JP2017525665A - 部位特異的タンパク質修飾 - Google Patents

Abstract

本発明は、タンパク質およびペプチドの部位選択的修飾において使用するための方法および試薬に関する。部位選択的修飾とは、Ｎ末端アミノ官能基の反応性を増大させために、タンパク質またはポリペプチドのＮ末端において、近隣のヒスチジンアミノ酸の存在を使用して、アミノ官能基を選択的に誘導することである。本発明の方法によって得られた、修飾されたタンパク質またはペプチドは、画像処理研究または治療用途に使用することができる。

Description

発明の分野
本発明は、一般に、タンパク質またはポリペプチドに修飾基を導入する新規な方法に関する。詳細には、本発明は、Ｎ末端アミノ官能基の反応性を増大させるために、タンパク質またはポリペプチドのＮ末端において、近隣のヒスチジンアミノ酸（neighboring histidine amino acid）の存在を使用して、アミノ官能基を選択的に誘導することに関する。

発明の背景
タンパク質またはペプチドに基をコンジュゲートさせることによって、タンパク質またはペプチドの特性および特徴を改良できることはよく知られている。一般に、このようなコンジュゲーションでは一般に、タンパク質中のある官能基がコンジュゲート基中の別の官能基と反応することが必要となる。リシン残基中のＮ−末端アミノ基またはε−アミノ基などのアミノ基が、この目的に適するアシル化試薬と組み合わせて使用されている。コンジュゲート用化合物をタンパク質に付着させる場合などでは、コンジュゲーション反応を制御することが、またどれだけのコンジュゲート基を付着させるのかを制御することが、往々にして望ましく、または必要である。これはしばしば、特異性または選択性と呼ばれる。

タンパク質またはペプチドの部位特異的な修飾は、医薬品およびバイオテクノロジー業界における長年にわたる課題である。古典的方法は、多くの場合、非特異的な標識（たとえば、ＮＨＳ標識）につながり、または工業技術（たとえば、マレイミドＣｙｓ標識または天然でないアミノ酸）を必要とする。加えて、選択的な化学反応のレパートリーは、しかしながら、非常に限られている。１つの選択肢は、独特な反応性を有する天然でない特別なアミノ酸を導入し、次いで、さらなる誘導体化においてこの反応性を活用する、組換え法によるものである。別の選択肢は、修飾しようとするタンパク質の構造的および機能的特色を認識する酵素の使用である。

組換え法にもかかわらず、タンパク質／ペプチドの選択的な誘導体化が非常に難しい仕事であることに変わりはない。したがって、当業界では、タンパク質またはペプチドのＮ末端などのアミノ酸残基を選択的に誘導体化する一般法が求められている。

発明の要旨
本発明は、標的タンパク質または標的ペプチドを、Ｎ末端アミノ酸のアミノ官能基において修飾する方法であって、
ａ．得られるタンパク質またはペプチドが、Ｎ末端アミノ酸に隣接する（adjacent to）位置にヒスチジンアミノ酸を含有するように、標的タンパク質または標的ペプチドを修飾するステップと、
ｂ．Ｎ末端アミノ酸に隣接する位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドを、アシル化用化合物（acylating compound）と６未満のｐＨで接触させて、修飾されたタンパク質またはポリペプチドを生成するステップと
を含む方法に関する。

本発明はまた、得られるタンパク質またはペプチドが、Ｎ末端アミノ酸に隣接する位置にヒスチジンアミノ酸を含有するように、標的タンパク質または標的ペプチドを修飾するための種々の方法に関する。このような方法について、本明細書においてより詳細に述べる。

別の実施形態では、本発明は、標的タンパク質または標的ペプチドを、Ｎ末端アミノ酸のアミノ官能基において修飾する方法であって、
ａ．得られるタンパク質またはペプチドが、Ｎ末端アミノ酸に隣接する位置にヒスチジンアミノ酸を含有するように、標的タンパク質または標的ペプチドをするステップと、
ｂ．Ｎ末端アミノ酸に隣接する位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドを、活性化型の次式の酸：
ＨＯ−Ｃ（Ｏ）−（Ｌ^１）_ｎ−Ｒ^１［式中、
Ｌ^１は、リンカーであり、
Ｒ^１は、生体相互作用薬（biointeractive agent）もしくは分析用薬剤（analytical agent）への共有結合を促進する反応性基を含む部分であり、またはＲ^１は、生体相互作用薬もしくは分析用薬剤であり、
ｎは、０または１である］
と６未満のｐＨで接触させて、修飾されたタンパク質またはポリペプチドを生成するステップと
を含む方法に関する。

別の実施形態では、本発明は、標的タンパク質または標的ペプチドを、式：

［式中、
Ｌ^１は、リンカーであり、
Ｒは、Ｈまたは−Ｓ（Ｏ）_２Ｎａであり、
Ｒ^１は、生体相互作用薬もしくは分析用薬剤への共有結合を促進する反応性基を含む部分であり、またはＲ^１は、生体相互作用薬もしくは分析用薬剤であり、
ｎは、０または１である］
のアシル化剤を使用して、上述のとおりに修飾するための選択的な方法に関する。

前述の実施形態のさらなる態様では、本発明は、タンパク質またはペプチドを、Ｎ末端アミノ基において本明細書に記載のとおりに修飾するための選択的な方法であって、前記の生体相互作用薬または分析用薬剤が、ビオチン、蛍光体（フルオロフォア（fluorophore））、毒素、キレーター、半減期延長性部分（たとえば、アルブミン結合性部分、Ｆｃ変異体（Fc variant）、未変性Ｆｃ（native Fc）など）、画像処理試薬（imaging reagent）、およびペプチドから選択される、選択的な方法に関する。

別の実施形態では、本発明は、タンパク質またはペプチドを、Ｎ末端アミノ基において本明細書に記載のとおりに修飾するための選択的な方法であって、Ｒ^１が、生体相互作用薬または分析用薬剤への共有結合を促進する反応性基を含む部分である、選択的な方法に関する。反応性基の例は、アシル、エステルもしくは混合無水物、アルキン、テトラジン、マレイミド、イミデート、カルボキシ、またはより一般には、アミノ基、アジド基、アルケン基、チオール基などの官能基、または生体相互作用薬もしくは分析用薬剤上に存在するヒドラジン、ヒドロキシルアミン基と共有結合を形成しうる基である。この実施形態の特定の一態様において、本発明の方法は、生体相互作用薬または分析用薬剤を、前記アシル化剤中に存在する反応性基と反応させるステップをさらに含み、前記生体相互作用薬または生体分析用薬剤は、官能基を介して、場合によりリンカーＬ^２を介して反応させる。リンカーは、本明細書においてより詳細に定義する。

一実施形態では、標的タンパク質または標的ペプチドは、増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）タンパク質、その相同体、変異体、断片、および他の修飾形態、未変性Ｆｃ、Ｆｃ変異体、またはＡＰＪアゴニストペプチドから選択される。

本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の詳細な説明において解明される。
図面の簡単な説明

詳細な説明
定義：
本明細書を解釈する目的では、別段指定しない限り、以下の定義が適用され、適切な場合は必ず、単数で使用された用語は複数も包含し、逆もまたそうなる。

特許、特許公報、および他の文献へのすべての言及は、これらを法的に許される程度に本開示に組み込むためになされる。

本発明は、標的タンパク質またはペプチドに修飾用化合物を選択的な要領で導入する方法を提供することにより、前述の要求に対処する。

本明細書で使用するとき、また添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」が、文脈によって明らかにそうでなく規定されない限り、複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。したがって、たとえば、「ｔｈｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ」への言及は、１つまたは複数のコンジュゲートへの言及を包含し、「ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」への言及は、１つまたは複数のポリペプチドへの言及を包含する、などである。

用語アルキルとは、１〜３０個の炭素原子を含む、完全飽和の分枝状もしくは非分枝状（または直鎖もしくは線状）炭化水素部分を指す。アルキルは、５〜２０個の炭素原子、より好ましくは１０〜１５個の炭素原子を含むことが好ましい。Ｃ_{１０〜１５}アルキルとは、１０〜１５個の炭素を含むアルキル鎖を指す。

用語「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する分枝状または非分枝状炭化水素を指す。用語「Ｃ_２〜３０−アルキニル」とは、２個〜７個の炭素原子を有し、少なくとも１つの炭素−炭素三重を含む炭化水素を指す。

用語「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する分枝状または非分枝状炭化水素を指す。用語「Ｃ_２〜３０−アルキニル」とは、２個〜７個の炭素原子を有し、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む炭化水素を指す。

用語アリールとは、環部分に６〜１０個の炭素原子を有する、単環式または二環式の芳香族炭化水素基を指す。アリールの代表例は、フェニルまたはナフチルである。

用語ヘテロアリールは、炭素原子と１〜５個のヘテロ原子とから選択される５〜１０個の環員を含んでおり、各ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから独立して選択され、ＳおよびＮは、種々の酸化状態に酸化されていてもよい、単環式または二環式ヘテロアリールを包含する。二環式ヘテロアリール系については、系は完全に芳香族である（すなわち、すべての環が芳香族である）。

