JP2023543045A - 尿酸酸化酵素－アルブミン結合体、その製造方法および用途 - Google Patents

尿酸酸化酵素－アルブミン結合体、その製造方法および用途 Download PDF

Info

Publication number
JP2023543045A
JP2023543045A JP2023519336A JP2023519336A JP2023543045A JP 2023543045 A JP2023543045 A JP 2023543045A JP 2023519336 A JP2023519336 A JP 2023519336A JP 2023519336 A JP2023519336 A JP 2023519336A JP 2023543045 A JP2023543045 A JP 2023543045A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
albumin
oxidase
uric acid
urate oxidase
linker
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023519336A
Other languages
English (en)
Inventor
ジョンヒェン ジョ
ソンオ シン
ヒョンウ キム
ヒョンソク キム
ドンホ パク
インチャン グウォン
ビョンソプ ヤン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Proabtech Inc
Original Assignee
Proabtech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Proabtech Inc filed Critical Proabtech Inc
Publication of JP2023543045A publication Critical patent/JP2023543045A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12N9/0048—Uricase (1.7.3.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
    • C12Y107/03—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12Y107/03003—Factor-independent urate hydroxylase (1.7.3.3), i.e. uricase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本明細書は、尿酸酸化酵素－アルブミン結合体およびその製造方法、並びに前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体に含まれる尿酸酸化酵素変異体およびその製造方法を開示する。前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸酸化酵素変異体に３つ以上のアルブミンがリンカーを介して結合されたことを特徴とし、これにより、半減期の向上、免疫原性の減少効果が現れる。また、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸が原因となる様々な疾患、疾病および／または適応症の予防または治療用途として使用することができる。

Description

本明細書では、位置特異的に非天然アミノ酸が導入された尿酸酸化酵素変異体およびその製造方法、並びに前記尿酸酸化酵素変異体およびアルブミンをリンカーによって結合した結合体およびその製造方法を開始する。また、本明細書では前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の用途を開始する。
尿酸酸化酵素（Ｕｒａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ；Ｕｒｉｃａｓｅ）は、ヒトを含む霊長類による自己合成が不可能な酵素の一種で、尿酸をアラントイン（Ａｌｌａｎｔｏｉｎ）に分解する働きをする。前記尿酸酸化酵素は、痛風発生の主原因である尿酸を排泄可能な形態に分解する直接的な治療メカニズムを有し、したがって強力な尿酸降下効果があるという利点があるが、１）体内の半減期が短いため注射剤としてしか使用できず、２）外部由来タンパク質であるため、体内に投与される場合、免疫反応が発生し、これによる副作用が発生するという欠点があって痛風治療剤として使用されることに制限がある。
一方、治療用タンパク質（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、様々な疾患の治療に効果があるということが報告されており、製薬分野の重要な成長動機のうちの１つである。しかしながら、治療用タンパク質は、患者の体内で糸球体の濾過（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、細胞吸収作用（ｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）、および免疫反応によって持続的に除去されるという問題点がある。したがって、治療用タンパク質を開発する際には、前記現象により患者の体内から除去される速度を緩和して薬効の持続時間を延ばすことが非常に重要である。このような問題点を改善するために、前記治療用タンパク質にアルブミンを物理的または化学的に結合させて半減期の改善を図る技術をアルブミン化（ａｌｂｕｍｉｎａｔｉｏｎ）と呼ぶ。
本明細書では、上記の尿酸酸化酵素の治療剤としての問題点を解決するために、尿酸酸化酵素をアルブミン化させた尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を開始する。
本明細書では、尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を提供することを意図している。
本明細書では、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法を提供することを意図している。
本明細書では、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体に含まれる尿酸酸化酵素変異体を提供することを意図している。
本明細書では、前記尿酸酸化酵素変異体の製造方法を提供することを意図している。
本明細書では、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を含む医薬組成物を提供することを意図している。
本明細書では、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の用途を提供することを意図している。
本明細書では、下記の化学式１で表現される、尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を提供する。
［化学式１］
Ｕｏｘ－［Ｊ１－Ａ－Ｊ２－ＨＳＡ］ｎ
ここで、前記Ｕｏｘは尿酸酸化酵素変異体、前記Ｊ１は尿酸酸化酵素－リンカー結合部、前記Ａはアンカー、前記Ｊ２はアルブミン－リンカー結合部、前記ＨＳＡはヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）を意味し、前記尿酸酸化酵素変異体は、ジエン官能基（ｄｉｅｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）を有する非天然アミノ酸を３つ以上含み、前記尿酸酸化酵素－リンカー結合部は、前記非天然アミノ酸のジエン官能基および前記アンカーに連結されたジエノフィル官能基（ｄｉｅｎｏｐｈｉｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）が逆電子要求ディールス・アルダー（Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ；ＩＥＤＤＡ）反応を介して結合したものであり、前記ｎは３または４である。
本明細書では、３つまたは４つのアルブミン－サブユニット結合体を含む尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を提供する。このとき、それぞれの前記アルブミン－サブユニット結合体は、下記の［化学式２］で表現され、
［化学式２］
ｐ'－Ｊ１－Ａ－Ｊ２－ＨＳＡ
ここで、前記ｐ'は尿酸酸化酵素変異体サブユニットであり、前記Ｊ１は尿酸酸化酵素－リンカー結合部であり、前記Ａはアンカー、前記Ｊ２はアルブミン－リンカー結合部、前記ＨＳＡはヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）を意味し、前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、野生型尿酸酸化酵素サブユニットの配列のうちの１つ以上のアミノ酸がテトラジン官能基（ｔｅｔｒａｚｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）またはトリアジン官能基（ｔｒｉａｚｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）を含む非天然アミノ酸に置き換えたものであり、前記尿酸酸化酵素－リンカー結合部は、前記非天然アミノ酸のテトラジン官能基またはトリアジン官能基、および前記アンカーに連結されたトランスシクロオクテン（ｔｒａｎｓ－ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ）官能基が逆電子要求ディールス・アルダー（Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ；ＩＥＤＤＡ）反応を起こして形成されたものである。また、選択的に、１つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットを含んでもよい。ここで、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体が３つのアルブミン－サブユニット複合体を含む場合、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は１つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットを含み、それぞれのアルブミン－サブユニット複合体に含まれる尿酸酸化酵素変異体サブユニットおよび１つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化して四量体を構成し、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体が４つのアルブミン－サブユニット複合体を含む場合、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は尿酸酸化酵素変異体サブユニットを含まず、それぞれのアルブミン－サブユニット複合体に含まれる尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化して四量体を構成する。
本明細書では、治療学的有効量の、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体および薬学的に許容される担体を含む、尿酸関連疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。
一実施例として、前記尿酸関連疾患は、高尿酸血症、急性痛風性関節炎、間欠期痛風、慢性結節性痛風、慢性腎臓病（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ）、および腫瘍崩壊症候群（Ｔｕｍｏｒ Ｌｙｓｉｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＴＬＳ）のうちのいずれか１つである。
一実施例として、前記薬学的に許容される担体は、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンなどのような結合剤；リン酸二カルシウムなどのような賦形剤；トウモロコシデンプンまたはサツマイモデンプンなどのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、フマル酸ステアリルナトリウムまたはポリエチレングリコールワックスなどのような潤滑油；甘味料；芳香剤；シロップ剤；脂肪油のような液体担体；滅菌水溶液；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；オレイン酸エチルのような注射可能なエステル；懸濁剤；乳剤；凍結乾燥製剤；外用剤；安定剤；緩衝剤；動物油；植物油；ワックス；パラフィン；デンプン；トラガカント；セルロース誘導体；ポリエチレングリコール；シリコン；ベントナイト；シリカ；タルク；酸化亜鉛のうちの１つ以上を含み得る。
本明細書では、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を尿酸関連疾患治療剤の製造に使用する用途を提供する。
本明細書では、アルブミンとリンカーを反応させることと、アルブミン－リンカー結合体と尿酸酸化酵素変異体を反応させることと、を含む尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法を提供する。ここで、前記リンカーは、ジエノフィル官能基（ｄｉｅｎｏｐｈｉｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）、アンカー、およびチオール反応性基（ｔｈｉｏｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｉｅｔｙ）を含み、前記リンカーのチオール反応性基および前記アルブミンのチオール基は反応を介して結合してアルブミン－リンカー結合体を生成し、前記尿酸酸化酵素変異体は、野生型尿酸酸化酵素の配列で３つ以上のアミノ酸がジエン官能基（ｄｉｅｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）を含む非天然アミノ酸に置き換えたものであり、前記尿酸酸化酵素変異体の前記ジエン官能基および前記アルブミン－リンカー結合体のリンカーに含まれる前記ジエノフィル官能基は逆電子要求ディールス・アルダー（Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ；ＩＥＤＤＡ）反応を介して結合して尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を生成し、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸酸化酵素変異体に３つ以上のアルブミンがリンカーを介して結合したことを特徴とする。
本明細書では、配列内に３つ以上の非天然アミノ酸を含み、ここで、それぞれの前記非天然アミノ酸は、テトラジン官能基（ｔｅｔｒａｚｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）またはトリアジン官能基（ｔｒｉａｚｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）を含むことを特徴とする尿酸酸化酵素変異体を提供する。
一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体は、１つの野生型尿酸酸化酵素サブユニットおよび３つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化して形成された四量体であり、前記各尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、野生の尿酸酸化酵素サブユニット配列で１つ以上のアミノ酸がテトラジン官能基（ｔｅｔｒａｚｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）またはトリアジン官能基（ｔｒｉａｚｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）を含む非天然アミノ酸に置換されていることを特徴とする。
一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体は、４つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化して形成された四量体であり、前記各尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、野生の尿酸酸化酵素サブユニット配列で１つ以上のアミノ酸がテトラジン官能基（ｔｅｔｒａｚｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）またはトリアジン官能基（ｔｒｉａｚｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）を含む非天然アミノ酸に置換されていることを特徴とする。
本明細書では、前記尿酸酸化酵素変異体を発現できるベクターを提供する。
本明細書では、直交的ｔＲＮＡ／合成酵素ペアを発現させることができるベクターおよび尿酸酸化酵素変異体発現ベクターを含む細胞株を用意することと、前記細胞株をテトラジン官能基および／またはトリアジン官能基を含む一種類以上の非天然アミノ酸が含まれた培地で培養することと、を含む尿酸酸化酵素変異体の製造方法を提供する。このとき、前記直交的ｔＲＮＡ／合成酵素ペアを発現させることができるベクターは、外来由来サプレッサーｔＲＮＡ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｔＲＮＡ）および外来由来ｔＲＮＡ合成酵素を発現させることができるものであり、前記外来由来サプレッサーｔＲＮＡは、特定の終結コドンを認識できるものであり、前記外来由来ｔＲＮＡ合成酵素は、テトラジン官能基および／またはトリアジン官能基を含む非天然アミノ酸を認識して前記外来由来サプレッサーｔＲＮＡに連結させることができるものであり、前記尿酸酸化酵素変異体発現ベクターは、前記尿酸酸化酵素変異体を発現させることができるものであり、前記尿酸酸化酵素変異体内に含まれる非天然アミノ酸に対応する位置は、前記特定の終結コドンでコードされていることを特徴とする。
本明細書に開示されている上記の技術的課題およびその解決方法によれば、尿酸酸化酵素－アルブミン結合体が提供される。前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、野生型尿酸酸化酵素に比べて半減期が向上し、免疫原性が低くなる効果があり、効果的な尿酸関連疾患の治療剤として使用することができる。
アルブミン－サブユニット結合体を模式的に示す図である。 尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の例を模式的に示す図である。図２は４つのアルブミンタンパク質が結合した尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を例示的に示す模式図であり、図３は３つのアルブミンタンパク質が結合した尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を例示的に示す模式図である。 ｐＴＡＣ－Ｕｏｘ－Ｗ１７４ａｍｂの酵素消化（ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）電気泳動の結果を示す図である。 ｐＴＡＣ－Ｕｏｘ－Ｗ１７４ａｍｂのクローニング（ｃｌｏｎｉｎｇ）配列を確認した結果を示す図である。 Ｕｏｘ－ｆｒＴｅｔ発現を確認するためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。 ＤＥＡＥカラムによるＵｏｘ－ｆｒＴｅｔの１次分離精製およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。 フェニルファストフロー（Ｐｈｅｎｙｌ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）カラムによるＵｏｘ－ｆｒＴｅｔの２次分離精製およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。 Ｕｏｘ－ｆｒＴｅｔおよびファスターテック（Ｆａｓｔｕｒｔｅｃ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。 ２次精製したＵｏｘ－ｆｒＴｅｔのＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。 蛍光標識染料（ＴＣＯ－Ｃｙ３）によるＵｏｘ内にｆｒＴｅｔ導入の有無を確認した結果を示す図である。 ２次精製完了したＵｏｘ－ＨＳＡのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。 Ｕｏｘ－ＨＳＡのＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。 ＦａｓｔｕｒｔｅｃおよびＵｏｘ－ＨＳＡの投与経路によるＰＫプロファイル結果を示す図である。ここで、１）Ｆａｓｔｕｒｔｅｃ＿ＩＶは野生型尿酸酸化酵素を静脈投与（ＩＶ）したものを、２）Ｕｏｘ－ＨＳＡ＿ＩＶは尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を静脈投与（ＩＶ）したものを、３）Ｕｏｘ－ＨＳＡ＿ＩＰは尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を腹腔投与（ＩＰ）したものを、４）Ｕｏｘ－ＨＳＡ＿ＩＭは尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を筋肉投与（ＩＭ）したものを示す図である。 ＦａｓｔｕｒｔｅｃおよびＵｏｘ－ＨＳＡの投与経路によるＰＫプロファイル結果データを示す図である。ここで、Ｆａｓｔｕｒｔｅｃ＿ＩＶ、Ｕｏｘ－ＨＳＡ＿ＩＶ、Ｕｏｘ－ＨＳＡ＿ＩＰ、およびＵｏｘ－ＨＳＡ＿ＩＭは図１６で説明した通りであり、ＡＶＧは各ＩＣＲマウスデータの平均値（ｎ＝５）、ＳＤは標準偏差を表し、ＡＵＣは前記ＰＫプロファイル結果の曲線下の面積（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ Ｃｕｒｖｅ）、Ｔ１／２は時間単位で表した半減期、Ｔｍａｘは薬物の血中濃度が最も高かった時間、およびＣｍａｘは薬物の血中濃度が最も高かった時の濃度を示す図である。 繰り返し高尿酸血症動物モデルにおけるＵｏｘ－ＨＳＡの投与による血中尿酸減少効果の薬力学評価試験の結果を示す図である。ここで、１）ネガティブコントロール（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）は陰性対照群、２）Ｕｏｘ－ＨＳＡ １ｍｇ／ｋｇは尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を１ｍｇ／ｋｇの用量で静脈投与したもの、３）Ｕｏｘ－ＨＳＡ ４ｍｇ／ｋｇは尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を４ｍｇ／ｋｇの用量で静脈投与したもの、４）Ｕｏｘ－ＨＳＡ １０ｍｇ／ｋｇは尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈投与したもの、５）Ｆａｓｔｕｒｔｅｃ １．３３ｍｇ／ｋｇは野生型尿酸酸化酵素（Ｆａｓｔｕｒｔｅｃ）を１．３３ｍｇ／ｋｇの用量で静脈投与したもの、６）フェブキソスタット（Ｆｅｂｕｘｏｓｔａｔ） １０ｍｇ／ｋｇはＦｅｂｕｘｏｓｔａｔ １ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与したものを示す図である。 繰り返し高尿酸血症動物モデルにおけるＵｏｘ－ＨＳＡの投与による血中尿酸減少効果の薬力学評価試験の結果データを示す図である。ここで、Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｕｏｘ－ＨＳＡ １ｍｇ／ｋｇ、Ｕｏｘ－ＨＳＡ ４ｍｇ／ｋｇ、Ｕｏｘ－ＨＳＡ １０ｍｇ／ｋｇ、Ｆａｓｔｕｒｔｅｃ １．３３ｍｇ／ｋｇ、Ｆｅｂｕｘｏｓｔａｔ １０ｍｇ／ｋｇは図１８で説明した通りであり、ＡＶＧは各動物モデルデータの平均値、ＳＤは標準偏差を示す図である。 Ｈｕｍａｎ ＦｃＲｎ ＴＧマウスにおけるＵｏｘ－ＨＳＡの投与によるＰＫプロファイル結果を示す図である。ここで、１）Ｕｏｘ－ＨＳＡ（Ｔｅｔｒａ）は１つの尿酸酸化酵素当たり４つのアルブミンが結合した尿酸酸化酵素－アルブミン結合体、２）Ｕｏｘ－ＨＳＡ（ｔｒｉ／ｄｉ）は１つの尿酸酸化酵素当たり２つないし３つのアルブミンが結合した尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を意味し、ＡＵＣは前記ＰＫプロファイル結果のＡｒｅａ Ｕｎｄｅｒ Ｃｕｒｖｅ、Ｔ１／２は時間単位で表した半減期、Ｒａｎｇｅは薬動力学評価時間範囲を示す図である。 ＰＢＭＣによるＵｏｘ－ＨＳＡの免疫原性分析結果を示す図である。 ＰＢＭＣによるＵｏｘ－ＨＳＡの免疫原性分析結果データを示す図である。ここで、１）ＣＤ４はＣＦＳＥ－ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するデータ、２）ＣＤ８はＣＦＳＥ－ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するデータを示す図である。各表中の＃１～＃３のデータは個体ごとの値を、Ｍｅａｎは全ての個体の平均値を示す図である。 尿酸酸化酵素変異体に導入できる非天然アミノ酸の例を示す図である。 尿酸酸化酵素－リンカー結合部構造の例およびそれに関連する非天然アミノ酸の例を示す図である。ここで、（１）部分は非天然アミノ酸の残りの残基部分に連結され、（２）部分はアンカーに連結される。 アンカー構造の例を示す図である。 アルブミン－リンカー結合部構造の例を示す図である。ここで、Ｊ１は尿酸酸化酵素－リンカー結合部、Ｊ２はアルブミン－リンカー結合部を意味する。 リンカー構造の例を示す図である。 ＡｇＵｏｘ－ＷＴおよびＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔのＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す図である。（Ａ）ＡｇＵｏｘ変異体のクーマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ；ＣＢＢ）染色結果であり、Ｍｗは分子量マーカー、ＢＩは誘導前、ＡＩは誘導後を示す。（Ｂ）精製されたＡｇＵｏｘ変異体のＣＢＢ染色タンパク質ゲルを示す。（Ｃ）ＴＣＯ－Ｃｙ３の存在下または不在下で培養したＡｇＵｏｘ変異体の表現型画像およびＣＢＢ染色タンパク質ゲルを示す。 ＡｇＵｏｘ－ＷＴ（Ａ）およびＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔ（Ｂ）のトリプシン分解断片の飛行質量スペクトル（ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａ）を示す図である。ＡｇＵｏｘ－ＷＴ断片であるＡｇＵｏｘ－ＷＴ断片であるＹＮＴＶＥＶＤＦＤＡＶＹＡＳＶＲ（配列番号１６５）の質量をＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔ断片ＹＮＴＶＸＶＤＦＤＡＶＹＡＳＶＲ（配列番号１６６、ＸはｆｒＴｅｔを表す）の質量と比較したものである。断片のピークであるＡＶＩＥＴＨＰＥＩＤＥＩＫＭＳＬＰＮＫ（配列番号１６７）を対照群として用いた。 ＭＡＬ－ＨＳＡ（ＭＡＬで表される）またはＡＰＮ－ＨＳＡ（ＡＰＮで表される）とＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔ反応混合物のタンパク質ゲルを示す図である。Ｍｗは分子量標準を示す。 ＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔおよびＭＡＬ－ＨＳＡ（Ａ）またはＡＰＮ－ＨＳＡ（Ｂ）のコンジュゲート混合物の画分のサイズ排除クロマトグラムおよびタンパク質ゲルを示す図である。溶出した画分をタンパク質ゲルにロードした後、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅで染色した。 ＡｇＵｏｘ－ＷＴおよびＡｇＵｏｘ－ＨＳＡ結合体の薬動力学分析（ＰＫプロファイル）結果を示す図である。残留ＡｇＵｏｘ－ＷＴおよびＡｇＵｏｘ－ＨＳＡ結合体の血清活性は、初期段階（０～８４時間）と後期（８４～１２０時間）で測定した。ｔｅ１／２およびｔｌ１／２は、それぞれ初期および後期の血清半減期を示す。
以下、添付の図面を参照して、発明の内容を特定の実施形態と例を通じてより詳細に説明する。前記添付の図面は、発明の一部の実施形態を含むが、全ての実施形態を含むわけではないことに留意されたい。本明細書によって開示される発明の内容は様々な形態で具体化することができ、ここで説明される特定の実施形態に制限されない。このような実施形態は、本明細書に適用される法的要件を満たすために提供されるものと見なされるべきである。本明細書に開示されている発明が属した技術分野における当業者であれば、本明細書に開示されている発明の内容に対する多くの変形および他の実施形態を思い出すことができるであろう。したがって、本明細書に開示された発明の内容は、ここに記載された特定の実施形態に制限されず、それに対する変形および他の実施形態も特許請求の範囲内に含まれることを理解されたい。
（用語の定義）
約
本明細書で使用される「約」という用語は、ある量にほとんど近い程度を意味し、参照量、レベル、値、数、頻度、パーセント、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％程度に変化する量、レベル、値、数，頻度、パーセント、寸法、サイズ、量、重量または長さを意味する。
クリック化学反応（Ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
本明細書で使用される「クリック化学反応（Ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」は、２つの分子が迅速かつ安定に共有結合を形成するように設計された相補的な化学官能基および化学反応を説明する概念であり、Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＫ．Ｂａｒｒｙ Ｓｈａｒｐｌｅｓｓによって導入された。前記クリック化学反応は、特定の反応を意味するのではなく、迅速で安定した反応の概念を意味する。クリック化学反応は、モジュール化され、広い範囲を有し、高い収率を有し、副産物が重大ではなく、立体特異的、生理学的に安定し、熱力学的に大きな原動力を有し（例えば、８４ｋＪ／ｍｏｌ以上）、高い原子経済性を有するという特徴がある。クリック化学反応の例として、１）ヒュイスゲン１，３－二極性環化付加（Ｈｕｉｓｇｅｎ １，３－ｄｉｐｏｌａｒ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ；Ｔｏｒｎｏｅ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）６７：３０７５－３０６４等参照）、２）ディールス・アルダー反応（Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、３）エポキシド（ｅｐｏｘｉｄｅ）やアジリジン（ａｚｉｒｉｄｉｎｅ）などの小さな歪んだ環（ｓｔｒａｉｎｅｄ ｒｉｎｇ）に対する求核付加反応（Ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ ａｄｄｉｔｉｏｎ）、４）活性化したカルボニル基（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎｙｌ ｇｒｏｕｐ）に対する求核付加反応、および５）炭素－炭素二重結合または三重結合に対する付加反応がある。前記クリック化学反応の意味は文脈によって適切に解釈されるべきであり、他の通常の技術者が認識できる意味をすべて含む。
生体直交反応（Ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ）
本明細書で使用される「生体直交反応（Ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」は生体内の固有分子とは反応が起こらずに、外部から投入された残基同士が選択的に反応することを意味する。ある反応が「生体直交的（Ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）」である場合、前記反応、または反応生成物に生体内の固有分子が関与しないので、体内で非常に安定であるという特性を有する。
標準アミノ酸（ｓｔａｎｄａｒｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）
本明細書で使用される「標準アミノ酸（ｓｔａｎｄａｒｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」という用語は、生物体（ｏｒｇａｎｉｓｍ）の体内での遺伝子の転写および翻訳過程を通じて合成される２０種のアミノ酸を総称して意味する。具体的には、前記標準アミノ酸は、アラニン（Ａｌａｎｉｎｅ；Ａｌａ，Ａ）、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ａｒｇ，Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ａｓｎ，Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ；Ａｓｐ，Ｄ）、システイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ；Ｃｙｓ，Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ；Ｇｌｕ，Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ；Ｇｌｎ，Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｇｌｙ，Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｈｉｓ，Ｈ）、イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ；Ｉｌｅ，Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ；Ｌｅｕ，Ｌ）、リシン（Ｌｙｓｉｎｅ；Ｌｙｓ Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ；Ｍｅｔ，Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｐｈｅ，Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ；Ｐｒｏ，Ｐ）、セリン（Ｓｅｒｉｎｅ；Ｓｅｒ，Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ；Ｔｈｒ，Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ；Ｔｒｐ，Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｔｙｒ，Ｙ），およびバリン（Ｖａｌｉｎｅ；Ｖａｌ，Ｖ）を含む。前記標準アミノ酸それぞれにはいずれも対応するＤＮＡコドンが存在し、一般的なアミノ酸の１文字または３文字表記法で表すことができる。前記標準アミノ酸という用語が指す対象は、文脈に応じて適切に解釈されるべきであり、他の通常の技術者が認識できる意味を全て含む。
非天然アミノ酸（ｎｏｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）
本明細書で使用される「非天然アミノ酸（ｎｏｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」という用語は、体内で合成されずに人工的に合成したアミノ酸を指す。前記非天然アミノ酸は、例えば、４－（１，２，３，４－テトラジン－３－イル）フェニルアラニン（４－（１，２，３，４－ｔｅｔｒａｚｉｎ－３－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）および４－（６－メチル－ｓ－テトラジン－３－イル）フェニルアラニン（４－（６－ｍｅｔｈｙｌ－ｓ－ｔｅｔｒａｚｉｎ－３－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）などがある。前記非天然アミノ酸にはそれに対応するＤＮＡコドンが存在しないため、一般的なアミノ酸の１文字または３文字表記法で表すことができず、他の文字を用いて表記し、さらに補足して説明する。前記非天然アミノ酸という用語が指す対象は、文脈に応じて適切に解釈されるべきであり、他の通常の技術者が認識できる意味を全て含む。
ペプチド配列の記載
特に記載がない限り、本明細書においてペプチドの配列を記載するときは、アミノ酸の１文字表記法または３文字表記法を用いて、Ｎ末端からＣ末端方向に記載する。例えば、ＲＮＶＰと表記する場合、Ｎ末端からＣ末端方向にアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、バリン（ｖａｌｉｎｅ）、およびプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）が順に連結されたペプチドを意味する。また、別の例として、Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓと表記する場合、Ｎ末端からＣ末端方向にスレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、ロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）、およびリシン（Ｌｙｓｉｎｅ）が順に連結されたペプチドを意味する。前記１文字表記法または３文字表記法で表現できないアミノ酸の場合、他の文字を用いて表記し、さらに補足して説明する。
免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）
本明細書で使用される「免疫原性」という用語は、事前に「免疫反応を引き起こす可能性がある抗原として作用する性質」を意味する。特定の抗原の免疫原性を測定するための様々な方法があり、前記方法はその目的に応じて適切に採用または設計することができる。例えば、１）前記抗原を対象の体内に投与する場合、対象の体内でＩｇＧ、ＩｇＡ、および／またはＩｇＥタイプの抗体が生成されるか否かを確認する方法、２）投与周期に応じて、前記ＩｇＧ、ＩｇＡ、および／またはＩｇＥタイプの抗体が生成される時期を確認する方法、３）前記誘導された抗体の前記抗原に対する力価を確認する方法、４）前記誘導された抗体の作用機序が明らかになった場合、前記作用機序による効果を測定する方法があり得るが、これに限定されるものではない。前記免疫原性という用語が指す対象は、文脈に応じて適切に解釈されるべきであり、他の通常の技術者が認識できる意味を全て含む。
（尿酸酸化酵素の痛風治療メカニズム）
痛風の原因
痛風関節炎は、血中尿酸濃度が正常範囲に比べて高い症状である高尿酸血症によって二次的に発生する尿酸塩結晶（ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｕｒａｔｅ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ ｃｒｙｓｔａｌｓ；ＭＳＵ）に対する炎症反応によって発生する。痛風は、肝臓と小腸での尿酸の過剰生産および／または尿酸の排泄の減少が原因となり、体内に尿酸が蓄積して発症する。痛風は一般的に高尿酸血症から出発して急性痛風性関節炎を経験した後、間欠期痛風を経て慢性結節性痛風に進行することになる。
尿酸酸化酵素の痛風治療メカニズム
尿酸酸化酵素（Ｕｒａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ；Ｕｒｉｃａｓｅ）は、ヒトを含む霊長類は自己合成が不可能な酵素の一種で、尿酸をアラントイン（Ａｌｌａｎｔｏｉｎ）に分解する働きをする。前記アラントインは尿酸に比べて溶解度が５倍～１０倍高く、腎臓で排泄されやすいという特徴がある。したがって、尿酸酸化酵素を治療剤として使用する場合、痛風発生の主な原因である尿酸の蓄積を防止し、尿酸を体外に排泄することによって痛風を治療することができる。
尿酸酸化酵素の痛風治療剤としての限界点
前記尿酸酸化酵素は、痛風発生の主な原因である尿酸を排泄可能な形に分解する直接的な治療メカニズムを有し、したがって強力な尿酸降下効果を有するという利点がある。しかし、前記尿酸酸化酵素はタンパク質薬物であるため、１）体内での半減期が短く、注射剤としてのみ使用可能であり、２）外部由来タンパク質であるため、体内に投与される場合、免疫反応が発生し、これによる副作用が発生するという欠点があって痛風治療剤として使用されることに制限がある。
