라 한다. 상기 요산산화효소-알부민 접합체에 포함된 상기 요산산화효소 변이체는 세 개 이상의 요산산화효소 변이체 서브유닛을 포함한다. 이때, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛 일부 또는 전부는 알부민과 접합된 서브유닛-알부민 접합체이다.
요산산화효소-알부민 접합체 구조 2 - 요산산화효소-링커 접합부
본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체와 알부민이 링커를 통해 접합된 것이다. 이때, 상기 요산산화효소 변이체와 링커가 접합된 부분을 요산산화효소-링커 접합부라 한다. 상기 요산산화효소 변이체와 링커는 IEDDA 반응을 통해 접합된 것을 특징으로 한다.
요산산화효소-알부민 접합체 구조 3 - 알부민-링커 접합부
본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체와 알부민이 링커를 통해 접합된 것이다. 이때, 상기 알부민과 링커가 접합된 부분을 알부민-링커 접합부라 한다.
요산산화효소-알부민 접합체 구조 4 - 앵커
상기 링커는 상기 요산산화효소 변이체와 접합될 수 있는 IEDDA 반응기, 및 알부민과 접합될 수 있는 티올 반응기를 포함하며, 이를 하나로 연결하는 앵커를 포함한다. 상기 앵커는 요산산화효소와 알부민을 연결시키는 반응에 관여하지 않는 부분이므로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체 내에서, 링커에 포함된 구조 그대로 남아 있는 것이 특징이다.
요산산화효소-알부민 접합체 구조 예시 1 - 요산산화효소 관점
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 다음 [화학식 1]로 표현된다:
[화학식 1] Uox-[J1-A-J2-HSA]n
이때, 상기 Uox는 요산산화효소 변이체,
상기 J1은 요산산화효소-링커 접합부,
상기 A는 앵커,
상기 J2는 알부민-링커 접합부,
상기 HSA는 인간 혈청 알부민 (Human Serum Albumin)을 의미하며,
상기 n은 3 또는 4이다.
요산산화효소-알부민 접합체 구조 예시 2 - 요산산화효소 서브유닛 관점
일 구현예로, 상기 서브유닛-알부민 접합체는 다음 [화학식 2]로 표현된다:
[화학식 2] p'-J1-A-J2-HSA
이때, 상기 p'은 요산산화효소 변이체 서브유닛이며, 나머지는 위에서 정의된 바와 같다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 1개의 야생형 요산산화효소 서브유닛 및 3개의 서브유닛-알부민 접합체를 포함한다. 구체적으로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체에서, 상기 야생형 요산산화효소 서브유닛 1개 및 상기 각각의 서브유닛-알부민 접합체에 포함된 요산산화효소 변이체 서브유닛 3개가 올리고머화하여 사량체를 이룬다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 1개의 요산산화효소 변이체 서브유닛 및 3개의 서브유닛-알부민 접합체를 포함한다. 구체적으로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체에서, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛 1개 및 상기 각각의 서브유닛-알부민 접합체에 포함된 요산산화효소 변이체 서브유닛 3개가 올리고머화하여 사량체를 이룬다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 4개의 서브유닛-알부민 접합체를 포함한다. 구체적으로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체에서, 상기 각각의 서브유닛-알부민 접합체에 포함된 요산산화효소 변이체 서브유닛 4개가 올리고머화하여 사량체를 이룬다.
요산산화효소-알부민 접합체 특징 1 - 알부민 접합을 통한 반감기 증대 효과
전술한 바, 약물 분자에 알부민을 결합시키는 경우, 체내 반감기가 증대되는 효과가 있다. 본 명세서에서 제공하는 요산산화효소-알부민 접합체는 치료용 단백질인 요산산화효소에 알부민을 접합시킴으로써, 체내 반감기가 증대되었다는 특징이 있다. 향상된 체내 반감기는 상기 요산산화효소-알부민 접합체를 체내에 투여한 후, 약동학적 평가(Pharmacokinetics profile) 실험을 통해 확인할 수 있으며, 실험예 4에서 확인할 수 있다.
요산산화효소-알부민 접합체 특징 2 - 요산산화효소의 활성을 저해하지 않음
선행기술의 한계점 중 하나는, 요산산화효소에 약물전달체, 예를 들어, 알부민, 또는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG) 등을 결합시켜 효능의 증대를 꾀했지만, 이러한 약물전달체가 입체구조 상 요산산화효소의 활성 부위를 가로막는 등 활성을 저해하고, 그 결과 약효가 감소된다는 것이다. 본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소의 활성을 저해하지 않는 부분에 알부민을 위치-특이적으로 결합시킴으로써, 약효를 감소시키지 않는다는 특징이 있다.
요산산화효소-알부민 접합체 특징 3 - 면역원성 감소 효과
인간은 요산산화효소를 생산하지 않는 것으로 알려져 있으며, 치료용으로 주로 사용하는 요산산화효소는 미생물 유래의 효소이다. 이러한 요산산화효소는 미생물 유래의 외래단백질이므로 체내에 단독으로 투여되는 경우 면역반응을 일으켜 부작용이 나타난다. 따라서, 상기 요산산화효소의 면역원성을 줄이는 것이 중요한 과제이다. 본 명세서에서 개시하는 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 상기 요산산화효소를 인체 혈장 단백질인 알부민과 접합시켜 요산산화효소의 면역원성을 감소시켰다는 특징이 있다. 상기 알부민은 혈장 단백질의 대부분을 구성하는 물질로, 인체 내에서 매우 안정하며 면역원성을 거의 나타내지 않는다. 따라서, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 단독으로 체내에 투여될 때에 비해 현저히 낮은 면역원성을 나타낸다.
요산산화효소-알부민 접합체 특징 4 - 요산산화효소에 3개, 혹은 4개의 알부민을 포함
종래 요산산화효소-알부민 접합체 기술은 요산산화효소 변이체 및 알부민을 Strain-Promoted Alkyne-Azide Cycloaddition reaction (SPAAC 반응)을 통해 연결했다. 상기 SPAAC 반응은 그 속도가 상대적으로 느리고, 수율이 낮아 상기 요산산화효소 변이체에 1개 또는 2개의 알부민이 결합된 요산산화효소-알부민 접합체를 제공할 수 밖에 없다는 한계점이 있다. 본 명세서에서 제공하는 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체 및 알부민을 반응 속도가 상대적으로 빠르고, 수율이 매우 높은 IEDDA 반응을 통해 연결시킴으로써, 하나의 요산산화효소 변이체에 3개 이상의 알부민이 결합되어 있는 것이 특징이다. 상기 특징으로 인해, 1) 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 반감기 증대 효과 및 면역원성 감소 효과가 극대화될 수 있으며, 2) 비천연 아미노산의 잔기가 노출되는 일이 최소화 되므로, 이로 인한 부작용이 최소화된다는 장점이 있다.
요산산화효소 변이체
요산산화효소 변이체 개괄
본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체에 포함된 요산산화효소 변이체는 미생물 유래의 야생형 요산산화효소의 아미노산 서열 일부가 변형된 것을 특징으로 한다. 상기 요산산화효소 변이체는 3개 이상의 비천연 아미노산을 포함하며, 각각의 비천연 아미노산 잔기를 통해 위치-특이적으로 알부민과 접합될 수 있다. 구체적으로, 상기 요산산화효소 변이체는 요산산화효소 변이체 서브유닛 4개가 올리고머화 되어 형성된 사합체이며, 각각의 요산산화효소 변이체 서브유닛은 야생형 요산산화효소 서브유닛과 비교해 그 서열 내 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 한다.
야생형 요산산화효소의 유래 미생물
본 명세서에서 제공하는 상기 요산산화효소 변이체의 원형이 되는 야생형 요산산화효소는 미생물에서 유래된 것이다. 일 구현예로, 상기 야생형 요산산화효소는 Aspergillus Flavus, Arthrobacter globiformis, 및 Candidas Utilis에서 선택된 미생물 유래 요산산화효소일 수 있다.
야생형 요산산화효소의 예시서열
상기 야생형 요산산화효소는 동일한 4개의 야생형 요산산화효소 서브유닛이 올리고머화된 사량체(tetramer) 단백질이다.
일 구현예로, 상기 야생형 요산산화효소가 Aspergillus Flavus 유래 요산산화효소인 경우, 그 서브유닛의 펩타이드 서열은 N말단에서 C말단 방향으로, SAVKAARYGKDNVRVYKVHKDEKTGVQTVYEMTVCVLLEGEIETSYTKADNSVIVATDSIKNTIYITAKQNPVTPPELFGSILGTHFIEKYNHIHAAHVNIVCHRWTRMDIDGKPHPHSFIRDSEEKRNVQVDVVEGKGIDIKSSLSGLTVLKSTNSQFWGFLRDEYTTLKETWDRILSTDVDATWQWKNFSGLQEVRSHVPKFDATWATAREVTLKTFAEDNSASVQATMYKMAEQILARQQLIETVEYSLPNKHYFEIDLSWHKGLQNTGKNAEVFAPQSDPNGLIKCTVGRSSLKSKL(서열번호 1) 일 수 있다.
또 다른 구현예로, 상기 야생형 요산산화효소가 Candida Utilis 유래 요산산화효소인 경우, 그 서브유닛의 펩타이드 서열은 N말단에서 C말단 방향으로, MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 51) 일 수 있다.
또 다른 구현예로, 상기 야생형 요산산화효소가 Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소인 경우, 그 서브유닛의 펩타이드 서열은 N말단에서 C말단 방향으로, MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC(서열번호 118)일 수 있다.
요산산화효소 변이체 서브유닛
상기 야생형 요산산화효소와 마찬가지로, 상기 요산산화효소 변이체도 4개의 서브유닛을 포함하는 사량체 단백질이다. 상기 요산산화효소 변이체는 3개 또는 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛을 포함하며, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 그 원형이 되는 야행성 요산산화효소 서브유닛에서 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 한다. 일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체는 3개의 요산산화효소 변이체 서브유닛, 및 1개의 야생형 요산산화효소 서브유닛을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체는 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛을 포함할 수 있다. 이하 "요산산화효소 변이체 서브유닛" 단락에서 더 구체적으로 설명한다.
요산산화효소 변이체 제조방법
본 명세서에서는 상기 요산산화효소 변이체를 제조하는 방법을 개시한다. 상기 요산산화효소 변이체는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는데, 자연계에서는 비천연 아미노산에 대응되는 핵산 코돈이 존재하지 않는다. 이러한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 세포 내에서 생합성하기 위해서는 상기한 비천연 아미노산에 대응하는 핵산 코돈이 없다는 문제를 해결해야 한다. 자연계에서 이용되는 종결 코돈 3종은 아미노산을 암호화하지 않음을 이용하여, 이러한 문제를 효과적으로 해결한 방법이 선행문헌 KR 1637010 B1 등에 개시되어 있다. 상기 요산산화효소 변이체를 제조하는 방법은 상기 선행문헌 KR 1637010 B1에 나온 방법을 참조하며, 1) 종결 코돈을 인식하여 비천연 아미노산을 서열 내에 도입하는 기능을 가지는 직교적 tRNA/합성효소 페어, 및 2) 상기 요산산화효소 변이체의 서열 중 비천연 아미노산 자리를 종결 코돈으로 암호화한 핵산을 사용한다. 이하 "요산산화효소 변이체 제조방법" 단락에서 더 구체적으로 설명한다.
요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터
본 명세서에서는 상기 요산산화효소 변이체 합성 방법에 사용되는 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터를 개시한다. 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터는 야생형 요산산화효소를 암호화하는 핵산 서열 중, 비천연 아미노산으로 치환하고자 하는 위치의 핵산 코돈이 종결 코돈으로 변경된 것을 특징으로 한다. 이하 "요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터" 단락에서 더 구체적으로 설명한다.
요산산화효소 변이체 서브유닛
요산산화효소 변이체 서브유닛 1 - 비천연 아미노산 치환
상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하며, 상기 비천연 아미노산은 링커와 IEDDA 반응을 통해 결합할 수 있는 작용기를 가지는 것을 특징으로 한다. 일 구현예로, 상기 비천연 아미노산은 IEDDA 반응을 일으킬 수 있는 디엔 작용기(Dien functional group)를 포함하는 아미노산일 수 있다. 구체적으로, 상기 디엔 작용기는 테트라진 작용기(tetrazine functional group) 또는 그 유도체, 및/또는 트리아진 작용기(triazine functional group) 또는 그 유도체일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 비천연 아미노산은 4-(1,2,3,4-tetrazin-3-yl) phenylalanine (frTet), 4-(6-methyl-s-tetrazin-3-yl)phenylalanine (Tet-v2.0), 3-(4-(1,2,4-triazin-6-yl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-(2-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)ethyl)phenyl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(6-phenyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)propanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)amino)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 3-(4-(2-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)ethyl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)thio)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-((6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)thio)phenyl)propanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)oxy)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-((6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)oxy)phenyl)propanoic acid, 3-(4'-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4'-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(6-(6-(pyridin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)pyridin-3-yl)propanoic acid, 3-(4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 및 2-amino-3-(4-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)propanoic acid 로 이뤄진 군에서 선택된 것일 수 있다.
요산산화효소 변이체 서브유닛 2 - 비천연 아미노산 예시
일 구현예로, 상기 비천연 아미노산은 다음 중 선택된 것일 수 있다:
Figure pat00001
[UAA01],
Figure pat00002
[UAA02],
Figure pat00003
[UAA03],
Figure pat00004
[UAA04],
Figure pat00005
[UAA05],
Figure pat00006
[UAA06],
Figure pat00007
[UAA07],
Figure pat00008
[UAA08], [UAA09],
Figure pat00009
[UAA10], [UAA11]
Figure pat00010
[UAA12], [UAA13], 및
Figure pat00011
[UAA14].
요산산화효소 변이체 서브유닛 3 - 치환 위치
야생형 요산산화효소에 비천연 아미노산을 삽입해 요산산화효소 변이체를 만들 때, 본래 요산산화효소의 구조와 기능에는 가능한 한 영향을 미치지 않아야 하므로, 요산산화효소의 활성 및 구조에 있어 중요한 역할을 하는 아미노산을 비천연 아미노산으로 치환할 수는 없다. 또한, 상기 비천연 아미노산은 요산산화효소-알부민 접합체 제조 과정에서 링커와 결합해야 하기 때문에, 요산산화효소의 입체 구조 상 상대적으로 용매 접근성이 높은 위치의 아미노산을 치환하는 것이 유리하다. 야생형 요산산화효소의 구조와 기능에 미치는 영향은 최소화하면서, 용매접근성이 높은 자리를 선별하기 위해 다양한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 분자 모델링 계산을 통해 야생형 요산산화효소 고유의 원자 에너지와 유사하면서도, 용매 접근성은 높은 후보 위치를 선별할 수 있다.
일 구현예로, 요산산화효소 변이체를 만들기 위해 상기 야생형 요산산화효소 서열 중 비천연 아미노산으로 치환하는 위치는 분자 모델링 시뮬레이션 결과를 참조하여 결정할 수 있다. 구체적으로, 상기 분자 모델링 시뮬레이션 결과는 Rosetta 분자 모델링 패키지의 스코어링 결과일 수 있다.
요산산화효소 변이체 서브유닛 4 - 치환 위치 예시
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1의 펩타이드 서열의 137번째 글리신, 22번째 글루탐산, 92번째 아스파라긴, 23번째 리신, 295번째 세린, 113번째 글리신, 273번째 리신, 171번째 리신, 240번째 알라닌, 89번째 글루탐산, 266번째 리신, 24번째 트레오닌, 48번째 리신, 192번째 세린, 202번째 프롤린, 110번째 아스파르트산, 243번째 글루타민, 195번째 글루타민, 138번째 리신, 115번째 프롤린, 199번째 세린, 272번째 글리신, 리신4, 112번째 아스파르트산, 267번째 글리신, 114번째 리신, 70번째 글루타민, 174번째 트립토판, 223번째 아스파라긴, 41번째 글루탐산, 261번째 아스파르트산, 25번째 글리신, 52번째 세린, 241번째 아르기닌, 213번째 글루탐산, 274번째 아스파라긴, 221번째 글루탐산, 206번째 알라닌, 236번째 글루탐산, 164번째 아르기닌, 269번째 글루타민, 136번째 글루탐산, 259번째 글루탐산, 246번째 글루탐산, 49번째 알라닌, 148번째 글리신, 19번째 히스티딘, 296번째 세린, 및 47번째 트레오닌 중 선택된 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 51의 펩타이드 서열의 301번째 트레오닌, 26번째 아스파라긴, 303번째 류신, 194번째 리신, 95번째 세린, 140번째 세린, 116번째 글리신, 302번째 리신, 167번째 리신, 115번째 아스파르트산, 299번째 글루탐산, 24번째 프롤린, 271번째 트립토판, 277번째 아스파르트산, 169번째 아스파르트산, 118번째 프롤린, 177번째 트레오닌, 174번째 글루타민, 208번째 리신, 275번째 글루탐산, 266번째 류신, 273번째 글리신, 200번째 티로신, 92번째 글루탐산, 247번째 글루탐산, 228번째 류신, 300번째 리신, 204번째 리신, 51번째 글루탐산, 207번째 아스파르트산, 117번째 리신, 250번째 시스테인, 175번째 프롤린, 270번째 리신, 268번째 아스파르트산, 44번째 글리신, 193번째 아스파라긴, 164번째 글리신, 73번째 트레오닌, 29번째 리신, 230번째 아스파라긴, 25번째 글루타민, 216번째 아스파라긴, 55번째 세린, 28번째 리신, 6번째 세린, 27번째 프롤린, 298번째 리신, 113번째 알라닌, 213번째 아스파라긴, 220번째 글루탐산, 141번째 글리신, 163번째 티로신, 253번째 티로신, 178번째 아스파르트산, 93번째 리신, 103번째 리신, 144번째 리신, 139번째 아르기닌, 138번째 리신, 세린7, 151번째 아스파르트산, 297번째 아르기닌, 272번째 리신, 278번째 아스파라긴, 및 265번째 페닐알라닌 중 선택된 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 118의 펩타이드 서열의 80번째 아스파르트산, 82번째 페닐알라닌, 100번째 페닐알라닌, 101번째 아스파르트산, 114번째 페닐알라닌, 119번째 아스파라긴, 120번째 아스파르트산, 142번째 세린, 143번째 글루탐산, 175번째 글리신, 195번째 발린, 196번째 글루탐산, 218번째 히스티딘, 238번째 프롤린 중 선택된 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
요산산화효소 변이체 서브유닛 5 - 예시서열
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체가 Aspergillus Flavus 유래 요산산화효소의 서열 일부를 변형시킨 것인 경우, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 2 내지 50로 표현될 수 있다. 이때, 서열 내의 X는 4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl) phenylalanine (frTet), 4-(6-methyl-s-tetrazin-3-yl)phenylalanine (Tet-v2.0), 3-(4-(1,2,4-triazin-6-yl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-(2-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)ethyl)phenyl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(6-phenyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)propanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)amino)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 3-(4-(2-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)ethyl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)thio)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-((6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)thio)phenyl)propanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)oxy)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-((6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)oxy)phenyl)propanoic acid, 3-(4'-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4'-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(6-(6-(pyridin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)pyridin-3-yl)propanoic acid, 3-(4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 및 2-amino-3-(4-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)propanoic acid 로 이뤄진 군에서 선택된 것이다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체가 Candida Utilis 유래 요산산화효소의 서열 일부를 변형시킨 것인 경우, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 52 내지 117로 표현될 수 있다. 이때, 서열 내의 X는 4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl) phenylalanine (frTet), 4-(6-methyl-s-tetrazin-3-yl)phenylalanine (Tet-v2.0), 3-(4-(1,2,4-triazin-6-yl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-(2-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)ethyl)phenyl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(6-phenyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)propanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)amino)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 3-(4-(2-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)ethyl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)thio)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-((6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)thio)phenyl)propanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)oxy)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-((6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)oxy)phenyl)propanoic acid, 3-(4'-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4'-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(6-(6-(pyridin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)pyridin-3-yl)propanoic acid, 3-(4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 및 2-amino-3-(4-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)propanoic acid 로 이뤄진 군에서 선택된 것이다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체가 Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소의 서열 일부를 변형시킨 것인 경우, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 119 내지 132로 표현될 수 있다. 이때, 서열 내의 X는 4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl) phenylalanine (frTet), 4-(6-methyl-s-tetrazin-3-yl)phenylalanine (Tet-v2.0), 3-(4-(1,2,4-triazin-6-yl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-(2-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)ethyl)phenyl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(6-phenyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)propanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)amino)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 3-(4-(2-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)ethyl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)thio)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-((6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)thio)phenyl)propanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)oxy)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-((6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)oxy)phenyl)propanoic acid, 3-(4'-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4'-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(6-(6-(pyridin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)pyridin-3-yl)propanoic acid, 3-(4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 및 2-amino-3-(4-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)propanoic acid 로 이뤄진 군에서 선택된 것이다.
요산산화효소 변이체 서브유닛 6 - 예시서열과 유사한 서열 포함
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 132 중 선택된 서열과 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치하는 서열을 가질 수 있다. 일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 132 중 선택된 서열과 바로 이전 문장에서 선택된 수치범위 내 일치하는 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 132 중 선택된 서열과 80% 내지 100% 일치하는 서열을 가질 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 132 중 선택된 서열과 95% 이상 일치하는 서열을 가질 수 있다.
요산산화효소 변이체의 제조방법
요산산화효소 변이체의 제조방법 개괄
본 명세서에서는 요산산화효소 변이체의 제조방법을 개시한다. 상기 요산산화효소 변이체의 제조방법에는 다음 구성 요소가 관여된다: 요산산화효소 변이체를 발현시킬 세포주; 특정 종결 코돈을 인식하는 외래 유래 suppressor tRNA(foreign suppressor tRNA); 외래 유래 tRNA 합성효소(foreign tRNA synthetase); 및 상기 종결코돈을 이용하여 비천연 아미노산을 암호화한, 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터. 여기서, 상기 외래 유래 suppressor tRNA 및 상기 외래 유래 tRNA 합성효소는, 상기 발현 세포주 고유의 suppressor tRNA 및 tRNA 합성효소가 아니라, 발현 세포주와 다른 세포에서 유래된 것이다. 따라서, 상기 외래 유래 suppressor tRNA는 상기 발현 세포주 고유의 tRNA 합성효소와 반응하지 않는 것을 특징으로 한다. 상기 외래 유래 tRNA 합성효소는, i) 상기 외래 유래 suppressor tRNA와만 반응하며, ii) 상기 요산산화효소 변이체에 포함시킬 비천연 아미노산에만 활성을 보인다. 결과적으로, 상기 외래 유래 tRNA 합성효소를 사용하는 경우, 상기 외래 유래 suppressor tRNA에 상기 비천연 아미노산을 특이적으로 연결시켜 펩타이드 서열 내 상기 비천연 아미노산을 도입할 수 있다.
상기 요산산화효소 변이체의 제조방법은 1) 상기 세포주 내에서, 2) 상기 외래 유래 suppressor tRNA 및 외래 유래 tRNA 합성효소가 관여되어, 3) 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터에 기반해, 4) 상기 요산산화효소 변이체가 발현되도록 하는 방법이다. 상기 요산산화효소 변이체 제조방법에서, 상기 세포주 내 상기 요산산화효소 변이체가 발현될 수 있다면 각 과정의 순서는 특별히 제한되지 않으며, 필요에 따라 추가적인 과정을 포함할 수 있다.