用語シクロアルキルとは、３〜１２個の炭素原子、好ましくは３〜８個、または３〜７個の炭素原子の、飽和または不飽和であるが非芳香族の単環式、二環式、または三環式炭化水素基を指す。二環式および三環式のシクロアルキル系については、すべての環が非芳香族である。たとえば、シクロアルキルは、シクロアルケニルおよびシクロアルキニルを包含する。用語「シクロアルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する、３〜１２個の炭素原子の二環式または三環式炭化水素基を指す。用語「シクロアルキニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する、３〜１２個の炭素原子の二環式または三環式炭化水素基を指す。

用語ヘテロシクリルとは、Ｏ、Ｓ、およびＮから選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含んでおり、ＮおよびＳは、場合により種々の酸化状態に酸化されていてもよい、飽和または不飽和の非芳香族（部分的不飽和であるが非芳香族の）単環式、二環式、または三環式環系を指す。一実施形態では、ヘテロシクリル部分は、５〜７個の環原子と、Ｏ、Ｓ、またはＮから選択されるさらなるヘテロ原子とを場合により含んでいる、飽和した単環に相当する。このヘテロ環は、アルキル、ハロ、オキソ、アルコキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシで置換されていてもよい。他の実施形態では、ヘテロシクリルは、二環式または三環式である。多環式の系については、一部の環が芳香族で、飽和または部分的に飽和した１つまたは複数の環に縮合していてもよい。全体的に縮合した系は、完全には芳香族でない。たとえば、ヘテロ環系は、芳香族ヘテロアリール環が飽和または部分的に飽和したシクロアルキル環系と縮合したものである場合もある。

用語「コンジュゲート」とは、標的タンパク質／ペプチドを、場合によりリンカーを介して生体相互作用薬／分析用薬剤に共有結合させた結果として生成されたエンティティ（entity）を指すものである。用語「コンジュゲーション」とは、標的タンパク質／ペプチドを、場合によりリンカーを介して生体相互作用薬／分析用薬剤に共有結合させるステップを指すものである。

本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」とは、自然に産生されようが合成によって生成されようが、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。約１０アミノ酸残基未満のポリペプチドは、「ペプチド」と呼ぶのが普通である。用語「ペプチド」とは、ペプチド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸の配列を示すものであり、前記アミノ酸は、天然でも天然でなくてもよい。この用語は、たとえばシステイン架橋などの共有結合性相互作用、または非共有結合相互作用によってまとまった２つ以上のペプチドからなるものでよい、用語ポリペプチドおよびタンパク質を包含する。当業界で受け入れられている３文字または１文字略語を使用して、本発明のペプチドおよびポリペプチドを構成するアミノ酸残基を表す。「Ｄ」が前に付く場合を除き、アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。１文字略語が大文字であるとき、略語は、Ｄ−アミノ酸を指す。１文字略語が小文字であるとき、略語は、Ｌ−アミノ酸を指す。集まりまたは連なりまたはアミノ酸略語を使用して、ペプチドを表す。ペプチドは、Ｎ末端を左側にして示し、配列は、Ｎ末端からＣ末端に向かって記す。

本発明のペプチドは、非天然アミノ酸（すなわち、自然界では発生しない化合物）を含んでおり、当業界で知られているような他のアミノ酸類似体をその代わりとして用いてもよい。

ある特定の非天然アミノ酸は、Deiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003、Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003、Wang et al., Science 292:498-500, 2001、Zhang et al., Science 303:371-373, 2004、または米国特許第７，０８３，９７０号明細書に記載の技術によって導入することができる。簡潔に述べると、こうした発現系の一部には、部位特異的突然変異誘発が関与して、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに、アンバーＴＡＧなどのナンセンスコドンが導入される。次いで、このような発現ベクターは、導入されたナンセンスコドンに特異的なｔＲＮＡを利用することのできる宿主に導入され、選択された非天然アミノ酸を積み込んでいる。本発明のポリペプチドに諸部分をコンジュゲートさせる目的で有益な特定の非天然アミノ酸として、アセチレン側鎖およびアジド側鎖を有するものが挙げられる。

「タンパク質」とは、１つまたは複数のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。タンパク質は、炭水化物基などの非ペプチド成分も含んでよい。炭水化物および他の非ペプチド置換基は、タンパク質が産生されるところの細胞によってタンパク質に付加される場合があり、細胞の種類によって様々となる。タンパク質は、本明細書では、そのアミノ酸主鎖構造に関して定義しており、炭水化物基などの置換基は一般に指定してないが、それにもかかわらず存在してよい。非宿主ＤＮＡ分子によってコードされたタンパク質またはポリペプチドは、「異種」タンパク質またはポリペプチドである。

「単離ポリペプチドまたは単離タンパク質」とは、本来はポリペプチドに随伴する炭水化物、脂質、または他のタンパク質性不純物などの細胞成分を本質的に含まないポリペプチドまたはタンパク質（たとえば、ＧＤＦ１５）である。通常、単離ポリペプチドまたはタンパク質の調製物は、高度に精製された形、すなわち、純度少なくとも約８０％、純度少なくとも約９０％、純度少なくとも約９５％、純度９５％超、たとえば、９６％、９７％、９８％、もしくはこれより高い純度、または純度９９％超のポリペプチドまたはタンパク質を含有する。特定のタンパク質調製物が単離ポリペプチドまたはタンパク質を含有することを示す１つの手段は、タンパク質調製物をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ染色した後の単一バンドの出現によるものである。しかし、用語「単離」は、二量体などの別の物理的形態、または別法としてグリコシル化もしくは誘導体化された形態の同じポリペプチドまたはタンパク質の存在を除外しない。単離ポリペプチドは、その治療、診断、予防、または研究用途の妨げとなる、その自然環境において見出される他のいかなる混入ポリペプチドまたは他の混入物も、実質的に含まないことが好ましい。

当業者なら、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質のいずれかの配列において、その活性を必然的に低下させることなく、種々のアミノ酸置換、たとえば、保存的アミノ酸置換がなされてもよいことは理解されよう。本明細書で使用するとき、「その置換基として一般に使用されるアミノ酸」は、保存的置換（すなわち、化学的特徴が同等であるアミノ酸での置換）を包含する。保存的置換の目的で、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性（親水性）天然アミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正電荷を有する（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが挙げられる。負電荷を有する（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。アミノ酸置換の例としては、その対応するＤ−アミノ酸の代わりにＬ−アミノ酸を用いるもの、ホモシステインもしくは含チオール側鎖を有する他の非天然アミノ酸の代わりにシステインを用いるもの、ホモリシン、ジアミノ酪酸、ジアミノプロピオン酸、オルニチン、もしくは含アミノ側鎖を有する他の非天然アミノ酸の代わりにリシンを用いるもの、またはノルバリンの代わりにアラニンを用いるものなどが挙げられる。

本明細書で使用する用語「アミノ酸」とは、その構造でそうした立体異性体型が可能である場合、すべて、そのＤおよびＬ立体異性体の、自然に存在するアミノ酸、天然でないアミノ酸、アミノ酸類似体、および、自然に存在するアミノ酸と同様にして機能するアミノ酸模倣物を指す。アミノ酸は、本明細書では、その名称、一般に知られているその３文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する１文字記号のいずれかで呼ぶ。

用語「自然に存在する」とは、自然界で見出され、人の手で操作されていない材料を指す。同様に、「自然に存在しない」や「自然でない」などは、本明細書で使用するとき、自然界で見出されない、または人の手で構造が改変されもしくは合成されている材料を指す。アミノ酸に関連して使用するとき、用語「自然に存在する」とは、２０種の通常のアミノ酸（すなわち、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）を指す。

本明細書で使用する用語「非天然アミノ酸」および「天然でないアミノ酸」は、同じであろうと異なっていようと、任意の生物中で、任意の生物からの未改変または改変遺伝子を使用して、生合成によって生成することのできないアミノ酸構造を、互換的に表すものである。これら用語は、自然に存在する（野生型）タンパク質配列または本発明の配列中に存在しないアミノ酸残基を指す。これらの用語は、限定はしないが、２０種の自然に存在するアミノ酸の１つ、セレノシステイン、ピロリシン（Ｐｙｌ）、またはピロリン−カルボキシ−リシン（Ｐｃｌ、たとえば、ＰＣＴ特許公開第２０１０／４８５８２号に記載のとおり）でない、改変アミノ酸および／またはアミノ酸類似体を包含する。このような非天然アミノ酸残基は、自然に存在するアミノ酸の置換によって、および／または自然に存在する（野生型）タンパク質配列もしくは本発明の配列への非天然アミノ酸の挿入によって導入することができる。非天然アミノ酸残基は、分子に所望の機能性、たとえば、機能性部分（たとえば、ＰＥＧ）を連結する能力が付与されるように組み込むこともできる。アミノ酸に関連して使用するとき、記号「Ｕ」は、本明細書で使用される「非天然アミノ酸」および「天然でないアミノ酸」を意味するものとする。