（従来技術の限界点）
市販の尿酸酸化酵素に基づく薬物の限界点
現在市販されている尿酸酸化酵素に基づく薬物（ＫＲＹＳＴＥＸＸＡ；ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ）は、前記尿酸酸化酵素の限界点である短い半減期を改善するために、尿酸酸化酵素にランダムにポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ；ＰＥＧ）を結合させて使用する。しかし、１）前記尿酸酸化酵素がランダムにペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）されることによって酵素の活性部位を遮断して効能が低下し、２）前記ＰＥＧが体内でアレルギー反応を起こす副作用があるという限界点がある。
従来の尿酸酸化酵素－アルブミン結合体技術の限界点
本発明者は、従来の先行文献登録公報ＫＲ１６３７０１０Ｂ１で尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を開示したことがある。前記先行文献に開示された尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、前記尿酸酸化酵素の１つ以上のアミノ酸を非天然アミノ酸であるＡｚＦ（ｐ－Ａｚｉｄｏ－Ｌ－ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）に置き換え、ジベンゾシクロオクチン（ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ；ＤＢＣＯ）反応基を有するリンカーを用いて尿酸酸化酵素およびアルブミンを、リンカーを介して結合させたものである。しかし、前記先行文献に開示された尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、結合部のＡｚＦおよびＤＢＣＯの結合反応である歪み誘導環化付加反応（Ｓｔｒａｉｎ－Ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ；ＳＰＡＡＣ）の速度が遅く、収率が非常に低いという問題点がある。したがって、前記先行文献に開示された尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸酸化酵素内のアルブミンが結合できる部位が少なくとも４箇所あるにも関わらず、ＳＰＡＡＣ反応の非効率性のために、尿酸酸化酵素の１単位当たり１～２個のアルブミンが結合した尿酸酸化酵素－アルブミン結合体しか得られないという限界点がある。上記の限界点により、先行文献に開示されている尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、１）アルブミン結合による半減期増大または免疫原性減少効果が制限され、２）アルブミンが結合しなかったＡｚＦの残基が露出して体内で意図しなかった反応を引き起こす可能性があるという問題点がある。
（尿酸酸化酵素－アルブミン結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ））
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の概要
本明細書は、尿酸酸化酵素－アルブミン結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を開示する。前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸酸化酵素変異体およびアルブミンがリンカーを介して連結したものである。前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、前記尿酸酸化酵素変異体に３つ以上のアルブミンがリンカーを介して結合されたことを特徴とする。前記尿酸酸化酵素変異体は、野生型尿酸酸化酵素配列で１つ以上のアミノ酸が非天然アミノ酸に置換したものであり、リンカーとアルブミンは前記非天然アミノ酸の残基を介して連結される。具体的には、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸酸化酵素変異体；尿酸酸化酵素変異体およびリンカーが結合して形成された尿酸酸化酵素－リンカー結合部；リンカー内に含まれるアンカー；アルブミンおよびリンカーが結合して形成されたアルブミン－リンカー結合部；およびアルブミンを含む。以下、各構成要素（尿酸酸化酵素変異体、アルブミン、リンカー）および前記構成要素が結合した結果である尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の構造について、より具体的に説明する。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の構成要素１－尿酸酸化酵素変異体
尿酸酸化酵素は、体内で尿酸をアラントイン（Ａｌｌａｎｔｏｉｎ）に分解する機能を有する酵素であり、尿酸が蓄積して発生する各種病気や疾患を治療する用途で使用することができる。前記尿酸酸化酵素は、４つの尿酸酸化酵素サブユニットがオリゴマー化（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）されて形成された四量体（ｔｅｔｒａｍｅｒ）である。本明細書に開示される尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸酸化酵素変異体を含むが、これは野生型尿酸酸化酵素配列で１つ以上のアミノ酸を非天然アミノ酸（ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）に置き換えたものである。具体的には、前記尿酸酸化酵素変異体は四量体のタンパク質であり、４つのサブユニットのうち３つまたは４つが尿酸酸化酵素変異体サブユニットであり、このとき、前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットの配列は野生型尿酸酸化酵素サブユニットの配列と比較して１つ以上のアミノ酸が非天然アミノ酸に置き換えたものである。野生型尿酸酸化酵素に非天然アミノ酸を挿入して尿酸酸化酵素変異体を作る目的は、前記非天然アミノ酸の残基およびリンカーを逆電子要求ディールス・アルダー反応（Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＩＥＤＤＡ反応）を利用して連結させるためである。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の構成要素２－アルブミン
前記アルブミンは、ヒト血清アルブミンおよび／またはヒト血清アルブミンの変異体を指し、前記尿酸酸化酵素変異体に対する薬物担体として機能する。前記アルブミンは、前記尿酸酸化酵素変異体が単独である場合と比較して、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体が向上した体内の半減期および低い免疫原性を示すようにする。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の構成要素３－リンカー
前記リンカーは、前記尿酸酸化酵素変異体および前記アルブミンを連結するためのものであり、尿酸酸化酵素変異体と結合できるＩＥＤＤＡ反応基、アルブミンと結合できるチオール反応基、およびアンカーを含む。前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体において前記ＩＥＤＤＡ反応基および前記チオール反応基はそれぞれ前記尿酸酸化酵素変異体および前記アルブミンと結合しているので、リンカーに含まれる原型のままではなく、尿酸酸化酵素－リンカー結合部およびアルブミン－リンカー結合部に変形している。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の構造１－サブユニット－アルブミン結合体
本明細書に開示される尿酸酸化酵素－アルブミン結合体に含まれる尿酸酸化酵素変異体は、４つのサブユニットがオリゴマー化して形成された四量体であり、前記サブユニットのうちの３つ以上はリンカーを介してアルブミンと結合されていることを特徴とする。前記尿酸酸化酵素変異体をなすサブユニットのうちリンカーを介してアルブミンと結合されているものをサブユニット－アルブミン結合体という。前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体に含まれる前記尿酸酸化酵素変異体は、３つ以上の尿酸酸化酵素変異体サブユニットを含む。このとき、前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットの一部または全部は、アルブミンと結合したサブユニット－アルブミン結合体である。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の構造２－尿酸酸化酵素－リンカー結合部
本明細書に開示される尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸酸化酵素変異体とアルブミンがリンカーを介して結合したものである。このとき、前記尿酸酸化酵素変異体とリンカーが結合した部分を尿酸酸化酵素－リンカー結合部という。前記尿酸酸化酵素変異体とリンカーは、ＩＥＤＤＡ反応を介して結合したことを特徴とする。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の構造３－アルブミン－リンカー結合部
本明細書に開示される尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸酸化酵素変異体とアルブミンがリンカーを介して結合したものである。このとき、前記アルブミンとリンカーが結合した部分をアルブミン－リンカー結合部という。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の構造４－アンカー
前記リンカーは、前記尿酸酸化酵素変異体と結合できるＩＥＤＤＡ反応基、およびアルブミンと結合できるチオール反応基を含み、それらを１つに連結するアンカーを含む。前記アンカーは、尿酸酸化酵素とアルブミンとを連結させる反応に関与しない部分であるため、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体内に、リンカーに含まれる構造そのまま残っていることが特徴である。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の構造例１－尿酸酸化酵素の観点
一実施例として、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は次に［化学式１］で表される。
［化学式１］
Ｕｏｘ－［Ｊ１－Ａ－Ｊ２－ＨＳＡ］ｎ
このとき、前記Ｕｏｘは尿酸酸化酵素変異体、
前記Ｊ１は尿酸酸化酵素－リンカー結合部、
前記Ａはアンカー、
前記Ｊ２はアルブミン－リンカー結合部、
前記ＨＳＡはヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）を意味して、
前記ｎは３または４である。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の構造例２－尿酸酸化酵素サブユニットの観点
一実施例として、前記サブユニット－アルブミン結合体は次に［化学式２］で表される。
［化学式２］
ｐ'－Ｊ１－Ａ－Ｊ２－ＨＳＡ
このとき、前記ｐ'は尿酸酸化酵素変異体サブユニットであり、残りは上記で定義した通りである。
一実施例として、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、１つの野生型尿酸酸化酵素サブユニットおよび３つのサブユニット－アルブミン結合体を含む。具体的には、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体において、１つの前記野生型尿酸酸化酵素サブユニットおよび前記それぞれのサブユニット－アルブミン結合体に含まれる３つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化して四量体を成す。
一実施例として、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、１つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットおよび３つのサブユニット－アルブミン結合体を含む。具体的には、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体において、１つの前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットおよび前記それぞれのサブユニット－アルブミン結合体に含まれる３つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化して四量体を成す。
一実施例として、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、４つのサブユニット－アルブミン結合体を含む。具体的には、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体において、前記それぞれのサブユニット－アルブミン結合体に含まれる４つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化して四量体を成す。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の特徴１－アルブミン結合による半減期増大効果
前述したように、薬物分子にアルブミンを結合させる場合、体内の半減期が増大する効果がある。本明細書で提供する尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、治療用タンパク質である尿酸酸化酵素にアルブミンを結合させることによって、体内の半減期が増大したという特徴がある。向上した体内の半減期は、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を体内に投与した後、薬動力学的評価（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｐｒｏｆｉｌｅ）実験により確認することができ、実験例４で確認することができる。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の特徴２－尿酸酸化酵素の活性を阻害しない
先行技術の限界点の１つは、尿酸酸化酵素に薬物担体、例えば、アルブミンまたはポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ；ＰＥＧ）等を結合させて効能の増大を図ったが、このような薬物担体が立体構造上の尿酸酸化酵素の活性部位を遮断するなど活性を阻害し、その結果、薬効が減少するということである。本明細書に開示される尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸酸化酵素の活性を阻害しない部分にアルブミンを位置－特異的に結合させることによって、薬効を減少させないという特徴がある。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の特徴３－免疫原性減少効果
ヒトは尿酸酸化酵素を生産しないことが知られており、治療用で主に使用される尿酸酸化酵素は微生物由来の酵素である。このような尿酸酸化酵素は微生物由来の外来タンパク質であるため、体内に単独で投与されると免疫反応を起こし、副作用が現れる。したがって、前記尿酸酸化酵素の免疫原性を低減することが重要な課題である。本明細書に開示される前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、前記尿酸酸化酵素を人体血漿タンパク質であるアルブミンと結合させて尿酸酸化酵素の免疫原性を減少させたという特徴がある。前記アルブミンは、血漿タンパク質の大部分を構成する物質であり、人体内で非常に安定しており、免疫原性をほとんど現わさない。したがって、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸酸化酵素単独で体内に投与された場合と比較して、著しく低い免疫原性を示す。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の特徴４－尿酸酸化酵素に３つまたは４つのアルブミンを含む
従来の尿酸酸化酵素－アルブミン結合体技術は、尿酸酸化酵素変異体およびアルブミンを歪み促進型アルキン－アジド付加環化反応（Ｓｔｒａｉｎ－Ｐｒｏｍｏｔｅｄ Ａｌｋｙｎｅ－Ａｚｉｄｅ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＳＰＡＡＣ反応））によって連結した。前記ＳＰＡＡＣ反応は、その速度が比較的遅く、収率が低いため、前記尿酸酸化酵素変異体に１つまたは２つのアルブミンが結合した尿酸酸化酵素－アルブミン結合体しか提供できないという限界点がある。本明細書で提供する尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸酸化酵素変異体およびアルブミンを、反応速度が比較的速く、収率が非常に高いＩＥＤＤＡ反応を介して連結することによって、１つの尿酸酸化酵素変異体に３つ以上のアルブミンが結合していることが特徴である。前記特徴により、１）前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の半減期増大効果および免疫原性減少効果を最大化することができ、２）非天然アミノ酸の残基が露出することが最小化されるので、これによる副作用が最小化されるという利点がある。
（尿酸酸化酵素変異体）
尿酸酸化酵素変異体の概要
本明細書に開示される尿酸酸化酵素－アルブミン結合体に含まれる尿酸酸化酵素変異体は、微生物由来の野生型尿酸酸化酵素のアミノ酸配列の一部が変形されたことを特徴とする。前記尿酸酸化酵素変異体は３つ以上の非天然アミノ酸を含み、それぞれの非天然アミノ酸残基を介して位置－特異的にアルブミンと結合することができる。具体的には、前記尿酸酸化酵素変異体は、４つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化して形成された四量体であり、それぞれの尿酸酸化酵素変異体サブユニットは野生型尿酸酸化酵素サブユニットと比較してその配列内の１つ以上のアミノ酸が非天然アミノ酸に置き換えたことを特徴とする。
野生型尿酸酸化酵素の由来微生物
本明細書で提供する前記尿酸酸化酵素変異体の原型となる野生型尿酸酸化酵素は、微生物に由来したものである。一実施例として、前記野生型尿酸酸化酵素は、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｆｌａｖｕｓ）、アルスロバクター・グロビフォルミスアルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）、およびカンジダス・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａｓ Ｕｔｉｌｉｓ）から選択される微生物由来の尿酸酸化酵素であり得る。
野生型尿酸酸化酵素の例示配列
前記野生型尿酸酸化酵素は、同じ４つの野生型尿酸酸化酵素サブユニットがオリゴマー化された四量体（ｔｅｔｒａｍｅｒ）タンパク質である。
一実施例として、前記野生型尿酸酸化酵素がアスペルギルス・フラバス由来の尿酸酸化酵素である場合、そのサブユニットのペプチド配列はＮ末端からＣ末端方向に、ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号１）であり得る。
また、他の実施形態として、前記野生型尿酸酸化酵素がカンジダ・ユチリス由来の尿酸酸化酵素である場合、そのサブユニットのペプチド配列はＮ末端からＣ末端方向に、ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫ ＴＫＬ（配列番号５１）であり得る。
また、他の実施形態として、前記野生型尿酸酸化酵素がアルスロバクター・グロビフォルミス由来の尿酸酸化酵素である場合、そのサブユニットのペプチド配列はＮ末端からＣ末端方向に、ＭＴＡＴＡＥＴＳＴＧＴＫＶＶＬＧＱＮＱＹＧＫＡＥＶＲＬＶＫＶＴＲＮＴＡＲＨＥＩＱＤＬＮＶＴＳＱＬＲＧＤＦＥＡＡＨＴＡＧＤＮＡＨＶＶＡＴＤＴＱＫＮＴＶＹＡＦＡＲＤＧＦＡＴＴＥＥＦＬＬＲＬＧＫＨＦＴＥＧＦＤＷＶＴＧＧＲＷＡＡＱＱＦＦＷＤＲＩＮＤＨＤＨＡＦＳＲＮＫＳＥＶＲＴＡＶＬＥＩＳＧＳＥＱＡＩＶＡＧＩＥＧＬＴＶＬＫＳＴＧＳＥＦＨＧＦＰＲＤＫＹＴＴＬＱＥＴＴＤＲＩＬＡＴＤＶＳＡＲＷＲＹＮＴＶＥＶＤＦＤＡＶＹＡＳＶＲＧＬＬＬＫＡＦＡＥＴＨＳＬＡＬＱＱＴＭＹＥＭＧＲＡＶＩＥＴＨＰＥＩＤＥＩＫＭＳＬＰＮＫＨＨＦＬＶＤＬＱＰＦＧＱＤＮＰＮＥＶＦＹＡＡＤＲＰＹＧＬＩＥＡＴＩＱＲＥＧＳＲＡＤＨＰＩＷＳＮＩＡＧＦＣ（配列番号１１８）であり得る。
尿酸酸化酵素変異体サブユニット
前記野生型尿酸酸化酵素と同様に、前記尿酸酸化酵素変異体も４つのサブユニットを含む四量体タンパク質である。前記尿酸酸化酵素変異体は、３つまたは４つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットを含み、前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、その原型となる野生型尿酸酸化酵素サブユニットで１つ以上のアミノ酸が非天然アミノ酸に置き換えたことを特徴とする。一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体は、３つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットおよび１つの野生型尿酸酸化酵素サブユニットを含むことができる。また、他の実施形態では、前記尿酸酸化酵素変異体は、４つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットを含むことができる。以下、「尿酸酸化酵素変異体サブユニット」の段落でより具体的に説明する。
尿酸酸化酵素変異体の製造方法
本明細書では、前記尿酸酸化酵素変異体を製造する方法を開示する。前記尿酸酸化酵素変異体は、１つ以上の非天然アミノ酸を含み、自然界では非天然アミノ酸に対応する核酸コドンは存在しない。このような非天然アミノ酸を含むタンパク質を細胞内で生合成するためには、上記の非天然アミノ酸に対応する核酸コドンがないという問題を解決しなければならない。自然界で利用される３種の終結コドンは、アミノ酸をコードしないことを利用して、このような問題を効果的に解決した方法が先行文献ＫＲ１６３７０１０Ｂ１等に開示されている。前記尿酸酸化酵素変異体を製造する方法は、前記先行文献ＫＲ１６３７０１０Ｂ１に示された方法を参照し、１）終結コドンを認識して非天然アミノ酸を配列内に導入する機能を有する直交的ｔＲＮＡ／合成酵素ペア、および２）前記尿酸酸化酵素変異体の配列のうち、非天然アミノ酸の部位を終結コドンにコードした核酸を使用する。以下、「尿酸酸化酵素変異体の製造方法」の段落でより具体的に説明する。
尿酸酸化酵素変異体をコードするベクター
本明細書では、前記尿酸酸化酵素変異体の合成方法に使用される前記尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターを開示する。前記尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターは、野生型尿酸酸化酵素をコードする核酸配列のうち、非天然アミノ酸に置き換えようとする位置の核酸コドンが終結コドンに変更されたことを特徴とする。以下、「尿酸酸化酵素変異体をコードするベクター」の段落でより具体的に説明する。
（尿酸酸化酵素変異体サブユニット）
尿酸酸化酵素変異体サブユニット１－非天然アミノ酸置換
前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットは１つ以上の非天然アミノ酸を含み、前記非天然アミノ酸はリンカーとＩＥＤＤＡ反応を介して結合できる官能基を有することを特徴とする。一実施例として、前記非天然アミノ酸はＩＥＤＤＡ反応を起こすことができるジエン官能基（Ｄｉｅｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）を含むアミノ酸であり得る。具体的には、前記ジエン官能基は、テトラジン官能基（ｔｅｔｒａｚｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）またはその誘導体、および／またはトリアジン官能基（ｔｒｉａｚｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）またはその誘導体であり得る。より具体的には、前記非天然アミノ酸は、４－（１，２，３，４－テトラジン－３－イル）フェニルアラニン（ｆｒＴｅｔ）、４－（６－メチル－ｓ－テトラジン－３－イル）フェニルアラニン（Ｔｅｔ－ｖ２．０）、３－（４－（１，２，４－トリアジン－６－イル）フェニル）－２－アミノプロパン酸、２－アミノ－３－（４－（２－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）エチル）フェニル）プロパン酸、２－アミノ－３－（４－（６－フェニル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）プロパン酸、３－（４－（（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）アミノ）フェニル）－２－アミノプロパン酸、３－（４－（２－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）エチル）フェニル）－２－アミノプロパン酸、３－（４－（（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）チオ）フェニル）－２－アミノプロパン酸、２－アミノ－３－（４－（（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）チオ）フェニル）プロパン酸、３－（４－（（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）オキシ）フェニル）－２－アミノプロパン酸、２－アミノ－３－（４－（（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）オキシ）フェニル）プロパン酸、３－（４'－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）－［１，１'－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸、２－アミノ－３－（４'－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）－［１，１'－ビフェニル］－４－イル）プロパン酸、２－アミノ－３－（６－（６－（ピリジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ピリジン－３－イル）プロパン酸、３－（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）－２－アミノプロパン酸、および２－アミノ－３－（４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）プロパン酸からなる群から選択されるものであり得る。
尿酸酸化酵素変異体サブユニット２－非天然アミノ酸の例
一実施例として、前記非天然アミノ酸は、以下の中から選択されるものであり得る。
尿酸酸化酵素変異体サブユニット３－置換位置
野生型尿酸酸化酵素に非天然アミノ酸を挿入して尿酸酸化酵素変異体を作るとき、本来尿酸酸化酵素の構造と機能にはできるだけ影響を与えてはならないので、尿酸酸化酵素の活性および構造において重要な役割を果たすアミノ酸を非天然アミノ酸に置き換えることはできない。また、前記非天然アミノ酸は、尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造過程でリンカーと結合しなければならないため、尿酸酸化酵素の立体構造上、溶媒接近性が比較的高い位置のアミノ酸を置き換えることが有利である。野生型尿酸酸化酵素の構造と機能への影響を最小限に抑えながら、溶媒接近性の高い部位を選別するために様々な方法を使用することができる。例えば、分子モデリング計算により、野生型尿酸酸化酵素に固有の原子エネルギーに似ているが、溶媒接近性は高い候補位置を選別することができる。
一実施例として、尿酸酸化酵素変異体を作るために前記野生型尿酸酸化酵素配列のうちの非天然アミノ酸に置き換える位置は分子モデリングシミュレーション結果を参照して決定することができる。具体的には、前記分子モデリングシミュレーション結果は、Ｒｏｓｅｔｔａ分子モデリングパッケージのスコアリング結果であり得る。
尿酸酸化酵素変異体サブユニット４－置換位置の例
一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号１のペプチド配列の１３７番目のグリシン、２２番目のグルタミン酸、９２番目のアスパラギン、２３番目のリシン、２９５番目のセリン、１１３番目のグリシン、２７３番目のリシン、１７１番目のリシン、２４０番目のアラニン、８９番目のグルタミン酸、２６６番目のリシン、２４番目のスレオニン、４８番目のリシン、１９２番目のセリン、２０２番目のプロリン、１１０番目のアスパラギン酸、２４３番目のグルタミン、１９５番目のグルタミン、１３８番目のリシン、１１５番目のプロリン、１９９番目のセリン、２７２番目のグリシン、リシン４、１１２番目のアスパラギン酸、２６７番目のグリシン、１１４番目のリシン、７０番目のグルタミン、１７４番目のトリプトファン、２２３番目のアスパラギン、４１番目のグルタミン酸、２６１番目のアスパラギン酸、２５番目のグリシン、５２番目のセリン、２４１番目のアルギニン、２１３番目のグルタミン酸、２７４番目のアスパラギン、２２１番目のグルタミン酸、２０６番目のアラニン、２３６番目のグルタミン酸、１６４番目のアルギニン、２６９番目のグルタミン、１３６番目のグルタミン酸、２５９番目のグルタミン酸、２４６番目のグルタミン酸、４９番目のアラニン、１４８番目のグリシン、１９番目のヒスチジン、２９６番目のセリン、および４７番目のスレオニンのうちの選択された１つ以上のアミノ酸が非天然アミノ酸に置き換えたものであり得る。
一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号５１のペプチド配列の３０１番目のスレオニン、２６番目のアスパラギン、３０３番目のロイシン、１９４番目のリシン、９５番目のセリン、１４０番目のセリン、１１６番目のグリシン、３０２番目のリシン、１６７番目のリシン、１１５番目のアスパラギン酸、２９９番目のグルタミン酸、２４番目のプロリン、２７１番目のトリプトファン、２７７番目のアスパラギン酸、１６９番目のアスパラギン酸、１１８番目のプロリン、１７７番目のスレオニン、１７４番目のグルタミン、２０８番目のリシン、２７５番目のグルタミン酸、２６６番目のロイシン、２７３番目のグリシン、２００番目のチロシン、９２番目のグルタミン酸、２４７番目のグルタミン酸、２２８番目のロイシン、３００番目のリシン、２０４番目のリシン、５１番目のグルタミン酸、２０７番目のアスパラギン酸、１１７番目のリシン、２５０番目のシステイン、１７５番目のプロリン、２７０番目のリシン、２６８番目のアスパラギン酸、４４番目のグリシン、１９３番目のアスパラギン、１６４番目のグリシン、７３番目のスレオニン、２９番目のリシン、２３０番目のアスパラギン、２５番目のグルタミン、２１６番目のアスパラギン、５５番目のセリン、２８番目のリシン、６番目のセリン、２７番目のプロリン、２９８番目のリシン、１１３番目のアラニン、２１３番目のアスパラギン、２２０番目のグルタミン酸、１４１番目のグリシン、１６３番目のチロシン、２５３番目のチロシン、１７８番目のアスパラギン酸、９３番目のリシン、１０３番目のリシン、１４４番目のリシン、１３９番目のアルギニン、１３８番目のリシン、セリン７、１５１番目のアスパラギン酸、２９７番目のアルギニン、２７２番目のリシン、２７８番目のアスパラギン、および２６５番目のフェニルアラニンのうちの選択された１つ以上のアミノ酸が非天然アミノ酸に置き換えたものであり得る。
一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号１１８のペプチド配列の８０番目のアスパラギン酸、８２番目のフェニルアラニン、１００番目のフェニルアラニン、１０１番目のアスパラギン酸、１１４番目のフェニルアラニン、１１９番目のアスパラギン、１２０番目のアスパラギン酸、１４２番目のセリン、１４３番目のグルタミン酸、１７５番目のグリシン、１９５番目のバリン、１９６番目のグルタミン酸、２１８番目のヒスチジン、２３８番目のプロリンのうちの選択された１つ以上のアミノ酸が非天然アミノ酸に置き換えたものであり得る。
尿酸酸化酵素変異体サブユニット５－例示配列
一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体がアスペルギルス・フラバス由来の尿酸酸化酵素の配列の一部を変形させたものである場合、前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットは配列番号２～５０で表すことができる。このとき、配列内のＸは、４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニルアラニン（ｆｒＴｅｔ）、４－（６－メチル－ｓ－テトラジン－３－イル）フェニルアラニン（Ｔｅｔ－ｖ２．０）、３－（４－（１，２，４－トリアジン－６－イル）フェニル）－２－アミノプロパン酸、２－アミノ－３－（４－（２－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）エチル）フェニル）プロパン酸、２－アミノ－３－（４－（６－フェニル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）プロパン酸、３－（４－（（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）アミノ）フェニル）－２－アミノプロパン酸、３－（４－（２－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）エチル）フェニル）－２－アミノプロパン酸、３－（４－（（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）チオ）フェニル）－２－アミノプロパン酸、２－アミノ－３－（４－（（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）チオ）フェニル）プロパン酸、３－（４－（（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）オキシ）フェニル）－２－アミノプロパン酸、２－アミノ－３－（４－（（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）オキシ）フェニル）プロパン酸、３－（４'－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）－［１，１'－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸、２－アミノ－３－（４'－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）－［１，１'－ビフェニル］－４－イル）プロパン酸、２－アミノ－３－（６－（６－（ピリジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ピリジン－３－イル）プロパン酸、３－（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）－２－アミノプロパン酸、および２－アミノ－３－（４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）プロパン酸からなる群から選択されたものである。
一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体がカンジダ・ユチリス由来の尿酸酸化酵素の配列の一部を変形させたものである場合、前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットは配列番号５２～１１７で表すことができる。このとき、配列内のＸは、４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニルアラニン（ｆｒＴｅｔ）、４－（６－メチル－ｓ－テトラジン－３－イル）フェニルアラニン（Ｔｅｔ－ｖ２．０）、３－（４－（１，２，４－トリアジン－６－イル）フェニル）－２－アミノプロパン酸、２－アミノ－３－（４－（２－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）エチル）フェニル）プロパン酸、２－アミノ－３－（４－（６－フェニル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）プロパン酸、３－（４－（（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）アミノ）フェニル）－２－アミノプロパン酸、３－（４－（２－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）エチル）フェニル）－２－アミノプロパン酸、３－（４－（（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）チオ）フェニル）－２－アミノプロパン酸、２－アミノ－３－（４－（（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）チオ）フェニル）プロパン酸、３－（４－（（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）オキシ）フェニル）－２－アミノプロパン酸、２－アミノ－３－（４－（（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）オキシ）フェニル）プロパン酸、３－（４'－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）－［１，１'－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸、２－アミノ－３－（４'－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）－［１，１'－ビフェニル］－４－イル）プロパン酸、２－アミノ－３－（６－（６－（ピリジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ピリジン－３－イル）プロパン酸、３－（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）－２－アミノプロパン酸、および２－アミノ－３－（４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）プロパン酸からなる群から選択されたものである。
一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体がアルスロバクター・グロビフォルミス由来の尿酸酸化酵素の配列の一部を変形させたものである場合、前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットは配列番号１１９～１３２で表すことができる。このとき、配列内のＸは、４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニルアラニン（ｆｒＴｅｔ）、４－（６－メチル－ｓ－テトラジン－３－イル）フェニルアラニン（Ｔｅｔ－ｖ２．０）、３－（４－（１，２，４－トリアジン－６－イル）フェニル）－２－アミノプロパン酸、２－アミノ－３－（４－（２－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）エチル）フェニル）プロパン酸、２－アミノ－３－（４－（６－フェニル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）プロパン酸、３－（４－（（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）アミノ）フェニル）－２－アミノプロパン酸、３－（４－（２－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）エチル）フェニル）－２－アミノプロパン酸、３－（４－（（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）チオ）フェニル）－２－アミノプロパン酸、２－アミノ－３－（４－（（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）チオ）フェニル）プロパン酸、３－（４－（（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）オキシ）フェニル）－２－アミノプロパン酸、２－アミノ－３－（４－（（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）オキシ）フェニル）プロパン酸、３－（４'－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）－［１，１'－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸、２－アミノ－３－（４'－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）－［１，１'－ビフェニル］－４－イル）プロパン酸、２－アミノ－３－（６－（６－（ピリジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ピリジン－３－イル）プロパン酸、３－（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）－２－アミノプロパン酸、および２－アミノ－３－（４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）プロパン酸からなる群から選択されたものである。
