KR20240049312A - Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소-알부민 접합체, 그 제조방법 및 그 용도 - Google Patents
Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소-알부민 접합체, 그 제조방법 및 그 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 명세서는 요산산화효소-알부민 접합체 및 그 제조방법, 및 상기 요산산화효소-알부민 접합체에 포함된 요산산화효소 변이체 및 그 제조방법을 개시한다. 특히, 본 명세서에서는 Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소의 변이체에 대해 개시한다. 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체에 3개 이상의 알부민이 링커를 통해 접합된 것을 특징으로 하며, 이에 따라 반감기의 향상, 면역원성의 감소 효과가 나타난다. 또한 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산이 원인이 되는 다양한 질병, 질환 및/또는 적응증의 예방 또는 치료 용도로 사용할 수 있다.
Description
본 명세서에서는 위치 특이적으로 비천연 아미노산이 도입된 요산산화효소 변이체, 특히 Arthrobacter globiformis 유래 요산산산화효소의 변이체 및 그 제조방법, 및 상기 요산산화효소 변이체 및 알부민을 링커로 접합시킨 접합체 및 그 제조방법에 대해 개시한다. 또한, 본 명세서에서는 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 용도를 개시한다.
요산산화효소(Urate oxidase; Uricase)는 인간을 비롯한 영장류는 자체 합성이 불가능한 효소의 일종으로, 요산을 알란토인(Allantoin)으로 분해하는 기능을 한다. 상기 요산산화효소는 통풍 발생의 주 원인인 요산을 배설가능한 형태로 분해하는 직접적인 치료기전을 가지며, 따라서 강력한 요산 강하 효과가 있다는 장점이 있으나, 1) 체내 반감기가 짧아 주사제로만 사용이 가능하고, 2) 외부 유래 단백질이기 때문에 체내에 투여되는 경우 면역반응이 발생하고, 이로 인한 부작용이 발생한다는 단점이 있어 통풍 치료제로 사용되는 데 제한이 있다.
한편, 치료용 단백질(therapeutic protein)은 다양한 질병의 치료에 효과가 있음이 보고되어 왔으며, 제약분야의 중요한 성장 동기 중 하나이다. 하지만, 치료용 단백질은 환자 체내에서 사구체의 여과(glomerular filtration), 세포흡수작용(pinocytosis), 및 면역반응에 의해 지속적으로 제거된다는 문제점이 있다. 따라서, 치료용 단백질의 개발 시 상기 현상으로 인해 환자 체내에서 제거되는 속도를 완화시켜 약효의 지속시간을 연장시키는 것이 매우 중요하다. 이러한 문제점을 개선하기 위해, 상기 치료용 단백질에 알부민을 물리적으로, 또는 화학적으로 결합시켜 반감기의 개선을 꾀하는 기술을 알부미네이션(albumination)이라 한다.
본 명세서에서는 상기한 요산산화효소의 치료제로서의 문제점을 해결하기 위해, 요산산화효소를 알부미네이션시킨 요산산화효소-알부민 접합체를 개시한다.
본 명세서에서는 요산산화효소-알부민 접합체를 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 상기 요산산화효소-알부민 접합체에 포함된 요산산화효소 변이체를 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 상기 요산산화효소 변이체의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 상기 요산산화효소-알부민 접합체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 용도를 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 [구조식 1]로 표현되는 요산산화효소-알부민 접합체를 개시한다:
[구조식 1]
Uox-[J1-A-J2-HSA]n,
여기서, 상기 Uox는 요산산화효소 변이체로, 요산산화효소는 _Arthrobacter globiformis_에서 유래한 것이고, 상기 J1은 요산산화효소-링커 접합부, 상기 A는 앵커, 상기 J2는 알부민-링커 접합부, 상기 HSA는 인간 혈청 알부민이며, 상기 n은 3 또는 4이고,
상기 요산산화효소 변이체는 3개 이상의 4-(1,2,3,4-tetrazine-3-yl) phenylalanines(frTet)를 포함하고,
상기 요산산화효소-링커 접합부는 상기 요산산화효소 변이체의 상기 frTet의 테트라진 반응기 및 상기 앵커에 연결된 트랜스-시클로옥텐 반응기가 역-전자 요구 디엘스-알더 반응을 통해 형성된 구조이고,
상기 요산산화효소-링커 접합부는 
로 표현되고, 여기서 (1)은 상기 frTet 잔기에 연결된 것이고, 상기 (2)는 앵커에 연결된 것이고,
상기 알부민-링커 접합부는 상기 인간 혈청 알부민의 티올 반응기 및 상기 앵커에 연결된 티올 반응성기가 반응하여 형성된 구조이고,
상기 알부민-링커 접합부는 
, 
, 또는 
로 표현되고,
여기서 (1)은 알부민에 연결된 것이고, (2)는 앵커에 연결된 것이다.
일 실시예로, 상기 요산산화효소 변이체는 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛으로 구성되고,
여기서, 상기 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛은 각각 독립적으로, 서열번호 2 내지 서열번호 15에서 선택된 아미노산 서열로 표현되며, 상기 아미노산 서열의 X는 4-(1,2,3,4-tetrazine-3-yl) phenylalanines(frTet)일 수 있다.
일 실시예로, 상기 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛 모두 서열번호 2 내지 서열번호 15에서 선택된 동일한 아미노산 서열로 표현되고,
상기 아미노산 서열의 X는 4-(1,2,3,4-tetrazine-3-yl) phenylalanines(frTet)일 수 있다.
일 실시예로, 상기 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛 모두 서열번호 13의 동일한 아미노산 서열로 표현되고, 상기 아미노산 서열의 X는 4-(1,2,3,4-tetrazine-3-yl) phenylalanines(frTet)일 수 있다.
일 실시예로, 상기 앵커는 다음 중 선택되는 요산산화효소-알부민 접합체일 수 있다:
및 
,
여기서, 상기 J1은 상기 요산산화효소-링커 접합부이고, 상기 J2는 상기 알부민-링커 접합부이다.
일 실시예로, 상기 인간 혈청 알부민은 각각 독립적으로, 서열번호 16 내지 서열번호 27 중 선택된 아미노산 서열로 표현될 수 있다.
본 명세서에서는 다음을 포함하는 요산산화효소-알부민 접합체를 개시한다:
제1 서브유닛; 제2 서브유닛; 제3 서브유닛; 및 제4 서브유닛,
여기서, 상기 제1 서브유닛, 상기 제2 서브유닛, 상기 제3 서브유닛, 및 상기 제4 서브유닛이 올리고머화하여 요산산화효소-알부민 접합체를 형성하고,
상기 제1 서브유닛, 상기 제2 서브유닛, 및 상기 제3 서브유닛은 [구조식 2]로 표현되고, 상기 제4 서브유닛은 [구조식 2], 또는 [구조식 3]으로 표현됨:
[구조식 2]
P'-J1-A-J2-HSA,
여기서, 상기 P'은 서열번호 2 내지 서열번호 15의 아미노산 서열로 표현되는 요산산화효소 변이체 서브유닛이고,
상기 아미노산 서열에 포함된 X는 4-(1,2,3,4-tetrazine-3-yl) phenylalanines(frTet)이고,
상기 J1은 요산산화효소-링커 접합부, 상기 A는 앵커, 상기 J2는 알부민-링커 접합부, 상기 HSA는 인간 혈청 알부민이며,
상기 요산산화효소-링커 접합부는 상기 요산산화효소 변이체의 상기 frTet의 테트라진 반응기 및 상기 앵커에 연결된 트랜스-시클로옥텐 반응기가 역-전자 요구 디엘스-알더 반응을 통해 형성된 구조이고,
상기 요산산화효소-링커 접합부는 
로 표현되고,
여기서 (1)은 상기 frTet 잔기에 연결된 것이고, 상기 (2)는 앵커에 연결된 것이고,
상기 알부민-링커 접합부는 상기 인간 혈청 알부민의 티올 반응기 및 상기 앵커에 연결된 티올 반응성기가 반응하여 형성된 구조이고,
상기 알부민-링커 접합부는 
, 
, 또는 
로 표현되고,
여기서 (1)은 알부민에 연결된 것이고, (2)는 앵커에 연결된 것임;
[구조식 3]
P',
여기서, 상기 P'은 서열번호 2 내지 서열번호 15의 아미노산 서열로 표현되는 요산산화효소 변이체 서브유닛임.
본 명세서에서는 다음을 포함하는 요산산화효소 변이체를 개시한다:
제1 서브유닛으로, 서열번호 2 내지 서열번호 15 중 선택된 아미노산 서열로 표현되는 것;
제2 서브유닛으로, 서열번호 2 내지 서열번호 15 중 선택된 아미노산 서열로 표현되는 것;
제3 서브유닛으로, 서열번호 2 내지 서열번호 15 중 선택된 아미노산 서열로 표현되는 것;
및 제4 서브유닛으로, 서열번호 2 내지 서열번호 15 중 선택된 아미노산 서열로 표현되는 것;
여기서, 상기 제1 서브유닛, 상기 제2 서브유닛, 상기 제3 서브유닛, 및 상기 제4 서브유닛이 올리고머화하여 요산산화효소-알부민 접합체를 형성하고,
상기 아미노산 서열에 포함된 각각의 X는 테트라진 작용기 또는 트리아진 작용기를 포함하는 비천연 아미노산임.
일 실시예로, 상기 비천연 아미노산은 각각 독립적으로 다음 중 선택되는 요산산화효소 변이체를 개시한다:
및 
.
일 실시예로, 상기 제1 서브유닛, 상기 제2 서브유닛, 상기 제3 서브유닛, 및 상기 제4 서브유닛 모두가 서열번호 2 내지 서열번호 15에서 선택된 동일한 아미노산으로 표현되고,
여기서, 상기 선택된 아미노산 서열의 X는 4-(1,2,3,4-tetrazine-3-yl) phenylalanines(frTet)일 수 있다.
본 명세서에서는 서열번호 2 내지 서열번호 15에서 선택된 펩타이드를 암호화하는 핵산서열을 포함하는 벡터로, 상기 아미노산 서열의 X는 비천연 아미노산이고, 상기 X에 대응하는 핵산 서열은 정지 코돈으로 암호화된 것을 개시한다.
일 실시예로, 상기 정지 코돈은 5'-UAG-3'일 수 있다.
일 실시예로, 상기 벡터는 서열번호 28 내지 서열번호 41의 핵산서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서는 다음을 포함하는 요산산화효소-알부민 접합체 제조방법을 개시한다:
(a) 알부민을 링커와 반응시키는 과정,
여기서, 상기 링커는 디에노필 작용기, 앵커, 및 티올 반응성기를 포함하고,
상기 디에노필 작용기는 트랜스-시클로옥텐 또는 트랜스-시클로옥텐의 유도체이고,
상기 티올 반응성기는 말레이미드 또는 말레이미드 유도체, 및 3-arylpropiolonitriles 또는 3-arylpropiolonitriles 유도체 중 선택된 것이고,
상기 링커의 티올 반응성기 및 상기 알부민의 티올기가 반응을 통해 결합하여 알부민-링커 접합체가 생성됨;
(b) 상기 알부민-링커 접합체를 요산산화효소 변이체화 반응시키는 과정,
여기서, 상기 요산산화효소 변이체는 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화된 4량체이고,
상기 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛은 각각 독립적으로, 서열번호 2 내지 서열번호 15 중 선택된 아미노산 서열로 표현되고,
여기서, 상기 서열번호 2 내지 서열번호 15의 X는 비천연 아미노산으로, 4-(1,2,3,4-tetrazine-3-yl) phenylalanines (frTet)이고,
상기 요산산화효소 변이체는 4개의 상기 frTet을 포함하고,
상기 frTet 잔기에 포함된 테트라진 반응성기가 상기 링커의 디에노필 작용기와 역-전자 요구 디엘스-알더 반응(IEDDA reaction)을 통해 결합하여 요산산화효소-알부민 접합체를 형성함; 및
(c) 상기 요산산화효소-알부민 접합체를 수득하는 과정, 여기서 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 3개 이상의 상기 알부민이 링커를 통해 요산산화효소 변이체와 연결되어 있는 것을 특징으로 함.
일 실시예로, 상기 링커는 다음 중 선택되는 요산산화효소-알부민 접합체 제조방법을 개시한다:
일 실시예로, 상기 요산산화효소 변이체에 포함된 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛은 모두 서열번호 2 내지 서열번호 15에서 선택된 동일한 아미노산 서열로 표현되고, 상기 선택된 아미노산 서열의 X는 4-(1,2,3,4-tetrazine-3-yl) phenylalanines (frTet)일 수 있다.
일 실시예로, 상기 알부민은 서열번호 16 내지 서열번호 27 중 선택된 아미노산 서열로 표현되고,
상기 링커의 티올 반응성기가 상기 알부민의 아미노산 서열의 34번째 시스테인의 티올 그룹과 반응을 통해 결합할 수 있다.
본 명세서에서는 다음을 포함하는 요산산화효소 변이체 제조방법을 개시한다:
(a) 직교적 tRNA/합성효소 페어, 및 요산산화효소 변이체를 발현할 수 있는 세포주를 준비하는 것,
여기서, 상기 세포주는 다음을 포함함:
직교적 tRNA/합성효소 페어를 암호화하는 핵산서열을 가지는 벡터; 및 요산산화효소 변이체 서브유닛을 암호화하는 핵산서열을 가지는 벡터,
여기서, 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어를 암호화하는 핵산서열을 가지는 벡터는 외래 유래 suppressor tRNA 및 외래 유래 tRNA 합성효소를 암호화하는 핵산서열을 포함하고,
상기 외래 유래 suppressor tRNA는 특정 종결 코돈을 인식할 수 있는 것이고,
상기 외래 유래 tRNA 합성효소는 테트라진 작용기 및/또는 트리아진 작용기를 포함하는 비천연 아미노산을 인식하여 상기 외래 유래 suppressor tRNA에 연결시킬 수 있는 것이고,
상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 2 내지 서열번호 15에서 선택된 아미노산 서열이고, 여기서, 상기 선택된 서열의 X는 비천연 아미노산으로, 상기 비천연 아미노산과 대응되는 핵산서열은 특정 종결 코돈으로 암호화되어 있음; 및
(b) 상기 세포주를 테트라진 작용기 및/또는 트리아진 작용기를 포함하는 한 종류 이상의 비천연 아미노산이 포함된 배지에서 배양하는 것.
일 실시예로, 상기 테트라진 작용기 및/또는 트리아진 작용기를 포함하는 비천연 아미노산은 다음 중 선택된 것일 수 있다:
일 실시예로, 상기 특정 종결 코돈은 5'-UAG-3'일 수 있다.
본 명세서에서는 다음을 포함하는, 요산 관련 질병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개시한다:
치료학적 유효량의 상기 요산산화효소-알부민 접합체; 및
약학적으로 허용되는 담체.
일 실시예로, 상기 약학적으로 허용되는 담체는 다음 중 선택되는 하나 이상일 수 있다:
락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유; 감미제; 방향제; 시럽제; 지방유와 같은 액체 담체; 멸균된 수용액; 프로필렌글리콜; 폴리에틸렌글리콜; 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르; 현탁제; 유제; 동결 건조 제제; 외용제; 안정제; 완충제; 동물성 유; 식물성 유; 왁스; 파라핀; 전분; 트라칸트; 셀룰로오스 유도체; 폴리에틸렌 글리콜; 실리콘; 벤토나이트; 실리카; 탈크; 산화 아연.
일 실시예로, 상기 요산 관련 질병은 고요산혈증, 급성 통풍성 관절염, 간헐기 통풍, 만성 결절성 통풍, 만성 신장 질환(Chronic Kidney Disease) 및 종양 용해 증후군(Tumor Lysis Syndrome; TLS)중 어느 하나일 수 있다.
본 명세서에서는 다음을 포함하는 요산 관련 질병 치료방법을 개시한다: 상기 약학적 조성물을 대상에 투여하는 것.
일 실시예로, 상기 투여 방법은 경구 투여, 비경구 투여, 정맥 내 투여, 정맥 점적 주입(intravenous infusion), 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여, 및 피하 투여 중 선택될 수 있다.
본 명세서에 개시된 상기 기술적 과제 및 그 해결방법에 따라, 요산산화효소-알부민 접합체가 제공된다. 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 야생형의 요산산화효소에 비해 반감기가 향상되고, 면역원성이 낮아지는 효과가 있어 효과적인 요산 관련 질병의 치료제로 사용할 수 있다.
도 1은 알부민-서브유닛 접합체를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2 내지 도 3은 요산산화효소-알부민 접합체의 예시를 모식적으로 나타낸 것이다. 도 2는 알부민 단백질 4개가 접합된 요산산화효소-알부민 접합체를 예시적으로 나타낸 모식도이고, 도 3은 알부민 단백질 3개가 접합된 요산산화효소-알부민 접합체를 예시적으로 나타낸 모식도이다.
도 4, 도 5, 도 6, 도 7, 및 도 8은 요산산화효소 변이체에 도입할 수 있는 비천연 아미노산의 예시를 나타낸 것이다.
도 9는 요산산화효소-링커 접합부 구조의 예시, 및 이와 관련된 비천연 아미노산의 예시를 나타낸 것이다. 달리 서술되지 않은 한, (1) 부분은 비천연 아미노산의 나머지 잔기 부분에 연결되고, (2) 부분은 앵커에 연결된 부분이다.
도 10은 앵커 구조의 예시를 나타낸 것이다. 달리 서술되지 않은 한, J1은 요산산화효소-링커 접합부, J2는 알부민-링커 접합부를 의미한다.
도 11은 알부민-링커 접합부 구조의 예시를 나타낸 것이다. 달리 서술되지 않은 한, (1) 부분은 알부민에 연결되고, (2) 부분은 앵커에 연결된 부분이다.
도 12은 링커 구조의 예시를 나타낸 것이다.
도 13는 AgUox-WT 및 AgUox-frTet의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다. (A) AgUox 변이체의 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue; CBB) 염색 결과로, Mw는 분자량 마커, BI는 유도 전, AI는 유도 후를 나타낸다. (B) 정제된 AgUox 변이체의 CBB 염색 단백질 겔을 나타낸다. (C) TCO-Cy3의 존재, 또는 부존재 하 배양된 AgUox 변이체의 형관 이미지 및 CBB 염색 단백질 겔을 나타낸다.
도 14는 AgUox-WT(A) 및 AgUox-frTet(B)의 트립신 분해 단편의 flight mass spectra를 나타낸 것이다. AgUox-WT 단편인 AgUox-WT 단편인 YNTVEVDFDAVYASVR(서열번호 78)의 질량을 AgUox-frTet 단편 YNTVXVDFDAVYASVR(서열번호 166, X는 frTet을 나타냄)의 질량과 비교한 것이다. 단편의 피크인 AVIETHPEIDEIKMSLPNK(서열번호 83)를 대조군으로 사용했다.
도 15는 MAL-HSA(MAL로 표시) 또는 APN-HSA(APN으로 표시)와 AgUox-frTet 반응 혼합물의 단백질 겔을 나타낸 것이다. Mw는 분자량 표준을 나타낸다.
도 16은 AgUox-frTet 및 MAL-HSA (도면 상단) 또는 APN-HSA (도면 하단)의 콘쥬게이트 혼합물 분획의 크기 배제 크로마토그램 및 단백질 겔을 나타낸다. 용출된 분획을 단백질 겔에 로딩한 후, Coomassie Brilliant Blue로 염색했다.
도 17은 AgUox-WT 및 AgUox-HSA 접합체의 약동학 분석(PK Profile) 결과를 나타낸 것이다. 잔류 AgUox-WT 및 AgUox-HSA 접합체의 혈청 활성은 초기 단계(0~84시간)와 후기(84~120시간)에서 측정되었다. te1/2 및 tl1/2는 각각 초기 및 후기의 혈청 반감기를 나타낸다.
도 18은 (a) frTet 결합을 위해 선택된 영역을 보여주는 AgUox의 결정 구조 (PDB 코드 : 2YZE), (b) frTet 결합 영역 및 frTet을 포함하는 해당 AgUox 변종을 표에 표시한 것이다.
도 19는 AgUox-frTet 변형의 발현 및 정제에 관한 도면으로, (a) AgUox-WT 및 AgUox-frTet (Ag1-14) 변형의 쿠마시 블루 염색 단백질 겔, 레인 : MW, 분자량 마커; BI, 유도 전; 유도 후 AI, (b) 정제 후 AgUox-WT 및 AgUox-frTet 변이체의 쿠마시 블루 염색 단백질 겔의 이미지를 나타낸 것이다.
도 20은 AgUox-WT 및 AgUox-frTet 변이체의 열 안정성 평가에 관한 것으로 (a) PBS에서 AgUox-WT 및 AgUox-frTet (Ag1-14) 변이체의 상대적 효소 활성은 0 및 120 시간에 모니터링한 것이다. 빨간색 선은 AgUox-WT의 50 % 효소 활성을 나타낸다. (b) 0, 120 및 240 시간에 모니터링한 AgUox-WT 및 5 개의 AgUox-frTet 변이체 (Ag1, 6, 8, 10 및 12)의 상대적 효소 활성을 나타낸 것으로, AgUox-frTet 변이체의 상대적 활성은 AgUox-WT의 효소 활성에 대해 정규화되었다.
도 21은 frTet을 AgUox에 결합하는 것으로, 형광 (조명 λex = 302 nm, Chemidoc XRS + 시스템에서 파장 510 및 610 nm) 및 TCO-Cy3와 AgUox-WT 또는 AgUox-frTet (Ag) 변이체의 반응 혼합물을 위한 쿠마시 블루 염색 단백질 겔을 나타낸 것이다.
도 22는 AgUox-HSA 접합체 변이체의 SDS-PAGE 분석 결과로. 단백질 겔은 쿠마시 블루 염색을 사용하여 이미징화하였다. 1은 Ag1 변이체의 AgUox-HSA, 2는 Ag6 변이체의 AgUox-HSA, 3은 Ag8 변이체의 AgUox-HSA, 4는 Ag10 변이체의 AgUox-HSA, 5는 Ag12 변이체의 AgUox-HSA를 나타낸다.
도 23은 HSA-결합된 Ag12 변이체 (Ag12-HSA)의 정제에 관한 도면으로, Ag12-HSA 결합체 혼합물의 크기 배제 크로마토 그래피 (오른쪽) 및 Ag12-HSA의 용출 분획 (F1-F3) (왼쪽)의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다. 단백질 겔은 단백질 밴드의 시각화를 위해 쿠마시 블루로 염색하였다.
도 24는 AgUox-WT, Ag12 및 Ag12-HSA의 상대적 효소 활성을 나타낸 것으로, 실험은 네 번 수행되었고, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 25는 마우스에서 AgUox-WT 및 Ag12-HSA의 약동학 연구에 관한 도면으로, 잔류 AgUox-WT 및 Ag12-HSA 결합체 샘플의 효소 활성은 15 분에 측정되었다. AgUox-WT의 경우 3, 6 및 12 시간에, Ag12-HSA의 경우 15 분 및 12, 24, 48 및 72 시간에 샘플을 BALB/c 암컷 마우스 (n=4)에 정맥 주사했다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 26은 AfUox-WT 및 AgUox-WT의 시간 경과에 따른 효소 활성에 관한 것으로, 효소 활성은 실험 방법 6에 기재된 대로 효소 활성 분석을 사용하여 확인하였다. AfUox-WT 및 AgUox-WT의 상대 활성은 AfUox-WT의 활성으로 정규화되었다.
도 27은 트립신으로 분해된 (a) Ag1, (b) Ag6, (c) Ag8, (d) Ag10 및 (e) Ag12의 MALDI-TOF MS(Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectra) 분석 결과를 나타낸 것으로, AgUox-WT가 대조군으로 사용되었다.
도 28은 요산산화효소 변이체 및 요산산화효소-알부민 접합체의 상대적인 효소 활성을 나타낸 그래프이다. 여기서, AgUox-WT는 Arthrobacter globiformis 유래 야생형 요산산화효소, AgUox-frTet은 실험예 1.3에 따라 제조된 요산산화효소 변이체, AgUox-MAL-HSA 및 AgUox-APN-HSA는 실험예 1.6에 따라 제조된 요산산화효소-알부민 접합체를 의미한다.
도 29는 실험예 1.6에 따라 제조된 요산산화효소-알부민 접합체에 대해 실험예 1.8에 따라 MALDI-TOF MS analysis를 수행한 결과이다. 왼쪽의 그래프는 AgUox-MAL-HSA에 대한 결과, 오른쪽의 그래프는 AgUox-APN-HSA에 대한 결과를 나타낸다.
도 30은 실험예 1.6에 따라 제조된 요산산화효소-알부민 접합체에 대해, 실험예 1.8에 따라 in vitro 안정성 테스트를 수행한 결과이다. 각 접합체의 샘플은 단백질 겔에 로드되었고, 쿠마씨 블루로 염색되었다. 여기서, AgUox-MAL-HSA 및 AgUox-APN-HSA는 실험예 1.5에서 제조된 각각의 요산산화효소-알부민 접합체를 의미한다.
도 2 내지 도 3은 요산산화효소-알부민 접합체의 예시를 모식적으로 나타낸 것이다. 도 2는 알부민 단백질 4개가 접합된 요산산화효소-알부민 접합체를 예시적으로 나타낸 모식도이고, 도 3은 알부민 단백질 3개가 접합된 요산산화효소-알부민 접합체를 예시적으로 나타낸 모식도이다.
도 4, 도 5, 도 6, 도 7, 및 도 8은 요산산화효소 변이체에 도입할 수 있는 비천연 아미노산의 예시를 나타낸 것이다.
도 9는 요산산화효소-링커 접합부 구조의 예시, 및 이와 관련된 비천연 아미노산의 예시를 나타낸 것이다. 달리 서술되지 않은 한, (1) 부분은 비천연 아미노산의 나머지 잔기 부분에 연결되고, (2) 부분은 앵커에 연결된 부분이다.
도 10은 앵커 구조의 예시를 나타낸 것이다. 달리 서술되지 않은 한, J1은 요산산화효소-링커 접합부, J2는 알부민-링커 접합부를 의미한다.
도 11은 알부민-링커 접합부 구조의 예시를 나타낸 것이다. 달리 서술되지 않은 한, (1) 부분은 알부민에 연결되고, (2) 부분은 앵커에 연결된 부분이다.
도 12은 링커 구조의 예시를 나타낸 것이다.
도 13는 AgUox-WT 및 AgUox-frTet의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다. (A) AgUox 변이체의 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue; CBB) 염색 결과로, Mw는 분자량 마커, BI는 유도 전, AI는 유도 후를 나타낸다. (B) 정제된 AgUox 변이체의 CBB 염색 단백질 겔을 나타낸다. (C) TCO-Cy3의 존재, 또는 부존재 하 배양된 AgUox 변이체의 형관 이미지 및 CBB 염색 단백질 겔을 나타낸다.