ポリペプチドまたはタンパク質について本明細書で使用する用語「類似体」とは、ペプチド／タンパク質の１つまたは複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置き換えられている、かつ／または１つまたは複数のアミノ酸残基がペプチド／タンパク質から欠失している、かつ／または１つまたは複数のアミノ酸残基がペプチド／タンパク質に付加されている、修飾されたペプチドまたはタンパク質を意味する。アミノ酸残基のこのような付加または欠失は、ペプチドのＮ末端および／またはペプチドのＣ末端で起こりうる。

用語「ＡＰＪ」（「アペリン受容体」、「アンジオテンシン様１受容体」、「アンジオテンシンＩＩ様１受容体」などとも呼ばれる）とは、３８０残基、７回膜貫通ドメインのＧｉ共役型受容体を指し、その遺伝子は、ヒトの１１番染色体の長腕上に位置する（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５１５２．１、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００５１６１によってコードされる）。ＡＰＪは、１９９３年に、変性オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ヒトゲノムＤＮＡから初めてクローン化され（O’Dowd et al. Gene, 136:355-60、1993）、１型アンジオテンシンＩＩ受容体と有意に相同的である。しかし、この相同性にもかかわらず、アンジオテンシンＩＩは、ＡＰＪを結合しない。この内因性リガンドは、長年の間オーファンであったが、単離され、アペリンと命名された（Tatemoto et al., Biochem Biophys Res Commun 251, 471-6 (1998)）。

用語「ＡＰＪアゴニスト」はアペリンポリペプチドを含む：アペリンは、７７残基のプレタンパク質（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５９１０９．３、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１７４１３．３によってコードされる）を指し、これがプロセシングを受けて、生物学的活性型のアペリンペプチド、たとえば、アペリン−３６、アペリン−１７、アペリン−１６、アペリン−１３、アペリン−１２になる。「アペリン−３６」と呼ばれる全長成熟ペプチドは、３６アミノ酸を含むが、最も強力なアイソフォームは、「Ｐｙｒ−１−アペリン−１３またはＰｙｒ^１−アペリン−１３」と呼ばれる、ピログルタミン酸化型のアペリン１３量体（アペリン−１３）である。種々のアペリン型は、たとえば、米国特許第６，４９２，３２４Ｂ１号明細書に記載されている。アペリンペプチドアゴニストは、参照により本明細書に援用される、特許出願番号国際公開第２０１３／１１１１１０号パンフレット、国際公開第２０１４／０８１７０２号パンフレット、国際公開第２０１５／０１３１６８号パンフレット、国際公開第２０１５／０１３１６５号パンフレット、国際公開第２０１５／０１３１６７号パンフレット、および国際公開第２０１５／０１３１６９号パンフレットにも記載されている。

用語「ＧＤＦ１５ポリペプチド」および「ＧＤＦ１５タンパク質」は、互換的に使用され、ヒトやマウスなどの哺乳動物において発現される、自然に存在する野生型ポリペプチドを意味する。この開示の目的では、用語「ＧＤＦ１５タンパク質」は、２０アミノ酸のシグナルペプチド、１６７アミノ酸のプロドメイン、およびプロドメインからフューリン様プロテアーゼによって切除される１１２アミノ酸の成熟ドメインを含んでいる、３０８アミノ酸残基からなるいずれかの全長ＧＤＦ１５ポリペプチド（ＮＣＩ参考配列ＮＰ＿００４８５５．２）を指すのに互換的に使用してよい。３０８アミノ酸のＧＤＦ１５ポリペプチドを「全長」ＧＤＦ１５ポリペプチドと呼び、１１２アミノ酸のＧＤＦ１５ポリペプチド（たとえば、アミノ酸１９７〜３０８）を「成熟」ＧＤＦ１５ポリペプチドと呼ぶ。成熟ＧＤＦ１５ペプチドは、ＴＧＦ〜スーパーファミリーの仲間に典型的である、（３つの鎖内ジスルフィド結合を有する）システインノットモチーフおよび単一の鎖間ジスルフィド結合の形成に必要となる７つの保存されたシステイン残基を含んでいる。成熟ＧＤＦ１５ペプチドは、４番目の鎖内ジスルフィド結合を形成する２つの追加のシステイン残基も含んでいる。したがって、生物学的に活性のあるＧＤＦ１５は、１つの鎖間ジスルフィド結合によって共有結合連結されている、成熟ペプチドのホモ二量体である。したがって、ＧＤＦ１５タンパク質またはポリペプチドには、このタンパク質の多量体、より詳細には二量体も含まれる。

用語「ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチド」は、自然に存在するＧＤＦ１５ポリペプチド配列が修飾されたものである、ＧＤＦ１５ポリペプチドを包含する。そのような修飾には、限定はしないが、自然に存在しないアミノ酸、自然に存在しないアミノ酸類似体、およびアミノ酸模倣物での置換を含めた、１つまたは複数のアミノ酸置換が含まれる。

一態様では、用語「ＧＤＦ１５突然変異体タンパク質」は、未変性ＧＤＦ１５ポリペプチドの所与の位置に通常見られる少なくとも１つの残基が欠失し、または未変性ＧＤＦ１５配列中のその位置に通常は見られない残基で置き換えられたものである、ＧＤＦ１５タンパク質配列（たとえば、配列番号１〜８）を指す。一部の場合では、未変性ＧＤＦ１５ポリペプチドの所与の位置に通常見られる単一の残基を、その位置に通常は見られない２つ以上の残基で置き換えることが望ましくなり、さらに他の場合では、未変性ＧＤＦ１５ポリペプチド配列を保持し、タンパク質中の所与の位置に１つまたは複数の残基を挿入することが望ましい場合もあり、さらに他の場合では、所与の残基を完全に欠失させることが望ましい場合もあり、これらの構築物はすべて、用語「ＧＤＦ１５突然変異体タンパク質」に包含される。本発明はまた、このようなＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチド配列をコードする核酸分子も包含する。

種々の実施形態において、ＧＤＦ１５突然変異体タンパク質は、自然に存在するＧＤＦ１５タンパク質に対する同一性が少なくとも約８５パーセントであるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、自然に存在するＧＤＦ１５ポリペプチドアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも約９０パーセント、または約９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセントであるアミノ酸配列を含む。このようなＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドは、血中グルコース、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロールレベルを低下させる能力；体重を減少させる能力；または耐糖能、エネルギー消費、もしくはインスリン感受性を改善する能力などの、野生型ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持することが好ましいが、必要ではない。

ＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドを含む構築物を、主としてヒトＧＤＦ１５について開示しているが、本発明は、そのようには限定されず、ＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドが他の種（たとえば、カニクイザル（cynomolgous monkeys）、マウス、ラット）由来である、ＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドを含む構築物へと拡張される。一部の例では、ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドは、対象において代謝障害を治療し、または改善するのに、対象と同じ種由来であるＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドの成熟型にして使用することができる。

ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドは、生物学的に活性があることが好ましい。種々のそれぞれの実施形態において、ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドは、自然に存在する形態の成熟ＧＤＦ１５タンパク質と同等である、それを超える、またはそれ未満である生物学的活性を有する。生物学的活性の例としては、血中グルコース、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロールレベルを低下させる能力；体重を減少させる能力；または耐糖能、脂質耐性、もしくはインスリン感受性を改善する能力；尿中グルコースおよびタンパク質排出を減少させる能力が挙げられる。

ポリペプチドまたはタンパク質の構造に関連して本明細書で使用するとき、用語「Ｎ末端」（または「アミノ末端」）および「Ｃ末端」（または「カルボキシル末端」）とは、それぞれ、ポリペプチドの最も端のアミノ末端およびカルボキシル末端を指す。用語「Ｎ末端アミノ酸」とは、Ｎ末端に存在する最後のアミノ酸を指す。用語「Ｎ末端アミノ酸に隣接するアミノ酸」とは、Ｎ末端の最後のアミノ酸に隣接する位置に存在するアミノ酸（すなわち、タンパク質またはペプチドに存在する、Ｎ末端から数えて２番目のアミノ酸）を指す。

半減期延長性部分という用語は、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー、脂肪酸、コレステロール基、炭水化物、もしくはオリゴ糖、またはサルベージ受容体に結合するいずれかの天然もしくは合成タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドを指す。半減期延長性部分は、血清半減期の長い血漿タンパク質（たとえば、アルブミンおよび免疫グロブリン）に結合させることができる。たとえば、半減期延長性部分は、ＩｇＧ定常ドメインもしくはその断片（たとえば、Ｆｃ領域）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはアルブミン結合性ポリペプチドである。他の実施形態では、半減期延長性部分は、アルブミン結合性残基または他の血漿タンパク質結合性残基である。本明細書で使用する「アルブミン結合性残基」とは、ヒト血清アルブミンに、共有結合によってでなく結合する残基を意味する。一実施形態では、アルブミン結合性残基は、親油性残基である。別の実施形態では、アルブミン結合性残基は、生理的ｐＨで負電荷を有する。結合性残基は、通常、負電荷を有しうるカルボン酸を含む。別の実施形態では、半減期延長性部分は、それぞれが、少なくとも１つのカルボン酸（たとえば、１、２、３または４つのＣＯ２Ｈ）で置換され、ヒドロキシル基で場合によりさらに置換されている、Ｃ６〜７０アルキル、Ｃ６〜７０アルケニル、またはＣ６〜７０アルキニル鎖であると定義することのできる、脂肪酸である。脂肪酸の例は、式Ａ１、Ａ２、およびＡ３によって規定される。他の実施形態では、半減期延長性部分は、血漿タンパク質（たとえば、アルブミン）に、非共有結合的に結合する小分子である。そのような小分子は、たとえば、Ｗａｒｆａｒｉｎ、アスピリン、ベンゾジアゼピン誘導体（たとえば、ジアゼパム）、インドール、カルデノリド（たとえば、ジギトキシン）、および胆汁酸（biliary acid）である。