요산산화효소 변이체 발현 세포주
상기 요산산화효소 변이체의 제조방법은 상기 요산산화효소 변이체를 세포주 내에서 발현시켜 수득하는 것을 특징으로 한다. 상기 요산산화효소 변이체 발현 세포주는 상기 요산산화효소 변이체를 생산할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 다만, 상기 세포주 내 종결 코돈을 인식하는 release facotr가 제 기능을 하는 경우, 상기 release factor가 상기 외래 유래 tRNA와 경쟁적으로 작용하게 되어 수율이 떨어지는 문제가 있다. 따라서, 종결 코돈을 인식하는 release facotr가 비활성화 된 세포주를 사용하는 것이 바람직하다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체를 발현시키는 세포주는 다음에서 선택된 것일 수 있다:
에스케리키아 (Escherichia) 속; 어위니아 (Erwinia) 속; 세라티아 (Serratia) 속; 프로비덴시아 (Providencia) 속; 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속; 슈도모나스 (Pseudomonas) 속; 렙토스피라 (Leptospira) 속; 살모넬라 (Salmonellar) 속; 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속; 하이포모나스 (Hyphomonas) 속; 크로모박테리움 (chromobactorium) 속; 노카디아 (norcardia) 속; 펀자이류 (Fungi); 및 효모류 (Yeast).
일 구현예로, 상기 세포주는 종결 코돈을 인식하여 번역을 종결시키는 release factor가 비활성화 된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 종결 코돈은 엠버 코돈(ambber codon; 5'-UAG-3'), 오커 코돈(ocher codon; 5'-UAA-3'), 및 오팔 코돈(opal codon; 5'-UGA-3') 중 선택된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체를 발현시키는 세포주는 등록공보 KR 1637010 B1에서 사용된 세포주일 수 있다. 구체적으로, 상기 세포주는 E.Coli C321.ΔA.exp(Addgene, ID:49018) 일 수 있다.
외래 유래 suppressor tRNA
상기 외래 유래 suppressor tRNA는 특정 종결코돈을 인식하는 기능을 하는 tRNA이며, 발현 세포주 고유의 tRNA 합성 효소와는 반응하지 않는다. 상기 외래 유래 suppressor tRNA는 상기 외래 유래 tRNA 합성효소와 특이적으로 반응하며, 상기 외래 유래 tRNA 합성효소는 상기 외래 유래 suppressor tRNA에 비천연 아미노산을 연결시키는 기능을 한다. 결과적으로, 상기 외래 유래 suppressor tRNA는 상기 특정 종결코돈을 인식해서, 해당 위치에 상기 비천연 아미노산을 도입할 수 있다.
일 구현예로, 상기 suppressor tRNA는 엠버 코돈(ambber codon; 5'-UAG-3'), 오커 코돈(ocher codon; 5'-UAA-3'), 및 오팔 코돈(opal codon; 5'-UGA-3') 중 선택된 것을 인식할 수 있다. 바람직하게, 상기 suppressor tRNA는 엠버 코돈을 인식하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 suppressor tRNA는 _Methanococcus jannaschii_ 유래의 suppressor tRNA (MjtRNA^Tyr^~CUA~)일 수 있다 (Yang et.al, Temporal Control of Efficient In Vivo Bioconjugation Using a Genetically Encoded Tetrazine-Mediated Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction, Bioconjugate Chemistry, 2020, 2456-2464).
외래 유래 tRNA 합성효소(synthetase)
상기 외래 유래 tRNA 합성효소는 특정 비천연 아미노산과 선택적으로 반응하며, 상기 외래 유래 suppressor tRNA에 상기 특정 비천연아미노산을 연결시키는 기능을 한다. 상기 외래 유래 tRNA 합성효소는 상기 발현 세포주 고유의 suppressor tRNA와는 반응하지 않으며, 상기 외래 유래 suppressor tRNA에만 특이적으로 반응한다. 일 구현예로, 상기 tRNA 합성효소는 테트라진(tetrazine) 유도체 및/또는 트리아진(triazine) 유도체를 포함하는 비천연 아미노산을 상기 외래 유래 suppressor tRNA에 연결하는 기능을 가질 수 있다. 일 구현예로, 상기 tRNA 합성 효소는 Methanococcus jannaschii 유래의 tyrosyl-tRNA 합성효소 (MjTyrRS)일 수 있다 (Yang et.al, Temporal Control of Efficient In Vivo Bioconjugation Using a Genetically Encoded Tetrazine-Mediated Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction, Bioconjugate Chemistry, 2020, 2456-2464). 바람직하게, 상기 tRNA 합성효소는 상기 MjTyrRS의 C11 변형체일 수 있다.
직교적 tRNA/합성효소 페어 (Orthogonal tRNA/syntetase pair)
본 명세서에서는, 1) 외래 유래 tRNA 합성효소와만 특이적으로 반응하는 외래 유래 suppressor tRNA, 및 2) 상기 외래 유래 tRNA 합성효소를 통틀어 직교적 tRNA/합성효소 페어이라 일컫는다. 본 명세서에서 개시하는 요산산화효소 변이체의 제조방법에 있어, 상기 발현 세포주 내에서 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현시키는 것이 중요하며, 이러한 목적을 달성할 수 있다면 그 방법은 크게 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체의 제조방법은 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현할 수 있는 벡터를 상기 세포주에 형질전환하는 것을 포함한다. 구체적으로, 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현할 수 있는 벡터는 Yang et.al (Temporal Control of Efficient In Vivo Bioconjugation Using a Genetically Encoded Tetrazine-Mediated Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction, Bioconjugate Chemistry, 2020, 2456-2464)에 개시된 pDule_C11일 수 있다.
요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터
상기 요산산화효소 변이체의 제조방법은 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터를 발현 세포주에 도입 또는 형질주입시키는 과정을 포함한다. 이하 "요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터" 단락에서 더 구체적으로 설명한다.
요산산화효소 변이체의 제조방법 예시
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체의 제조방법은 다음을 포함한다:
직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현시킬 수 있는 벡터, 및 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터를 포함하는 세포주를 준비하는 것,
여기서, 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어는 외래 유래 suppressor tRNA 및 외래 유래 tRNA 합성효소를 포함하고,
상기 요산산화효소 변이체는 야생형의 요산산화효소 서열 중 3개 이상의 아미노산이 테트라진 유도체 또는 트리아진 유도체를 포함하는 비천연 아미노산으로 치환된 것이고,
상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터에서 상기 비천연 아미노산에 대응하는 코돈은 엠버 코돈(5'-UAG-3')임; 및
상기 세포주를 테트라진 유도체 및/또는 트리아진 유도체를 포함하는 비천연 아미노산이 포함된 배지에서 배양하는 것,
이때, 상기 외래 유래 suppressor tRNA는 엠버 코돈(5'-UAG-3')을 인식할 수 있고,
상기 외래 유래 tRNA 합성효소는 상기 비천연 아미노산을 상기 외래 유래 tRNA에 연결시킬 수 있으며,
이에 따라, 상기 세포주는 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터를 발현시킬 때, 상기 엠버 코돈에 대응하는 위치에 상기 비천연 아미노산이 연결된 펩타이드를 발현하는 것을 특징으로 함.
요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터
요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터 개괄
본 명세서에서는 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터를 개시한다. 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터는 상기 요산산화효소 변이체 서열 중 비천연 아미노산을 종결 코돈을 사용하여 암호화한 것을 특징으로 한다. 일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터에서, 상기 요산산화효소 변이체 서열 중, 표준 아미노산은 자연계에서 발견되는 상기 표준 아미노산과 대응되는 코돈으로 암호화하고, 비천연 아미노산은 종결 코돈으로 암호화한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 종결 코돈은 엠버 코돈(ambber codon; 5'-UAG-3'), 오커 코돈(ocher codon; 5'-UAA-3'), 및 오팔 코돈(opal codon; 5'-UGA-3') 중 선택된 것일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 종결 코돈은 5'-TAG-3', 5'-TAA-3', 및 5'-TGA-3' 중 선택된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터는 상기 발현 세포주에 대하여 코돈 최적화된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터는 대장균 코돈 최적화된 것일 수 있다.
요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터 서열 예시
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체가 Aspergillus Flavus 유래 요산산화효소의 서열 일부를 변형시킨 것인 경우, 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터는 서열번호 152 내지 154 중 선택된 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체가 Candida Utilis 유래 요산산화효소의 서열 일부를 변형시킨 것인 경우, 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터는 서열번호 155 내지 157 중 선택된 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체가 Arthrobacter Globiformis 유래 요산산화효소의 서열 일부를 변형시킨 것인 경우, 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 서열번호 158 내지 160 중 선택된 서열을 포함할 수 있다.
요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터 예시 서열과 유사한 서열 포함
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터는 서열번호 145 내지 160 중 선택된 서열과 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치하는 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터는 서열번호 145 내지 160 중 선택된 서열과 바로 이전 문장에서 선택된 수치범위 내 일치하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터는 서열번호 145 내지 160 중 선택된 서열과 80% 내지 100% 일치하는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터는 서열번호 145 내지 160 중 선택된 서열과 95% 이상 일치하는 서열을 포함할 수 있다.
알부민
알부민 개괄
본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체에 포함된 알부민은 통상적인 알부민 단백질을 지칭한다. 상기 알부민은 요산산화효소와 접합시켜 상기 요산산화효소의 반감기를 증대시키거나, 및/또는 면역원성을 감소시키는 역할을 한다. 상기 알부민은 전술한 기능을 가질 수 있는 것이면 달리 제한되지 않으며, 자연계에서 발견되는 야생형의 알부민이거나, 상기 야생형의 알부민을 유전적으로 조작한 것 (알부민 변이체)일 수 있다.
알부민 예시
일 구현예로, 상기 알부민은 포유류의 알부민일 수 있다. 구체적으로, 상기 알부민은 인간 혈청 알부민(human serum albumin)일 수 있다. 일 구현예로, 상기 알부민은 야생형의 인간 혈청 알부민일 수 있다. 일 구현예로, 상기 알부민은 야생형의 인간 혈청 알부민을 유전적으로 조작한 재조합 알부민(recombinant albumin)일 수 있다.
알부민 서열 예시
일 구현예로, 상기 알부민은 서열번호 133 내지 144 중 선택된 서열로 표현될 수 있다.
알부민 예시 서열과 유사한 서열 포함
일 구현예로, 상기 알부민은 서열번호 133 내지 144 중 선택된 서열과 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치하는 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 알부민은 서열번호 133 내지 144 중 선택된 서열과 바로 이전 문장에서 선택된 수치범위 내 일치하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 알부민은 서열번호 133 내지 144 중 선택된 서열과 80% 내지 100% 일치하는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 알부민은 서열번호 133 내지 144 중 선택된 서열과 95% 이상 일치하는 서열을 포함할 수 있다.
링커
링커 개괄
본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체 및 알부민이 링커를 통해 결합된 것이다. 이때, 상기 링커는 요산산화효소-알부민 접합체 제조 시 요산산화효소 변이체 및 알부민을 연결하기 위해 사용하는 물질을 의미한다.
구체적으로, 상기 링커는 다음을 포함한다: 요산산화효소 변이체와 결합할 수 있는 IEDDA 반응기; 앵커; 및 알부민과 결합할 수 있는 티올(thiol) 반응기. 상기 요산산화효소-알부민 접합체 제조과정에서, 상기 요산산화효소 변이체와 링커는 상기 IEDDA 반응기를 통해 결합하고, 상기 알부민과 링커는 상기 티올 반응기를 통해 결합한다. 구체적인 결합 과정은 해당 단락을 참조한다. 따라서, 상기 요산산화효소-알부민 접합체 내 상기 링커는 그 원형 그대로 존재하지 않고, 1) 요산산화효소-링커 접합부, 2) 앵커, 및 3) 알부민-링커 접합부가 연결된 형태로 존재하게 된다.
링커 구조 1 - IEDDA 반응기
상기 링커는 역 전자-요구 디엘스 엘더 반응(inverse electron-demand diels-alder reaction; IEDDA reaction)을 일으킬 수 있는 IEDDA 반응기를 포함한다. 상기 IEDDA 반응기는 상기 요산산화효소 변이체와 연결될 수 있는 구성으로, 상기 요산산화효소 변이체의 비천연 아미노산의 잔기와 반응하여 요산산화효소-링커 접합부를 형성할 수 있다. 일 구현예로, 상기 IEDDA 반응기는 디에노필 작용기(Dienophile functional group)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 IEDDA 반응기는 trans-cyclooctene 또는 그 유도체일 수 있다.
일 구현예로, 상기 IEDDA 반응기는 다음 중 선택된 것일 수 있다:
Figure pat00012
, 및
Figure pat00013
.
링커 구조 2 - 티올 반응기
상기 링커는 티올기와 화학 반응을 일으킬 수 있는 티올 반응기를 포함한다. 상기 티올기는 상기 알부민과 연결될 수 있는 구성으로, 상기 알부민에 포함된 티올기와 반응하여 알부민-링커 접합부를 형성할 수 있다. 일 구현예로, 상기 티올 반응기는 maleimide (MAL) 또는 그 유도체, 및/또는 3-arylpropiolonitriles (APN) 또는 그 유도체일 수 있다.
구체적으로, 상기 티올 반응기는 다음 중 선택된 것일 수 있다:
Figure pat00014
,
Figure pat00015
, 및
Figure pat00016
.
링커 구조 3 - 앵커
상기 링커는 상기 IEDDA 반응기 및 상기 티올 반응기를 연결하는 앵커를 포함한다. 상기 앵커는 상기 IEDDA 반응기 및 상기 티올 반응기를 한 분자로 엮어주며, 상기 요산산화효소 및/또는 알부민의 활성에 영향을 미치지 않는 한 그 구조가 특별히 제한되지는 않는다. 일 구현예로, 상기 앵커는 선형 구조를 가질 수 있다. 또 다른 구현예로, 상기 앵커는 가지형 구조를 가질 수 있다. 일 구현예로, 상기 앵커는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol;PEG)을 포함할 수 있다.
링커 예시
일 구현예로, 상기 링커는 다음 중 선택된 어느 하나일 수 있다:
Figure pat00017
,
Figure pat00018
,
Figure pat00019
,
Figure pat00020
, 및
Figure pat00021
.
요산산화효소-링커 접합부
요산산화효소-링커 접합부 개괄
본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소-링커 접합부를 포함한다. 상기 요산산화효소-링커 접합부는 요산산화효소 변이체 및 링커가 IEDDA 반응을 통해 결합하여 생성된 것이다. 구체적으로, 상기 IEDDA 반응은 요산산화효소 변이체에 포함된 비천연 아미노산의 잔기 및 링커에 포함된 IEDDA 반응기 사이의 반응을 지칭하며, 상기 비천연 아미노산의 잔기 및 상기 IEDDA 반응기의 종류에 따라 반응 후 요산산화효소-링커 접합부의 구조가 결정된다. 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 3개 이상의 알부민 접합체를 포함하므로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 3개 이상의 요산산화효소-링커 접합부를 포함한다. 전술한 바 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 3개 이상의 서브유닛-알부민 접합체를 포함한다. 상기 서브유닛-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체 서브유닛과 알부민이 링커를 통해 접합된 것이다. 따라서, 각각의 상기 서브유닛-알부민 접합체는 적어도 하나의 요산산화효소-링커 접합부를 포함한다.
요산산화효소-링커 접합부 위치
상기 요산산화효소-링커 접합부는 상기 요산산화효소 변이체의 비천연 아미노산 및 링커의 앵커를 연결하는 위치에 있다. 전술한 바, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 상기 비천연 아미노산의 잔기 및 상기 IEDDA 반응기의 반응을 통해 형성된 것이므로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 상기 요산산화효소 변이체에 포함된 비천연 아미노산의 잔기 해당하는 위치에 있다. 달리 표현하면, 상기 요산산화효소-링커 접합부는 상기 링커의 IEDDA 반응기에 해당하는 위치에 있다.
요산산화효소-링커 접합부 형성반응
상기 요산산화효소-링커 접합부를 형성하는 반응은 역 전자-요구 디엘스 엘더 반응(inverse electron-demand diels-alder reaction; IEDDA reaction)의 일종이다. 구체적인 반응 양태는 상기 상기 요산산화효소 변이체에 포함된 비천연 아미노산의 작용기 및 링커에 포함된 IEDDA 반응기의 종류에 따라 달라질 수 있다. 일 구현예로, 상기 요산산화효소-링커 접합부 형성반응은 다음 중 어느 하나일 수 있다:
Figure pat00022
, 및
Figure pat00023
.
여기서, 상기 A2는 IEDDA 반응기를 제외한 링커 부분이며, 상기 Rx는 상기 비천연 아미노산의 종류에 따라 달라질 수 있고(전술한 비천연 아미노산 예시 부분 참고), 상기 A1은 상기 비천연 아미노산의 테트라진 작용기를 제외한 상기 요산산화효소 변이체 부분이다.
요산산화효소-링커 접합부 구조
일 구현예로, 상기 요산산화효소-링커 접합부 구조는 다음 중 어느 하나일 수 있다:
Figure pat00024
,
여기서, 상기 R은 H, CH3,
Figure pat00025
, 및
Figure pat00026
중 선택된 것이며,
상기 (1) 부분은 요산산화효소 변이체에 연결되어 있으며, 상기 (2) 부분은 링커의 앵커 부분에 연결되어 있음; 및
Figure pat00027
여기서, 상기 (1) 부분은 요산산화효소 변이체에 연결되어 있으며, 상기 (2) 부분은 링커의 앵커 부분에 연결되어 있음
알부민-링커 접합부
알부민-링커 접합부 개괄
본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체는 알부민-링커 접합부를 포함한다. 상기 알부민-링커 접합부는 알부민에 포함된 티올기 및 링커에 포함된 티올 반응기가 결합하여 생성된 것이다. 이때, 상기 결합을 매개하는 상기 알부민의 티올기는 알부민의 반감기 증대 기능을 저해하지 않기 위해 알부민의 FcRn-결합 도메인에서 이격된 위치에 있는 것을 특징으로 한다. 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 3개 이상의 알부민 접합체를 포함하므로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 3개 이상의 알부민-링커 접합부를 포함한다. 전술한 바 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 3개 이상의 서브유닛-알부민 접합체를 포함한다. 상기 서브유닛-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체 서브유닛과 알부민이 링커를 통해 접합된 것이다. 따라서, 각각의 상기 서브유닛-알부민 접합체는 적어도 하나의 알부민-링커 접합부를 포함한다.
알부민-링커 접합부 위치
상기 알부민-링커 접합부는 상기 알부민의 티올기 및 상기 링커의 앵커를 연결하는 위치에 있다. 본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소에 알부민을 접합시켜 체내 반감기를 증대시킨다는 목적이 있으므로, 상기 알부민과 상기 링커가 연결되는 위치는 알부민의 FcRn 결합 도메인과 이격된 위치여야 한다. 전술한 바, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 상기 알부민의 티올기 및 상기 링커의 티올 반응기가 반응하여 형성된 것이므로, 상기 알부민-링커 접합부는 상기 알부민의 티올기에 해당하는 위치에 있다. 달리 표현하면, 상기 알부민-링커 접합부는 상기 링커의 티올 반응기에 해당하는 위치에 있다. 상기 알부민-링커 접합부의 위치는 알부민에 포함된 티올기 중 알부민의 구조, 기능, 및/또는 활성에 영향을 미치지 않는 부분에서 선택된다.
알부민-링커 접합부 위치 예시
일 구현예로, 상기 알부민-링커 접합부는 서열번호 133 내지 S016로 표현되는 알부민의 34번째 시스테인 잔기에 포함된 티올기에 위치한 것일 수 있다.
알부민-링커 접합부 형성반응
상기 알부민-링커 접합부를 형성하는 반응은 티올 반응의 일종이다. 구체적인 반응 양태는 상기 링커에 포함된 티올 반응기의 종류에 따라 달라질 수 있다.
일 구현예로, 상기 알부민-링커 접합부 형성반응은 다음 중 어느 하나일 수 있다:
Figure pat00028
, 및
Figure pat00029
.
여기서, 상기 R1은 상기 티올기를 제외한 알부민 부분이며, R2는 상기 티올 반응기를 제외한 링커 부분이다.
알부민-링커 접합부 구조 예시
일 구현예로, 상기 알부민-링커 접합부 구조는 다음 중 어느 하나일 수 있다:
Figure pat00030
;
Figure pat00031
; 및
Figure pat00032
,
여기서, 상기 (1) 부분은 알부민에 연결되어 있으며, 상기 (2) 부분은 링커의 앵커 부분에 연결되어 있다.
앵커
앵커 개괄
본 명세서에서 개시하는 앵커는 상기 요산산화효소-링커 접합부 및 상기 알부민-링커 접합부 사이에 연결된 구성을 지칭한다. 상기 앵커는 상기 요산산화효소 변이체, 요산산화효소-링커 접합부, 알부민-링커 접합부, 및 알부민을 하나의 구조체로 엮어주며, 앵커의 구조에 따라 요산산화효소-알부민 접합체에 포함된 요산산화효소 변이체 및 알부민의 거리를 조절하는 기능을 할 수 있다.
앵커 구조 예시
일 구현예로, 상기 앵커는 다음 중 선택된 어느 하나일 수 있다:
Figure pat00033
(A01),
Figure pat00034
(A02),
Figure pat00035
(A03),
Figure pat00036
(A04), 및
Figure pat00037
(A05).
여기서, 상기 J1은 요산산화효소-링커 접합부, 상기 J2는 알부민-링커 접합부이다.
요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법
요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법 개괄
본 명세서에서는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법을 개시한다. 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법에는 다음 요소가 관여된다: 요산산화효소 변이체; 링커; 및 알부민. 이때, 각각의 요소는 각 단락에서 설명된 바와 같다.
상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법은 상기 각 요소를 적절히 반응시켜 위에서 설명한 요산산화효소-알부민 접합체를 제조하는 것이다. 구체적으로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법은 상기 요산산화효소 변이체에 포함된 비천연 아미노산 잔기와 상기 링커의 IEDDA 반응기를 반응시켜 요산산화효소-링커 접합부를 만드는 것 (요산산화효소-링커 접합 반응); 및 상기 알부민에 포함된 티올기와 상기 링커의 티올 반응기를 반응시켜 알부민-링커 접합부를 만드는 것 (알부민-링커 접합 반응)을 포함한다. 이때, 상기 요산산화효소-링커 접합 반응 및 알부민-링커 접합 반응을 일으키는 순서는 무관하며, 두 반응을 동시에 일으킬 수도 있다. 또한, 각 반응의 순서에 따라 반응의 중간 산물이 생성될 수 있다. 이하 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법을 더 구체적으로 설명한다.
요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법 1 - 알부민과 링커를 먼저 결합시키는 방법
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법은 다음을 포함한다:
알부민 및 링커를 반응시키는 것,
여기서, 상기 알부민의 티올기 및 상기 링커의 티올 반응기가 접촉하여 알부민-링커 접합체가 생성됨; 및
상기 알부민-링커 접합체 및 요산산화효소 변이체를 반응시키는 것,
여기서, 상기 알부민-링커 접합체의 IEDDA 반응기 및 상기 요산산화효소 변이체의 비천연 아미노산에 포함된 디엔 작용기가 접촉하여 요산산화효소-알부민 접합체가 생성됨.