도 14는 AgUox-WT(A) 및 AgUox-frTet(B)의 트립신 분해 단편의 flight mass spectra를 나타낸 것이다. AgUox-WT 단편인 AgUox-WT 단편인 YNTVEVDFDAVYASVR(서열번호 78)의 질량을 AgUox-frTet 단편 YNTVXVDFDAVYASVR(서열번호 166, X는 frTet을 나타냄)의 질량과 비교한 것이다. 단편의 피크인 AVIETHPEIDEIKMSLPNK(서열번호 83)를 대조군으로 사용했다.
도 15는 MAL-HSA(MAL로 표시) 또는 APN-HSA(APN으로 표시)와 AgUox-frTet 반응 혼합물의 단백질 겔을 나타낸 것이다. Mw는 분자량 표준을 나타낸다.
도 16은 AgUox-frTet 및 MAL-HSA (도면 상단) 또는 APN-HSA (도면 하단)의 콘쥬게이트 혼합물 분획의 크기 배제 크로마토그램 및 단백질 겔을 나타낸다. 용출된 분획을 단백질 겔에 로딩한 후, Coomassie Brilliant Blue로 염색했다.
도 17은 AgUox-WT 및 AgUox-HSA 접합체의 약동학 분석(PK Profile) 결과를 나타낸 것이다. 잔류 AgUox-WT 및 AgUox-HSA 접합체의 혈청 활성은 초기 단계(0~84시간)와 후기(84~120시간)에서 측정되었다. te1/2 및 tl1/2는 각각 초기 및 후기의 혈청 반감기를 나타낸다.
도 18은 (a) frTet 결합을 위해 선택된 영역을 보여주는 AgUox의 결정 구조 (PDB 코드 : 2YZE), (b) frTet 결합 영역 및 frTet을 포함하는 해당 AgUox 변종을 표에 표시한 것이다.
도 19는 AgUox-frTet 변형의 발현 및 정제에 관한 도면으로, (a) AgUox-WT 및 AgUox-frTet (Ag1-14) 변형의 쿠마시 블루 염색 단백질 겔, 레인 : MW, 분자량 마커; BI, 유도 전; 유도 후 AI, (b) 정제 후 AgUox-WT 및 AgUox-frTet 변이체의 쿠마시 블루 염색 단백질 겔의 이미지를 나타낸 것이다.
도 20은 AgUox-WT 및 AgUox-frTet 변이체의 열 안정성 평가에 관한 것으로 (a) PBS에서 AgUox-WT 및 AgUox-frTet (Ag1-14) 변이체의 상대적 효소 활성은 0 및 120 시간에 모니터링한 것이다. 빨간색 선은 AgUox-WT의 50 % 효소 활성을 나타낸다. (b) 0, 120 및 240 시간에 모니터링한 AgUox-WT 및 5 개의 AgUox-frTet 변이체 (Ag1, 6, 8, 10 및 12)의 상대적 효소 활성을 나타낸 것으로, AgUox-frTet 변이체의 상대적 활성은 AgUox-WT의 효소 활성에 대해 정규화되었다.
도 21은 frTet을 AgUox에 결합하는 것으로, 형광 (조명 λex = 302 nm, Chemidoc XRS + 시스템에서 파장 510 및 610 nm) 및 TCO-Cy3와 AgUox-WT 또는 AgUox-frTet (Ag) 변이체의 반응 혼합물을 위한 쿠마시 블루 염색 단백질 겔을 나타낸 것이다.
도 22는 AgUox-HSA 접합체 변이체의 SDS-PAGE 분석 결과로. 단백질 겔은 쿠마시 블루 염색을 사용하여 이미징화하였다. 1은 Ag1 변이체의 AgUox-HSA, 2는 Ag6 변이체의 AgUox-HSA, 3은 Ag8 변이체의 AgUox-HSA, 4는 Ag10 변이체의 AgUox-HSA, 5는 Ag12 변이체의 AgUox-HSA를 나타낸다.
도 23은 HSA-결합된 Ag12 변이체 (Ag12-HSA)의 정제에 관한 도면으로, Ag12-HSA 결합체 혼합물의 크기 배제 크로마토 그래피 (오른쪽) 및 Ag12-HSA의 용출 분획 (F1-F3) (왼쪽)의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다. 단백질 겔은 단백질 밴드의 시각화를 위해 쿠마시 블루로 염색하였다.
도 24는 AgUox-WT, Ag12 및 Ag12-HSA의 상대적 효소 활성을 나타낸 것으로, 실험은 네 번 수행되었고, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 25는 마우스에서 AgUox-WT 및 Ag12-HSA의 약동학 연구에 관한 도면으로, 잔류 AgUox-WT 및 Ag12-HSA 결합체 샘플의 효소 활성은 15 분에 측정되었다. AgUox-WT의 경우 3, 6 및 12 시간에, Ag12-HSA의 경우 15 분 및 12, 24, 48 및 72 시간에 샘플을 BALB/c 암컷 마우스 (n=4)에 정맥 주사했다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 26은 AfUox-WT 및 AgUox-WT의 시간 경과에 따른 효소 활성에 관한 것으로, 효소 활성은 실험 방법 6에 기재된 대로 효소 활성 분석을 사용하여 확인하였다. AfUox-WT 및 AgUox-WT의 상대 활성은 AfUox-WT의 활성으로 정규화되었다.
도 27은 트립신으로 분해된 (a) Ag1, (b) Ag6, (c) Ag8, (d) Ag10 및 (e) Ag12의 MALDI-TOF MS(Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectra) 분석 결과를 나타낸 것으로, AgUox-WT가 대조군으로 사용되었다.
도 28은 요산산화효소 변이체 및 요산산화효소-알부민 접합체의 상대적인 효소 활성을 나타낸 그래프이다. 여기서, AgUox-WT는 Arthrobacter globiformis 유래 야생형 요산산화효소, AgUox-frTet은 실험예 1.3에 따라 제조된 요산산화효소 변이체, AgUox-MAL-HSA 및 AgUox-APN-HSA는 실험예 1.6에 따라 제조된 요산산화효소-알부민 접합체를 의미한다.
도 29는 실험예 1.6에 따라 제조된 요산산화효소-알부민 접합체에 대해 실험예 1.8에 따라 MALDI-TOF MS analysis를 수행한 결과이다. 왼쪽의 그래프는 AgUox-MAL-HSA에 대한 결과, 오른쪽의 그래프는 AgUox-APN-HSA에 대한 결과를 나타낸다.
도 30은 실험예 1.6에 따라 제조된 요산산화효소-알부민 접합체에 대해, 실험예 1.8에 따라 in vitro 안정성 테스트를 수행한 결과이다. 각 접합체의 샘플은 단백질 겔에 로드되었고, 쿠마씨 블루로 염색되었다. 여기서, AgUox-MAL-HSA 및 AgUox-APN-HSA는 실험예 1.5에서 제조된 각각의 요산산화효소-알부민 접합체를 의미한다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
용어의 정의
약
본 명세서에서 사용되는 "약"이라는 용어는 어떤 수량에 거의 가까운 정도를 의미하며, 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
클릭화학반응(Click chemistry)
본 명세서에서 사용되는 "클릭화학반응(Click chemistry)"은 두 개의 분자가 빠르고 안정적으로 공유 결합을 형성하도록 설계된 상보적인 화학작용기 및 화학반응을 설명하는 개념으로, Scripps Research Institute의 K. Barry Sharpless에 의해 도입되었다. 상기 클릭화학반응은 특정한 반응을 의미하는 것이 아니라, 빠르고 안정적인 반응의 개념을 의미한다. 클릭화학반응은 모듈화되고, 넓은 범위를 가지며, 높은 수율을 갖고, 부산물이 중대하지 않고, 입체특이적이며, 생리학적으로 안정하고, 열역학적으로 큰 원동력을 가지며 (예를 들어, 84kJ/mol 이상), 높은 원자 경제성을 가진다는 특징이 있다. 클릭화학반응의 예시로, 1) 휴이스겐 1,3-이극성 고리화첨가 (Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition; Tornoe et al. Journal of Organic Chemistry (2002) 67: 3075-3064 등 참조), 2) 디엘스-알더 반응 (Diels-Alder reaction), 3) 에폭사이드 (epoxide) 및 아지리딘 (aziridine)과 같은 작은 스트레인된 고리 (strained ring)에 대한 친핵성 첨가 반응 (Nucleophilic addition), 4) 활성화된 카르보닐기 (activated carbonyl group)에 대한 친핵성 첨가 반응, 및 5) 탄소-탄소 이중결합 또는 삼중결합에 대한 첨가 반응이 있다. 상기 클릭화학반응의 의미는 문맥에 따라 적절해 해석되어야 하며, 그 외 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함한다.
생물직교반응(Bioorthogonal reaction)
본 명세서에서 사용되는 "생물직교반응(Bioorthogonal reaction)은 생체 내 고유 분자와는 반응이 일어나지 않으면서, 외부에서 투입된 잔기끼리 선택적으로 반응하는 것을 의미한다. 어떤 반응이"생물직교적(Bioorthogonal)"인 경우, 상기 반응, 또는 반응 산물에 생체 내 고유 분자가 관여하지 않으므로, 체내에서 매우 안정하다는 특성을 가진다.
표준 아미노산(standard amino acid)
본 명세서에서 사용되는 "표준 아미노산(standard amino acid)"이라는 용어는 유기체(organism)의 체내에서 유전자의 전사 및 번역 과정을 통해 합성되는 20종의 아미노산을 통틀어 의미한다. 구체적으로, 상기 표준 아미노산은 알라닌(Alanine; Ala, A), 아르기닌(Arginine; Arg, R), 아스파라긴(Asparagine; Asn, N), 아스파르트산(Aspartic acid; Asp, D), 시스테인(Cysteine; Cys, C), 글루탐산(Glutamic acid; Glu, E), 글루타민(Glutamine; Gln, Q), 글리신(Glycine; Gly, G), 히스티딘(Histidine; His, H), 이소류신(Isoleucine; Ile, I), 류신(Leucine; Leu, L), 리신(Lysine; Lys K), 메티오닌(Methionine; Met, M), 페닐알라닌(Phenylalanine; Phe, F), 프롤린(Proline; Pro, P), 세린(Serine; Ser, S), 트레오닌(Threonine; Thr, T), 트립토판(Tryptophan; Trp, W), 티로신(Tyrosine; Tyr, Y), 및 발린(Valine; Val, V)을 포함한다. 상기 표준 아미노산 각각은 모두 대응하는 DNA 코돈이 존재하며, 일반적인 아미노산 일문자 또는 세문자 표기법으로 나타낼 수 있다. 상기 표준 아미노산이라는 용어가 지칭하는 대상은 문맥에 따라 적절하게 해석되어야 하며, 그 외 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함한다.
비천연 아미노산(nonnatural amino acid)
본 명세서에서 사용되는 "비천연 아미노산(nonnatural amino acid)"이라는 용어는, 체내에서 합성되지 않고 인공적으로 합성한 아미노산을 지칭한다. 상기 비천연 아미노산은 예들 들어, 4-(1,2,3,4-tetrazin-3-yl) phenylalanine, 및 4-(6-methyl-s-tetrazin-3-yl)phenylalanine 등이 있다. 상기 비천연 아미노산은 이에 대응하는 DNA 코돈이 존재하지 않으며, 일반적인 아미노산 일문자 또는 세문자 표기법으로 나타낼 수 없으므로, 다른 문자를 사용하여 표기하며, 추가적으로 보충하여 설명한다. 상기 비천연 아미노산이라는 용어가 지칭하는 대상은 문맥에 따라 적절하게 해석되어야 하며, 그 외 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함한다.
펩타이드 서열 기재
달리 서술하지 않는 한, 본 명세서에서 펩타이드의 서열을 기재할 때는 아미노산 일문자 표기법, 또는 세문자 표기법을 사용하여, N-터미널에서 C-터미널 방향으로 기재한다. 예를 들어, RNVP로 표기하는 경우, N-터미널에서 C-터미널 방향으로 아르기닌(arginine), 아스파라긴(asparagine), 발린(valine), 및 프롤린(proline)이 차례로 연결된 펩타이드를 의미한다. 또 다른 예를 들어, Thr-Leu-Lys로 표기하는 경우, N-터미널에서 C-터미널 방향으로 트레오닌(Threonine), 류신(Leucine), 및 리신(Lysine)이 차례로 연결된 펩타이드를 의미한다. 상기 일문자 표기법, 또는 세문자 표기법으로 나타낼 수 없는 아미노산의 경우, 다른 문자를 사용하여 표기하며, 추가적으로 보충하여 설명한다.
면역원성(immunogenicity)
본 명세서에서 사용되는 "면역원성"이라는 용어는, 사전적으로 "면역 반응을 일으킬 수 있는 항원으로 작용하는 성질"을 의미한다. 특정 항원의 면역원성을 측정하기 위한 다양한 방법들이 있고, 상기 방법은 그 목적에 따라 적절히 채택되거나, 설계될 수 있다. 예를 들어, 1) 상기 항원을 대상의 체내에 투여하는 경우, 대상의 체내에서 IgG, IgA, 및/또는 IgE 타입의 항체가 생성되는지 여부를 확인하는 방법, 2) 투여 주기에 따라, 상기 IgG, IgA, 및/또는 IgE 타입의 항체가 생성되는 시기를 확인하는 방법, 3) 상기 유도된 항체의 상기 항원에 대한 역가를 확인하는 방법, 4) 상기 유도된 항체의 작용기작이 밝혀진 경우, 상기 작용기작에 따른 효과를 측정하는 방법이 있을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 면역원성이라는 용어가 지칭하는 대상은 문맥에 따라 적절하게 해석되어야 하며, 그 외 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함한다.
요산산화효소의 통풍치료기전
통풍의 원인
통풍 관절염은 혈중 요산 농도가 정상범위에 비해 높은 증상인 고요산혈증에 의해 이차적으로 발생하는 요산염결정(monosodium urate monohydrate crystals; MSU)에 대한 염증반응으로 발생한다. 통풍은 간과 소장에서의 요산의 과잉생산 및/또는 요산의 배설 감소가 원인이 되어, 체내에 요산이 축적되어 발병한다. 통풍은 일반적으로 고요산혈증에서 출발하여 급성 통풍성 관절염을 겪은 후, 간헐기 통풍을 거쳐 만성 결절성 통풍으로 진행되게 된다.
요산산화효소의 통풍치료기전
요산산화효소(Urate oxidase; Uricase)는 인간을 비롯한 영장류는 자체 합성이 불가능한 효소의 일종으로, 요산을 알란토인(Allantoin)으로 분해하는 기능을 한다. 상기 알란토인은 요산에 비해 용해도가 5배 내지 10배 높아 신장으로 배설되기 쉽다는 특징이 있다. 따라서, 요산산화효소를 치료제로 사용하는 경우, 통풍 발생의 주 원인인 요산 축적을 방지하고, 요산을 체외로 배설시킴으로써 통풍을 치료할 수 있다.
요산산화효소의 통풍 치료제로서의 한계점
상기 요산산화효소는 통풍 발생의 주 원인인 요산을 배설가능한 형태로 분해하는 직접적인 치료기전을 가지며, 따라서 강력한 요산 강하 효과가 있다는 장점이 있다. 하지만, 상기 요산산화효소는 단백질 약물로써 1) 체내 반감기가 짧아 주사제로만 사용이 가능하고, 2) 외부 유래 단백질이기 때문에 체내에 투여되는 경우 면역반응이 발생하고, 이로 인한 부작용이 발생한다는 단점이 있어 통풍 치료제로 사용되는 데 제한이 있다.
알부미네이션 (albumination)
치료용 단백질
치료용 단백질은 다양한 질병의 치료에 효과가 있음이 보고되어 왔으며, 제약분야의 중요한 성장 동기 중 하나이다. 하지만, 치료용 단백질은 환자 체내에서 사구체의 여과(glomerular filtration), 세포흡수작용(pinocytosis), 및 면역반응에 의해 지속적으로 제거된다는 문제점이 있다. 따라서, 치료용 단백질의 개발 시 상기 현상으로 인해 환자 체내에서 제거되는 속도를 완화시켜 약효의 지속시간을 연장시키는 것이 매우 중요하다.
알부미네이션
인간 혈청 알부민은 혈청에서 2주 이상의 긴 반감기를 가진다. 이는, 1) 알부민 분자의 정전기적 반발력(electrostatic repulsion)으로 인해 사구체에서 쉽게 여과되지 않으며, 2) 내피세포(endothelium)의 neonatal Fc receptor (FcRn)에 의해 매개되는 재순환 작용으로 인해 체내에서 분해되는 주기가 길기 때문이다. 이러한 알부민을 화학적으로, 또는 물리적으로 약물 분자 (예를 들어, 치료용 단백질, 또는 화합물 등)에 결합시키는 경우, 상기 약물 분자의 반감기를 증가시킬 수 있는데, 이러한 기술을 알부미네이션(albumination)이라 한다.
종래기술의 한계점
시판 요산산화효소 기반 약물의 한계점
현재 시판 중인 요산산화효소 기반 약물 (KRYSTEXXA; pegloticase)은 상기 요산산화효소의 한계점인 짧은 반감기를 개선하기 위하여, 요산산화효소에 무작위로 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol; PEG)을 결합시켜 사용한다. 하지만, 1) 상기 요산산화효소가 무작위로 페길레이션(pegylation)됨에 따라 효소의 활성 부위를 가로막아 효능이 떨어지고, 2) 상기 PEG가 체내에서 알러지 반응을 일으키는 부작용이 있다는 한계점이 있다.
종래 요산산화효소-알부민 접합체 기술의 한계점
본 발명자는 종래 선행문헌 등록공보 KR 1637010 B1에서 요산산화효소-알부민 접합체를 개시한 바 있다. 상기 선행문헌에서 개시된 요산산화효소-알부민 접합체는 상기 요산산화효소의 하나 이상의 아미노산을 비천연 아미노산인 AzF(p-Azido-L-phenylalanine)로 치환하고, 디벤조시클로옥틴(dibenzocyclooctyne; DBCO) 반응기를 가진 링커를 사용하여 요산산화효소 및 알부민을 링커를 통해 접합시킨 것이다. 하지만, 상기 선행문헌에서 개시된 요산산화효소-알부민 접합체는, 접합부의 AzF 및 DBCO의 결합 반응인 스트레인 유도 고리화첨가 반응 (Strain-Promoted cycloaddition; SPAAC)의 속도가 느려 수율이 매우 낮다는 문제점이 있다. 따라서, 상기 선행문헌에서 개시된 요산산화효소-알부민 접합체는, 요산산화효소 내 알부민이 접합할 수 있는 부위가 적어도 네 군데 있음에도 불구하고, SPAAC 반응의 비효율성 때문에 요산산화효소 한 단위 당 한개 내지 두개의 알부민이 접합된 요산산화효소-알부민 접합체 밖에 수득할 수 없다는 한계점이 있다. 상기한 한계점으로 인해, 선행문헌에 개시된 요산산화효소-알부민 접합체는 1) 알부민 접합으로 인한 반감기 증대 또는 면역원성 감소 효과가 제한적이고, 2) 알부민이 접합되지 않은 AzF의 잔기가 노출되어 체내에서 의도하지 않은 반응을 일으킬 수 있다는 문제점이 있다.
요산산화효소-알부민 접합체(conjugate)
요산산화효소-알부민 접합체 개괄
본 명세서는 요산산화효소-알부민 접합체(conjugate)를 개시한다. 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체 및 알부민이 링커를 통해 연결된 것이다. 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 상기 요산산화효소 변이체에 3개 이상의 알부민이 링커를 통해 접합된 것을 특징으로 한다. 상기 요산산화효소 변이체는 야생형의 요산산화효소 서열에서 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것으로, 상기 비천연 아미노산의 잔기를 통해 링커 및 알부민이 연결된다. 구체적으로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체; 요산산화효소 변이체 및 링커가 접합하여 형성된 요산산화효소-링커 접합부; 링커 내에 포함된 앵커; 알부민 및 링커가 접합하여 형성된 알부민-링커 접합부; 및 알부민을 포함한다. 이하 각 구성요소(요산산화효소 변이체, 알부민, 링커) 및 상기 구성요소가 접합된 결과인 요산산화효소-알부민 접합체의 구조를 더 구체적으로 설명한다.
요산산화효소-알부민 접합체 구성요소 1 - 요산산화효소 변이체
요산산화효소는 체내에서 요산을 알란토인(Allantoin)으로 분해하는 기능을 가지는 효소로, 요산이 축적되어 발생하는 각종 질병이나 질환을 치료하는 용도로 사용할 수 있다. 상기 요산산화효소는 요산산화효소 서브유닛 4개가 올리고머화(oligomerization)되어 형성된 사합체(tetramer)이다. 본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체를 포함하는데, 이는 야생형의 요산산화효소 서열에서 하나 이상의 아미노산을 비천연 아미노산(unnatural amino acid)으로 치환한 것이다. 구체적으로, 상기 요산산화효소 변이체는 사합체 단백질로서, 네 개의 서브유닛 중 세 개 또는 네 개가 요산산화효소 변이체 서브유닛이며, 이때, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛의 서열은 야생형 요산산화효소 서브유닛 서열과 비교해 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것이다. 야생형 요산산화효소에 비천연 아미노산을 삽입하여 요산산화효소 변이체를 만드는 목적은, 상기 비천연 아미노산의 잔기 및 링커를 역 전자-요구 디엘스 엘더 반응(Inverse Electron-Demand Diels-Alder reaction; IEDDA 반응)을 이용하여 연결시키기 위함이다.
요산산화효소-알부민 접합체 구성요소 2 - 알부민
상기 알부민은 인간 혈청 알부민 및/또는 인간 혈청 알부민의 변이체를 지칭하며, 상기 요산산화효소 변이체에 대한 약물전달체 역할을 한다. 상기 알부민은 상기 요산산화효소 변이체가 단독으로 있을 때와 비교하여, 상기 요산산화효소-알부민 접합체가 향상된 체내 반감기 및 낮은 면역원성을 나타내도록 한다.
요산산화효소-알부민 접합체 구성요소 3 - 링커
상기 링커는 상기 요산산화효소 변이체 및 상기 알부민을 연결시키기 위한 것으로, 요산산화효소 변이체와 결합할 수 있는 IEDDA 반응기, 알부민과 결합할 수 있는 티올 반응기, 및 앵커를 포함한다. 상기 요산산화효소-알부민 접합체에서 상기 IEDDA 반응기 및 상기 티올 반응기는 각각 상기 요산산화효소 변이체 및 상기 알부민과 결합하여 있으므로, 링커에 포함된 원형 그대로 있지 않고 요산산화효소-링커 접합부 및 알부민-링커 접합부로 변형되어 있다.
요산산화효소-알부민 접합체 구조 1 - 서브유닛-알부민 접합체
본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체에 포함된 요산산화효소 변이체는 네 개의 서브유닛이 올리고머화되어 형성 된 사량체이며, 상기 서브유닛 중 3개 이상은 링커를 통해 알부민과 접합되어 있는 것을 특징으로 한다. 상기 요산산화효소 변이체를 이루는 서브유닛 중 링커를 통해 알부민과 접합되어 있는 것을 서브유닛-알부민 접합체라 한다. 상기 요산산화효소-알부민 접합체에 포함된 상기 요산산화효소 변이체는 세 개 이상의 요산산화효소 변이체 서브유닛을 포함한다. 이때, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛 일부 또는 전부는 알부민과 접합된 서브유닛-알부민 접합체이다.
요산산화효소-알부민 접합체 구조 2 - 요산산화효소-링커 접합부
본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체와 알부민이 링커를 통해 접합된 것이다. 이때, 상기 요산산화효소 변이체와 링커가 접합된 부분을 요산산화효소-링커 접합부라 한다. 상기 요산산화효소 변이체와 링커는 IEDDA 반응을 통해 접합된 것을 특징으로 한다.
요산산화효소-알부민 접합체 구조 3 - 알부민-링커 접합부
본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체와 알부민이 링커를 통해 접합된 것이다. 이때, 상기 알부민과 링커가 접합된 부분을 알부민-링커 접합부라 한다.
요산산화효소-알부민 접합체 구조 4 - 앵커
상기 링커는 상기 요산산화효소 변이체와 접합될 수 있는 IEDDA 반응기, 및 알부민과 접합될 수 있는 티올 반응기를 포함하며, 이를 하나로 연결하는 앵커를 포함한다. 상기 앵커는 요산산화효소와 알부민을 연결시키는 반응에 관여하지 않는 부분이므로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체 내에서, 링커에 포함된 구조 그대로 남아 있는 것이 특징이다.
요산산화효소-알부민 접합체 구조 예시 1 - 요산산화효소 관점
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 다음 [화학식 1]로 표현된다:
[화학식 1] Uox-[J1-A-J2-HSA]n
이때, 상기 Uox는 요산산화효소 변이체,
상기 J1은 요산산화효소-링커 접합부,
상기 A는 앵커,
상기 J2는 알부민-링커 접합부,
상기 HSA는 인간 혈청 알부민 (Human Serum Albumin)을 의미하며,
상기 n은 3 또는 4이다.
요산산화효소-알부민 접합체 구조 예시 2 - 요산산화효소 서브유닛 관점
일 구현예로, 상기 서브유닛-알부민 접합체는 다음 [화학식 2]로 표현된다:
[화학식 2] p'-J1-A-J2-HSA
이때, 상기 p'은 요산산화효소 변이체 서브유닛이며, 나머지는 위에서 정의된 바와 같다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 1개의 야생형 요산산화효소 서브유닛 및 3개의 서브유닛-알부민 접합체를 포함한다. 구체적으로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체에서, 상기 야생형 요산산화효소 서브유닛 1개 및 상기 각각의 서브유닛-알부민 접합체에 포함된 요산산화효소 변이체 서브유닛 3개가 올리고머화하여 사량체를 이룬다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 1개의 요산산화효소 변이체 서브유닛 및 3개의 서브유닛-알부민 접합체를 포함한다. 구체적으로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체에서, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛 1개 및 상기 각각의 서브유닛-알부민 접합체에 포함된 요산산화효소 변이체 서브유닛 3개가 올리고머화하여 사량체를 이룬다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 4개의 서브유닛-알부민 접합체를 포함한다. 구체적으로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체에서, 상기 각각의 서브유닛-알부민 접합체에 포함된 요산산화효소 변이체 서브유닛 4개가 올리고머화하여 사량체를 이룬다.
요산산화효소-알부민 접합체 특징 1 -
Arthrobacter globiformis
유래 요산산화효소 기반
본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체는 특히, Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소 기반의 요산산화효소 변이체를 사용하는 것이 특징이다. 상기 Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소는 1) 체내에서 타 미생물 유래 요산산화효소에 비해 더 높은 활성을 나타내고, 2) 높은 용해도로 인해 발현 및 정제가 수월하며, 3) 체내에서 낮은 면역원성을 나타내고, 4) 높은 열 안정성을 보인다. 따라서, 본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체의 효능이 타 미생물 유래 요산산화효소를 사용하는 것 대비 여러 면에서 효과가 뛰어나다는 장점이 있다.