半減期延長性部分は、分子量が、出所の種に応じて、その単量体の形で、およそ６５〜６７キロダルトンの間である、血漿において最も豊富なタンパク質を指す、アルブミンを包含する。用語「アルブミン」は、「血清アルブミン」と互換的に使用され、本発明の修飾ペプチドとコンジュゲートを形成するアルブミンの供給源を定義することにはならない。したがって、本明細書で使用する用語「アルブミン」は、血液や漿液などの自然供給源から精製されたアルブミンを指すこともあり、または化学合成もしくは組換え生成されたアルブミンを指すこともある。

半減期延長性部分は、単量体の形であろうと多量体の形であろうと、全抗体の消化によって得られる、または他の手段によって生成された、非抗原結合性断片の配列を含む分子または配列を指す、「未変性Ｆｃ」を包含し、ヒンジ領域を含んでいてもよい。未変性Ｆｃのもともとの免疫グロブリン供給源は、ヒト起源であることが好ましく、免疫グロブリンのいずれでもよいが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２が好ましい。未変性Ｆｃ分子は、共有結合性（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合性の連係によって、二量体または多量体の形に連結されうる単量体ポリペプチドで構成されている。未変性Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）またはサブクラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、およびＩｇＧＡ２）に応じて、１〜４の範囲である。未変性Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化によって得られる、ジスルフィド結合型の二量体である（Ellison et al., 1982, Nucleic Acids Res. 10: 4071-9を参照されたい）。本明細書で使用する用語「未変性Ｆｃ」は、単量体、二量体、および多量体形態に対して総称的である。

半減期延長性部分は、未変性Ｆｃから修飾されてはいるが、サルベージ受容体、すなわちＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）に対する結合部位を依然として含む分子または配列を指す、「Ｆｃ変異体」を包含する。国際公開第第９７／３４６３１号パンフレットおよび第９６／３２４７８号パンフレットは、典型的なＦｃ変異体、ならびにサルベージ受容体との相互作用について記載しており、参照により本明細書に援用される。したがって、用語「Ｆｃ変異体」は、非ヒト化未変性Ｆｃからヒト化された分子または配列を含みうる。さらに、未変性Ｆｃは、本発明のバイオコンジュゲートに必要とならない構造上の特色または生物学的活性をもたらすので除去してよい領域を含む。したがって、用語「Ｆｃ変異体」は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合、（３）選択された宿主細胞において発現された後のＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または（７）抗体依存的な細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、に影響を及ぼす、またはこれらに関与する、１つまたは複数の未変性Ｆｃ部位もしくは残基を欠いている、または１つまたは複数のＦｃ部位もしくは残基が修飾されている分子または配列を包含する。Ｆｃ変異体については、以下でさらに詳細に述べる。

半減期延長性部分（half-time extending moiety）とは、上で規定したとおりの未変性ＦｃならびにＦｃ変異体および配列を包含する「Ｆｃドメイン」を指す。Ｆｃ変異体および未変性Ｆｃ分子のように、用語「Ｆｃドメイン」は、全抗体から消化されていようが、他の手段によって生成されていようが、単量体または多量体の形の分子を包含する。本発明の一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、式Ｉ’、または式Ｉ〜ＩＸのいずれかのポリペプチドに、たとえば、Ｆｃドメインとペプチド配列間の共有結合を介して、コンジュゲートさせることができる。このようなＦｃタンパク質は、Ｆｃドメインの連係によって多量体を形成することができ、そうしたＦｃタンパク質およびその多量体は両方とも、本発明の態様である。

半減期延長性部分は、修飾配列を含む、抗体のＦｃ断片を意味するものとされる、「修飾Ｆｃ断片」を包含する。Ｆｃ断片は、ＣＨ２、ＣＨ３、およびヒンジ領域の一部を含む、抗体の一部分である。修飾Ｆｃ断片は、たとえば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から導くことができる。ＦｃＬＡＬＡは、ＬＡＬＡ突然変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）を有する修飾Ｆｃ断片であり、低下した効率でＡＤＣＣを誘発し、ヒト補体を弱く結合および活性化する。Hessell et al. 2007 Nature 449:101-104。Ｆｃ断片への追加の修飾については、たとえば、米国特許第７，２１７，７９８号明細書に記載されている。

リンカーは、標的タンパク質／ペプチドと、生体相互作用薬／分析用薬剤または生体相互作用薬／分析用薬剤への共有結合を促進する反応性基を含むいずれかの部分とを隔てる。リンカーは、主としてスペーサーとして働くので、その化学構造は肝要でない。

リンカーは、一方が標的ペプチド／タンパク質、他方が生体相互作用薬／生体分析用薬剤と反応しうる、２つの反応性基／官能基を含んでいる化学的部分である。リンカーの２つの反応性基／官能基は、連結部分またはスペーサーを介して連結され、連結部分またはスペーサーの構造は、リンカーの標的タンパク質／ペプチド、および生体相互作用薬／分析用薬剤との結合の妨げとならない限り、肝要でない。

リンカーは、ペプチド結合によって互いに連結しているアミノ酸で構成されたものでよい。本発明の一部の実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって連結された１〜２０個のアミノ酸で構成され、アミノ酸は、２０種の自然に存在するアミノ酸から選択される。種々の実施形態において、１〜２０個のアミノ酸は、アミノ酸のグリシン、セリン、アラニン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、およびリシンから選択される。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンやアラニンなどの、立体障害のない大多数のアミノ酸で構成される。一部の実施形態では、リンカーは、ポリグリシン、ポリアラニン、グリシンとアラニンの組合せ（ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）など）、またはグリシンとセリンの組合せ（ポリ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）など）である。

一部の実施形態では、リンカーは、非天然アミノ酸から選択される１〜２０のアミノ酸を含む。生体相互作用薬または分析用薬剤とのコンジュゲーションには、１〜１０アミノ酸残基のリンカーが好ましいが、本発明は、いずれの長さまたは組成のリンカーも企図する。非天然アミノ酸リンカーの一例は、次式：

を有する８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸またはその反復単位である。

本明細書に記載のリンカーは、例示的なものであり、はるかに長い、また他の残基を含むリンカーが、本発明によって企図される。非ペプチドリンカーも、本発明によって企図される。

他の実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、ヘテロ環基、ポリエチレングリコール、および／または１つまたは複数の天然もしくは天然でないアミノ酸、またはこれらの組合せを含み、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、および／または天然もしくは天然でないアミノ酸はそれぞれ、場合により合体および連結し合っており（combined and linked together）、または生体相互作用薬／分析用薬剤および／もしくは標的タンパク質／ペプチドに、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｏ−、＝ＮＨ−Ｏ−、＝ＮＨ−ＮＨ−、もしくは＝ＮＨ−Ｎ（アルキル）−から選択される化学基を介して連結している。

アルキルスペーサーを含んでいるリンカーは、たとえば、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｚ−Ｃ（Ｏ）−または−Ｓ−（ＣＨ_２）_ｚ−Ｃ（Ｏ）−または−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｚ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｚ−ＮＨ、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）_ｚ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｚ−Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｚ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−などであり、ｚは、２〜２０である。こうしたアルキルリンカーは、限定はしないが、低級アルキル（たとえば、Ｃ_１〜Ｃ_６）、低級アシル、ハロゲン（たとえば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、またはフェニルを含めた、いずれかの非立体障害性基でさらに置換されていてもよい。

リンカーは、ポリマーの性質のものでもよい。リンカーは、生物学的に安定または生分解性であるポリマー鎖または単位を含んでよい。連結が繰り返されているポリマーは、結合不安定性に応じて、生理的条件下で様々な程度の安定性を備えうる。ポリマーは、ポリカルボネート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、ポリエステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、ポリウレタン（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、ポリアミド（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）などの結合を含んでいてよい。こうした結合は、例として示しており、本発明のポリマー鎖またはリンカーにおいて用いることのできる結合のタイプを限定するものではない。適切なポリマーとしては、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテルマレイン酸無水物、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖、セルロースおよびセルロース誘導体、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体のコポリマー、ポリビニルエチルエーテルなど、およびこれらの混合物が挙げられる。ポリマーリンカーは、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧリンカーは、線状または分枝状である場合がある。本発明におけるＰＥＧリンカーの分子量は、特定のいずれかの大きさに限定されないが、ある特定の実施形態は、１００〜５０００ダルトン、たとえば、５００〜１５００ダルトンの間の分子量を有する。