상기 요산산화효소 변이체, 상기 링커, 및 상기 알부민 및 이에 포함된 요소들은 위에서 설명된 바와 같다.
요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법 2 - 요산산화효소와 링커를 먼저 결합시키는 방법
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법은 다음을 포함한다:
요산산화효소 변이체 및 링커를 반응시키는 것,
여기서, 상기 링커의 IEDDA 반응기 및 상기 요산산화효소 변이체의 비천연 아미노산에 포함된 디엔 작용기가 접촉하여 요산산화효소-링커 접합체가 생성됨; 및
상기 요산산화효소-링커 접합체 및 알부민을 반응시키는 것,
여기서, 상기 알부민의 티올 반응기 및 상기 요산산화효소-링커 접합체의 티올기가 접촉하여 요산산화효소-알부민 접합체가 생성됨.
상기 요산산화효소 변이체, 상기 링커, 및 상기 알부민 및 이에 포함된 요소들은 위에서 설명된 바와 같다.
요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법 3 - 요산산화효로, 링커, 및 알부민을 동시에 결합시키는 방법
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법은 반응물들을 모두 첨가하여 동시에 반응시킴으로써 수행 수 있다.
이때, 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법은 다음을 포함한다:
요산산화효소 변이체, 링커, 및 알부민을 반응시키는 것,
여기서, 상기 알부민의 티올기 및 상기 링커의 티올 반응기가 반응을 일으켜 접합되고,
상기 요산산화효소 변이체의 비천연 아미노산에 포함된 디엔 작용기 및 상기 링커의 IEDDA 반응기가 반응을 일으켜 접합되며,
상기 반응 결과 요산산화효소-알부민 접합체가 생성됨.
상기 요산산화효소 변이체, 상기 링커, 및 상기 알부민 및 이에 포함된 요소들은 위에서 설명된 바와 같다.
요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법 특징 1 - 생물직교반응을 이용하여 체내 안정성이 높음
상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법은 상기 요산산화효소 변이체 및 상기 알부민을 생물직교반응의 일종인 IEDDA 반응을 이용하여 접합한다. 상기 접합 반응에 관여하는 화학작용기는 체내 분자 내 존재하지 않는 것이므로, 상기 제조방법을 통해 제조된 요산산화효소-알부민 접합체는 체내에 도입되어도 그 결합의 안정성이 매우 높다는 장점을 가진다.
요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법 특징 2 - IEDDA 반응을 이용하여 수율이 매우 높음
상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법에서, 요산산화효소 변이체 및 링커를 접합시키기 위해 역 전자 디엘스-엘더 반응(inverse electron demand diels-alder reaction; IEDDA 반응)을 사용한다. 상기 IEDDA 반응은 매우 빠른 반응속도로 일어나고, 반응 환경 조성이 수월하기 때문에, SPAAC(Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition) 반응을 이용하는 경우와 비교하여 접합체를 제조할 때 수율이 매우 높다는 장점을 가진다.
요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법 특징 3 - 접합체 당 3개, 혹은 4개의 알부민을 포함
본 명세서에서 제공하는 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법에 따르면, 수율이 매우 높은 IEDDA 반응을 이용하기 때문에, 요산산화효소 한 단위 당 3개, 혹은 4개의 알부민이 접합된 요산산화효소-알부민 접합체를 수득할 수 있다. 이는 선행기술 KR 1637010 B1에 개시된 요산산화효소-알부민 접합체 제조방법에 따를 경우 요산산화효소 한 단위 당 1개, 혹은 2개의 알부민이 접합된 요산산화효소-알부민 접합체를 수득하는 것이 한계인 것과 비교해 분명히 개선된 특징이다.
요산산화효소-링커 접합 방법
본 명세서에서 제공하는 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법은 요산산화효소 변이체 및 링커를 접합하는 것을 포함한다. 구체적으로, 상기 요산산화효소-링커 접합 방법은 상기 요산산화효소 변이체의 비천연 아미노산 잔기와 상기 링커의 IEDDA 반응기를 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 요산산화효소-링커 접합 방법은 알부민과 링커가 접합하는 부위, 혹은 알부민과 링커의 접합 여부에 영향을 받지 않는다. 따라서, 이하 개시하는 요산산화효소-링커 접합 방법은 "요산산화효소 변이체"에 "링커"를 결합시키는 것, 및 "요산산화효소 변이체"에 "알부민-링커 접합체"를 결합시키는 것 모두에 적용할 수 있다. 상기 요산산화효소-링커 접합 방법은 알부민-링커 접합 방법과 독립적으로 수행될 수 있다.
상기 요산산화효소-링커 접합방법은 "요산산화효소-링커 접합부 형성반응" 단락에서 설명된 반응을 일으킬 수 있는 방법이면 달리 제한되지 않으며, 통상의 기술자가 상기 반응을 일으킬 수 있는 공지된 방법을 적절하게 선택한 것일 수 있다.
여기서, 요산산화효소-링커 접합 방법으로 테트라진 작용기 및 trans-cyclooctene 작용기 간의 IEDDA 반응을 일으키는 경우, 염기성 pH 환경에서는 테트라진 작용기가 환원되어 IEDDA 반응을 일으키지 않을 가능성이 커진다. 따라서, 상기 IEDDA 반응은 중성 pH 환경에서 진행하는 것이 바람직하다. 일 구현예로, 상기 요산산화효소-링커 접합 방법은 중성 pH 환경에서 수행될 수 있다. 일 구현예로, 상기 요산산화효소-링커 접합 방법은 pH 8.0 이하, pH 9.0 이하, pH 10.0 이하, pH 11.0 이하, pH 11.0 이하, pH 13.0 이하, pH 14.0 이하의 환경에서 수행될 수 있다.
알부민-링커 접합 방법
본 명세서에서 제공하는 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법은 알부민 및 링커를 접합하는 것을 포함한다. 구체적으로, 상기 알부민-링커 접합 방법은 상기 알부민의 티올기와 상기 링커의 티올 반응기를 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 알부민-링커 접합방법은 요산산화효소 변이체와 링커가 접합하는 부위, 혹은 요산산화효소 변이체와 링커의 접합 여부에 영향을 받지 않는다. 따라서, 이하 개시하는 알부민-링커 접합 방법은 "알부민"에 "링커"를 결합시키는 것, 및 "알부민"에 "요산산화효소-링커 접합체"를 결합시키는 것 모두에 적용할 수 있다. 상기 알부민-링커 접합 방법은 상기 요산산화효소-링커 접합 방법과 독립적으로 수행될 수 있다.
요산산화효소-알부민 접합체의 용도
요산산화효소-알부민 접합체의 용도 개괄
본 명세서에서는 요산산화효소-알부민 접합체의 용도를 개시한다. 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 체내에서 높은 반감기를 가져 안정적이고, 면역원성이 낮아 탁월한 요산 강하 효과를 가진다. 따라서, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산이 원인이 되는 질환, 질병, 및/또는 적응증의 예방 또는 치료 용도로 사용할 수 있다.
요산산화효소-알부민 접합체의 예방 및/또는 치료 용도 1 - 적응증
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 고요산혈증, 급성 통풍성 관절염, 간헐기 통풍, 및 만성 결절성 통풍, 만성 신장 질환(Chronic Kidney Disease) 및/또는 종양 용해 증후군(Tumor Lysis Syndrome; TLS)의 예방 또는 치료 용도로 사용할 수 있다.
요산산화효소-알부민 접합체의 예방 및/또는 치료 용도 2 - 투여방법
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산이 원인이 되는 질환, 질병, 및/또는 적응증의 예방 또는 치료를 위해 적절한 제제화를 거쳐, 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 투여 방법은 경구 투여, 비경구 투여, 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여, 및 피하 투여 중 선택된 하나일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 투여 방법은 정맥 점적주입(intravenous infusion)일 수 있다.
요산산화효소-알부민 접합체의 예방 및/또는 치료 용도 3 - 투여용량
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산이 원인이 되는 질환, 질병, 및/또는 적응증의 예방 또는 치료를 위해 적절한 제제화를 거쳐, 적절한 투여 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 투여 용량은 요산산화효소-알부민 접합체 기준 약 0.01 mg/kg 내지 1000mg/kg 용량으로 투여될 수 있다.
요산산화효소-알부민 접합체의 예방 및/또는 치료 용도 4 - 투여주기
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산이 원인이 되는 질환, 질병, 및/또는 적응증의 예방 또는 치료를 위해 적절한 제제화를 거쳐, 적절한 투여 주기로 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 투여 주기는 상기 적절한 투여 용량의 요산산화효소-알부민 접합체를을 1일 1회 투여하는 것일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 투여 주기는 상기 적절한 투여 용량의 요산산화효소-알부민 접합체를을 1일 2회 이상 나누어 투여하는 것일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 투여 주기는 상기 적절한 투여 용량의 요산산화효소-알부민 접합체를을 1시간, 2시간, 6시간, 12시간, 24시간, 2일, 3일, 일주일, 이주일, 한 달, 및/또는 세 달 간격으로 투여하는 것일 수 있다.
요산산화효소-알부민 접합체를 포함하는 약학적 조성물
요산산화효소-알부민 접합체를 포함하는 약학적 조성물 개괄
상기 요산산화효소-알부민 접합체를 요산이 원인이 되는 질환, 질병, 및/또는 적응증에 사용하기 위해서는 적절한 제제화를 거쳐야 한다. 본 명세서에서는 요산산화효소-알부민 접합체를 치료제로 사용하기 위해 적절히 제제화 된 약학적 조성물을 개시하며, 제제화하기 위해 필요한 약학적으로 허용되는 담체를 개시한다. 예를 들면, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 경구용, 비경구용, 주사액, 에어로졸제, 및/또는 경피용으로 제제화될 수 있으며, 이를 위해 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
제제화를 위한 구성 1 - 경구용 제제
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 트로키제 (troches), 로젠지 (lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화될 수 있다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체를 경구 투여용으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유 등을 사용할 수 있으며, 감미제, 방향제, 시럽제 등도 사용할 수 있다. 나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다.
제제화를 위한 구성 2 - 비경구용 제제
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림으로 제제화될 수 있다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체를 비경구 투여용으로 제제화하기 위해, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
제제화를 위한 구성 3 - 주사액 제제
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체를 주사액으로 제제화하기 위해, 상기 요산산화효소-알부민 접합체를 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다.
제제화를 위한 구성 4 - 에어로졸제 제제
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체에 추진제 등을 첨가제와 함께 배합하여 수분산된 농축물, 또는 습윤 분말을 제조하여 에어로졸제로 제제화할 수 있다.
제제화를 위한 구성 5 - 경피용 제제
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체를 경피용으로 제제화하는 경우, 상기 요산산화효소-알부민 접합체에 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 담체로 첨가하여 연고, 크림, 도포용 파우더, 오일, 피부 외용제 등을 제조할 수 있다.
제제화를 위한 구성 6 - 어쥬번트 및 기타 구성
일 구현예로, 상기 요산산화호소-알부민 접합체를 포함하는 약학적 조성물은 물, 염수, 덱스트로즈, 에탄올, 글리세롤, 염화나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 솔비톨, 락토즈, 젤라틴, 알부민, 수산화알루미늄, 프로인트 불완전 보조제(Freund's Incomplete Adjuvant) 및 완전 항원보조제(Complete Adjuvant)(Pifco Laboratories, Detroit, Mich.), 머크 항원보강제 65(Merck and Company, Inc., Rahway, NJ.), Alhydrogel(Al(OH)3), 수산화알루미늄 겔(알룸), 또는 인산알루미늄과 같은 알루미늄 염, AS04 series, MF, squalene, MF59, QS21, 칼슘, 철 또는 아연염, 아실화 티로신의 불용성 현탁액, 아실화 과당, 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도된 폴리사카라이드, 폴리포스파젠, 생분해성 미세구, 및 퀼(Quil) A, 톨-라이크 리셉터(TLR) 작용제, PHAD[Avanti polar lipid, Monophosphoryl Lipid A (synthetic)], 모노포스포릴 지질 A(MPL, monophosphoryl Lipid A), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, 알루미늄 염, 사이토카인, 사포닌, Prolactin, growth hormone deoxycholic acid, betaglucan, polyribonucleotides, 무라밀 다이펩타이드(MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람-음성 박테리아의 리포폴리사카라이드(LPS), 폴리포스파젠, 에멀젼, 비로솜, 코크리트(cochleate), 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLG) 마이크로입자, 폴록사머 입자, 마이크로입자, 리포솜, 또는 이들의 적절한 조합을 포함할 수 있다.
발명의 가능한 실시예
요산산화효소-알부민 접합체 1
실시예 1, 요산산화효소-알부민 접합체
다음 [화학식 1]로 표현되는, 요산산화효소-알부민 접합체:
[화학식 1] Uox-[J1-A-J2-HSA]n
여기서, 상기 Uox는 요산산화효소 변이체, 상기 J1은 요산산화효소-링커 접합부, 상기 A는 앵커, 상기 J2는 알부민-링커 접합부, 및, 상기 HSA는 인간 혈청 알부민 (Human Serum Albumin)을 의미하며,
상기 요산산화효소 변이체는 디엔 작용기(dien functional group)를 가지는 비천연 아미노산을 3개 이상 포함하고,
상기 요산산화효소-링커 접합부는 상기 비천연 아미노산의 디엔 작용기 및 상기 앵커에 연결된 디에노필 작용기(dienophile functional group)가 역 전자 요구 디엘스-알더(Inverse Electron Demand Diels-Alder; IEDDA) 반응을 통해 결합된 것이고,
상기 n은 3 또는 4임.
실시예 2, 요산산화효소 미생물 유래 한정
실시예 1에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체는 미생물 유래 야생형 요산산화효소 서열에서 3개 이상의 아미노산이 상기 비천연 아미노산으로 치환된 것이며, 상기 미생물은 다음 중 선택된 것임: Aspergillus Flavus, Arthrobacter Globiformis, 및 Candida Utilis.
실시예 3, 변이체 서브유닛 4개
실시예 1 내지 2 중 어느 하나에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체는 요산산화효소 변이체 서브유닛 4개가 올리고머화 된 사량체이고, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 야생형 요산산화효소 서브유닛 서열에서 하나 이상의 아미노산이 상기 비천연 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체.
실시예 4, 변이체 서브유닛 3개, 야생형 서브유닛 하나
실시예 1 내지 2 중 어느 하나에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체는 요산산화효소 변이체 서브유닛 3개 및 야생형 요산산화효소 서브유닛 1개가 올리고머화된 사량체이고, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 야생형 요산산화효소 서브유닛 서열에서 하나 이상의 아미노산이 상기 비천연 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체.
실시예 5, 비천연 아미노산, 테트라진 작용기 한정
실시예 1 내지 4 중 어느 하나 있어서, 상기 디엔 작용기는 트리아진 작용기 또는 그 유도체, 또는 테트라진 작용기 또는 그 유도체인 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체.
실시예 6, 비천연 아미노산 예시(명칭)
실시예 5에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 다음 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체:
4-(1,2,3,4-tetrazin-3-yl) phenylalanine (frTet); 4-(6-methyl-s-tetrazin-3-yl)phenylalanine (Tet-v2.0); 3-(4-(1,2,4-triazin-6-yl)phenyl)-2-aminopropanoic acid; 2-amino-3-(4-(2-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)ethyl)phenyl)propanoic acid; 2-amino-3-(4-(6-phenyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)propanoic acid; 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)amino)phenyl)-2-aminopropanoic acid; 3-(4-(2-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)ethyl)phenyl)-2-aminopropanoic acid; 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)thio)phenyl)-2-aminopropanoic acid; 2-amino-3-(4-((6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)thio)phenyl)propanoic acid; 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)oxy)phenyl)-2-aminopropanoic acid; 2-amino-3-(4-((6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)oxy)phenyl)propanoic acid; 3-(4'-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)-2-aminopropanoic acid; 2-amino-3-(4'-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)propanoic acid; 2-amino-3-(6-(6-(pyridin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)pyridin-3-yl)propanoic acid; 3-(4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)-2-aminopropanoic acid; 및 2-amino-3-(4-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)propanoic acid.
실시예 7, 비천연 아미노산 예시(화학식)
실시예 5에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 도 23 내지 27의 표에서 각각 독립적으로 선택된 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체.
실시예 8, 서브유닛 서열 예시 1, Asp.Uox
실시예 2 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 다음에서 선택된 서열로 표현되는 요산산화효소-알부민 접합체:
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SAVKAARYGKDNVRVYKVHKDEKTGVQTVYEMTVCVLLEGEIETSYTKXDNSVIVATDSIKNTIYITAKQNPVTPPELFGSILGTHFIEKYNHIHAAHVNIVCHRWTRMDIDGKPHPHSFIRDSEEKRNVQVDVVEGKGIDIKSSLSGLTVLKSTNSQFWGFLRDEYTTLKETWDRILSTDVDATWQWKNFSGLQEVRSHVPKFDATWATAREVTLKTFAEDNSASVQATMYKMAEQILARQQLIETVEYSLPNKHYFEIDLSWHKGLQNTGKNAEVFAPQSDPNGLIKCTVGRSSLKSKL (서열번호 46);
SAVKAARYGKDNVRVYKVHKDEKTGVQTVYEMTVCVLLEGEIETSYTKADNSVIVATDSIKNTIYITAKQNPVTPPELFGSILGTHFIEKYNHIHAAHVNIVCHRWTRMDIDGKPHPHSFIRDSEEKRNVQVDVVEGKGIDIKSSLSXLTVLKSTNSQFWGFLRDEYTTLKETWDRILSTDVDATWQWKNFSGLQEVRSHVPKFDATWATAREVTLKTFAEDNSASVQATMYKMAEQILARQQLIETVEYSLPNKHYFEIDLSWHKGLQNTGKNAEVFAPQSDPNGLIKCTVGRSSLKSKL (서열번호 47);
SAVKAARYGKDNVRVYKVXKDEKTGVQTVYEMTVCVLLEGEIETSYTKADNSVIVATDSIKNTIYITAKQNPVTPPELFGSILGTHFIEKYNHIHAAHVNIVCHRWTRMDIDGKPHPHSFIRDSEEKRNVQVDVVEGKGIDIKSSLSGLTVLKSTNSQFWGFLRDEYTTLKETWDRILSTDVDATWQWKNFSGLQEVRSHVPKFDATWATAREVTLKTFAEDNSASVQATMYKMAEQILARQQLIETVEYSLPNKHYFEIDLSWHKGLQNTGKNAEVFAPQSDPNGLIKCTVGRSSLKSKL (서열번호 48);
SAVKAARYGKDNVRVYKVHKDEKTGVQTVYEMTVCVLLEGEIETSYTKADNSVIVATDSIKNTIYITAKQNPVTPPELFGSILGTHFIEKYNHIHAAHVNIVCHRWTRMDIDGKPHPHSFIRDSEEKRNVQVDVVEGKGIDIKSSLSGLTVLKSTNSQFWGFLRDEYTTLKETWDRILSTDVDATWQWKNFSGLQEVRSHVPKFDATWATAREVTLKTFAEDNSASVQATMYKMAEQILARQQLIETVEYSLPNKHYFEIDLSWHKGLQNTGKNAEVFAPQSDPNGLIKCTVGRSXLKSKL (서열번호 49); 및
SAVKAARYGKDNVRVYKVHKDEKTGVQTVYEMTVCVLLEGEIETSYXKADNSVIVATDSIKNTIYITAKQNPVTPPELFGSILGTHFIEKYNHIHAAHVNIVCHRWTRMDIDGKPHPHSFIRDSEEKRNVQVDVVEGKGIDIKSSLSGLTVLKSTNSQFWGFLRDEYTTLKETWDRILSTDVDATWQWKNFSGLQEVRSHVPKFDATWATAREVTLKTFAEDNSASVQATMYKMAEQILARQQLIETVEYSLPNKHYFEIDLSWHKGLQNTGKNAEVFAPQSDPNGLIKCTVGRSSLKSKL (서열번호 50),
여기서, 상기 X는 도 23 내지 27의 표에 개시된 비천연 아미노산 중 선택된 것이다.
실시예 9, 서브유닛 서열 예시 2, Candida.Uox
실시예 2 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 다음에서 선택된 서열로 표현되는 요산산화효소-알부민 접합체:
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKXKL(서열번호 52);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQXPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 53);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKX(서열번호 54);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNXKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 55);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYXHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 56);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRXGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 57);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDXKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 58);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTXL(서열번호 59);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNXCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 60);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVXGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 61);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKXKTKL(서열번호 62);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDXQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 63);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKXKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 64);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENXNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 65);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCXFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 66);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKXHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 67);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTXDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 68);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLXPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 69);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADXGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 70);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLXNDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 71);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFXIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 72);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKXLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 73);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVXDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 74);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVXKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 75);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILXKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 76);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFAXENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 77);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEXTKL(서열번호 78);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAXAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 79);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTXADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 80);
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MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQXTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 84);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLXWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 85);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIXLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 86);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGXFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 87);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDXKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 88);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYXYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 89);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKXTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 90);
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MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQARXITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 102);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSXDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 103);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFXGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 104);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVXSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 105);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTXRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 106);
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MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYXRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 111);
MSTTLSXSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 112);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKXLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 113);
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVXKEKTKL(서열번호 114);
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MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDXELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 116); 및
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYXLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 117),
여기서, 상기 X는 도 23 내지 27의 표에 개시된 비천연 아미노산 중 선택된 것이다.
실시예 10, 서브유닛 서열 예시 3, Arth.Uox
실시예 2 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 다음에서 선택된 서열로 표현되는 요산산화효소-알부민 접합체:
MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARXGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC(서열번호 119);
MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGXATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC(서열번호 120);
MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGXDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC(서열번호 121);
MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFXWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC(서열번호 122);
MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFXWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC(서열번호 123);
MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRIXDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC(서열번호 124);
MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINXHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC(서열번호 125);
MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGXEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC(서열번호 126);
MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSXQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC(서열번호 127);
MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLXETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC(서열번호 128);
MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTXEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC(서열번호 129);
MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVXVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC(서열번호 130);
MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETXSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC(서열번호 131); 및
MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHXEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC(서열번호 132),
여기서, 상기 X는 도 23 내지 27의 표에 개시된 비천연 아미노산 중 선택된 것이다.
실시예 11, 요산산화효소-링커 접합부 예시
실시예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 요산산화효소-링커 접합부는 다음 중 선택된 어느 하나인 요산산화효소-알부민 접합체:
Figure pat00038
,
여기서, 상기 R은 H, CH3,
Figure pat00039
, 및
Figure pat00040
중 선택된 것임; 및
Figure pat00041
,
여기서, 상기 (1) 부분은 요산산화효소 변이체에 연결되어 있으며, 상기 (2) 부분은 링커의 앵커 부분에 연결되어 있다.
실시예 12, 알부민 서열 한정
실시예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 알부민은 다음 중 선택된 서열로 표현되는 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체:
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (서열번호 133);
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실시예 13, 알부민-링커 접합체 한정
실시예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 알부민-링커 접합부는 상기 알부민에 포함된 티올기 및 상기 앵커에 연결된 티올 반응기가 반응하여 형성된 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체.
실시예 14, 알부민 접합 위치 한정
실시예 13에 있어서, 상기 알부민의 서열은 서열번호 133 내지 144에서 선택된 것이고, 상기 알부민-링커 접합부는 상기 알부민 서열 중 34번째 시스테인 잔기의 티올기 및 상기 앵커에 연결된 티올 반응기가 반응하여 형성된 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체.