尿酸酸化酵素変異体サブユニット６－例示配列と類似の配列含む
一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号１～１３２から選択された配列と５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％一致する配列を有することができる。一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号１～１３２から選択された配列と直前の文から選択された数値範囲内に一致する配列を有することができる。例えば、前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号１～１３２から選択された配列と８０％～１００％一致する配列を有することができる。また、別の例として、前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号１～１３２から選択された配列と９５％以上一致する配列を有することができる。
（尿酸酸化酵素変異体の製造方法）
尿酸酸化酵素変異体の製造方法の概要
本明細書では、尿酸酸化酵素変異体の製造方法を開示する。前記尿酸酸化酵素変異体の製造方法には、尿酸酸化酵素変異体を発現させる細胞株；特定の終結コドンを認識する外来由来サプレッサーｔＲＮＡ（ｆｏｒｅｉｇｎ サプレッサーｔＲＮＡ）；外来由来ｔＲＮＡ合成酵素（ｆｏｒｅｉｇｎ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）；および前記終結コドンを利用して非天然アミノ酸をコードした、尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターのような構成要素が関与する。ここで、前記外来由来サプレッサーｔＲＮＡおよび前記外来由来ｔＲＮＡ合成酵素は、前記発現細胞株固有のサプレッサーｔＲＮＡおよびｔＲＮＡ合成酵素ではなく、発現細胞株とは異なる細胞に由来したものである。したがって、前記外来由来サプレッサーｔＲＮＡは前記発現細胞株固有のｔＲＮＡ合成酵素と反応しないことを特徴とする。前記外来由来ｔＲＮＡ合成酵素は、ｉ）前記外来由来サプレッサーｔＲＮＡとのみ反応し、ｉｉ）前記尿酸酸化酵素変異体に含ませる非天然アミノ酸にのみ活性を示す。その結果、前記外来由来ｔＲＮＡ合成酵素を使用する場合、前記外来由来サプレッサーｔＲＮＡに前記非天然アミノ酸を特異的に連結してペプチド配列内に前記非天然アミノ酸を導入することができる。
前記尿酸酸化酵素変異体の製造方法は、１）前記細胞株内で、２）前記外来由来サプレッサーｔＲＮＡおよび外来由来ｔＲＮＡ合成酵素が関与し、３）前記尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターに基づいて、４）前記尿酸酸化酵素変異体が発現されるようにする方法である。前記尿酸酸化酵素変異体の製造方法において、前記細胞株内に前記尿酸酸化酵素変異体が発現されれば、各工程の順序は特に制限されず、必要に応じて追加の工程を含むことができる。
尿酸酸化酵素変異体の発現細胞株
前記尿酸酸化酵素変異体の製造方法は、前記尿酸酸化酵素変異体を細胞株内で発現させて得ることを特徴とする。前記尿酸酸化酵素変異体の発現細胞株は、前記尿酸酸化酵素変異体を生産できるものであれば、特に制限されない。ただし、前記細胞株内の終結コドンを認識する終結因子（ｒｅｌｅａｓｅ ｆａｃｔｏｒ）が正常に機能する場合、前記終結因子が前記外来由来ｔＲＮＡと競合的に作用して収率が低下してしまう問題がある。したがって、終結コドンを認識する終結因子が不活性化された細胞株を使用することが好ましい。
一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体を発現させる細胞株は、以下から選択されるものであり得る。
エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属；エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属；セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属；プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属；コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属；レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属；サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｒ）属；プレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属；ハイフォモナス（Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ）属；クロモバクテリウム（ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｏｒｉｕｍ）属；ノカルジア（ｎｏｒｃａｒｄｉａ）属；菌類（Ｆｕｎｇｉ）；および酵母類（Ｙｅａｓｔ）。
一実施例として、前記細胞株は、終結コドンを認識して翻訳を終結させる終結因子が不活性化されたものであり得る。具体的には、前記終結コドンは、アンバーコドン（ａｍｂｂｅｒ ｃｏｄｏｎ；５'－ＵＡＧ－３'）、オーカーコドン（ｏｃｈｅｒ ｃｏｄｏｎ；５'－ＵＡＡ－３'）、およびオパールコドン（ｏｐａｌ ｃｏｄｏｎ；５'－ＵＧＡ－３'）のうちから選択されるものであり得る。
一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体を発現させる細胞株は、登録公報ＫＲ１６３７０１０Ｂ１で使用される細胞株であり得る。具体的には、前記細胞株は、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｃ３２１．ΔＡ．ｅｘｐ（Ａｄｄｇｅｎｅ，ＩＤ：４９０１８）であり得る。
外来由来サプレッサーｔＲＮＡ
前記外来由来サプレッサーｔＲＮＡは、特定の終結コドンを認識する機能を有するｔＲＮＡであり、発現細胞株固有のｔＲＮＡ合成酵素とは反応しない。前記外来由来サプレッサーｔＲＮＡは前記外来由来ｔＲＮＡ合成酵素と特異的に反応し、前記外来由来ｔＲＮＡ合成酵素は前記外来由来サプレッサーｔＲＮＡに非天然アミノ酸を連結する機能をする。その結果、前記外来由来サプレッサーｔＲＮＡは前記特定の終結コドンを認識して、該当位置に前記非天然アミノ酸を導入することができる。
一実施例として、前記サプレッサーｔＲＮＡは、アンバーコドン（ａｍｂｂｅｒ ｃｏｄｏｎ；５'－ＵＡＧ－３'）、オーカーコドン（ｏｃｈｅｒ ｃｏｄｏｎ；５'－ＵＡＡ－３'）、およびオパールコドン（ｏｐａｌ ｃｏｄｏｎ；５'－ＵＧＡ－３'）から選択されるものを認識することができる。好ましくは、前記サプレッサーｔＲＮＡはアンバーコドンを認識するものであってもよい。例えば、前記サプレッサーｔＲＮＡは＿Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ＿由来のサプレッサーｔＲＮＡ（ＭｊｔＲＮＡ＾Ｔｙｒ＾～ＣＵＡ～）であり得る（Ｙａｎｇ ｅｔ．ａｌ，Ｔｅｍｐｏｒａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｔｅｔｒａｚｉｎｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎｖｅｒｓｅ－Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０２０，２４５６－２４６４）。
外来由来ｔＲＮＡ合成酵素（ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）
前記外来由来ｔＲＮＡ合成酵素は、特定の非天然アミノ酸と選択的に反応し、前記外来由来サプレッサーｔＲＮＡに前記特定の非天然アミノ酸を連結する機能をする。前記外来由来ｔＲＮＡ合成酵素は、前記発現細胞株固有のサプレッサーｔＲＮＡとは反応せず、前記外来由来サプレッサーｔＲＮＡにのみ特異的に反応する。一実施例として、前記ｔＲＮＡ合成酵素は、テトラジン（ｔｅｔｒａｚｉｎｅ）誘導体および／またはトリアジン（ｔｒｉａｚｉｎｅ）誘導体を含む非天然アミノ酸を前記外来由来サプレッサーｔＲＮＡに連結する機能を有することができる。一実施例として、前記ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のｔｙｒｏｓｙｌ－ｔＲＮＡ合成酵素（ＭｊＴｙｒＲＳ）であり得る（Ｙａｎｇ ｅｔ．ａｌ，Ｔｅｍｐｏｒａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｔｅｔｒａｚｉｎｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎｖｅｒｓｅ－Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０２０，２４５６－２４６４）。好ましくは、前記ｔＲＮＡ合成酵素は、前記ＭｊＴｙｒＲＳのＣ１１変形体であり得る。
直交的ｔＲＮＡ／合成酵素ペア（Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔＲＮＡ／ｓｙｎｔｅｔａｓｅ ｐａｉｒ）
本明細書では、１）外来由来ｔＲＮＡ合成酵素とのみ特異的に反応する外来由来サプレッサーｔＲＮＡ、および２）前記外来由来ｔＲＮＡ合成酵素を総称して直交的ｔＲＮＡ／合成酵素ペアと称する。本明細書に開示される尿酸酸化酵素変異体の製造方法において、前記発現細胞株内で前記直交的ｔＲＮＡ／合成酵素ペアを発現させることが重要であり、このような目的を達成できればその方法は大きく制限されない。一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体の製造方法は、前記直交的ｔＲＮＡ／合成酵素ペアを発現できるベクターを前記細胞株に形質転換することを含む。具体的には、前記直交的ｔＲＮＡ／合成酵素ペアを発現できるベクターは、Ｙａｎｇ ｅｔ．ａｌ（Ｔｅｍｐｏｒａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｔｅｔｒａｚｉｎｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎｖｅｒｓｅ－Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０２０，２４５６－２４６４）に開示されているｐＤｕｌｅ＿Ｃ１１であり得る。
尿酸酸化酵素変異体をコードするベクター
前記尿酸酸化酵素変異体の製造方法は、尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターを発現細胞株に導入または形質注入させる工程を含む。以下、「尿酸酸化酵素変異体をコードするベクター」の段落でより具体的に説明する。
尿酸酸化酵素変異体の製造方法の例
一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体の製造方法は以下を含む。
直交的ｔＲＮＡ／合成酵素ペアを発現させることができるベクター、および尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターを含む細胞株を用意する。
ここで、前記直交的ｔＲＮＡ／合成酵素ペアは外来由来サプレッサーｔＲＮＡおよび外来由来ｔＲＮＡ合成酵素を含む。
前記尿酸酸化酵素変異体は、野生型の尿酸酸化酵素配列のうちの３つ以上のアミノ酸がテトラジン誘導体またはトリアジン誘導体を含む非天然アミノ酸に置き換えたものである。
前記尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターにおいて、前記非天然アミノ酸に対応するコドンはアンバーコドン（５'－ＵＡＧ－３'）である。
前記細胞株をテトラジン誘導体および／またはトリアジン誘導体を含む非天然アミノ酸が含まれた培地で培養する。
このとき、前記外来由来サプレッサーｔＲＮＡはアンバーコドン（５'－ＵＡＧ－３'）を認識できる。
前記外来由来ｔＲＮＡ合成酵素は前記非天然アミノ酸を前記外来由来ｔＲＮＡに連結させることができる。
したがって、前記細胞株は、前記尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターを発現させる際に、前記アンバーコドンに対応する位置に前記非天然アミノ酸が連結されたペプチドを発現することを特徴とする。
（尿酸酸化酵素変異体をコードするベクター）
尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターの概要
本明細書では尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターを開始する。前記尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターは、前記尿酸酸化酵素変異体配列中の非天然アミノ酸を、終結コドンを用いてコードしたことを特徴とする。一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターにおいて、前記尿酸酸化酵素変異体配列のうち、標準アミノ酸は自然界で発見される前記標準アミノ酸と対応するコドンでコードされ、非天然アミノ酸は終結コドンでコードしたものであり得る。例えば、前記終結コドンは、アンバーコドン（ａｍｂｂｅｒ ｃｏｄｏｎ；５'－ＵＡＧ－３'）、オーカーコドン（ｏｃｈｅｒ ｃｏｄｏｎ；５'－ＵＡＡ－３'）、およびオパールコドン（ｏｐａｌ ｃｏｄｏｎ；５'－ＵＧＡ－３'）から選択されるものであってもよい。また、別の例として、前記終結コドンは、５'－ＴＡＧ－３'、５'－ＴＡＡ－３'、および５'－ＴＧＡ－３'から選択されるものであってもよい。一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターは、前記発現細胞株に対してコドン最適化されたものであり得る。例えば、前記尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターは、大腸菌コドン最適化されたものであり得る。
尿酸酸化酵素変異体をコードするベクター配列の例
一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体がアスペルギルス・フラバス由来の尿酸酸化酵素の配列の一部を変形させたものである場合、前記尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターは配列番号１５２～１５４から選択される配列を含むことができる。
一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体がカンジダ・ユチリス由来の尿酸酸化酵素の配列の一部を変形させたものである場合、前記尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターは配列番号１５５～１５７から選択された配列を含むことができる。
一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体がアルスロバクター・グロビフォルミス由来の尿酸酸化酵素の配列の一部を変形させたものである場合、前記尿酸酸化酵素変異体をコードする配列番号１５８～１６０から選択された配列を含むことができる。
尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターの例示配列と類似の配列を含む
一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターは、配列番号１４５～１６０から選択された配列と５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％一致する配列を含むことができる。一実施例として、前記尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターは、配列番号１４５～１６０から選択された配列と直前の文から選択された数値範囲内に一致する配列を含むことができる。例えば、前記尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターは、配列番号１４５～１６０から選択された配列と８０％～１００％一致する配列を含むことができる。また、別の例として、前記尿酸酸化酵素変異体をコードするベクターは、配列番号１４５～１６０から選択された配列と９５％以上一致する配列を含むことができる。
（アルブミン）
アルブミンの概要
本明細書に開示される尿酸酸化酵素－アルブミン結合体に含まれるアルブミンは、通常のアルブミンタンパク質を指す。前記アルブミンは、尿酸酸化酵素と結合して前記尿酸酸化酵素の半減期を増大させたり、および／または免疫原性を減少させたりする役割を果たす。前記アルブミンは、上記の機能を有することができるものであれば特に制限されず、自然界で発見される野生型のアルブミンや、前記野生型のアルブミンを遺伝的に操作したもの（アルブミン変異体）であってもよい。
アルブミンの例
一実施例として、前記アルブミンは哺乳類のアルブミンであり得る。具体的には、前記アルブミンはヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）であり得る。一実施例では、前記アルブミンは野生型のヒト血清アルブミンであり得る。一実施例では、前記アルブミンは野生型のヒト血清アルブミンを遺伝的に操作した再組換えアルブミン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｌｂｕｍｉｎ）であり得る。
アルブミン配列の例
一実施例として、前記アルブミンは配列番号１３３～１４４から選択された配列で表すことができる。
アルブミンの例示配列と類似の配列を含む
一実施例として、前記アルブミンは、配列番号１３３～１４４から選択された配列と５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％一致する配列を含むことができる。一実施例として、前記アルブミンは、配列番号１３３～１４４から選択された配列と直前の文から選択された数値範囲内に一致する配列を含むことができる。例えば、前記アルブミンは、配列番号１３３～１４４から選択された配列と８０％～１００％一致する配列を含むことができる。また、別の例として、前記アルブミンは、配列番号１３３～１４４から選択された配列と９５％以上一致する配列を含むことができる。
（リンカー）
リンカーの概要
本明細書に開示される尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸酸化酵素変異体およびアルブミンがリンカーを介して結合したものである。このとき、前記リンカーは、尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造時に尿酸酸化酵素変異体およびアルブミンを連結するために使用される物質を意味する。
具体的には、前記リンカーは、尿酸酸化酵素変異体と結合できるＩＥＤＤＡ反応基と、アンカーと、アルブミンと結合できるチオール（ｔｈｉｏｌ）反応基と、を含む。前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造過程において、前記尿酸酸化酵素変異体とリンカーは前記ＩＥＤＤＡ反応基を介して結合し、前記アルブミンとリンカーは前記チオール反応基を介して結合する。具体的な結合過程は該当する段落を参照する。したがって、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体内の前記リンカーは、その原型のままでは存在せず、１）尿酸酸化酵素－リンカー結合部、２）アンカー、および３）アルブミン－リンカー結合部が連結された形態で存在する。
リンカー構造１－ＩＥＤＤＡ反応基
前記リンカーは、逆電子要求ディールス・アルダー反応（ｉｎｖｅｒｓｅ ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｄｅｍａｎｄ ｄｉｅｌｓ－ａｌｄｅｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＩＥＤＤＡ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を起こすことができるＩＥＤＤＡ反応基を含む。前記ＩＥＤＤＡ反応基は、前記尿酸酸化酵素変異体と連結することができる構成であり、前記尿酸酸化酵素変異体の非天然アミノ酸の残基と反応して尿酸酸化酵素－リンカー結合部を形成することができる。一実施例として、前記ＩＥＤＤＡ反応基はジエノフィル官能基（Ｄｉｅｎｏｐｈｉｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）を含むことができる。具体的には、前記ＩＥＤＤＡ反応基はトランスシクロオクテンまたはその誘導体であり得る。
一実施例として、前記ＩＥＤＤＡ反応基は以下の中から選択されるものであり得る。
リンカー構造２－チオール反応基
前記リンカーは、チオール基と化学反応を起こすことができるチオール反応基を含む。前記チオール基は、前記アルブミンと連結することができる構成であり、前記アルブミンに含まれるチオール基と反応してアルブミン－リンカー結合部を形成することができる。一実施例として、前記チオール反応基は、マレイミドマレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）（ＭＡＬ）またはその誘導体、および／または３-アリルプロピロニトリル（３－ａｒｙｌｐｒｏｐｉｏｌｏｎｉｔｒｉｌｅｓ）（ＡＰＮ）またはその誘導体であり得る。
具体的には、前記チオール反応基は以下の中から選択されるものであり得る。
リンカー構造３－アンカー
前記リンカーは、前記ＩＥＤＤＡ反応基および前記チオール反応基を連結するアンカーを含む。前記アンカーは、前記ＩＥＤＤＡ反応基および前記チオール反応基を１分子で結合したものであり、前記尿酸酸化酵素および／またはアルブミンの活性に影響を与えない限り、その構造は特に制限されない。一実施例として、前記アンカーは直線構造を有していてもよい。また、別の実施形態では、前記アンカーは分岐構造を有していてもよい。一実施例では、前記アンカーはポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ；ＰＥＧ）を含むことができる。
リンカーの例
一実施例として、前記リンカーは、以下の中から選択されるいずれか１つであり得る。
（尿酸酸化酵素－リンカー結合部）
尿酸酸化酵素－リンカー結合部の概要
本明細書に開示される尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は尿酸酸化酵素－リンカー結合部を含む。前記尿酸酸化酵素－リンカー結合部は、尿酸酸化酵素変異体およびリンカーがＩＥＤＤＡ反応を介して結合して生成されたものである。具体的には、前記ＩＥＤＤＡ反応は、尿酸酸化酵素変異体に含まれる非天然アミノ酸の残基とリンカーに含まれるＩＥＤＤＡ反応基との反応を指し、前記非天然アミノ酸の残基および前記ＩＥＤＤＡ反応基の種類によって反応後の尿酸酸化酵素－リンカー結合部の構造が決定される。前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は３つ以上のアルブミン結合体を含むので、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は３つ以上の尿酸酸化酵素－リンカー結合部を含む。上記のように、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は３つ以上のサブユニット－アルブミン結合体を含む。前記サブユニット－アルブミン結合体は尿酸酸化酵素変異体サブユニットとアルブミンがリンカーを介して結合されたものである。したがって、各前記サブユニット－アルブミン結合体は少なくとも１つの尿酸酸化酵素－リンカー結合部を含む。
尿酸酸化酵素－リンカー結合部の位置
前記尿酸酸化酵素－リンカー結合部は、前記尿酸酸化酵素変異体の非天然アミノ酸およびリンカーのアンカーを連結する位置にある。上記のように、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、前記非天然アミノ酸の残基および前記ＩＥＤＤＡ反応基の反応によって形成されるので、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、前記尿酸酸化酵素変異体に含まれる非天然アミノ酸の残基に該当する位置にある。言い換えれば、前記尿酸酸化酵素－リンカー結合部は、前記リンカーのＩＥＤＤＡ反応基に該当する位置にある。
尿酸酸化酵素－リンカー結合部を形成するための反応
前記尿酸酸化酵素－リンカー結合部を形成する反応は、逆電子要求ディールス・アルダー反応（ｉｎｖｅｒｓｅ ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｄｅｍａｎｄ ｄｉｅｌｓ－ａｌｄｅｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＩＥＤＤＡ ｒｅａｃｔｉｏｎ）の一種である。具体的な反応様態は、前記尿酸酸化酵素変異体に含まれる非天然アミノ酸の官能基およびリンカーに含まれるＩＥＤＤＡ反応基の種類によって変わることができる。一実施例として、前記尿酸酸化酵素－リンカー結合部を形成するための反応は、以下のいずれか１つであり得る。
ここで、前記Ａ２はＩＥＤＤＡ反応基を除くリンカーの部分であり、前記Ｒｘは前記非天然アミノ酸の種類によって変わることができ（前述の非天然アミノ酸の例示部分参考）、前記Ａ１は前記非天然アミノ酸のテトラジン官能基を除いた前記尿酸酸化酵素変異体の部分である。
尿酸酸化酵素－リンカー結合部の構造
一実施例として、前記尿酸酸化酵素－リンカー結合部の構造は、以下のいずれか１つであり得る。
前記（１）部分は尿酸酸化酵素変異体に連結され、前記（２）部分はリンカーのアンカー部分に連結されていること；および
ここで、前記（１）部分は尿酸酸化酵素変異体に連結され、前記（２）部分はリンカーのアンカー部分に連結されている。
（アルブミン－リンカー結合部）
アルブミン－リンカー結合部の概要
本明細書に開示される尿酸酸化酵素－アルブミン結合体はアルブミン－リンカー結合部を含む。前記アルブミン－リンカー結合部は、アルブミンに含まれるチオール基およびリンカーに含まれるチオール反応基が結合して生成されたものである。このとき、前記結合を媒介する前記アルブミンのチオール基は、アルブミンの半減期増大機能を阻害しないようにアルブミンのＦｃＲｎ－結合ドメインにおいて離隔した位置にあることを特徴とする。前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は３つ以上のアルブミン結合体を含むので、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は３つ以上のアルブミン－リンカー結合部を含む。上記のように、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は３つ以上のサブユニット－アルブミン結合体を含む。前記サブユニット－アルブミン結合体は尿酸酸化酵素変異体サブユニットとアルブミンがリンカーを介して結合したものである。したがって、各前記サブユニット－アルブミン結合体は少なくとも１つのアルブミン－リンカー結合部を含む。
アルブミン－リンカー結合部の位置
前記アルブミン－リンカー結合部は、前記アルブミンのチオール基および前記リンカーのアンカーを連結する位置にある。本明細書に開示される尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸酸化酵素にアルブミンを結合させて体内の半減期を増大させるという目的があるため、前記アルブミンと前記リンカーが連結される位置は、アルブミンのＦｃＲｎ結合ドメインと離隔した位置でなければならない。上記のように、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、前記アルブミンのチオール基および前記リンカーのチオール反応基が反応して形成されたものであるため、前記アルブミン－リンカー結合部は、前記アルブミンのチオール基に該当する位置にある。言い換えれば、前記アルブミン－リンカー結合部は、前記リンカーのチオール反応基に該当する位置にある。前記アルブミン－リンカー結合部の位置は、アルブミンに含まれるチオール基のうち、アルブミンの構造、機能、および／または活性に影響を及ぼさない部分から選択される。
アルブミン－リンカー結合部の位置の例
一実施例として、前記アルブミン－リンカー結合部は、配列番号１３３～Ｓ０１６で表すアルブミンの３４番目のシステイン残基に含まれるチオール基に位置したものであり得る。
アルブミン－リンカー結合部の形成反応
前記アルブミン－リンカー結合部を形成する反応はチオール反応の一種である。具体的な反応様態は前記リンカーに含まれるチオール反応基の種類によって異なることができる。
一実施例として、前記アルブミン－リンカー結合部の形成反応は以下のいずれか１つであり得る。
ここで、前記Ｒ１は前記チオール基を除いたアルブミン部分であり、Ｒ２は前記チオール反応基を除いたリンカー部分である。
アルブミン－リンカー結合部の構造例
一実施例として、前記アルブミン－リンカー結合部構造は以下のいずれか１つであり得る。
ここで、前記（１）部分はアルブミンに連結され、前記（２）部分はリンカーのアンカー部分に連結されている。
（アンカー）
アンカーの概要
本明細書に開示されるアンカーは、前記尿酸酸化酵素－リンカー結合部と前記アルブミン－リンカー結合部との間に連結された構成を指す。前記アンカーは、前記尿酸酸化酵素変異体、尿酸酸化酵素－リンカー結合部、アルブミン－リンカー結合部、およびアルブミンを１つの構造体に結合し、アンカーの構造によって尿酸酸化酵素－アルブミン結合体に含まれる尿酸酸化酵素変異体およびアルブミンの距離を調節するように機能することができる。
アンカーの構造例
一実施例として、前記アンカーは以下のいずれか１つであり得る。
ここで、前記Ｊ１は尿酸酸化酵素－リンカー結合部、前記Ｊ２はアルブミン－リンカー結合部である。
（尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法）
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法の概要
本明細書では尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法を開示する。前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法には、尿酸酸化酵素変異体、リンカー、およびアルブミンなどの要素が関与する。このとき、各要素は各段落で説明した通りである。
前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法は、前記各要素を適切に反応させて上記した尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を製造することである。具体的には、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法は、前記尿酸酸化酵素変異体に含まれる非天然アミノ酸残基と前記リンカーのＩＥＤＤＡ反応基を反応させて尿酸酸化酵素－リンカー結合部を作ること（尿酸酸化酵素－リンカー結合反応）と、前記アルブミンに含まれるチオール基と前記リンカーのチオール反応基を反応させてアルブミン－リンカー結合部を作ること（アルブミン－リンカー結合反応）と、を含む。このとき、前記尿酸酸化酵素－リンカー結合反応およびアルブミン－リンカー結合反応が起こる順序は無関係であり、両方の反応が同時に起こる可能性がある。また、各反応の順序によって反応の中間生成物が生成される場合がある。以下、尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法をより詳細に説明する。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法１－アルブミンとリンカーを最初に結合させる方法
一実施例として、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法は、
アルブミンとリンカーを反応させることであって、
前記アルブミンのチオール基と前記リンカーのチオール反応基とが接触してアルブミン－リンカー結合体が生成されることと、
前記アルブミン－リンカー結合体と尿酸酸化酵素変異体を反応させることであって、
前記アルブミン－リンカー結合体のＩＥＤＤＡ反応基と前記尿酸酸化酵素変異体の非天然アミノ酸に含まれるジエン官能基とが接触して尿酸酸化酵素－アルブミン結合体が生成されることと、含む。
前記尿酸酸化酵素変異体、前記リンカー、および前記アルブミンおよびそれらに含まれる要素は、上記の通りである。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法２－尿酸酸化酵素とリンカーを最初に結合させる方法
一実施例として、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法は、
尿酸酸化酵素変異体とリンカーを反応させることであって、
前記リンカーのＩＥＤＤＡ反応基と前記尿酸酸化酵素変異体の非天然アミノ酸に含まれるジエン官能基とが接触して尿酸酸化酵素－リンカー結合体が生成されることと、
前記尿酸酸化酵素－リンカー結合体とアルブミンを反応させることであって、
前記アルブミンのチオール反応基と前記尿酸酸化酵素－リンカー結合体のチオール基とが接触して尿酸酸化酵素－アルブミン結合体が生成されることと、を含む。
前記尿酸酸化酵素変異体、前記リンカー、および前記アルブミンおよびそれらに含まれる要素は、上記の通りである。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法３－尿酸酸化酵素、リンカー、およびアルブミンを同時に結合させる方法
一実施例として、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法は、反応物の全てを添加して同時に反応させることによって実行することができる。
このとき、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法は、
尿酸酸化酵素変異体、リンカー、およびアルブミンを反応させることを含み、
ここで、前記アルブミンのチオール基と前記リンカーのチオール反応基とが反応を起こして結合され、
前記尿酸酸化酵素変異体の非天然アミノ酸に含まれるジエン官能基と前記リンカーのＩＥＤＤＡ反応基とが反応を起こして結合され、
前記反応結果尿酸酸化酵素－アルブミン結合体が生成される。
前記尿酸酸化酵素変異体、前記リンカー、および前記アルブミンおよびそれらに含まれる要素は上記の通りである。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法の特徴１－生体直交反応を利用して体内安定性が高い
前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法は、前記尿酸酸化酵素変異体および前記アルブミンを生体直交反応の一種であるＩＥＤＤＡ反応を利用して結合する。前記結合反応に関与する化学官能基は体内の分子内に存在しないものであるため、前記製造方法を通じて製造された尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は体内に導入されてもその結合の安定性が非常に高いという利点を有する。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法の特徴２－ＩＥＤＤＡ反応を利用して収率が非常に高い
前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法では、尿酸酸化酵素変異体とリンカーを結合させるために逆電子ディールス・アルダー反応（ｉｎｖｅｒｓｅ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｅｍａｎｄ ｄｉｅｌｓ－ａｌｄｅｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＩＥＤＤＡ反応）を使用する。前記ＩＥＤＤＡ反応は非常に速い反応速度で起こり、反応環境組成が容易であるため、ＳＰＡＡＣ（Ｓｔｒａｉｎ－Ｐｒｏｍｏｔｅｄ Ａｚｉｄｅ－Ａｌｋｙｎｅ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ）反応を利用する場合と比較して結合体を製造する際に収率が非常に高いという利点を有する。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法の特徴３－結合体当たり３つまたは４つのアルブミンを含む
本明細書で提供する前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法によれば、収率が非常に高いＩＥＤＤＡ反応を利用するため、尿酸酸化酵素１単位当たり３つまたは４つのアルブミンが結合した尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を得ることができる。これは、先行技術ＫＲ１６３７０１０Ｂ１に開示されている尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法に従う場合、尿酸酸化酵素１単位当たり１つまたは２つのアルブミンが結合した尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を得ることが限界であることと比較して明らかに改善された特徴である。
（尿酸酸化酵素－リンカー結合方法）
本明細書で提供する前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法は、尿酸酸化酵素変異体とリンカーとを結合することを含む。具体的には、前記尿酸酸化酵素－リンカー結合方法は、前記尿酸酸化酵素変異体の非天然アミノ酸残基と前記リンカーのＩＥＤＤＡ反応基を接触させることを含む。前記尿酸酸化酵素－リンカー結合方法は、アルブミンとリンカーが結合する部位、またはアルブミンとリンカーとの結合の有無に影響を受けない。したがって、以下に開示する尿酸酸化酵素－リンカー結合方法は、「尿酸酸化酵素変異体」に「リンカー」を結合させること、および「尿酸酸化酵素変異体」に「アルブミン－リンカー結合体」を結合させることの両方に適用することができる。前記尿酸酸化酵素－リンカー結合方法は、アルブミン－リンカー結合方法とは独立して実行することができる。
前記尿酸酸化酵素－リンカー結合方法は、「尿酸酸化酵素－リンカー結合部の形成反応」の段落に説明された反応を起こすことができる方法であれば特に制限されず、通常の技術者が前記反応を起こすことができる公知の方法を適切に選択したことであり得る。
ここで、尿酸酸化酵素－リンカー結合方法において、テトラジン官能基とトランスシクロオクテン官能基との間でＩＥＤＤＡ反応を起こす場合、塩基性ｐＨ環境ではテトラジン官能基が還元されてＩＥＤＤＡ反応を起こさない可能性が大きくなる。したがって、前記ＩＥＤＤＡ反応は中性ｐＨ環境で行うことが好ましい。一実施例では、前記尿酸酸化酵素－リンカー結合方法は中性ｐＨ環境で実行することができる。一実施例では、前記尿酸酸化酵素－リンカー結合方法は、ｐＨ８．０以下、ｐＨ９．０以下、ｐＨ１０．０以下、ｐＨ１１．０以下、ｐＨ１１．０以下、ｐＨ１３．０以下、ｐＨ１４．０以下の環境で実行することができる。
（アルブミン－リンカー結合方法）