リンカーは、標的ペプチド／タンパク質のアミノ基と生体相互作用薬／生体分析用薬剤上の官能基／反応性基との間に架橋を形成する適切な官能基−反応性基を、両方の末端に含んでいる。

リンカーは、性質の異なるいくつかの連結部分（またはスペーサー）（たとえば、アミノ酸、ヘテロシクリル部分、ＰＥＧ、および／またはアルキル部分の組合せ）を含んでもよい。この例において、各連結部分は、これら部分が互いに連結され、また各末端において、それぞれのパートナーとの架橋が形成されるように、両方の末端に、適切な官能基−反応性基を含んでいる。

修飾された標的タンパク質／ペプチドまたはその構築物（すなわち、部分的なリンカーに付着しているペプチド／タンパク質）は、分析用薬剤／生体相互作用薬またはその構築物（すなわち、部分的なリンカーに予め付着しているもの）上の利用可能な反応性官能基と反応し、共有結合を形成しうる反応性基を含む。反応性基は、共有結合を形成しうる化学基である。反応性基は、コンジュゲーションの一方の部位に配置され、一般に、それによってコンジュゲーションの他方の部位にあるアミノ基、ヒドロキシル基、アルケン基、カルボキシ基、ヒドラジン基、ヒドロキシルアミン基、アジド基、またはチオール基のような官能基と共有結合を形成することのできる、カルボキシ、ホスホリル、アシル基、エステルまたは混合無水物、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、テトラジン、アルキン、イミデート、ピリジン−２−イル−ジスルファニルでよい。

標的ペプチド／標的タンパク質を生体相互作用薬／分析用薬剤および／もしくはリンカー部分にコンジュゲートさせる、および／または性質の異なる種々の連結部分を互いにコンジュゲートさせるための、特に重要な反応性基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、アルキン（より詳細にはシクロオクチン）である。

官能基（Ｆｇ）としては、１．マレイミド、トシルスルホン、またはピリジン−２−イルジスルファニルなどの反応性基と反応させるためのチオール基；２．カルボン酸または活性化型カルボン酸（たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド化学によるアミド結合形成）、ホスホリル基、アシル基、混合無水物などの反応性基と反応させるためのアミノ基（たとえば、アミノ酸のアミノ官能基）；３．アルキン、より詳細にはシクロオクチン反応性基とのＨｕｉｓｇｅｎ付加環化（より一般的にはクリックケミストリーとして知られる）にかけるためのアジド；４．ヒドロキシルアミンまたはヒドラジンから選択される反応性基と反応させて、それぞれオキシムまたはヒドラジンを生成するためのカルボニル基；５．アザ［４＋２］付加においてテトラジン反応性基と反応させるためのアルケンが挙げられる。リンカーおよび官能基／反応性基のいくつかの例を本明細書で述べてはいるが、本発明は、リンカーまたはいずれの長さおよび組成を企図する。

用語「毒素」とは、酵素、細胞受容体、巨大分子および細胞などと相互作用をなすことができ、危害または疾患を引き起こす、小分子またはペプチドを指す。このような毒素は、がん療法において、がん細胞を破壊するのに使用することができる。その毒性ゆえに、こうした毒素は、薬物それ自体として使用することはできない。毒素は通常、これをがん細胞に仕向けるタンパク質に連結される。毒素の例は、ＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ）、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）、メルタンシン（mertansine）（ＤＭ−１）、メイタンシン、クリプトフィシン、ツブリシン（tubulysin）、およびドラスタチン１０である。

用語「キレーター」または「キレート剤」とは、金属イオン（たとえば、ランタニド）と錯体を形成しうる有機分子を指す。キレーターは、タンパク質またはペプチドの標識に一般に使用される。金属イオンコンジュゲートの最終製品は、放射免疫検出法、放射免疫療法、磁気共鳴画像法、光線力学療法または他の同様の物理療法に使用される。キレーターまたはキレート剤の非限定的な例は、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物）およびその誘導体、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸）およびその誘導体、たとえばＮＯＤＡ−ＧＡ、（放射性金属イオンを結合する）ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸）およびその誘導体、ＴＥＴＡ（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸）およびその誘導体、ＤＴＴＡＮ−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸である。これらおよび他のキレーターは、市販品供給元から容易に入手可能である。

用語「画像処理試薬」とは、臨床家が、塊（mass）が良性であるか悪性であるかを判定し、身体における転移がん部位の場所を突き止められるように設計された化学薬品である。画像処理剤は、特定の腫瘍を目標とし、その後、ターゲットが中和されるように画像処理機器を調整することができる。画像処理剤の例は、蛍光体、ｖｉｖｏｔａｇ、蛍光ナノ粒子、ルシフェリン、およびｘｅｎｏｌｉｇｈｔである。

用語「蛍光体」とは、光励起後に再び発光しうる化学化合物を指す。蛍光体は、通常、いくつかの芳香族基の組合せ、またはいくつかのπ結合を有する平面もしくは環状分子を含んでいる。蛍光体は、一般に、巨大分子に共有結合されて、親和性（affine）または生体活性試薬（抗体、ペプチド、核酸）のマーカー（または色素、タグ、もしくはレポーター）として働く。蛍光体は、様々な分析方法、すなわち、蛍光画像法および分光法において、組織、細胞、または材料の染色に顕著に使用される。例としては、フルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ５やＣｙ７などのＣｙ色素、Ａｌｅｘａ７５０、Ａｌｅｘａ６４７、Ａｌｅｘａ４８８などのＡｌｅｘａ色素、クマリンなどが挙げられる。

本明細書で使用する「生体相互作用薬」とは、生きている組織または細胞に導入されたとき、生物学的反応を引き起こす有機部分または化合物を指す。生体相互作用薬の例としては、抗原、毒素、治療用タンパク質またはペプチドなどが挙げられる。生体相互作用薬は、小分子および巨大分子の場合がある。

本明細書で使用する「分析用薬剤」とは、分析用薬剤が結合され、または別な形で関連付けられている材料を、質的または量的に特徴付けるための、機器を用いた方法によって検出することのできる、有機部分または化合物を指す。このような分析用薬剤の例としては、標識、たとえば、蛍光体または放射標識が挙げられる。

実施形態
本発明の種々の実施形態をここに記載する。各実施形態で明細に述べられた特色は、明細に述べられた他の特色と組み合わせて、さらなる実施形態を実現してもよいと認識される。

実施形態１において、本発明は、標的タンパク質または標的ペプチドを、Ｎ末端アミノ酸のアミノ官能基において修飾する方法であって、
ｃ．得られるタンパク質またはペプチドが、Ｎ末端アミノ酸に隣接する位置にヒスチジンアミノ酸を含有するように、標的タンパク質または標的ペプチドを修飾するステップと、
ｄ．Ｎ末端アミノ酸に隣接する位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドを、アシル化用化合物と６未満のｐＨで接触させて、修飾されたタンパク質またはペプチドを生成するステップと
を含む方法に関する。

実施形態２において、本発明は、Ｎ末端アミノ酸に隣接する位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端アミノ酸に隣接するアミノ酸を、ヒスチジンアミノ酸で置き換えることにより調製される、実施形態１に従う方法に関する。

実施形態３において、本発明は、Ｎ末端アミノ酸に隣接する位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端にある２つのアミノ酸を、アミノ酸配列ＸＨ−［Ｈは、ヒスチジンであり、Ｘは、Ｍ、Ａ、Ｑ、ＮおよびＧから選択されるアミノ酸である］で置き換えることにより調製される、実施形態１に従う方法に関する。

実施形態４において、本発明は、前記アミノ酸配列ＸＨ−がＭＨ−およびＡＨ−である、実施形態３に従う方法に関する。

実施形態５において、本発明は、Ｎ末端アミノ酸に隣接する位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端にある３つのアミノ酸を、アミノ酸配列ＸＨＸ’−［Ｈは、ヒスチジンであり、ＸおよびＸ’は、独立して、Ｍ、Ａ、Ｑ、ＮおよびＧから選択されるアミノ酸である］で置き換えることにより調製される、実施形態１に従う方法に関する。

実施形態６において、本発明は、前記アミノ酸配列ＸＨＸ’−がＡＨＡ−およびＭＨＡである、実施形態５に従う方法に関する。

実施形態７において、本発明は、Ｎ末端アミノ酸に隣接する位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端に、式ＸＨの２つのアミノ酸配列または式ＸＨＸ’−の３つのアミノ酸配列［式中、Ｈは、ヒスチジンであり、ＸおよびＸ’は、Ｍ、Ａ、Ｑ、ＮおよびＧから独立して選択される］を追加することにより調製される、実施形態１に従う方法に関する。