실시예 15, 알부민 링커 접합부 한정
실시예 13 내지 실시예 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 알부민-링커 접합부는 도 30의 표에서 선택된 것인 요산산화효소-알부민 접합체.
실시예 16, 앵커 한정
실시예 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 앵커는 도 40의 표에서 선택된 것인 요산산화효소-알부민 접합체.
요산산화효소-알부민 접합체 2
실시예 17, 요산산화효소-알부민 접합체, 서브유닛 관점
다음을 포함하는 요산산화효소-알부민 접합체:
3개 또는 4개의 알부민-서브유닛 접합체, 이때, 각각의 상기 알부민-서브유닛 접합체는 다음 [화학식 2]로 표현됨:
[화학식 2] p'-J1-A-J2-HSA,
여기서, 상기 p'은 요산산화효소 변이체 서브유닛이며, 상기 J1은 요산산화효소-링커 접합부이고, 상기 A는 앵커, 상기 J2는 알부민-링커 접합부, 및 상기 HSA는 인간 혈청 알부민 (Human Serum Albumin)을 의미하고,
상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 야생형 요산산화효소 서브유닛의 서열 중 하나 이상의 아미노산이 테트라진 작용기(tetrazin functional group) 또는 트리아진 작용기(triazine functional group)를 포함하는 비천연 아미노산으로 치환된 것이며,
상기 요산산화효소-링커 접합부는 상기 비천연 아미노산의 테트라진 작용기 또는 트리아진 작용기, 및 상기 앵커에 연결된 trans-cyclooctene 작용기가 역 전자 요구 디엘스-알더(Inverse Electron Demand Diels-Alder; IEDDA) 반응을 일으켜 형성된 것임; 및
선택적으로, 1개의 요산산화효소 변이체 서브유닛,
여기서, 상기 요산산화효소-알부민 접합체가 알부민-서브유닛 복합체를 3개 포함하는 경우, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체 서브유닛을 1개 포함하고, 각각의 알부민-서브유닛 복합체에 포함된 요산산화효소 변이체 서브유닛 및 1개의 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화하여 사량체를 이루며,
상기 요산산화효소-알부민 접합체가 알부민-서브유닛 복합체를 4개 포함하는 경우, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체 서브유닛을 포함하지 않으며, 각각의 알부민-서브유닛 복합체에 포함된 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화하여 사량체를 이룸.
실시예 18, 알부민 4개 접합
실시예 17에 있어서, 다음을 포함하는 상기 요산산화효소-알부민 접합체:
제1 알부민-서브유닛 접합체,
여기서, 상기 제1 알부민-서브유닛 접합체는 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제1 요산산화효소-링커 접합부, 제1 앵커, 제1 알부민-링커 접합부, 및 제1 알부민을 포함함;
제2 알부민-서브유닛 접합체,
여기서, 상기 제2 알부민-서브유닛 접합체는 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제2 요산산화효소-링커 접합부, 제2 앵커, 제2 알부민-링커 접합부, 및 제2 알부민을 포함함;
제3 알부민-서브유닛 접합체,
여기서, 상기 제3 알부민-서브유닛 접합체는 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제3 요산산화효소-링커 접합부, 제3 앵커, 제3 알부민-링커 접합부, 및 제3 알부민을 포함함; 및
제4 알부민-서브유닛 접합체,
여기서, 상기 제4 알부민-서브유닛 접합체는 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제4 요산산화효소-링커 접합부, 제4 앵커, 제4 알부민-링커 접합부, 및 제4 알부민을 포함함; 및
여기서, 상기 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 및 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화하여 사량체를 이룸.
실시예 19, 알부민 4개 접합, 구성요소 마쿠시 청구항
실시예 18에 있어서, 다음을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체:
상기 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 서열번호 132에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며, 여기서 상기 선택된 서열에 포함된 X는 도 23 내지 27의 표에서 선택된 비천연 아미노산이고,
상기 제1 요산산화효소-링커 접합부는 상기 도 23 내지 27의 표에서 선택된 비천연 아미노산에 따라 도 28의 표에 개시된 것으로 결정되고,
상기 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 서열번호 132에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며, 여기서 상기 선택된 서열에 포함된 X는 도 23 내지 27의 표에서 선택된 비천연 아미노산이고,
상기 제2 요산산화효소-링커 접합부는 상기 도 23 내지 27의 표에서 선택된 비천연 아미노산에 따라 도 28의 표에 개시된 것으로 결정되고,
상기 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 서열번호 132에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며, 여기서 상기 선택된 서열에 포함된 X는 도 23 내지 27의 표에서 선택된 비천연 아미노산이고,
상기 제3 요산산화효소-링커 접합부는 상기 도 23 내지 27의 표에서 선택된 비천연 아미노산에 따라 도 28의 표에 개시된 것으로 결정되고,
상기 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 서열번호 132에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며, 여기서 상기 선택된 서열에 포함된 X는 도 23 내지 27의 표에서 선택된 비천연 아미노산이고,
상기 제4 요산산화효소-링커 접합부는 상기 도 23 내지 27의 표에서 선택된 비천연 아미노산에 따라 도 28의 표에 개시된 것으로 결정되고,
상기 제1 앵커, 제2 앵커, 제3 앵커, 및 제4 앵커는 각각 독립적으로, 도 29의 표에서 선택되고,
상기 제1 알부민-링커 접합부, 제2 알부민-링커 접합부, 제3 알부민-링커 접합부, 및 제4 알부민 링커 접합부는 각각 독립적으로, 도 30의 표에서 선택되고,
상기 제1 알부민, 제2 알부민, 제3 알부민, 및 제4 알부민은 각각 독립적으로, 서열번호 133 내지 서열번호 145에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며,
상기 제1 알부민-링커 접합부는, 상기 제1 앵커에 연결된 티올 반응기(thiol reactive moiety) 및 상기 제1 알부민 서열 중 34번째 시스테인의 티올기(thiol moiety)가 반응하여 형성된 것이고,
상기 제2 알부민-링커 접합부는, 상기 제2 앵커에 연결된 티올 반응기(thiol reactive moiety) 및 상기 제2 알부민 서열 중 34번째 시스테인의 티올기(thiol moiety)가 반응하여 형성된 것이고,
상기 제3 알부민-링커 접합부는, 상기 제3 앵커에 연결된 티올 반응기(thiol reactive moiety) 및 상기 제3 알부민 서열 중 34번째 시스테인의 티올기(thiol moiety)가 반응하여 형성된 것이고,
상기 제4 알부민-링커 접합부는, 상기 제4 앵커에 연결된 티올 반응기(thiol reactive moiety) 및 상기 제4 알부민 서열 중 34번째 시스테인의 티올기(thiol moiety)가 반응하여 형성된 것임.
실시예 20, 알부민 4개 접합, 요산산화효소 유래 한정
실시예 19에 있어서, 상기 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 상기 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 상기 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 및 상기 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛은 모두 Aspergillus Flavus, Candida Utilis, 및 Arthrobacter Globiformis중 선택된 하나의 미생물에서 유래된 것을 특징으로 하는 요선선화효소-알부민 접합체.
실시예 21, 알부민 3개 접합
실시예 17에 있어서, 다음을 포함하는 상기 요산산화효소-알부민 접합체:
제1 알부민-서브유닛 접합체,
여기서, 상기 제1 알부민-서브유닛 접합체는 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제1 요산산화효소-링커 접합부, 제1 앵커, 제1 알부민-링커 접합부, 및 제1 알부민을 포함함;
제2 알부민-서브유닛 접합체,
여기서, 상기 제2 알부민-서브유닛 접합체는 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제2 요산산화효소-링커 접합부, 제2 앵커, 제2 알부민-링커 접합부, 및 제2 알부민을 포함함;
제3 알부민-서브유닛 접합체,
여기서, 상기 제3 알부민-서브유닛 접합체는 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제3 요산산화효소-링커 접합부, 제3 앵커, 제3 알부민-링커 접합부, 및 제3 알부민을 포함함; 및
제4 요산산화효소 변이체 서브유닛,
여기서, 상기 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 및 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화하여 사량체를 이룸.
실시예 22, 알부민 3개 접합, 구성요소 마쿠시 청구항
실시예 21에 있어서, 다음을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체:
상기 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 서열번호 132에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며, 여기서 상기 선택된 서열에 포함된 X는 도 23 내지 27의 표에서 선택된 비천연 아미노산이고,
상기 제1 요산산화효소-링커 접합부는 상기 도 23 내지 27의 표에서 선택된 비천연 아미노산에 따라 도 28의 표에 개시된 것으로 결정되고,
상기 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 서열번호 132에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며, 여기서 상기 선택된 서열에 포함된 X는 도 23 내지 27의 표에서 선택된 비천연 아미노산이고,
상기 제2 요산산화효소-링커 접합부는 상기 도 23 내지 27의 표에서 선택된 비천연 아미노산에 따라 도 28의 표에 개시된 것으로 결정되고,
상기 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 서열번호 132에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며, 여기서 상기 선택된 서열에 포함된 X는 도 23 내지 27의 표에서 선택된 비천연 아미노산이고,
상기 제3 요산산화효소-링커 접합부는 상기 도 23 내지 27의 표에서 선택된 비천연 아미노산에 따라 도 28의 표에 개시된 것으로 결정되고,
상기 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 서열번호 132에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며, 여기서 상기 선택된 서열에 포함된 X는 도 23 내지 27의 표에서 선택된 비천연 아미노산이고,
상기 제1 앵커, 제2 앵커, 및 제3 앵커는 각각 독립적으로, 도 29의 표에서 선택되고,
상기 제1 알부민-링커 접합부, 제2 알부민-링커 접합부, 및 제3 알부민-링커 접합부는 각각 독립적으로, 도 30의 표에서 선택되고,
상기 제1 알부민, 제2 알부민, 제3 알부민, 및 제4 알부민은 각각 독립적으로, 서열번호 133 내지 서열번호 145에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며,
상기 제1 알부민-링커 접합부는, 상기 제1 앵커에 연결된 티올 반응기(thiol reactive moiety) 및 상기 제1 알부민 서열 중 34번째 시스테인의 티올기(thiol moiety)가 반응하여 형성된 것이고,
상기 제2 알부민-링커 접합부는, 상기 제2 앵커에 연결된 티올 반응기(thiol reactive moiety) 및 상기 제2 알부민 서열 중 34번째 시스테인의 티올기(thiol moiety)가 반응하여 형성된 것이고,
상기 제3 알부민-링커 접합부는, 상기 제3 앵커에 연결된 티올 반응기(thiol reactive moiety) 및 상기 제3 알부민 서열 중 34번째 시스테인의 티올기(thiol moiety)가 반응하여 형성된 것임.
실시예 23, 알부민 3개 접합, 요산산화효소 유래 한정
실시예 22에 있어서, 상기 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 상기 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 상기 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 및 상기 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛은 모두 Aspergillus Flavus, Candida Utilis, 및 Arthrobacter Globiformis중 선택된 하나의 미생물에서 유래된 것을 특징으로 하는 요선선화효소-알부민 접합체.
요산산화효소-알부민 접합체를 포함하는 약학적 조성물
실시예 24, 약학적 조성물 청구항
다음을 포함하는, 요산 관련 질병 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
치료학적 유효량의, 실시예 1 내지 23 중 어느 하나의 요산산화효소-알부민 접합체; 및
약학적으로 허용되는 담체.
실시예 25, 적응증 한정
실시예 24에 있어서, 상기 요산 관련 질병은 고요산혈증, 급성 통풍성 관절염, 간헐기 통풍, 만성 결절성 통풍, 만성 신장 질환(Chronic Kidney Disease) 및 종양 용해 증후군(Tumor Lysis Syndrome; TLS)중 어느 하나인 약학적 조성물.
실시예 26, 담체 예시
실시예 24 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 담체는 다음 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물:
락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유; 감미제; 방향제; 시럽제; 지방유와 같은 액체 담체; 멸균된 수용액; 프로필렌글리콜; 폴리에틸렌글리콜; 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르; 현탁제; 유제; 동결 건조 제제; 외용제; 안정제; 완충제; 동물성 유; 식물성 유; 왁스; 파라핀; 전분; 트라칸트; 셀룰로오스 유도체; 폴리에틸렌 글리콜; 실리콘; 벤토나이트; 실리카; 탈크; 산화 아연.
요산산화효소-알부민 접합체를 사용한 치료방법
실시예 27, 약학적 조성물을 사용하는 치료 방법
다음을 포함하는, 요산 관련 질병 예방 또는 치료 방법:
실시예 24 내지 26 중 어느 하나의 약학적 조성물을 환자 체내에 투여하는 것.
실시예 28, 적응증 한정
실시예 27에 있어서, 상기 요산 관련 질병은 고요산혈증, 급성 통풍성 관절염, 간헐기 통풍, 만성 결절성 통풍, 만성 신장 질환(Chronic Kidney Disease) 및 종양 용해 증후군(Tumor Lysis Syndrome; TLS)중 어느 하나인 약학적 조성물.
실시예 29, 투여 방법 한정
실시예 27 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여 방법은 경구 투여, 비경구 투여, 정맥 내 투여, 정맥 점적 주입(intravenous infusion), 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여, 및 피하 투여 중 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
실시예 30, 투여 용량 한정
실시예 27 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 약학적 조성물을 0.01 mg/kg 내지 1000mg/kg의 용량으로 상기 환자 체내에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
실시예 31, 투여 주기 한정 1
실시예 27 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 약학적 조성물을 1일 1회 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
실시예 32, 투여 주기 한정 2
실시예 27 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 약학적 조성물을 1일 2회 이상 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
요산산화효소-알부민 접합체의 용도
실시예 33, 치료제 제조 용도
실시예 1 내지 23 중 어느 하나의 요산산화효소-알부민 접합체를 요산 관련 질병 치료제로 제조하는 용도.
실시예 34, 적응증 한정
실시예 33에 있어서, 상기 요산 관련 질병은 고요산혈증, 급성 통풍성 관절염, 간헐기 통풍, 만성 결절성 통풍, 만성 신장 질환(Chronic Kidney Disease) 및 종양 용해 증후군(Tumor Lysis Syndrome; TLS)중 어느 하나인 용도.
요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법
실시예 35, 알부민-링커 접합 우선
다음을 포함하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법:
알부민 및 링커를 반응시키는 것,
여기서, 상기 링커는 디에노필 작용기(dienophile functional group), 앵커, 및 티올 반응성기(thiol reactive moiety)를 포함하며,
상기 링커의 티올 반응성기 및 상기 알부민의 티올기가 반응을 통해 결합하여 알부민-링커 접합체가 생성됨; 및
상기 알부민-링커 접합체 및 요산산화효소 변이체를 반응시키는 것,
여기서, 상기 요산산화효소 변이체는 야생형 요산산화효소의 서열에서 3개 이상의 아미노산이 디엔 작용기(dien functional group)를 포함하는 비천연 아미노산으로 치환된 것이며,
상기 요산산화효소 변이체의 상기 디엔 작용기 및 상기 알부민-링커 접합체의 링커에 포함된 상기 디에노필 작용기가 역 전자 요구 디엘스-알더 (Inverse Electron Demand Diels-Alder; IEDDA) 반응을 통해 결합하여 요산산화효소-알부민 접합체가 생성되고,
상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체에 3개 이상의 알부민이 링커를 통해 접합된 것을 특징으로 함.
실시예 36, 요산산화효소-알부민 접합 우선
다음을 포함하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법:
요산산화효소 변이체 및 링커를 반응시키는 것,
여기서, 상기 요산산화효소 변이체는 야생형 요산산화효소의 서열에서 3개 이상의 아미노산이 디엔 작용기(dien functional group)를 포함하는 비천연 아미노산으로 치환된 것이며,
상기 링커는 디에노필 작용기(dienophile functional group), 앵커, 및 티올 반응성기(thiol reactive moiety)를 포함하며,
상기 요산산화효소 변이체의 상기 디엔 작용기 및 상기 링커의 상기 디에노필 작용기가 역 전자 요구 디엘스-알더 (Inverse Electron Demand Diels-Alder; IEDDA) 반응을 통해 결합하여 요산산화효소-링커 접합체가 생성되고,
상기 요산산화효소-링커 접합체는 요산산화효소 변이체에 3개 이상의 링커가 접합된 것을 특징으로 함; 및
상기 요산산화효소-링커 접합체 및 알부민을 반응시키는 것,
여기서, 상기 요산산화효소-링커 접합체의 링커에 포함된 티올 반응성기 및 상기 알부민의 티올기가 반응을 통해 결합하여 요산산화효소-알부민 접합체가 생성되며,
상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소-링커 접합체에 3개 이상의 알부민이 접합된 것을 특징으로 함.
실시예 37, 요산산화효소, 링커, 알부민 동시
다음을 포함하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법:
요산산화효소 변이체, 링커, 및 알부민을 반응시키는 것,
여기서, 상기 요산산화효소 변이체는 야생형 요산산화효소의 서열에서 3개 이상의 아미노산이 디엔 작용기(dien functional group)를 포함하는 비천연 아미노산으로 치환된 것이며,
상기 링커는 디에노필 작용기(dienophile functional group), 앵커, 및 티올 반응성기(thiol reactive moiety)를 포함하며,
여기서, 상기 알부민의 티올기 및 상기 링커의 티올 반응기가 반응을 일으켜 접합되고,
상기 요산산화효소 변이체의 비천연 아미노산에 포함된 디엔 작용기 및 상기 링커의 IEDDA 반응기가 반응을 일으켜 접합되며,
상기 반응 결과 요산산화효소-알부민 접합체가 생성됨.
실시예 38, 요산산화효소 변이체 한정
실시예 36 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체는 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화 된 사량체 단백질이며, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 야생형의 요산산화효소 서브유닛과 비교해 1개 이상의 아미노산이 디엔 작용기를 포함하는 비천연 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는, 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법.
실시예 39, 비천연 아미노산 디엔 작용기 한정
실시예 35 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 비천연 아미노산의 디엔 작용기는 테트라진 작용기 또는 트리아진 작용기인 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법.
실시예 40, 디에노필 작용기 한정
실시예 35 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 링커의 상기 디에노필 작용기는 trans-cyclooctene 및 그 유도체에서 선택된 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법.
실시예 41, 티올 반응기 한정
실시예 35 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 티올 반응기는 maleimide 또는 그 유도체, 및 3-arylpropiolonitriles 또는 그 유도체 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법.
실시예 42, 요산산화효소-링커 반응 조건 한정
실시예 35 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체 및 링커를 반응시키는 것은 중성 pH 환경에서 수행되는 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법.
실시예 43, 반응물 마쿠시 청구항
실시예 35 내지 37 중 어느 하나에 있어서,
상기 요산산화효소 변이체는 서열번호 1 내지 132에서 각각 독립적으로 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되는 요산산화효소 변이체 서브유닛 4개가 올리고머화한 사량체이고, 여기서 상기 선택된 서열에 포함된 X는 도 23 내지 27의 표에서 선택된 비천연 아미노산이고,
상기 링커는 도 31의 표에서 선택되고,
상기 알부민은 서열번호 133 내지 144에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며,
상기 알부민의 티올기는 상기 서열번호 133 내지 144에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열 중 34번째 시스테인의 티올기인 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법.
요산산화효소 변이체
실시예 44, 요산산화효소 변이체
서열 내 3개 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 요산산화효소 변이체,
여기서, 각각의 상기 비천연 아미노산은 테트라진 작용기(tetrazine functional group) 또는 트리아진 작용기(triazine functional group)를 포함하는 것을 특징으로 함.
실시예 45, 3개의 요산산화효소 변이체 서브유닛 포함
실시예 44에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체는 1개의 야생형 요산산화효소 서브유닛 및 3개의 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화하여 형성된 사량체이고,
상기 각각의 요산산화효소 변이체 서브유닛은 야생의 요산산화효소 서브유닛 서열에서 1개 이상의 아미노산이 테트라진 작용기(tetrazine functional group) 또는 트리아진 작용기(triazine functional group)를 포함하는 비천연 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
실시예 46, 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛 포함
실시예 44에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체는 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화하여 형성된 사량체이고,
상기 각각의 요산산화효소 변이체 서브유닛은 야생의 요산산화효소 서브유닛 서열에서 1개 이상의 아미노산이 테트라진 작용기(tetrazine functional group) 또는 트리아진 작용기(triazine functional group)를 포함하는 비천연 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
실시예 47, 요산산화효소 변이체의 유래 한정
실시예 46에 있어서, 상기 각각의 요산산화효소 변이체 서브유닛은 Aspergillus Flavus, Candida Utilis, 및 Arthrobacter Globiformis에서 선택된 미생물 유래 야생형 요산산화효소 서브유닛 서열을 변형시킨 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
실시예 48, 요산산화효소 변이체 치환 위치 한정
실시예 46에 있어서, 상기 각각의 요산산화효소 변이체 서브유닛은 야생의 요산산화효소 서브유닛 서열 내 1개 이상의 치환 적합 위치의 아미노산을 상기 비천연 아미노산으로 치환한 것이고,
상기 치환 적합 위치는 요산산화효소 서브유닛의 기능과 구조에 별다른 영향을 미치지 않으며, 용매 접근성이 높은 위치인 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
실시예 49, 요산산화효소 변이체 치환 위치 결정 방법 한정
실시예 48에 있어서, 상기 치환 적합 위치는 분자 모델링 시뮬레이션 결과, 바람직하게는 Rosetta 분자 모델링 패키지의 스코어링 결과를 참조하여 결정된 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
실시예 50, Aspergillus Flavus Uox, 서열 택일
실시예 47에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체는 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 및 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛을 포함하고,
상기 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 및 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 2 내지 서열번호 50에서 각각 독립적으로 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되고,
여기서, 각 서열 내의 X는 테트라진 작용기, 또는 트리아진 작용기를 포함하는 비천연 아미노산인 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
실시예 51, Aspergillus Flavus Uox, 비천연 아미노산 택일
실시예 50에 있어서, 각각의 요산산화효소 변이체 서브유닛 서열에 포함된 X는 도 23 내지 27에 개시된 표에서 각각 독립적으로 선택된 비천연 아미노산인 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
실시예 52, Aspergillus Flavus Uox, 서열 통일
실시예 51에 있어서, 상기 제1 요산산화효소 변이체, 제2 요산산화효소 변이체, 제3 요산산화효소 변이체, 및 제4 요산산화효소 변이체는 동일한 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
실시예 53, Candida Utilis Uox, 서열 택일
실시예 47에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체는 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 및 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛을 포함하고,
상기 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 및 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 52 내지 서열번호 117에서 각각 독립적으로 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되고,
여기서, 각 서열 내의 X는 테트라진 작용기, 또는 트리아진 작용기를 포함하는 비천연 아미노산인 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
실시예 54, Candida Utilis Uox, 비천연 아미노산 택일
실시예 53에 있어서, 각각의 요산산화효소 변이체 서브유닛 서열에 포함된 X는 도 23 내지 27에 개시된 표에서 각각 독립적으로 선택된 비천연 아미노산인 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
실시예 55, Candida Utilis Uox, 서열 통일
실시예 54에 있어서, 상기 제1 요산산화효소 변이체, 제2 요산산화효소 변이체, 제3 요산산화효소 변이체, 및 제4 요산산화효소 변이체는 동일한 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
실시예 56, Arthrobacter Globiformis Uox, 서열 택일
실시예 47에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체는 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 및 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛을 포함하고,
상기 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 및 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 119 내지 서열번호 132에서 각각 독립적으로 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되고,
여기서, 각 서열 내의 X는 테트라진 작용기, 또는 트리아진 작용기를 포함하는 비천연 아미노산인 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
실시예 57, Arthrobacter Globiformis Uox, 비천연 아미노산 택일
실시예 56에 있어서, 각각의 요산산화효소 변이체 서브유닛 서열에 포함된 X는 도 23 내지 27에 개시된 표에서 각각 독립적으로 선택된 비천연 아미노산인 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
실시예 58, Arthrobacter Globiformis Uox, 서열 통일
실시예 57에 있어서, 상기 제1 요산산화효소 변이체, 제2 요산산화효소 변이체, 제3 요산산화효소 변이체, 및 제4 요산산화효소 변이체는 동일한 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
요산산화효소 변이체 발현 벡터
실시예 59, 요산산화효소 변이체 발현 벡터
실시예 44 내지 58 중 어느 하나의 요산산화효소 변이체를 발현할 수 있는 벡터로, 상기 요산산화효소 변이체에 포함된 비천연 아미노산에 해당하는 부분은 엠버 코돈(ambber codon; 5'-UAG-3'), 오커 코돈(ocher codon; 5'-UAA-3'), 및 오팔 코돈(opal codon; 5'-UGA-3') 중 선택된 것으로 암호화된 것을 특징으로 하는 벡터.