本明細書で提供する前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法は、アルブミンとリンカーとを結合することを含む。具体的には、前記アルブミン－リンカー結合方法は、前記アルブミンのチオール基と前記リンカーのチオール反応基を接触させることを含む。前記アルブミン－リンカー結合方法は、尿酸酸化酵素変異体とリンカーが結合する部位、または尿酸酸化酵素変異体とリンカーとの結合の有無に影響を受けない。したがって、以下に開示するアルブミン－リンカー結合方法は、「アルブミン」に「リンカー」を結合させること、および「アルブミン」に「尿酸酸化酵素－リンカー結合体」を結合させることの両方に適用することができる。前記アルブミン－リンカー結合方法は、前記尿酸酸化酵素－リンカー結合方法とは独立して実行することができる。
（尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の用途）
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の用途の概要
本明細書では尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の用途を開示する。前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、体内で高い半減期を有し安定であり、免疫原性が低く、優れた尿酸降下効果を有する。したがって、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸が原因となる疾患、疾病、および／または適応症の予防または治療用途として使用することができる。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の予防および／または治療用途１－適応症
一実施例として、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、高尿酸血症、急性痛風性関節炎、間欠期痛風、および慢性結節性痛風、慢性腎臓病（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ）および／または腫瘍崩壊症候群（Ｔｕｍｏｒ Ｌｙｓｉｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＴＬＳ）の予防または治療用途として使用することができる。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の予防および／または治療用途２－投与方法
一実施例として、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸が原因となる疾患、疾病、および／または適応症の予防または治療のために適切な製剤化を経て、患者に投与することができる。例えば、前記投与方法は、経口投与、非経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、経皮投与、および皮下投与から選択された１つであり得る。また、別の例として、前記投与方法は点滴静脈注射（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）であり得る。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の予防および／または治療用途３－投与用量
一実施例として、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸が原因となる疾患、疾病、および／または適応症の予防または治療のために適切な製剤化を経て、適切な投与用量で投与することができる。例えば、前記投与用量は、尿酸酸化酵素－アルブミン結合体基準で約０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の予防および／または治療用途４－投与周期
一実施例として、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸が原因となる疾患、疾病、および／または適応症の予防または治療のために適切な製剤化を経て、適切な投与周期で投与することができる。例えば、前記投与周期は、前記適切な投与用量の尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を１日１回投与することができる。また、別の例として、前記投与周期は、前記適切な投与用量の尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を１日２回以上に分けて投与することができる。また、別の例として、前記投与周期は、前記適切な投与用量の尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を１時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間、２日、３日、１週間、２週間、１ヶ月、および／または３ヶ月間隔で投与することができる。
（尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を含む医薬組成物）
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を含む医薬組成物の概要
前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を尿酸が原因となる疾患、疾病、および／または適応症に使用するために適切な製剤化を受けなければならない。本明細書では、尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を治療剤として使用するために適切に製剤化された医薬組成物を開示し、製剤化するために必要な薬学的に許容される担体を開示する。例えば、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、経口用、非経口用、注射液、エアロゾル剤、および／または経皮用に製剤化することができ、そのために薬学的に許容される担体を含むことができる。
製剤化のための構成１－経口用製剤
一実施例として、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、トローチ剤（ｔｒｏｃｈｅｓ）、ロゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）、錠剤、水溶性懸濁液、油性懸濁液、調製粉末、顆粒、乳濁液、ハードカプセル、ソフトカプセル、シロップまたは、エリキシル剤として製剤化され得る。
一実施例として、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を経口投与用に製剤化するために、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプンまたはサツマイモデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、フマル酸ステアリルナトリウムまたはポリエチレングリコールワックスなどの潤滑油などを使用することができ、甘味料、芳香剤、シロップ剤等も使用することができる。さらに、カプセル剤の場合には、上記の物質に加えて、脂肪油のような液体担体などをさらに使用してもよい。
製剤化のための構成２－非経口用製剤
一実施例として、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、注射液、坐剤、呼吸器吸入用粉末、スプレー用エアロゾル剤、軟膏、塗布用粉末、油、クリームとして製剤化することができる。
一実施例では、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を非経口投与用に製剤化するために、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、外用剤などを使用することができ、前記非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどを使用することができる。
製剤化のための構成３－注射液製剤
一実施例として、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を注射液に製剤化するために、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を安定剤または緩衝剤と共に水中で混合して溶液または懸濁液として製造し、それをアンプルまたはバイアルの単位投与用に製剤化することができる。
製剤化のための構成４－エアロゾル剤製剤
一実施例として、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体に推進剤などを添加剤と組み合わせて水分散された濃縮物、または湿潤粉末を製造してエアロゾル剤に製剤化することができる。
製剤化のための構成５－経皮用製剤
一実施例として、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を経皮用に製剤化する場合、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体に動物油、植物油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛などを担体として添加して軟膏、クリーム、塗布用粉末、オイル、皮膚外用剤などを製造することができる。
製剤化のための構成６－アジュバントおよび他の構成
一実施例として、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を含む医薬組成物は、水、塩水、ブドウ糖、エタノール、グリセロール、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、乳糖、ゼラチン、アルブミン、水酸化アルミニウム、フロイント不完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ'ｓ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ）および完全抗原アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ）（Ｐｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．）、メルク抗原強化剤６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ．）、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（Ａｌ（ＯＨ）３）、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）、またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩、ＡＳ０４ ｓｅｒｉｅｓ、ＭＦ、ｓｑｕａｌｅｎｅ、ＭＦ５９、ＱＳ２１、カルシウム、鉄または亜鉛塩、アシル化チロシンの不溶性懸濁液、アシル化フルクトース、カチオン的またはアニオン的に誘導された多糖類、ポリホスファゼン、生分解性ミクロスフェア、およびクイル（Ｑｕｉｌ）Ａ、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、ＰＨＡＤ［Ａｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ，Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ Ｌｉｐｉｄ Ａ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）］、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ，ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ Ｌｉｐｉｄ Ａ）、合成脂質Ａ、脂質Ａ模倣体または類似体、アルミニウム塩、サイトカイン、サポニン、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、成長ホルモンデオキシコール酸（ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ベタグルカン（ｂｅｔａｇｌｕｃａｎ）、ポリリボヌクレオチド（ｐｏｌｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム－陰性細菌のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、乳濁液、ビロソーム、コクリート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、またはそれらの適切な組み合わせを含むことができる。
（発明の可能な実施例）
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体１
実施例１：尿酸酸化酵素－アルブミン結合体
下記の化学式１で表現される、尿酸酸化酵素－アルブミン結合体：
［化学式１］
Ｕｏｘ－［Ｊ１－Ａ－Ｊ２－ＨＳＡ］ｎ
ここで、前記Ｕｏｘは尿酸酸化酵素変異体、前記Ｊ１は尿酸酸化酵素－リンカー結合部、前記Ａはアンカー、前記Ｊ２はアルブミン－リンカー結合部、前記ＨＳＡはヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）を意味し、
前記尿酸酸化酵素変異体は、ジエン官能基（ｄｉｅｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）を有する非天然アミノ酸を３つ以上含み、
前記尿酸酸化酵素－リンカー結合部は、前記非天然アミノ酸のジエン官能基および前記アンカーに連結されたジエノフィル官能基（ｄｉｅｎｏｐｈｉｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）が逆電子要求ディールス・アルダー（Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ；ＩＥＤＤＡ）反応を介して結合したものであり、
前記ｎは３または４である。
実施例２：尿酸酸化酵素の微生物由来の限定
実施例１において、前記尿酸酸化酵素変異体は、微生物由来の野生型尿酸酸化酵素配列で３つ以上のアミノ酸が前記非天然アミノ酸に置き換えたものであり、前記微生物は、アスペルギルス・フラバス、アルスロバクター・グロビフォルミス、およびカンジダ・ユチリスから選択される。
実施例３：４つの変異体サブユニット
実施例１～２のいずれかにおいて、前記尿酸酸化酵素変異体は、４つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化された四量体であり、前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、野生型尿酸酸化酵素サブユニット配列で１つ以上のアミノ酸が前記非天然アミノ酸に置き換えていることを特徴とする尿酸酸化酵素－アルブミン結合体。
実施例４：３つの変異体サブユニット、１つの野生型サブユニット
実施例１～２のいずれかにおいて、前記尿酸酸化酵素変異体は、３つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットおよび１つの野生型尿酸酸化酵素サブユニットがオリゴマー化された四量体であり、前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、野生型尿酸酸化酵素サブユニット配列で１つ以上のアミノ酸が前記非天然アミノ酸に置き換えていることを特徴とする尿酸酸化酵素－アルブミン結合体。
実施例５：非天然アミノ酸、テトラジン官能基の限定
実施例１～４のいずれかにおいて、前記ジエン官能基は、トリアジン官能基もしくはその誘導体、またはテトラジン官能基もしくはその誘導体であることを特徴とする尿酸酸化酵素－アルブミン結合体。
実施例６：非天然アミノ酸の例（名称）
実施例５において、前記非天然アミノ酸が以下から選択されたいずれか１つであることを特徴とする尿酸酸化酵素－アルブミン結合体：
４－（１，２，３，４－テトラジン－３－イル）フェニルアラニン（ｆｒＴｅｔ）；４－（６－メチル－ｓ－テトラジン－３－イル）フェニルアラニン（Ｔｅｔ－ｖ２．０）；３－（４－（１，２，４－トリアジン－６－イル）フェニル）－２－アミノプロパン酸；２－アミノ－３－（４－（２－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）エチル）フェニル）プロパン酸；２－アミノ－３－（４－（６－フェニル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）プロパン酸；３－（４－（（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）アミノ）フェニル）－２－アミノプロパン酸；３－（４－（２－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）エチル）フェニル）－２－アミノプロパン酸；３－（４－（（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）チオ）フェニル）－２－アミノプロパン酸；２－アミノ－３－（４－（（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）チオ）フェニル）プロパン酸；３－（４－（（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）オキシ）フェニル）－２－アミノプロパン酸；２－アミノ－３－（４－（（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）オキシ）フェニル）プロパン酸；３－（４'－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）－［１，１'－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸；２－アミノ－３－（４'－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）－［１，１'－ビフェニル］－４－イル）プロパン酸；２－アミノ－３－（６－（６－（ピリジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ピリジン－３－イル）プロパン酸；３－（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）－２－アミノプロパン酸；および２－アミノ－３－（４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）プロパン酸。
実施例７：非天然アミノ酸の例（化学式）
実施例５において、前記非天然アミノ酸は、図２３～２７の表でそれぞれ独立して選択されることを特徴とする尿酸酸化酵素－アルブミン結合体。
実施例８：サブユニット配列の例１，Ａｓｐ．Ｕｏｘ
実施例２～７のいずれか１つにおいて、前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットが以下から選択された配列で表される尿酸酸化酵素－アルブミン結合体：
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＸＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号２）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＸＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号３）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＸＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号４）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＸＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号５）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＸＳＬＫＳＫＬ（配列番号６）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＸＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号７）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＸＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号８）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＸＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号９）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＸＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号１０）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＸＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号１１）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＸＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号１２）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＸＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号１３）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＸＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号１４）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＸＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号１５）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＸＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号１６）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＸＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号１７）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＸＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号１８）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＸＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号１９）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＸＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号２０）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＸＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号２１）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＸＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号２２）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＸＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号２３）；
ＳＡＶＸＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号２４）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＸＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号２５）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＸＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号２６）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＸＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号２７）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＸＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号２８）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＸＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号２９）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＸＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号３０）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＸＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号３１）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＸＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号３２）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＸＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号３３）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＸＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号３４）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＸＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号３５）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＸＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号３６）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＸＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号３７）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＸＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号３８）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＸＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号３９）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＸＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号４０）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＸＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号４１）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＸＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号４２）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＸＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号４３）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＸＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号４４）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＸＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号４５）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＸＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号４６）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＸＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号４７）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＸＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号４８）；
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＴＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＸＬＫＳＫＬ（配列番号４９）；および
ＳＡＶＫＡＡＲＹＧＫＤＮＶＲＶＹＫＶＨＫＤＥＫＴＧＶＱＴＶＹＥＭＴＶＣＶＬＬＥＧＥＩＥＴＳＹＸＫＡＤＮＳＶＩＶＡＴＤＳＩＫＮＴＩＹＩＴＡＫＱＮＰＶＴＰＰＥＬＦＧＳＩＬＧＴＨＦＩＥＫＹＮＨＩＨＡＡＨＶＮＩＶＣＨＲＷＴＲＭＤＩＤＧＫＰＨＰＨＳＦＩＲＤＳＥＥＫＲＮＶＱＶＤＶＶＥＧＫＧＩＤＩＫＳＳＬＳＧＬＴＶＬＫＳＴＮＳＱＦＷＧＦＬＲＤＥＹＴＴＬＫＥＴＷＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＱＷＫＮＦＳＧＬＱＥＶＲＳＨＶＰＫＦＤＡＴＷＡＴＡＲＥＶＴＬＫＴＦＡＥＤＮＳＡＳＶＱＡＴＭＹＫＭＡＥＱＩＬＡＲＱＱＬＩＥＴＶＥＹＳＬＰＮＫＨＹＦＥＩＤＬＳＷＨＫＧＬＱＮＴＧＫＮＡＥＶＦＡＰＱＳＤＰＮＧＬＩＫＣＴＶＧＲＳＳＬＫＳＫＬ（配列番号５０）、
ここで、前記Ｘは、図２３～２７の表に開示されている非天然アミノ酸から選択されたものである。
実施例９：サブユニット配列の例２，Ｃａｎｄｉｄａ．Ｕｏｘ
実施例２～７のいずれか１つにおいて、前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットが以下から選択された配列で表される尿酸酸化酵素－アルブミン結合体：
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＸＫＬ（配列番号５２）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＸＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号５３）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＸ（配列番号５４）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＸＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号５５）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＸＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号５６）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＸＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号５７）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＸＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号５８）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＸＬ（配列番号５９）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＸＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号６０）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＸＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号６１）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＸＫＴＫＬ（配列番号６２）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＸＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号６３）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＸＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号６４）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＸＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号６５）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＸＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号６６）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＸＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号６７）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＸＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号６８）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＸＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号６９）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＸＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号７０）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＸＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号７１）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＸＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号７２）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＸＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号７３）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＸＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号７４）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＸＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号７５）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＸＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号７６）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＸＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号７７）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＸＴＫＬ（配列番号７８）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＸＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号７９）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＸＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号８０）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＸＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号８１）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＸＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号８２）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＸＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号８３）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＸＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号８４）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＸＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号８５）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＸＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号８６）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＸＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号８７）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＸＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号８８）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＸＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号８９）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＸＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号９０）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＸＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号９１）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＸＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号９２）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＸＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号９３）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＸＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号９４）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＸＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号９５）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＸＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号９６）；
ＭＳＴＴＬＸＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号９７）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＸＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号９８）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＸＥＫＴＫＬ（配列番号９９）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＸＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号１００）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＸＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号１０１）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＸＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号１０２）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＸＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号１０３）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＸＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号１０４）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＸＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号１０５）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＸＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号１０６）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＸＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号１０７）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＸＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号１０８）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＸＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号１０９）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＸＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号１１０）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＸＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号１１１）；
ＭＳＴＴＬＳＸＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号１１２）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＸＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号１１３）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＸＫＥＫＴＫＬ（配列番号１１４）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＸＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号１１５）；
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＦＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＸＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号１１６）；および
ＭＳＴＴＬＳＳＳＴＹＧＫＤＮＶＫＦＬＫＶＫＫＤＰＱＮＰＫＫＱＥＶＭＥＡＴＶＴＣＬＬＥＧＧＦＤＴＳＹＴＥＡＤＮＳＳＩＶＰＴＤＴＶＫＮＴＩＬＶＬＡＫＴＴＥＩＷＰＩＥＲＦＡＡＫＬＡＴＨＦＶＥＫＹＳＨＶＳＧＶＳＶＫＩＶＱＤＲＷＶＫＹＡＶＤＧＫＰＨＤＨＳＦＩＨＥＧＧＥＫＲＩＴＤＬＹＹＫＲＳＧＤＹＫＬＳＳＡＩＫＤＬＴＶＬＫＳＴＧＳＭＦＹＧＹＮＫＣＤＦＴＴＬＱＰＴＴＤＲＩＬＳＴＤＶＤＡＴＷＶＷＤＮＫＫＩＧＳＶＹＤＩＡＫＡＡＤＫＧＩＦＤＮＶＹＮＱＡＲＥＩＴＬＴＴＦＡＬＥＮＳＰＳＶＱＡＴＭＦＮＭＡＴＱＩＬＥＫＡＣＳＶＹＳＶＳＹＡＬＰＮＫＨＹＸＬＩＤＬＫＷＫＧＬＥＮＤＮＥＬＦＹＰＳＰＨＰＮＧＬＩＫＣＴＶＶＲＫＥＫＴＫＬ（配列番号１１７）、
ここで、前記Ｘは、図２３～２７の表に開示されている非天然アミノ酸から選択されたものである。
実施例１０：サブユニット配列の例３，Ａｒｔｈ．Ｕｏｘ
実施例２～７のいずれか１つにおいて、前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットが以下から選択された配列で表される尿酸酸化酵素－アルブミン結合体：
ＭＴＡＴＡＥＴＳＴＧＴＫＶＶＬＧＱＮＱＹＧＫＡＥＶＲＬＶＫＶＴＲＮＴＡＲＨＥＩＱＤＬＮＶＴＳＱＬＲＧＤＦＥＡＡＨＴＡＧＤＮＡＨＶＶＡＴＤＴＱＫＮＴＶＹＡＦＡＲＸＧＦＡＴＴＥＥＦＬＬＲＬＧＫＨＦＴＥＧＦＤＷＶＴＧＧＲＷＡＡＱＱＦＦＷＤＲＩＮＤＨＤＨＡＦＳＲＮＫＳＥＶＲＴＡＶＬＥＩＳＧＳＥＱＡＩＶＡＧＩＥＧＬＴＶＬＫＳＴＧＳＥＦＨＧＦＰＲＤＫＹＴＴＬＱＥＴＴＤＲＩＬＡＴＤＶＳＡＲＷＲＹＮＴＶＥＶＤＦＤＡＶＹＡＳＶＲＧＬＬＬＫＡＦＡＥＴＨＳＬＡＬＱＱＴＭＹＥＭＧＲＡＶＩＥＴＨＰＥＩＤＥＩＫＭＳＬＰＮＫＨＨＦＬＶＤＬＱＰＦＧＱＤＮＰＮＥＶＦＹＡＡＤＲＰＹＧＬＩＥＡＴＩＱＲＥＧＳＲＡＤＨＰＩＷＳＮＩＡＧＦＣ（配列番号１１９）；
ＭＴＡＴＡＥＴＳＴＧＴＫＶＶＬＧＱＮＱＹＧＫＡＥＶＲＬＶＫＶＴＲＮＴＡＲＨＥＩＱＤＬＮＶＴＳＱＬＲＧＤＦＥＡＡＨＴＡＧＤＮＡＨＶＶＡＴＤＴＱＫＮＴＶＹＡＦＡＲＤＧＸＡＴＴＥＥＦＬＬＲＬＧＫＨＦＴＥＧＦＤＷＶＴＧＧＲＷＡＡＱＱＦＦＷＤＲＩＮＤＨＤＨＡＦＳＲＮＫＳＥＶＲＴＡＶＬＥＩＳＧＳＥＱＡＩＶＡＧＩＥＧＬＴＶＬＫＳＴＧＳＥＦＨＧＦＰＲＤＫＹＴＴＬＱＥＴＴＤＲＩＬＡＴＤＶＳＡＲＷＲＹＮＴＶＥＶＤＦＤＡＶＹＡＳＶＲＧＬＬＬＫＡＦＡＥＴＨＳＬＡＬＱＱＴＭＹＥＭＧＲＡＶＩＥＴＨＰＥＩＤＥＩＫＭＳＬＰＮＫＨＨＦＬＶＤＬＱＰＦＧＱＤＮＰＮＥＶＦＹＡＡＤＲＰＹＧＬＩＥＡＴＩＱＲＥＧＳＲＡＤＨＰＩＷＳＮＩＡＧＦＣ（配列番号１２０）；
ＭＴＡＴＡＥＴＳＴＧＴＫＶＶＬＧＱＮＱＹＧＫＡＥＶＲＬＶＫＶＴＲＮＴＡＲＨＥＩＱＤＬＮＶＴＳＱＬＲＧＤＦＥＡＡＨＴＡＧＤＮＡＨＶＶＡＴＤＴＱＫＮＴＶＹＡＦＡＲＤＧＦＡＴＴＥＥＦＬＬＲＬＧＫＨＦＴＥＧＸＤＷＶＴＧＧＲＷＡＡＱＱＦＦＷＤＲＩＮＤＨＤＨＡＦＳＲＮＫＳＥＶＲＴＡＶＬＥＩＳＧＳＥＱＡＩＶＡＧＩＥＧＬＴＶＬＫＳＴＧＳＥＦＨＧＦＰＲＤＫＹＴＴＬＱＥＴＴＤＲＩＬＡＴＤＶＳＡＲＷＲＹＮＴＶＥＶＤＦＤＡＶＹＡＳＶＲＧＬＬＬＫＡＦＡＥＴＨＳＬＡＬＱＱＴＭＹＥＭＧＲＡＶＩＥＴＨＰＥＩＤＥＩＫＭＳＬＰＮＫＨＨＦＬＶＤＬＱＰＦＧＱＤＮＰＮＥＶＦＹＡＡＤＲＰＹＧＬＩＥＡＴＩＱＲＥＧＳＲＡＤＨＰＩＷＳＮＩＡＧＦＣ（配列番号１２１）；
ＭＴＡＴＡＥＴＳＴＧＴＫＶＶＬＧＱＮＱＹＧＫＡＥＶＲＬＶＫＶＴＲＮＴＡＲＨＥＩＱＤＬＮＶＴＳＱＬＲＧＤＦＥＡＡＨＴＡＧＤＮＡＨＶＶＡＴＤＴＱＫＮＴＶＹＡＦＡＲＤＧＦＡＴＴＥＥＦＬＬＲＬＧＫＨＦＴＥＧＦＸＷＶＴＧＧＲＷＡＡＱＱＦＦＷＤＲＩＮＤＨＤＨＡＦＳＲＮＫＳＥＶＲＴＡＶＬＥＩＳＧＳＥＱＡＩＶＡＧＩＥＧＬＴＶＬＫＳＴＧＳＥＦＨＧＦＰＲＤＫＹＴＴＬＱＥＴＴＤＲＩＬＡＴＤＶＳＡＲＷＲＹＮＴＶＥＶＤＦＤＡＶＹＡＳＶＲＧＬＬＬＫＡＦＡＥＴＨＳＬＡＬＱＱＴＭＹＥＭＧＲＡＶＩＥＴＨＰＥＩＤＥＩＫＭＳＬＰＮＫＨＨＦＬＶＤＬＱＰＦＧＱＤＮＰＮＥＶＦＹＡＡＤＲＰＹＧＬＩＥＡＴＩＱＲＥＧＳＲＡＤＨＰＩＷＳＮＩＡＧＦＣ（配列番号１２２）；
ＭＴＡＴＡＥＴＳＴＧＴＫＶＶＬＧＱＮＱＹＧＫＡＥＶＲＬＶＫＶＴＲＮＴＡＲＨＥＩＱＤＬＮＶＴＳＱＬＲＧＤＦＥＡＡＨＴＡＧＤＮＡＨＶＶＡＴＤＴＱＫＮＴＶＹＡＦＡＲＤＧＦＡＴＴＥＥＦＬＬＲＬＧＫＨＦＴＥＧＦＤＷＶＴＧＧＲＷＡＡＱＱＦＸＷＤＲＩＮＤＨＤＨＡＦＳＲＮＫＳＥＶＲＴＡＶＬＥＩＳＧＳＥＱＡＩＶＡＧＩＥＧＬＴＶＬＫＳＴＧＳＥＦＨＧＦＰＲＤＫＹＴＴＬＱＥＴＴＤＲＩＬＡＴＤＶＳＡＲＷＲＹＮＴＶＥＶＤＦＤＡＶＹＡＳＶＲＧＬＬＬＫＡＦＡＥＴＨＳＬＡＬＱＱＴＭＹＥＭＧＲＡＶＩＥＴＨＰＥＩＤＥＩＫＭＳＬＰＮＫＨＨＦＬＶＤＬＱＰＦＧＱＤＮＰＮＥＶＦＹＡＡＤＲＰＹＧＬＩＥＡＴＩＱＲＥＧＳＲＡＤＨＰＩＷＳＮＩＡＧＦＣ（配列番号１２３）；
ＭＴＡＴＡＥＴＳＴＧＴＫＶＶＬＧＱＮＱＹＧＫＡＥＶＲＬＶＫＶＴＲＮＴＡＲＨＥＩＱＤＬＮＶＴＳＱＬＲＧＤＦＥＡＡＨＴＡＧＤＮＡＨＶＶＡＴＤＴＱＫＮＴＶＹＡＦＡＲＤＧＦＡＴＴＥＥＦＬＬＲＬＧＫＨＦＴＥＧＦＤＷＶＴＧＧＲＷＡＡＱＱＦＦＷＤＲＩＸＤＨＤＨＡＦＳＲＮＫＳＥＶＲＴＡＶＬＥＩＳＧＳＥＱＡＩＶＡＧＩＥＧＬＴＶＬＫＳＴＧＳＥＦＨＧＦＰＲＤＫＹＴＴＬＱＥＴＴＤＲＩＬＡＴＤＶＳＡＲＷＲＹＮＴＶＥＶＤＦＤＡＶＹＡＳＶＲＧＬＬＬＫＡＦＡＥＴＨＳＬＡＬＱＱＴＭＹＥＭＧＲＡＶＩＥＴＨＰＥＩＤＥＩＫＭＳＬＰＮＫＨＨＦＬＶＤＬＱＰＦＧＱＤＮＰＮＥＶＦＹＡＡＤＲＰＹＧＬＩＥＡＴＩＱＲＥＧＳＲＡＤＨＰＩＷＳＮＩＡＧＦＣ（配列番号１２４）；
ＭＴＡＴＡＥＴＳＴＧＴＫＶＶＬＧＱＮＱＹＧＫＡＥＶＲＬＶＫＶＴＲＮＴＡＲＨＥＩＱＤＬＮＶＴＳＱＬＲＧＤＦＥＡＡＨＴＡＧＤＮＡＨＶＶＡＴＤＴＱＫＮＴＶＹＡＦＡＲＤＧＦＡＴＴＥＥＦＬＬＲＬＧＫＨＦＴＥＧＦＤＷＶＴＧＧＲＷＡＡＱＱＦＦＷＤＲＩＮＸＨＤＨＡＦＳＲＮＫＳＥＶＲＴＡＶＬＥＩＳＧＳＥＱＡＩＶＡＧＩＥＧＬＴＶＬＫＳＴＧＳＥＦＨＧＦＰＲＤＫＹＴＴＬＱＥＴＴＤＲＩＬＡＴＤＶＳＡＲＷＲＹＮＴＶＥＶＤＦＤＡＶＹＡＳＶＲＧＬＬＬＫＡＦＡＥＴＨＳＬＡＬＱＱＴＭＹＥＭＧＲＡＶＩＥＴＨＰＥＩＤＥＩＫＭＳＬＰＮＫＨＨＦＬＶＤＬＱＰＦＧＱＤＮＰＮＥＶＦＹＡＡＤＲＰＹＧＬＩＥＡＴＩＱＲＥＧＳＲＡＤＨＰＩＷＳＮＩＡＧＦＣ（配列番号１２５）；
ＭＴＡＴＡＥＴＳＴＧＴＫＶＶＬＧＱＮＱＹＧＫＡＥＶＲＬＶＫＶＴＲＮＴＡＲＨＥＩＱＤＬＮＶＴＳＱＬＲＧＤＦＥＡＡＨＴＡＧＤＮＡＨＶＶＡＴＤＴＱＫＮＴＶＹＡＦＡＲＤＧＦＡＴＴＥＥＦＬＬＲＬＧＫＨＦＴＥＧＦＤＷＶＴＧＧＲＷＡＡＱＱＦＦＷＤＲＩＮＤＨＤＨＡＦＳＲＮＫＳＥＶＲＴＡＶＬＥＩＳＧＸＥＱＡＩＶＡＧＩＥＧＬＴＶＬＫＳＴＧＳＥＦＨＧＦＰＲＤＫＹＴＴＬＱＥＴＴＤＲＩＬＡＴＤＶＳＡＲＷＲＹＮＴＶＥＶＤＦＤＡＶＹＡＳＶＲＧＬＬＬＫＡＦＡＥＴＨＳＬＡＬＱＱＴＭＹＥＭＧＲＡＶＩＥＴＨＰＥＩＤＥＩＫＭＳＬＰＮＫＨＨＦＬＶＤＬＱＰＦＧＱＤＮＰＮＥＶＦＹＡＡＤＲＰＹＧＬＩＥＡＴＩＱＲＥＧＳＲＡＤＨＰＩＷＳＮＩＡＧＦＣ（配列番号１２６）；
ＭＴＡＴＡＥＴＳＴＧＴＫＶＶＬＧＱＮＱＹＧＫＡＥＶＲＬＶＫＶＴＲＮＴＡＲＨＥＩＱＤＬＮＶＴＳＱＬＲＧＤＦＥＡＡＨＴＡＧＤＮＡＨＶＶＡＴＤＴＱＫＮＴＶＹＡＦＡＲＤＧＦＡＴＴＥＥＦＬＬＲＬＧＫＨＦＴＥＧＦＤＷＶＴＧＧＲＷＡＡＱＱＦＦＷＤＲＩＮＤＨＤＨＡＦＳＲＮＫＳＥＶＲＴＡＶＬＥＩＳＧＳＸＱＡＩＶＡＧＩＥＧＬＴＶＬＫＳＴＧＳＥＦＨＧＦＰＲＤＫＹＴＴＬＱＥＴＴＤＲＩＬＡＴＤＶＳＡＲＷＲＹＮＴＶＥＶＤＦＤＡＶＹＡＳＶＲＧＬＬＬＫＡＦＡＥＴＨＳＬＡＬＱＱＴＭＹＥＭＧＲＡＶＩＥＴＨＰＥＩＤＥＩＫＭＳＬＰＮＫＨＨＦＬＶＤＬＱＰＦＧＱＤＮＰＮＥＶＦＹＡＡＤＲＰＹＧＬＩＥＡＴＩＱＲＥＧＳＲＡＤＨＰＩＷＳＮＩＡＧＦＣ（配列番号１２７）；
ＭＴＡＴＡＥＴＳＴＧＴＫＶＶＬＧＱＮＱＹＧＫＡＥＶＲＬＶＫＶＴＲＮＴＡＲＨＥＩＱＤＬＮＶＴＳＱＬＲＧＤＦＥＡＡＨＴＡＧＤＮＡＨＶＶＡＴＤＴＱＫＮＴＶＹＡＦＡＲＤＧＦＡＴＴＥＥＦＬＬＲＬＧＫＨＦＴＥＧＦＤＷＶＴＧＧＲＷＡＡＱＱＦＦＷＤＲＩＮＤＨＤＨＡＦＳＲＮＫＳＥＶＲＴＡＶＬＥＩＳＧＳＥＱＡＩＶＡＧＩＥＧＬＴＶＬＫＳＴＧＳＥＦＨＧＦＰＲＤＫＹＴＴＬＸＥＴＴＤＲＩＬＡＴＤＶＳＡＲＷＲＹＮＴＶＥＶＤＦＤＡＶＹＡＳＶＲＧＬＬＬＫＡＦＡＥＴＨＳＬＡＬＱＱＴＭＹＥＭＧＲＡＶＩＥＴＨＰＥＩＤＥＩＫＭＳＬＰＮＫＨＨＦＬＶＤＬＱＰＦＧＱＤＮＰＮＥＶＦＹＡＡＤＲＰＹＧＬＩＥＡＴＩＱＲＥＧＳＲＡＤＨＰＩＷＳＮＩＡＧＦＣ（配列番号１２８）；
ＭＴＡＴＡＥＴＳＴＧＴＫＶＶＬＧＱＮＱＹＧＫＡＥＶＲＬＶＫＶＴＲＮＴＡＲＨＥＩＱＤＬＮＶＴＳＱＬＲＧＤＦＥＡＡＨＴＡＧＤＮＡＨＶＶＡＴＤＴＱＫＮＴＶＹＡＦＡＲＤＧＦＡＴＴＥＥＦＬＬＲＬＧＫＨＦＴＥＧＦＤＷＶＴＧＧＲＷＡＡＱＱＦＦＷＤＲＩＮＤＨＤＨＡＦＳＲＮＫＳＥＶＲＴＡＶＬＥＩＳＧＳＥＱＡＩＶＡＧＩＥＧＬＴＶＬＫＳＴＧＳＥＦＨＧＦＰＲＤＫＹＴＴＬＱＥＴＴＤＲＩＬＡＴＤＶＳＡＲＷＲＹＮＴＸＥＶＤＦＤＡＶＹＡＳＶＲＧＬＬＬＫＡＦＡＥＴＨＳＬＡＬＱＱＴＭＹＥＭＧＲＡＶＩＥＴＨＰＥＩＤＥＩＫＭＳＬＰＮＫＨＨＦＬＶＤＬＱＰＦＧＱＤＮＰＮＥＶＦＹＡＡＤＲＰＹＧＬＩＥＡＴＩＱＲＥＧＳＲＡＤＨＰＩＷＳＮＩＡＧＦＣ（配列番号１２９）；
ＭＴＡＴＡＥＴＳＴＧＴＫＶＶＬＧＱＮＱＹＧＫＡＥＶＲＬＶＫＶＴＲＮＴＡＲＨＥＩＱＤＬＮＶＴＳＱＬＲＧＤＦＥＡＡＨＴＡＧＤＮＡＨＶＶＡＴＤＴＱＫＮＴＶＹＡＦＡＲＤＧＦＡＴＴＥＥＦＬＬＲＬＧＫＨＦＴＥＧＦＤＷＶＴＧＧＲＷＡＡＱＱＦＦＷＤＲＩＮＤＨＤＨＡＦＳＲＮＫＳＥＶＲＴＡＶＬＥＩＳＧＳＥＱＡＩＶＡＧＩＥＧＬＴＶＬＫＳＴＧＳＥＦＨＧＦＰＲＤＫＹＴＴＬＱＥＴＴＤＲＩＬＡＴＤＶＳＡＲＷＲＹＮＴＶＸＶＤＦＤＡＶＹＡＳＶＲＧＬＬＬＫＡＦＡＥＴＨＳＬＡＬＱＱＴＭＹＥＭＧＲＡＶＩＥＴＨＰＥＩＤＥＩＫＭＳＬＰＮＫＨＨＦＬＶＤＬＱＰＦＧＱＤＮＰＮＥＶＦＹＡＡＤＲＰＹＧＬＩＥＡＴＩＱＲＥＧＳＲＡＤＨＰＩＷＳＮＩＡＧＦＣ（配列番号１３０）；
ＭＴＡＴＡＥＴＳＴＧＴＫＶＶＬＧＱＮＱＹＧＫＡＥＶＲＬＶＫＶＴＲＮＴＡＲＨＥＩＱＤＬＮＶＴＳＱＬＲＧＤＦＥＡＡＨＴＡＧＤＮＡＨＶＶＡＴＤＴＱＫＮＴＶＹＡＦＡＲＤＧＦＡＴＴＥＥＦＬＬＲＬＧＫＨＦＴＥＧＦＤＷＶＴＧＧＲＷＡＡＱＱＦＦＷＤＲＩＮＤＨＤＨＡＦＳＲＮＫＳＥＶＲＴＡＶＬＥＩＳＧＳＥＱＡＩＶＡＧＩＥＧＬＴＶＬＫＳＴＧＳＥＦＨＧＦＰＲＤＫＹＴＴＬＱＥＴＴＤＲＩＬＡＴＤＶＳＡＲＷＲＹＮＴＶＥＶＤＦＤＡＶＹＡＳＶＲＧＬＬＬＫＡＦＡＥＴＸＳＬＡＬＱＱＴＭＹＥＭＧＲＡＶＩＥＴＨＰＥＩＤＥＩＫＭＳＬＰＮＫＨＨＦＬＶＤＬＱＰＦＧＱＤＮＰＮＥＶＦＹＡＡＤＲＰＹＧＬＩＥＡＴＩＱＲＥＧＳＲＡＤＨＰＩＷＳＮＩＡＧＦＣ（配列番号１３１）；および
ＭＴＡＴＡＥＴＳＴＧＴＫＶＶＬＧＱＮＱＹＧＫＡＥＶＲＬＶＫＶＴＲＮＴＡＲＨＥＩＱＤＬＮＶＴＳＱＬＲＧＤＦＥＡＡＨＴＡＧＤＮＡＨＶＶＡＴＤＴＱＫＮＴＶＹＡＦＡＲＤＧＦＡＴＴＥＥＦＬＬＲＬＧＫＨＦＴＥＧＦＤＷＶＴＧＧＲＷＡＡＱＱＦＦＷＤＲＩＮＤＨＤＨＡＦＳＲＮＫＳＥＶＲＴＡＶＬＥＩＳＧＳＥＱＡＩＶＡＧＩＥＧＬＴＶＬＫＳＴＧＳＥＦＨＧＦＰＲＤＫＹＴＴＬＱＥＴＴＤＲＩＬＡＴＤＶＳＡＲＷＲＹＮＴＶＥＶＤＦＤＡＶＹＡＳＶＲＧＬＬＬＫＡＦＡＥＴＨＳＬＡＬＱＱＴＭＹＥＭＧＲＡＶＩＥＴＨＸＥＩＤＥＩＫＭＳＬＰＮＫＨＨＦＬＶＤＬＱＰＦＧＱＤＮＰＮＥＶＦＹＡＡＤＲＰＹＧＬＩＥＡＴＩＱＲＥＧＳＲＡＤＨＰＩＷＳＮＩＡＧＦＣ（配列番号１３２）、
このとき、前記Ｘは、図２３～２７の表に開示されている非天然アミノ酸から選択されたものである。
実施例１１：尿酸酸化酵素－リンカー結合部の例
実施例１～１０のいずれか１つにおいて、前記尿酸酸化酵素－リンカー結合部が以下から選択されたいずれか１つである尿酸酸化酵素－アルブミン結合体：
ここで、前記（１）部分は尿酸酸化酵素変異体に連結され、前記（２）部分はリンカーのアンカー部分に連結されている。
実施例１２：アルブミン配列の限定
実施例１～１１のいずれか１つにおいて、前記アルブミンが以下から選択された配列で表されることを特徴とする尿酸酸化酵素－アルブミン結合体：
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号１３３）；
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＭＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号１３４）；
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡ ＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＡＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号１３５）；
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＲＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号１３６）；
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＧＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号１３７）；
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＡＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号１３８）；
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＹＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号１３９）；
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＩＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫ ＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号１４０）；
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＤＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号１４１）；
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＶＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号１４２）；
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＭＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号１４３）；および
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＴＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号１４４）。
実施例１３：アルブミン－リンカー結合体の限定
実施例１～１２のいずれか１つにおいて、前記アルブミン－リンカー結合部は、前記アルブミンに含まれるチオール基と前記アンカーに連結されたチオール反応基とが反応して形成されることを特徴とする尿酸酸化酵素－アルブミン結合体。
実施例１４：アルブミン結合位置の限定
実施例１３において、前記アルブミンの配列は配列番号１３３～１４４から選択され、前記アルブミン－リンカー結合部は前記アルブミン配列のうちの３４番目のシステイン残基のチオール基と前記アンカーに連結されたチオール反応基とが反応して形成されることを特徴とする尿酸酸化酵素－アルブミン結合体。
実施例１５：アルブミン－リンカー結合部の限定
実施例１３～実施例１４のいずれか１つにおいて、前記アルブミン－リンカー結合部は図３０の表から選択されたものである尿酸酸化酵素－アルブミン結合体。
実施例１６：アンカーの限定
実施例１～１５のいずれか１つにおいて、前記アンカーは図４０の表から選択されたものである尿酸酸化酵素－アルブミン結合体。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体２
実施例１７：尿酸酸化酵素－アルブミン結合体、サブユニットの観点
３つまたは４つのアルブミン－サブユニット結合体を含む尿酸酸化酵素－アルブミン結合体：
このとき、それぞれの前記アルブミン－サブユニット結合体は、下記の［化学式２］で表現され、
［化学式２］
ｐ'－Ｊ１－Ａ－Ｊ２－ＨＳＡ
ここで、前記ｐ'は尿酸酸化酵素変異体サブユニットであり、前記Ｊ１は尿酸酸化酵素－リンカー結合部であり、前記Ａはアンカー、前記Ｊ２はアルブミン－リンカー結合部、前記ＨＳＡはヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）を意味し、
前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、野生型尿酸酸化酵素サブユニットの配列のうちの１つ以上のアミノ酸がテトラジン官能基（ｔｅｔｒａｚｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）またはトリアジン官能基（ｔｒｉａｚｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）を含む非天然アミノ酸に置き換えたものであり、
前記尿酸酸化酵素－リンカー結合部は、前記非天然アミノ酸のテトラジン官能基またはトリアジン官能基、および前記アンカーに連結されたトランスシクロオクテン官能基が逆電子要求ディールス・アルダー（Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ；ＩＥＤＤＡ）反応を起こして形成されたものであり、
選択的に、１つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットを含み、
ここで、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体が３つのアルブミン－サブユニット複合体を含む場合、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は１つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットを含み、それぞれのアルブミン－サブユニット複合体に含まれる尿酸酸化酵素変異体サブユニットおよび１つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化して四量体を構成し、
前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体が４つのアルブミン－サブユニット複合体を含む場合、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は尿酸酸化酵素変異体サブユニットを含まず、それぞれのアルブミン－サブユニット複合体に含まれる尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化して四量体を構成する。
実施例１８：４つのアルブミンの結合
実施例１７において、第１～第４アルブミン－サブユニット結合体を含む前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体：
前記第１アルブミン－サブユニット結合体は、第１尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第１尿酸酸化酵素－リンカー結合部、第１アンカー、第１アルブミン－リンカー結合部、および第１アルブミンを含み、
前記第２アルブミン－サブユニット結合体は、第２尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第２尿酸酸化酵素－リンカー結合部、第２アンカー、第２アルブミン－リンカー結合部、および第２アルブミンを含み、
前記第３アルブミン－サブユニット結合体は、第３尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第３尿酸酸化酵素－リンカー結合部、第３アンカー、第３アルブミン－リンカー結合部、および第３アルブミンを含み、
前記第４アルブミン－サブユニット結合体は、第４尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第４尿酸酸化酵素－リンカー結合部、第４アンカー、第４アルブミン－リンカー結合部、および第４アルブミンを含み、
前記第１尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第２尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第３尿酸酸化酵素変異体サブユニット、および第４尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化して四量体となる。
実施例１９：４つのアルブミンの結合、構成要素のマーカッシュ請求項
実施例１８において、以下を特徴とする尿酸酸化酵素－アルブミン結合体：
前記第１尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号１～配列番号１３２で選択された配列、または前記選択された配列と８０％以上一致する配列と表現され、ここで前記選択された配列に含まれるＸは、図２３～２７の表から選択された非天然アミノ酸であり、
前記第１尿酸酸化酵素－リンカー結合部は、前記図２３～２７の表から選択された非天然アミノ酸に従って図２８の表に開示されていると決定され、
前記第２尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号１～配列番号１３２で選択された配列、または前記選択された配列と８０％以上一致する配列と表現され、ここで前記選択された配列に含まれるＸは、図２３～２７の表から選択された非天然アミノ酸であり、
前記第２尿酸酸化酵素－リンカー結合部は、前記図２３～２７の表から選択された非天然アミノ酸に従って図２８の表に開示されていると決定され、
前記第３尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号１～配列番号１３２で選択された配列、または前記選択された配列と８０％以上一致する配列と表現され、ここで前記選択された配列に含まれるＸは、図２３～２７の表から選択された非天然アミノ酸であり、
前記第３尿酸酸化酵素－リンカー結合部は、前記図２３～２７の表から選択された非天然アミノ酸に従って図２８の表に開示されていると決定され、
前記第４尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号１～配列番号１３２で選択された配列、または前記選択された配列と８０％以上一致する配列と表現され、ここで前記選択された配列に含まれるＸは、図２３～２７の表から選択された非天然アミノ酸であり、
前記第４尿酸酸化酵素－リンカー結合部は、前記図２３～２７の表から選択された非天然アミノ酸に従って図２８の表に開示されていると決定され、
前記第１アンカー、第２アンカー、第３アンカー、および第４アンカーは、それぞれ独立して図２９の表から選択され、
前記第１アルブミン－リンカー結合部、第２アルブミン－リンカー結合部、第３アルブミン－リンカー結合部、および第４アルブミン－リンカー結合部は、それぞれ独立して図３０の表から選択され、
前記第１アルブミン、第２アルブミン、第３アルブミン、および第４アルブミンは、それぞれ独立に、配列番号１３３～配列番号１４５で選択された配列、または前記選択された配列と８０％以上一致する配列と表現され、
前記第１アルブミン－リンカー結合部は、前記第１アンカーに連結されたチオール反応基（ｔｈｉｏｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｉｅｔｙ）および前記第１アルブミン配列のうち、３４番目のシステインのチオール基（ｔｈｉｏｌ ｍｏｉｅｔｙ）が反応して形成されたものであり、
前記第２アルブミン－リンカー結合部は、前記第２アンカーに連結されたチオール反応基（ｔｈｉｏｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｉｅｔｙ）および前記第２アルブミン配列のうち、３４番目のシステインのチオール基（ｔｈｉｏｌ ｍｏｉｅｔｙ）が反応して形成されたものであり、
前記第３アルブミン－リンカー結合部は、前記第３アンカーに連結されたチオール反応基（ｔｈｉｏｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｉｅｔｙ）および前記第３アルブミン配列のうち、３４番目のシステインのチオール基（ｔｈｉｏｌ ｍｏｉｅｔｙ）が反応して形成されたものであり、
前記第４アルブミン－リンカー結合部は、前記第４アンカーに連結されたチオール反応基（ｔｈｉｏｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｉｅｔｙ）および前記第４アルブミン配列のうち、３４番目のシステインのチオール基（ｔｈｉｏｌ ｍｏｉｅｔｙ）が反応して形成されたものである。
実施例２０：４つのアルブミンの結合、尿酸酸化酵素由来の限定
実施例１９において、前記第１尿酸酸化酵素変異体サブユニット、前記第２尿酸酸化酵素変異体サブユニット、前記第３尿酸酸化酵素変異体サブユニット、および前記第４尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、いずれもアスペルギルス・フラバス、カンジダ・ユチリス、およびアルスロバクター・グロビフォルミスから選択された１つの微生物に由来したものであることを特徴とする尿酸酸化酵素－アルブミン結合体。
実施例２１：３つのアルブミンの結合
実施例１７において、第１～第４アルブミン－サブユニット結合体を含む前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体：
前記第１アルブミン－サブユニット結合体は、第１尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第１尿酸酸化酵素－リンカー結合部、第１アンカー、第１アルブミン－リンカー結合部、および第１アルブミンを含み、
前記第２アルブミン－サブユニット結合体は、第２尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第２尿酸酸化酵素－リンカー結合部、第２アンカー、第２アルブミン－リンカー結合部、および第２アルブミンを含み、
前記第３アルブミン－サブユニット結合体は、第３尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第３尿酸酸化酵素－リンカー結合部、第３アンカー、第３アルブミン－リンカー結合部、および第３アルブミンを含み、
前記第１尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第２尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第３尿酸酸化酵素変異体サブユニット、および第４尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化して四量体となる。
実施例２２：３つのアルブミンの結合、構成要素のマーカッシュ請求項
実施例２１において、以下を特徴とする尿酸酸化酵素－アルブミン結合体：
前記第１尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号１～配列番号１３２で選択された配列、または前記選択された配列と８０％以上一致する配列と表現され、ここで前記選択された配列に含まれるＸは、図２３～２７の表から選択された非天然アミノ酸であり、
前記第１尿酸酸化酵素－リンカー結合部は、前記図２３～２７の表から選択された非天然アミノ酸に従って図２８の表に開示されていると決定され、
前記第２尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号１～配列番号１３２で選択された配列、または前記選択された配列と８０％以上一致する配列と表現され、ここで前記選択された配列に含まれるＸは、図２３～２７の表から選択された非天然アミノ酸であり、
前記第２尿酸酸化酵素－リンカー結合部は、前記図２３～２７の表から選択された非天然アミノ酸に従って図２８の表に開示されていると決定され、
前記第３尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号１～配列番号１３２で選択された配列、または前記選択された配列と８０％以上一致する配列と表現され、ここで前記選択された配列に含まれるＸは、図２３～２７の表から選択された非天然アミノ酸であり、
前記第３尿酸酸化酵素－リンカー結合部は、前記図２３～２７の表から選択された非天然アミノ酸に従って図２８の表に開示されていると決定され、
前記第４尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号１～配列番号１３２で選択された配列、または前記選択された配列と８０％以上一致する配列と表現され、ここで前記選択された配列に含まれるＸは、図２３～２７の表から選択された非天然アミノ酸であり、
前記第１アンカー、第２アンカー、および第３アンカーはそれぞれ独立して、図２９の表から選択され、
前記第１アルブミン－リンカー結合部、第２アルブミン－リンカー結合部、および第３アルブミン－リンカー結合部はそれぞれ独立して、図３０の表から選択され、
前記第１アルブミン、第２アルブミン、第３アルブミン、および第４アルブミンはそれぞれ独立して、配列番号１３３～配列番号１４５で選択された配列、または前記選択された配列と８０％以上一致する配列と表現され、
前記第１アルブミン－リンカー結合部は、前記第１アンカーに連結されたチオール反応基（ｔｈｉｏｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｉｅｔｙ）および前記第１アルブミン配列のうち、３４番目のシステインのチオール基（ｔｈｉｏｌ ｍｏｉｅｔｙ）が反応して形成されたものであり、
前記第２アルブミン－リンカー結合部は、前記第２アンカーに連結されたチオール反応基（ｔｈｉｏｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｉｅｔｙ）および前記第２アルブミン配列のうち、３４番目のシステインのチオール基（ｔｈｉｏｌ ｍｏｉｅｔｙ）が反応して形成されたものであり、
前記第３アルブミン－リンカー結合部は、前記第３アンカーに連結されたチオール反応基（ｔｈｉｏｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｉｅｔｙ）および前記第３アルブミン配列のうち、３４番目のシステインのチオール基（ｔｈｉｏｌ ｍｏｉｅｔｙ）が反応して形成されたものである。
実施例２３：３つのアルブミンの結合、尿酸酸化酵素由来の限定
実施例２２において、前記第１尿酸酸化酵素変異体サブユニット、前記第２尿酸酸化酵素変異体サブユニット、前記第３尿酸酸化酵素変異体サブユニット、および前記第４尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、いずれもアスペルギルス・フラバス、カンジダ・ユチリス、およびアルスロバクター・グロビフォルミスから選択された１つの微生物に由来したものであることを特徴とする尿酸酸化酵素－アルブミン結合体。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を含む医薬組成物
実施例２４：医薬組成物の請求項
尿酸関連疾患を予防または治療するための医薬組成物であって、
治療学的有効量の、実施例１～２３のいずれか１つの尿酸酸化酵素－アルブミン結合体と、
薬学的に許容される担体と、を含む。
実施例２５：適応症の限定
実施例２４において、前記尿酸関連疾患は、高尿酸血症、急性痛風性関節炎、間欠期痛風、慢性結節性痛風、慢性腎臓病（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ）、および腫瘍崩壊症候群（Ｔｕｍｏｒ Ｌｙｓｉｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＴＬＳ）のうちのいずれか１つである医薬組成物。
実施例２６；担体の例
実施例２４～２５のいずれか１つにおいて、前記薬学的に許容される担体は、
ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプンまたはサツマイモデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、フマル酸ステアリルナトリウムまたはポリエチレングリコールワックスなどの潤滑油；甘味料；芳香剤；シロップ剤；脂肪油のような液体担体；滅菌水溶液；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；オレイン酸エチルのような注射可能なエステル；懸濁剤；乳剤；凍結乾燥製剤；外用剤；安定剤；緩衝剤；動物油；植物油；ワックス；パラフィン；デンプン；トラガカント；セルロース誘導体；ポリエチレングリコール；シリコン；ベントナイト；シリカ；タルク；酸化亜鉛のうちの１つ以上を含む医薬組成物である。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を用いた治療方法
実施例２７：医薬組成物を使用する治療方法
実施例２４～２６のいずれか１つの医薬組成物を患者体内に投与することを含む、尿酸関連疾患の予防または治療方法。
実施例２８：適応症の限定
実施例２７において、前記尿酸関連疾患は、高尿酸血症、急性痛風性関節炎、間欠期痛風、慢性結節性痛風、慢性腎臓病（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ）および腫瘍崩壊症候群（Ｔｕｍｏｒ Ｌｙｓｉｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＴＬＳ）のうちのいずれか１つである医薬組成物。
実施例２９：投与方法の限定
実施例２７～２８のいずれか１つにおいて、前記投与方法は、経口投与、非経口投与、静脈内投与、点滴静脈注射（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、腹腔内投与、筋肉内投与、経皮投与、および皮下投与から選択されることを特徴とする方法。
実施例３０：投与用量の限定
実施例２７～２９のいずれか１つにおいて、前記医薬組成物を０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇの用量で前記患者体内に投与することを特徴とする方法。
実施例３１：投与周期の限定１
実施例２７～３０のいずれか１つにおいて、前記医薬組成物を１日１回投与することを特徴とする方法。
実施例３２：投与周期の限定２
実施例２７～３０のいずれか１つにおいて、前記医薬組成物を１日２回以上投与することを特徴とする方法。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の用途
実施例３３：治療剤の製造用途
実施例１～２３のいずれか１つの尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を尿酸関連疾患治療剤として製造する用途。
実施例３４：適応症の限定