実施形態８において、本発明は、Ｎ末端アミノ酸に隣接する位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端にヒスチジンタグを追加することにより調製される、実施形態１に従う方法に関する。この実施形態の一態様では、前記ヒスチジンタグは、１〜１０のヒスチジンアミノ酸を含む。この実施形態のさらなる態様では、前記ヒスチジンタグは、１つまたは複数のメチオニンアミノ酸を、このアミノ酸がＮ末端アミノ酸に隣接する位置に配置されない限り、さらに含む。

実施形態９において、本発明は、Ｎ末端アミノ酸に隣接する位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端に、ＭＨＨＨＨＨＨ−またはＭＨＨＨＨＨＨＭ−から選択されるアミノ酸配列を追加することにより調製される、実施形態８に従う方法に関する。

実施形態１０において、本発明は、前記アシル化剤が、活性化型の式：
ＨＯ−Ｃ（Ｏ）−（Ｌ^１）_ｎ−Ｒ^１［式中、
Ｌ^１は、リンカーであり、
Ｒ^１は、生体相互作用薬もしくは分析用薬剤への共有結合を促進する反応性基を含む部分であり、またはＲ^１は、生体相互作用薬もしくは分析用薬剤であり、
ｎは、０または１である］の酸である、実施形態１〜９のいずれか１つの方法に関する。

活性化型のカルボン酸は、当業者によく知られている。実施形態１０Ａにおいて、本発明で使用する活性化型のカルボン酸は、フルオロフェニルエステルなどのエステル；無水物または混合無水物；塩化アシル、アジ化アシル；リン酸アシル、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドによって活性化された酸から選択される。

実施形態１１において、本発明は、前記アシル化剤が次式：

［Ｒは、ＨまたはＳＯ_３Ｎａである］のものである、実施形態１０または１０Ａの方法に関する。

実施形態１２において、本発明は、ｎが１であり、Ｌ^１が、１つまたは複数のアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、ヘテロ環基、ポリエチレングリコール、および／もしくは１つまたは複数の天然もしくは天然でないアミノ酸、またはこれらの組合せを含み、前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、および／もしくは天然もしくは天然でないアミノ酸はそれぞれ、場合により互いに合体および連結しており、または前記生体相互作用薬／分析用薬剤および／もしくは前記標的タンパク質／ペプチドに、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｏ−、＝ＮＨ−Ｏ−、＝ＮＨ−ＮＨ−、もしくは＝ＮＨ−Ｎ（アルキル）−から選択される化学基を介して連結している、実施形態１０、１０Ａ、または１１の方法に関する。

実施形態１３において、本発明は、前記リンカーが、線状もしくは分枝状アルキル、または分子量が１００ｋＤ〜５０００ｋＤの間であるポリエチレングリコールである、実施形態１２に従う方法に関する。実施形態１３Ａにおいて、最も重要なリンカーは、式：

［式中、ｙは、０〜３４である］の分枝状でないオリゴエチレングリコール部分である。

実施形態１４において、本発明は、Ｒ１が生体相互作用薬／分析用薬剤である、実施形態１０、１０Ａ、１１、１２、または１３に従う方法に関する。

実施形態１５において、本発明は、Ｒ１がビオチンである、実施形態１４に従う方法に関する。ビオチン化のためのこうしたアシル化剤の非限定的な例は、
式：

のＳＯ_３ＮＨＳ−ビオチン、
式：

のＳＯ_３ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、
式：

のＮＨＳ−ＰＥＧ２４−ビオチン、
および、たとえば市販品供給元から容易に入手可能である他の既知のビオチン構築物である。

実施形態１６、本発明は、Ｒ１が脂肪酸（ＦＡ）部分である、実施形態１４に従う方法に関する。脂肪酸の例は、少なくとも１つのカルボン酸（たとえば、１、２、３または４つのＣＯ_２Ｈ）で置換され、場合によりヒドロキシル基でさらに置換されている、Ｃ_６〜７０アルキル、Ｃ_６〜７０アルケニル、Ｃ_６〜７０アルキニル鎖である。脂肪酸（ＦＡ）は、標的タンパク質または標的ペプチドに、リンカーＬ^１を介してコンジュゲートされることが好ましい。実施形態１６Ａにおいて、本発明は、Ｒ１が、次式：

［Ｒ^２は、ＣＯ_２Ｈ、Ｈであり、
Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＯ_２Ｈ、−ＣＨ＝ＣＨ_２、または−Ｃ≡ＣＨであり、
Ａｋ^１は、分枝状Ｃ_６〜Ｃ_３０アルキレンであり、
ｑ、ｒ、およびｐは、互いに独立して、６〜３０の間の整数であり、結合点は、ＣＯ２Ｈ官能基のいずれかである］またはこれらのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩から選択される、実施形態１６に従う方法に関する。

実施形態１６Ｃにおいて、Ｒ１は、次の脂肪酸：

［式中、Ａｋ^２、Ａｋ^３、Ａｋ^４、Ａｋ^５、およびＡｋ^６は、独立して、（Ｃ_８〜２０）アルキレンであり、Ｒ^６およびＲ^７は、独立して、（Ｃ_８〜２０）アルキルである］から選択される。

実施形態１６Ｄにおいて、Ｒ１は、次の脂肪酸：

から選択される。

これらの脂肪酸部分は、同時出願された米国出願番号、米国特許出願公開第６２／０１５，８６２号明細書（代理人案件整理番号ＰＡＴ０５６２７４−ＵＳ−ＰＳＰ）、米国特許出願公開第６２／０８２，３２７号明細書（代理人案件整理番号ＰＡＴ０５６２７４−ＵＳ−ＰＳＰ０２）、および米国特許出願公開第６２／１０７，０１６号明細書（代理人案件整理番号ＰＡＴ０５６２７４−ＵＳ−ＰＳＰ０３）に記載されている。

実施形態１７において、本発明は、前記アシル化剤が、

［Ｒ８は、線状もしくは分枝状Ｃ_６〜７０アルキル、線状もしくは分枝状Ｃ_６〜７０アルケニル、または線状もしくは分枝状Ｃ_６〜７０アルキニルであり、これらはそれぞれ、カルボキシおよびヒドロキシルから選択される１〜３つの置換基で場合により置換されており（optionally substituted with optionally substituted with 1 to 3 substituents selected from carboxy and hydroxyl）、
ｓは、１〜３４である］である、実施形態１〜１４および１６のいずれか１つに従う方法に関する。この実施形態の特定の態様において、Ｒ８は、

［式中、Ａｋ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、ｑ、ｒ、およびｐは、上で規定している］である。このような脂肪酸−ＰＥＧ−ＮＨＳ部分の例は、同時出願された米国特許出願公開第６２／０１５，８６２号（代理人案件整理番号ＰＡＴ０５６２７４−ＵＳ−ＰＳＰ）明細書および米国特許出願公開第６２／０８２，３２７号（代理人案件整理番号ＰＡＴ０５６２７４−ＵＳ−ＰＳＰ０２）明細書および第６２／１０７，０１６号（代理人案件整理番号ＰＡＴ０５６２７４−ＵＳ−ＰＳＰ０３）明細書に記載されている。

実施形態１８において、本発明は、Ｒ１が、生体相互作用薬への共有結合を促進する反応性基を含む部分である、実施形態１０、１０Ａ、１１、１２、または１３に従う方法に関する。

実施形態１９において、本発明は、前記反応性基が、アシル、エステルまたは混合無水物、アルキン、テトラジン、マレイミド、イミデート、カルボキシから選択される、実施形態１８に従う方法に関する。この実施形態の特定の一態様において、前記反応性基は、シクロアルキン、テトラジン、およびマレイミドから選択される。この実施形態のさらに別の態様では、前記反応性基は、シクロアルキン部分である。

実施形態２０において、本発明は、Ｒ１がシクロオクチン部分である、実施形態１８または１９に従う方法に関する。この実施形態の一態様では、前記アシル化剤は、次のカルボン酸：

または式：

のアシル化剤から活性化されたものである。

実施形態１９の別の態様では、前記反応性基は、テトラジンである。テトラジン反応性基を含むアシル化用部分の非限定的な例は、活性化型の次の酸：

または式：

のアシル化剤である。

実施形態１９のさらに別の態様では、前記反応性基は、マレイミドである。マレイミド反応性基を含むアシル化用部分の非限定的な例は、活性化型の次の酸：

［式中、Ａｋ_７は、Ｃ_２〜１０アルキレンである］

実施形態２１において、本発明は、前記アシル化剤が

である、実施形態１〜１３および１８〜２０のいずれか１つに従う方法に関する。

実施形態２２において、本発明は、生体相互作用薬または分析用薬剤を、前記アシル化剤中に存在する反応性基と反応させるステップをさらに含み、前記生体相互作用薬または生体分析用薬剤は、官能基を介して、場合によりリンカーＬ２を介して反応させる、実施形態１８〜２１のいずれか１つに従う方法に関する。

実施形態２３において、本発明は、前記官能基が、アミノ基、アジド基、アルケン基、チオール基、およびヒドラジン、ヒドロキシルアミン基から選択される、実施形態２２に従う方法に関する。実施形態２３の好ましい態様である実施形態２３Ａでは、官能基は、アジドである。