실시예 60, 요산산화효소 변이체 발현 벡터 서열 한정
실시예 59에 있어서, 상기 벡터는 다음 중 선택된 하나 이상의 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터:
5'-ATGTCTGCTGTGAAGGCCGCAAGATATGGCAAGGATAATGTGAGGGTGTACAAGGTGCATAAGGACGAAAAGACTGGCGTGCAGACAGTGTACGAGATGACCGTGTGCGTCCTGCTGGAGGGCGAAATCGAGACTTCTTATACCAAAGCCGACAACTCCGTGATTGTGGCCACAGATTCTATCAAGAACACTATCTATATCACCGCCAAACAGAACCCAGTGACACCACCTGAACTGTTCGGCAGCATTCTCGGCACACACTTTATTGAGAAGTACAACCACATCCATGCTGCACACGTGAATATCGTGTGTCATCGCTGGACCCGCATGGACATCTAGGGAAAGCCACACCCCCACTCTTTTATCAGAGACTCTGAAGAAAAGAGAAACGTGCAGGTCGACGTGGTGGAGGGAAAAGGTATCGACATCAAGAGCTCACTCTCCGGCCTGACCGTGCTGAAGAGTACCAATTCACAGTTTTGGGGGTTTCTGAGAGACGAATACACTACACTGAAGGAGACTTGGGATAGAATCCTGAGTACCGACGTGGATGCAACCTGGCAGTGGAAGAATTTTTCCGGGCTGCAGGAAGTGCGGTCCCACGTGCCCAAGTTTGATGCAACCTGGGCAACCGCAAGGGAGGTGACACTGAAAACCTTTGCCGAGGACAACTCCGCTAGCGTGCAGGCCACAATGTACAAGATGGCCGAACAGATCCTGGCCAGACAGCAGCTGATTGAGACTGTGGAGTACTCTCTGCCTAACAAGCACTATTTCGAAATCGACCTGTCCTGGCACAAGGGACTGCAGAATACTGGTAAAAACGCAGAGGTGTTCGCCCCTCAGAGTGATCCCAATGGTCTGATCAAATGCACAGTGGGGAGATCCTCTCTGAAGAGCAAGCTGTAA-3' (서열번호 152);
5'-ATGTCTGCTGTGAAGGCCGCAAGATATGGCAAGGATAATGTGAGGGTGTACAAGGTGCATAAGGACGAAAAGACTGGCGTGCAGACAGTGTACGAGATGACCGTGTGCGTCCTGCTGGAGGGCGAAATCGAGACTTCTTATACCAAAGCCGACAACTCCGTGATTGTGGCCACAGATTCTATCAAGAACACTATCTATATCACCGCCAAACAGAACCCAGTGACACCACCTGAACTGTTCGGCAGCATTCTCGGCACACACTTTATTGAGAAGTACAACCACATCCATGCTGCACACGTGAATATCGTGTGTCATCGCTGGACCCGCATGGACATCGACGGAAAGCCACACCCCCACTCTTTTATCAGAGACTCTGAAGAAAAGAGAAACGTGCAGGTCGACGTGGTGGAGGGAAAAGGTATCGACATCAAGAGCTCACTCTCCGGCCTGACCGTGCTGAAGAGTACCAATTCACAGTTTTAGGGGTTTCTGAGAGACGAATACACTACACTGAAGGAGACTTGGGATAGAATCCTGAGTACCGACGTGGATGCAACCTGGCAGTGGAAGAATTTTTCCGGGCTGCAGGAAGTGCGGTCCCACGTGCCCAAGTTTGATGCAACCTGGGCAACCGCAAGGGAGGTGACACTGAAAACCTTTGCCGAGGACAACTCCGCTAGCGTGCAGGCCACAATGTACAAGATGGCCGAACAGATCCTGGCCAGACAGCAGCTGATTGAGACTGTGGAGTACTCTCTGCCTAACAAGCACTATTTCGAAATCGACCTGTCCTGGCACAAGGGACTGCAGAATACTGGTAAAAACGCAGAGGTGTTCGCCCCTCAGAGTGATCCCAATGGTCTGATCAAATGCACAGTGGGGAGATCCTCTCTGAAGAGCAAGCTGTAA-3' (서열번호 153);
5'-ATGTCTGCTGTGAAGGCCGCAAGATATGGCAAGGATAATGTGAGGGTGTACAAGGTGCATAAGGACGAAAAGACTGGCGTGCAGACAGTGTACGAGATGACCGTGTGCGTCCTGCTGGAGGGCGAAATCGAGACTTCTTATACCAAAGCCGACAACTCCGTGATTGTGGCCACAGATTCTATCAAGAACACTATCTATATCACCGCCAAACAGAACCCAGTGACACCACCTGAACTGTTCGGCAGCATTCTCGGCACACACTTTATTGAGAAGTACAACCACATCCATGCTGCACACGTGAATATCGTGTGTCATCGCTGGACCCGCATGGACATCGACGGAAAGCCACACCCCCACTCTTTTATCAGAGACTCTGAAGAAAAGAGAAACGTGCAGGTCGACGTGGTGGAGGGAAAAGGTATCGACATCAAGAGCTCACTCTCCGGCCTGACCGTGCTGAAGAGTACCAATTCACAGTTTTGGGGGTTTCTGAGAGACGAATACACTACACTGAAGGAGACTTAGGATAGAATCCTGAGTACCGACGTGGATGCAACCTGGCAGTGGAAGAATTTTTCCGGGCTGCAGGAAGTGCGGTCCCACGTGCCCAAGTTTGATGCAACCTGGGCAACCGCAAGGGAGGTGACACTGAAAACCTTTGCCGAGGACAACTCCGCTAGCGTGCAGGCCACAATGTACAAGATGGCCGAACAGATCCTGGCCAGACAGCAGCTGATTGAGACTGTGGAGTACTCTCTGCCTAACAAGCACTATTTCGAAATCGACCTGTCCTGGCACAAGGGACTGCAGAATACTGGTAAAAACGCAGAGGTGTTCGCCCCTCAGAGTGATCCCAATGGTCTGATCAAATGCACAGTGGGGAGATCCTCTCTGAAGAGCAAGCTGTAA-3' (서열번호 154);
5'-ATGAGCACCACACTGAGCAGCAGCACCTATGGTAAAGATAATGTGAAATTCCTGAAAGTGAAAAAAGATCCGCAGAACCCGAAAAAACAAGAAGTTATGGAAGCAACCGTTACCTGTCTGCTGGAAGGTGGTTTTGATACCAGCTATACCGAAGCAGATAATAGCAGCATTGTTCCGACCGATACCGTGAAAAATACCATTCTGGTTCTGGCAAAAACCACCGAAATTTGGCCGATTGAACGTTTTGCAGCCAAACTGGCAACCCATTTTGTTGAGAAATATTCTCATGTTAGCGGTGTGAGCGTTAAAATTGTTCAGGATCGTTGGGTTAAATATGCCGTTGATGGTAAACCGCATGATCACAGCTTTATTCATGAAGGTGGTGAAAAACGTATCACCGACCTGTATTACAAACGTAGCGGTGATTATAAACTGTCCAGCGCAATTAAAGATCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGCAGCATGTTTTAGGGTTATAACAAATGCGATTTCACAACCCTGCAGCCGACCACCGATCGTATTCTGAGCACCGATGTTGATGCAACCTGGGTTTGGGATAATAAGAAAATTGGTAGCGTGTACGATATTGCCAAAGCAGCAGATAAAGGCATCTTCGATAATGTGTATAATCAGGCACGTGAAATTACCCTGACCACCTTTGCACTGGAAAATAGCCCGAGCGTTCAGGCAACCATGTTTAATATGGCGACCCAGATTCTGGAAAAAGCGTGTAGCGTTTATAGCGTTAGCTATGCACTGCCGAACAAACACTATTTTCTGATTGACCTGAAATGGAAGGGCCTTGAAAATGATAACGAACTGTTTTATCCGAGTCCGCATCCGAATGGTCTGATTAAATGTACCGTTGTGCGTAAAGAGAAAACCAAACTGTAA-3' (서열번호 155);
5'-ATGAGCACCACACTGAGCAGCAGCACCTATGGTAAAGATAATGTGAAATTCCTGAAAGTGAAAAAAGATCCGCAGAACCCGAAAAAACAAGAAGTTATGGAAGCAACCGTTACCTGTCTGCTGGAAGGTGGTTTTGATACCAGCTATACCGAAGCAGATAATAGCAGCATTGTTCCGACCGATACCGTGAAAAATACCATTCTGGTTCTGGCAAAAACCACCGAAATTTGGCCGATTGAACGTTTTGCAGCCAAACTGGCAACCCATTTTGTTGAGAAATATTCTCATGTTAGCGGTGTGAGCGTTAAAATTGTTCAGGATCGTTGGGTTAAATATGCCGTTGATGGTAAACCGCATGATCACAGCTTTATTCATGAAGGTGGTGAAAAACGTATCACCGACCTGTATTACAAACGTAGCGGTGATTATAAACTGTCCAGCGCAATTAAAGATCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGCAGCATGTTTTATGGTTATAACAAATGCGATTTCACAACCCTGCAGCCGACCACCGATCGTATTCTGAGCACCGATGTTGATGCAACCTGGGTTTGGGATAATAAGAAAATTGGTAGCGTGTAGGATATTGCCAAAGCAGCAGATAAAGGCATCTTCGATAATGTGTATAATCAGGCACGTGAAATTACCCTGACCACCTTTGCACTGGAAAATAGCCCGAGCGTTCAGGCAACCATGTTTAATATGGCGACCCAGATTCTGGAAAAAGCGTGTAGCGTTTATAGCGTTAGCTATGCACTGCCGAACAAACACTATTTTCTGATTGACCTGAAATGGAAGGGCCTTGAAAATGATAACGAACTGTTTTATCCGAGTCCGCATCCGAATGGTCTGATTAAATGTACCGTTGTGCGTAAAGAGAAAACCAAACTGTAA-3' (서열번호 156);
5'-ATGAGCACCACACTGAGCAGCAGCACCTATGGTAAAGATAATGTGAAATTCCTGAAAGTGAAAAAAGATCCGCAGAACCCGAAAAAACAAGAAGTTATGGAAGCAACCGTTACCTGTCTGCTGGAAGGTGGTTTTGATACCAGCTATACCGAAGCAGATAATAGCAGCATTGTTCCGACCGATACCGTGAAAAATACCATTCTGGTTCTGGCAAAAACCACCGAAATTTGGCCGATTGAACGTTTTGCAGCCAAACTGGCAACCCATTTTGTTGAGAAATATTCTCATGTTAGCGGTGTGAGCGTTAAAATTGTTCAGGATCGTTGGGTTAAATATGCCGTTGATGGTAAACCGCATGATCACAGCTTTATTCATGAAGGTGGTGAAAAACGTATCACCGACCTGTATTACAAACGTAGCGGTGATTATAAACTGTCCAGCGCAATTAAAGATCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGCAGCATGTTTTATGGTTATAACAAATGCGATTTCACAACCCTGCAGCCGACCACCGATCGTATTCTGAGCACCGATGTTGATGCAACCTGGGTTTGGGATAATAAGAAAATTGGTAGCGTGTACGATATTGCCAAAGCAGCAGATAAAGGCATCTTCGATAATGTGTATAATCAGGCACGTGAAATTACCCTGACCACCTTTGCACTGGAAAATAGCCCGAGCGTTCAGGCAACCATGTTTAATATGGCGACCCAGATTCTGGAAAAAGCGTGTAGCGTTTATAGCGTTAGCTATGCACTGCCGAACAAACACTATTTTCTGATTGACCTGAAATAGAAGGGCCTTGAAAATGATAACGAACTGTTTTATCCGAGTCCGCATCCGAATGGTCTGATTAAATGTACCGTTGTGCGTAAAGAGAAAACCAAACTGTAA-3' (서열번호 157);
5'-ATGACCGCAACCGCAGAAACCAGCACCGGCACCAAAGTTGTTCTGGGTCAGAATCAGTATGGTAAAGCAGAAGTTCGTCTGGTTAAAGTTACCCGTAATACCGCACGTCATGAAATTCAGGATCTGAATGTTACCAGCCAGCTGCGTGGTGATTTTGAAGCAGCACATACCGCAGGCGATAATGCACATGTTGTTGCAACCGATACACAGAAAAACACCGTTTATGCATTTGCCCGTGATGGTTTTGCAACCACCGAAGAATTTCTGCTGCGTCTGGGTAAACATTTCACCGAAGGTTTTGATTGGGTTACCGGTGGTCGTTGGGCAGCACAGCAGTTTTTCTGGGATCGTATTTAGGATCACGATCATGCCTTTAGCCGCAATAAAAGCGAAGTGCGTACCGCAGTTCTGGAAATTAGCGGTAGCGAACAGGCAATTGTTGCAGGTATTGAAGGTCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGTAGCGAGTTTCATGGTTTTCCGCGTGATAAATACACCACACTGCAAGAAACCACCGATCGTATTCTGGCAACCGATGTTAGCGCACGTTGGCGTTATAATACCGTTGAAGTTGATTTTGATGCGGTTTATGCAAGCGTTCGTGGTCTGCTGCTGAAAGCATTTGCAGAAACCCATAGCCTGGCACTGCAGCAGACAATGTATGAAATGGGTCGTGCAGTTATTGAAACCCATCCGGAAATTGATGAGATCAAAATGAGCCTGCCGAACAAACATCATTTTCTGGTTGATCTGCAGCCGTTTGGTCAGGATAATCCGAATGAAGTGTTTTATGCAGCAGATCGTCCGTATGGTCTGATTGAAGCAACCATTCAGCGTGAAGGTAGCCGTGCAGATCATCCGATTTGGAGTAATATTGCAGGTTTTTGCTAA-3' (서열번호 158);
5'-ATGACCGCAACCGCAGAAACCAGCACCGGCACCAAAGTTGTTCTGGGTCAGAATCAGTATGGTAAAGCAGAAGTTCGTCTGGTTAAAGTTACCCGTAATACCGCACGTCATGAAATTCAGGATCTGAATGTTACCAGCCAGCTGCGTGGTGATTTTGAAGCAGCACATACCGCAGGCGATAATGCACATGTTGTTGCAACCGATACACAGAAAAACACCGTTTATGCATTTGCCCGTGATGGTTTTGCAACCACCGAAGAATTTCTGCTGCGTCTGGGTAAACATTTCACCGAAGGTTTTGATTGGGTTACCGGTGGTCGTTGGGCAGCACAGCAGTTTTTCTGGGATCGTATTAATGATCACGATCATGCCTTTAGCCGCAATAAAAGCGAAGTGCGTACCGCAGTTCTGGAAATTAGCGGTTAGGAACAGGCAATTGTTGCAGGTATTGAAGGTCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGTAGCGAGTTTCATGGTTTTCCGCGTGATAAATACACCACACTGCAAGAAACCACCGATCGTATTCTGGCAACCGATGTTAGCGCACGTTGGCGTTATAATACCGTTGAAGTTGATTTTGATGCGGTTTATGCAAGCGTTCGTGGTCTGCTGCTGAAAGCATTTGCAGAAACCCATAGCCTGGCACTGCAGCAGACAATGTATGAAATGGGTCGTGCAGTTATTGAAACCCATCCGGAAATTGATGAGATCAAAATGAGCCTGCCGAACAAACATCATTTTCTGGTTGATCTGCAGCCGTTTGGTCAGGATAATCCGAATGAAGTGTTTTATGCAGCAGATCGTCCGTATGGTCTGATTGAAGCAACCATTCAGCGTGAAGGTAGCCGTGCAGATCATCCGATTTGGAGTAATATTGCAGGTTTTTGCTAA-3' (서열번호 159); 및
5'-ATGACCGCAACCGCAGAAACCAGCACCGGCACCAAAGTTGTTCTGGGTCAGAATCAGTATGGTAAAGCAGAAGTTCGTCTGGTTAAAGTTACCCGTAATACCGCACGTCATGAAATTCAGGATCTGAATGTTACCAGCCAGCTGCGTGGTGATTTTGAAGCAGCACATACCGCAGGCGATAATGCACATGTTGTTGCAACCGATACACAGAAAAACACCGTTTATGCATTTGCCCGTGATGGTTTTGCAACCACCGAAGAATTTCTGCTGCGTCTGGGTAAACATTTCACCGAAGGTTTTGATTGGGTTACCGGTGGTCGTTGGGCAGCACAGCAGTTTTTCTGGGATCGTATTAATGATCACGATCATGCCTTTAGCCGCAATAAAAGCGAAGTGCGTACCGCAGTTCTGGAAATTAGCGGTAGCGAACAGGCAATTGTTGCAGGTATTGAAGGTCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGTAGCGAGTTTCATGGTTTTCCGCGTGATAAATACACCACACTGCAAGAAACCACCGATCGTATTCTGGCAACCGATGTTAGCGCACGTTGGCGTTATAATACCGTTTAGGTTGATTTTGATGCGGTTTATGCAAGCGTTCGTGGTCTGCTGCTGAAAGCATTTGCAGAAACCCATAGCCTGGCACTGCAGCAGACAATGTATGAAATGGGTCGTGCAGTTATTGAAACCCATCCGGAAATTGATGAGATCAAAATGAGCCTGCCGAACAAACATCATTTTCTGGTTGATCTGCAGCCGTTTGGTCAGGATAATCCGAATGAAGTGTTTTATGCAGCAGATCGTCCGTATGGTCTGATTGAAGCAACCATTCAGCGTGAAGGTAGCCGTGCAGATCATCCGATTTGGAGTAATATTGCAGGTTTTTGCTAA-3' (서열번호 160).
요산산화효소 변이체의 제조방법
실시예 61, 요산산화효소 변이체의 제조방법
다음을 포함하는 요산산화효소 변이체의 제조방법:
직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현시킬 수 있는 벡터, 및 요산산화효소 변이체 발현 벡터를 포함하는 세포주를 준비하는 것,
이때, 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현시킬 수 있는 벡터는 외래 유래 suppressor tRNA 및 외래 유래 tRNA 합성효소를 발현시킬 수 있는 것이고,
상기 외래 유래 suppressor tRNA는 특정 종결 코돈을 인식할 수 있는 것이고,
상기 외래 유래 tRNA 합성효소는 테트라진 작용기 및/또는 트리아진 작용기를 포함하는 비천연 아미노산을 인식하여 상기 외래 유래 suppressor tRNA에 연결시킬 수 있는 것이고,
상기 요산산화효소 변이체 발현 벡터는 실시예 44 내지 58 중 어느 하나의 요산산화효소 변이체를 발현시킬 수 있는 것으로, 상기 요산산화효소 변이체 내에 포함된 비천연 아미노산에 대응하는 위치가 상기 특정 종결 코돈으로 암호화된 것을 특징으로 함; 및
상기 세포주를 테트라진 작용기 및/또는 트리아진 작용기를 포함하는 한 종류 이상의 비천연 아미노산이 포함된 배지에서 배양하는 것.
실시예 62, 종결 코돈 한정
실시예 61에 있어서, 상기 특정 종결 코돈은 엠버 코돈(ambber codon; 5'-UAG-3'), 오커 코돈(ocher codon; 5'-UAA-3'), 및 오팔 코돈(opal codon; 5'-UGA-3') 중 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
실시예 63, 세포주 변이
실시예 62에 있어서, 상기 세포주는 상기 특정 종결 코돈을 인식하는 release factor가 비활성화 된 세포주인 것을 특징으로 하는 방법.
실시예 64, 세포주 한정
실시예 63에 있어서, 상기 세포주는 E.Coli C321.ΔA.exp(Addgene, ID:49018)인 것을 특징으로 하는 방법.
실시예 65, 직교적 tRNA/합성효소 페어 한정
실시예 61에 있어서, 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어는 Methanococcus jannaschii 유래의 suppressor tRNA (MjtRNATyr CUA), 및 Methanococcus jannaschii 유래의 tyrosyl-tRNA 합성효소 (MjTyrRS)인 것을 특징으로 하는 방법.
실시예 66, 직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현하는 벡터 한정
실시예 65에 있어서, 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현할 수 있는 벡터는 Yang et.al (Temporal Control of Efficient In Vivo Bioconjugation Using a Genetically Encoded Tetrazine-Mediated Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction, Bioconjugate Chemistry, 2020, 2456-2464)에 개시된 pDule_C11인 것을 특징으로 하는 방법.
실시예 67, 요산산화효소 변이체 서열 한정
실시예 61에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체 발현 벡터는 실시예 51, 실시예 54, 실시예 57 중 어느 하나의 요산산화효소 변이체를 발현시킬 수 있는 것으로, 상기 요산산화효소 변이체 서열에 포함된 비천연 아미노산이 상기 특정 종결 코돈으로 암호화된 것을 특징으로 하는 방법.
이하, 실험예 및 실시예를 통해 본 명세서가 제공하는 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 예시하기 위한 것으로, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험예 1 요산산화효소 변이체 수득
실험예 1.1 요산산화효소 변이체 발현을 위한 벡터 제작
_Aspergillus flavus_에서 유래한 Uox를 코딩하는 유전자를 주형으로, pTAC_Uox 플라스미드를 제작하였다. TAC promoter를 적용하기 위해 pTAC-MAT-TAG-1 발현 벡터(Sigma, E5530)의 서열정보를 참고하였으며, 기존 pQE80 벡터 보다 확장된 RBS(Ribosome binding site) 서열인 5'-TTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA-3'(서열번호 151)을 적용했다. pTAC vector의 재조합 단백질 발현을 위해서 transcription 조절, rrnBt1 및 rrnBt2 terminator 서열을 적용했다.
TAC promoter 부터 rrnbT1-rrnbT2 terminator 서열은 (주)마크로젠에 의뢰하여 DNA 합성을 진행하였고, pQE80L vector에 cloning을 수행하여 pTAC-empty vector를 제작하였다. pTAC-empty의 cloning 은 infusion cloning을 통하여 진행되었으며, Infusion® HD cloning kit(다카라코리아바이오메디칼)을 이용하여 cloning을 완료하였다. 제작된 pTAC-empty vector는 sequencing 분석을 의뢰하여 서열 검증을 완료하였다.