実施例３３において、前記尿酸関連疾患は、高尿酸血症、急性痛風性関節炎、間欠期痛風、慢性結節性痛風、慢性腎臓病（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ）および腫瘍崩壊症候群（Ｔｕｍｏｒ Ｌｙｓｉｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＴＬＳ）のうちのいずれか１つである用途。
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法
実施例３５：アルブミン－リンカー結合優先
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法は、
アルブミンとリンカーを反応させることと、
アルブミン－リンカー結合体と尿酸酸化酵素変異体を反応させることと、を含み、
前記リンカーは、ジエノフィル官能基（ｄｉｅｎｏｐｈｉｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）、アンカー、およびチオール反応性基（ｔｈｉｏｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｉｅｔｙ）を含み、
前記リンカーのチオール反応性基と前記アルブミンのチオール基が反応を介して結合してアルブミン－リンカー結合体を生成し、
前記尿酸酸化酵素変異体は、野生型尿酸酸化酵素の配列で３つ以上のアミノ酸がジエン官能基（ｄｉｅｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）を含む非天然アミノ酸に置き換えたものであり、
前記尿酸酸化酵素変異体の前記ジエン官能基および前記アルブミン－リンカー結合体のリンカーに含まれる前記ジエノフィル官能基は逆電子要求ディールス・アルダー（Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ；ＩＥＤＤＡ）反応を介して結合して尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を生成し、
前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸酸化酵素変異体に３つ以上のアルブミンがリンカーを介して結合したことを特徴とする。
実施例３６：尿酸酸化酵素－アルブミン結合優先
尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法は、
尿酸酸化酵素変異体とリンカーを反応させることと、
尿酸酸化酵素－リンカー結合体とアルブミンを反応させることと、を含み、
前記尿酸酸化酵素変異体は、野生型尿酸酸化酵素の配列で３つ以上のアミノ酸がジエン官能基（ｄｉｅｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）を含む非天然アミノ酸に置き換えたものであり、
前記リンカーは、ジエノフィル官能基（ｄｉｅｎｏｐｈｉｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）、アンカー、およびチオール反応性基（ｔｈｉｏｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｉｅｔｙ）を含み、
前記尿酸酸化酵素変異体の前記ジエン官能基および前記リンカーの前記ジエノフィル官能基は逆電子要求ディールス・アルダー（Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ；ＩＥＤＤＡ）反応を介して結合して尿酸酸化酵素－リンカー結合体を生成し、
前記尿酸酸化酵素－リンカー結合体は、尿酸酸化酵素変異体に３つ以上のリンカーが結合されたものであり、
前記尿酸酸化酵素－リンカー結合体のリンカーに含まれるチオール反応性基と前記アルブミンのチオール基が反応を介して結合して尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を生成し、
前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸酸化酵素－リンカー結合体に３つ以上のアルブミンが結合されたものであることを特徴とする。
実施例３７：尿酸酸化酵素、リンカー、アルブミン同時
尿酸酸化酵素変異体、リンカー、およびアルブミンを反応させることを含む尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法であって、
前記尿酸酸化酵素変異体は、野生型尿酸酸化酵素の配列で３つ以上のアミノ酸がジエン官能基（ｄｉｅｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）を含む非天然アミノ酸に置き換えたものであり、
前記リンカーは、ジエノフィル官能基（ｄｉｅｎｏｐｈｉｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）、アンカー、およびチオール反応性基（ｔｈｉｏｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｉｅｔｙ）を含み、
前記アルブミンのチオール基と前記リンカーのチオール反応基とが反応を起こして結合され、
前記尿酸酸化酵素変異体の非天然アミノ酸に含まれるジエン官能基と前記リンカーのＩＥＤＤＡ反応基とが反応を起こして結合され、
前記反応結果尿酸酸化酵素－アルブミン結合体が生成される。
実施例３８：尿酸酸化酵素変異体の限定
実施例３６～３７のいずれか１つにおいて、前記尿酸酸化酵素変異体が４つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化された四量体タンパク質であり、前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットが野生型の尿酸酸化酵素サブユニットと比較して１つ以上のアミノ酸がジエン官能基を含む非天然アミノ酸に置き換えたことを特徴とする、尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法。
実施例３９：非天然アミノ酸ジエン官能基の限定
実施例３５～３７のいずれか１つにおいて、前記非天然アミノ酸のジエン官能基がテトラジン官能基またはトリアジン官能基であることを特徴とする尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法。
実施例４０：ジエノフィル官能基の限定
実施例３５～３７のいずれか１つにおいて、前記リンカーの前記ジエノフィル官能基は、トランスシクロオクテンおよびその誘導体から選択されたものであることを特徴とする尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法。
実施例４１：チオール反応基の限定
実施例３５～３７のいずれか１つにおいて、前記チオール反応基は、マレイミドまたはその誘導体、および３-アリルプロピロニトリルまたはその誘導体から選択されたものであることを特徴とする尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法。
実施例４２：尿酸酸化酵素－リンカー反応条件の限定
実施例３５～３７のいずれか１つにおいて、前記尿酸酸化酵素変異体とリンカーを反応させることは、中性ｐＨ環境で実行されることを特徴とする尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法。
実施例４３：反応物マーカッシュ請求項
実施例３５～３７のいずれか１つにおいて、
前記尿酸酸化酵素変異体は、配列番号１～１３２からそれぞれ独立に選択された配列、または前記選択された配列と８０％以上一致する配列と表現される４つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化した四量体であり、ここで前記選択された配列に含まれるＸは、図２３～２７の表から選択された非天然アミノ酸であり、
前記リンカーは、図３１の表から選択され、
前記アルブミンは、配列番号１３３～１４４で選択された配列、または前記選択された配列と８０％以上一致する配列と表現され、
前記アルブミンのチオール基は、前記配列番号１３３～１４４で選択された配列、または前記選択された配列と８０％以上一致する配列のうち、３４番目のシステインのチオール基であることを特徴とする尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法。
尿酸酸化酵素変異体
実施例４４：尿酸酸化酵素変異体
配列内に３つ以上の非天然アミノ酸を含む尿酸酸化酵素変異体であって、
ここで、それぞれの前記非天然アミノ酸は、テトラジン官能基（ｔｅｔｒａｚｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）またはトリアジン官能基（ｔｒｉａｚｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）を含むことを特徴とする。
実施例４５：３つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットを含む
実施例４４において、前記尿酸酸化酵素変異体は、１つの野生型尿酸酸化酵素サブユニットと３つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化して形成された四量体であり、
前記各尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、野生の尿酸酸化酵素サブユニット配列で１つ以上のアミノ酸がテトラジン官能基（ｔｅｔｒａｚｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）またはトリアジン官能基（ｔｒｉａｚｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）を含む非天然アミノ酸に置き換えたものであることを特徴とする尿酸酸化酵素変異体。
実施例４６：４つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットを含む
実施例４４において、前記尿酸酸化酵素変異体は、４つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化して形成された四量体であり、
前記各尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、野生の尿酸酸化酵素サブユニット配列で１つ以上のアミノ酸がテトラジン官能基（ｔｅｔｒａｚｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）またはトリアジン官能基（ｔｒｉａｚｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）を含む非天然アミノ酸に置き換えたものであることを特徴とする尿酸酸化酵素変異体。
実施例４７：尿酸酸化酵素変異体の由来の限定
実施例４６において、前記各尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、アスペルギルス・フラバス、カンジダ・ユチリス、およびアルスロバクター・グロビフォルミスから選択された微生物由来の野生型尿酸酸化酵素サブユニット配列を変形させたことを特徴とする尿酸酸化酵素変異体。
実施例４８：尿酸酸化酵素変異体の置換位置の限定
実施例４６において、前記各尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、野生の尿酸酸化酵素サブユニット配列内の１つ以上の置換適合位置のアミノ酸を前記非天然アミノ酸に置き換えたものであり、
前記置換適合位置は、尿酸酸化酵素サブユニットの機能と構造に特に影響を及ぼさず、溶媒接近性が高い位置であることを特徴とする尿酸酸化酵素変異体。
実施例４９：尿酸酸化酵素変異体の置換位置の決定方法の限定
実施例４８において、前記置換適合位置は、分子モデリングシミュレーション結果、好ましくはＲｏｓｅｔｔａ分子モデリングパッケージのスコアリング結果を参照して決定されたことを特徴とする尿酸酸化酵素変異体。
実施例５０：アスペルギルス・フラバスＵｏｘ、配列選択
実施例４７において、前記尿酸酸化酵素変異体は、第１尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第２尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第３尿酸酸化酵素変異体サブユニット、および第４尿酸酸化酵素変異体サブユニットを含み、
前記第１尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第２尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第３尿酸酸化酵素変異体サブユニット、および第４尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号２～配列番号５０でそれぞれ独立に選択された配列、または前記選択された配列と８０％以上一致する配列と表現され、
ここで、各配列内のＸは、テトラジン官能基またはトリアジン官能基を含む非天然アミノ酸であることを特徴とする尿酸酸化酵素変異体。
実施例５１：アスペルギルス・フラバスＵｏｘ、非天然アミノ酸選択
実施例５０において、それぞれの尿酸酸化酵素変異体サブユニット配列に含まれるＸは、図２３～２７に開示されている表からそれぞれ独立して選択された非天然アミノ酸であることを特徴とする尿酸酸化酵素変異体。
実施例５２：アスペルギルス・フラバスＵｏｘ、配列統一
実施例５１において、前記第１尿酸酸化酵素変異体、第２尿酸酸化酵素変異体、第３尿酸酸化酵素変異体、および第４尿酸酸化酵素変異体は同じ配列を有することを特徴とする尿酸酸化酵素変異体。
実施例５３：カンジダ・ユチリスＵｏｘ、配列選択
実施例４７において、前記尿酸酸化酵素変異体は、第１尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第２尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第３尿酸酸化酵素変異体サブユニット、および第４尿酸酸化酵素変異体サブユニットを含み、
前記第１尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第２尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第３尿酸酸化酵素変異体サブユニット、および第４尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号５２～配列番号１１７でそれぞれ独立に選択された配列、または前記選択された配列と８０％以上一致する配列と表現され、
ここで、各配列内のＸは、テトラジン官能基またはトリアジン官能基を含む非天然アミノ酸であることを特徴とする尿酸酸化酵素変異体。
実施例５４：カンジダ・ユチリスＵｏｘ、非天然アミノ酸選択
実施例５３において、それぞれの尿酸酸化酵素変異体サブユニット配列に含まれるＸは、図２３～２７に開示されている表からそれぞれ独立して選択された非天然アミノ酸であることを特徴とする尿酸酸化酵素変異体。
実施例５５：カンジダ・ユチリスＵｏｘ、配列統一
実施例５４において、前記第１尿酸酸化酵素変異体、第２尿酸酸化酵素変異体、第３尿酸酸化酵素変異体、および第４尿酸酸化酵素変異体は同じ配列を有することを特徴とする尿酸酸化酵素変異体。
実施例５６：アルスロバクター・グロビフォルミスＵｏｘ、配列選択
実施例４７において、前記尿酸酸化酵素変異体は、第１尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第２尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第３尿酸酸化酵素変異体サブユニット、および第４尿酸酸化酵素変異体サブユニットを含み、
前記第１尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第２尿酸酸化酵素変異体サブユニット、第３尿酸酸化酵素変異体サブユニット、および第４尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号１１９～配列番号１３２でそれぞれ独立に選択された配列、または前記選択された配列と８０％以上一致する配列と表現され、
ここで、各配列内のＸは、テトラジン官能基またはトリアジン官能基を含む非天然アミノ酸であることを特徴とする尿酸酸化酵素変異体。
実施例５７：アルスロバクター・グロビフォルミスＵｏｘ、非天然アミノ酸選択
実施例５６において、それぞれの尿酸酸化酵素変異体サブユニット配列に含まれるＸは、図２３～２７に開示されている表からそれぞれ独立して選択された非天然アミノ酸であることを特徴とする尿酸酸化酵素変異体。
実施例５８：アルスロバクター・グロビフォルミスＵｏｘ、配列統一
実施例５７において、前記第１尿酸酸化酵素変異体、第２尿酸酸化酵素変異体、第３尿酸酸化酵素変異体、および第４尿酸酸化酵素変異体は同じ配列を有することを特徴とする尿酸酸化酵素変異体。
尿酸酸化酵素変異体発現ベクター
実施例５９：尿酸酸化酵素変異体発現ベクター
実施例４４～５８のいずれか１つの尿酸酸化酵素変異体を発現できるベクターであって、前記尿酸酸化酵素変異体に含まれる非天然アミノ酸に該当する部分が、アンバーコドン（ａｍｂｂｅｒ ｃｏｄｏｎ；５'－ＵＡＧ－３'）、オーカーコドン（ｏｃｈｅｒ ｃｏｄｏｎ；５'－ＵＡＡ－３'）、およびオパールコドン（ｏｐａｌ ｃｏｄｏｎ；５'－ＵＧＡ－３'）から選択されたものでコードされることを特徴とするベクター。
実施例６０：尿酸酸化酵素変異体発現ベクター配列の限定
実施例５９において、前記ベクターは、以下から選択される１つ以上の配列、または前記選択された配列と８０％以上一致する配列を含むことを特徴とするベクター：
５'－ＡＴＧＴＣＴＧＣＴＧＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＴＡＡＴＧＴＧＡＧＧＧＴＧＴＡＣＡＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＡＧＡＣＴＧＧＣＧＴＧＣＡＧＡＣＡＧＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣＧＴＧＴＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＧＣＧＡＡＡＴＣＧＡＧＡＣＴＴＣＴＴＡＴＡＣＣＡＡＡＧＣＣＧＡＣＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＴＴＧＴＧＧＣＣＡＣＡＧＡＴＴＣＴＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＣＴＡＴＣＴＡＴＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＡＡＣＡＧＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＴＴＣＴＣＧＧＣＡＣＡＣＡＣＴＴＴＡＴＴＧＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＴＧＣＴＧＣＡＣＡＣＧＴＧＡＡＴＡＴＣＧＴＧＴＧＴＣＡＴＣＧＣＴＧＧＡＣＣＣＧＣＡＴＧＧＡＣＡＴＣＴＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＡＧＡＧＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＡＣＧＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＧＡＡＡＡＧＧＴＡＴＣＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＧＣＴＣＡＣＴＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＧＡＣＧＡＡＴＡＣＡＣＴＡＣＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＴＧＧＧＡＴＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＧＴＡＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＴＧＣＡＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＴＴＴＣＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＣＧＧＴＣＣＣＡＣＧＴＧＣＣＣＡＡＧＴＴＴＧＡＴＧＣＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＣＧＣＡＡＧＧＧＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＣＣＴＴＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＣＣＧＣＴＡＧＣＧＴＧＣＡＧＧＣＣＡＣＡＡＴＧＴＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＡＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＴＧＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＧＴＡＣＴＣＴＣＴＧＣＣＴＡＡＣＡＡＧＣＡＣＴＡＴＴＴＣＧＡＡＡＴＣＧＡＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧＣＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＧＣＡＧＡＡＴＡＣＴＧＧＴＡＡＡＡＡＣＧＣＡＧＡＧＧＴＧＴＴＣＧＣＣＣＣＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＣＣＣＡＡＴＧＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＡＧＡＴＣＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣ ＡＡＧＣＴＧＴＡＡ－３'（配列番号１５２）；
５'－ＡＴＧＴＣＴＧＣＴＧＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＴＡＡＴＧＴＧＡＧＧＧＴＧＴＡＣＡＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＡＧＡＣＴＧＧＣＧＴＧＣＡＧＡＣＡＧＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣＧＴＧＴＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＧＣＧＡＡＡＴＣＧＡＧＡＣＴＴＣＴＴＡＴＡＣＣＡＡＡＧＣＣＧＡＣＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＴＴＧＴＧＧＣＣＡＣＡＧＡＴＴＣＴＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＣＴＡＴＣＴＡＴＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＡＡＣＡＧＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＴＴＣＴＣＧＧＣＡＣＡＣＡＣＴＴＴＡＴＴＧＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＴＧＣＴＧＣＡＣＡＣＧＴＧＡＡＴＡＴＣＧＴＧＴＧＴＣＡＴＣＧＣＴＧＧＡＣＣＣＧＣＡＴＧＧＡＣＡＴＣＧＡＣＧＧＡＡＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＡＧＡＧＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＡＣＧＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＧＡＡＡＡＧＧＴＡＴＣＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＧＣＴＣＡＣＴＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＡＧＧＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＧＡＣＧＡＡＴＡＣＡＣＴＡＣＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＴＧＧＧＡＴＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＧＴＡＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＴＧＣＡＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＴＴＴＣＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＣＧＧＴＣＣＣＡＣＧＴＧＣＣＣＡＡＧＴＴＴＧＡＴＧＣＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＣＧＣＡＡＧＧＧＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＣＣＴＴＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＣＣＧＣＴＡＧＣＧＴＧＣＡＧＧＣＣＡＣＡＡＴＧＴＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＡＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＴＧＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＧＴＡＣＴＣＴＣＴＧＣＣＴＡＡＣＡＡＧＣＡＣＴＡＴＴＴＣＧＡＡＡＴＣＧＡＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧＣＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＧＣＡＧＡＡＴＡＣＴＧＧＴＡＡＡＡＡＣＧＣＡＧＡＧＧＴＧＴＴＣＧＣＣＣＣＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＣＣＣＡＡＴＧＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＡＧＡＴＣＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＴＡＡ－３'（配列番号１５３）；
５'－ＡＴＧＴＣＴＧＣＴＧＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＴＡＡＴＧＴＧＡＧＧＧＴＧＴＡＣＡＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＡＧＡＣＴＧＧＣＧＴＧＣＡＧＡＣＡＧＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣＧＴＧＴＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＧＣＧＡＡＡＴＣＧＡＧＡＣＴＴＣＴＴＡＴＡＣＣＡＡＡＧＣＣＧＡＣＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＴＴＧＴＧＧＣＣＡＣＡＧＡＴＴＣＴＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＣＴＡＴＣＴＡＴＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＡＡＣＡＧＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＴＴＣＴＣＧＧＣＡＣＡＣＡＣＴＴＴＡＴＴＧＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＴＧＣＴＧＣＡＣＡＣＧＴＧＡＡＴＡＴＣＧＴＧＴＧＴＣＡＴＣＧＣＴＧＧＡＣＣＣＧＣＡＴＧＧＡＣＡＴＣＧＡＣＧＧＡＡＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＡＧＡＧＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＡＣＧＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＧＡＡＡＡＧＧＴＡＴＣＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＧＣＴＣＡＣＴＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＧＡＣＧＡＡＴＡＣＡＣＴＡＣＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＴＡＧＧＡＴＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＧＴＡＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＴＧＣＡＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＴＴＴＣＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＣＧＧＴＣＣＣＡＣＧＴＧＣＣＣＡＡＧＴＴＴＧＡＴＧＣＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＣＧＣＡＡＧＧＧＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＣＣＴＴＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＣＣＧＣＴＡＧＣＧＴＧＣＡＧＧＣＣＡＣＡＡＴＧＴＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＡＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＴＧＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＧＴＡＣＴＣＴＣＴＧＣＣＴＡＡＣＡＡＧＣＡＣＴＡＴＴＴＣＧＡＡＡＴＣＧＡＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧＣＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＧＣＡＧＡＡＴＡＣＴＧＧＴＡＡＡＡＡＣＧＣＡＧＡＧＧＴＧＴＴＣＧＣＣＣＣＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＣＣＣＡＡＴＧＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＡＧＡＴＣＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＴＡＡ－３'（配列番号１５４）；
５'－ＡＴＧＡＧＣＡＣＣＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＡＴＧＧＴＡＡＡＧＡＴＡＡＴＧＴＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＴＴＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＣＣＴＧＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＴＡＴＡＣＣＧＡＡＧＣＡＧＡＴＡＡＴＡＧＣＡＧＣＡＴＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＧＡＴＡＣＣＧＴＧＡＡＡＡＡＴＡＣＣＡＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＣＣＧＡＡＡＴＴＴＧＧＣＣＧＡＴＴＧＡＡＣＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡＣＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＴＴＴＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＴＡＴＴＣＴＣＡＴＧＴＴＡＧＣＧＧＴＧＴＧＡＧＣＧＴＴＡＡＡＡＴＴＧＴＴＣＡＧＧＡＴＣＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＡＴＡＴＧＣＣＧＴＴＧＡＴＧＧＴＡＡＡＣＣＧＣＡＴＧＡＴＣＡＣＡＧＣＴＴＴＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＡＡＡＡＣＧＴＡＴＣＡＣＣＧＡＣＣＴＧＴＡＴＴＡＣＡＡＡＣＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＴＴＡＴＡＡＡＣＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＴＧＴＴＴＴＡＧＧＧＴＴＡＴＡＡＣＡＡＡＴＧＣＧＡＴＴＴＣＡＣＡＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＴＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧＣＡＡＣＣＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＡＴＡＡＴＡＡＧＡＡＡＡＴＴＧＧＴＡＧＣＧＴＧＴＡＣＧＡＴＡＴＴＧＣＣＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＡＡＡＧＧＣＡＴＣＴＴＣＧＡＴＡＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＴＣＡＧＧＣＡＣＧＴＧＡＡＡＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＴＧＣＡＣＴＧＧＡＡＡＡＴＡＧＣＣＣＧＡＧＣＧＴＴＣＡＧＧＣＡＡＣＣＡＴＧＴＴＴＡＡＴＡＴＧＧＣＧＡＣＣＣＡＧＡＴＴＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＣＧＴＧＴＡＧＣＧＴＴＴＡＴＡＧＣＧＴＴＡＧＣＴＡＴＧＣＡＣＴＧＣＣＧＡＡＣＡＡＡＣＡＣＴＡＴＴＴＴＣＴＧＡＴＴＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧＧＧＣＣＴＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＴＴＴＡＴＣＣＧＡＧＴＣＣＧＣＡＴＣＣＧＡＡＴＧＧＴＣＴＧＡＴＴＡＡＡＴＧＴＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＧＴＡＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＴＧＴＡＡ－３'（配列番号１５５）；
５'－ＡＴＧＡＧＣＡＣＣＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＡＴＧＧＴＡＡＡＧＡＴＡＡＴＧＴＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＴＴＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＣＣＴＧＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＴＡＴＡＣＣＧＡＡＧＣＡＧＡＴＡＡＴＡＧＣＡＧＣＡＴＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＧＡＴＡＣＣＧＴＧＡＡＡＡＡＴＡＣＣＡＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＣＣＧＡＡＡＴＴＴＧＧＣＣＧＡＴＴＧＡＡＣＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡＣＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＴＴＴＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＴＡＴＴＣＴＣＡＴＧＴＴＡＧＣＧＧＴＧＴＧＡＧＣＧＴＴＡＡＡＡＴＴＧＴＴＣＡＧＧＡＴＣＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＡＴＡＴＧＣＣＧＴＴＧＡＴＧＧＴＡＡＡＣＣＧＣＡＴＧＡＴＣＡＣＡＧＣＴＴＴＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＡＡＡＡＣＧＴＡＴＣＡＣＣＧＡＣＣＴＧＴＡＴＴＡＣＡＡＡＣＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＴＴＡＴＡＡＡＣＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＴＧＴＴＴＴＡＴＧＧＴＴＡＴＡＡＣＡＡＡＴＧＣＧＡＴＴＴＣＡＣＡＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＴＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧＣＡＡＣＣＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＡＴＡＡＴＡＡＧＡＡＡＡＴＴＧＧＴＡＧＣＧＴＧＴＡＧＧＡＴＡＴＴＧＣＣＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＡＡＡＧＧＣＡＴＣＴＴＣＧＡＴＡＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＴＣＡＧＧＣＡＣＧＴＧＡＡＡＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＴＧＣＡＣＴＧＧＡＡＡＡＴＡＧＣＣＣＧＡＧＣＧＴＴＣＡＧＧＣＡＡＣＣＡＴＧＴＴＴＡＡＴＡＴＧＧＣＧＡＣＣＣＡＧＡＴＴＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＣＧＴＧＴＡＧＣＧＴＴＴＡＴＡＧＣＧＴＴＡＧＣＴＡＴＧＣＡＣＴＧＣＣＧＡＡＣＡＡＡＣＡＣＴＡＴＴＴＴＣＴＧＡＴＴＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧＧＧＣＣＴＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＴＴＴＡＴＣＣＧＡＧＴＣＣＧＣＡＴＣＣＧＡＡＴＧＧＴＣＴＧＡＴＴＡＡＡＴＧＴＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＧＴＡＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＴＧＴＡＡ－３'（配列番号１５６）；