요산산화효소-알부민 접합체 특징 2 - 알부민 접합을 통한 반감기 증대 효과
전술한 바, 약물 분자에 알부민을 결합시키는 경우, 체내 반감기가 증대되는 효과가 있다. 본 명세서에서 제공하는 요산산화효소-알부민 접합체는 치료용 단백질인 요산산화효소에 알부민을 접합시킴으로써, 체내 반감기가 증대되었다는 특징이 있다. 향상된 체내 반감기는 상기 요산산화효소-알부민 접합체를 체내에 투여한 후, 약동학적 평가(Pharmacokinetics profile) 실험을 통해 확인할 수 있으며, 실험예 4에서 확인할 수 있다.
요산산화효소-알부민 접합체 특징 3 - 요산산화효소의 활성을 저해하지 않음
선행기술의 한계점 중 하나는, 요산산화효소에 약물전달체, 예를 들어, 알부민, 또는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG) 등을 결합시켜 효능의 증대를 꾀했지만, 이러한 약물전달체가 입체구조 상 요산산화효소의 활성 부위를 가로막는 등 활성을 저해하고, 그 결과 약효가 감소된다는 것이다. 본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소의 활성을 저해하지 않는 부분에 알부민을 위치-특이적으로 결합시킴으로써, 약효를 감소시키지 않는다는 특징이 있다.
요산산화효소-알부민 접합체 특징 4 - 면역원성 감소 효과
인간은 요산산화효소를 생산하지 않는 것으로 알려져 있으며, 치료용으로 주로 사용하는 요산산화효소는 미생물 유래의 효소이다. 이러한 요산산화효소는 미생물 유래의 외래단백질이므로 체내에 단독으로 투여되는 경우 면역반응을 일으켜 부작용이 나타난다. 따라서, 상기 요산산화효소의 면역원성을 줄이는 것이 중요한 과제이다. 본 명세서에서 개시하는 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 상기 요산산화효소를 인체 혈장 단백질인 알부민과 접합시켜 요산산화효소의 면역원성을 감소시켰다는 특징이 있다. 상기 알부민은 혈장 단백질의 대부분을 구성하는 물질로, 인체 내에서 매우 안정하며 면역원성을 거의 나타내지 않는다. 따라서, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 단독으로 체내에 투여될 때에 비해 현저히 낮은 면역원성을 나타낸다.
요산산화효소-알부민 접합체 특징 5 - 요산산화효소에 3개, 혹은 4개의 알부민을 포함
종래 요산산화효소-알부민 접합체 기술은 요산산화효소 변이체 및 알부민을 Strain-Promoted Alkyne-Azide Cycloaddition reaction (SPAAC 반응)을 통해 연결했다. 상기 SPAAC 반응은 그 속도가 상대적으로 느리고, 수율이 낮아 상기 요산산화효소 변이체에 1개 또는 2개의 알부민이 결합된 요산산화효소-알부민 접합체를 제공할 수 밖에 없다는 한계점이 있다. 본 명세서에서 제공하는 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체 및 알부민을 반응 속도가 상대적으로 빠르고, 수율이 매우 높은 IEDDA 반응을 통해 연결시킴으로써, 하나의 요산산화효소 변이체에 3개 이상의 알부민이 결합되어 있는 것이 특징이다. 상기 특징으로 인해, 1) 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 반감기 증대 효과 및 면역원성 감소 효과가 극대화될 수 있으며, 2) 비천연 아미노산의 잔기가 노출되는 일이 최소화 되므로, 이로 인한 부작용이 최소화된다는 장점이 있다.
요산산화효소 변이체
요산산화효소 변이체 개괄
본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체에 포함된 요산산화효소 변이체는 미생물 유래의 야생형 요산산화효소의 아미노산 서열 일부가 변형된 것을 특징으로 한다. 상기 요산산화효소 변이체는 3개 이상의 비천연 아미노산을 포함하며, 각각의 비천연 아미노산 잔기를 통해 위치-특이적으로 알부민과 접합될 수 있다. 구체적으로, 상기 요산산화효소 변이체는 요산산화효소 변이체 서브유닛 4개가 올리고머화 되어 형성된 사합체이며, 각각의 요산산화효소 변이체 서브유닛은 야생형 요산산화효소 서브유닛과 비교해 그 서열 내 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 한다.
야생형 요산산화효소의 유래 미생물
본 명세서에서 제공하는 상기 요산산화효소 변이체의 원형이 되는 야생형 요산산화효소는 Arthrobacter globiformis에서 유래된 것이다.
야생형 요산산화효소의 예시서열
상기 야생형 요산산화효소는 동일한 4개의 야생형 요산산화효소 서브유닛이 올리고머화된 사량체(tetramer) 단백질이다.
일 구현예로, 상기 야생형 요산산화효소의 서브유닛의 펩타이드 서열은 N말단에서 C말단 방향으로, MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC(서열번호 1)일 수 있다.
요산산화효소 변이체 서브유닛
상기 야생형 요산산화효소와 마찬가지로, 상기 요산산화효소 변이체도 4개의 서브유닛을 포함하는 사량체 단백질이다. 상기 요산산화효소 변이체는 3개 또는 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛을 포함하며, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 그 원형이 되는 야행성 요산산화효소 서브유닛에서 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 한다. 일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체는 3개의 요산산화효소 변이체 서브유닛, 및 1개의 야생형 요산산화효소 서브유닛을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체는 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛을 포함할 수 있다. 이하 "요산산화효소 변이체 서브유닛" 단락에서 더 구체적으로 설명한다.
요산산화효소 변이체 제조방법
본 명세서에서는 상기 요산산화효소 변이체를 제조하는 방법을 개시한다. 상기 요산산화효소 변이체는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는데, 자연계에서는 비천연 아미노산에 대응되는 핵산 코돈이 존재하지 않는다. 이러한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 세포 내에서 생합성하기 위해서는 상기한 비천연 아미노산에 대응하는 핵산 코돈이 없다는 문제를 해결해야 한다. 자연계에서 이용되는 종결 코돈 3종은 아미노산을 암호화하지 않음을 이용하여, 이러한 문제를 효과적으로 해결한 방법이 선행문헌 KR 1637010 B1 등에 개시되어 있다. 상기 요산산화효소 변이체를 제조하는 방법은 상기 선행문헌 KR 1637010 B1에 나온 방법을 참조하며, 1) 종결 코돈을 인식하여 비천연 아미노산을 서열 내에 도입하는 기능을 가지는 직교적 tRNA/합성효소 페어, 및 2) 상기 요산산화효소 변이체의 서열 중 비천연 아미노산 자리를 종결 코돈으로 암호화한 핵산을 사용한다. 이하 "요산산화효소 변이체 제조방법" 단락에서 더 구체적으로 설명한다.
요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터
본 명세서에서는 상기 요산산화효소 변이체 합성 방법에 사용되는 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터를 개시한다. 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터는 야생형 요산산화효소를 암호화하는 핵산 서열 중, 비천연 아미노산으로 치환하고자 하는 위치의 핵산 코돈이 종결 코돈으로 변경된 것을 특징으로 한다. 이하 "요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터" 단락에서 더 구체적으로 설명한다.
요산산화효소 변이체 서브유닛
요산산화효소 변이체 서브유닛 1 - 비천연 아미노산 치환
상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하며, 상기 비천연 아미노산은 링커와 IEDDA 반응을 통해 결합할 수 있는 작용기를 가지는 것을 특징으로 한다. 일 구현예로, 상기 비천연 아미노산은 IEDDA 반응을 일으킬 수 있는 디엔 작용기(Dien functional group)를 포함하는 아미노산일 수 있다. 구체적으로, 상기 디엔 작용기는 테트라진 작용기(tetrazine functional group) 또는 그 유도체, 및/또는 트리아진 작용기(triazine functional group) 또는 그 유도체일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 비천연 아미노산은 4-(1,2,3,4-tetrazin-3-yl) phenylalanine (frTet), 4-(6-methyl-s-tetrazin-3-yl)phenylalanine (Tet-v2.0), 3-(4-(1,2,4-triazin-6-yl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-(2-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)ethyl)phenyl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(6-phenyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)propanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)amino)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 3-(4-(2-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)ethyl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)thio)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-((6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)thio)phenyl)propanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)oxy)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-((6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)oxy)phenyl)propanoic acid, 3-(4'-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4'-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(6-(6-(pyridin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)pyridin-3-yl)propanoic acid, 3-(4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 및 2-amino-3-(4-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)propanoic acid 로 이뤄진 군에서 선택된 것일 수 있다.
요산산화효소 변이체 서브유닛 2 - 비천연 아미노산 예시
일 구현예로, 상기 비천연 아미노산은 다음 중 선택된 것일 수 있다:
요산산화효소 변이체 서브유닛 3 - 치환 위치
야생형 요산산화효소에 비천연 아미노산을 삽입해 요산산화효소 변이체를 만들 때, 본래 요산산화효소의 구조와 기능에는 가능한 한 영향을 미치지 않아야 하므로, 요산산화효소의 활성 및 구조에 있어 중요한 역할을 하는 아미노산을 비천연 아미노산으로 치환할 수는 없다. 또한, 상기 비천연 아미노산은 요산산화효소-알부민 접합체 제조 과정에서 링커와 결합해야 하기 때문에, 요산산화효소의 입체 구조 상 상대적으로 용매 접근성이 높은 위치의 아미노산을 치환하는 것이 유리하다. 야생형 요산산화효소의 구조와 기능에 미치는 영향은 최소화하면서, 용매접근성이 높은 자리를 선별하기 위해 다양한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 분자 모델링 계산을 통해 야생형 요산산화효소 고유의 원자 에너지와 유사하면서도, 용매 접근성은 높은 후보 위치를 선별할 수 있다.
일 구현예로, 요산산화효소 변이체를 만들기 위해 상기 야생형 요산산화효소 서열 중 비천연 아미노산으로 치환하는 위치는 분자 모델링 시뮬레이션 결과를 참조하여 결정할 수 있다. 구체적으로, 상기 분자 모델링 시뮬레이션 결과는 Rosetta 분자 모델링 패키지의 스코어링 결과일 수 있다.
요산산화효소 변이체 서브유닛 4 - 치환 위치 예시
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1의 펩타이드 서열의 80번째 아스파르트산, 82번째 페닐알라닌, 100번째 페닐알라닌, 101번째 아스파르트산, 114번째 페닐알라닌, 119번째 아스파라긴, 120번째 아스파르트산, 142번째 세린, 143번째 글루탐산, 175번째 글리신, 195번째 발린, 196번째 글루탐산, 218번째 히스티딘, 238번째 프롤린 중 선택된 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
요산산화효소 변이체 서브유닛 5 - 예시서열
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체가 Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소의 서열 일부를 변형시킨 것인 경우, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 2 내지 서열번호 15의 아미노산 서열로 표현될 수 있다. 이때, 서열 내의 X는 4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl) phenylalanine (frTet), 4-(6-methyl-s-tetrazin-3-yl)phenylalanine (Tet-v2.0), 3-(4-(1,2,4-triazin-6-yl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-(2-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)ethyl)phenyl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(6-phenyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)propanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)amino)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 3-(4-(2-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)ethyl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)thio)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-((6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)thio)phenyl)propanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)oxy)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-((6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)oxy)phenyl)propanoic acid, 3-(4'-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4'-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(6-(6-(pyridin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)pyridin-3-yl)propanoic acid, 3-(4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 및 2-amino-3-(4-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)propanoic acid 로 이뤄진 군에서 선택된 것이다.
요산산화효소 변이체 서브유닛 6 - 예시서열과 유사한 서열 포함
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 2 내지 서열번호 15 중 선택된 서열과 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치하는 서열을 가질 수 있다. 일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 2 내지 서열번호 15 중 선택된 서열과 바로 이전 문장에서 선택된 수치범위 내 일치하는 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 2 내지 서열번호 15 중 선택된 서열과 80% 내지 100% 일치하는 서열을 가질 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 2 내지 서열번호 15 중 선택된 서열과 95% 이상 일치하는 서열을 가질 수 있다.
요산산화효소 변이체의 제조방법
요산산화효소 변이체의 제조방법 개괄
본 명세서에서는 요산산화효소 변이체의 제조방법을 개시한다. 상기 요산산화효소 변이체의 제조방법에는 다음 구성 요소가 관여된다: 요산산화효소 변이체를 발현시킬 세포주; 특정 종결 코돈을 인식하는 외래 유래 suppressor tRNA(foreign suppressor tRNA); 외래 유래 tRNA 합성효소(foreign tRNA synthetase); 및 상기 종결코돈을 이용하여 비천연 아미노산을 암호화한, 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터. 여기서, 상기 외래 유래 suppressor tRNA 및 상기 외래 유래 tRNA 합성효소는, 상기 발현 세포주 고유의 suppressor tRNA 및 tRNA 합성효소가 아니라, 발현 세포주와 다른 세포에서 유래된 것이다. 따라서, 상기 외래 유래 suppressor tRNA는 상기 발현 세포주 고유의 tRNA 합성효소와 반응하지 않는 것을 특징으로 한다. 상기 외래 유래 tRNA 합성효소는, i) 상기 외래 유래 suppressor tRNA와만 반응하며, ii) 상기 요산산화효소 변이체에 포함시킬 비천연 아미노산에만 활성을 보인다. 결과적으로, 상기 외래 유래 tRNA 합성효소를 사용하는 경우, 상기 외래 유래 suppressor tRNA에 상기 비천연 아미노산을 특이적으로 연결시켜 펩타이드 서열 내 상기 비천연 아미노산을 도입할 수 있다.
상기 요산산화효소 변이체의 제조방법은 1) 상기 세포주 내에서, 2) 상기 외래 유래 suppressor tRNA 및 외래 유래 tRNA 합성효소가 관여되어, 3) 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터에 기반해, 4) 상기 요산산화효소 변이체가 발현되도록 하는 방법이다. 상기 요산산화효소 변이체 제조방법에서, 상기 세포주 내 상기 요산산화효소 변이체가 발현될 수 있다면 각 과정의 순서는 특별히 제한되지 않으며, 필요에 따라 추가적인 과정을 포함할 수 있다.
요산산화효소 변이체 발현 세포주
상기 요산산화효소 변이체의 제조방법은 상기 요산산화효소 변이체를 세포주 내에서 발현시켜 수득하는 것을 특징으로 한다. 상기 요산산화효소 변이체 발현 세포주는 상기 요산산화효소 변이체를 생산할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 다만, 상기 세포주 내 종결 코돈을 인식하는 release facotr가 제 기능을 하는 경우, 상기 release factor가 상기 외래 유래 tRNA와 경쟁적으로 작용하게 되어 수율이 떨어지는 문제가 있다. 따라서, 종결 코돈을 인식하는 release facotr가 비활성화 된 세포주를 사용하는 것이 바람직하다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체를 발현시키는 세포주는 다음에서 선택된 것일 수 있다:
에스케리키아 (Escherichia) 속; 어위니아 (Erwinia) 속; 세라티아 (Serratia) 속; 프로비덴시아 (Providencia) 속; 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속; 슈도모나스 (Pseudomonas) 속; 렙토스피라 (Leptospira) 속; 살모넬라 (Salmonellar) 속; 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속; 하이포모나스 (Hyphomonas) 속; 크로모박테리움 (chromobactorium) 속; 노카디아 (norcardia) 속; 펀자이류 (Fungi); 및 효모류 (Yeast).
일 구현예로, 상기 세포주는 종결 코돈을 인식하여 번역을 종결시키는 release factor가 비활성화 된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 종결 코돈은 엠버 코돈(ambber codon; 5'-UAG-3'), 오커 코돈(ocher codon; 5'-UAA-3'), 및 오팔 코돈(opal codon; 5'-UGA-3') 중 선택된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체를 발현시키는 세포주는 등록공보 KR 1637010 B1에서 사용된 세포주일 수 있다. 구체적으로, 상기 세포주는 E.Coli C321.ΔA.exp(Addgene, ID:49018) 일 수 있다.
외래 유래 suppressor tRNA
상기 외래 유래 suppressor tRNA는 특정 종결코돈을 인식하는 기능을 하는 tRNA이며, 발현 세포주 고유의 tRNA 합성 효소와는 반응하지 않는다. 상기 외래 유래 suppressor tRNA는 상기 외래 유래 tRNA 합성효소와 특이적으로 반응하며, 상기 외래 유래 tRNA 합성효소는 상기 외래 유래 suppressor tRNA에 비천연 아미노산을 연결시키는 기능을 한다. 결과적으로, 상기 외래 유래 suppressor tRNA는 상기 특정 종결코돈을 인식해서, 해당 위치에 상기 비천연 아미노산을 도입할 수 있다.
일 구현예로, 상기 suppressor tRNA는 엠버 코돈(ambber codon; 5'-UAG-3'), 오커 코돈(ocher codon; 5'-UAA-3'), 및 오팔 코돈(opal codon; 5'-UGA-3') 중 선택된 것을 인식할 수 있다. 바람직하게, 상기 suppressor tRNA는 엠버 코돈을 인식하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 suppressor tRNA는 Methanococcus jannaschii 유래의 suppressor tRNA (MjtRNATyr CUA)일 수 있다 (Yang et.al, Temporal Control of Efficient In Vivo Bioconjugation Using a Genetically Encoded Tetrazine-Mediated Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction, Bioconjugate Chemistry, 2020, 2456-2464).
외래 유래 tRNA 합성효소(synthetase)
상기 외래 유래 tRNA 합성효소는 특정 비천연 아미노산과 선택적으로 반응하며, 상기 외래 유래 suppressor tRNA에 상기 특정 비천연아미노산을 연결시키는 기능을 한다. 상기 외래 유래 tRNA 합성효소는 상기 발현 세포주 고유의 suppressor tRNA와는 반응하지 않으며, 상기 외래 유래 suppressor tRNA에만 특이적으로 반응한다. 일 구현예로, 상기 tRNA 합성효소는 테트라진(tetrazine) 유도체 및/또는 트리아진(triazine) 유도체를 포함하는 비천연 아미노산을 상기 외래 유래 suppressor tRNA에 연결하는 기능을 가질 수 있다. 일 구현예로, 상기 tRNA 합성 효소는 Methanococcus jannaschii 유래의 tyrosyl-tRNA 합성효소 (MjTyrRS)일 수 있다 (Yang et.al, Temporal Control of Efficient In Vivo Bioconjugation Using a Genetically Encoded Tetrazine-Mediated Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction, Bioconjugate Chemistry, 2020, 2456-2464). 바람직하게, 상기 tRNA 합성효소는 상기 MjTyrRS의 C11 변형체일 수 있다.
직교적 tRNA/합성효소 페어 (Orthogonal tRNA/syntetase pair)
본 명세서에서는, 1) 외래 유래 tRNA 합성효소와만 특이적으로 반응하는 외래 유래 suppressor tRNA, 및 2) 상기 외래 유래 tRNA 합성효소를 통틀어 직교적 tRNA/합성효소 페어이라 일컫는다. 본 명세서에서 개시하는 요산산화효소 변이체의 제조방법에 있어, 상기 발현 세포주 내에서 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현시키는 것이 중요하며, 이러한 목적을 달성할 수 있다면 그 방법은 크게 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체의 제조방법은 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현할 수 있는 벡터를 상기 세포주에 형질전환하는 것을 포함한다. 구체적으로, 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현할 수 있는 벡터는 Yang et.al (Temporal Control of Efficient In Vivo Bioconjugation Using a Genetically Encoded Tetrazine-Mediated Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction, Bioconjugate Chemistry, 2020, 2456-2464)에 개시된 pDule_C11일 수 있다.
요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터
상기 요산산화효소 변이체의 제조방법은 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터를 발현 세포주에 도입 또는 형질주입시키는 과정을 포함한다. 이하 "요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터" 단락에서 더 구체적으로 설명한다.
요산산화효소 변이체의 제조방법 예시
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체의 제조방법은 다음을 포함한다:
직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현시킬 수 있는 벡터, 및 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터를 포함하는 세포주를 준비하는 것,
여기서, 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어는 외래 유래 suppressor tRNA 및 외래 유래 tRNA 합성효소를 포함하고,
상기 요산산화효소 변이체는 야생형의 요산산화효소 서열 중 3개 이상의 아미노산이 테트라진 유도체 또는 트리아진 유도체를 포함하는 비천연 아미노산으로 치환된 것이고,
상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터에서 상기 비천연 아미노산에 대응하는 코돈은 엠버 코돈(5'-UAG-3')임; 및
상기 세포주를 테트라진 유도체 및/또는 트리아진 유도체를 포함하는 비천연 아미노산이 포함된 배지에서 배양하는 것,
이때, 상기 외래 유래 suppressor tRNA는 엠버 코돈(5'-UAG-3')을 인식할 수 있고,
상기 외래 유래 tRNA 합성효소는 상기 비천연 아미노산을 상기 외래 유래 tRNA에 연결시킬 수 있으며,
이에 따라, 상기 세포주는 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터를 발현시킬 때, 상기 엠버 코돈에 대응하는 위치에 상기 비천연 아미노산이 연결된 펩타이드를 발현하는 것을 특징으로 함.
요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터
요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터 개괄
본 명세서에서는 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터를 개시한다. 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터는 상기 요산산화효소 변이체 서열 중 비천연 아미노산을 종결 코돈을 사용하여 암호화한 것을 특징으로 한다. 일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터에서, 상기 요산산화효소 변이체 서열 중, 표준 아미노산은 자연계에서 발견되는 상기 표준 아미노산과 대응되는 코돈으로 암호화하고, 비천연 아미노산은 종결 코돈으로 암호화한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 종결 코돈은 엠버 코돈(ambber codon; 5'-UAG-3'), 오커 코돈(ocher codon; 5'-UAA-3'), 및 오팔 코돈(opal codon; 5'-UGA-3') 중 선택된 것일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 종결 코돈은 5'-TAG-3', 5'-TAA-3', 및 5'-TGA-3' 중 선택된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터는 상기 발현 세포주에 대하여 코돈 최적화된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터는 대장균 코돈 최적화된 것일 수 있다.
요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터 서열 예시
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체가 Arthrobacter Globiformis 유래 요산산화효소의 서열 일부를 변형시킨 것인 경우, 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 핵산은 서열번호 28 내지 서열번호 41 중 선택된 핵산서열을 가질 수 있다.
요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터 예시 서열과 유사한 서열 포함
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터는 서열번호 28 내지 서열번호 41 중 선택된 핵산서열과 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치하는 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터는 서열번호 28 내지 서열번호 41 중 선택된 핵산서열과 바로 이전 문장에서 선택된 수치범위 내 일치하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터는 서열번호 28 내지 서열번호 41 중 선택된 핵산서열과 80% 내지 100% 일치하는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터는 서열번호 28 내지 서열번호 41 중 선택된 핵산서열과 95% 이상 일치하는 서열을 포함할 수 있다.
알부민
알부민 개괄
본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체에 포함된 알부민은 통상적인 알부민 단백질을 지칭한다. 상기 알부민은 요산산화효소와 접합시켜 상기 요산산화효소의 반감기를 증대시키거나, 및/또는 면역원성을 감소시키는 역할을 한다. 상기 알부민은 전술한 기능을 가질 수 있는 것이면 달리 제한되지 않으며, 자연계에서 발견되는 야생형의 알부민이거나, 상기 야생형의 알부민을 유전적으로 조작한 것 (알부민 변이체)일 수 있다.
알부민 예시
일 구현예로, 상기 알부민은 포유류의 알부민일 수 있다. 구체적으로, 상기 알부민은 인간 혈청 알부민(human serum albumin)일 수 있다. 일 구현예로, 상기 알부민은 야생형의 인간 혈청 알부민일 수 있다. 일 구현예로, 상기 알부민은 야생형의 인간 혈청 알부민을 유전적으로 조작한 재조합 알부민(recombinant albumin)일 수 있다.
알부민 서열 예시
일 구현예로, 상기 알부민은 서열번호 16 내지 서열번호 27 중 선택된 아미노산 서열로 표현될 수 있다.
알부민 예시 서열과 유사한 서열 포함
일 구현예로, 상기 알부민은 서열번호 16 내지 서열번호 27 중 선택된 아미노산 서열과 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치하는 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 알부민은 서열번호 16 내지 서열번호 27 중 선택된 아미노산 서열과 바로 이전 문장에서 선택된 수치범위 내 일치하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 알부민은 서열번호 16 내지 서열번호 27 중 선택된 아미노산 서열과 80% 내지 100% 일치하는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 알부민은 서열번호 16 내지 서열번호 27 중 선택된 아미노산 서열과 95% 이상 일치하는 서열을 포함할 수 있다.
링커
링커 개괄
본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체 및 알부민이 링커를 통해 결합된 것이다. 이때, 상기 링커는 요산산화효소-알부민 접합체 제조 시 요산산화효소 변이체 및 알부민을 연결하기 위해 사용하는 물질을 의미한다.
구체적으로, 상기 링커는 다음을 포함한다: 요산산화효소 변이체와 결합할 수 있는 IEDDA 반응기; 앵커; 및 알부민과 결합할 수 있는 티올(thiol) 반응기. 상기 요산산화효소-알부민 접합체 제조과정에서, 상기 요산산화효소 변이체와 링커는 상기 IEDDA 반응기를 통해 결합하고, 상기 알부민과 링커는 상기 티올 반응기를 통해 결합한다. 구체적인 결합 과정은 해당 단락을 참조한다. 따라서, 상기 요산산화효소-알부민 접합체 내 상기 링커는 그 원형 그대로 존재하지 않고, 1) 요산산화효소-링커 접합부, 2) 앵커, 및 3) 알부민-링커 접합부가 연결된 형태로 존재하게 된다.
링커 구조 1 - IEDDA 반응기
상기 링커는 역 전자-요구 디엘스 엘더 반응(inverse electron-demand diels-alder reaction; IEDDA reaction)을 일으킬 수 있는 IEDDA 반응기를 포함한다. 상기 IEDDA 반응기는 상기 요산산화효소 변이체와 연결될 수 있는 구성으로, 상기 요산산화효소 변이체의 비천연 아미노산의 잔기와 반응하여 요산산화효소-링커 접합부를 형성할 수 있다. 일 구현예로, 상기 IEDDA 반응기는 디에노필 작용기(Dienophile functional group)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 IEDDA 반응기는 trans-cyclooctene 또는 그 유도체일 수 있다.
일 구현예로, 상기 IEDDA 반응기는 다음 중 선택된 것일 수 있다:
링커 구조 2 - 티올 반응기
상기 링커는 티올기와 화학 반응을 일으킬 수 있는 티올 반응기를 포함한다. 상기 티올기는 상기 알부민과 연결될 수 있는 구성으로, 상기 알부민에 포함된 티올기와 반응하여 알부민-링커 접합부를 형성할 수 있다. 일 구현예로, 상기 티올 반응기는 maleimide (MAL) 또는 그 유도체, 및/또는 3-arylpropiolonitriles (APN) 또는 그 유도체일 수 있다.