벡터 제작에 사용된 각각의 서열을 아래 표 1에 나타냈다.
[표 1]
Figure pat00042
Aspergillus flavus에서 유래한 Uox를 코딩하는 유전자를 주형으로 증폭하기 위하여 기존의 cloning 되어있는 pQE80-Uox-W174amb vector에서 PCR-amplification 하여 제작된 pTAC-empty vector에 infusion cloning을 진행하였다. Infusion reaction은 vector 50 ng에 22 ng의 insert(Uox_W174amb)로 반영하였으며 50
Figure pat00043
조건에서 15분간 반응 후 E.Coli DH5a 에 transformation 하였다. 이후 single colony pick up 하여 4mL LB broth medium에 inoculation하여 mini-prep을 수행하였다. EcoRI/HindIII restriction enzyme digestion 을 수행하여 cloning insert gene 서열인 Uox-W174amb 의 band (953bp)를 확인했다 (도 4). 클로닝이 완료된 pTAC-Uox-W174amb는 sequencing 의뢰하여 결과를 NCBI의 BLAST 프로그램을 이용하여 cloning 결과를 확인했다(도 5).
실험예 1.2 요산산화효소 변이체 발현 및 정제
Uox에서 174번째 위치는 이전에 구조적/기능적 역할을 하지 않는 것으로 보고되었으므로(Lim, 2015), HSA 접합시에도 효소 활성을 유지하는 섭동(perturbation)이 거의 또는 전혀 없을 것으로 예상되었다. 이에, HSA와 Uox의 접합을 위해, 4 량체로 구성된 Uox에서 1량체당 1 개의 반응성 위치를 선정하여, 총 4개의 반응성 위치를 갖도록 하였다. 구체적으로, Uox는 1량체가 4개로 올리고머화 (oligomerization)되는 4량체 단백질인 바, 1량체에 1개의 도입자리가 들어가면 결과적으로 4량체로 올리고머화되어 4개의 반응성 위치를 갖는다.
구체적으로, Uox-frTet을 발현시키기 위해, 실험예 1.1에서 제작한 pDule_C11 및 pTAC_Uox-174Amb 플라스미드를 이용하여 C321delAexp Escherichia coli 숙주 세포를 공동형질전환시킨 후(C321delA.exp [pDule_C11] [pTAC_Uox-174Amb]), 이를 2x YT 배지에서 배양하였다. Uox-frTet의 발현은 1~3mM frTet 및 테트라사이클린(10 μg/mL), 가나마이신(35 μg/mL) 을 첨가한 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 이후, IPTG를 첨가하여 Uox-frTet의 발현을 촉진하였으며 발현 유도시간 별로 Uox-frTet 발현유무를 확인하였다.
SDS-PAGE 분석결과 분자량이 약 34kDa인 단백질 밴드가 존재하는 것으로 나타났으며 유도시간 별로 단백질 밴드가 점점 강해지는 경향을 확인하였고, 이는 단량체 Uox(34kDa)의 예상 분자량과 일치한다. 상기 결과를 통해 Uox-frTet의 발현을 확인하였다.(도 6)
Uox-frTet 을 분리 정제를 위해, 수득한 균체를 버퍼(20 mM Tris-HCl pH 9.0) 와 1:5(w/w%) 비율로 하여 혼합하고 초음파 분쇄기를 이용하여 세포 파쇄를 진행하였다. 세포 파쇄한 후 균체 찌꺼기를 제거하기 위해 9,500 rpm, 40분 동안 원심분리를 진행하고 상층액을 회수하였다.
회수한 상층액을 0.45um 필터한 후 DEAE Sepharose Fast Flow(Cytiva, MA, USA) 컬럼으로 평형화 버퍼 20 mM Tris-HCl pH 9.0을 사용하고 용출 버퍼 20 mM sodium phosphate pH 6.0을 사용하여 1차 분리 정제를 진행하였다(도 7 및 도 8).
1차 정제 분획을 통합해 phenyl Fast Flow(Cytiva, MA, USA) 컬럼으로 평형화 버퍼 20 mM Tris-HCl pH 9.0 + 1M Ammomium sulfate를 사용하고 용출 버퍼 20 mM Tris-HCl pH 9.0을 사용하여 2차 분리 정제를 진행하였다(도 9 및 도 10).
2차 정제 분획을 통합해 분석한 결과, 고순도의 Uox-frTet를 수득하였으며, 쿠마씨 블루 염색 단백질 겔에서 정제 후 용리 레인(elution lane)은 분자량이 약 34kDa인 단일 밴드가 존재하는 것으로 나타났으며, 또한 시판되고 있는 요산산화효소인 FASTURTEC(Rasburicase, sanofi-aventis)과 SDS-PAGE 분석한 결과 일치하는 분자량 밴드를 확인하였다(도 11).
실험예 1.3 요산산화효소 변이체 순도 확인
Uox-frTet의 순도 확인을 위해 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분석하였다. 분석 컬럼은 TSKgel G3000SWXL(TOSOH)을 사용하였으며, 이동상 20 mM sodium phosphate pH 7.0 + 0.3M NaCl를 사용하여 0.6 mL/min 속도로 UV 220nm에서 분석하였다.
그 결과 2차 정제한 Uox-frTet는 14.7분에 주요 피크로 검출되었으며, 순도는 99% 이상으로 관찰되었음. Uox-frTet는 고순도로 정제된 것을 확인했다 (도 12).
*실험예 1.4 요산산화효소 변이체 내 frTet 도입 확인
형광 표지 염료 접합을 사용하여 유전적으로 암호화된 frTet이 IEDDA 반응성을 나타내는지 조사하였다. 구체적으로, 형광 라벨링 분석을 위해, 정제된 Uox-WT 및 Uox-frTet을 실온에서 2 시간 동안 PBS(pH 7.4)에서 1 : 2의 몰비로 TCO(Trans-Cyclooct-2-ene)-Cy3 염료와 반응시켰다. 반응 혼합물은 SDS-PAGE로 분석하였다. 겔의 형광 강도는 ChemiDoc XRS+ 시스템(302 nm, 필터 510/610 nm에서 조명; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 사용하여 검출한 다음 Image Lab 소프트웨어(Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 분석하였다. TCO-Cy3가 있거나 또는 없는 Uox-WT 샘플을 대조군으로 사용하여 IEDDA 반응성을 확인하였다.
형광 라벨링 분석 후, 단백질 시각화를 위해 쿠마씨 블루 염색을 수행하였다. 단백질 겔을 쿠마씨 브릴리언트 블루 R-250(Coomassie Brilliant Blue R-250) 염료를 사용하여 염색하고 ChemiDoc XRS+ 시스템 (백색 조명)을 사용하여 밴드를 검출하였다.
그 결과, TCO-Cy3와 함께 배양된 Uox-frTet에서 밴드가 확인되었으며, TCO-Cy3와의 배양 유무에 관계없이 쿠마씨 블루 염색 후 모든 Uox 변이체에서는 단일 단백질 밴드가 확인되었다. 이러한 결과는 Uox에 도입된 frTet이 IEDDA 반응성을 나타냄을 보여준다 (도 13).
실험예 2 요산산화효소-알부민 접합체 수득
Uox-HSA 제조를 위해, HSA 와 TCO-Maleimide 링커를 1:4(molar ratio) 비율로 4 시간 동안 상온에서 결합시켰다. 미반응 TCO-MAL 링커를 제거하기 위해 반응 혼합물을 HiPrep 26/10 Desalting 컬럼을 사용하여 PBS 완충액(pH 7.4)으로 제거 및 탈염시켰다. 이후 HSA-TCO와 Uox-frTet 를 5:1(molar ratio) 비율로 15 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 시료를 0.45um 필터한 후 20 mM sodium phosphate pH 6.0로 버퍼 교환하고 SP Sepharose 컬럼(Cytiva, MA. USA)에 주입하여 용출 버퍼 20 mM sodium phosphate pH 6.0 + 1 M NaCl을 사용하여 1차 분리 정제를 진행하였다. 1차 정제 분획을 모아 20 mM Bis-Tris pH 6.5로 버퍼 교환하고 Q sepharose 컬럼에 주입하여 용출 버퍼 20 mM Bis-Tris pH 6.5 + 1 M NaCl를 사용하여 2차 분리 정제를 진행하였다. 2차 정제 완료된 시료를 쿠마씨 블루 염색 단백질 겔에서 분석한 결과 분자량 약 101kDa인 주요 밴드가 존재하는 것으로 나타났으며, 이는 단량체 Uox-HSA(101kDa)의 예상 분자량과 일치하였다(도 14). 2차 정제 분획을 모아 Superdex 200 Increase 10/300 GL (Cytiva, MA, USA) 컬럼으로 3차 분리 정제를 진행하였다. 3차 정제 분획을 통합해 분석한 결과, 고순도의 Uox-HSA 를 수득하였음을 확인했다. 또한, SEC-HPLC로 분석한 결과 순도 100%의 단일 peak를 확인하였다(도 15). 이를 통해, 고순도의 요산산화효소-알부민 접합체(Uox-HSA)를 수득하였다.
실험예 3 요산산화효소-알부민 접합체의 in vitro 효소 활성 분석
Uox-frTet 및 Uox-HSA 의 in vitro 효소 활성을 평가하기 위해, 시료를 10 nM 농도로 희석하고 111.1 uM Uric acid와 1:9(v/v%) 비율로 혼합하여 마이크로 플레이트에 넣고 흡광도 293 nm 에서 15초 간격으로 10 분 동안 측정하였다. Uox-frTet 및 Uox-HSA 의 in vitro 효소 활성 측정 결과, uric acid가 감소하는 경향을 보이며 기울기를 측정하여 아래 계산식을 이용해 활성을 평가하였다.
Figure pat00044
Figure pat00045
그 결과 Uox-frTet의 단위 용량당 활성은 0.072 U/mL로 나타났으며, Uox-HSA의 단위 용량당 활성은 0.067 U/mL로 나타났다. 이는 Uox-frTet에 알부민이 4개 결합하더라도 효소 활성 감소에 큰 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다. 또한 Uox-frTet의 specific activity는 53 U/mg의 활성을 나타냈으며 Uox-HSA의 specific activity는 16.6 U/mg의 활성을 나타냈다.
실험예 4 요산산화효소-알부민 접합체에 대한 약동학적(Pharmacokinetics; PK) 평가
Uox-HSA 의 반감기 평가를 위해 ICR 마우스(n=5)를 이용하여 PK 분석을 진행했다. Uox-HSA는 투여 방법 IV(정맥투여), IP(복강투여), IM(근육투여)에 따른 반감기를 확인하였다. 대조군으로는 야생형 요산산화효소인 Fasturtec를 이용하여 비교하였다. 투여용량은 Uox-HSA (6.0 mg/kg, 14.6 nmol/kg, IV, IP, IM), Fasturtec (2.0 mg/kg, 14.6 nmol/kg, IV)으로 투여하였다.
그 결과 투여 경로별 의 area under curve (AUC)는 IV (4,471 mU/mL x h), IP (4,180 mU/mL x h), IM (2,879 mU/mL x h) 순서로 IV 투여 경로에서 가장 높게 평가되었고, Uox-WT은 476 mU/mL x h으로 크게 하회하였다. 또한, Uox-HSA의 반감기는 IV 26.22시간, IP 28.2시간, IM 21.61시간으로 나타났고, Fasturtec의 반감기는 IV 1.86시간으로 나타났다. 즉, IV 투여를 기준으로 Uox-HSA는 Fasturtec 대비 반감기가 약 14배 향상된 것으로 확인되었다(도 16 내지 도 17).
실험예 5 고요산혈증 동물모델을 이용한 요산산화효소-알부민 접합체의 혈중 요산 감소효과
요산 전구체 물질인 하이포잔티 (Hypoxanthine, 500 mg/kg)과 요산산화효소 억제제인 칼륨 옥소네이트 (Potassium oxonate, 250 mg/kg)를 이용하여 고요산혈증 동물모델 (Winster-SD rat)을 제작했다. 그리고, 이 동물모델에 상기 제조한 Uox-HSA 약물을 처리하여 혈중 요산수치를 확인하는 약력학 평가 시험을 진행하였다.
고요산혈증 유도는 시험약물 투여 전 2회 유도를 하고 시험약물 투여 후 각 24시간, 48시간 후 2회 재유도하였다. 각 관찰시점에서 혈중 요산감소 효과 및 지속성 등을 확인하였다. 투여용량은 Uox-HSA 1.0 mg/kg (2.4 nmol/kg), Uox-HSA 4.0 mg/kg (9.8 nmol/kg), Uox-HSA 10 mg/kg (24.6 nmol/kg), Fasturtec(Rasburicase) 1.33 mg/kg (9.8 nmol/kg)을 정맥으로 투여하였고 Febuxostat (10 mg/kg, 양성대조군)을 구강 투여하였다. 그 결과, 고요산 유발 후 초기 혈중 요산 수치는 음성대조군 (Hyperuricemia, negative control)에서 12 mg/dL 로 랫드에서 고요산혈증이 정상적으로 유도됨을 확인하였다. 약물 투여 후 30분 후에는 모든 약물 투여군에서 정상수치 (6 mg/dL) 이하로 요산수치의 감소가 확인되었으며 이 수치는 12시간까지 지속되었다.
약물의 지속성을 확인하기 위하여 2차 유도(약물투여 후 24시간)하였다. 그 결과는 Uox-HSA 투여군에서 혈중 요산수치가 낮게 유지되는 반면 Uox-WT과 양성대조군 Febuxostat을 투여한 군에서는 요산 수치가 상승하는 것으로 나타났다.
약물 투여 후 48시간에 3차 유도한 결과 Uox-HSA 투여군에서 혈중 요산 감소 효과를 보였다. 이는 Uox-HSA가 고요산 혈증 동물모델에서 지속적으로 혈중 요산을 감소시킴을 확인하였다(도 18 내지 도 19).
실험예 6 Human FcRn (+/+) TG 마우스를 이용한 약동학적 평가(PK Profile)
Uox-HSA는 인체유래 알부민이 결합되어 있는 약물로 마우스 FcRn에 결합능력이 떨어짐으로써 반감기 향상이 크지 않다. 따라서, human FcRn이 transgenic된 마우스를 이용할 경우 인체유래 알부민에 의한 FcRn 재순환효과를 기대할 수 있다. 이를 평가하기 위해, Tg32 Alb -/-(human FcRn +/+) 마우스(n=4)(JAX#025201, The Jackson Laboratory)를 이용하여 상기 제조한 Uox-HSA의 반감기를 평가했다. 알부민이 4개 결합된 Uox-HSA(tetra-HSA)는 6.0 mg/kg 용량으로 IV 단회 투여하였으며, 알부민이 2개 결합된 Uox-HSA(di-HSA)는 5.0 mg/kg 용량으로 IV 단회 투여하여 0.5h, 1d, 4d, 7d에 혈액을 채취하여 혈액 내 Uricase의 활성을 확인하였다. 그 결과 알부민이 4개 결합된 Uox-HSA(tetra-HSA)의 경우 60.3시간의 반감기를 보였다. 이는 ICR 마우스에서 확인한 반감기 대비 2.3배 증가하였으며, AUC는 4.2배 증가하였다. 또한, 알부민이 2개 결합된 Uox-HSA(di-HSA)의 경우 32.4시간의 반감기를 보였다. 알부민 개수에 따라 반감기의 큰 차이를 보이는 것이 확인되었다. 특히, human FcRn TG마우스의 결과를 볼 때 인체에 Uox-HSA(tetra-HSA) 투여 시 반감기는 더 증가할 것으로 예상된다.
실험예 7 인간 유래 PBMC 기반 in vitro 면역원성 분석
생물의약품의 면역원성 조기 예측은 생물의약품 개발의 성공 여부를 결정하는 필수적인 요소임에도 불구하고 인간과 실험동물의 면역체계 차이로 임상시험 전 생물의약품의 면역원성을 신뢰성 있게 예측할 수 있는 실험동물 모델이 없다. 따라서, 사람 PBMC를 이용한 면역원성 분석 기술을 이용하여 면역원성 분석을 진행하였다. 본 실험을 통해 임상 시험 전 Uox-HSA의 면역원성에 대한 신뢰성 높은 평가를 얻을 수 있다.
현재까지 가장 신뢰성이 높다고 알려진 인간 단핵세포에서 수지상 세포로 분화를 유도한 후 Uox-HSA에 의해 유도된 면역세포들의 반응도 (CD4+, CD8+ T cell activation)를 측정했다. CD4+ T 세포 활성도 분석 결과, Uox-HSA (6 ug/ml) 와 Fasturtec (2 ug/ml) 모두 SI 값이 2 이하로 아래의 HLA type에서는 면역원성을 나타내지 않을 것이라는 결과를 얻었다. 상대적인 비교에서는 Fasturtec (2 ug/ml) 가 Uox-HSA (6 ug/ml) 보다 CD4+ T cell 활성도가 조금 더 높게 나왔으나 통계적으로 유의한 결과는 아니었다. CD8+ T 세포 활성도 분석 결과, Uox-HSA (6 ug/ml) 와 Fasturtec (2 ug/ml) 모두 SI 값이 2 이하로 아래의 HLA type에서는 면역원성을 나타내지 않을 것이라는 결과를 얻었다. 결과적으로 인체유래 알부민이 결합됨으로써 오리지널 약물 대비 면역원성이 낮을 것으로 분석되었다.
실험예 8 요산산화효소-알부민 접합체 제조
실험예 8.1 요산산화효소 변이체 발현을 위한 벡터 제작
실험예 1.1에 개시된 방법으로 요산산화효소 변이체 발현을 위한 벡터를 제작한다. 여기서, 발현 대상이 되는 요산산화효소 변이체의 벡터 서열은 서열번호 152 내지 160에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다.
실험예 8.2 요산산화효소 변이체 발현 및 정제
실험예 1.2에 개시된 방법으로, 실험예 6.1의 요산산화효소 변이체 발현을 위한 벡터를 사용하여, 요산산화효소 변이체를 발현하고, 이를 정제한다.
실험예 8.3 요산산화효소 변이체 수득 및 확인
실험예 1.3 내지 1.4에 개시된 방법으로, 실험예 8.2에서 수득한 요산산화효소 변이체의 순도 및 요산산화효소 변이체 내 비천연 아미노산이 잘 도입되었는지 확인한다.
실험예 8.4 링커 제조
상기 요산산화효소 변이체 및 알부민을 접합하기 위한 링커는 위에서 개시한 구조를 가진 것이면 제한되지 않으며, 통상의 기술자가 공지된 방법을 사용하여 적절히 제조하거나, 및/또는 제조된 것을 구매하여 사용할 수 있다.
상기 요산산화효소 변이체와 반응하는 IEDDA 반응기로써 tranc-cyclooctene(TCO)을, 알부민과 반응하는 티올 반응성기로써 3-arylpropiolonitriles (APN)을 포함하는 링커를 사용하는 경우, 다음 방법에 따라 제조하여 사용한다:
1) TCO-NHS ester(예를 들어, CONJU-PROBE 사 구입) 및 APN-amine(예를 들어, CONJU-PROBE 사 구입)를 1:1 몰비로 Dimethyl sulfoxide(DMSO) 용매 하 상온에서 반응시킨다.
2) 상기 반응물을 실리카 겔을 사용한 컬럼 크로마토그래피를 사용해 분리 정제한다. 이때, 분리정제도는 95% 이상으로 한다.
실험예 8.5 요산산화효소-알부민 접합체 수득
실험예 8.2에서 수득한 요산산화효소 변이체 및 실험예 8.4에서 수득한 링커를 사용하여, 실험예 2에 개시된 방법을 통해 요산산화효소-알부면 접합체를 수득한다.
실험예 8.6 요산산화효소-알부민 접합체의 in vitro 효소 활성 분석
실험예 8.5에서 수득한 요산산화효소-알부민 접합체를 사용하여, 실험예 3에 개시된 방법을 통해 요산산화효소-알부민 접합체의 in vitro 효소 활성을 분석한다.
실험예 8.7 요산산화효소-알부민 접합체에 대한 약동학적 평가
실험예 8.5에서 수득한 요산산화효소-알부민 접합체를 사용하여, 실험예 4에 개시된 방법을 통해, 요산산화효소-알부민 접합체에 대한 약동학적 평가 실험을 수행한다.
실험예 8.8 고요산혈증 동물모델을 이용한 요산산화효소-알부민 접합체의 혈중 요산 감소효과
실험예 8.5에서 수득한 요산산화효소-알부민 접합체를 사용하여, 실험예 5에 개시된 방법을 통해, 요산산화효소-알부민 접합체의 혈중 요산 감소효과를 측정한다.
실험예 8.9 Human FcRn (+/+) TG 마우스를 이용한 약동학적 평가(PK Profile)
실험예 8.5에서 수득한 요산산화효소-알부민 접합체를 사용하여, 실험예 6에 개시된 방법을 통해, 요산산화효소-알부민 접합체의 Human FcRn (+/+) TG 마우스를 이용한 약동학적 평가(PK Profile)를 수행한다.
실험예 8.10 인간 유래 PBMC 기반 in vitro 면역원성 분석
실험예 8.5에서 수득한 요산산화효소-알부민 접합체를 사용하여, 실험예 6에 개시된 방법을 통해, 요산산화효소-알부민 접합체의 Human FcRn (+/+) TG 마우스를 이용한 약동학적 평가(PK Profile)를 수행한다.
실험예 9 Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소-알부민 접합체 수득 및 효과 확인
실험예 9.1 실험재료
4-(1,2,3,4-tetrazin-3-yl) phenylalanine (frTet)을 Aldlab Chemicals (Woburn, MA, USA)에서 구입했다. Trans-cylooctene (TCO)?Cy3는 AAT Bioquest (Sunnyvale, CA, USA)에서 구입했다. TCO-PEG4-maleimide (TCO-PEG4-MAL) 및 amine-axially substituted TCO (TCO-amine)는 FutureChem (Seoul, Korea)에서 구입했다. Pentafluor-ophenyl ester (PFP)-PEG4-APN는 CONJU-PROBE (San Diego, CA, USA)에서 구입했다. 일회용 PD-10 탈염 컬럼(desalting columns) 및 Superdex 200 10/300 GL 증가 컬럼(Increase columns)은 Cytiva (Uppsala, Sweden)에서 구입했다. 분자량 컷오프(molecular weight cut-off; MWCO)가 10 및 100 kDA인 Vivaspin 6 원심 농축기(centrifugal concentrators)는 Sartorius (Got-tingen, Germany)에서 구입했다. 인간 혈청 알부민(HSA) 및 기타 모든 화학 시약은 달리 언급되지 않은 한, Sigma-Aldrich에서 구입했다.