５'－ＡＴＧＡＧＣＡＣＣＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＡＴＧＧＴＡＡＡＧＡＴＡＡＴＧＴＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＴＴＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＣＣＴＧＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＴＡＴＡＣＣＧＡＡＧＣＡＧＡＴＡＡＴＡＧＣＡＧＣＡＴＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＧＡＴＡＣＣＧＴＧＡＡＡＡＡＴＡＣＣＡＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＣＣＧＡＡＡＴＴＴＧＧＣＣＧＡＴＴＧＡＡＣＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡＣＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＴＴＴＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＴＡＴＴＣＴＣＡＴＧＴＴＡＧＣＧＧＴＧＴＧＡＧＣＧＴＴＡＡＡＡＴＴＧＴＴＣＡＧＧＡＴＣＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＡＴＡＴＧＣＣＧＴＴＧＡＴＧＧＴＡＡＡＣＣＧＣＡＴＧＡＴＣＡＣＡＧＣＴＴＴＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＡＡＡＡＣＧＴＡＴＣＡＣＣＧＡＣＣＴＧＴＡＴＴＡＣＡＡＡＣＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＴＴＡＴＡＡＡＣＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＴＧＴＴＴＴＡＴＧＧＴＴＡＴＡＡＣＡＡＡＴＧＣＧＡＴＴＴＣＡＣＡＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＴＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧＣＡＡＣＣＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＡＴＡＡＴＡＡＧＡＡＡＡＴＴＧＧＴＡＧＣＧＴＧＴＡＣＧＡＴＡＴＴＧＣＣＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＡＡＡＧＧＣＡＴＣＴＴＣＧＡＴＡＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＴＣＡＧＧＣＡＣＧＴＧＡＡＡＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＴＧＣＡＣＴＧＧＡＡＡＡＴＡＧＣＣＣＧＡＧＣＧＴＴＣＡＧＧＣＡＡＣＣＡＴＧＴＴＴＡＡＴＡＴＧＧＣＧＡＣＣＣＡＧＡＴＴＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＣＧＴＧＴＡＧＣＧＴＴＴＡＴＡＧＣＧＴＴＡＧＣＴＡＴＧＣＡＣＴＧＣＣＧＡＡＣＡＡＡＣＡＣＴＡＴＴＴＴＣＴＧＡＴＴＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＡＧＡＡＧＧＧＣＣＴＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＴＴＴＡＴＣＣＧＡＧＴＣＣＧＣＡＴＣＣＧＡＡＴＧＧＴＣＴＧＡＴＴＡＡＡＴＧＴＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＧＴＡＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＴＧＴＡＡ－３'配列番号１５７）；
５'－ＡＴＧＡＣＣＧＣＡＡＣＣＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＧＴＣＡＧＡＡＴＣＡＧＴＡＴＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＡＡＧＴＴＣＧＴＣＴＧＧＴＴＡＡＡＧＴＴＡＣＣＣＧＴＡＡＴＡＣＣＧＣＡＣＧＴＣＡＴＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＡＡＴＧＴＴＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＡＴＡＣＣＧＣＡＧＧＣＧＡＴＡＡＴＧＣＡＣＡＴＧＴＴＧＴＴＧＣＡＡＣＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＣＡＣＣＧＴＴＴＡＴＧＣＡＴＴＴＧＣＣＣＧＴＧＡＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＡＣＣＡＣＣＧＡＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＧＴＡＡＡＣＡＴＴＴＣＡＣＣＧＡＡＧＧＴＴＴＴＧＡＴＴＧＧＧＴＴＡＣＣＧＧＴＧＧＴＣＧＴＴＧＧＧＣＡＧＣＡＣＡＧＣＡＧＴＴＴＴＴＣＴＧＧＧＡＴＣＧＴＡＴＴＴＡＧＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＴＧＣＣＴＴＴＡＧＣＣＧＣＡＡＴＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣＧＴＡＣＣＧＣＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＡＧＣＧＧＴＡＧＣＧＡＡＣＡＧＧＣＡＡＴＴＧＴＴＧＣＡＧＧＴＡＴＴＧＡＡＧＧＴＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＧＴＡＧＣＧＡＧＴＴＴＣＡＴＧＧＴＴＴＴＣＣＧＣＧＴＧＡＴＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＡＴＣＧＴＡＴＴＣＴＧＧＣＡＡＣＣＧＡＴＧＴＴＡＧＣＧＣＡＣＧＴＴＧＧＣＧＴＴＡＴＡＡＴＡＣＣＧＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＡＴＧＣＡＡＧＣＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＡＴＡＧＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＧＴＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＣＧＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＡＡＡＣＣＣＡＴＣＣＧＧＡＡＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＴＣＡＡＡＡＴＧＡＧＣＣＴＧＣＣＧＡＡＣＡＡＡＣＡＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＣＧＴＴＴＧＧＴＣＡＧＧＡＴＡＡＴＣＣＧＡＡＴＧＡＡＧＴＧＴＴＴＴＡＴＧＣＡＧＣＡＧＡＴＣＧＴＣＣＧＴＡＴＧＧＴＣＴＧＡＴＴＧＡＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＡＧＣＣＧＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣＣＧＡＴＴＴＧＧＡＧＴＡＡＴＡＴＴＧＣＡＧＧＴＴＴＴＴＧＣＴＡＡ－３'（配列番号１５８）；
５'－ＡＴＧＡＣＣＧＣＡＡＣＣＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＧＴＣＡＧＡＡＴＣＡＧＴＡＴＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＡＡＧＴＴＣＧＴＣＴＧＧＴＴＡＡＡＧＴＴＡＣＣＣＧＴＡＡＴＡＣＣＧＣＡＣＧＴＣＡＴＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＡＡＴＧＴＴＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＡＴＡＣＣＧＣＡＧＧＣＧＡＴＡＡＴＧＣＡＣＡＴＧＴＴＧＴＴＧＣＡＡＣＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＣＡＣＣＧＴＴＴＡＴＧＣＡＴＴＴＧＣＣＣＧＴＧＡＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＡＣＣＡＣＣＧＡＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＧＴＡＡＡＣＡＴＴＴＣＡＣＣＧＡＡＧＧＴＴＴＴＧＡＴＴＧＧＧＴＴＡＣＣＧＧＴＧＧＴＣＧＴＴＧＧＧＣＡＧＣＡＣＡＧＣＡＧＴＴＴＴＴＣＴＧＧＧＡＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＴＧＣＣＴＴＴＡＧＣＣＧＣＡＡＴＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣＧＴＡＣＣＧＣＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＡＧＣＧＧＴＴＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＡＡＴＴＧＴＴＧＣＡＧＧＴＡＴＴＧＡＡＧＧＴＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＧＴＡＧＣＧＡＧＴＴＴＣＡＴＧＧＴＴＴＴＣＣＧＣＧＴＧＡＴＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＡＴＣＧＴＡＴＴＣＴＧＧＣＡＡＣＣＧＡＴＧＴＴＡＧＣＧＣＡＣＧＴＴＧＧＣＧＴＴＡＴＡＡＴＡＣＣＧＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＡＴＧＣＡＡＧＣＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＡＴＡＧＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＧＴＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＣＧＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＡＡＡＣＣＣＡＴＣＣＧＧＡＡＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＴＣＡＡＡＡＴＧＡＧＣＣＴＧＣＣＧＡＡＣＡＡＡＣＡＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＣＧＴＴＴＧＧＴＣＡＧＧＡＴＡＡＴＣＣＧＡＡＴＧＡＡＧＴＧＴＴＴＴＡＴＧＣＡＧＣＡＧＡＴＣＧＴＣＣＧＴＡＴＧＧＴＣＴＧＡＴＴＧＡＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＡＧＣＣＧＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣＣＧＡＴＴＴＧＧＡＧＴＡＡＴＡＴＴＧＣＡＧＧＴＴＴＴＴＧＣＴＡＡ－３'（配列番号１５９）；および
５'－ＡＴＧＡＣＣＧＣＡＡＣＣＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＧＴＣＡＧＡＡＴＣＡＧＴＡＴＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＡＡＧＴＴＣＧＴＣＴＧＧＴＴＡＡＡＧＴＴＡＣＣＣＧＴＡＡＴＡＣＣＧＣＡＣＧＴＣＡＴＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＡＡＴＧＴＴＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＡＴＡＣＣＧＣＡＧＧＣＧＡＴＡＡＴＧＣＡＣＡＴＧＴＴＧＴＴＧＣＡＡＣＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＣＡＣＣＧＴＴＴＡＴＧＣＡＴＴＴＧＣＣＣＧＴＧＡＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＡＣＣＡＣＣＧＡＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＧＴＡＡＡＣＡＴＴＴＣＡＣＣＧＡＡＧＧＴＴＴＴＧＡＴＴＧＧＧＴＴＡＣＣＧＧＴＧＧＴＣＧＴＴＧＧＧＣＡＧＣＡＣＡＧＣＡＧＴＴＴＴＴＣＴＧＧＧＡＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＴＧＣＣＴＴＴＡＧＣＣＧＣＡＡＴＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣＧＴＡＣＣＧＣＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＡＧＣＧＧＴＡＧＣＧＡＡＣＡＧＧＣＡＡＴＴＧＴＴＧＣＡＧＧＴＡＴＴＧＡＡＧＧＴＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＴＧＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＧＴＡＧＣＧＡＧＴＴＴＣＡＴＧＧＴＴＴＴＣＣＧＣＧＴＧＡＴＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＡＴＣＧＴＡＴＴＣＴＧＧＣＡＡＣＣＧＡＴＧＴＴＡＧＣＧＣＡＣＧＴＴＧＧＣＧＴＴＡＴＡＡＴＡＣＣＧＴＴＴＡＧＧＴＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＡＴＧＣＡＡＧＣＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＡＴＡＧＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＧＴＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＣＧＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＡＡＡＣＣＣＡＴＣＣＧＧＡＡＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＴＣＡＡＡＡＴＧＡＧＣＣＴＧＣＣＧＡＡＣＡＡＡＣＡＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＣＧＴＴＴＧＧＴＣＡＧＧＡＴＡＡＴＣＣＧＡＡＴＧＡＡＧＴＧＴＴＴＴＡＴＧＣＡＧＣＡＧＡＴＣＧＴＣＣＧＴＡＴＧＧＴＣＴＧＡＴＴＧＡＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＡＧＣＣＧＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣＣＧＡＴＴＴＧＧＡＧＴＡＡＴＡＴＴＧＣＡＧＧＴＴＴＴＴＧＣＴＡＡ－３'（配列番号１６０）。
尿酸酸化酵素変異体の製造方法
実施例６１：尿酸酸化酵素変異体の製造方法
尿酸酸化酵素変異体の製造方法は、
直交的ｔＲＮＡ／合成酵素ペアを発現させることができるベクターおよび尿酸酸化酵素変異体発現ベクターを含む細胞株を用意することと、
前記細胞株をテトラジン官能基および／またはトリアジン官能基を含む一種類以上の非天然アミノ酸が含まれた培地で培養することと、含み、
前記直交的ｔＲＮＡ／合成酵素ペアを発現させることができるベクターは、外来由来サプレッサーｔＲＮＡおよび外来由来ｔＲＮＡ合成酵素を発現させることができるものであり、
前記外来由来サプレッサーｔＲＮＡは、特定の終結コドンを認識できるものであり、
前記外来由来ｔＲＮＡ合成酵素は、テトラジン官能基および／またはトリアジン官能基を含む非天然アミノ酸を認識して前記外来由来サプレッサーｔＲＮＡに連結することができるものであり、
前記尿酸酸化酵素変異体発現ベクターは、実施例４４～５８のいずれか１つの尿酸酸化酵素変異体を発現させることができるものであり、前記尿酸酸化酵素変異体内に含まれる非天然アミノ酸に対応する位置が前記特定の終結コドンでコードされたことを特徴とする。
実施例６２：終結コドンの限定
実施例６１において、前記特定の終結コドンは、アンバーコドン（ａｍｂｂｅｒ ｃｏｄｏｎ；５'－ＵＡＧ－３'）、オーカーコドン（ｏｃｈｅｒ ｃｏｄｏｎ；５'－ＵＡＡ－３'）、およびオパールコドン（ｏｐａｌ ｃｏｄｏｎ；５'－ＵＧＡ－３'）から選択されることを特徴とする方法。
実施例６３：細胞株の変異
実施例６２において、前記細胞株は、前記特定の終結コドンを認識する終結因子が不活性化された細胞株であることを特徴とする方法。
実施例６４：細胞株の限定
実施例６３において、前記細胞株は、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｃ３２１．ΔＡ．ｅｘｐ（Ａｄｄｇｅｎｅ，ＩＤ：４９０１８）であることを特徴とする方法。
実施例６５：直交的ｔＲＮＡ／合成酵素ペアの限定
実施例６１において、前記直交的ｔＲＮＡ／合成酵素ペアは、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のサプレッサーｔＲＮＡ（ＭｊｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ）と、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のｔｙｒｏｓｙｌ－ｔＲＮＡ合成酵素（ＭｊＴｙｒＲＳ）であることを特徴とする方法。
実施例６６：直交的ｔＲＮＡ／合成酵素ペアを発現するベクターの限定
実施例６５において、前記直交的ｔＲＮＡ／合成酵素ペアを発現できるベクターは、Ｙａｎｇ ｅｔ．ａｌ（Ｔｅｍｐｏｒａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｔｅｔｒａｚｉｎｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎｖｅｒｓｅ－Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０２０，２４５６－２４６４）に開示されているｐＤｕｌｅ＿Ｃ１１であることを特徴とする方法。
実施例６７：尿酸酸化酵素変異体配列の限定
実施例６１において、前記尿酸酸化酵素変異体発現ベクターは、実施例５１、実施例５４、実施例５７のうちのいずれか１つの尿酸酸化酵素変異体を発現させることができるものであり、前記尿酸酸化酵素変異体配列に含まれる非天然アミノ酸が前記特定の終結コドンでコードされることを特徴とする方法。
（発明の実施のための形態）
以下、実験例および実施例を通じて本明細書が提供する発明についてより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本明細書によって開示される内容を例示するためのものであり、本明細書によって開示される内容の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業者にとって自明であろう。
（実験例１ 尿酸酸化酵素変異体の取得）
実験例１．１ 尿酸酸化酵素変異体発現のためのベクター作製
アスペルギルス・フラバス由来のＵｏｘをコードする遺伝子を鋳型として、ｐＴＡＣ＿Ｕｏｘプラスミドを作製した。ＴＡＣ ｐｒｏｍｏｔｅｒを適用するために、ｐＴＡＣ－ＭＡＴ－ＴＡＧ－１発現ベクター（Ｓｉｇｍａ，Ｅ５５３０）の配列情報を参照し、既存のｐＱＥ８０ベクターよりも拡張されたＲＢＳ（リボソーム結合部位：Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）配列である５'－ＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡ－３'（配列番号１５１）を適用した。ｐＴＡＣ ｖｅｃｔｏｒの再組換えタンパク質発現のために、転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）調節、ｒｒｎＢｔ１およびｒｒｎＢｔ２ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ配列を適用した。
ＴＡＣ ｐｒｏｍｏｔｅｒからｒｒｎｂＴ１－ｒｒｎｂＴ２ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ配列は、（株）マクロゲンに依頼してＤＮＡ合成を進め、ｐＱＥ８０Ｌ ｖｅｃｔｏｒにクローニングを行ってｐＴＡＣ－ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒを作製した。ｐＴＡＣ－ｅｍｐｔｙのクローニングはインフュージョンクローニング（ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ）を介して行われ、ＩｎｆｕｓｉｏｎR ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｋｏｒｅａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を利用してクローニングを完了した。作製されたｐＴＡＣ－ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒはシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）分析を依頼して配列検証を完了した。
ベクター作製に使用した各配列を以下の表１に示す。
[表１]
アスペルギルス・フラバス由来のＵｏｘをコードする遺伝子を鋳型として増幅するために、既存のクローニングしたｐＱＥ８０－Ｕｏｘ－Ｗ１７４ａｍｂ ｖｅｃｔｏｒでＰＣＲ増幅して作製したｐＴＡＣ－ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒにインフュージョンクローニングを行った。インフュージョン反応は、５０ｎｇのベクターに２２ｎｇのインサート（Ｕｏｘ＿Ｗ１７４ａｍｂ）で反映し、５０℃条件で１５分間反応後、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＤＨ５ａに形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）した。その後、シングルコロニーをピックアップして４ｍＬのＬＢブロス培地（ＬＢ ｂｒｏｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）へ接種（ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）してミニプレップ（ｍｉｎｉ－ｐｒｅｐ）を行った。ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素消化（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を行って、クローニングインサート遺伝子配列であるＵｏｘ－Ｗ１７４ａｍｂのバンド（ｂａｎｄ）（９５３ｂｐ）を確認した（図４）。クローニングが完了したｐＴＡＣ－Ｕｏｘ－Ｗ１７４ａｍｂは、シークエンシング依頼して結果をＮＣＢＩのＢＬＡＳＴプログラムを利用してクローニング結果を確認した（図５）。
実験例１．２ 尿酸酸化酵素変異体の発現および精製
Ｕｏｘで１７４番目の位置は、構造的／機能的役割を果たしないと以前に報告されているため（Ｌｉｍ、２０１５）、ＨＳＡ結合時にも酵素活性を維持するための摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）はほとんどまたは全くないと予想された。そこで、ＨＳＡとＵｏｘとの結合のために、四量体で構成されたＵｏｘで１量体当たり１つの反応性位置を選定し、合計４つの反応性位置を有するようにした。具体的には、Ｕｏｘは、１量体が４つでオリゴマー化（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）される四量体タンパク質であるが、１量体に１つの導入部位が入ると、結果的に四量体にオリゴマー化されて４つの反応性位置を有する。
具体的には、Ｕｏｘ－ｆｒＴｅｔを発現させるため、実験例１．１で作製したｐＤｕｌｅ＿Ｃ１１およびｐＴＡＣ＿Ｕｏｘ－１７４Ａｍｂプラスミドを利用してＣ３２１ｄｅｌＡｅｘｐ大腸菌宿主細胞を共同形質転換させた後（Ｃ３２１ｄｅｌＡ．ｅｘｐ[ｐＤｕｌｅ＿Ｃ１１][ｐＴＡＣ＿Ｕｏｘ－１７４Ａｍｂ]）、これを２ｘＹＴ培地で培養した。Ｕｏｘ－ｆｒＴｅｔの発現は、１～３ｍＭ ｆｒＴｅｔおよびテトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（３５μｇ／ｍＬ）を添加したプロトコルを用いて行った。その後、ＩＰＴＧを添加してＵｏｘ－ｆｒＴｅｔの発現を促進し、発現誘導時間ごとにＵｏｘ－ｆｒＴｅｔ発現の有無を確認した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果、分子量が約３４ｋＤａであるタンパク質バンドが存在することが判明し、誘導時間ごとにタンパク質バンドがますます強くなる傾向を確認し、これはモノマーＵｏｘ（３４ｋＤａ）の予想分子量と一致する。以上の結果によって、Ｕｏｘ－ｆｒＴｅｔの発現を確認した。（図６）
Ｕｏｘ－ｆｒＴｅｔを分離精製のために、得られた菌体をバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ９．０）と１：５（ｗ／ｗ％）の割合で混合し、超音波粉砕機を利用して細胞破砕を行った。細胞破砕後、菌体残渣を除去するために、９，５００ｒｐｍ、４０分間遠心分離して上清を回収した。
回収した上清を０．４５μｍ濾過した後、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｃｙｔｉｖａ，ＭＡ，ＵＳＡ）カラムで平衡化バッファー２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ９．０を用い、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）の溶出バッファーを用いて１次分離精製を行った（図７および図８）。
１次精製画分を統合し、フェニルファストフロー（Ｃｙｔｉｖａ，ＭＡ，ＵＳＡ）カラムで平衡化バッファー２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ９．０＋１Ｍ Ａｍｍｏｍｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅを用い、溶出バッファー２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ９．０を用いて２次分離精製を行った（図９および図１０）。
２次精製画分を統合して分析した結果、高純度のＵｏｘ－ｆｒＴｅｔが得られ、クーマシーブルー染色タンパク質ゲルで精製後、溶離レーン（ｅｌｕｔｉｏｎ ｌａｎｅ）は分子量が約３４ｋＤａである単一バンドが存在することが示され、また、市販されている尿酸酸化酵素であるＦＡＳＴＵＲＴＥＣ（Ｒａｓｂｕｒｉｃａｓｅ，ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ）とＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析した結果、一致する分子量バンドを確認した（図１１）。
実験例１．３ 尿酸酸化酵素変異体の純度の確認
Ｕｏｘ－ｆｒＴｅｔの純度を確認するために、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を利用して分析した。分析カラムにはＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ）を使用し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）＋０．３Ｍ ＮａＣｌの移動相を用いて２２０ｎｍのＵＶにおいて０．６ ｍＬ／ｍｉｎ速度で分析した。
その結果、２次精製したＵｏｘ－ｆｒＴｅｔが１４．７分で主要ピークとして検出され、純度が９９％以上と観察された。Ｕｏｘ－ｆｒＴｅｔが高純度に精製されたことを確認した（図１２）。
実験例１．４ 尿酸酸化酵素変異体内へのｆｒＴｅｔ導入の確認
蛍光標識染料結合を利用して遺伝的にコードされたｆｒＴｅｔがＩＥＤＤＡ反応性を示すかどうかを調査した。具体的には、蛍光レーベリング分析のために、精製されたＵｏｘ－ＷＴとＵｏｘ－ｆｒＴｅｔを室温で２時間、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１：２のモル比でＴＣＯ（Ｔｒａｎｓ－Ｃｙｃｌｏｏｃｔ－２－ｅｎｅ）－Ｃｙ３染料と反応させた。反応混合物はＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。ゲルの蛍光強度は、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋システム（３０２ｎｍ、フィルター５１０／６１０ｎｍで照明；Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて検出し、次にＩｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて分析した。ＴＣＯ－Ｃｙ３を含むまたは含まないＵｏｘ－ＷＴサンプルを、ＩＥＤＤＡ反応性を確認するための対照群として使用した。
蛍光レーベリング分析後、タンパク質を視覚化するためにクーマシーブルー染色を行った。タンパク質ゲルを、クーマシーブリリアントブルーＲ－２５０（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ－２５０）染料を用いて染色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋システム（白色照明）を用いてバンドを検出した。
その結果、ＴＣＯ－Ｃｙ３と共に培養されたＵｏｘ－ｆｒＴｅｔでバンドが確認され、ＴＣＯ－Ｃｙ３との培養の有無に関わらず、クーマシーブルー染色後、全てのＵｏｘ変異体において単一タンパク質バンドが確認された。このような結果は、Ｕｏｘに導入されたｆｒＴｅｔがＩＥＤＤＡ反応性を表すことを示している（図１３）。
（実験例２ 尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の取得）
Ｕｏｘ－ＨＳＡ製造のために、ＨＳＡとＴＣＯ－マレイミドリンカーを１：４（ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏ）の割合で４時間、常温で結合させた。未反応ＴＣＯ－ＭＡＬリンカーを除去するために、反応混合物をＨｉＰｒｅｐ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラムを使用してＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で除去および脱塩させた。その後、ＨＳＡ－ＴＣＯとＵｏｘ－ｆｒＴｅｔを５：１（ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏ）の割合で１５時間、常温で反応させた。反応が終わった試料を０．４５μｍ濾過した後、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）でバッファー交換し、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｃｙｔｉｖａ，ＭＡ．ＵＳＡ）に注入し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）＋１Ｍ ＮａＣｌの溶出バッファーを用いて１次分離精製を行った。１次精製画分を集めて２０ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．５でバッファー交換し、Ｑ ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに注入し、２０ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．５＋１Ｍ ＮａＣｌの溶出バッファーを用いて２次分離精製を行った。２次精製完了した試料をクーマシーブルー染色タンパク質ゲルで分析した結果、分子量が約１０１ｋＤａである主要バンドが存在することが示され、これはモノマーＵｏｘ－ＨＳＡ（１０１ｋＤａ）の予想分子量と一致した（図１４）。２次精製画分を集めてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ（Ｃｙｔｉｖａ，ＭＡ，ＵＳＡ）カラムで３次分離精製を行った。３次精製画分を統合して分析した結果、高純度のＵｏｘ－ＨＳＡが得られたことを確認した。また、ＳＥＣ－ＨＰＬＣで分析した結果、純度１００％の単一ピークを確認した（図１５）。これにより、高純度の尿酸酸化酵素－アルブミン結合体（Ｕｏｘ－ＨＳＡ）が得られた。
（実験例３ 尿酸酸化酵素－アルブミン結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性分析）
Ｕｏｘ－ｆｒＴｅｔおよびＵｏｘ－ＨＳＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性を評価するために、試料を１０ｎＭ濃度に希釈し、１１１．１ｕＭ Ｕｒｉｃ ａｃｉｄと１：９（ｖ／ｖ％）割合で混合してマイクロプレートに入れ、吸光度２９３ｎｍで１５秒間隔で１０分間測定した。Ｕｏｘ－ｆｒＴｅｔおよびＵｏｘ－ＨＳＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性測定結果、ｕｒｉｃ ａｃｉｄが減少する傾向を示し、その傾きを測定し、下記式を利用して活性を評価した。
その結果、Ｕｏｘ－ｆｒＴｅｔの単位用量当たりの活性は０．０７２Ｕ／ｍＬで現れ、Ｕｏｘ－ＨＳＡの単位用量当たりの活性は０．０６７Ｕ／ｍＬで現れた。これは、Ｕｏｘ－ｆｒＴｅｔにアルブミンが４つ結合しても酵素活性の減少に大きな影響を与えないことが確認できた。また、Ｕｏｘ－ｆｒＴｅｔのｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙは５３Ｕ／ｍｇの活性を示し、Ｕｏｘ－ＨＳＡのｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙは１６．６Ｕ／ｍｇの活性を示した。
（実験例４ 尿酸酸化酵素－アルブミン結合体に対する薬動力学的（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ；ＰＫ）評価）
Ｕｏｘ－ＨＳＡの半減期評価のために、ＩＣＲマウス（ｎ＝５）を利用してＰＫ分析を行った。Ｕｏｘ－ＨＳＡは、投与方法ＩＶ（静脈投与）、ＩＰ（腹腔投与）、ＩＭ（筋肉投与）による半減期を確認した。対照群として、野生型尿酸酸化酵素であるＦａｓｔｕｒｔｅｃを利用して比較した。投与用量はＵｏｘ－ＨＳＡ（６．０ｍｇ／ｋｇ、１４．６ｎｍｏｌ／ｋｇ、ＩＶ、ＩＰ、ＩＭ）、Ｆａｓｔｕｒｔｅｃ（２．０ｍｇ／ｋｇ、１４．６ｎｍｏｌ／ｋｇ、ＩＶ）で投与した。
その結果、投与経路ごとの曲線下の面積（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ；ＡＵＣ）は、ＩＶ（４，４７１ｍＵ／ｍＬ×ｈ）、ＩＰ（４，１８０ｍＵ／ｍＬ×ｈ）、ＩＭ（２，８７９ｍＵ／ｍＬ×ｈ）の順でＩＶ投与経路において最も高く評価され、Ｕｏｘ－ＷＴは４７６ｍＵ／ｍＬ×ｈと大きく下回った。また、Ｕｏｘ－ＨＳＡの半減期は、ＩＶ ２６．２２時間、ＩＰ ２８．２時間、ＩＭ ２１．６１時間で現れ、Ｆａｓｔｕｒｔｅｃの半減期はＩＶ １．８６時間で現れた。すなわち、ＩＶ投与を基準として、Ｕｏｘ－ＨＳＡは、Ｆａｓｔｕｒｔｅｃに比べて半減期が約１４倍向上することが確認された（図１６～図１７）。
（実験例５ 高尿酸血症動物モデルを用いた尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の血中尿酸減少効果）
尿酸前駆体物質であるヒポキサンチン（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ、５００ｍｇ／ｋｇ）と尿酸酸化酵素阻害剤であるオキソン酸カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｏｘｏｎａｔｅ、２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて高尿酸血症動物モデル（Ｗｉｎｓｔｅｒ－ＳＤ ｒａｔ）を作製した。そして、この動物モデルに前記製造したＵｏｘ－ＨＳＡ薬物を処理して血中尿酸数値を確認する薬力学評価試験を行った。
高尿酸血症の誘導は、試験薬物投与前に２回誘導を行い、試験薬物投与後各２４時間、４８時間後に２回再誘導した。各観察時点で血中尿酸減少効果および持続性などを確認した。投与用量は、Ｕｏｘ－ＨＳＡ １．０ｍｇ／ｋｇ（２．４ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｕｏｘ－ＨＳＡ ４．０ｍｇ／ｋｇ（９．８ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｕｏｘ－ＨＳＡ １０ｍｇ／ｋｇ（２４．６ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｆａｓｔｕｒｔｅｃ（Ｒａｓｂｕｒｉｃａｓｅ） １．３３ｍｇ／ｋｇ（９．８ｎｍｏｌ／ｋｇ）を静脈内投与し、Ｆｅｂｕｘｏｓｔａｔ（１０ｍｇ／ｋｇ、陽性対照群）を経口投与した。その結果、高尿酸誘発後の初期血中尿酸数値は陰性対照群（Ｈｙｐｅｒｕｒｉｃｅｍｉａ，ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）において１２ｍｇ／ｄＬで高尿酸血症がラットで正常に誘導されることを確認した。薬物投与後の３０分後に尿酸数値が全ての薬物投与群において正常数値（６ｍｇ／ｄＬ）以下に減少することを確認し、この数値は１２時間まで持続した。
薬物の持続性を確認するために２次誘導（薬物投与後の２４時間）した。その結果、Ｕｏｘ－ＨＳＡ投与群では血中尿酸数値が低く維持されるが、Ｕｏｘ－ＷＴと陽性対照群Ｆｅｂｕｘｏｓｔａｔを投与した群では尿酸数値が上昇することを示している。
薬物投与後の４８時間で３次誘導した結果、Ｕｏｘ－ＨＳＡ投与群で血中尿酸減少効果を示した。これは、Ｕｏｘ－ＨＳＡが高尿酸血症動物モデルにおいて持続的に血中尿酸を減少させることを確認した（図１８～図１９）。
（実験例６ Ｈｕｍａｎ ＦｃＲｎ（＋／＋） ＴＧマウスを利用した薬動力学的評価（ＰＫプロファイル））
Ｕｏｘ－ＨＳＡは、人体由来アルブミンが結合している薬物であるが、マウスＦｃＲｎに対する結合能が低下することで半減期の向上が大きくない。したがって、ｈｕｍａｎ ＦｃＲｎがトランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）されたマウスを利用する場合、人体由来アルブミンによるＦｃＲｎ再循環効果が期待できる。これを評価するために、Ｔｇ３２ Ａｌｂ－／－（ｈｕｍａｎ ＦｃＲｎ＋／＋）マウス（ｎ＝４）（ＪＡＸ＃０２５２０１，Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を利用して前記製造したＵｏｘ－ＨＳＡの半減期を評価した。４つのアルブミンを結合したＵｏｘ－ＨＳＡ（ｔｅｔｒａ－ＨＳＡ）は６．０ｍｇ／ｋｇの用量でＩＶ単回投与し、２つのアルブミンを結合したＵｏｘ－ＨＳＡ（ｄｉ－ＨＳＡ）は５．０ｍｇ／ｋｇの用量でＩＶ単回投与し、０．５時間、１日、４日、７日に血液を採取して血液中のＵｒｉｃａｓｅの活性を確認した。その結果、４つのアルブミンを結合したＵｏｘ－ＨＳＡ（ｔｅｔｒａ－ＨＳＡ）の場合、６０．３時間の半減期を示した。これは、ＩＣＲマウスで確認すると半減期は２．３倍増加し、ＡＵＣは４．２倍増加した。また、２つのアルブミンを結合したＵｏｘ－ＨＳＡ（ｄｉ－ＨＳＡ）の場合、３２．４時間の半減期を示した。アルブミン数により半減期に大きな差があることが確認された。特に、ｈｕｍａｎ ＦｃＲｎ ＴＧマウスの結果を見ると、Ｕｏｘ－ＨＳＡ（ｔｅｔｒａ－ＨＳＡ）を人体に投与する際に、半減期はさらに増加すると予想される。
（実験例７ ヒト由来ＰＢＭＣに基づくｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫原性の分析）
生体医薬品の免疫原性の早期予測は、生体医薬品の開発の成功の可否を決定する必須の要素にもかかわらず、ヒトと実験動物の免疫系の差により臨床試験前の生体医薬品の免疫原性を信頼性よく予測できる実験動物モデルがない。したがって、ヒトＰＢＭＣを用いた免疫原性分析技術を用いて免疫原性分析を行った。本実験により、臨床試験前のＵｏｘ－ＨＳＡの免疫原性に対する信頼性の高い評価を得ることができる。
現在まで最も信頼性が高いと知られているヒト単核細胞から樹状細胞に分化を誘導した後、Ｕｏｘ－ＨＳＡによって誘導された免疫細胞の反応度（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を測定した。ＣＤ４＋Ｔ細胞活性度分析の結果、Ｕｏｘ－ＨＳＡ（６ｕｇ／ｍｌ）とＦａｓｔｕｒｔｅｃ（２ｕｇ／ｍｌ）は、いずれもＳＩ値が２以下で、以下のＨＬＡ ｔｙｐｅでは免疫原性を示さないという結果を得た。相対的な比較では、Ｆａｓｔｕｒｔｅｃ（２ｕｇ／ｍｌ）がＵｏｘ－ＨＳＡ（６ｕｇ／ｍｌ）よりもわずかに高いＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌ活性度を示したが、統計的に留意した結果ではなかった。ＣＤ８＋Ｔ細胞活性度分析の結果、Ｕｏｘ－ＨＳＡ（６ｕｇ／ｍｌ）とＦａｓｔｕｒｔｅｃ（２ｕｇ／ｍｌ）は、いずれもＳＩ値が２以下で、以下のＨＬＡ ｔｙｐｅでは免疫原性を示さないという結果を得た。その結果、人体由来アルブミンが結合することによってオリジナル薬物に対する免疫原性が低いと分析された。
（実験例８ 尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造）
実験例８．１ 尿酸酸化酵素変異体発現のためのベクター作製
実験例１．１に開示されている方法で尿酸酸化酵素変異体発現のためのベクターを作製する。ここで、発現対象となる尿酸酸化酵素変異体のベクター配列は、配列番号１５２～１６０から選択される１つ以上の配列を含む。
実験例８．２ 尿酸酸化酵素変異体の発現および精製
実験例１．２に開示されている方法で、実験例６．１の尿酸酸化酵素変異体発現のためのベクターを用いて、尿酸酸化酵素変異体を発現し、これを精製する。
実験例８．３ 尿酸酸化酵素変異体の取得および確認
実験例１．３～１．４に開示されている方法で、実験例８．２で得られた尿酸酸化酵素変異体の純度および尿酸酸化酵素変異体内に非天然アミノ酸がよく導入されたか否かを確認する。
実験例８．４ リンカーの製造
前記尿酸酸化酵素変異体およびアルブミンを結合するためのリンカーは、上記に開始した構造を有するものであれば制限されず、通常の技術者が公知の方法を用いて適切に製造したり、および／または製造されたものを購入して使用することができる。