구체적으로, 상기 티올 반응기는 다음 중 선택된 것일 수 있다:
링커 구조 3 - 앵커
상기 링커는 상기 IEDDA 반응기 및 상기 티올 반응기를 연결하는 앵커를 포함한다. 상기 앵커는 상기 IEDDA 반응기 및 상기 티올 반응기를 한 분자로 엮어주며, 상기 요산산화효소 및/또는 알부민의 활성에 영향을 미치지 않는 한 그 구조가 특별히 제한되지는 않는다. 일 구현예로, 상기 앵커는 선형 구조를 가질 수 있다. 또 다른 구현예로, 상기 앵커는 가지형 구조를 가질 수 있다. 일 구현예로, 상기 앵커는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol;PEG)을 포함할 수 있다.
링커 예시
일 구현예로, 상기 링커는 다음 중 선택된 어느 하나일 수 있다:
요산산화효소-링커 접합부
요산산화효소-링커 접합부 개괄
본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소-링커 접합부를 포함한다. 상기 요산산화효소-링커 접합부는 요산산화효소 변이체 및 링커가 IEDDA 반응을 통해 결합하여 생성된 것이다. 구체적으로, 상기 IEDDA 반응은 요산산화효소 변이체에 포함된 비천연 아미노산의 잔기 및 링커에 포함된 IEDDA 반응기 사이의 반응을 지칭하며, 상기 비천연 아미노산의 잔기 및 상기 IEDDA 반응기의 종류에 따라 반응 후 요산산화효소-링커 접합부의 구조가 결정된다. 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 3개 이상의 알부민 접합체를 포함하므로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 3개 이상의 요산산화효소-링커 접합부를 포함한다. 전술한 바 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 3개 이상의 서브유닛-알부민 접합체를 포함한다. 상기 서브유닛-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체 서브유닛과 알부민이 링커를 통해 접합된 것이다. 따라서, 각각의 상기 서브유닛-알부민 접합체는 적어도 하나의 요산산화효소-링커 접합부를 포함한다.
요산산화효소-링커 접합부 위치
상기 요산산화효소-링커 접합부는 상기 요산산화효소 변이체의 비천연 아미노산 및 링커의 앵커를 연결하는 위치에 있다. 전술한 바, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 상기 비천연 아미노산의 잔기 및 상기 IEDDA 반응기의 반응을 통해 형성된 것이므로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 상기 요산산화효소 변이체에 포함된 비천연 아미노산의 잔기 해당하는 위치에 있다. 달리 표현하면, 상기 요산산화효소-링커 접합부는 상기 링커의 IEDDA 반응기에 해당하는 위치에 있다.
요산산화효소-링커 접합부 형성반응
상기 요산산화효소-링커 접합부를 형성하는 반응은 역 전자-요구 디엘스 엘더 반응(inverse electron-demand diels-alder reaction; IEDDA reaction)의 일종이다. 구체적인 반응 양태는 상기 상기 요산산화효소 변이체에 포함된 비천연 아미노산의 작용기 및 링커에 포함된 IEDDA 반응기의 종류에 따라 달라질 수 있다. 일 구현예로, 상기 요산산화효소-링커 접합부 형성반응은 다음 중 어느 하나일 수 있다:
여기서, 상기 A2는 IEDDA 반응기를 제외한 링커 부분이며, 상기 Rx는 상기 비천연 아미노산의 종류에 따라 달라질 수 있고(전술한 비천연 아미노산 예시 부분 참고), 상기 A1은 상기 비천연 아미노산의 테트라진 작용기를 제외한 상기 요산산화효소 변이체 부분이다.
요산산화효소-링커 접합부 구조
일 구현예로, 상기 요산산화효소-링커 접합부 구조는 다음 중 어느 하나일 수 있다:
여기서, 상기 R은 H, CH3, 
, 및 
중 선택된 것이며,
상기 (1) 부분은 요산산화효소 변이체에 연결되어 있으며, 상기 (2) 부분은 링커의 앵커 부분에 연결되어 있음; 및
여기서, 상기 (1) 부분은 요산산화효소 변이체에 연결되어 있으며, 상기 (2) 부분은 링커의 앵커 부분에 연결되어 있음.
알부민-링커 접합부
알부민-링커 접합부 개괄
본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체는 알부민-링커 접합부를 포함한다. 상기 알부민-링커 접합부는 알부민에 포함된 티올기 및 링커에 포함된 티올 반응기가 결합하여 생성된 것이다. 이때, 상기 결합을 매개하는 상기 알부민의 티올기는 알부민의 반감기 증대 기능을 저해하지 않기 위해 알부민의 FcRn-결합 도메인에서 이격된 위치에 있는 것을 특징으로 한다. 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 3개 이상의 알부민 접합체를 포함하므로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 3개 이상의 알부민-링커 접합부를 포함한다. 전술한 바 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 3개 이상의 서브유닛-알부민 접합체를 포함한다. 상기 서브유닛-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체 서브유닛과 알부민이 링커를 통해 접합된 것이다. 따라서, 각각의 상기 서브유닛-알부민 접합체는 적어도 하나의 알부민-링커 접합부를 포함한다.
알부민-링커 접합부 위치
상기 알부민-링커 접합부는 상기 알부민의 티올기 및 상기 링커의 앵커를 연결하는 위치에 있다. 본 명세서에서 개시하는 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소에 알부민을 접합시켜 체내 반감기를 증대시킨다는 목적이 있으므로, 상기 알부민과 상기 링커가 연결되는 위치는 알부민의 FcRn 결합 도메인과 이격된 위치여야 한다. 전술한 바, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 상기 알부민의 티올기 및 상기 링커의 티올 반응기가 반응하여 형성된 것이므로, 상기 알부민-링커 접합부는 상기 알부민의 티올기에 해당하는 위치에 있다. 달리 표현하면, 상기 알부민-링커 접합부는 상기 링커의 티올 반응기에 해당하는 위치에 있다. 상기 알부민-링커 접합부의 위치는 알부민에 포함된 티올기 중 알부민의 구조, 기능, 및/또는 활성에 영향을 미치지 않는 부분에서 선택된다.
알부민-링커 접합부 위치 예시
일 구현예로, 상기 알부민-링커 접합부는 서열번호 133 내지 S016로 표현되는 알부민의 34번째 시스테인 잔기에 포함된 티올기에 위치한 것일 수 있다.
알부민-링커 접합부 형성반응
상기 알부민-링커 접합부를 형성하는 반응은 티올 반응의 일종이다. 구체적인 반응 양태는 상기 링커에 포함된 티올 반응기의 종류에 따라 달라질 수 있다.
일 구현예로, 상기 알부민-링커 접합부 형성반응은 다음 중 어느 하나일 수 있다:
여기서, 상기 R1은 상기 티올기를 제외한 알부민 부분이며, R2는 상기 티올 반응기를 제외한 링커 부분이다.
알부민-링커 접합부 구조 예시
일 구현예로, 상기 알부민-링커 접합부 구조는 다음 중 어느 하나일 수 있다:
여기서, 상기 (1) 부분은 알부민에 연결되어 있으며, 상기 (2) 부분은 링커의 앵커 부분에 연결되어 있다.
앵커
앵커 개괄
본 명세서에서 개시하는 앵커는 상기 요산산화효소-링커 접합부 및 상기 알부민-링커 접합부 사이에 연결된 구성을 지칭한다. 상기 앵커는 상기 요산산화효소 변이체, 요산산화효소-링커 접합부, 알부민-링커 접합부, 및 알부민을 하나의 구조체로 엮어주며, 앵커의 구조에 따라 요산산화효소-알부민 접합체에 포함된 요산산화효소 변이체 및 알부민의 거리를 조절하는 기능을 할 수 있다.
앵커 구조 예시
일 구현예로, 상기 앵커는 다음 중 선택된 어느 하나일 수 있다:
여기서, 상기 J1은 요산산화효소-링커 접합부, 상기 J2는 알부민-링커 접합부이다.
요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법
요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법 개괄
본 명세서에서는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법을 개시한다. 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법에는 다음 요소가 관여된다: 요산산화효소 변이체; 링커; 및 알부민. 이때, 각각의 요소는 각 단락에서 설명된 바와 같다.
상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법은 상기 각 요소를 적절히 반응시켜 위에서 설명한 요산산화효소-알부민 접합체를 제조하는 것이다. 구체적으로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법은 상기 요산산화효소 변이체에 포함된 비천연 아미노산 잔기와 상기 링커의 IEDDA 반응기를 반응시켜 요산산화효소-링커 접합부를 만드는 것 (요산산화효소-링커 접합 반응); 및 상기 알부민에 포함된 티올기와 상기 링커의 티올 반응기를 반응시켜 알부민-링커 접합부를 만드는 것 (알부민-링커 접합 반응)을 포함한다. 이때, 상기 요산산화효소-링커 접합 반응 및 알부민-링커 접합 반응을 일으키는 순서는 무관하며, 두 반응을 동시에 일으킬 수도 있다. 또한, 각 반응의 순서에 따라 반응의 중간 산물이 생성될 수 있다. 이하 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법을 더 구체적으로 설명한다.
요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법 1 - 알부민과 링커를 먼저 결합시키는 방법
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법은 다음을 포함한다:
알부민 및 링커를 반응시키는 것,
여기서, 상기 알부민의 티올기 및 상기 링커의 티올 반응기가 접촉하여 알부민-링커 접합체가 생성됨; 및
상기 알부민-링커 접합체 및 요산산화효소 변이체를 반응시키는 것,
여기서, 상기 알부민-링커 접합체의 IEDDA 반응기 및 상기 요산산화효소 변이체의 비천연 아미노산에 포함된 디엔 작용기가 접촉하여 요산산화효소-알부민 접합체가 생성됨.
상기 요산산화효소 변이체, 상기 링커, 및 상기 알부민 및 이에 포함된 요소들은 위에서 설명된 바와 같다.
요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법 2 - 요산산화효소와 링커를 먼저 결합시키는 방법
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법은 다음을 포함한다:
요산산화효소 변이체 및 링커를 반응시키는 것,
여기서, 상기 링커의 IEDDA 반응기 및 상기 요산산화효소 변이체의 비천연 아미노산에 포함된 디엔 작용기가 접촉하여 요산산화효소-링커 접합체가 생성됨; 및
상기 요산산화효소-링커 접합체 및 알부민을 반응시키는 것,
여기서, 상기 알부민의 티올 반응기 및 상기 요산산화효소-링커 접합체의 티올기가 접촉하여 요산산화효소-알부민 접합체가 생성됨.
상기 요산산화효소 변이체, 상기 링커, 및 상기 알부민 및 이에 포함된 요소들은 위에서 설명된 바와 같다.
요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법 3 - 요산산화효로, 링커, 및 알부민을 동시에 결합시키는 방법
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법은 반응물들을 모두 첨가하여 동시에 반응시킴으로써 수행 수 있다.
이때, 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법은 다음을 포함한다:
요산산화효소 변이체, 링커, 및 알부민을 반응시키는 것,
여기서, 상기 알부민의 티올기 및 상기 링커의 티올 반응기가 반응을 일으켜 접합되고,
상기 요산산화효소 변이체의 비천연 아미노산에 포함된 디엔 작용기 및 상기 링커의 IEDDA 반응기가 반응을 일으켜 접합되며,
상기 반응 결과 요산산화효소-알부민 접합체가 생성됨.
상기 요산산화효소 변이체, 상기 링커, 및 상기 알부민 및 이에 포함된 요소들은 위에서 설명된 바와 같다.
요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법 특징 1 - 생물직교반응을 이용하여 체내 안정성이 높음
상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법은 상기 요산산화효소 변이체 및 상기 알부민을 생물직교반응의 일종인 IEDDA 반응을 이용하여 접합한다. 상기 접합 반응에 관여하는 화학작용기는 체내 분자 내 존재하지 않는 것이므로, 상기 제조방법을 통해 제조된 요산산화효소-알부민 접합체는 체내에 도입되어도 그 결합의 안정성이 매우 높다는 장점을 가진다.
요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법 특징 2 - IEDDA 반응을 이용하여 수율이 매우 높음
상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법에서, 요산산화효소 변이체 및 링커를 접합시키기 위해 역 전자 디엘스-엘더 반응(inverse electron demand diels-alder reaction; IEDDA 반응)을 사용한다. 상기 IEDDA 반응은 매우 빠른 반응속도로 일어나고, 반응 환경 조성이 수월하기 때문에, SPAAC(Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition) 반응을 이용하는 경우와 비교하여 접합체를 제조할 때 수율이 매우 높다는 장점을 가진다.
요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법 특징 3 - 접합체 당 3개, 혹은 4개의 알부민을 포함
본 명세서에서 제공하는 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법에 따르면, 수율이 매우 높은 IEDDA 반응을 이용하기 때문에, 요산산화효소 한 단위 당 3개, 혹은 4개의 알부민이 접합된 요산산화효소-알부민 접합체를 수득할 수 있다. 이는 선행기술 KR 1637010 B1에 개시된 요산산화효소-알부민 접합체 제조방법에 따를 경우 요산산화효소 한 단위 당 1개, 혹은 2개의 알부민이 접합된 요산산화효소-알부민 접합체를 수득하는 것이 한계인 것과 비교해 분명히 개선된 특징이다.
요산산화효소-링커 접합 방법
본 명세서에서 제공하는 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법은 요산산화효소 변이체 및 링커를 접합하는 것을 포함한다. 구체적으로, 상기 요산산화효소-링커 접합 방법은 상기 요산산화효소 변이체의 비천연 아미노산 잔기와 상기 링커의 IEDDA 반응기를 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 요산산화효소-링커 접합 방법은 알부민과 링커가 접합하는 부위, 혹은 알부민과 링커의 접합 여부에 영향을 받지 않는다. 따라서, 이하 개시하는 요산산화효소-링커 접합 방법은 "요산산화효소 변이체"에 "링커"를 결합시키는 것, 및 "요산산화효소 변이체"에 "알부민-링커 접합체"를 결합시키는 것 모두에 적용할 수 있다. 상기 요산산화효소-링커 접합 방법은 알부민-링커 접합 방법과 독립적으로 수행될 수 있다.
상기 요산산화효소-링커 접합방법은 "요산산화효소-링커 접합부 형성반응" 단락에서 설명된 반응을 일으킬 수 있는 방법이면 달리 제한되지 않으며, 통상의 기술자가 상기 반응을 일으킬 수 있는 공지된 방법을 적절하게 선택한 것일 수 있다.
여기서, 요산산화효소-링커 접합 방법으로 테트라진 작용기 및 trans-cyclooctene 작용기 간의 IEDDA 반응을 일으키는 경우, 염기성 pH 환경에서는 테트라진 작용기가 환원되어 IEDDA 반응을 일으키지 않을 가능성이 커진다. 따라서, 상기 IEDDA 반응은 중성 pH 환경에서 진행하는 것이 바람직하다. 일 구현예로, 상기 요산산화효소-링커 접합 방법은 중성 pH 환경에서 수행될 수 있다. 일 구현예로, 상기 요산산화효소-링커 접합 방법은 pH 8.0 이하, pH 9.0 이하, pH 10.0 이하, pH 11.0 이하, pH 11.0 이하, pH 13.0 이하, pH 14.0 이하의 환경에서 수행될 수 있다.
알부민-링커 접합 방법
본 명세서에서 제공하는 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법은 알부민 및 링커를 접합하는 것을 포함한다. 구체적으로, 상기 알부민-링커 접합 방법은 상기 알부민의 티올기와 상기 링커의 티올 반응기를 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 알부민-링커 접합방법은 요산산화효소 변이체와 링커가 접합하는 부위, 혹은 요산산화효소 변이체와 링커의 접합 여부에 영향을 받지 않는다. 따라서, 이하 개시하는 알부민-링커 접합 방법은 "알부민"에 "링커"를 결합시키는 것, 및 "알부민"에 "요산산화효소-링커 접합체"를 결합시키는 것 모두에 적용할 수 있다. 상기 알부민-링커 접합 방법은 상기 요산산화효소-링커 접합 방법과 독립적으로 수행될 수 있다.
요산산화효소-알부민 접합체의 용도
요산산화효소-알부민 접합체의 용도 개괄
본 명세서에서는 요산산화효소-알부민 접합체의 용도를 개시한다. 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 체내에서 높은 반감기를 가져 안정적이고, 면역원성이 낮아 탁월한 요산 강하 효과를 가진다. 따라서, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산이 원인이 되는 질환, 질병, 및/또는 적응증의 예방 또는 치료 용도로 사용할 수 있다.
요산산화효소-알부민 접합체의 예방 및/또는 치료 용도 1 - 적응증
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 고요산혈증, 급성 통풍성 관절염, 간헐기 통풍, 및 만성 결절성 통풍, 만성 신장 질환(Chronic Kidney Disease) 및/또는 종양 용해 증후군(Tumor Lysis Syndrome; TLS)의 예방 또는 치료 용도로 사용할 수 있다.
요산산화효소-알부민 접합체의 예방 및/또는 치료 용도 2 - 투여방법
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산이 원인이 되는 질환, 질병, 및/또는 적응증의 예방 또는 치료를 위해 적절한 제제화를 거쳐, 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 투여 방법은 경구 투여, 비경구 투여, 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여, 및 피하 투여 중 선택된 하나일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 투여 방법은 정맥 점적주입(intravenous infusion)일 수 있다.
요산산화효소-알부민 접합체의 예방 및/또는 치료 용도 3 - 투여용량
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산이 원인이 되는 질환, 질병, 및/또는 적응증의 예방 또는 치료를 위해 적절한 제제화를 거쳐, 적절한 투여 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 투여 용량은 요산산화효소-알부민 접합체 기준 약 0.01 mg/kg 내지 1000mg/kg 용량으로 투여될 수 있다.
요산산화효소-알부민 접합체의 예방 및/또는 치료 용도 4 - 투여주기
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산이 원인이 되는 질환, 질병, 및/또는 적응증의 예방 또는 치료를 위해 적절한 제제화를 거쳐, 적절한 투여 주기로 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 투여 주기는 상기 적절한 투여 용량의 요산산화효소-알부민 접합체를을 1일 1회 투여하는 것일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 투여 주기는 상기 적절한 투여 용량의 요산산화효소-알부민 접합체를을 1일 2회 이상 나누어 투여하는 것일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 투여 주기는 상기 적절한 투여 용량의 요산산화효소-알부민 접합체를을 1시간, 2시간, 6시간, 12시간, 24시간, 2일, 3일, 일주일, 이주일, 한 달, 및/또는 세 달 간격으로 투여하는 것일 수 있다.
요산산화효소-알부민 접합체를 포함하는 약학적 조성물
요산산화효소-알부민 접합체를 포함하는 약학적 조성물 개괄
상기 요산산화효소-알부민 접합체를 요산이 원인이 되는 질환, 질병, 및/또는 적응증에 사용하기 위해서는 적절한 제제화를 거쳐야 한다. 본 명세서에서는 요산산화효소-알부민 접합체를 치료제로 사용하기 위해 적절히 제제화 된 약학적 조성물을 개시하며, 제제화하기 위해 필요한 약학적으로 허용되는 담체를 개시한다. 예를 들면, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 경구용, 비경구용, 주사액, 에어로졸제, 및/또는 경피용으로 제제화될 수 있으며, 이를 위해 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
제제화를 위한 구성 1 - 경구용 제제
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 트로키제 (troches), 로젠지 (lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화될 수 있다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체를 경구 투여용으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유 등을 사용할 수 있으며, 감미제, 방향제, 시럽제 등도 사용할 수 있다. 나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다.
제제화를 위한 구성 2 - 비경구용 제제
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림으로 제제화될 수 있다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체를 비경구 투여용으로 제제화하기 위해, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
제제화를 위한 구성 3 - 주사액 제제
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체를 주사액으로 제제화하기 위해, 상기 요산산화효소-알부민 접합체를 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다.
제제화를 위한 구성 4 - 에어로졸제 제제
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체에 추진제 등을 첨가제와 함께 배합하여 수분산된 농축물, 또는 습윤 분말을 제조하여 에어로졸제로 제제화할 수 있다.
제제화를 위한 구성 5 - 경피용 제제
일 구현예로, 상기 요산산화효소-알부민 접합체를 경피용으로 제제화하는 경우, 상기 요산산화효소-알부민 접합체에 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 담체로 첨가하여 연고, 크림, 도포용 파우더, 오일, 피부 외용제 등을 제조할 수 있다.
제제화를 위한 구성 6 - 어쥬번트 및 기타 구성
일 구현예로, 상기 요산산화호소-알부민 접합체를 포함하는 약학적 조성물은 물, 염수, 덱스트로즈, 에탄올, 글리세롤, 염화나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 솔비톨, 락토즈, 젤라틴, 알부민, 수산화알루미늄, 프로인트 불완전 보조제(Freund's Incomplete Adjuvant) 및 완전 항원보조제(Complete Adjuvant)(Pifco Laboratories, Detroit, Mich.), 머크 항원보강제 65(Merck and Company, Inc., Rahway, NJ.), Alhydrogel(Al(OH)3), 수산화알루미늄 겔(알룸), 또는 인산알루미늄과 같은 알루미늄 염, AS04 series, MF, squalene, MF59, QS21, 칼슘, 철 또는 아연염, 아실화 티로신의 불용성 현탁액, 아실화 과당, 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도된 폴리사카라이드, 폴리포스파젠, 생분해성 미세구, 및 퀼(Quil) A, 톨-라이크 리셉터(TLR) 작용제, PHAD[Avanti polar lipid, Monophosphoryl Lipid A (synthetic)], 모노포스포릴 지질 A(MPL, monophosphoryl Lipid A), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, 알루미늄 염, 사이토카인, 사포닌, Prolactin, growth hormone deoxycholic acid, betaglucan, polyribonucleotides, 무라밀 다이펩타이드(MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람-음성 박테리아의 리포폴리사카라이드(LPS), 폴리포스파젠, 에멀젼, 비로솜, 코크리트(cochleate), 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLG) 마이크로입자, 폴록사머 입자, 마이크로입자, 리포솜, 또는 이들의 적절한 조합을 포함할 수 있다.
발명의 가능한 실시예
요산산화효소-알부민 접합체 1
실시예 1, 요산산화효소-알부민 접합체
다음 [화학식 1]로 표현되는, 요산산화효소-알부민 접합체:
[화학식 1] Uox-[J1-A-J2-HSA]n
여기서, 상기 Uox는 요산산화효소 변이체, 상기 J1은 요산산화효소-링커 접합부, 상기 A는 앵커, 상기 J2는 알부민-링커 접합부, 및, 상기 HSA는 인간 혈청 알부민 (Human Serum Albumin)을 의미하며,
상기 요산산화효소 변이체는 디엔 작용기(dien functional group)를 가지는 비천연 아미노산을 3개 이상 포함하고,
상기 요산산화효소-링커 접합부는 상기 비천연 아미노산의 디엔 작용기 및 상기 앵커에 연결된 디에노필 작용기(dienophile functional group)가 역 전자 요구 디엘스-알더(Inverse Electron Demand Diels-Alder; IEDDA) 반응을 통해 결합된 것이고,
상기 n은 3 또는 4임.
실시예 2, 요산산화효소 미생물 유래 한정
실시예 1에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체는 미생물 유래 야생형 요산산화효소 서열에서 3개 이상의 아미노산이 상기 비천연 아미노산으로 치환된 것이며, 상기 미생물은 _Arthrobacter Globiformis_임.
실시예 3, 변이체 서브유닛 4개
실시예 1 내지 2 중 어느 하나에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체는 요산산화효소 변이체 서브유닛 4개가 올리고머화 된 사량체이고, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 야생형 요산산화효소 서브유닛 서열에서 하나 이상의 아미노산이 상기 비천연 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체.
실시예 4, 변이체 서브유닛 3개, 야생형 서브유닛 하나
실시예 1 내지 2 중 어느 하나에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체는 요산산화효소 변이체 서브유닛 3개 및 야생형 요산산화효소 서브유닛 1개가 올리고머화된 사량체이고, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 야생형 요산산화효소 서브유닛 서열에서 하나 이상의 아미노산이 상기 비천연 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체.
실시예 5, 비천연 아미노산, 테트라진 작용기 한정
실시예 1 내지 4 중 어느 하나 있어서, 상기 디엔 작용기는 트리아진 작용기 또는 그 유도체, 또는 테트라진 작용기 또는 그 유도체인 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체.
실시예 6, 비천연 아미노산 예시(명칭)
실시예 5에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 다음 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체:
4-(1,2,3,4-tetrazin-3-yl) phenylalanine (frTet); 4-(6-methyl-s-tetrazin-3-yl)phenylalanine (Tet-v2.0); 3-(4-(1,2,4-triazin-6-yl)phenyl)-2-aminopropanoic acid; 2-amino-3-(4-(2-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)ethyl)phenyl)propanoic acid; 2-amino-3-(4-(6-phenyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)propanoic acid; 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)amino)phenyl)-2-aminopropanoic acid; 3-(4-(2-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)ethyl)phenyl)-2-aminopropanoic acid; 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)thio)phenyl)-2-aminopropanoic acid; 2-amino-3-(4-((6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)thio)phenyl)propanoic acid; 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)oxy)phenyl)-2-aminopropanoic acid; 2-amino-3-(4-((6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)oxy)phenyl)propanoic acid; 3-(4'-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)-2-aminopropanoic acid; 2-amino-3-(4'-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)propanoic acid; 2-amino-3-(6-(6-(pyridin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)pyridin-3-yl)propanoic acid; 3-(4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)-2-aminopropanoic acid; 및 2-amino-3-(4-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)propanoic acid.
실시예 7, 비천연 아미노산 예시(화학식)
실시예 5에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 도 4 내지 도 8의 표에서 각각 독립적으로 선택된 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체.
실시예 8, 서브유닛 서열 예시
실시예 2 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 다음에서 선택된 서열로 표현되는 요산산화효소-알부민 접합체:
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이때, 상기 X는 도 4 내지 도 8의 표에 개시된 비천연 아미노산 중 선택된 것이다.
실시예 9, 요산산화효소-링커 접합부 예시
실시예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 요산산화효소-링커 접합부는 다음 중 선택된 어느 하나인 요산산화효소-알부민 접합체:
여기서, 상기 R은 H, CH3, 
, 및 
중 선택된 것임; 및
여기서, 상기 (1) 부분은 요산산화효소 변이체에 연결되어 있으며, 상기 (2) 부분은 링커의 앵커 부분에 연결되어 있다.
실시예 10, 알부민 서열 한정
실시예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 알부민은 다음 중 선택된 서열로 표현되는 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체:
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실시예 11, 알부민-링커 접합체 한정
실시예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 알부민-링커 접합부는 상기 알부민에 포함된 티올기 및 상기 앵커에 연결된 티올 반응기가 반응하여 형성된 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체.
실시예 12, 알부민 접합 위치 한정
실시예 11에 있어서, 상기 알부민의 서열은 서열번호 16 내지 서열번호 27에서 선택된 것이고, 상기 알부민-링커 접합부는 상기 알부민 서열 중 34번째 시스테인 잔기의 티올기 및 상기 앵커에 연결된 티올 반응기가 반응하여 형성된 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체.