実施形態２４において、本発明は、アジド官能基を含む前記生体相互作用薬または分析用薬剤が、

［式中、ｙは、０〜３４であり、ＦＡは、そのカルボン酸官能基の１つを介してＰＥＧリンカーに付着している脂肪酸残基である］である、実施形態２２、２３、または２３Ａに従う方法に関する。別の実施形態では、ＦＡは、次式：

を有する。

アジド官能基を含む生体相互作用薬の別の例は、（好ましくはＮ末端に）アジドリシンが場合によりリンカー（たとえば、ポリグリシン）を介して導入されている治療用ペプチドである。このような生体相互作用薬の一例は、

である。

実施形態２５において、本発明は、前記生体相互作用薬または分析用薬剤が、ビオチン、蛍光体、毒素、キレーター、半減期延長性部分、たとえば、アルブミン結合性部分または他の血漿タンパク質結合性部分、未変性ＦｃまたはＦｃ変異体、画像処理試薬、およびペプチドから選択される、前述の実施形態のいずれか１つに従う方法に関する。

実施形態２５Ａにおいて、前記生体相互作用薬は、毒素である。毒素の非限定的な例は、ＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチン（monomethylauristation））：

である。

実施形態２６において、本発明は、前記標的タンパク質または標的ペプチドが、ＡＰＪアゴニストペプチド、未変性ＦｃもしくはＦｃ変異体、またはＧＤＦ１５タンパク質もしくはその変異体である、前述の実施形態のいずれか１つに従う方法に関する。

実施形態２７において、本発明は、前記ｐＨが５未満である、前述の実施形態のいずれか１つに従う方法に関する。

実施形態２７Ａにおいて、本発明は、前記ｐＨが約４．５である、前述の実施形態のいずれか１つに従う方法に関する。実施形態２７の別の態様である実施形態２７Ｂでは、前記ｐＨは、４．５〜４．８である。実施形態２７Ｂの一態様では、前記ｐＨは、約４．６である。実施形態２７Ｂの別の態様では、前記ｐＨは、約４．７５である。ｐＨは、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、もしくはリン酸カリウム、またはこれらの組合せである緩衝液を使用して調整することができる。緩衝液の非限定的な例は、ＮａＯＡｃ、リン酸水素ナトリウムまたはリン酸二カリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４またはＫ_２ＨＰＯ_４）である。

実施形態２８において、本発明は、前記ｐＨが４である、前述の実施形態のいずれか１つに従う方法に関する。

別の態様では、本明細書で開示する方法から調製されるコンジュゲートが開示される。別の態様では、本明細書で開示するコンジュゲートまたは修飾タンパク質／ペプチドを用いて調製されるワクチンが開示される。別の態様では、本明細書で開示する修飾タンパク質／ペプチドを含む治療用タンパク質／ペプチドが開示される。別の態様では、本明細書で開示する修飾タンパク質／ペプチドを含む画像処理剤が開示される。別の態様では、本明細書で開示する修飾タンパク質／ペプチドを含む標識用ツールが開示される。

別の実施形態では、方法、方法から得られるコンジュゲート、リンカー、および生体相互作用薬／分析用薬剤は、以下の実施例の部において定めるものである。

方法のステップａ）：得られるタンパク質またはペプチドが、Ｎ末端アミノ酸に隣接する位置にヒスチジンアミノ酸を含有するようになる、標的ペプチド／タンパク質の合成。
標的タンパク質／ペプチドは、Ｎ末端アミノ酸に隣接する位置に、ヒスチジンアミノ酸をすでに有するものでもよい。標的タンパク質が、Ｎ末端アミノ酸に隣接する位置にヒスチジンアミノ酸を有していない場合、本発明のステップａ）に従って、タンパク質／ペプチドを修飾することが可能である。タンパク質へのアミノ酸残基の挿入は、翻訳後化学修飾やトランスジェニック技術などの、当業者に知られている標準技術によって引き起こすことができる。

本発明のこの方法は、標的ペプチドまたはタンパク質が修飾される結果、Ｎ末端にあるアミノ酸のアミノ官能基が活性化される、ステップａ）を含む。
ステップａは、以下のスキーム１〜５によって表すことができる。

スキーム１は、標的タンパク質またはペプチドを、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端アミノ酸に隣接するアミノ酸をヒスチジンアミノ酸で置き換えることにより修飾する、ステップａ）について述べるものである。

式中、Ｐは、Ｎ末端にその最後の３アミノ酸（Ａａ３、Ａａ２、Ａａ１）を有する、標的タンパク質／ペプチドである。

スキーム２は、標的タンパク質またはペプチドを、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端にある２つのアミノ酸（すなわち、Ａａ_１およびＡａ_２）をアミノ酸配列ＸＨ−［Ｈは、ヒスチジンであり、Ｘは、Ｍ、Ａ、Ｑ、ＮおよびＧから選択されるアミノ酸である］で置き換えることにより修飾する、ステップａ）について述べるものである。

スキーム３は、標的タンパク質またはペプチドを、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端にある３つのアミノ酸（すなわち、Ａａ_１、Ａａ_２、およびＡａ_３）をアミノ酸配列ＸＨＸ’−［Ｈは、ヒスチジンであり、ＸおよびＸ’は、独立して、Ｍ、Ａ、Ｑ、ＮおよびＧである］で置き換えることにより修飾する、ステップａ）について述べるものである。

スキーム４および５は、標的ペプチドまたはタンパク質を、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端に、式ＸＨの２つのアミノ酸配列または式ＸＨＸ’−の３つのアミノ酸配列［式中、Ｈは、ヒスチジンであり、ＸおよびＸ’は、Ｍ、Ａ、Ｑ、ＮおよびＧから独立して選択される］を追加することにより修飾する、ステップａ）について述べるものである。

スキーム１〜５において上述したとおりの修飾ペプチドまたはポリペプチド／タンパク質は、合成化学的方法もしくは組換え法のいずれかによって、または両方の方法を組み合わせて生成することができる。ペプチドまたはポリペプチド／タンパク質構築物は、全長として生成してもよいし、または全長でない断片として合成し、つないでもよい。本発明のペプチドおよびポリペプチドは、ペプチド合成のための、それ自体が知られている手順によって生成することができる。ペプチド合成の方法は、固相合成および液相合成のいずれかのものでよい。すなわち、問題のペプチドおよびポリペプチドは、タンパク質を構成しうる部分的なペプチドまたはアミノ酸をその残部と縮合させ、生成物が保護基を有するとき、保護基を外し、その後、所望のペプチドを製造することができる。縮合および脱保護の既知の方法としては、以下の文献（１）〜（５）に記載の手順が挙げられる。
（１）M. Bodanszky and M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York, 1966、
（２）Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York, 1965、
（３）Nobuo Izumiya et al. Fundamentals and Experiments in Peptide Synthesis, Maruzen, 1975、
（４）Haruaki Yajima and Shumpei Sakakibara, Biochemical Experiment Series 1, Protein Chemistry IV, 205, 1977、および
（５）Haruaki Yajima (ed.), Development of Drugs-Continued, 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten

反応後、ペプチドまたはポリペプチドは、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、サイズ排斥クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、再結晶などの従来の精製技術を組み合わせて、精製および単離することができる。上述のように単離したペプチドが遊離化合物である場合、既知の方法によってペプチドを適切な塩に変換することができる。逆に、単離された生成物が塩である場合、既知の方法によってペプチドを遊離ペプチドに変換することができる。

ポリペプチドのアミドは、アミド化に適した、ペプチド合成用の樹脂を使用して得ることができる。樹脂としては、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ樹脂、塩化２−クロロトリチル樹脂などが挙げられる。このような樹脂を使用して、α−アミノ基および側鎖の官能基が適切に保護されているアミノ酸を、目的のペプチドの配列に従い、それ自体が知られている種々の縮合技術によって樹脂上で縮合させる。一連の反応の終盤に、ペプチドまたは保護されたペプチドを樹脂から外し、必要に応じて保護基を除去し、ジスルフィド結合を形成させて、目的のポリペプチドを得る。

上述の保護されたアミノ酸の縮合には、ＨＡＴＵ、ＨＣＴＵ、またはたとえばカルボジイミドなどの、ペプチド合成用の様々な活性化試薬を使用することができる。カルボジイミドとしては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、およびＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドが挙げられる。このような試薬を用いた活性化には、ラセミ化防止添加剤、たとえば、ＨＯＢｔまたはＯｘｙｍａ Ｐｕｒｅを使用することができる。保護されたアミノ酸は、活性化試薬およびラセミ化防止剤と共に、樹脂にそのまま加えてもよいし、または対称酸無水物、ＨＯＢｔエステル、またはＨＯＯＢｔエステルとして予め活性化し、次いで樹脂に加えてもよい。保護されたアミノ酸の活性化または樹脂との縮合のための溶媒は、ペプチド縮合反応に有用であることがわかっている溶媒の中から適正に選択することができる。たとえば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、クロロホルム、トリフルオロエタノール、ジメチルスルホキシド、ＤＭＦ、ピリジン、ジオキサン、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチル、またはこれらの適切な混合物を挙げることができる。反応温度は、ペプチド結合形成に有用であることがこれまでにわかっている範囲から選択することができ、普通は、約−２０℃〜５０℃の範囲から選択する。活性化型アミノ酸誘導体は、一般に、１．５〜４倍過剰の割合で使用する。ニンヒドリン反応を利用した試験によって、縮合が不十分であるとわかったなら、十分な縮合を実現するために、保護基を除去せずに、縮合反応を繰り返すことができる。繰り返した縮合によって、それでも十分な程度の縮合がなされない場合、未反応のアミノ基を、無水酢酸またはアセチルイミダゾールでアセチル化することができる。