前記尿酸酸化酵素変異体と反応するＩＥＤＤＡ反応基としてｔｒａｎｃ－シクロオクテン（ＴＣＯ）を、アルブミンと反応するチオール反応性基として３-アリルプロピロニトリル（ＡＰＮ）を含むリンカーを使用する場合、以下の方法に従って製造して使用する。
１）ＴＣＯ－ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ（例えば、ＣＯＮＪＵ－ＰＲＯＢＥ社購入）およびＡＰＮ－ａｍｉｎｅ（例えば、ＣＯＮＪＵ－ＰＲＯＢＥ社購入）を１：１モル比でＤｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）溶媒下、常温で反応させる。
２）前記反応物を、シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーにより分離精製する。このとき、分離精製度は９５％以上とする。
実験例８．５ 尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の取得
実験例８．２で得られた尿酸酸化酵素変異体および実験例８．４で得られたリンカーを用いて、実験例２に開示されている方法により尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を得る。
実験例８．６ 尿酸酸化酵素－アルブミン結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性の分析
実験例８．５で得られた尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を用いて、実験例３に開示されている方法により尿酸酸化酵素－アルブミン結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性を分析する。
実験例８．７ 尿酸酸化酵素－アルブミン結合体に対する薬動力学的評価
実験例８．５で得られた尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を用いて、実験例４に開示されている方法により、尿酸酸化酵素－アルブミン結合体に対する薬動力学的評価実験を実行する。
実験例８．８ 高尿酸血症動物モデルを利用した尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の血中尿酸減少効果
実験例８．５で得られた尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を用いて、実験例５に開示されている方法により、尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の血中尿酸減少効果を測定する。
実験例８．９ Ｈｕｍａｎ ＦｃＲｎ（＋／＋） ＴＧマウスを利用した薬動力学的評価（ＰＫプロファイル）
実験例８．５で得られた尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を用いて、実験例６に開示されている方法により、尿酸酸化酵素－アルブミン結合体のＨｕｍａｎ ＦｃＲｎ（＋／＋） ＴＧマウスを利用した薬動力学的評価（ＰＫプロファイル）を実行する。
実験例８．１０ ヒト由来ＰＢＭＣに基づくｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫原性の分析
実験例８．５で得られた尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を用いて、実験例６に開示されている方法により、尿酸酸化酵素－アルブミン結合体のＨｕｍａｎ ＦｃＲｎ（＋／＋） ＴＧマウスを利用した薬動力学的評価（ＰＫプロファイル）を実行する。
実験例９ アルスロバクター・グロビフォルミス由来尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の取得および効果の確認
実験例９．１ 実験材料
４－（１，２，３，４－テトラジン－３－イル）フェニルアラニン（ｆｒＴｅｔ）をＡｌｄｌａｂ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。Ｔｒａｎｓ－ｃｙｌｏｏｃｔｅｎｅ（ＴＣＯ）－Ｃｙ３はＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＴＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミド（ＴＣＯ－ＰＥＧ４－ＭＡＬ）およびａｍｉｎｅ－ａｘｉａｌｌｙ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ＴＣＯ（ＴＣＯ－ａｍｉｎｅ）はＦｕｔｕｒｅＣｈｅｍ（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）から購入した。Ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒ－ｏｐｈｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ（ＰＦＰ）－ＰＥＧ４－ＡＰＮはＣＯＮＪＵ－ＰＲＯＢＥ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。使い捨てＰＤ－１０脱塩カラム（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎｓ）およびＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ増加カラム（Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｃｏｌｕｍｎｓ）はＣｙｔｉｖａ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。分子量カットオフ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ－ｏｆｆ；ＭＷＣＯ）が１０および１００ｋＤＡであるＶｉｖａｓｐｉｎ６遠心濃縮器（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒｓ）はＳａｒｔｏｒｉｕｓ（Ｇｏｔ－ｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）および他の全ての化学試薬は、特に言及されない限り、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
実験例９．２ アルスロバクター・グロビフォルミス由来尿酸酸化酵素変異体（ＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔ）を取得するためのベクター製造
アルスロバクター・グロビフォルミス由来尿酸酸化酵素（ＡｇＵｏｘ）およびその変異体をコードする遺伝子はＭａｃｒｏｇｅｎ（Ｓｅｏｕｌ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）に依頼して合成した。野生型ＡｇＵｏｘ（ＡｇＵｏｘ－ＷＴ）、または非天然アミノ酸であるｆｒＴｅｔが配列内に導入されたＡｇＵｏｘ変異体（ＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔ）を発現させるために、合成された前記遺伝子を鋳型とし、プライマーｐＢＡＤ－ＡｇＵｏｘ＿Ｆ（５'－ＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＴＧＴＧＡＡＧＧ－３'，配列番号１６１）およびｐＢＡＤ－ＡｇＵｏｘ＿Ｒ（５'－ＧＣＣＧＡＧＡＴＣＴＴＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧ－３'，配列番号１６２）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。増幅された遺伝子を２つの制限酵素（ＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩＩ）で消化し、ｐＢＡＤベクターのＮｃｏＩおよびＢｇＩＩＩ部位に前記遺伝子を挿入してｐＢＡＤ＿ＡｇＵｏｘを合成した。ＡｇＵｏｘ－ＷＴ配列内の１９６番位置のグルタミン酸コドンをアンバーコドン（ＵＡＧ）に置換するために、前記ｐＢＡＤ－ＡｇＵｏｘを鋳型として使用し、プライマーＡｇＵｏｘ－１９６Ａｍｂ＿Ｆ（５'－ＧＴＣＧＡＡＧＴＣＣＡＣＣＴＡＴＡＣＧＧＴＧＴＴＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＣＧＧ－３'配列番号１６３）およびＡｇＵｏｘ－１９６Ａｍｂ＿Ｒ（５'－ＣＣＧＴＴＧＧＣＧＴＴＡＣＡＡＣＡＣＣＧＴＡＴＡＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＧＡＣ－３'，配列番号１６４）を用いてｐＢＡＤ－ＡｇＵｏｘ＿１９６ａｍｂを製造した。
実験例９．３ ＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔの取得
ＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔを発現させるために、Ｙａｎｇ ｅｔ．ａｌ，Ｔｅｍｐｏｒａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｔｅｔｒａｚｉｎｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎｖｅｒｓｅ－Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０２０，２４５６－２４６４に開示されている方法を参照して、Ｃ３２１ΔＡ．ｅｘｐ、ｐＤｕｌｅ＿Ｃ１１、およびｐＢＡＤ＿ＡｇＵｏｘ－１９６ａｍｂを用いて以下のような方法でＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔを発現させた。
ｆｒＴｅｔに対して最適化されたＭｊｔＲＮＡＴｙｒ／ＭｊＴｙｒＲＳを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞を用意した。ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（１００ｇ／ｍＬ）およびｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ（１０ｇ／ｍＬ）が含まれたＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地で培養されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を３７℃で一晩振盪しながら、同じ条件下で２ｘＹＴ培地に接種した。振盪培養２．５時間後、前記細胞を含む培地が６００ｎｍで光学密度０．５に到達したとき、ｆｒＴｅｔおよびＬ－（＋）－アラビノースを培地に添加して最終濃度がそれぞれ１ｍＭおよび０．４％（ｗ／ｖ）となるようにした。これを５時間培養した後、細胞を５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、ＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔを得た。前記ＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔを製造業者のプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）に従って４℃で固定金属親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。前記精製したＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔはＰＤ－１０カラムを用いてＰＢＳ（ｐＨ７．４）で脱塩した。ＡｇＵｏｘ－ＷＴの発現および精製過程はＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔと同様の方法に従ったが、発現段階中に培養培地にテトラサイクリンおよびｆｒＴｅｔを添加しなかった。
実験例９．３ 製造されたＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔの分析および確認
前記製造されたＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔおよびＡｇＵｏｘ－ＷＴを確認するために、これらを製造業者のプロトコルに従ってトリプシンに分解した。合計０．４ｍｇ／ｍＬのＵｏｘ変異体（ＡｇＵｏｘ－ＷＴおよびＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔ）を３７℃で一晩分解した後、ＺｉｐＴｉｐ Ｃ１８を用いて脱塩した。トリプシンに分解した混合物を２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）マトリックス溶液（３０：７０（ｖ／ｖ）アセトニトリル：トリフルオロ酢酸０．１％内ＤＨＢ ２０ｍｇ／ｍＬ）と混合した後、Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ装置（Ｂｒｕｋｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて分析した。
実験例９．４ ＡｇＵｏｘ－ＷＴおよびＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔの部位ごとの蛍光染料レーベリング
精製したＡｇＵｏｘ－ＷＴおよびＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、室温、１：２モル比でＴＣＯ－Ｃｙ３蛍光染料と反応させた。２時間後、反応混合物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）に適用した。タンパク質ゲルの蛍光画像は、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋システム（３０２ｎｍでイルミネーション、５１０－６１０ｎｍフィルター、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して得た。蛍光分析後、タンパク質ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ－２５０染料で染色した。白色光照明を使用するＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋システムを使用してタンパク質ゲル画像を得た。
前記実験例９．３～実験例９．４によって製造されたＡｇＵｏｘ－ＷＴおよびＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔを分析した結果を図３２～図３３に示した。
実験例９．５ ＡｇＵｏｘ－ＨＳＡ結合体の製造（ＡｇＵｏｘ－ＭＡＬ－ＨＳＡ ａｎｄ ＡｇＵｏｘ－ＡＰＮ－ＨＳＡ）
ＡｇＵｏｘで部位特異的アルブミン化を実行するために、ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰアニオン交換カラムを用いてアニオン交換クロマトグラフィーによりＨＳＡを精製した。精製されたＨＳＡをＰＢＳ（ｐＨ７．０）で脱塩した後、ＴＣＯ－ＭＡＬと反応させ、室温下、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で１：４のモル比で反応させた。２時間後、反応混合物を、ＰＤ－１０カラムを用いてＰＢＳ（ｐＨ７．４）で脱塩し、未反応ＴＣＯ－ＰＥＧ４－ＭＡＬリンカーを除去してＭＡＬ－ＨＳＡ結合体を得た。精製したＵｏｘ－ｆｒＴｅｔをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１：４のモル比でＭＡＬ－ＨＳＡと室温で５時間反応させた。コンジュゲーション（結合）後、前記反応混合物をＮＧＣ Ｑｕｅｓｔ １０ Ｐｌｕｓクロマトグラフィーシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＳＥＣ）に適用した。溶出した画分の分子量および純度はＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて分析し、４つのＭＡＬ－ＨＳＡ分子（ＡｇＵｏｘ－ＭＡＬ－ＨＳＡ）に結合したＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔに対応する画分を選別し、さらなる分析のために濃縮した。
ＴＣＯおよびＡＰＮを含有するヘテロ二官能性クロスリンカー（ｈｅｔｅｒｏ－ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｒ）を介してＡｇＵｏｘ－ＨＳＡ結合体を生成するために、ＴＣＯ－アミンをＰＦＰ－ＰＥＧ４－ＡＰＮと反応させ、室温で３０分間ＤＭＳＯで１：１のモル比で反応させた。精製したＨＳＡを５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で緩衝液交換した。５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で、精製したＨＳＡをＴＣＯ－ＰＥＧ４－ＡＰＮと１：４のモル比で室温で２時間反応させた。未反応ＴＣＯ－ＡＰＮリンカーを除去するために、反応混合物を、ＰＤ－１０カラムを用いてＰＢＳ（ｐＨ７．４）で脱塩した。ＡＰＮを含有するリンカーを介して４つのＨＳＡ分子に結合したＡｇＵｏｘ－ｆｒＴｅｔの結合（ＡｇＵｏｘ－ＡＰＮ－ＨＳＡ）および精製したＡｇＵｏｘ－ＭＡＬ－ＨＳＡと同様の方式で行った。
前記実験例９．５によってＡｇＵｏｘ－ＨＳＡ結合体を製造した結果を図３４～図３５に示した。
実験例９．６ ＡｇＵｏｘ－ＨＳＡ結合体に対するＩｎ ｖｉｖｏ半減期の同定（ＰＫプロファイル）
マウスにおけるＡｇＵｏｘ－ＨＳＡ結合体の安定性分析は、光州科学技術院（ＧＩＳＴ－２０２０－０３７）の動物管理および使用委員会の指示に従って実行した。ＡｇＵｏｘ－ＷＴ、ＡｇＵｏｘ－ＭＡＬ－ＨＳＡ、またはＡｇＵｏｘ－ＡＰＮ－ＨＳＡそれぞれを、ｐＨ７．４で２００μＬのＰＢＳのＡｇＵｏｘ基準５．０ｎｍｏｌを若い雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）の尾静脈に注射した。ＡｇＵｏｘ－ＷＴの場合、１５分、３時間、６時間および１２時間後に眼窩後出血（ｒｅｔｒｏ－ｏｒｂｉｔａｌ ｂｌｅｅｄｉｎｇ）を介して血液サンプルを行い、ＡｇＵｏｘ－ＨＳＡ結合体の場合、同じ方法で１５分、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間および１２０時間に血液サンプルを収集した。前記収集した血液から血清を分離した後、ＡｇＵｏｘ－ＷＴおよびＡｇＵｏｘ－ＭＡＬ－ＨＳＡ、およびＡｇＵｏｘ－ＡＰＮ－ＨＳＡの血清活性を、５μＬの血清を含む１００μＬ酵素活性緩衝液に１００μＭの尿酸を含む酵素活性分析緩衝液１００μＬを添加して２９３ｎｍにおける吸光度の変化によって測定した。
前記ｉｎ ｖｉｖｏ半減期確認結果を図３６に示した。
実験の結果、アルブミンを結合しなかったＡｇＵｏｘ－ＷＴと比較して、ＡｇＵｏｘ－ＡＰＮ－ＨＳＡおよびＡｇＵｏｘ－ＭＡＬ－ＨＳＡにおいて顕著な半減期上昇が現れることを確認した。
（産業上の利用可能性）
本明細書では、尿酸酸化酵素－アルブミン結合体およびその製造方法、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体に含まれる尿酸酸化酵素変異体およびその製造方法を開始し、前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、尿酸が原因となる様々な疾患、疾病、または適応症の予防および治療に使用可能である。

Claims (24)

  1. 以下の化学式１で表現される、尿酸酸化酵素－アルブミン結合体であって、
    ［化学式１］
    Ｕｏｘ－［Ｊ１－Ａ－Ｊ２－ＨＳＡ］ｎ
    ここで、前記Ｕｏｘは尿酸酸化酵素変異体、前記Ｊ１は尿酸酸化酵素－リンカー結合部、前記Ａはアンカー、前記Ｊ２はアルブミン－リンカー結合部、前記ＨＳＡはヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）を意味し、
    前記ｎは３または４であり、
    前記尿酸酸化酵素変異体は、４つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化した四量体であり、
    前記各尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号２～５０からそれぞれ独立して選択されたペプチド配列、または前記選択されたペプチド配列と９０％以上一致したものであり、
    ここで、前記配列番号２～５０の配列は非天然アミノ酸Ｘを含み、前記非天然アミノ酸は４－（１，２，３，４－テトラジン－３－イル）フェニルアラニン（ｆｒＴｅｔ）であり、
    前記尿酸酸化酵素－リンカー結合部は、前記尿酸酸化酵素変異体に含まれる非天然アミノ酸のテトラジン残基および前記アンカーに連結されたトランスシクロオクテン残基が逆電子要求ディールス・アルダー（Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ；ＩＥＤＤＡ）反応を介して結合したものであり、
    前記尿酸酸化酵素－リンカー結合部は次の化学式と表現され、
    ここで、前記（１）部分は前記非天然アミノ酸の残基の部分に連結され、前記（２）部分はアンカーの部分に連結され、
    前記アルブミン－リンカー結合部は、前記アルブミンに含まれるチオール基（ｔｈｉｏｌ ｍｏｉｅｔｙ）および前記アンカーのチオール反応基（ｔｈｉｏｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｉｅｔｙ）が反応して結合したものであることを特徴とする尿酸酸化酵素－アルブミン結合体。
  2. 前記尿酸酸化酵素変異体は配列番号２９の尿酸酸化酵素変異体サブユニットを４つ含み、前記配列番号２９に含まれる非天然アミノ酸ＸはｆｒＴｅｔであることを特徴とする請求項１に記載の尿酸酸化酵素－アルブミン結合体。
  3. 前記アルブミン－リンカー結合部は、
    ここで、（１）部分は前記アルブミンに連結され、（２）部分は前記アンカーの部分に連結されることを特徴とする請求項１に記載の尿酸酸化酵素－アルブミン結合体。
  4. 前記アンカーは、
    ここで、前記Ｊ１は尿酸酸化酵素－リンカー結合部、前記Ｊ２はアルブミン－リンカー結合部であることを特徴とする請求項１に記載の尿酸酸化酵素－アルブミン結合体。
  5. 前記アルブミンは、配列番号１３３～１４４から選択された配列、または前記選択された配列と９０％以上一致するものであることを特徴とする請求項１に記載の尿酸酸化酵素－アルブミン結合体。
  6. 尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法において、
    アルブミンとリンカーを反応させることと、
    アルブミン－リンカー結合体と尿酸酸化酵素変異体を反応させることと、を含み、
    ここで、前記リンカーは、ジエノフィル官能基（ｄｉｅｎｏｐｈｉｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）、アンカー、およびチオール反応性基（ｔｈｉｏｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｉｅｔｙ）を含み、
    前記ジエノフィル官能基は、トランスシクロオクテンまたはその誘導体であり、
    前記チオール反応性基は、マレイミドまたはその誘導体、および３-アリルプロピロニトリルまたはその誘導体のうちから選択され、
    前記リンカーのチオール反応性基と前記アルブミンのチオール基とは反応を介して結合され、アルブミン－リンカー結合体を生成し、
    前記尿酸酸化酵素変異体は、４つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化した四量体であり、
    前記尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、それぞれ独立に、配列番号２～５０から選択された配列、または前記選択された配列と９０％以上一致する配列と表現され、
    前記配列番号２～５０に含まれるＸは、非天然アミノ酸である４－（１，２，３，４－テトラジン－３－イル）フェニルアラニン（ｆｒＴｅｔ）であり、
    前記尿酸酸化酵素変異体は、４つのｆｒＴｅｔを含み、
    前記ｆｒＴｅｔの残基に含まれるテトラジン官能基と前記リンカーのジエノフィル官能基は、逆電子要求ディールス・アルダー（Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ；ＩＥＤＤＡ）反応を介して結合し、尿酸酸化酵素－アルブミン結合体を生成し、
    前記尿酸酸化酵素－アルブミン結合体は、前記尿酸酸化酵素変異体に３つ以上の前記アルブミンがリンカーを介して結合されたことを特徴とする尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法。
  7. 前記リンカーは、
    のうちから選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
  8. 前記尿酸酸化酵素変異体は、配列番号２９で表現される４つの尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化された四量体であり、前記配列番号２９に含まれるＸはｆｒＴｅｔであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
  9. 前記アルブミンは、配列番号１３３～１４４から選択された配列、または前記選択された配列と９０％以上一致する配列と表現され、前記リンカーのチオール反応性基および前記アルブミン配列のうちの３４番目のシステインに含まれるチオール基が反応を介して結合することを特徴とする請求項６に記載の方法。
  10. 前記尿酸酸化酵素変異体とリンカーを反応させることは、ｐＨ６～８で実行されることを特徴とする請求項６に記載の尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の製造方法。
  11. 第１尿酸酸化酵素変異体サブユニットと、第２尿酸酸化酵素変異体サブユニットと、第３尿酸酸化酵素変異体サブユニットと、第４尿酸酸化酵素変異体サブユニットと、を含む尿酸酸化酵素変異体であって、
    前記尿酸酸化酵素変異体は、前記第１尿酸酸化酵素変異体サブユニット、前記第２尿酸酸化酵素変異体サブユニット、前記第３尿酸酸化酵素変異体サブユニット、および前記第４尿酸酸化酵素変異体サブユニットがオリゴマー化して形成された四量体であり、
    前記第１尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号２～５０から選択された配列、または前記選択された配列と９０％以上一致する配列と表現され、
    前記第２尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号２～５０から選択された配列、または前記選択された配列と９０％以上一致する配列と表現され、
    前記第３尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号２～５０から選択された配列、または前記選択された配列と９０％以上一致する配列と表現され、
    前記第４尿酸酸化酵素変異体サブユニットは、配列番号２～５０で選択された配列、または前記選択された配列と９０％以上一致する配列と表現され、
    ここで、前記配列番号２～５０に含まれるＸは、テトラジン官能基またはトリアジン官能基を含む非天然アミノ酸であることを特徴とする尿酸酸化酵素変異体。
  12. 前記非天然アミノ酸は、
    のうちから選択されることを特徴とする尿酸酸化酵素変異体。
  13. 配列番号２～５０のペプチドをコードする尿酸酸化酵素変異体発現ベクターであって、
    前記配列番号２～５０に含まれるＸは非天然アミノ酸であり、前記Ｘに対応するベクター配列は終結コドンにコードされたことを特徴とする尿酸酸化酵素変異体発現ベクター。
  14. 前記終結コドンは、５'－ＵＡＧ－３'であることを特徴とする請求項１３に記載のベクター。
  15. 直交的ｔＲＮＡ／合成酵素ペアを発現させることができるベクターおよび尿酸酸化酵素変異体発現ベクターを含む細胞株を用意することと、
    前記細胞株をテトラジン官能基および／またはトリアジン官能基を含む一種類以上の非天然アミノ酸が含まれた培地で培養することと、を含む尿酸酸化酵素変異体の製造方法において、
    前記直交的ｔＲＮＡ／合成酵素ペアを発現させることができるベクターは、外来由来サプレッサーｔＲＮＡおよび外来由来ｔＲＮＡ合成酵素を発現させることができ、
    前記外来由来サプレッサーｔＲＮＡは、特定の終結コドンを認識でき、
    前記外来由来ｔＲＮＡ合成酵素は、テトラジン官能基および／またはトリアジン官能基を含む非天然アミノ酸を認識して前記外来由来サプレッサーｔＲＮＡに連結することができ、
    前記尿酸酸化酵素変異体発現ベクターは、配列番号２～５０から選択された配列、または前記選択された配列と９０％以上一致する配列で表現される尿酸酸化酵素変異体サブユニットを発現させることができ、前記尿酸酸化酵素変異体内に含まれる非天然アミノ酸に対応する位置が前記特定の終結コドンにコードされることを特徴とする尿酸酸化酵素変異体の製造方法。
  16. 前記細胞株を、
    のうちから選択された非天然アミノ酸が含まれる培地で培養することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  17. 前記特定の終結コドンは、５'－ＵＡＧ－３'であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  18. 尿酸関連疾患を予防または治療するための医薬組成物であって、
    治療学的有効量の、請求項１に記載の尿酸酸化酵素－アルブミン結合体と、
    薬学的に許容される担体と、を含むことを特徴とする医薬組成物。
  19. 前記尿酸関連疾患は、高尿酸血症、急性痛風性関節炎、間欠期痛風、慢性結節性痛風、慢性腎臓病（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ）および腫瘍崩壊症候群（Ｔｕｍｏｒ Ｌｙｓｉｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＴＬＳ）のうちのいずれか１つであることを特徴とする請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 前記薬学的に許容される担体は、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプンまたはサツマイモデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、フマル酸ステアリルナトリウムまたはポリエチレングリコールワックスなどの潤滑油；甘味料；芳香剤；シロップ剤；脂肪油のような液体担体；滅菌水溶液；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；オレイン酸エチルのような注射可能なエステル；懸濁剤；乳剤；凍結乾燥製剤；外用剤；安定剤；緩衝剤；動物油；植物油；ワックス；パラフィン；デンプン；トラガカント；セルロース誘導体；ポリエチレングリコール；シリコン；ベントナイト；シリカ；タルク；酸化亜鉛のうちの１つ以上を含むことを特徴とする請求項１８に記載の医薬組成物。
  21. 尿酸関連疾患の予防または治療方法であって、
    請求項１８に記載の医薬組成物を対象の体内に投与することを特徴とする尿酸関連疾患の予防または治療方法。
  22. 前記尿酸関連疾患は、高尿酸血症、急性痛風性関節炎、間欠期痛風、慢性結節性痛風、慢性腎臓病（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ）および腫瘍崩壊症候群（Ｔｕｍｏｒ Ｌｙｓｉｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＴＬＳ）のいずれか１つであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
  23. 前記医薬組成物を対象の体内に投与することは、経口投与、非経口投与、静脈内投与、点滴静脈注射（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、腹腔内投与、筋肉内投与、経皮投与、および皮下投与から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
  24. 前記医薬組成物の投与用量が、対象の質量に対する投与された尿酸酸化酵素－アルブミン結合体の質量を基準として、１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
JP2023519336A 2020-09-25 2021-09-24 尿酸酸化酵素－アルブミン結合体、その製造方法および用途 Pending JP2023543045A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2020-0125215 2020-09-25
KR20200125215 2020-09-25
KR20210013537 2021-01-29
KR10-2021-0013537 2021-01-29
PCT/KR2021/013037 WO2022065913A1 (ko) 2020-09-25 2021-09-24 요산산화효소-알부민 접합체, 그 제조방법 및 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023543045A true JP2023543045A (ja) 2023-10-12

Family

ID=80845753

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023519336A Pending JP2023543045A (ja) 2020-09-25 2021-09-24 尿酸酸化酵素－アルブミン結合体、その製造方法および用途

Country Status (7)

Country Link
US (2) US20230211002A1 (ja)
EP (1) EP4282876A1 (ja)
JP (1) JP2023543045A (ja)
KR (2) KR102501387B1 (ja)
AU (1) AU2021350514A1 (ja)
CA (1) CA3196814A1 (ja)
WO (1) WO2022065913A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023282556A1 (ko) * 2021-07-08 2023-01-12 주식회사 프로앱텍 Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소-알부민 접합체, 그 제조방법 및 그 용도
WO2023048505A1 (ko) * 2021-09-23 2023-03-30 주식회사 프로앱텍 Apn 그룹을 포함하는 링커 및 이를 이용하여 제조된 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1637010A (en) 1926-07-14 1927-07-26 Rees Alfred Arnold Game apparatus
CN102317315A (zh) * 2009-02-11 2012-01-11 诺维信生物制药丹麦公司 白蛋白变体和缀合物
US9840493B2 (en) * 2013-10-11 2017-12-12 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use
KR101637010B1 (ko) 2015-04-24 2016-07-07 광주과학기술원 위치 특이적으로 알부민이 연결된 요산 산화효소 및 단백질에 위치 특이적으로 알부민을 연결하는 방법
KR20200061688A (ko) 2018-11-26 2020-06-03 광주과학기술원 알부민이 결합된 글루카곤 유사 펩타이드-1 유사체
KR102161728B1 (ko) * 2019-04-22 2020-10-06 광주과학기술원 다중 효소 결합체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 유기물 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021350514A1 (en) 2023-01-19
KR102501387B9 (ko) 2023-04-17
US20230211002A1 (en) 2023-07-06
KR20220156636A (ko) 2022-11-25
KR102501387B1 (ko) 2023-02-24
WO2022065913A1 (ko) 2022-03-31
CA3196814A1 (en) 2022-03-31
KR20230059777A (ko) 2023-05-03
EP4282876A1 (en) 2023-11-29
US20230149517A1 (en) 2023-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230149517A1 (en) Urate oxidase-albumin conjugate, preparation method thereof, and use thereof
JP6243452B2 (ja) アルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質を含有する医薬組成物
JP2022028673A (ja) 糖標的化治療剤
WO2013130684A1 (en) Xten-folate conjugate compositions and methods of making same
JP2012531893A (ja) アルギナーゼ製剤および方法
JP7273214B2 (ja) イヌアトピー性皮膚炎の治療
JP2014527072A (ja) ウイルスタンパク質の集合を制御するための方法および組成物
CN112513099A (zh) 用于癌症、肥胖症、代谢紊乱和相关并发症及合并症的精氨酸耗竭剂的组合物和应用
JP2004531230A (ja) Ｇｂ３レセプター発現細胞を標的とする分子の一般担体
FR2816844A1 (fr) Domaine periplasmique d'une proteine omp d'enterobacterie et son utilisation comme porteur et/ou adjuvant
CN111050784A (zh) 截短的豚鼠l-天冬酰胺酶变体及其使用方法
WO2022263574A1 (en) Crm197 protein carrier
RU2584572C2 (ru) Способ получения полипептида, конъюгированного с поли(этиленгликолевым) фрагментом, нуклеиновая кислота и слитый полипептид, предназначенные для применения в способе
JP5594691B2 (ja) 改変タンパク質
CN116888258A (zh) 修饰的红细胞及其治疗高尿酸血症和痛风的用途
CN116615259A (zh) 尿酸酶-白蛋白偶联物、其制备方法及其用途
KR20230136740A (ko) 다량체 단백질-알부민 접합체, 제조방법, 및 그 용도
Wang et al. Preparation of a peptide vaccine against GnRH by a bioprocess system based on asparaginase
KR20240049312A (ko) Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소-알부민 접합체, 그 제조방법 및 그 용도
KR20240083169A (ko) Apn 그룹을 포함하는 링커 및 이를 이용하여 제조된 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트
WO2024088213A1 (en) Combination to induce specific immune tolerance
WO2024047090A2 (en) Modified virus-like particles of cmv
KR20230009278A (ko) 신규 단백질 컨쥬게이트
TW202417630A (zh) 經修飾的cmv類病毒粒子與ngf抗原之獸醫組成物
KR20220077590A (ko) Candida Utilis 유래 요산산화효소-알부민 복합체 및 이의 제조 방법