실시예 13, 알부민 링커 접합부 한정
실시예 11 내지 실시예 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 알부민-링커 접합부는 도 11의 표에서 선택된 것인 요산산화효소-알부민 접합체.
실시예 14, 앵커 한정
실시예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 앵커는 도 10의 표에서 선택된 것인 요산산화효소-알부민 접합체.
요산산화효소-알부민 접합체 2
실시예 15, 요산산화효소-알부민 접합체, 서브유닛 관점
다음을 포함하는 요산산화효소-알부민 접합체:
3개 또는 4개의 알부민-서브유닛 접합체, 이때, 각각의 상기 알부민-서브유닛 접합체는 다음 [화학식 2]로 표현됨:
[화학식 2] p'-J1-A-J2-HSA,
여기서, 상기 p'은 요산산화효소 변이체 서브유닛이며, 상기 J1은 요산산화효소-링커 접합부이고, 상기 A는 앵커, 상기 J2는 알부민-링커 접합부, 및 상기 HSA는 인간 혈청 알부민 (Human Serum Albumin)을 의미하고,
상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 야생형 요산산화효소 서브유닛의 서열 중 하나 이상의 아미노산이 테트라진 작용기(tetrazin functional group) 또는 트리아진 작용기(triazine functional group)를 포함하는 비천연 아미노산으로 치환된 것이며,
상기 요산산화효소-링커 접합부는 상기 비천연 아미노산의 테트라진 작용기 또는 트리아진 작용기, 및 상기 앵커에 연결된 trans-cyclooctene 작용기가 역 전자 요구 디엘스-알더(Inverse Electron Demand Diels-Alder; IEDDA) 반응을 일으켜 형성된 것임; 및
선택적으로, 1개의 요산산화효소 변이체 서브유닛,
여기서, 상기 요산산화효소-알부민 접합체가 알부민-서브유닛 복합체를 3개 포함하는 경우, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체 서브유닛을 1개 포함하고, 각각의 알부민-서브유닛 복합체에 포함된 요산산화효소 변이체 서브유닛 및 1개의 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화하여 사량체를 이루며,
상기 요산산화효소-알부민 접합체가 알부민-서브유닛 복합체를 4개 포함하는 경우, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소 변이체 서브유닛을 포함하지 않으며, 각각의 알부민-서브유닛 복합체에 포함된 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화하여 사량체를 이룸.
실시예 16, 알부민 4개 접합
실시예 15에 있어서, 다음을 포함하는 상기 요산산화효소-알부민 접합체:
제1 알부민-서브유닛 접합체,
여기서, 상기 제1 알부민-서브유닛 접합체는 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제1 요산산화효소-링커 접합부, 제1 앵커, 제1 알부민-링커 접합부, 및 제1 알부민을 포함함;
제2 알부민-서브유닛 접합체,
여기서, 상기 제2 알부민-서브유닛 접합체는 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제2 요산산화효소-링커 접합부, 제2 앵커, 제2 알부민-링커 접합부, 및 제2 알부민을 포함함;
제3 알부민-서브유닛 접합체,
여기서, 상기 제3 알부민-서브유닛 접합체는 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제3 요산산화효소-링커 접합부, 제3 앵커, 제3 알부민-링커 접합부, 및 제3 알부민을 포함함; 및
제4 알부민-서브유닛 접합체,
여기서, 상기 제4 알부민-서브유닛 접합체는 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제4 요산산화효소-링커 접합부, 제4 앵커, 제4 알부민-링커 접합부, 및 제4 알부민을 포함함; 및
여기서, 상기 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 및 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화하여 사량체를 이룸.
실시예 17, 알부민 4개 접합, 구성요소 마쿠시 청구항
실시예 16에 있어서, 다음을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체:
상기 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 서열번호 15에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며, 여기서 상기 선택된 서열에 포함된 X는 도 4 내지 도 8의 표에서 선택된 비천연 아미노산이고,
상기 제1 요산산화효소-링커 접합부는 상기 도 4 내지 도 8의 표에서 선택된 비천연 아미노산에 따라 도 28의 표에 개시된 것으로 결정되고,
상기 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 서열번호 15에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며, 여기서 상기 선택된 서열에 포함된 X는 도 4 내지 도 8의 표에서 선택된 비천연 아미노산이고,
상기 제2 요산산화효소-링커 접합부는 상기 도 4 내지 도 8의 표에서 선택된 비천연 아미노산에 따라 도 28의 표에 개시된 것으로 결정되고,
상기 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 서열번호 15에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며, 여기서 상기 선택된 서열에 포함된 X는 도 4 내지 도 8의 표에서 선택된 비천연 아미노산이고,
상기 제3 요산산화효소-링커 접합부는 상기 도 4 내지 도 8의 표에서 선택된 비천연 아미노산에 따라 도 28의 표에 개시된 것으로 결정되고,
상기 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 서열번호 15에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며, 여기서 상기 선택된 서열에 포함된 X는 도 4 내지 도 8의 표에서 선택된 비천연 아미노산이고,
상기 제4 요산산화효소-링커 접합부는 상기 도 4 내지 도 8의 표에서 선택된 비천연 아미노산에 따라 도 9의 표에 개시된 것으로 결정되고,
상기 제1 앵커, 제2 앵커, 제3 앵커, 및 제4 앵커는 각각 독립적으로, 도 10의 표에서 선택되고,
상기 제1 알부민-링커 접합부, 제2 알부민-링커 접합부, 제3 알부민-링커 접합부, 및 제4 알부민 링커 접합부는 각각 독립적으로, 도 11의 표에서 선택되고,
상기 제1 알부민, 제2 알부민, 제3 알부민, 및 제4 알부민은 각각 독립적으로, 서열번호 16 내지 서열번호 27에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며,
상기 제1 알부민-링커 접합부는, 상기 제1 앵커에 연결된 티올 반응기(thiol reactive moiety) 및 상기 제1 알부민 서열 중 34번째 시스테인의 티올기(thiol moiety)가 반응하여 형성된 것이고,
상기 제2 알부민-링커 접합부는, 상기 제2 앵커에 연결된 티올 반응기(thiol reactive moiety) 및 상기 제2 알부민 서열 중 34번째 시스테인의 티올기(thiol moiety)가 반응하여 형성된 것이고,
상기 제3 알부민-링커 접합부는, 상기 제3 앵커에 연결된 티올 반응기(thiol reactive moiety) 및 상기 제3 알부민 서열 중 34번째 시스테인의 티올기(thiol moiety)가 반응하여 형성된 것이고,
상기 제4 알부민-링커 접합부는, 상기 제4 앵커에 연결된 티올 반응기(thiol reactive moiety) 및 상기 제4 알부민 서열 중 34번째 시스테인의 티올기(thiol moiety)가 반응하여 형성된 것임.
실시예 18, 알부민 4개 접합, 요산산화효소 유래 한정
실시예 17에 있어서, 상기 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 상기 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 상기 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 및 상기 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛은 모두 _Arthrobacter Globiformis_에서 유래된 요산산화효소의 변이체인 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체.
실시예 19, 알부민 3개 접합
실시예 15에 있어서, 다음을 포함하는 상기 요산산화효소-알부민 접합체:
제1 알부민-서브유닛 접합체,
여기서, 상기 제1 알부민-서브유닛 접합체는 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제1 요산산화효소-링커 접합부, 제1 앵커, 제1 알부민-링커 접합부, 및 제1 알부민을 포함함;
제2 알부민-서브유닛 접합체,
여기서, 상기 제2 알부민-서브유닛 접합체는 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제2 요산산화효소-링커 접합부, 제2 앵커, 제2 알부민-링커 접합부, 및 제2 알부민을 포함함;
제3 알부민-서브유닛 접합체,
여기서, 상기 제3 알부민-서브유닛 접합체는 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제3 요산산화효소-링커 접합부, 제3 앵커, 제3 알부민-링커 접합부, 및 제3 알부민을 포함함; 및
제4 요산산화효소 변이체 서브유닛,
여기서, 상기 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 및 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화하여 사량체를 이룸.
실시예 20, 알부민 3개 접합, 구성요소 마쿠시 청구항
실시예 19에 있어서, 다음을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체:
상기 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 서열번호 15에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며, 여기서 상기 선택된 서열에 포함된 X는 도 4 내지 도 8의 표에서 선택된 비천연 아미노산이고,
상기 제1 요산산화효소-링커 접합부는 상기 도 4 내지 도 8의 표에서 선택된 비천연 아미노산에 따라 도 9의 표에 개시된 것으로 결정되고,
상기 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 서열번호 15에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며, 여기서 상기 선택된 서열에 포함된 X는 도 4 내지 도 8의 표에서 선택된 비천연 아미노산이고,
상기 제2 요산산화효소-링커 접합부는 상기 도 4 내지 도 8의 표에서 선택된 비천연 아미노산에 따라 도 9의 표에 개시된 것으로 결정되고,
상기 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 서열번호 15에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며, 여기서 상기 선택된 서열에 포함된 X는 도 4 내지 도 8의 표에서 선택된 비천연 아미노산이고,
상기 제3 요산산화효소-링커 접합부는 상기 도 4 내지 도 8의 표에서 선택된 비천연 아미노산에 따라 도 9의 표에 개시된 것으로 결정되고,
상기 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 서열번호 15에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며, 여기서 상기 선택된 서열에 포함된 X는 도 4 내지 도 8의 표에서 선택된 비천연 아미노산이고,
상기 제1 앵커, 제2 앵커, 및 제3 앵커는 각각 독립적으로, 도 10의 표에서 선택되고,
상기 제1 알부민-링커 접합부, 제2 알부민-링커 접합부, 및 제3 알부민-링커 접합부는 각각 독립적으로, 도 11의 표에서 선택되고,
상기 제1 알부민, 제2 알부민, 제3 알부민, 및 제4 알부민은 각각 독립적으로, 서열번호 16 내지 서열번호 27에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며,
상기 제1 알부민-링커 접합부는, 상기 제1 앵커에 연결된 티올 반응기(thiol reactive moiety) 및 상기 제1 알부민 서열 중 34번째 시스테인의 티올기(thiol moiety)가 반응하여 형성된 것이고,
상기 제2 알부민-링커 접합부는, 상기 제2 앵커에 연결된 티올 반응기(thiol reactive moiety) 및 상기 제2 알부민 서열 중 34번째 시스테인의 티올기(thiol moiety)가 반응하여 형성된 것이고,
상기 제3 알부민-링커 접합부는, 상기 제3 앵커에 연결된 티올 반응기(thiol reactive moiety) 및 상기 제3 알부민 서열 중 34번째 시스테인의 티올기(thiol moiety)가 반응하여 형성된 것임.
실시예 21, 알부민 3개 접합, 요산산화효소 유래 한정
실시예 20에 있어서, 상기 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 상기 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 상기 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 및 상기 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛은 모두 _Arthrobacter Globiformis_에서 유래된 것을 특징으로 하는 요선선화효소-알부민 접합체.
요산산화효소-알부민 접합체를 포함하는 약학적 조성물
실시예 22, 약학적 조성물 청구항
다음을 포함하는, 요산 관련 질병 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
치료학적 유효량의, 실시예 1 내지 21 중 어느 하나의 요산산화효소-알부민 접합체; 및
약학적으로 허용되는 담체.
실시예 23, 적응증 한정
실시예 22에 있어서, 상기 요산 관련 질병은 고요산혈증, 급성 통풍성 관절염, 간헐기 통풍, 만성 결절성 통풍, 만성 신장 질환(Chronic Kidney Disease) 및 종양 용해 증후군(Tumor Lysis Syndrome; TLS)중 어느 하나인 약학적 조성물.
실시예 24, 담체 예시
실시예 22 내지 실시예 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 담체는 다음 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물:
락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유; 감미제; 방향제; 시럽제; 지방유와 같은 액체 담체; 멸균된 수용액; 프로필렌글리콜; 폴리에틸렌글리콜; 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르; 현탁제; 유제; 동결 건조 제제; 외용제; 안정제; 완충제; 동물성 유; 식물성 유; 왁스; 파라핀; 전분; 트라칸트; 셀룰로오스 유도체; 폴리에틸렌 글리콜; 실리콘; 벤토나이트; 실리카; 탈크; 산화 아연.
요산산화효소-알부민 접합체를 사용한 치료방법
실시예 25, 약학적 조성물을 사용하는 치료 방법
다음을 포함하는, 요산 관련 질병 예방 또는 치료 방법:
실시예 22 내지 실시예 24 중 어느 하나의 약학적 조성물을 환자 체내에 투여하는 것.
실시예 26, 적응증 한정
실시예 25에 있어서, 상기 요산 관련 질병은 고요산혈증, 급성 통풍성 관절염, 간헐기 통풍, 만성 결절성 통풍, 만성 신장 질환(Chronic Kidney Disease) 및 종양 용해 증후군(Tumor Lysis Syndrome; TLS)중 어느 하나인 약학적 조성물.
실시예 27, 투여 방법 한정
실시예 25 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여 방법은 경구 투여, 비경구 투여, 정맥 내 투여, 정맥 점적 주입(intravenous infusion), 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여, 및 피하 투여 중 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
실시예 28, 투여 용량 한정
실시예 25 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 약학적 조성물을 0.01 mg/kg 내지 1000mg/kg의 용량으로 상기 환자 체내에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
실시예 29, 투여 주기 한정 1
실시예 25 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 약학적 조성물을 1일 1회 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
실시예 30, 투여 주기 한정 2
실시예 25 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 약학적 조성물을 1일 2회 이상 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
요산산화효소-알부민 접합체의 용도
실시예 31, 치료제 제조 용도
실시예 1 내지 21 중 어느 하나의 요산산화효소-알부민 접합체를 요산 관련 질병 치료제로 제조하는 용도.
실시예 32, 적응증 한정
실시예 31에 있어서, 상기 요산 관련 질병은 고요산혈증, 급성 통풍성 관절염, 간헐기 통풍, 만성 결절성 통풍, 만성 신장 질환(Chronic Kidney Disease) 및 종양 용해 증후군(Tumor Lysis Syndrome; TLS)중 어느 하나인 용도.
요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법 1
실시예 33, 알부민-링커 접합 우선
다음을 포함하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법:
알부민 및 링커를 반응시키는 것,
여기서, 상기 링커는 디에노필 작용기(dienophile functional group), 앵커, 및 티올 반응성기(thiol reactive moiety)를 포함하며,
상기 링커의 티올 반응성기 및 상기 알부민의 티올기가 반응을 통해 결합하여 알부민-링커 접합체가 생성됨; 및
상기 알부민-링커 접합체 및 요산산화효소 변이체를 반응시키는 것,
여기서, 상기 요산산화효소 변이체는 야생형 요산산화효소의 서열에서 3개 이상의 아미노산이 디엔 작용기(dien functional group)를 포함하는 비천연 아미노산으로 치환된 것이며,
상기 요산산화효소 변이체의 상기 디엔 작용기 및 상기 알부민-링커 접합체의 링커에 포함된 상기 디에노필 작용기가 역 전자 요구 디엘스-알더 (Inverse Electron Demand Diels-Alder; IEDDA) 반응을 통해 결합하여 요산산화효소-알부민 접합체가 생성되고; 및
상기 요산산화효소-알부민 접합체를 수득하는 것,
여기서, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 상기 요산산화효소 변이체에 3개 이상의 알부민이 링커를 통해 접합된 것을 특징으로 함.
실시예 34, 요산산화효소-알부민 접합 우선
다음을 포함하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법:
요산산화효소 변이체 및 링커를 반응시키는 것,
여기서, 상기 요산산화효소 변이체는 야생형 요산산화효소의 서열에서 3개 이상의 아미노산이 디엔 작용기(dien functional group)를 포함하는 비천연 아미노산으로 치환된 것이며,
상기 링커는 디에노필 작용기(dienophile functional group), 앵커, 및 티올 반응성기(thiol reactive moiety)를 포함하며,
상기 요산산화효소 변이체의 상기 디엔 작용기 및 상기 링커의 상기 디에노필 작용기가 역 전자 요구 디엘스-알더 (Inverse Electron Demand Diels-Alder; IEDDA) 반응을 통해 결합하여 요산산화효소-링커 접합체가 생성되고,
상기 요산산화효소-링커 접합체는 요산산화효소 변이체에 3개 이상의 링커가 접합된 것을 특징으로 함; 및
상기 요산산화효소-링커 접합체 및 알부민을 반응시키는 것,
여기서, 상기 요산산화효소-링커 접합체의 링커에 포함된 티올 반응성기 및 상기 알부민의 티올기가 반응을 통해 결합하여 요산산화효소-알부민 접합체가 생성됨; 및
상기 요산산화효소-알부민 접합체를 수득하는 것,
상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소-링커 접합합체에 3개 이상의 알부민이 접합된 것을 특징으로 함.
실시예 35, 요산산화효소, 링커, 알부민 동시
다음을 포함하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법:
요산산화효소 변이체, 링커, 및 알부민을 반응시키는 것,
여기서, 상기 요산산화효소 변이체는 야생형 요산산화효소의 서열에서 3개 이상의 아미노산이 디엔 작용기(dien functional group)를 포함하는 비천연 아미노산으로 치환된 것이며,
상기 링커는 디에노필 작용기(dienophile functional group), 앵커, 및 티올 반응성기(thiol reactive moiety)를 포함하며,
여기서, 상기 알부민의 티올기 및 상기 링커의 티올 반응기가 반응을 일으켜 접합되고,
상기 요산산화효소 변이체의 비천연 아미노산에 포함된 디엔 작용기 및 상기 링커의 IEDDA 반응기가 반응을 일으켜 접합되며,
상기 반응 결과 요산산화효소-알부민 접합체가 생성됨; 및
상기 요산산화효소-알부민 접합체를 수득하는 것,
여기서, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 상기 요산산화효소 변이체에 3개 이상의 알부민이 링커를 통해 접합된 것을 특징으로 함.
실시예 36, 요산산화효소 변이체 한정
실시예 33 내지 실시예 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체는 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화 된 사량체 단백질이며, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 야생형의 요산산화효소 서브유닛과 비교해 1개 이상의 아미노산이 디엔 작용기를 포함하는 비천연 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는, 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법.
실시예 37, 비천연 아미노산 디엔 작용기 한정
실시예 33 내지 실시예 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 비천연 아미노산의 디엔 작용기는 테트라진 작용기 또는 트리아진 작용기인 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법.
실시예 38, 디에노필 작용기 한정
실시예 33 내지 실시예 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 링커의 상기 디에노필 작용기는 trans-cyclooctene 및 그 유도체에서 선택된 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법.
실시예 39, 티올 반응기 한정
실시예 33 내지 실시예 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 티올 반응기는 maleimide 또는 그 유도체, 및 3-arylpropiolonitriles 또는 그 유도체 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법.
실시예 40, 요산산화효소-링커 반응 조건 한정
실시예 33 내지 실시예 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체 및 링커를 반응시키는 것은 중성 pH 환경에서 수행되는 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법.
실시예 41, 반응물 마쿠시 청구항
실시예 33 내지 실시예 35 중 어느 하나에 있어서,
상기 요산산화효소 변이체는 서열번호 1 내지 서열번호 15에서 각각 독립적으로 선택된 아미노산 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 아미노산 서열로 표현되는 요산산화효소 변이체 서브유닛 4개가 올리고머화한 사량체이고, 여기서 상기 선택된 서열에 포함된 X는 도 4 내지 도 8의 표에서 선택된 비천연 아미노산이고,
상기 링커는 도 12의 표에서 선택되고,
상기 알부민은 서열번호 16 내지 서열번호 27에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되며,
상기 알부민의 티올기는 상기 서열번호 16 내지 서열번호 27에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열 중 34번째 시스테인의 티올기인 것을 특징으로 하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법.
요산산화효소 변이체
실시예 42, 요산산화효소 변이체
서열 내 3개 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 요산산화효소 변이체,
여기서, 각각의 상기 비천연 아미노산은 테트라진 작용기(tetrazine functional group) 또는 트리아진 작용기(triazine functional group)를 포함하는 것을 특징으로 함.
실시예 43, 3개의 요산산화효소 변이체 서브유닛 포함
실시예 42에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체는 1개의 야생형 요산산화효소 서브유닛 및 3개의 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화하여 형성된 사량체이고,
상기 각각의 요산산화효소 변이체 서브유닛은 야생의 요산산화효소 서브유닛 서열에서 1개 이상의 아미노산이 테트라진 작용기(tetrazine functional group) 또는 트리아진 작용기(triazine functional group)를 포함하는 비천연 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
실시예 44, 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛 포함
실시예 42에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체는 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화하여 형성된 사량체이고,
상기 각각의 요산산화효소 변이체 서브유닛은 야생의 요산산화효소 서브유닛 서열에서 1개 이상의 아미노산이 테트라진 작용기(tetrazine functional group) 또는 트리아진 작용기(triazine functional group)를 포함하는 비천연 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
실시예 45, 요산산화효소 변이체의 유래 한정
실시예 44에 있어서, 상기 각각의 요산산화효소 변이체 서브유닛은 Arthrobacter Globiformis 유래 야생형 요산산화효소 서브유닛 서열을 변형시킨 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
실시예 46, 요산산화효소 변이체 치환 위치 한정
실시예 44에 있어서, 상기 각각의 요산산화효소 변이체 서브유닛은 야생의 요산산화효소 서브유닛 서열 내 1개 이상의 치환 적합 위치의 아미노산을 상기 비천연 아미노산으로 치환한 것이고,
상기 치환 적합 위치는 요산산화효소 서브유닛의 기능과 구조에 별다른 영향을 미치지 않으며, 용매 접근성이 높은 위치인 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
실시예 47, 요산산화효소 변이체 치환 위치 결정 방법 한정
실시예 46에 있어서, 상기 치환 적합 위치는 분자 모델링 시뮬레이션 결과, 바람직하게는 Rosetta 분자 모델링 패키지의 스코어링 결과를 참조하여 결정된 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
실시예 48, Arthrobacter Globiformis Uox, 서열 택일
실시예 42 내지 실시예 47 중 어느 하나에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체는 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 및 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛을 포함하고,
상기 제1 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제2 요산산화효소 변이체 서브유닛, 제3 요산산화효소 변이체 서브유닛, 및 제4 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 1 내지 서열번호 15에서 각각 독립적으로 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현되고,
여기서, 각 서열 내의 X는 테트라진 작용기, 또는 트리아진 작용기를 포함하는 비천연 아미노산인 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
실시예 49, Arthrobacter Globiformis Uox, 비천연 아미노산 택일
실시예 48에 있어서, 각각의 요산산화효소 변이체 서브유닛 서열에 포함된 X는 도 4 내지 도 8에 개시된 표에서 각각 독립적으로 선택된 비천연 아미노산인 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
실시예 50, Arthrobacter Globiformis Uox, 서열 통일
실시예 57에 있어서, 상기 제1 요산산화효소 변이체, 제2 요산산화효소 변이체, 제3 요산산화효소 변이체, 및 제4 요산산화효소 변이체는 동일한 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 요산산화효소 변이체.
요산산화효소 변이체 발현 벡터
실시예 51, 요산산화효소 변이체 발현 벡터
실시예 42 내지 50 중 어느 하나의 요산산화효소 변이체를 발현할 수 있는 벡터로, 상기 요산산화효소 변이체에 포함된 비천연 아미노산에 해당하는 부분은 엠버 코돈(ambber codon; 5'-UAG-3'), 오커 코돈(ocher codon; 5'-UAA-3'), 및 오팔 코돈(opal codon; 5'-UGA-3') 중 선택된 것으로 암호화된 것을 특징으로 하는 벡터.
실시예 52, 요산산화효소 변이체 발현 벡터, 암호화 서열 한정
실시예 51에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 2 내지 서열번호 15 중 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산서열을 포함하고, 여기서, 상기 선택된 서열에 포함된 X는 비천연 아미노산이고, 상기 X와 대응되는 위치의 핵산서열은 엠버 코돈(ambber codon; 5'-UAG-3'), 오커 코돈(ocher codon; 5'-UAA-3'), 및 오팔 코돈(opal codon; 5'-UGA-3') 중 선택된 것으로 암호화된 것을 특징으로 하는 벡터.