실험예 9.2 Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소 변이체(AgUox-frTet) 수득을 위한 벡터 제조
Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소(AgUox) 및 그 변이체를 암호화하는 유전자는 Macrogen (Seoul, South Korea)에 의뢰해 합성했다. 야생형 AgUox(AgUox-WT), 또는 비천연 아미노산인 frTet이 서열 내에 도입된 AgUox 변이체 (AgUox-frTet)를 발현시키기 위해, 합성된 상기 유전자를 주형으로 삼고, 프라이머 pBAD-AgUox_F (5'-GCCGCCATGGTGTCTGCTGTGAAGG-3', 서열번호 161) 및 pBAD-AgUox_R (5'-GCCGAGATCTTTAATGGTGATGGTG-3', 서열번호 162)를 사용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 증폭했다. 증폭된 유전자를 2개의 제한효소 (NcoI 및 BglIII)로 절단하고, pBAD 벡터의 NcoI 및 BgIII 부위에 상기 유전자를 삽입하여 pBAD_AgUox를 합성하였다. AgUox-WT 서열 내 196번 위치의 글루탐산 코돈을 엠버 코돈 (UAG)로 대체하기 위해, 상기 pBAD-AgUox를 주형으로 사용하고, 프라이머 AgUox-196Amb_F (5'-GTCGAAGTCCACCTATACGGTGTTGTAACGCCAACGG-3' 서열번호 163) 및 AgUox-196Amb_R (5'-CCGTTGGCGTTACAACACCGTATAGGTGGACTTCGAC-3', 서열번호 164)를 사용하여 pBAD-AgUox_196amb를 제조했다.
실험예 9.3 AgUox-frTet 수득
AgUox-frTet을 발현시키기 위해, Yang et.al, Temporal Control of Efficient In Vivo Bioconjugation Using a Genetically Encoded Tetrazine-Mediated Inverse-Electron-Demand Diels?Alder Reaction, Bioconjugate Chemistry, 2020, 2456-2464에 개시된 방법을 참조하여, C321ΔA.exp, pDule_C11, 및 pBAD_AgUox-196amb를 사용하여 아래와 같은 방법으로 AgUox-frTet를 발현시켰다.
frTet에 대해 최적화된 MjtRNATyr/MjTyrRS를 포함하는 E.coli 세포를 준비했다. ampicillin (100 ?g/mL) 및 tetracycline (10 ?g/mL)이 포함된 Luria Broth (LB) 배지에서 배양된 E.coli 세포를 at 37℃에서 밤새 진탕하면서, 동일 조건 하 2x YT 배지에 접종했다. 진탕 배양 2.5시간 후, 상기 세포를 포함하는 배지가 600 nm에서 광학 밀도 0.5에 도달했을 때, frTet 및 L-(+)-아라비노스를 배지에 첨가하여 최종 농도가 각각 1mM 및 0.4%(w/v)가 되도록 하였다. 이를 5 시간동안 배양한 후, 세포를 5000rpm에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, AgUox-frTet을 수득했다. 상기 AgUox-frTet을 제조업제의 프로토콜(Qiagen)에 따라 4℃에서 고정 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제했다. 상기 정제된 AgUox-frTet은 PD-10 컬럼을 사용하여 PBS(pH 7.4)로 탈염했다. AgUox-WT의 발현 및 정제 과정은 AgUox-frTet과 유사한 방법을 따르되, 발현 단계 동안 배양 배지에 테트라사이클린 및 frTet을 첨가하지 않았다.
실험예 9.3 제조된 AgUox-frTet 분석 및 확인
상기 제조된 AgUox-frTet 및 AgUox-WT를 확인하기 위해, 이들을 제조업체의 프로토콜에 따라 트립신으로 분해시켰다. 총 0.4mg/mL의 Uox 변이체(AgUox-WT 및 AgUox-frTet)를 37℃에서 밤새 분해한 후 ZipTip C18을 사용하여 탈염했다. 트립신으로 분해된 혼합물을 2,5-디히드록시벤조산(DHB) 매트릭스 용액(30:70(v/v) 아세토니트릴: 트리플루오로아세트산 0.1% 내 DHB 20mg/mL)과 혼합한 후, Microflex MALDI-TOF/MS 장치(Bruker Corporation, Billerica, MA, USA)를 사용해 분석했다.
실험예 9.4 AgUox-WT 및 AgUox-frTet의 부위별 형광 염료 라벨링
정제된 AgUox-WT 및 AgUox-frTet을 PBS(pH 7.4)에서 실온에서 1:2 몰비로 TCO-Cy3 형광 염료와 반응시켰다. 2시간 후, 반응 혼합물을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)에 적용하였다. 단백질 겔의 형광 이미지는 ChemiDoc XRS+ 시스템(302 nm에서 일루미네이션, 510-610 nm 필터, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 사용하여 수득하였다. 형광분석 후 단백질 겔을 Coomassie Brilliant Blue R-250 염료로 염색하였다. 백색광 조명을 사용하는 ChemiDoc XRS+ 시스템을 사용하여 단백질 겔 이미지를 수득하였다.
상기 실험예 9.3 내지 실험예 9.4에 의해 제조된 AgUox-WT 및 AgUox-frTet을 분석한 결과를 도 32 내지 도 33에 나타냈다.
실험예 9.5 AgUox-HSA 접합체 제조 (AgUox-MAL-HSA and AgUox-APN-HSA)
AgUox에서 부위 특이적 알부미네이션을 수행하기 위해, HiTrap Q HP 음이온 교환 컬럼을 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 HSA를 정제하였다. 정제된 HSA를 PBS(pH 7.0)로 탈염한 후, TCO-MAL과 반응시키되, 실온 하 PBS(pH 7.0)에서 1:4의 몰비로 반응시켰다. 2시간 후, 반응 혼합물을 PD-10 컬럼을 사용하여 PBS(pH 7.4)로 탈염하고, 미반응 TCO-PEG4-MAL 링커를 제거하여 MAL-HSA 접합체를 얻었다. 정제된 Uox-frTet을 PBS(pH 7.4)에서 1:4의 몰비로 MAL-HSA와 실온에서 5시간 동안 반응시켰다. 컨쥬게이션(접합) 후, 상기 반응 혼합물을 NGC Quest 10 Plus 크로마토그래피 시스템(Bio-Rad Laboratories Inc., Berkeley, CA, USA)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC)에 적용했다. 용출된 분획의 분자량 및 순도는 SDS-PAGE를 사용하여 분석하였고, 4개의 MAL-HSA 분자(AgUox-MAL-HSA)에 접합된 AgUox-frTet에 상응하는 분획을 선별하고 추가 분석을 위해 농축했다.
TCO 및 APN을 함유하는 이종-이작용성 크로스링커(hetero-bifunctional cross-linker)를 통해 AgUox-HSA 접합체를 생성하기 위해, TCO-아민을 PFP-PEG4-APN과 반응시키되, 실온에서 30분 동안 DMSO에서 1:1의 몰비로 반응시켰다. 정제된 HSA를 50mM 붕산나트륨 완충액(pH 9.0)으로 완충액 교환하였다. 50mM 붕산나트륨 완충액(pH 9.0)에서, 정제된 HSA를 TCO-PEG4-APN과 1:4의 몰비로 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 미반응 TCO-APN 링커를 제거하기 위해, 반응 혼합물을 PD-10 컬럼을 사용하여 PBS(pH 7.4)로 탈염하였다. APN을 함유하는 링커를 통해 4개의 HSA 분자에 접합된 AgUox-frTet의 접합(AgUox-APN-HSA) 및 정제는 AgUox-MAL-HSA와 유사한 방식으로 수행되었다.
상기 실험예 9.5에 의해 AgUox-HSA 접합체를 제조한 결과를 도 34 내지 도 35에 나타냈다.
실험예 9.6 AgUox-HSA 접합체에 대한 In vivo 반감기 확인 (PK profile)
마우스에서 AgUox-HSA 접합체의 안정성 분석은 광주과학기술원 (GIST-2020-037)의 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 수행하였다. AgUox-WT, AgUox-MAL-HSA, 또는 AgUox-APN-HSA 각각을 pH 7.4에서 200 μL PBS의 AgUox 기준 5.0 nmol을 어린 암컷 BALB/c 마우스 (n=4)의 꼬리 정맥에 주사했다. AgUox-WT의 경우 15분, 3 시간, 6 시간 및 12시간 후 안와후 출혈(retro-orbital bleeding)을 통해 혈액 샘플을 했고, AgUox-HSA 접합체의 경우 같은 방법으로 15분, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간, 108 시간 및 120시간에 혈액 샘플을 수집했다. 상기 수집한 혈액에서 혈청을 분리한 후, AgUox-WT 및 AgUox-MAL-HSA, 및 AgUox-APN-HSA의 혈청 활성을 100 μM의 요산을 포함하는 효소 활성 분석 완충액 100 μL를 5 μL의 혈청을 포함하는 100 μL 효소 활성 완충액에 첨가하여 293 nm에서의 흡광도 변화에 의해 측정하였다.
상기 in vivo 반감기 확인 결과를 도 36에 나타냈다.
실험 결과, 알부민을 접합하지 않은 AgUox-WT에 비해 AgUox-APN-HSA 및 AgUox-MAL-HSA에서 현저한 반감기 상승이 나타남을 확인했다.
<110> Proabtech <120> Uricase-Albumin conjugate and its manufacturing method, and use thereof <130> OPP21-055-PCT <150> KR 10-2021-0013537 <151> 2021-01-29 <150> KR 10-2020-0125215 <151> 2020-09-25 <150> KR 10-2021-0089516 <151> 2021-07-08 <150> KR 10-2021-0125723 <151> 2021-09-23 <160> 167 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 301 <212> PRT <213> Aspergillus Flavus <400> 1 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp 195 200 205 Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser 210 215 220 Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala 225 230 235 240 Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His 245 250 255 Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly 260 265 270 Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile 275 280 285 Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 290 295 300 <210> 2 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp.Uox Variant Subunit (G137) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(301) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 2 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Xaa Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp 195 200 205 Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser 210 215 220 Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala 225 230 235 240 Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His 245 250 255 Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly 260 265 270 Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile 275 280 285 Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 290 295 300 <210> 3 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(301) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 3 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Xaa Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp 195 200 205 Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser 210 215 220 Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala 225 230 235 240 Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His 245 250 255 Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln 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125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp 195 200 205 Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser 210 215 220 Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala 225 230 235 240 Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His 245 250 255 Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly 260 265 270 Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile 275 280 285 Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 290 295 300 <210> 5 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(301) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 5 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Xaa Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp 195 200 205 Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser 210 215 220 Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala 225 230 235 240 Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His 245 250 255 Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly 260 265 270 Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile 275 280 285 Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 290 295 300 <210> 6 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(301) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 6 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val 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Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 8 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 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Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp 195 200 205 Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser 210 215 220 Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Xaa 225 230 235 240 Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His 245 250 255 Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly 260 265 270 Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile 275 280 285 Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 290 295 300 <210> 11 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(301) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 11 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Xaa Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp 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110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp 195 200 205 Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser 210 215 220 Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala 225 230 235 240 Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His 245 250 255 Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly 260 265 270 Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile 275 280 285 Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 290 295 300 <210> 14 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(301) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 14 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Xaa 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp 195 200 205 Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser 210 215 220 Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala 225 230 235 240 Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His 245 250 255 Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly 260 265 270 Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile 275 280 285 Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 290 295 300 <210> 15 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(301) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 15 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys 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<210> 19 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp.Uox Variant Subunit <400> 19 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 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Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Gln Glu Val Arg Xaa His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp 195 200 205 Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser 210 215 220 Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala 225 230 235 240 Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu 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triazine functional group. <400> 24 Ser Ala Val Xaa Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr 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<211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp.Uox Variant Subunit <400> 26 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp 195 200 205 Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser 210 215 220 Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala 225 230 235 240 Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His 245 250 255 Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Xaa Leu Gln Asn Thr Gly 260 265 270 Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile 275 280 285 Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 290 295 300 <210> 27 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(301) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 27 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser 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Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly 260 265 270 Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile 275 280 285 Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 290 295 300 <210> 28 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp.Uox Variant Subunit <400> 28 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Xaa Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys 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Variant Subunit <400> 31 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Xaa Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp 195 200 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(301) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 33 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Xaa Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp 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Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp 195 200 205 Ala Thr Ala Arg Xaa Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn 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Subunit <400> 38 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp 195 200 205 Ala 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Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile 275 280 285 Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 290 295 300 <210> 40 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp.Uox Variant Subunit <400> 40 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr 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<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(301) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 45 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr 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Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile 275 280 285 Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 290 295 300 <210> 47 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp.Uox Variant Subunit <400> 47 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Xaa Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu 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Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala 225 230 235 240 Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His 245 250 255 Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly 260 265 270 Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile 275 280 285 Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 290 295 300 <210> 51 <211> 303 <212> PRT <213> Candida Utilis <400> 51 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu 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<223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 52 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Xaa Lys Leu 290 295 300 <210> 53 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <400> 53 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Xaa Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp 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Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 54 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <400> 54 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln 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Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Xaa Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 56 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <400> 56 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Xaa His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 57 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 57 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Xaa Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 58 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 58 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Xaa Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 59 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 59 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Xaa Leu 290 295 300 <210> 60 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 60 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Xaa Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 61 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 61 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Xaa Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 62 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 62 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Xaa Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 63 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 63 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Xaa Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 64 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 64 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Xaa Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 65 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 65 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Xaa Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 66 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 66 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Xaa Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 67 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 67 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Xaa His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 68 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 68 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala 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Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Xaa Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 70 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 70 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Xaa 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 71 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 71 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser 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Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Xaa Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 72 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 72 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Xaa Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 73 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 73 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Xaa Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 74 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 74 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu 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Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 75 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 75 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Xaa Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val 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<223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 76 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln 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Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Xaa Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 78 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 78 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser 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300 <210> 79 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 79 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 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Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Xaa Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 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80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Xaa Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 82 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 82 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Xaa Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 83 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 83 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Xaa Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 84 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 84 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Xaa Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 85 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 85 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Xaa Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 86 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 86 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Xaa Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 87 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 87 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Xaa Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn 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His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Xaa Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 89 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 89 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Xaa Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 90 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 90 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Xaa Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys 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Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 92 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Xaa Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 93 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 93 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Xaa Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 94 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 94 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Xaa Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 95 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 95 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Xaa Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 96 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 96 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Xaa Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 97 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 97 Met Ser Thr Thr Leu Xaa Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 98 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 98 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Xaa Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 99 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 99 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp 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Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Xaa Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp 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115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Xaa Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 102 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 102 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 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Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Xaa Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 104 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 104 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Xaa Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 105 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 105 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Xaa Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 106 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 106 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Xaa Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 107 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 107 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Xaa Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 108 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 108 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Xaa Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 109 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 109 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Xaa 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 110 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 110 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala 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Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 111 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 111 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Xaa Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 112 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 112 Met Ser Thr Thr Leu Ser Xaa Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 113 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 113 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu 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functional group, and/or triazine functional group. <400> 115 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Xaa 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 116 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 116 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser 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Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Xaa Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 117 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 117 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Xaa Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 118 <211> 302 <212> PRT <213> Arthrobacter Globiformis <400> 118 Met Thr Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Lys Val 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Asp His Pro Ile Trp Ser Asn Ile Ala Gly Phe Cys 290 295 300 <210> 120 <211> 302 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arth.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(302) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 120 Met Thr Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Lys Val Val Leu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg 20 25 30 Asn Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu 35 40 45 Arg Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val 50 55 60 Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp 65 70 75 80 Gly Xaa Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe 85 90 95 Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln 100 105 110 Phe Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn 115 120 125 Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln 130 135 140 Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu 165 170 175 Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr 180 185 190 Asn Thr Val Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly 195 200 205 Leu Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln 210 215 220 Thr Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile 225 230 235 240 Asp Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp 245 250 255 Leu Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala 260 265 270 Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser 275 280 285 Arg Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn Ile Ala Gly Phe Cys 290 295 300 <210> 121 <211> 302 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arth.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(302) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 121 Met Thr Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Lys Val Val Leu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg 20 25 30 Asn Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu 35 40 45 Arg Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val 50 55 60 Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp 65 70 75 80 Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe 85 90 95 Thr Glu Gly Xaa Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln 100 105 110 Phe Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn 115 120 125 Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln 130 135 140 Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu 165 170 175 Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr 180 185 190 Asn Thr Val Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly 195 200 205 Leu Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln 210 215 220 Thr Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile 225 230 235 240 Asp Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp 245 250 255 Leu Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala 260 265 270 Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser 275 280 285 Arg Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn Ile Ala Gly Phe Cys 290 295 300 <210> 122 <211> 302 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arth.