실시예 53, 요산산화효소 변이체 발현 벡터 서열 한정
실시예 51 내지 실시예 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 다음 중 선택된 하나 이상의 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터:
5'-ATGACCGCAACCGCAGAAACCAGCACCGGCACCAAAGTTGTTCTGGGTCAGAATCAGTATGGTAAAGCAGAAGTTCGTCTGGTTAAAGTTACCCGTAATACCGCACGTCATGAAATTCAGGATCTGAATGTTACCAGCCAGCTGCGTGGTGATTTTGAAGCAGCACATACCGCAGGCGATAATGCACATGTTGTTGCAACCGATACACAGAAAAACACCGTTTATGCATTTGCCCGTTAGGGTTTTGCAACCACCGAAGAATTTCTGCTGCGTCTGGGTAAACATTTCACCGAAGGTTTTGATTGGGTTACCGGTGGTCGTTGGGCAGCACAGCAGTTTTTCTGGGATCGTATTAATGATCACGATCATGCCTTTAGCCGCAATAAAAGCGAAGTGCGTACCGCAGTTCTGGAAATTAGCGGTAGCGAACAGGCAATTGTTGCAGGTATTGAAGGTCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGTAGCGAGTTTCATGGTTTTCCGCGTGATAAATACACCACACTGCAAGAAACCACCGATCGTATTCTGGCAACCGATGTTAGCGCACGTTGGCGTTATAATACCGTTGAAGTTGATTTTGATGCGGTTTATGCAAGCGTTCGTGGTCTGCTGCTGAAAGCATTTGCAGAAACCCATAGCCTGGCACTGCAGCAGACAATGTATGAAATGGGTCGTGCAGTTATTGAAACCCATCCGGAAATTGATGAGATCAAAATGAGCCTGCCGAACAAACATCATTTTCTGGTTGATCTGCAGCCGTTTGGTCAGGATAATCCGAATGAAGTGTTTTATGCAGCAGATCGTCCGTATGGTCTGATTGAAGCAACCATTCAGCGTGAAGGTAGCCGTGCAGATCATCCGATTTGGAGTAATATTGCAGGTTTTTGCTAA-3' (서열번호 28);
5'-ATGACCGCAACCGCAGAAACCAGCACCGGCACCAAAGTTGTTCTGGGTCAGAATCAGTATGGTAAAGCAGAAGTTCGTCTGGTTAAAGTTACCCGTAATACCGCACGTCATGAAATTCAGGATCTGAATGTTACCAGCCAGCTGCGTGGTGATTTTGAAGCAGCACATACCGCAGGCGATAATGCACATGTTGTTGCAACCGATACACAGAAAAACACCGTTTATGCATTTGCCCGTGATGGTTAGGCAACCACCGAAGAATTTCTGCTGCGTCTGGGTAAACATTTCACCGAAGGTTTTGATTGGGTTACCGGTGGTCGTTGGGCAGCACAGCAGTTTTTCTGGGATCGTATTAATGATCACGATCATGCCTTTAGCCGCAATAAAAGCGAAGTGCGTACCGCAGTTCTGGAAATTAGCGGTAGCGAACAGGCAATTGTTGCAGGTATTGAAGGTCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGTAGCGAGTTTCATGGTTTTCCGCGTGATAAATACACCACACTGCAAGAAACCACCGATCGTATTCTGGCAACCGATGTTAGCGCACGTTGGCGTTATAATACCGTTGAAGTTGATTTTGATGCGGTTTATGCAAGCGTTCGTGGTCTGCTGCTGAAAGCATTTGCAGAAACCCATAGCCTGGCACTGCAGCAGACAATGTATGAAATGGGTCGTGCAGTTATTGAAACCCATCCGGAAATTGATGAGATCAAAATGAGCCTGCCGAACAAACATCATTTTCTGGTTGATCTGCAGCCGTTTGGTCAGGATAATCCGAATGAAGTGTTTTATGCAGCAGATCGTCCGTATGGTCTGATTGAAGCAACCATTCAGCGTGAAGGTAGCCGTGCAGATCATCCGATTTGGAGTAATATTGCAGGTTTTTGCTAA-3' (서열번호 29);
5'-ATGACCGCAACCGCAGAAACCAGCACCGGCACCAAAGTTGTTCTGGGTCAGAATCAGTATGGTAAAGCAGAAGTTCGTCTGGTTAAAGTTACCCGTAATACCGCACGTCATGAAATTCAGGATCTGAATGTTACCAGCCAGCTGCGTGGTGATTTTGAAGCAGCACATACCGCAGGCGATAATGCACATGTTGTTGCAACCGATACACAGAAAAACACCGTTTATGCATTTGCCCGTGATGGTTTTGCAACCACCGAAGAATTTCTGCTGCGTCTGGGTAAACATTTCACCGAAGGTTAGGATTGGGTTACCGGTGGTCGTTGGGCAGCACAGCAGTTTTTCTGGGATCGTATTAATGATCACGATCATGCCTTTAGCCGCAATAAAAGCGAAGTGCGTACCGCAGTTCTGGAAATTAGCGGTAGCGAACAGGCAATTGTTGCAGGTATTGAAGGTCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGTAGCGAGTTTCATGGTTTTCCGCGTGATAAATACACCACACTGCAAGAAACCACCGATCGTATTCTGGCAACCGATGTTAGCGCACGTTGGCGTTATAATACCGTTGAAGTTGATTTTGATGCGGTTTATGCAAGCGTTCGTGGTCTGCTGCTGAAAGCATTTGCAGAAACCCATAGCCTGGCACTGCAGCAGACAATGTATGAAATGGGTCGTGCAGTTATTGAAACCCATCCGGAAATTGATGAGATCAAAATGAGCCTGCCGAACAAACATCATTTTCTGGTTGATCTGCAGCCGTTTGGTCAGGATAATCCGAATGAAGTGTTTTATGCAGCAGATCGTCCGTATGGTCTGATTGAAGCAACCATTCAGCGTGAAGGTAGCCGTGCAGATCATCCGATTTGGAGTAATATTGCAGGTTTTTGCTAA-3' (서열번호 30);
5'-ATGACCGCAACCGCAGAAACCAGCACCGGCACCAAAGTTGTTCTGGGTCAGAATCAGTATGGTAAAGCAGAAGTTCGTCTGGTTAAAGTTACCCGTAATACCGCACGTCATGAAATTCAGGATCTGAATGTTACCAGCCAGCTGCGTGGTGATTTTGAAGCAGCACATACCGCAGGCGATAATGCACATGTTGTTGCAACCGATACACAGAAAAACACCGTTTATGCATTTGCCCGTGATGGTTTTGCAACCACCGAAGAATTTCTGCTGCGTCTGGGTAAACATTTCACCGAAGGTTTTTAGTGGGTTACCGGTGGTCGTTGGGCAGCACAGCAGTTTTTCTGGGATCGTATTAATGATCACGATCATGCCTTTAGCCGCAATAAAAGCGAAGTGCGTACCGCAGTTCTGGAAATTAGCGGTAGCGAACAGGCAATTGTTGCAGGTATTGAAGGTCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGTAGCGAGTTTCATGGTTTTCCGCGTGATAAATACACCACACTGCAAGAAACCACCGATCGTATTCTGGCAACCGATGTTAGCGCACGTTGGCGTTATAATACCGTTGAAGTTGATTTTGATGCGGTTTATGCAAGCGTTCGTGGTCTGCTGCTGAAAGCATTTGCAGAAACCCATAGCCTGGCACTGCAGCAGACAATGTATGAAATGGGTCGTGCAGTTATTGAAACCCATCCGGAAATTGATGAGATCAAAATGAGCCTGCCGAACAAACATCATTTTCTGGTTGATCTGCAGCCGTTTGGTCAGGATAATCCGAATGAAGTGTTTTATGCAGCAGATCGTCCGTATGGTCTGATTGAAGCAACCATTCAGCGTGAAGGTAGCCGTGCAGATCATCCGATTTGGAGTAATATTGCAGGTTTTTGCTAA-3' (서열번호 31);
5'-ATGACCGCAACCGCAGAAACCAGCACCGGCACCAAAGTTGTTCTGGGTCAGAATCAGTATGGTAAAGCAGAAGTTCGTCTGGTTAAAGTTACCCGTAATACCGCACGTCATGAAATTCAGGATCTGAATGTTACCAGCCAGCTGCGTGGTGATTTTGAAGCAGCACATACCGCAGGCGATAATGCACATGTTGTTGCAACCGATACACAGAAAAACACCGTTTATGCATTTGCCCGTGATGGTTTTGCAACCACCGAAGAATTTCTGCTGCGTCTGGGTAAACATTTCACCGAAGGTTTTGATTGGGTTACCGGTGGTCGTTGGGCAGCACAGCAGTTTTAGTGGGATCGTATTAATGATCACGATCATGCCTTTAGCCGCAATAAAAGCGAAGTGCGTACCGCAGTTCTGGAAATTAGCGGTAGCGAACAGGCAATTGTTGCAGGTATTGAAGGTCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGTAGCGAGTTTCATGGTTTTCCGCGTGATAAATACACCACACTGCAAGAAACCACCGATCGTATTCTGGCAACCGATGTTAGCGCACGTTGGCGTTATAATACCGTTGAAGTTGATTTTGATGCGGTTTATGCAAGCGTTCGTGGTCTGCTGCTGAAAGCATTTGCAGAAACCCATAGCCTGGCACTGCAGCAGACAATGTATGAAATGGGTCGTGCAGTTATTGAAACCCATCCGGAAATTGATGAGATCAAAATGAGCCTGCCGAACAAACATCATTTTCTGGTTGATCTGCAGCCGTTTGGTCAGGATAATCCGAATGAAGTGTTTTATGCAGCAGATCGTCCGTATGGTCTGATTGAAGCAACCATTCAGCGTGAAGGTAGCCGTGCAGATCATCCGATTTGGAGTAATATTGCAGGTTTTTGCTAA-3' (서열번호 32);
5'-ATGACCGCAACCGCAGAAACCAGCACCGGCACCAAAGTTGTTCTGGGTCAGAATCAGTATGGTAAAGCAGAAGTTCGTCTGGTTAAAGTTACCCGTAATACCGCACGTCATGAAATTCAGGATCTGAATGTTACCAGCCAGCTGCGTGGTGATTTTGAAGCAGCACATACCGCAGGCGATAATGCACATGTTGTTGCAACCGATACACAGAAAAACACCGTTTATGCATTTGCCCGTGATGGTTTTGCAACCACCGAAGAATTTCTGCTGCGTCTGGGTAAACATTTCACCGAAGGTTTTGATTGGGTTACCGGTGGTCGTTGGGCAGCACAGCAGTTTTTCTGGGATCGTATTTAGGATCACGATCATGCCTTTAGCCGCAATAAAAGCGAAGTGCGTACCGCAGTTCTGGAAATTAGCGGTAGCGAACAGGCAATTGTTGCAGGTATTGAAGGTCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGTAGCGAGTTTCATGGTTTTCCGCGTGATAAATACACCACACTGCAAGAAACCACCGATCGTATTCTGGCAACCGATGTTAGCGCACGTTGGCGTTATAATACCGTTGAAGTTGATTTTGATGCGGTTTATGCAAGCGTTCGTGGTCTGCTGCTGAAAGCATTTGCAGAAACCCATAGCCTGGCACTGCAGCAGACAATGTATGAAATGGGTCGTGCAGTTATTGAAACCCATCCGGAAATTGATGAGATCAAAATGAGCCTGCCGAACAAACATCATTTTCTGGTTGATCTGCAGCCGTTTGGTCAGGATAATCCGAATGAAGTGTTTTATGCAGCAGATCGTCCGTATGGTCTGATTGAAGCAACCATTCAGCGTGAAGGTAGCCGTGCAGATCATCCGATTTGGAGTAATATTGCAGGTTTTTGCTAA-3' (서열번호 33);
5'-ATGACCGCAACCGCAGAAACCAGCACCGGCACCAAAGTTGTTCTGGGTCAGAATCAGTATGGTAAAGCAGAAGTTCGTCTGGTTAAAGTTACCCGTAATACCGCACGTCATGAAATTCAGGATCTGAATGTTACCAGCCAGCTGCGTGGTGATTTTGAAGCAGCACATACCGCAGGCGATAATGCACATGTTGTTGCAACCGATACACAGAAAAACACCGTTTATGCATTTGCCCGTGATGGTTTTGCAACCACCGAAGAATTTCTGCTGCGTCTGGGTAAACATTTCACCGAAGGTTTTGATTGGGTTACCGGTGGTCGTTGGGCAGCACAGCAGTTTTTCTGGGATCGTATTAATTAGCACGATCATGCCTTTAGCCGCAATAAAAGCGAAGTGCGTACCGCAGTTCTGGAAATTAGCGGTAGCGAACAGGCAATTGTTGCAGGTATTGAAGGTCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGTAGCGAGTTTCATGGTTTTCCGCGTGATAAATACACCACACTGCAAGAAACCACCGATCGTATTCTGGCAACCGATGTTAGCGCACGTTGGCGTTATAATACCGTTGAAGTTGATTTTGATGCGGTTTATGCAAGCGTTCGTGGTCTGCTGCTGAAAGCATTTGCAGAAACCCATAGCCTGGCACTGCAGCAGACAATGTATGAAATGGGTCGTGCAGTTATTGAAACCCATCCGGAAATTGATGAGATCAAAATGAGCCTGCCGAACAAACATCATTTTCTGGTTGATCTGCAGCCGTTTGGTCAGGATAATCCGAATGAAGTGTTTTATGCAGCAGATCGTCCGTATGGTCTGATTGAAGCAACCATTCAGCGTGAAGGTAGCCGTGCAGATCATCCGATTTGGAGTAATATTGCAGGTTTTTGCTAA-3' (서열번호 34);
5'-ATGACCGCAACCGCAGAAACCAGCACCGGCACCAAAGTTGTTCTGGGTCAGAATCAGTATGGTAAAGCAGAAGTTCGTCTGGTTAAAGTTACCCGTAATACCGCACGTCATGAAATTCAGGATCTGAATGTTACCAGCCAGCTGCGTGGTGATTTTGAAGCAGCACATACCGCAGGCGATAATGCACATGTTGTTGCAACCGATACACAGAAAAACACCGTTTATGCATTTGCCCGTGATGGTTTTGCAACCACCGAAGAATTTCTGCTGCGTCTGGGTAAACATTTCACCGAAGGTTTTGATTGGGTTACCGGTGGTCGTTGGGCAGCACAGCAGTTTTTCTGGGATCGTATTAATGATCACGATCATGCCTTTAGCCGCAATAAAAGCGAAGTGCGTACCGCAGTTCTGGAAATTAGCGGTTAGGAACAGGCAATTGTTGCAGGTATTGAAGGTCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGTAGCGAGTTTCATGGTTTTCCGCGTGATAAATACACCACACTGCAAGAAACCACCGATCGTATTCTGGCAACCGATGTTAGCGCACGTTGGCGTTATAATACCGTTGAAGTTGATTTTGATGCGGTTTATGCAAGCGTTCGTGGTCTGCTGCTGAAAGCATTTGCAGAAACCCATAGCCTGGCACTGCAGCAGACAATGTATGAAATGGGTCGTGCAGTTATTGAAACCCATCCGGAAATTGATGAGATCAAAATGAGCCTGCCGAACAAACATCATTTTCTGGTTGATCTGCAGCCGTTTGGTCAGGATAATCCGAATGAAGTGTTTTATGCAGCAGATCGTCCGTATGGTCTGATTGAAGCAACCATTCAGCGTGAAGGTAGCCGTGCAGATCATCCGATTTGGAGTAATATTGCAGGTTTTTGCTAA-3' (서열번호 35);
5'-ATGACCGCAACCGCAGAAACCAGCACCGGCACCAAAGTTGTTCTGGGTCAGAATCAGTATGGTAAAGCAGAAGTTCGTCTGGTTAAAGTTACCCGTAATACCGCACGTCATGAAATTCAGGATCTGAATGTTACCAGCCAGCTGCGTGGTGATTTTGAAGCAGCACATACCGCAGGCGATAATGCACATGTTGTTGCAACCGATACACAGAAAAACACCGTTTATGCATTTGCCCGTGATGGTTTTGCAACCACCGAAGAATTTCTGCTGCGTCTGGGTAAACATTTCACCGAAGGTTTTGATTGGGTTACCGGTGGTCGTTGGGCAGCACAGCAGTTTTTCTGGGATCGTATTAATGATCACGATCATGCCTTTAGCCGCAATAAAAGCGAAGTGCGTACCGCAGTTCTGGAAATTAGCGGTAGCTAGCAGGCAATTGTTGCAGGTATTGAAGGTCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGTAGCGAGTTTCATGGTTTTCCGCGTGATAAATACACCACACTGCAAGAAACCACCGATCGTATTCTGGCAACCGATGTTAGCGCACGTTGGCGTTATAATACCGTTGAAGTTGATTTTGATGCGGTTTATGCAAGCGTTCGTGGTCTGCTGCTGAAAGCATTTGCAGAAACCCATAGCCTGGCACTGCAGCAGACAATGTATGAAATGGGTCGTGCAGTTATTGAAACCCATCCGGAAATTGATGAGATCAAAATGAGCCTGCCGAACAAACATCATTTTCTGGTTGATCTGCAGCCGTTTGGTCAGGATAATCCGAATGAAGTGTTTTATGCAGCAGATCGTCCGTATGGTCTGATTGAAGCAACCATTCAGCGTGAAGGTAGCCGTGCAGATCATCCGATTTGGAGTAATATTGCAGGTTTTTGCTAA-3' (서열번호 36);
5'-ATGACCGCAACCGCAGAAACCAGCACCGGCACCAAAGTTGTTCTGGGTCAGAATCAGTATGGTAAAGCAGAAGTTCGTCTGGTTAAAGTTACCCGTAATACCGCACGTCATGAAATTCAGGATCTGAATGTTACCAGCCAGCTGCGTGGTGATTTTGAAGCAGCACATACCGCAGGCGATAATGCACATGTTGTTGCAACCGATACACAGAAAAACACCGTTTATGCATTTGCCCGTGATGGTTTTGCAACCACCGAAGAATTTCTGCTGCGTCTGGGTAAACATTTCACCGAAGGTTTTGATTGGGTTACCGGTGGTCGTTGGGCAGCACAGCAGTTTTTCTGGGATCGTATTAATGATCACGATCATGCCTTTAGCCGCAATAAAAGCGAAGTGCGTACCGCAGTTCTGGAAATTAGCGGTAGCGAACAGGCAATTGTTGCAGGTATTGAAGGTCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGTAGCGAGTTTCATGGTTTTCCGCGTGATAAATACACCACACTGTAGGAAACCACCGATCGTATTCTGGCAACCGATGTTAGCGCACGTTGGCGTTATAATACCGTTGAAGTTGATTTTGATGCGGTTTATGCAAGCGTTCGTGGTCTGCTGCTGAAAGCATTTGCAGAAACCCATAGCCTGGCACTGCAGCAGACAATGTATGAAATGGGTCGTGCAGTTATTGAAACCCATCCGGAAATTGATGAGATCAAAATGAGCCTGCCGAACAAACATCATTTTCTGGTTGATCTGCAGCCGTTTGGTCAGGATAATCCGAATGAAGTGTTTTATGCAGCAGATCGTCCGTATGGTCTGATTGAAGCAACCATTCAGCGTGAAGGTAGCCGTGCAGATCATCCGATTTGGAGTAATATTGCAGGTTTTTGCTAA-3' (서열번호 37);
5'-ATGACCGCAACCGCAGAAACCAGCACCGGCACCAAAGTTGTTCTGGGTCAGAATCAGTATGGTAAAGCAGAAGTTCGTCTGGTTAAAGTTACCCGTAATACCGCACGTCATGAAATTCAGGATCTGAATGTTACCAGCCAGCTGCGTGGTGATTTTGAAGCAGCACATACCGCAGGCGATAATGCACATGTTGTTGCAACCGATACACAGAAAAACACCGTTTATGCATTTGCCCGTGATGGTTTTGCAACCACCGAAGAATTTCTGCTGCGTCTGGGTAAACATTTCACCGAAGGTTTTGATTGGGTTACCGGTGGTCGTTGGGCAGCACAGCAGTTTTTCTGGGATCGTATTAATGATCACGATCATGCCTTTAGCCGCAATAAAAGCGAAGTGCGTACCGCAGTTCTGGAAATTAGCGGTAGCGAACAGGCAATTGTTGCAGGTATTGAAGGTCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGTAGCGAGTTTCATGGTTTTCCGCGTGATAAATACACCACACTGCAAGAAACCACCGATCGTATTCTGGCAACCGATGTTAGCGCACGTTGGCGTTATAATACCTAGGAAGTTGATTTTGATGCGGTTTATGCAAGCGTTCGTGGTCTGCTGCTGAAAGCATTTGCAGAAACCCATAGCCTGGCACTGCAGCAGACAATGTATGAAATGGGTCGTGCAGTTATTGAAACCCATCCGGAAATTGATGAGATCAAAATGAGCCTGCCGAACAAACATCATTTTCTGGTTGATCTGCAGCCGTTTGGTCAGGATAATCCGAATGAAGTGTTTTATGCAGCAGATCGTCCGTATGGTCTGATTGAAGCAACCATTCAGCGTGAAGGTAGCCGTGCAGATCATCCGATTTGGAGTAATATTGCAGGTTTTTGCTAA-3' (서열번호 38);
5'-ATGACCGCAACCGCAGAAACCAGCACCGGCACCAAAGTTGTTCTGGGTCAGAATCAGTATGGTAAAGCAGAAGTTCGTCTGGTTAAAGTTACCCGTAATACCGCACGTCATGAAATTCAGGATCTGAATGTTACCAGCCAGCTGCGTGGTGATTTTGAAGCAGCACATACCGCAGGCGATAATGCACATGTTGTTGCAACCGATACACAGAAAAACACCGTTTATGCATTTGCCCGTGATGGTTTTGCAACCACCGAAGAATTTCTGCTGCGTCTGGGTAAACATTTCACCGAAGGTTTTGATTGGGTTACCGGTGGTCGTTGGGCAGCACAGCAGTTTTTCTGGGATCGTATTAATGATCACGATCATGCCTTTAGCCGCAATAAAAGCGAAGTGCGTACCGCAGTTCTGGAAATTAGCGGTAGCGAACAGGCAATTGTTGCAGGTATTGAAGGTCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGTAGCGAGTTTCATGGTTTTCCGCGTGATAAATACACCACACTGCAAGAAACCACCGATCGTATTCTGGCAACCGATGTTAGCGCACGTTGGCGTTATAATACCGTTTAGGTTGATTTTGATGCGGTTTATGCAAGCGTTCGTGGTCTGCTGCTGAAAGCATTTGCAGAAACCCATAGCCTGGCACTGCAGCAGACAATGTATGAAATGGGTCGTGCAGTTATTGAAACCCATCCGGAAATTGATGAGATCAAAATGAGCCTGCCGAACAAACATCATTTTCTGGTTGATCTGCAGCCGTTTGGTCAGGATAATCCGAATGAAGTGTTTTATGCAGCAGATCGTCCGTATGGTCTGATTGAAGCAACCATTCAGCGTGAAGGTAGCCGTGCAGATCATCCGATTTGGAGTAATATTGCAGGTTTTTGCTAA-3' (서열번호 39);
5'-ATGACCGCAACCGCAGAAACCAGCACCGGCACCAAAGTTGTTCTGGGTCAGAATCAGTATGGTAAAGCAGAAGTTCGTCTGGTTAAAGTTACCCGTAATACCGCACGTCATGAAATTCAGGATCTGAATGTTACCAGCCAGCTGCGTGGTGATTTTGAAGCAGCACATACCGCAGGCGATAATGCACATGTTGTTGCAACCGATACACAGAAAAACACCGTTTATGCATTTGCCCGTGATGGTTTTGCAACCACCGAAGAATTTCTGCTGCGTCTGGGTAAACATTTCACCGAAGGTTTTGATTGGGTTACCGGTGGTCGTTGGGCAGCACAGCAGTTTTTCTGGGATCGTATTAATGATCACGATCATGCCTTTAGCCGCAATAAAAGCGAAGTGCGTACCGCAGTTCTGGAAATTAGCGGTAGCGAACAGGCAATTGTTGCAGGTATTGAAGGTCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGTAGCGAGTTTCATGGTTTTCCGCGTGATAAATACACCACACTGCAAGAAACCACCGATCGTATTCTGGCAACCGATGTTAGCGCACGTTGGCGTTATAATACCGTTGAAGTTGATTTTGATGCGGTTTATGCAAGCGTTCGTGGTCTGCTGCTGAAAGCATTTGCATAGACCCATAGCCTGGCACTGCAGCAGACAATGTATGAAATGGGTCGTGCAGTTATTGAAACCCATCCGGAAATTGATGAGATCAAAATGAGCCTGCCGAACAAACATCATTTTCTGGTTGATCTGCAGCCGTTTGGTCAGGATAATCCGAATGAAGTGTTTTATGCAGCAGATCGTCCGTATGGTCTGATTGAAGCAACCATTCAGCGTGAAGGTAGCCGTGCAGATCATCCGATTTGGAGTAATATTGCAGGTTTTTGCTAA-3' (서열번호 40);
5'-ATGACCGCAACCGCAGAAACCAGCACCGGCACCAAAGTTGTTCTGGGTCAGAATCAGTATGGTAAAGCAGAAGTTCGTCTGGTTAAAGTTACCCGTAATACCGCACGTCATGAAATTCAGGATCTGAATGTTACCAGCCAGCTGCGTGGTGATTTTGAAGCAGCACATACCGCAGGCGATAATGCACATGTTGTTGCAACCGATACACAGAAAAACACCGTTTATGCATTTGCCCGTGATGGTTTTGCAACCACCGAAGAATTTCTGCTGCGTCTGGGTAAACATTTCACCGAAGGTTTTGATTGGGTTACCGGTGGTCGTTGGGCAGCACAGCAGTTTTTCTGGGATCGTATTAATGATCACGATCATGCCTTTAGCCGCAATAAAAGCGAAGTGCGTACCGCAGTTCTGGAAATTAGCGGTAGCGAACAGGCAATTGTTGCAGGTATTGAAGGTCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGTAGCGAGTTTCATGGTTTTCCGCGTGATAAATACACCACACTGCAAGAAACCACCGATCGTATTCTGGCAACCGATGTTAGCGCACGTTGGCGTTATAATACCGTTGAAGTTGATTTTGATGCGGTTTATGCAAGCGTTCGTGGTCTGCTGCTGAAAGCATTTGCAGAAACCCATAGCCTGGCACTGCAGCAGACAATGTATGAAATGGGTCGTGCAGTTATTGAAACCCATTAGGAAATTGATGAGATCAAAATGAGCCTGCCGAACAAACATCATTTTCTGGTTGATCTGCAGCCGTTTGGTCAGGATAATCCGAATGAAGTGTTTTATGCAGCAGATCGTCCGTATGGTCTGATTGAAGCAACCATTCAGCGTGAAGGTAGCCGTGCAGATCATCCGATTTGGAGTAATATTGCAGGTTTTTGCTAA-3' (서열번호 41);
요산산화효소 변이체의 제조방법
실시예 54, 요산산화효소 변이체의 제조방법
다음을 포함하는 요산산화효소 변이체의 제조방법:
직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현시킬 수 있는 벡터, 및 요산산화효소 변이체 발현 벡터를 포함하는 세포주를 준비하는 것,
이때, 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현시킬 수 있는 벡터는 외래 유래 suppressor tRNA 및 외래 유래 tRNA 합성효소를 발현시킬 수 있는 것이고,
상기 외래 유래 suppressor tRNA는 특정 종결 코돈을 인식할 수 있는 것이고,
상기 외래 유래 tRNA 합성효소는 테트라진 작용기 및/또는 트리아진 작용기를 포함하는 비천연 아미노산을 인식하여 상기 외래 유래 suppressor tRNA에 연결시킬 수 있는 것이고,
상기 요산산화효소 변이체 발현 벡터는 실시예 44 내지 58 중 어느 하나의 요산산화효소 변이체를 발현시킬 수 있는 것으로, 상기 요산산화효소 변이체 내에 포함된 비천연 아미노산에 대응하는 위치가 상기 특정 종결 코돈으로 암호화된 것을 특징으로 함; 및
상기 세포주를 테트라진 작용기 및/또는 트리아진 작용기를 포함하는 한 종류 이상의 비천연 아미노산이 포함된 배지에서 배양하는 것.
실시예 55, 벡터 한정
실시예 54에 있어서, 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현시킬 수 있는 벡터는 상기 외래 유래 suppressor tRNA를 암호화하는 핵산 및 상기 외래 유래 tRNA 합성효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 것인 벡터.
실시예 56, 종결 코돈 한정
실시예 54 내지 실시예 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 특정 종결 코돈은 엠버 코돈(ambber codon; 5'-UAG-3'), 오커 코돈(ocher codon; 5'-UAA-3'), 및 오팔 코돈(opal codon; 5'-UGA-3') 중 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
실시예 57, 세포주 변이
실시예 54 내지 실시예 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포주는 상기 특정 종결 코돈을 인식하는 release factor가 비활성화 된 세포주인 것을 특징으로 하는 방법.
실시예 58, 세포주 한정
실시예 57에 있어서, 상기 세포주는 E.Coli C321.ΔA.exp(Addgene, ID:49018)인 것을 특징으로 하는 방법.
실시예 59, 직교적 tRNA/합성효소 페어 한정
실시예 54 내지 실시예 58 중 어느 하나에 있어서, 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어는 Methanococcus jannaschii 유래의 suppressor tRNA (MjtRNATyr CUA), 및 Methanococcus jannaschii 유래의 tyrosyl-tRNA 합성효소 (MjTyrRS)인 것을 특징으로 하는 방법.