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(302) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 122 Met Thr Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Lys Val Val Leu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg 20 25 30 Asn Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu 35 40 45 Arg Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val 50 55 60 Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys 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Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser 275 280 285 Arg Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn Ile Ala Gly Phe Cys 290 295 300 <210> 123 <211> 302 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arth.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(302) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 123 Met Thr Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Lys Val Val Leu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg 20 25 30 Asn Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu 35 40 45 Arg Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val 50 55 60 Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp 65 70 75 80 Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe 85 90 95 Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln 100 105 110 Phe Xaa Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn 115 120 125 Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln 130 135 140 Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu 165 170 175 Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr 180 185 190 Asn Thr Val Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly 195 200 205 Leu Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln 210 215 220 Thr Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile 225 230 235 240 Asp Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp 245 250 255 Leu Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala 260 265 270 Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser 275 280 285 Arg Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn Ile Ala Gly Phe Cys 290 295 300 <210> 124 <211> 302 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arth.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(302) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 124 Met Thr Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Lys Val Val Leu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg 20 25 30 Asn Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu 35 40 45 Arg Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val 50 55 60 Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp 65 70 75 80 Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe 85 90 95 Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln 100 105 110 Phe Phe Trp Asp Arg Ile Xaa Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn 115 120 125 Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln 130 135 140 Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu 165 170 175 Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr 180 185 190 Asn Thr Val Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly 195 200 205 Leu Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln 210 215 220 Thr Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile 225 230 235 240 Asp Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp 245 250 255 Leu Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala 260 265 270 Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser 275 280 285 Arg Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn Ile Ala Gly Phe Cys 290 295 300 <210> 125 <211> 302 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arth.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(302) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 125 Met Thr Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Lys Val Val Leu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg 20 25 30 Asn Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu 35 40 45 Arg Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn 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Ala 260 265 270 Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser 275 280 285 Arg Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn Ile Ala Gly Phe Cys 290 295 300 <210> 126 <211> 302 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arth.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(302) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 126 Met Thr Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Lys Val Val Leu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg 20 25 30 Asn Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu 35 40 45 Arg Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val 50 55 60 Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp 65 70 75 80 Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe 85 90 95 Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln 100 105 110 Phe Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn 115 120 125 Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Xaa Glu Gln 130 135 140 Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu 165 170 175 Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr 180 185 190 Asn Thr Val Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly 195 200 205 Leu Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln 210 215 220 Thr Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile 225 230 235 240 Asp Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp 245 250 255 Leu Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala 260 265 270 Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser 275 280 285 Arg Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn Ile Ala Gly Phe Cys 290 295 300 <210> 127 <211> 302 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arth.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(302) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 127 Met Thr Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Lys Val Val Leu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg 20 25 30 Asn Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu 35 40 45 Arg Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val 50 55 60 Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp 65 70 75 80 Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe 85 90 95 Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln 100 105 110 Phe Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn 115 120 125 Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Xaa Gln 130 135 140 Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu 165 170 175 Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr 180 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35 40 45 Arg Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val 50 55 60 Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp 65 70 75 80 Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe 85 90 95 Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln 100 105 110 Phe Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn 115 120 125 Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln 130 135 140 Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Xaa Glu 165 170 175 Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr 180 185 190 Asn Thr Val Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly 195 200 205 Leu Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln 210 215 220 Thr Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile 225 230 235 240 Asp Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp 245 250 255 Leu Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala 260 265 270 Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser 275 280 285 Arg Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn Ile Ala Gly Phe Cys 290 295 300 <210> 129 <211> 302 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arth.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(302) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 129 Met Thr Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Lys Val Val Leu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg 20 25 30 Asn Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu 35 40 45 Arg Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val 50 55 60 Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp 65 70 75 80 Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe 85 90 95 Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln 100 105 110 Phe Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn 115 120 125 Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln 130 135 140 Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu 165 170 175 Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr 180 185 190 Asn Thr Xaa Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly 195 200 205 Leu Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln 210 215 220 Thr Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile 225 230 235 240 Asp Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp 245 250 255 Leu Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala 260 265 270 Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser 275 280 285 Arg Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn Ile Ala Gly Phe Cys 290 295 300 <210> 130 <211> 302 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arth.Uox Variant Subunit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(302) <223> Xaa is unnatural amino acid containing tetrazine functional group, and/or triazine functional group. <400> 130 Met Thr Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Lys Val Val Leu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg 20 25 30 Asn Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu 35 40 45 Arg Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val 50 55 60 Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp 65 70 75 80 Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe 85 90 95 Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln 100 105 110 Phe Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn 115 120 125 Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln 130 135 140 Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu 165 170 175 Thr Thr Asp Arg 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ctttattgag aagtacaacc acatccatgc tgcacacgtg 300 aatatcgtgt gtcatcgctg gacccgcatg gacatctagg gaaagccaca cccccactct 360 tttatcagag actctgaaga aaagagaaac gtgcaggtcg acgtggtgga gggaaaaggt 420 atcgacatca agagctcact ctccggcctg accgtgctga agagtaccaa ttcacagttt 480 tgggggtttc tgagagacga atacactaca ctgaaggaga cttgggatag aatcctgagt 540 accgacgtgg atgcaacctg gcagtggaag aatttttccg ggctgcagga agtgcggtcc 600 cacgtgccca agtttgatgc aacctgggca accgcaaggg aggtgacact gaaaaccttt 660 gccgaggaca actccgctag cgtgcaggcc acaatgtaca agatggccga acagatcctg 720 gccagacagc agctgattga gactgtggag tactctctgc ctaacaagca ctatttcgaa 780 atcgacctgt cctggcacaa gggactgcag aatactggta aaaacgcaga ggtgttcgcc 840 cctcagagtg atcccaatgg tctgatcaaa tgcacagtgg ggagatcctc tctgaagagc 900 aagctgtaa 909 <210> 153 <211> 909 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp.Uox Variant Coding DNA <400> 153 atgtctgctg tgaaggccgc aagatatggc aaggataatg tgagggtgta caaggtgcat 60 aaggacgaaa agactggcgt gcagacagtg tacgagatga ccgtgtgcgt cctgctggag 120 ggcgaaatcg agacttctta taccaaagcc gacaactccg tgattgtggc cacagattct 180 atcaagaaca ctatctatat caccgccaaa cagaacccag tgacaccacc tgaactgttc 240 ggcagcattc tcggcacaca ctttattgag aagtacaacc acatccatgc tgcacacgtg 300 aatatcgtgt gtcatcgctg gacccgcatg gacatcgacg gaaagccaca cccccactct 360 tttatcagag actctgaaga aaagagaaac gtgcaggtcg acgtggtgga gggaaaaggt 420 atcgacatca agagctcact ctccggcctg accgtgctga agagtaccaa ttcacagttt 480 taggggtttc tgagagacga atacactaca ctgaaggaga cttgggatag aatcctgagt 540 accgacgtgg atgcaacctg gcagtggaag aatttttccg ggctgcagga agtgcggtcc 600 cacgtgccca agtttgatgc aacctgggca accgcaaggg aggtgacact gaaaaccttt 660 gccgaggaca actccgctag cgtgcaggcc acaatgtaca agatggccga acagatcctg 720 gccagacagc agctgattga gactgtggag tactctctgc ctaacaagca ctatttcgaa 780 atcgacctgt cctggcacaa gggactgcag aatactggta aaaacgcaga ggtgttcgcc 840 cctcagagtg atcccaatgg tctgatcaaa tgcacagtgg ggagatcctc tctgaagagc 900 aagctgtaa 909 <210> 154 <211> 909 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp.Uox Variant Coding DNA <400> 154 atgtctgctg tgaaggccgc aagatatggc aaggataatg tgagggtgta caaggtgcat 60 aaggacgaaa agactggcgt gcagacagtg tacgagatga ccgtgtgcgt cctgctggag 120 ggcgaaatcg agacttctta taccaaagcc gacaactccg tgattgtggc cacagattct 180 atcaagaaca ctatctatat caccgccaaa cagaacccag tgacaccacc tgaactgttc 240 ggcagcattc tcggcacaca ctttattgag aagtacaacc acatccatgc tgcacacgtg 300 aatatcgtgt gtcatcgctg gacccgcatg gacatcgacg gaaagccaca cccccactct 360 tttatcagag actctgaaga aaagagaaac gtgcaggtcg acgtggtgga gggaaaaggt 420 atcgacatca agagctcact ctccggcctg accgtgctga agagtaccaa ttcacagttt 480 tgggggtttc tgagagacga atacactaca ctgaaggaga cttaggatag aatcctgagt 540 accgacgtgg atgcaacctg gcagtggaag aatttttccg ggctgcagga agtgcggtcc 600 cacgtgccca agtttgatgc aacctgggca accgcaaggg aggtgacact gaaaaccttt 660 gccgaggaca actccgctag cgtgcaggcc acaatgtaca agatggccga acagatcctg 720 gccagacagc agctgattga gactgtggag tactctctgc ctaacaagca ctatttcgaa 780 atcgacctgt cctggcacaa gggactgcag aatactggta aaaacgcaga ggtgttcgcc 840 cctcagagtg atcccaatgg tctgatcaaa tgcacagtgg ggagatcctc tctgaagagc 900 aagctgtaa 909 <210> 155 <211> 912 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Coding DNA <400> 155 atgagcacca cactgagcag cagcacctat ggtaaagata atgtgaaatt cctgaaagtg 60 aaaaaagatc cgcagaaccc gaaaaaacaa gaagttatgg aagcaaccgt tacctgtctg 120 ctggaaggtg gttttgatac cagctatacc gaagcagata atagcagcat tgttccgacc 180 gataccgtga aaaataccat tctggttctg gcaaaaacca ccgaaatttg gccgattgaa 240 cgttttgcag ccaaactggc aacccatttt gttgagaaat attctcatgt tagcggtgtg 300 agcgttaaaa ttgttcagga tcgttgggtt aaatatgccg ttgatggtaa accgcatgat 360 cacagcttta ttcatgaagg tggtgaaaaa cgtatcaccg acctgtatta caaacgtagc 420 ggtgattata aactgtccag cgcaattaaa gatctgaccg ttctgaaaag caccggcagc 480 atgttttagg gttataacaa atgcgatttc acaaccctgc agccgaccac cgatcgtatt 540 ctgagcaccg atgttgatgc aacctgggtt tgggataata agaaaattgg tagcgtgtac 600 gatattgcca aagcagcaga taaaggcatc ttcgataatg tgtataatca ggcacgtgaa 660 attaccctga ccacctttgc actggaaaat agcccgagcg ttcaggcaac catgtttaat 720 atggcgaccc agattctgga aaaagcgtgt agcgtttata gcgttagcta tgcactgccg 780 aacaaacact attttctgat tgacctgaaa tggaagggcc ttgaaaatga taacgaactg 840 ttttatccga gtccgcatcc gaatggtctg attaaatgta ccgttgtgcg taaagagaaa 900 accaaactgt aa 912 <210> 156 <211> 912 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Coding DNA <400> 156 atgagcacca cactgagcag cagcacctat ggtaaagata atgtgaaatt cctgaaagtg 60 aaaaaagatc cgcagaaccc gaaaaaacaa gaagttatgg aagcaaccgt tacctgtctg 120 ctggaaggtg gttttgatac cagctatacc gaagcagata atagcagcat tgttccgacc 180 gataccgtga aaaataccat tctggttctg gcaaaaacca ccgaaatttg gccgattgaa 240 cgttttgcag ccaaactggc aacccatttt gttgagaaat attctcatgt tagcggtgtg 300 agcgttaaaa ttgttcagga tcgttgggtt aaatatgccg ttgatggtaa accgcatgat 360 cacagcttta ttcatgaagg tggtgaaaaa cgtatcaccg acctgtatta caaacgtagc 420 ggtgattata aactgtccag cgcaattaaa gatctgaccg ttctgaaaag caccggcagc 480 atgttttatg gttataacaa atgcgatttc acaaccctgc agccgaccac cgatcgtatt 540 ctgagcaccg atgttgatgc aacctgggtt tgggataata agaaaattgg tagcgtgtag 600 gatattgcca aagcagcaga taaaggcatc ttcgataatg tgtataatca ggcacgtgaa 660 attaccctga ccacctttgc actggaaaat agcccgagcg ttcaggcaac catgtttaat 720 atggcgaccc agattctgga aaaagcgtgt agcgtttata gcgttagcta tgcactgccg 780 aacaaacact attttctgat tgacctgaaa tggaagggcc ttgaaaatga taacgaactg 840 ttttatccga gtccgcatcc gaatggtctg attaaatgta ccgttgtgcg taaagagaaa 900 accaaactgt aa 912 <210> 157 <211> 912 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida.Uox Variant Coding DNA <400> 157 atgagcacca cactgagcag cagcacctat ggtaaagata atgtgaaatt cctgaaagtg 60 aaaaaagatc cgcagaaccc gaaaaaacaa gaagttatgg aagcaaccgt tacctgtctg 120 ctggaaggtg gttttgatac cagctatacc gaagcagata atagcagcat tgttccgacc 180 gataccgtga aaaataccat tctggttctg gcaaaaacca ccgaaatttg gccgattgaa 240 cgttttgcag ccaaactggc aacccatttt gttgagaaat attctcatgt tagcggtgtg 300 agcgttaaaa ttgttcagga tcgttgggtt aaatatgccg ttgatggtaa accgcatgat 360 cacagcttta ttcatgaagg tggtgaaaaa cgtatcaccg acctgtatta caaacgtagc 420 ggtgattata aactgtccag cgcaattaaa gatctgaccg ttctgaaaag caccggcagc 480 atgttttatg gttataacaa atgcgatttc acaaccctgc agccgaccac cgatcgtatt 540 ctgagcaccg atgttgatgc aacctgggtt tgggataata agaaaattgg tagcgtgtac 600 gatattgcca aagcagcaga taaaggcatc ttcgataatg tgtataatca ggcacgtgaa 660 attaccctga ccacctttgc actggaaaat agcccgagcg ttcaggcaac catgtttaat 720 atggcgaccc agattctgga aaaagcgtgt agcgtttata gcgttagcta tgcactgccg 780 aacaaacact attttctgat tgacctgaaa tagaagggcc ttgaaaatga taacgaactg 840 ttttatccga gtccgcatcc gaatggtctg attaaatgta ccgttgtgcg taaagagaaa 900 accaaactgt aa 912 <210> 158 <211> 909 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arth.Uox Variant Coding DNA <400> 158 atgaccgcaa ccgcagaaac cagcaccggc accaaagttg ttctgggtca gaatcagtat 60 ggtaaagcag aagttcgtct ggttaaagtt acccgtaata ccgcacgtca tgaaattcag 120 gatctgaatg ttaccagcca gctgcgtggt gattttgaag cagcacatac cgcaggcgat 180 aatgcacatg ttgttgcaac cgatacacag aaaaacaccg tttatgcatt tgcccgtgat 240 ggttttgcaa ccaccgaaga atttctgctg cgtctgggta aacatttcac cgaaggtttt 300 gattgggtta ccggtggtcg ttgggcagca cagcagtttt tctgggatcg tatttaggat 360 cacgatcatg cctttagccg caataaaagc gaagtgcgta ccgcagttct ggaaattagc 420 ggtagcgaac aggcaattgt tgcaggtatt gaaggtctga ccgttctgaa aagcaccggt 480 agcgagtttc atggttttcc gcgtgataaa tacaccacac tgcaagaaac caccgatcgt 540 attctggcaa ccgatgttag cgcacgttgg cgttataata ccgttgaagt tgattttgat 600 gcggtttatg caagcgttcg tggtctgctg ctgaaagcat ttgcagaaac ccatagcctg 660 gcactgcagc agacaatgta tgaaatgggt cgtgcagtta ttgaaaccca tccggaaatt 720 gatgagatca aaatgagcct gccgaacaaa catcattttc tggttgatct gcagccgttt 780 ggtcaggata atccgaatga agtgttttat gcagcagatc gtccgtatgg tctgattgaa 840 gcaaccattc agcgtgaagg tagccgtgca gatcatccga tttggagtaa tattgcaggt 900 ttttgctaa 909 <210> 159 <211> 909 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arth.Uox Variant Coding DNA <400> 159 atgaccgcaa ccgcagaaac cagcaccggc accaaagttg ttctgggtca gaatcagtat 60 ggtaaagcag aagttcgtct ggttaaagtt acccgtaata ccgcacgtca tgaaattcag 120 gatctgaatg ttaccagcca gctgcgtggt gattttgaag cagcacatac cgcaggcgat 180 aatgcacatg ttgttgcaac cgatacacag aaaaacaccg tttatgcatt tgcccgtgat 240 ggttttgcaa ccaccgaaga atttctgctg cgtctgggta aacatttcac cgaaggtttt 300 gattgggtta ccggtggtcg ttgggcagca cagcagtttt tctgggatcg tattaatgat 360 cacgatcatg cctttagccg caataaaagc gaagtgcgta ccgcagttct ggaaattagc 420 ggttaggaac aggcaattgt tgcaggtatt gaaggtctga ccgttctgaa aagcaccggt 480 agcgagtttc atggttttcc gcgtgataaa tacaccacac tgcaagaaac caccgatcgt 540 attctggcaa ccgatgttag cgcacgttgg cgttataata ccgttgaagt tgattttgat 600 gcggtttatg caagcgttcg tggtctgctg ctgaaagcat ttgcagaaac ccatagcctg 660 gcactgcagc agacaatgta tgaaatgggt cgtgcagtta ttgaaaccca tccggaaatt 720 gatgagatca aaatgagcct gccgaacaaa catcattttc tggttgatct gcagccgttt 780 ggtcaggata atccgaatga agtgttttat gcagcagatc gtccgtatgg tctgattgaa 840 gcaaccattc agcgtgaagg tagccgtgca gatcatccga tttggagtaa tattgcaggt 900 ttttgctaa 909 <210> 160 <211> 909 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arth.Uox Variant Coding DNA <400> 160 atgaccgcaa ccgcagaaac cagcaccggc accaaagttg ttctgggtca gaatcagtat 60 ggtaaagcag aagttcgtct ggttaaagtt acccgtaata ccgcacgtca tgaaattcag 120 gatctgaatg ttaccagcca gctgcgtggt gattttgaag cagcacatac cgcaggcgat 180 aatgcacatg ttgttgcaac cgatacacag aaaaacaccg tttatgcatt tgcccgtgat 240 ggttttgcaa ccaccgaaga atttctgctg cgtctgggta aacatttcac cgaaggtttt 300 gattgggtta ccggtggtcg ttgggcagca cagcagtttt tctgggatcg tattaatgat 360 cacgatcatg cctttagccg caataaaagc gaagtgcgta ccgcagttct ggaaattagc 420 ggtagcgaac aggcaattgt tgcaggtatt gaaggtctga ccgttctgaa aagcaccggt 480 agcgagtttc atggttttcc gcgtgataaa tacaccacac tgcaagaaac caccgatcgt 540 attctggcaa ccgatgttag cgcacgttgg cgttataata ccgtttaggt tgattttgat 600 gcggtttatg caagcgttcg tggtctgctg ctgaaagcat ttgcagaaac ccatagcctg 660 gcactgcagc agacaatgta tgaaatgggt cgtgcagtta ttgaaaccca tccggaaatt 720 gatgagatca aaatgagcct gccgaacaaa catcattttc tggttgatct gcagccgttt 780 ggtcaggata atccgaatga agtgttttat gcagcagatc gtccgtatgg tctgattgaa 840 gcaaccattc agcgtgaagg tagccgtgca gatcatccga tttggagtaa tattgcaggt 900 ttttgctaa 909 <210> 161 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBAD-AgUox_F <400> 161 gccgccatgg tgtctgctgt gaagg 25 <210> 162 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBAD-AgUox_R <400> 162 gccgagatct ttaatggtga tggtg 25 <210> 163 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AgUox-196Amb_F <400> 163 gtcgaagtcc acctatacgg tgttgtaacg ccaacgg 37 <210> 164 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AgUox-196Amb_R <400> 164 ccgttggcgt tacaacaccg tataggtgga cttcgac 37 <210> 165 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AgUox-WT fregment <400> 165 Tyr Asn Thr Val Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg 1 5 10 15 <210> 166 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AgUox-frTet fregment <400> 166 Tyr Asn Thr Val Xaa Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg 1 5 10 15 <210> 167 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fregment control <400> 167 Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile Asp Glu Ile Lys Met Ser Leu 1 5 10 15 Pro Asn Lys

Claims (24)

  1. 다음 [화학식 1]로 표현되는, 요산산화효소-알부민 접합체:
    [화학식 1] Uox-[J1-A-J2-HSA]n
    여기서, 상기 Uox는 요산산화효소 변이체, 상기 J1은 요산산화효소-링커 접합부, 상기 A는 앵커, 상기 J2는 알부민-링커 접합부, 및, 상기 HSA는 인간 혈청 알부민 (Human Serum Albumin)을 의미하며,
    상기 n은 3 또는 4이고,
    상기 요산산화효소 변이체는 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화한 사량체이고,
    상기 각각의 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 2 내지 50에서 각각 독립적으로 선택된 펩타이드 서열, 또는 상기 선택된 펩타이드 서열과 90% 이상 일치하는 것이며,
    여기서, 상기 서열번호 2 내지 50의 서열은 비천연 아미노산 X를 포함하는데, 상기 비천연 아미노산은 4-(1,2,3,4-tetrazine-3-yl) phenylalanines (frTet)이고,
    상기 요산산화효소-링커 접합부는 상기 요산산화효소 변이체에 포함된 비천연 아미노산의 테트라진 잔기 및 상기 앵커에 연결된 trans-cyclooctene 잔기가 역 전자 요구 디엘스-알더(Inverse Electron Demand Diels-Alder; IEDDA) 반응을 통해 결합된 것이며,
    상기 요산산화효소-링커 접합부는 다음 화학식으로 표현되고,
    Figure pat00046
    ,
    여기서, 상기 (1) 부분은 상기 비천연 아미노산의 잔기 부분에 연결된 것이고, 상기 (2) 부분은 앵커 부분에 연결된 것이고,
    상기 알부민-링커 접합부는 상기 알부민에 포함된 티올기(thiol moiety) 및 상기 앵커의 티올 반응기(thiol reactive moiety)가 반응하여 결합한 것임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체는 서열번호 29의 요산산화효소 변이체 서브유닛 4개를 포함하고, 상기 서열번호 29에 포함된 비천연 아미노산 X는 frTet인 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 알부민-링커 접합부는 다음 중 선택되는 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체:
    Figure pat00047
    ;
    Figure pat00048
    ; 및
    Figure pat00049
    ,
    여기서, (1) 부분은 상기 알부민에 연결된 것이고, (2) 부분은 상기 앵커 부분에 연결됨.
  4. 제1항에 있어서, 상기 앵커는 다음 중 선택되는 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체:
    Figure pat00050
    ;
    Figure pat00051
    ;
    Figure pat00052
    ;
    Figure pat00053
    ; 및
    Figure pat00054
    ,
    여기서, 상기 J1은 요산산화효소-링커 접합부, 상기 J2는 알부민-링커 접합부임.
  5. 제1항에 있어서, 상기 알부민은 서열번호 133 내지 144에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 90% 이상 일치하는 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체.
  6. 다음을 포함하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법:
    알부민 및 링커를 반응시키는 것,
    여기서, 상기 링커는 디에노필 작용기(dienophile functional group), 앵커, 및 티올 반응성기(thiol reactive moiety)를 포함하며,
    상기 디에노필 작용기는 trans-cyclooctene 또는 그 유도체이며,
    상기 티올 반응성기는 maleimide 또는 그 유도체, 및 3-arylpropiolonitriles 또는 그 유도체 중 선택된 것이고,
    상기 링커의 티올 반응성기 및 상기 알부민의 티올기가 반응을 통해 결합하여 알부민-링커 접합체가 생성됨; 및
    상기 알부민-링커 접합체 및 요산산화효소 변이체를 반응시키는 것,
    여기서, 상기 요산산화효소 변이체는 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화한 사량체이고,
    상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 각각 독립적으로, 서열번호 2 내지 50에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 90% 이상 일치하는 서열로 표현되고,
    상기 서열번호 2 내지 50에 포함된 X는 비천연 아미노산인 4-(1,2,3,4-tetrazine-3-yl) phenylalanines (frTet)이고,
    상기 요산산화효소 변이체는 4개의 frTet을 포함하고,
    상기 frTet의 잔기에 포함된 테트라진 작용기 및 상기 링커의 디에노필 작용기가 역 전자 요구 디엘스-알더 (Inverse Electron Demand Diels-Alder; IEDDA) 반응을 통해 결합하여 요산산화효소-알부민 접합체가 생성되고,
    상기 요산산화효소-알부민 접합체는 상기 요산산화효소 변이체에 3개 이상의 상기 알부민이 링커를 통해 접합된 것을 특징으로 함.
  7. 제6항에 있어서, 상기 링커는 다음 중 선택된 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure pat00055
    ;
    Figure pat00056
    ;
    Figure pat00057
    ;
    Figure pat00058
    ; 및
    Figure pat00059
    .
  8. 제6항에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체는 서열번호 29로 표현되는 요산산화효소 변이체 서브유닛 4개가 올리고머화 된 사량체이며, 상기 서열번호 29에 포함된 X는 frTet인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 알부민은 서열번호 133 내지 144에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 90% 이상 일치하는 서열로 표현되고, 상기 링커의 티올 반응성기 및 상기 알부민 서열 중 34번째 시스테인에 포함된 티올기가 반응을 통해 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체 및 링커를 반응시키는 것은 pH 6 내지 8에서 수행되는 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법.
  11. 다음을 포함하는 요산산화효소 변이체:
    제1 요산산화효소 변이체 서브유닛;
    제2 요산산화효소 변이체 서브유닛;
    제3 요산산화효소 변이체 서브유닛; 및
    제4 요산산화효소 변이체 서브유닛,
    여기서, 상기 요산산화효소 변이체는 상기 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 상기 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 상기 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 및 상기 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화하여 형성된 사량체이고,
    상기 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 2 내지 50에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 90% 이상 일치하는 서열로 표현되고,
    상기 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 2 내지 50에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 90% 이상 일치하는 서열로 표현되고,
    상기 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 2 내지 50에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 90% 이상 일치하는 서열로 표현되고,
    상기 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 2 내지 50에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 90% 이상 일치하는 서열로 표현되고,
    여기서, 상기 서열번호 2 내지 50에 포함된 X는 테트라진 작용기, 또는 트리아진 작용기를 포함하는 비천연 아미노산인 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 다음 중 선택된 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체:
    Figure pat00060
    ;
    Figure pat00061
    ;
    Figure pat00062
    ;
    Figure pat00063
    ;
    Figure pat00064
    ;
    Figure pat00065
    ;
    Figure pat00066
    ;
    Figure pat00067
    ;
    Figure pat00068
    ;
    Figure pat00069
    ; 및
    Figure pat00070
    .
  13. 서열번호 2 내지 50의 펩타이드를 암호화하는 요산산화효소 변이체 발현 벡터,
    여기서, 상기 서열번호 2 내지 50에 포함된 X는 비천연 아미노산으로, 상기 X에 대응되는 벡터 서열은 종결 코돈으로 암호화된 것을 특징으로 함.
  14. 제13항에 있어서, 상기 종결 코돈은 5'-UAG-3'인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 다음을 포함하는 요산산화효소 변이체의 제조방법:
    직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현시킬 수 있는 벡터, 및 요산산화효소 변이체 발현 벡터를 포함하는 세포주를 준비하는 것,
    이때, 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현시킬 수 있는 벡터는 외래 유래 suppressor tRNA 및 외래 유래 tRNA 합성효소를 발현시킬 수 있는 것이고,
    상기 외래 유래 suppressor tRNA는 특정 종결 코돈을 인식할 수 있는 것이고,
    상기 외래 유래 tRNA 합성효소는 테트라진 작용기 및/또는 트리아진 작용기를 포함하는 비천연 아미노산을 인식하여 상기 외래 유래 suppressor tRNA에 연결시킬 수 있는 것이고,
    상기 요산산화효소 변이체 발현 벡터는 서열번호 2 내지 50에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 90% 이상 일치하는 서열로 표현되는 요산산화효소 변이체 서브유닛을 발현시킬 수 있는 것으로, 상기 요산산화효소 변이체 내에 포함된 비천연 아미노산에 대응하는 위치가 상기 특정 종결 코돈으로 암호화된 것을 특징으로 함; 및
    상기 세포주를 테트라진 작용기 및/또는 트리아진 작용기를 포함하는 한 종류 이상의 비천연 아미노산이 포함된 배지에서 배양하는 것.
  16. 제15항에 있어서, 상기 세포주를 다음 중 선택된 비천연 아미노산이 포함된 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure pat00071
    ;
    Figure pat00072
    ;
    Figure pat00073
    ;
    Figure pat00074
    ;
    Figure pat00075
    ;
    Figure pat00076
    ;
    Figure pat00077
    ;
    Figure pat00078
    ;
    Figure pat00079
    ;
    Figure pat00080
    ; 및
    Figure pat00081
    .
  17. 제15항에 있어서, 상기 특정 종결 코돈은 5'-UAG-3'인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 다음을 포함하는, 요산 관련 질병 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    치료학적 유효량의, 제1항의 요산산화효소-알부민 접합체; 및
    약학적으로 허용되는 담체.
  19. 제18항에 있어서, 상기 요산 관련 질병은 고요산혈증, 급성 통풍성 관절염, 간헐기 통풍, 만성 결절성 통풍, 만성 신장 질환(Chronic Kidney Disease) 및 종양 용해 증후군(Tumor Lysis Syndrome; TLS)중 어느 하나인 약학적 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 담체는 다음 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물:
    락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유; 감미제; 방향제; 시럽제; 지방유와 같은 액체 담체; 멸균된 수용액; 프로필렌글리콜; 폴리에틸렌글리콜; 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르; 현탁제; 유제; 동결 건조 제제; 외용제; 안정제; 완충제; 동물성 유; 식물성 유; 왁스; 파라핀; 전분; 트라칸트; 셀룰로오스 유도체; 폴리에틸렌 글리콜; 실리콘; 벤토나이트; 실리카; 탈크; 산화 아연.
  21. 다음을 포함하는, 요산 관련 질병 예방 또는 치료 방법:
    제18항의 약학적 조성물을 대상의 체내에 투여하는 것.
  22. 제21항에 있어서, 상기 요산 관련 질병은 고요산혈증, 급성 통풍성 관절염, 간헐기 통풍, 만성 결절성 통풍, 만성 신장 질환(Chronic Kidney Disease) 및 종양 용해 증후군(Tumor Lysis Syndrome; TLS)중 어느 하나인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 약학적 조성물을 대상의 체내에 투여하는 것은 경구 투여, 비경구 투여, 정맥 내 투여, 정맥 점적 주입(intravenous infusion), 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여, 및 피하 투여 중 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 약학적 조성물의 투여 용량은, 대상의 질량 대비 투여된 요산산화효소-알부민 접합체의 질량 기준, 1 mg/kg 내지 10 mg/kg인 것을 특징으로 하는 방법.
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