실시예 60, 직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현하는 벡터 한정
실시예 58에 있어서, 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현할 수 있는 벡터는 Yang et.al (Temporal Control of Efficient In Vivo Bioconjugation Using a Genetically Encoded Tetrazine-Mediated Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction, Bioconjugate Chemistry, 2020, 2456-2464)에 개시된 pDule_C11인 것을 특징으로 하는 방법.
실시예 61, 요산산화효소 변이체 서열 한정
실시예 60에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체 발현 벡터는 실시예 42 내지 실시예 50 중 어느 하나의 요산산화효소 변이체를 발현시킬 수 있는 것으로, 상기 요산산화효소 변이체 서열에 포함된 비천연 아미노산이 상기 특정 종결 코돈으로 암호화된 것을 특징으로 하는 방법.
요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법 2
실시예 62, 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법, 행위 기준
다음을 포함하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법:
(a) 알부민 및 링커를 혼합하여 알부민-링커 접합체를 수득하는 과정,
여기서, 상기 링커는 디에노필 작용기(dienophile functional group), 앵커, 및 티올 반응성기(thiol reactive moiety)를 포함함;
(b) 상기 (a)에서 수득한 알부민-링커 접합체와 요산산화효소 변이체를 혼합하는 과정,
여기서, 상기 요산산화효소 변이체는 3개 이상의 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화된 4량체이고,
상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 Arthrobacter globiformis 유래 야생형 요산산화효소 서브유닛의 변이체로, 각각 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하고,
상기 비천연 아미노산은 디엔 작용기(dien functional group)를 포함함;
(c) 상기 (b)의 혼합물로부터 요산산화효소-알부민 접합체를 수득하는 과정,
여기서, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 3개 이상의 상기 알부민이 상기 링커를 통해 상기 요산산화효소 변이체에 접합된 것을 특징으로 함.
실시예 63, 각 작용기 한정
실시예 62에 있어서,
상기 링커의 디에노필 작용기는 trans-cylooctene 또는 상기 trans-cylooctene의 유도체이고,
상기 링커의 티올 반응성기는 maleimide 또는 상기 maleimide의 유도체, 및 3-arylpropiolonitriles, 또는 상기 3-arylpropiolonitriles의 유도체 중 선택된 것이고,
상기 요산산화효소 변이체에 포함된 비천연 아미노산의 디엔 작용기는 테트라진 또는 테트라진 유도체, 및 트리아진 또는 트리아진 유도체 중 선택된 것임.
실시예 64, 반응물 마쿠시
실시예 62 내지 실시예 63 중 어느 하나에 있어서,
상기 요산산화효소 변이체는 서열번호 1 내지 서열번호 15에서 각각 독립적으로 선택된 아미노산 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 아미노산 서열로 표현되는 요산산화효소 변이체 서브유닛 4개가 올리고머화한 사량체이고, 여기서 상기 선택된 서열에 포함된 X는 도 4 내지 도 8의 표에서 선택된 비천연 아미노산이고,
상기 링커는 도 12의 표에서 선택되고,
상기 알부민은 서열번호 16 내지 서열번호 27에서 선택된 서열, 또는 상기 선택된 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현됨.
요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법 3
실시예 65, 신규 공정
다음을 포함하는 요산산화효소-알부민 접합체의 제조방법:
(a) 요산산화효소 변이체를 포함하는 세포를 파쇄하는 과정,
여기서, 상기 요산산화효소 변이체는 실시예 1 내지 실시예 21 중 선택된 어느 하나임;
(b) 상기 (a)의 결과물에 알부민-링커 접합체를 첨가하는 과정,
여기서, 상기 알부민-링커 접합체는 [구조식 4]로 표현됨:
[구조식 4]
T-A-J2-HSA,
여기서, 상기 T는 디에노필 작용기이고, 상기 A는 앵커이고, 상기 J2는 알부민-링커 접합부이고, 상기 HSA는 인간 혈청 알부민임; 및
(c) 상기 (b)의 결과물로부터 요산산화효소-알부민 접합체를 수득하는 과정,
여기서, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 3개 이상의 알부민이 링커를 통해 요산산화효소 변이체와 접합된 것임.
실시예 66, 알부민-링커 접합체 구성 한정
실시예 66에 있어서,
상기 알부민-링커 접합체의 디에노필 작용기는 trans-cyclooctene 또는 상기 trans-cyclooctene의 유도체이고,
상기 알부민-링커 접합체의 앵커는 도 10의 표에서 선택된 것이고, 여기서 J1은 상기 디에노필 작용기이고, J2는 상기 알부민-링커 접합부이고,
상기 알부민-링커 접합체의 알부민-링커 접합부는 도 11의 표에서 선택된 것이고, 여기서 (1)은 알부민과 연결되고, (2)는 상기 앵커와 연결되고,
상기 알부민-링커 접합체의 알부민은 서열번호 16 내지 서열번호 27에서 선택된 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열과 80% 이상 일치하는 서열로 표현됨.
발명의 실시를 위한 형태
실험예 1 Arthrobacter Globiformis 유래 요산산화효소-알부민 접합체 제조 및 평가 1
실험예 1.1 실험재료
4-(1,2,3,4-tetrazin-3-yl) phenylalanine (frTet)을 Aldlab_chemical (Woburn, MA, USA)에서 구입했다. Trans-cylooctene (TCO)-Cy3는 AAT Bioquest (Sunnyvale, CA, USA)에서 구입했다. TCO-PEG4-maleimide (TCO-PEG4-MAL) 및 amine-axially substituted TCO (TCO-amine)는 FutureChem (Seoul, Korea)에서 구입했다. Pentafluor-ophenyl ester (PFP)-PEG4-APN는 CONJU-PROBE (San Diego, CA, USA)에서 구입했다. 일회용 PD-10 탈염 컬럼(desalting columns) 및 Superdex 200 10/300 GL 증가 컬럼(Increase columns)은 Cytiva (Uppsala, Sweden)에서 구입했다. 분자량 컷오프(molecular weight cut-off; MWCO)가 10 및 100 kDA인 Vivaspin 6 원심 농축기(centrifugal concentrators)는 Sartorius (Got-tingen, Germany)에서 구입했다. 인간 혈청 알부민(HSA) 및 기타 모든 화학 시약은 달리 언급되지 않은 한, Sigma-Aldrich에서 구입했다.
실험예 1.2 Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소 변이체(AgUox-frTet) 수득을 위한 벡터 제조
Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소(AgUox) 및 그 변이체를 암호화하는 유전자는 Macrogen (Seoul, South Korea)에 의뢰해 합성했다. 야생형 AgUox(AgUox-WT), 또는 비천연 아미노산인 frTet이 서열 내에 도입된 AgUox 변이체 (AgUox-frTet)를 발현시키기 위해, 합성된 상기 유전자를 주형으로 삼고, 프라이머 pBAD-AgUox_F (5'-GCCGCCATGGTGTCTGCTGTGAAGG-3', 서열번호 70) 및 pBAD-AgUox_R (5'-GCCGAGATCTTTAATGGTGATGGTG-3', 서열번호 71)를 사용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 증폭했다. 증폭된 유전자를 2개의 제한효소 (NcoI 및 BglIII)로 절단하고, pBAD 벡터의 NcoI 및 BgIII 부위에 상기 유전자를 삽입하여 pBAD_AgUox를 합성하였다. AgUox-WT 서열 내 196번 위치의 글루탐산 코돈을 엠버 코돈 (UAG)로 대체하기 위해, 상기 pBAD-AgUox를 주형으로 사용하고, 프라이머 AgUox-196Amb_F (5'-GTCGAAGTCCACCTATACGGTGTTGTAACGCCAACGG-3' 서열번호 79) 및 AgUox-196Amb_R (5'-CCGTTGGCGTTACAACACCGTATAGGTGGACTTCGAC-3', 서열번호 80)를 사용하여 pBAD-AgUox_196amb를 제조했다.
실험예 1.3 AgUox-frTet 수득
AgUox-frTet을 발현시키기 위해, Yang et. al, Temporal Control of Efficient In Vivo Bioconjugation Using a Genetically Encoded Tetrazine-Mediated Inverse-Electron Demand Diels-Alder Reaction, Bioconjugate Chemistry, 1818, 1856-1684에 개시된 방법을 참조하여, C319ΔA.exp, pDule_C11, 및 pBAD_AgUox-196amb를 사용하여 아래와 같은 방법으로 AgUox-frTet를 발현시켰다. frTet에 대해 최적화된 MjtRNATyr/MjTyrRS를 포함하는 E.coli 세포를 준비했다. ampicillin (100 μg/mL) 및 tetracycline (10 μg/mL)이 포함된 Luria Broth (LB) 배지에서 배양된 E.coli 세포를 at 37℃에서 밤새 진탕하면서, 동일 조건 하 2x YT 배지에 접종했다. 진탕 배양 2.5시간 후, 상기 세포를 포함하는 배지가 600 nm에서 광학 밀도 0.5에 도달했을 때, frTet 및 L-(+)-아라비노스를 배지에 첨가하여 최종 농도가 각각 1mM 및 0.4%(w/v)가 되도록 하였다. 이를 5 시간동안 배양한 후, 세포를 5000rpm에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, AgUox-frTet을 수득했다. 상기 AgUox-frTet을 제조업제의 프로토콜(Qiagen)에 따라 4℃에서 고정 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제했다. 상기 정제된 AgUox-frTet은 PD-10 컬럼을 사용하여 PBS(pH 7.4)로 탈염했다. AgUox-WT의 발현 및 정제 과정은 AgUox-frTet과 유사한 방법을 따르되, 발현 단계 동안 배양 배지에 테트라사이클린 및 frTet을 첨가하지 않았다.
실험예 1.4 제조된 AgUox-frTet 분석 및 확인
상기 제조된 AgUox-frTet 및 AgUox-WT를 확인하기 위해, 이들을 제조업체의 프로토콜에 따라 트립신으로 분해시켰다. 총 0.4mg/mL의 Uox 변이체(AgUox-WT 및 AgUox-frTet)를 37℃에서 밤새 분해한 후 ZipTip C18을 사용하여 탈염했다. 트립신으로 분해된 혼합물을 2,5-디히드록시벤조산(DHB) 매트릭스 용액(18:70(v/v) 아세토니트릴: 트리플루오로아세트산 0.1% 내 DHB 18mg/mL)과 혼합한 후, Microflex MALDI-TOF/MS 장치(Bruker Corporation, Billerica, MA, USA)를 사용해 분석했다.
실험예 1.5 AgUox-WT 및 AgUox-frTet의 부위별 형광 염료 라벨링
정제된 AgUox-WT 및 AgUox-frTet을 PBS(pH 7.4)에서 실온에서 1:2 몰비로 TCO-Cy3 형광 염료와 반응시켰다. 2시간 후, 반응 혼합물을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)에 적용하였다. 단백질 겔의 형광 이미지는 ChemiDoc XRS+ 시스템(302 nm에서 일루미네이션, 510-70 nm 필터, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 사용하여 수득하였다. 형광분석 후 단백질 겔을 Coomassie Brilliant Blue R-250 염료로 염색하였다. 백색광 조명을 사용하는 ChemiDoc XRS+ 시스템을 사용하여 단백질 겔 이미지를 수득하였다.
상기 실험예 1.3 내지 실험예 1.4에 의해 제조된 AgUox-WT 및 AgUox-frTet을 분석한 결과를 도 13 내지 도 14에 나타냈다.
실험예 1.6 AgUox-HSA 접합체 제조 (AgUox-MAL-HSA and AgUox-APN-HSA)
AgUox에서 부위 특이적 알부미네이션을 수행하기 위해, HiTrap Q HP 음이온 교환 컬럼을 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 HSA를 정제하였다. 정제된 HSA를 PBS(pH 7.0)로 탈염한 후, TCO-MAL과 반응시키되, 실온 하 PBS(pH 7.0)에서 1:4의 몰비로 반응시켰다. 2시간 후, 반응 혼합물을 PD-10 컬럼을 사용하여 PBS(pH 7.4)로 탈염하고, 미반응 TCO-PEG4-MAL 링커를 제거하여 MAL-HSA 접합체를 얻었다. 정제된 Uox-frTet을 PBS(pH 7.4)에서 1:4의 몰비로 MAL-HSA와 실온에서 5시간 동안 반응시켰다. 컨쥬게이션(접합) 후, 상기 반응 혼합물을 NGC Quest 10 Plus 크로마토그래피 시스템(Bio-Rad Laboratories Inc., Berkeley, CA, USA)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC)에 적용했다. 용출된 분획의 분자량 및 순도는 SDS-PAGE를 사용하여 분석하였고, 4개의 MAL-HSA 분자(AgUox-MAL-HSA)에 접합된 AgUox-frTet에 상응하는 분획을 선별하고 추가 분석을 위해 농축했다. TCO 및 APN을 함유하는 이종-이작용성 크로스링커(hetero-bifunctional cross-linker)를 통해 AgUox-HSA 접합체를 생성하기 위해, TCO-아민을 PFP-PEG4-APN과 반응시키되, 실온에서 30분 동안 DMSO에서 1:1의 몰비로 반응시켰다. 정제된 HSA를 50mM 붕산나트륨 완충액(pH 9.0)으로 완충액 교환하였다. 50mM 붕산나트륨 완충액(pH 9.0)에서, 정제된 HSA를 TCO-PEG4-APN과 1:4의 몰비로 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 미반응 TCO-APN 링커를 제거하기 위해, 반응 혼합물을 PD-10 컬럼을 사용하여 PBS(pH 7.4)로 탈염하였다. APN을 함유하는 링커를 통해 4개의 HSA 분자에 접합된 AgUox-frTet의 접합(AgUox-APN-HSA) 및 정제는 AgUox-MAL-HSA와 유사한 방식으로 수행되었다.
상기 실험예 1.6에 의해 AgUox-HSA 접합체를 제조한 결과를 도 15 내지 도 16에 나타냈다.
실험예 1.7 AgUox-HSA 접합체에 대한 효소 활성 평가
실험예 1.3에 따라 제조된 요산산화효소 변이체 및 실험예 1.6에 따라 제조된 요산산화효소-알부민 접합체에 대해, 효소 활성 평가를 진행했다. 구체적으로, 효소 활성 분석 완충액(50mM 붕산나트륨 및 0.2M NaCl, pH 9.5) 중 200μM 요산 100μL를 120nM 정제된 AgUox-WT 또는 AgUox-HSA 접합체 100μL에 첨가했고, 분광광도계를 사용하여 293nm에서의 흡광도 변화로 측정했다. 요산산화효소-알부민 접합체에 대해서도 유사한 방법으로 효소 활성을 측정하였다.
상기 실험예 1.7에 따라 효소 활성 평가를 진행한 결과를 도 28에 나타냈다. 효소 활성 평가 결과, 상기 요산산화효소-알부민 접합체의 활성은 야생형의 요산산화효소(AgUox-WT)와 비교하여 약 94%였으며, 이는 요산산화효소 변이체(AgUox-frTet)의 활성과 비슷했다. 따라서, MAL 또는 APN을 포함하는 링커를 이용하여 위치-특이적으로 알부민을 접합시킨 요산산화효소-알부민 접합체는 요산산화효소의 효소 활성을 실질적으로 감소시키지 않는 것으로 나타났다.
실험예 1.8 AgUox-HSA 접합체에 대한 in vitro 안정성 평가
상기 생산된 요산산화효소-알부민 접합체(AgUox-MAL-HSA 및 AgUox-APN-HSA)에 대해 in vitro 안정성을 평가하고, MALDI-TOF MS 분석을 통해 각 단백질의 밴드를 확인했다. 구체적으로, 정상적인 혈액 환경을 모방한 37℃의, 5μM 티올 글루타티온과 20μM HSA를 포함하는 PBS 완충액(pH 7.4)에서 AgUox-HSA 접합체를 5일간 배양했고, SDS-PAGE를 이용하여 분석했다 (도 30).
또한, MALDI-TOF/MS 분석을 위하여, 상기 샘플을 시나핀산(sinapinic acid; SA) 매트릭스 용액 II(20 mg/mL의 SA를 30:70(v/v) 아세토니트릴:트리플루오로아세트산 0.1% 수용액에 넣은 것)과 혼합했고, SA 매트릭스 용액 (에탄올 중 SA 20mg/mL)로 코팅된 표적 플레이트에 로딩했다. 상기 샘플의 질량 스펙트럼을 Microflex MALDI-TOF/MS (Bruker Corporation, Billerica, MA, USA)를 이용하여 분석했다 (도 29).
상기 실험 수행 결과, APN을 포함하는 링커를 통해 제조된 요산산화효소-알부민 접합체(AgUox-APN-HSA)가 혈액과 유사한 조건 하 매우 안정성이 높은 것으로 나타났다.
실험예 1.9 AgUox-HSA 접합체에 대한 In vivo 반감기 확인 (PK profile)
마우스에서 AgUox-HSA 접합체의 안정성 분석은 광주과학기술원 (GIST-1818-037)의 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 수행하였다. AgUox-WT, AgUox-MAL-HSA, 또는 AgUox-APN-HSA 각각을 pH 7.4에서 180 μL PBS의 AgUox 기준 5.0 nmol을 어린 암컷 BALB/c 마우스 (n=4)의 꼬리 정맥에 주사했다. AgUox-WT의 경우 15분, 3 시간, 6 시간 및 12시간 후 안와후 출혈(retro-orbital bleeding)을 통해 혈액 샘플을 했고, AgUox-HSA 접합체의 경우 같은 방법으로 15분, 12 시간, 18 시간, 48 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간, 108 시간 및 118시간에 혈액 샘플을 수집했다. 상기 수집한 혈액에서 혈청을 분리한 후, AgUox-WT 및 AgUox-MAL-HSA, 및 AgUox-APN-HSA의 혈청 활성을 100 μM의 요산을 포함하는 효소 활성 분석 완충액 100 μL를 5 μL의 혈청을 포함하는 100 μL 효소 활성 완충액에 첨가하여 193 nm에서의 흡광도 변화에 의해 측정하였다.
상기 in vivo 반감기 확인 결과를 도 17에 나타냈다. 실험 결과, 알부민을 접합하지 않은 AgUox-WT에 비해 AgUox-APN-HSA 및 AgUox-MAL-HSA에서 현저한 반감기 상승이 나타남을 확인했다.
실험예 2 Arthrobacter Globiformis 유래 요산산화효소-알부민 접합체 제조 및 평가 2
실험예 2.1 실험 재료
박토트립톤(Bacto tryptone) 및 효모 추출물은 BD Biosciences (San Jose, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Ni-nitrilotriacetic acid (NTA) agarose는 Qiagen (Hilden, Germany)에서 구입하여 사용했으며, frTet [4- (1,2,3,4-tetrazin-3-yl)phenylalanine]은 Aldlab_media (Woburn, MA, 미국). TCO-Cy3는 AAT Bioquest (Sunnyvale, CA, USA)에서 구입하여 사용했다. 축 치환된 트랜스-시클로옥텐말레이미드 (TCO-말레이미드, A)는 FutureChem (한국 서울)에서 구입했다. 일회용 PD-10 탈염 컬럼, HiTrap Q HP 음이온 교환 컬럼 및 Superdex 180 10/180 GL 크기 증가 제외 컬럼은 Cytiva (스웨덴 웁살라)에서 구입했다. 상기 시약을 제외한 다른 시약들은 Sigma-Aldrich (미국 미주리 주 세인트 루이스)에서 구입하여 사용하였다.
실험예 2.2 AgUox의 frTet 결합 영역에 대한 분석
frTet 결합 영역 스크리닝은 AgUox 구조 (PDB ID : 2YZE)를 기반으로 점 돌연변이 및 에너지 스코어링 기능을 수행하는 분자 모듈링 소프트웨어 PyRosetta (Python 기반 Rosetta 분자 모델링 패키지)를 사용하여 수행되었다. 야생형(WT) AgUox의 아미노산 서열을 Y(티로신) 또는 W(트립토판) 서열로 대체한 다음, 단백질의 전체 원자 에너지를 계산했다. PyRosetta의 에너지 기능은 천연 단백질 형태가 고유하고 저에너지 열역학적으로 안정적인 형태를 나타낸다는 Anfinsen의 가설을 기반으로 한다. 점수 값은 반데르발스 힘, 인력, 반발 에너지, 가우스 배제 암시적 용매화 및 거리로 구분된 서로 다른 잔기에 있는 원자 사이의 수소 결합 (단, 장거리, 백본 측사슬 및 측쇄)의 합을 나타낸다.
실험예 2.3 AgUox-WT 및 AgUox-frTet 변이체의 발현을 위한 플라스미드 제조
AgUox는 Macrogen (서울, 한국)에서 합성하고 pBAD에 클로닝하고 영역별 frTet 결합을 통해 pBAD_AgUox 플라스미드를 생성했다. PyRosetta 스코어링에 의해 선택된 영역을 앰버 코돈으로 대체하기 위해 pBAD_AgUox 벡터를 주형으로 사용하여 영역 지정 돌연변이 유발 PCR을 수행했다. 사용된 프라이머는 표 1 및 표 2와 같다.
[표 1]
[표 2]
실험예 2.4 AgUox-WT 및 AgUox-frTet 변이체의 발현 및 정제
frTet을 AgUox에 영역 특이적으로 결합시키기 위해, 각 변이 플라스미드를 C319ΔpDule C11RS] 컴피턴트 세포로 형질 전환하여, C319ΔpDule C11RS] [pBAD_AgUox_Amb 변이체] E.coli 세포를 생성했다. 형질 전환체를 암피실린 (100μg/mL) 및 테트라사이클린 (10μg/mL)을 포함하는 Luria 브로스 배지에서 밤새 37 ℃조건으로 배양했다. 전 배양된 대장균 세포를 동일한 신선한 배지에 접종하였다. 단백질 발현을 유도하기 위해 최종 농도 1mM와 frTet 및 아라비노스 0.4 %를 각각 배지에 첨가하여 0.5 % (600nm)의 광학 밀도에 도달하도록 하였다. 배양 배지를 흔들면서 37 ℃에서 5 시간 동안 인큐베이션 한 후, 4 ℃에서 10 분 동안 5,000rpm에서 원심 분리를 통해 생성물을 얻었다. AgUox 함유 frTet 변이체는 제조업체의 프로토콜에 따라 Ni-NTA와 His-tag 간의 상호작용을 통해 고정된 금속 친화성 크로마토 그래피로 정제되었다. AgUox-WT의 발현 및 정제는 테트라사이클린 및 frTet의 첨가 없이, AgUox-frTet 변이체와 유사하게 수행하였다.
실험예 2.5 매트릭스 지원 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분석법 (MALDI-TOF MS) 및 AgUox 변종의 염료 라벨링 분석
정제된 AgUox-WT 및 AgUox-frTet 변이체 (0.4 mg/mL)를 제조업체의 프로토콜에 따라 트립신 분해 후, ZipTip C18로 탈염했다. 트립신으로 소화된 단백질의 단편을 2,5-디하이드록시벤조산 용액과 1 : 1 비율로 혼합하였다. 이 혼합물을 타겟 플레이트 (Bruker Corporation, Billerica, MA, USA)에 로딩하고 MALDI-TOF MS (Bruker)로 분자량을 분석하였다.
AgUox-frTet 변이체의 IEDDA 반응성을 확인하기 위해 정제된 AgUox-WT 및 AgUox-frTet 변이체를 인산염 완충 식염수 (PBS, pH 7.4)로 탈염한 다음, 실온에서 2 시간 동안 TCO-Cy3와 1 : 2의 몰비로 혼합했다. 그 후, TCO-Cy3를 첨가하거나 첨가하지 않은 혼합물을 SDS-PAGE로 분리하였다. 겔은 ChemiDoc XRS + 시스템 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에서 형광 분석 (여기: 182 nm, 필터 510/70 nm)을 수행한 후 Coomassie brilliant blue (CBB) 염색 후 시각화했다.
실험예 2.6 AgUox-WT 및 AgUox-frTet 변이체의 효소 활성 분석 및 열 안정성 평가
AgUox 변이체 (효소 활성 분석 완충액 [50 mM 붕산 나트륨 및 150 mM NaCl]에서 118 nM에서 100 μL)를 효소 활성 분석 완충액에서 100 μL의 180 μM 요산과 혼합했다. 그 다음, 193 nm에서 혼합 용액의 흡광도를 사용하여 요산의 분해를 측정했다. AgUox-WT 및 AgUox-frTet 변이체의 혈청 활성은 요산을 포함하는 효소 분석 버퍼에서 희석된 혈청의 효소 활성 분석으로 측정하였다. 즉, 간략하게 전혈에서 분리된 10 μL의 혈청을 90 μL의 효소 활성 분석 완충액에 희석한 다음 180 μM 요산 용액 100 μL와 혼합하고 193 nm에서 흡광도를 측정한 것이다. AgUox 변이체의 열 안정성을 측정하기 위해 각 변이체를 PBS (pH 7.4)에서 10일 동안 인큐베이션하고 0, 5 및 10 일에 위에서 설명한 효소 활성 분석을 실시하였다.
실험예 2.7 HSA 결합 AgUox-frTet 변이체의 생성
HSA(human serum albumin)는 이전에 보고된 바와 같이 18mM Tris 완충액 (pH 7.0)에서 음이온 교환 크로마토 그래피 (Hitrap Q HP 컬럼)를 사용하여 고분자량 응집체를 제거했다. 정제된 HSA를 PBS (pH 7.0)로 탈염하고 TCO-MAL 헤테로이기작용성 가교제와 1 : 4의 몰비로 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 그 후, 혼합물을 PBS (pH 7.4)로 탈염하여 HSA-TCO 접합체를 생성하였다. 정제된 AgUox-frTet 변이체를 HSA-TCO와 1 : 4의 몰비로 실온에서 5 시간 동안 혼합한 다음, SDS-PAGE로 분석하여 영역별 알부민 접합 수율을 확인했다. 추가 활성 및 약동학 연구를 위해 크기 배제 크로마토 그래피를 사용하여 HSA-접합 AgUox-196frTet (AgUox-196HSA)를 반응 혼합물에서 분리했다. Uox-HSA 접합체에 해당하는 용출 피크는 SDS-PAGE 분석으로 분자량을 측정한 후 효소 활성 분석 및 약동학 연구에 사용하였다.
실험예 2.8 약동학 연구
180 μL PBS (pH 7.4)에서 AgUox-WT 또는 AgUox-HSA4의 4.4 nmol (단량체 AgUox 기준)을 어린 암컷 BALB / c 마우스 (n = 4)의 꼬리에 정맥 주사했다. 마우스에서의 혈중 반감기 측정을 위해서, AgUox-WT 샘풀 주입 후 15분, 3, 6, 12시간에, AgUox-HSA의 경우에는 15분, 3,6, 12, 18, 48 및 72시간에 안와정맥 채혈법으로 혈액 샘플을 확보하였다. 혈청 내 잔류 AgUox-WT 또는 AgUox-HSA4 정량화를 위해 효소 활성 분석을 실시하였다. 효소 활성 분석은 수집된 전혈 샘플을 회전시키고 분리된 혈청에서 측정되었다. 혈청 활성은 수집된 다른 전혈 샘플로부터 분리된 혈청에서 측정되었다.
실험예 2.9 frTet (AgUox-frTet) 변이체를 포함하는 AgUox-WT 및 AgUox의 제조
HSA 결합 AgUox 변이체를 준비하기 위해 먼저, HSA가 결합할 수 있는 AgUox의 최적 영역을 결정했다. 돌연변이는 단백질이 잘못 접히거나 펴지게 한다. PyRosetta를 이용하여 단일 돌연변이를 포함하는 AgUox 변이체의 에너지 점수를 계산했다. 각 변이체의 에너지 점수는 상대적 접힘 안정성으로 변환되었다. frTet (페닐알라닌 유사체)에 대한 변이와 비슷하게, Y 또는 W에 대한 변이를 AgUox-WT의 다양한 영역에 도입하였다. Y 및 W 변이에 대한 에너지 점수는 AgUox-WT (표 TTT) 및 frTet (AgUox-frTet)을 포함하는 14 개의 AgUox 변이 (Ag1-14, 도 18)로 확인되었다. 14 개의 AgUox-frTet 변이체를 제조하기 위해 PCR 매개 변이 유발에 의해 AgUox-WT의 14 개 영역 각각에 앰버 코돈을 도입 하였다. 그 다음, C319delAexp E. coli 세포를 ftTet에 특이적으로 조작된 MjtRNATyr / MjTyrRS 및 각 AgUox 변이체를 갖는 벡터를 인코딩하는 pDule C11RS 플라스미드로 공동 형질 전환시켰다. 형질전환체는 방법 3에 전술한 바와 같이, 각 AgUox-frTet 변이체를 발현하도록 배양되었다. CBB 염색 단백질 겔에서, 단량체 AgUox에 해당하는 34kDa의 분자량은 유도 및 정제된 AgUox-frTet 후 세포 용해물의 레인에서 검출되었다(도 19). 전반적으로 이러한 결과는 AgUox-WT 및 AgUox-frTet 변이체가 성공적으로 발현 및 정제되었음을 의미한다. 표 3는 (a) 트립토판 또는 (b) 티로신으로의 점 돌연변이 후 AgUox의 ROSETTA 점수를 나타낸 것이다.
[표 3]
실험예 2.10 AgUox 변이체의 효소 활성 및 열 안정성 분석
AgUox에 frTet의 결합 영역이 생물학적 기능에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, 정제된 AgUox-WT 및 AgUox-frTet 변이체의 효소 활성을 비교했다. AgUox-frTet 변이체의 효소 활성은 AgUox-WT (도 20a)에 비해 1-93 % 사이에서 다양하게 나타났고, 이는 frTet 결합 영역이 AgUox의 기능에 상당한 영향을 미친다는 것을 의미한다. AgUox-frTet 변이체 Ag1, 6, 8, 10 및 12는 비교적 높은 효소 활성을 나타냈다(도 20a). AgUox의 활성 부위는 단량체 사이의 경계면에 있다. 이러한 변이체 (Ag1, 6, 8, 10 및 12)의 frTet 결합 영역은 단량체 간의 활성 부위 및 계면에서 떨어져있다.
AgUox-WT는 내열성이 있는 것으로 보고되었고, AgUox-frTet 변이체의 열 안정성을 평가하기 위해 AgUox-frTet 변이체와 AgUox-WT를 37 ℃에서 5 일 동안 배양한 후 효소 활성 분석을 수행했다. 그 결과, 예상대로 5 일 배양 후 AgUox-WT의 활성 손실이 관찰되지 않았다 (도 20a). 14 개의 AgUox-frTet 변이체 중 Ag1, 6, 8, 10 및 12는 같은 기간 이후에 AgUox-WT의 50 % 이상의 활성을 나타냈다 (도 20a). 이 5 가지 변종은 37 ℃에서 최대 10 일 동안 배양된 후 Ag1, 6, 8, 10은 여전히 AgUox-WT의 50 %보다 높은 활성을 나타냈다 (도 20b). 10 일 배양 후, 약간의 활성 손실이 관찰되었지만 Ag12 변이체는 AgUox-WT와 유사한 효소 활성을 유지했다 (도 20b).
실험예 2.11 AgUox에 대한 영역 특정 frTet 결합 확인
AgUox의 각 영역에 frTet 결합을 확인하기 위해 우리는 손상되지 않은 AgUox-frTet 변이체의 형광 염료 라벨링을 수행했다. 대표적인 사례로 상대적으로 높은 활성 (Ag1, 6, 8, 10, 12)을 가진 5 가지 AgUox-frTet 변이체를 분석했다. 먼저, AgUox-frTet 변이체의 IEDDA 반응성을 확인하기 위해 TCO-Cy3를 사용하여 형광 염료 라벨링을 수행했다. 단백질 겔의 형광 이미지를 평가한 결과, AgUox-WT 샘플에는 밴드가 나타나지 않았고 이는 AgUox-WT의 IEDDA 반응성이 없음을 의미한다 (도 21). 반면, Ag1, 6, 8, 10 및 12 변이체는 단백질 겔의 형광 이미지와 CBB 염색 단백질 겔 모두에서 밴드를 명확하게 나타내어 AgUox-frTet 변이체의 IEDDA 반응성을 확인했다 (도 21).
다음으로, frTet 혼입은 AgUox-WT를 대조군으로 사용하여 trypsin-digested AgUox-frTet (Ag1, 6, 8, 10 및 12) 변이체의 MALDI-TOF MS에 의해 추가로 확인되었다. Ag1 (AgUox-D80frTet)의 경우, 80번 위치 (D80)의 아스파르트산이 트립신으로 분해된 AgUox-WT의 펩티드 NTVYAFARDGFATTEEFLLR (서열번호 71, 잔기 72-91, 이론적 질량 2,319.2 m/z)에 포함되었다. AgUox-WT의 질량 스펙트럼에서 이론값과 일치하는 2,319.1 m/z 피크가 감지되었다 (도 27a, 상단). 트립신으로 분해된 Ag1의 질량 스펙트럼에서 펩티드 NTVYAFARXGFATTEEFLLR (서열번호 81, X = frTet)에 해당하는 피크 (2,435.4 m/z)가 확인되었으며, 이는 이론적 값 (2,435.3 m/z)과 일치한다 (도 27a, 하단). 펩타이드에서 D80을 frTet으로 대체하면 114.3 m/z의 질량 이동이 발생했고, 이는 이론적 질량 이동 인 114.1 m/z와 일치했다. 119번 위치 (N119)의 아스파라긴 및 142 위치 (S142)의 세린은 펩티드 WAAQQFFWDRINDHDHAFSRNK (서열번호 73, 잔기 108-119, 이론적 질량 2,789.3 m/z) 및 펩티드 SEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLK (서열번호 82, 잔기 118-157, 이론적 질량 2,869.6 m/z)에 포함되었다. AgUox-WT의 질량 스펙트럼에서 2,790.7 및 2,870.8 m/z 피크가 검출되었으며, 이는 이론적 값과 일치했다 (도 27b 및 27c, 상단). 트립신으로 분해된 Ag6 (AgUox-N119frTet) 및 Ag8 (AgUox-S146frTet)의 질량 스펙트럼에서 펩티드 WAAQQFFWDRIXDHDHAFSRNK(서열번호 75) 및 SEVRTAVLEISGXEQAIVAGIEGLTVLK(서열번호 76) (X = frTet)에 해당하는 피크는 2,905.8 (도 27b, 하단) 및 3,012.9 m/z에서 관찰되었고 (도 27c, 하단), 이는 이론적 질량 2,904.4 및 3,011.8 m/z와 일치한다. 175번 위치 (Q175)의 글루타민이 트립신으로 분해된 AgUox-WT의 펩티드 STGSEFHGFPRDKYTTLQETTDR (서열번호 77, 잔기 158-180, 이론적 질량 2,673.3 m/z)에 포함되었다. AgUox-WT의 질량 스펙트럼에서 이론 값과 일치하는 2,673.3 m/z 피크가 감지되었다 (도 27d, 상단). 트립신으로 분해된 Ag10 변이체 (AgUox-Q175frTet)의 질량 스펙트럼에서 펩타이드 11.8 m/z의 질량 이동이 관찰되어 2,775.1 m/z (도 27d, 하단)에서 피크를 나타냈으며, 이는 이론과 일치한다. Q175frTet 변이체는 11.1 m/z의 질량 이동. 196번 위치 (E196)에 있는 글루타민산은 펩티드 YNTVEVDFDAVYASVR (서열번호 78, 잔기 192-187, 이론적 질량 1,847.9 m/z)에 포함되었다. AgUox-WT의 질량 스펙트럼에서 이론 값과 일치하는 1,847.2 m/z의 피크가 감지되었다 (도 27e, 상단). 트립신으로 분해된 Ag12 변이체 (AgUox-E196frTet)의 질량 스펙트럼에서 11.3 m/z의 질량 이동이 관찰되어 이론적 질량과 일치하는 1,948.5 m/z에서 피크가 발생했고 (도 27e, 하단), 이는 E196frTet 변이체의 11.1 m/z 질량 이동과 일치하는 결과이다. 이러한 결과는 AgUox-frTet 변이체의 특정 영역에 있어 frTet의 영역 특이적 도입을 의미한다.
실험예 2.12 AgUox-frTet에 대한 영역별 HSA-결합
HSA-결합된 AgUox를 제조하기 위해 우리는 헤테로이기작용성 가교제 TCO-MAL을 사용했다. 첫째, TCO-MAL은 Michael 첨가 반응을 통해 HSA의 34번 위치 (Cys34)에서 유리 시스테인에 접합되었다. HSA 표면의 유일한 유리 시스테인 (Cys34)은 FcRn 결합 도메인에서 멀리 떨어져 있기 때문에 생체 접합에 자주 사용되었다. 그 다음, TCO-HSA를 IEDDA 반응을 통해 정제된 AgUox-frTet 변이체에 결합시켜 AgUox-HSA 결합체를 생성했다. 반응 혼합물은 SDS-PAGE 분석을 거쳐 (도 22), CBB 염색 단백질 겔에서 HSA 결합 AgUox-frTet (Ag1, 6, 8, 10 및 12) 변이체의 밴드는 100-118 kDa 범위에서 명확하게 관찰되었다 (도 22). Ag1, 8 및 12 변이체의 경우, 단량체 AgUox 밴드가 관찰되지 않았으며, 이는 AgUox와 HSA가 거의 완전하게 결합되었음을 의미한다. Ag6 및 10의 경우, AgUox 모노머의 밴드가 19-37 kDa 내에서 관찰되어 HSA에 대한 AgUox 결합이 제대로 나타나지 않음을 나타낸다. Ag8을 제외한 Ag 변이체의 HSA 결합 수율의 추세는 용매 접근성의 경향과 유사했다 (각각 Ag1, 6, 8, 10 및 12 : 0.93, 0.51, 0.9, 0.85 및 0.92). Ag12 변이체는 가장 높은 HSA 결합 수율과 가장 높은 효소 활성을 나타내 었다.
실험예 2.13 AgUox-HSA 접합체의 효소 활성
크기 배제 크로마토 그래피를 사용하여 반응 혼합물에서 HSA-결합 Ag12 변이체 (Ag12-HSA)를 정제했다. 크로마토그램에서 용출된 분획은 SDS-PAGE로 분석되었다 (도 23). 두 개의 주요 피크는 각각 Ag12-HSA 및 미반응 HSA-TCO를 나타내는 반면, Ag12 모노머의 피크는 검출되지 않아 HSA 결합 수율이 높음을 나타냈다. 그 다음 Ag12 및 Ag12-HSA의 효소 활성을 평가한 결과, AgUox-WT의 약 93 %를 나타냈다 (도 24). 이러한 결과는 Ag12 변이체가 효소 활성이 유지된 영역 특이적 HSA 결합에 적합함을 나타낸다.
실험예 2.14 AgUox-WT 및 Ag12-HSA의 약동학 연구
마우스에 AgUox-WT 및 Ag12-HSA를 정맥 내 투여한 후, AgUox-WT 및 Ag12-HSA의 혈청 반감기를 측정했다. 또한 혈청 샘플에서 AgUox 종의 효소 활성을 모니터링 했다. AgUox-WT의 혈청 반감기는 약 1.7 시간 (도 25)으로 AfUox-WT (1.3 시간)보다 길었다. 또한 Ag12-HSA 접합체의 혈청 반감기가 29 시간으로 AgUox-WT (도 25)보다 약 17 배 더 높았으며, 이는 HSA 결합에 의해 AgUox의 혈청 반감기가 효과적으로 길어졌음을 나타낸다. 중요한 것은, Ag12-HSA 결합체의 혈청 반감기가 AfUox-HSA (19 h)보다 길게 나타났다는 것이다. Ag12-HSA와 AfUox-HSA 모두 동일한 링커를 사용하여 각 Uox 분자에 결합된 4 개의 HSA 분자를 가지고 있다는 점을 고려할 때, 혈청 반감기에서 관찰된 차이는 열 안정성 차이 문이라고 보인다. AfUox-HSA의 경우, Ag12-HSA의 혈청 반감기는 혈청에 남아있는 AgUox 변이체의 효소 활성을 측정하여 평가되었다. 이러한 결과는 AgUox의 열 안정성과 생체 내에서 효소 활성을 유지하는 방법을 나타낸다. 또한, 이러한 데이터는 높은 열 안정성을 갖는 AgUox에 HSA의 결합이 생체 내에서 상당히 긴 혈청 반감기를 초래함을 나타낸다.
본 명세서에서는 요산산화효소-알부민 접합체 및 그 제조방법, 상기 요산산화효소-알부민 접합체에 포함되는 요산산화효소 변이체 및 그 제조방법을 개시하며, 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 요산이 원인이 되는 다양한 질환, 질병, 또는 적응증의 예방 및 치료에 사용 가능하다.
Claims (25)
- [구조식 1]로 표현되는 요산산화효소-알부민 접합체:
[구조식 1]
Uox-[J1-A-J2-HSA]n,
여기서, 상기 Uox는 요산산화효소 변이체로, 요산산화효소는 _Arthrobacter globiformis_에서 유래한 것이고, 상기 J1은 요산산화효소-링커 접합부, 상기 A는 앵커, 상기 J2는 알부민-링커 접합부, 상기 HSA는 인간 혈청 알부민이며, 상기 n은 3 또는 4이고,
상기 요산산화효소 변이체는 3개 이상의 4-(1,2,3,4-tetrazine-3-yl) phenylalanines(frTet)를 포함하고,
상기 요산산화효소-링커 접합부는 상기 요산산화효소 변이체의 상기 frTet의 테트라진 반응기 및 상기 앵커에 연결된 트랜스-시클로옥텐 반응기가 역-전자 요구 디엘스-알더 반응을 통해 형성된 구조이고,
상기 요산산화효소-링커 접합부는로 표현되고, 여기서 (1)은 상기 frTet 잔기에 연결된 것이고, 상기 (2)는 앵커에 연결된 것이고,
상기 알부민-링커 접합부는 상기 인간 혈청 알부민의 티올 반응기 및 상기 앵커에 연결된 티올 반응성기가 반응하여 형성된 구조이고,
상기 알부민-링커 접합부는,
, 또는
로 표현되고, 여기서 (1)은 알부민에 연결된 것이고, (2)는 앵커에 연결된 것임.
- 제1항에 있어서,
상기 요산산화효소 변이체는 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛으로 구성되고,
여기서, 상기 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛은 각각 독립적으로, 서열번호 2 내지 서열번호 15에서 선택된 아미노산 서열로 표현되며,
상기 아미노산 서열의 X는 4-(1,2,3,4-tetrazine-3-yl) phenylalanines(frTet)인 요산산화효소-알부민 접합체. - 제2항에 있어서,
상기 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛 모두 서열번호 2 내지 서열번호 15에서 선택된 동일한 아미노산 서열로 표현되고, 상기 아미노산 서열의 X는 4-(1,2,3,4-tetrazine-3-yl) phenylalanines(frTet)인 요산산화효소-알부민 접합체. - 제3항에 있어서,
상기 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛 모두 서열번호 13의 동일한 아미노산 서열로 표현되고, 상기 아미노산 서열의 X는 4-(1,2,3,4-tetrazine-3-yl) phenylalanines(frTet)인 요산산화효소-알부민 접합체. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 앵커는 다음 중 선택되는 요산산화효소-알부민 접합체:
;
;
;
; 및
,
여기서, 상기 J1은 상기 요산산화효소-링커 접합부이고, 상기 J2는 상기 알부민-링커 접합부임. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인간 혈청 알부민은 각각 독립적으로, 서열번호 16 내지 서열번호 27 중 선택된 아미노산 서열로 표현되는 요산산화효소-알부민 접합체. - 다음을 포함하는 요산산화효소-알부민 접합체:
제1 서브유닛; 제2 서브유닛; 제3 서브유닛; 및 제4 서브유닛,
여기서, 상기 제1 서브유닛, 상기 제2 서브유닛, 상기 제3 서브유닛, 및 상기 제4 서브유닛이 올리고머화하여 요산산화효소-알부민 접합체를 형성하고,
상기 제1 서브유닛, 상기 제2 서브유닛, 및 상기 제3 서브유닛은 [구조식 2]로 표현되고, 상기 제4 서브유닛은 [구조식 2], 또는 [구조식 3]으로 표현됨:
[구조식 2]
P'-J1-A-J2-HSA,
여기서, 상기 P'은 서열번호 2 내지 서열번호 15의 아미노산 서열로 표현되는 요산산화효소 변이체 서브유닛이고, 상기 아미노산 서열에 포함된 X는 4-(1,2,3,4-tetrazine-3-yl) phenylalanines(frTet)이고,
상기 J1은 요산산화효소-링커 접합부, 상기 A는 앵커, 상기 J2는 알부민-링커 접합부, 상기 HSA는 인간 혈청 알부민이며,
상기 요산산화효소-링커 접합부는 상기 요산산화효소 변이체의 상기 frTet의 테트라진 반응기 및 상기 앵커에 연결된 트랜스-시클로옥텐 반응기가 역-전자 요구 디엘스-알더 반응을 통해 형성된 구조이고,
상기 요산산화효소-링커 접합부는로 표현되고, 여기서 (1)은 상기 frTet 잔기에 연결된 것이고, 상기 (2)는 앵커에 연결된 것이고,
상기 알부민-링커 접합부는 상기 인간 혈청 알부민의 티올 반응기 및 상기 앵커에 연결된 티올 반응성기가 반응하여 형성된 구조이고,
상기 알부민-링커 접합부는,
, 또는
로 표현되고, 여기서 (1)은 알부민에 연결된 것이고, (2)는 앵커에 연결된 것임;
[구조식 3]
P',
여기서, 상기 P'은 서열번호 2 내지 서열번호 15의 아미노산 서열로 표현되는 요산산화효소 변이체 서브유닛임. - 다음을 포함하는 요산산화효소 변이체:
제1 서브유닛으로, 서열번호 2 내지 서열번호 15 중 선택된 아미노산 서열로 표현되는 것;
제2 서브유닛으로, 서열번호 2 내지 서열번호 15 중 선택된 아미노산 서열로 표현되는 것;
제3 서브유닛으로, 서열번호 2 내지 서열번호 15 중 선택된 아미노산 서열로 표현되는 것; 및
제4 서브유닛으로, 서열번호 2 내지 서열번호 15 중 선택된 아미노산 서열로 표현되는 것;
여기서, 상기 제1 서브유닛, 상기 제2 서브유닛, 상기 제3 서브유닛, 및 상기 제4 서브유닛이 올리고머화하여 요산산화효소-알부민 접합체를 형성하고,
상기 아미노산 서열에 포함된 각각의 X는 테트라진 작용기 또는 트리아진 작용기를 포함하는 비천연 아미노산임. - 제8항에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 각각 독립적으로 다음 중 선택되는 요산산화효소 변이체:
;
;
;
;
;
;
;
;
;
; 및
.
- 제1항에 있어서,
상기 제1 서브유닛, 상기 제2 서브유닛, 상기 제3 서브유닛, 및 상기 제4 서브유닛 모두가 서열번호 2 내지 서열번호 15에서 선택된 동일한 아미노산으로 표현되고,
여기서, 상기 선택된 아미노산 서열의 X는 4-(1,2,3,4-tetrazine-3-yl) phenylalanines(frTet)인, 요산산화효소 변이체. - 서열번호 2 내지 서열번호 15에서 선택된 펩타이드를 암호화하는 핵산서열을 포함하는 벡터, 여기서, 상기 아미노산 서열의 X는 비천연 아미노산이고, 상기 X에 대응하는 핵산 서열은 정지 코돈으로 암호화됨.
- 제11항에 있어서, 상기 정지 코돈은 5'-UAG-3'인 벡터.
- 제11항 내지 제12항 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 28 내지 서열번호 41의 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 다음을 포함하는 요산산화효소-알부민 접합체 제조방법:
(a) 알부민을 링커와 반응시키는 과정,
여기서, 상기 링커는 디에노필 작용기, 앵커, 및 티올 반응성기를 포함하고,
상기 디에노필 작용기는 트랜스-시클로옥텐 또는 트랜스-시클로옥텐의 유도체이고,
상기 티올 반응성기는 말레이미드 또는 말레이미드 유도체, 및 3-arylpropiolonitriles 또는 3-arylpropiolonitriles 유도체 중 선택된 것이고,
상기 링커의 티올 반응성기 및 상기 알부민의 티올기가 반응을 통해 결합하여 알부민-링커 접합체가 생성됨;
(b) 상기 알부민-링커 접합체를 요산산화효소 변이체화 반응시키는 과정,
여기서, 상기 요산산화효소 변이체는 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛이 올리고머화된 4량체이고,
상기 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛은 각각 독립적으로, 서열번호 2 내지 서열번호 15 중 선택된 아미노산 서열로 표현되고,
여기서, 상기 서열번호 2 내지 서열번호 15의 X는 비천연 아미노산으로, 4-(1,2,3,4-tetrazine-3-yl) phenylalanines (frTet)이고,
상기 요산산화효소 변이체는 4개의 상기 frTet을 포함하고,
상기 frTet 잔기에 포함된 테트라진 반응성기가 상기 링커의 디에노필 작용기와 역-전자 요구 디엘스-알더 반응(IEDDA reaction)을 통해 결합하여 요산산화효소-알부민 접합체를 형성함; 및
(c) 상기 요산산화효소-알부민 접합체를 수득하는 과정,
여기서 상기 요산산화효소-알부민 접합체는 3개 이상의 상기 알부민이 링커를 통해 요산산화효소 변이체와 연결되어 있는 것을 특징으로 함. - 제14항에 있어서, 상기 링커는 다음 중 선택되는 요산산화효소-알부민 접합체 제조방법:
;
;
;
; 및
.
- 제14항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 요산산화효소 변이체에 포함된 4개의 요산산화효소 변이체 서브유닛은 모두 서열번호 2 내지 서열번호 15에서 선택된 동일한 아미노산 서열로 표현되고, 상기 선택된 아미노산 서열의 X는 4-(1,2,3,4-tetrazine-3-yl) phenylalanines (frTet)인 요산산화효소-알부민 접합체 제조방법.
- 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 알부민은 서열번호 16 내지 서열번호 27 중 선택된 아미노산 서열로 표현되고,
상기 링커의 티올 반응성기가 상기 알부민의 아미노산 서열의 34번째 시스테인의 티올 그룹과 반응을 통해 결합하는 요산산화효소-알부민 접합체 제조방법. - 다음을 포함하는 요산산화효소 변이체 제조방법:
(a) 직교적 tRNA/합성효소 페어, 및 요산산화효소 변이체를 발현할 수 있는 세포주를 준비하는 것,
여기서, 상기 세포주는 다음을 포함함:
직교적 tRNA/합성효소 페어를 암호화하는 핵산서열을 가지는 벡터; 및 요산산화효소 변이체 서브유닛을 암호화하는 핵산서열을 가지는 벡터,
여기서, 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어를 암호화하는 핵산서열을 가지는 벡터는 외래 유래 suppressor tRNA 및 외래 유래 tRNA 합성효소를 암호화하는 핵산서열을 포함하고,
상기 외래 유래 suppressor tRNA는 특정 종결 코돈을 인식할 수 있는 것이고,
상기 외래 유래 tRNA 합성효소는 테트라진 작용기 및/또는 트리아진 작용기를 포함하는 비천연 아미노산을 인식하여 상기 외래 유래 suppressor tRNA에 연결시킬 수 있는 것이고,
상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 2 내지 서열번호 15에서 선택된 아미노산 서열이고, 여기서, 상기 선택된 서열의 X는 비천연 아미노산으로, 상기 비천연 아미노산과 대응되는 핵산서열은 특정 종결 코돈으로 암호화되어 있음; 및
(b) 상기 세포주를 테트라진 작용기 및/또는 트리아진 작용기를 포함하는 한 종류 이상의 비천연 아미노산이 포함된 배지에서 배양하는 것. - 제18항에 있어서, 상기 테트라진 작용기 및/또는 트리아진 작용기를 포함하는 비천연 아미노산은 다음 중 선택된 것인 요산산화효소 변이체 제조방법:
;
;
;
;
;
;
;
;
;
; 및
.
- 제18항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특정 종결 코돈은 5'-UAG-3'인 요산산화효소 변이체 제조방법.
- 다음을 포함하는, 요산 관련 질병 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
치료학적 유효량의 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 요산산화효소-알부민 접합체; 및
약학적으로 허용되는 담체. - 제21항에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 담체는 다음 중 선택되는 하나 이상인 약학적 조성물:
락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유; 감미제; 방향제; 시럽제; 지방유와 같은 액체 담체; 멸균된 수용액; 프로필렌글리콜; 폴리에틸렌글리콜; 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르; 현탁제; 유제; 동결 건조 제제; 외용제; 안정제; 완충제; 동물성 유; 식물성 유; 왁스; 파라핀; 전분; 트라칸트; 셀룰로오스 유도체; 폴리에틸렌 글리콜; 실리콘; 벤토나이트; 실리카; 탈크; 산화 아연. - 제21항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 요산 관련 질병은 고요산혈증, 급성 통풍성 관절염, 간헐기 통풍, 만성 결절성 통풍, 만성 신장 질환(Chronic Kidney Disease) 및 종양 용해 증후군(Tumor Lysis Syndrome; TLS)중 어느 하나인 약학적 조성물.
- 다음을 포함하는 요산 관련 질병 치료방법: 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 대상에 투여하는 것.
- 제24항에 있어서, 상기 투여 방법은 경구 투여, 비경구 투여, 정맥 내 투여, 정맥 점적 주입(intravenous infusion), 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여, 및 피하 투여 중 선택되는 것인 치료방법.
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