出発材料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、Ｚ、Ｂｏｃ、第三級アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、ＣＩ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、またはＦｍｏｃが挙げられる。使用することのできるカルボキシ保護基としては、限定はしないが、上述のＣ_１〜６アルキル、Ｃ_３〜８シクロアルキル、およびＣ_６〜１０アリール−Ｃ_１〜２アルキル、ならびに２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシル、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド、第三級ブトキシカルボニルヒドラジド、およびトリチルヒドラジドが挙げられる。

セリンおよびトレオニンのヒドロキシ基は、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。前記エステル化に適した基としては、炭素から導かれる基、たとえば、低級アルカノイル基、たとえばアセチルなど、アロイル基、たとえばベンゾイルなど、ベンジルオキシカルボニル、およびエトキシカルボニルが挙げられる。前記エーテル化に適した基としては、ベンジル、テトラヒドロピラニル、および第三級ブチルが挙げられる。チロシンのフェノール性ヒドロキシル基の保護基としては、Ｂｚｌ、Ｃｌ_２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、および第三級ブチルが挙げられる。

ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリエチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、およびＦｍｏｃが挙げられる。

出発アミノ酸の活性化型カルボキシル基には、対応する酸無水物、アジ化物、および活性エステル、たとえば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、ｐ−ニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔなどのアルコールとのエステルなどが含まれる。出発アミノ酸の活性化型アミノ基には、対応するホスホルアミドが挙げられる。

保護基の脱離方法としては、パラジウムブラックやパラジウム炭素などの触媒の存在下で水素ガスを使用する触媒還元、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、またはこうした酸の混合物での酸処理、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンでの塩基処理、液体アンモニア中でのナトリウム金属による還元が挙げられる。上述の酸処理による脱離反応は、一般に、−２０℃〜４０℃の温度で実施され、アニソール、フェノール、チオアニソール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、硫化ジメチル、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのカチオンアクセプターを加えて、有利に行うことができる。ヒスチジンのイミダゾール基の保護に使用した２，４−ジニトロフェニル基は、チオフェノールでの処理によって脱離させることができ、トリプトファンのインドール基の保護に使用したホルミル基は、希水酸化ナトリウム溶液または希アンモニア水溶液でのアルカリ処理、ならびに１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオール存在下での上述の酸処理によって脱離させることができる。

出発材料の反応に関与すべきでない官能基の保護方法、使用することのできる保護基、保護基の除去方法、および反応に関与すべき官能基を活性化する方法は、すべて、既知の基および方法の中から公正に選択することができる。

アミド型のポリペプチドを得る別の方法は、Ｃ末端アミノ酸の−カルボキシル基を最初にアミド化するステップと、次いでペプチド鎖を所望の鎖長までＮ側に伸長し、次いで、Ｃ末端ペプチドのα−アミノ基、および目的ポリペプチドの残部を形成することになるアミノ酸またはペプチドのα−カルボキシ基を選択的に脱保護するステップと、α−アミノ基および側鎖官能基が上述の適切な保護基で保護されている２つの断片を、上で挙げたものなどの混合溶媒中で縮合させるステップとを含む。この縮合反応のパラメータは、上述したのと同じものでよい。縮合によって得られた保護ペプチドから、上述の方法によってすべての保護基を除去して、その結果、所望の粗製ペプチドが得られる。この粗製ペプチドを、既知の精製手順によって精製し、主画分を凍結乾燥して、目的のアミド化ポリペプチドを得ることができる。ポリペプチドのエステルを得るには、Ｃ末端アミノ酸のａ−カルボキシル基を所望のアルコールと縮合させて、アミノ酸エステルを得、次いで、アミド生成について上述した手順に従う。

別法として、スキーム１〜５に記載のとおりの修飾ペプチドまたはタンパク質の生成には、組換え発現法が特に有用である。宿主細胞（ペプチドの配列をコードする核酸を含むように人工的に操作されており、転写および翻訳を行い、場合によりペプチドを細胞成長培地に分泌する細胞）を使用する組換えタンパク質発現は、当業界で日常的に使用される。組換え生成法については、通常、ペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸が、従来の方法によって合成され、発現ベクターに組み込まれることになる。このような方法は、追加のペプチド配列または他のタンパク質もしくはタンパク質断片もしくはドメインに融合したペプチドを含むポリペプチド組成物の製造に特に好ましい。宿主細胞は、場合により、大腸菌（E.Coli）、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＴ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ｈｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫、もしくは植物細胞、またはこれらのいずれかの派生、不死化、もしくは形質転換細胞から選択される少なくとも１種でよい。

本発明はまた、ＲＮＡの形でも、またはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含めたＤＮＡの形でもよい、上述の変異体をコードするポリヌクレオチドも包含する。ＤＮＡは、二本鎖でも一本鎖でもよい。本発明の組成物をコードするコード配列は、遺伝暗号の冗長性または縮重の結果として様々となりうる。

本発明の組成物をコードするポリヌクレオチドには、次のもの、すなわち、変異体のコード配列のみ；変異体のコード配列と、機能ポリペプチドやリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパク質配列などの追加のコード配列；変異体のコード配列と、変異体のコード配列の５’および／または３’側のイントロンや非コード配列などの非コード配列を含めることができる。したがって、用語「変異体をコードするポリヌクレオチド」は、変異体のコード配列だけでなく、追加のコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドも含みうる、ポリヌクレオチドを包含する。

本発明はさらに、示された置換を含んでいる、ポリペプチドの断片、類似体、および誘導体をコードする、記載のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、上述のとおり、ヒトＧＤＦ１５配列の自然に存在するアレル変異体、自然に存在しない変異体、または切断型変異体でよい。したがって、本発明は、上述の変異体をコードするポリヌクレオチド、ならびに開示された変異体の断片、誘導体、または類似体をコードする、そのようなポリヌクレオチドの変異体も包含する。このようなヌクレオチド変異体には、第１または第２の実施形態の、示されたアミノ酸置換の少なくとも１つが存在しさえすれば、欠失変異体、置換変異体、切断型変異体、および付加または挿入変異体が含まれる。

本発明のポリヌクレオチドは、配列を発現制御配列に作動可能に連結（すなわち、それが確実に機能するように配置）した後、宿主中で発現させることができる。こうした発現ベクターは、通常、宿主生物中で、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡの一体部分として複製可能である。一般的に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、たとえば、テトラサイクリン、ネオマイシン、およびジヒドロ葉酸還元酵素を含む。ＧＤＦ１５変異体は、哺乳動物細胞、昆虫、酵母、細菌細胞、または他の細胞において、適切なプロモーターの制御下で発現させることができる。本発明のＤＮＡ構築物から得られたＲＮＡを使用する、無細胞翻訳系を用いて、このようなタンパク質を生成することもできる。

大腸菌（Escherichia Coli）（E. coli）は、特に本発明のポリヌクレオチドのクローン化に有用な、原核生物宿主である。使用に適する他の微生物宿主として、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、ならびにセラチア属（Serratia）、シュードモナス属（Pseudomonas）、連鎖球菌属（Streptococcus）、およびブドウ球菌属（Staphylococcus）の種々の種が挙げられるが、選択できるものとして、他の微生物宿主を用いてもよい。こうした原核生物宿主では、宿主細胞と適合しうる発現制御配列（たとえば、複製開始点）を通常含んでいる発現ベクターも作製することができる。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージλもしくはＴ７からのプロモーター系などの、よく知られたいくつかのプロモーターのいずれかが存在してもよい。プロモーターは通常、転写および翻訳を開始し、完了するために、場合によりオペレーター配列と共に発現を制御し、リボソーム結合部位配列などを備えている。

タンパク質発現の分野の技術者なら、大腸菌（E. coli）中での発現については、成熟配列のＮ末端に、メチオニンまたはメチオニン−アルギニン配列が導入される場合があり、本発明の文脈の範囲内で予期されることを認識されよう。したがって、別段注釈を加えない限り、大腸菌（E. coli）中で発現させた本発明の組成物は、Ｎ末端に導入されたメチオニン配列を有する。

酵母や真菌などの他の微生物も、発現に使用してよい。ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・アングスタ（Pichia angusta）が、好ましい酵母宿主の例であり、適切なベクターは、望み通りに、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素を始めとするプロモーターや複製開始点などの発現制御配列、停止配列などを有する。クロコウジカビ（Aspergillus niger）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、およびスエヒロタケ（Schizophyllum commune）が真菌宿主の例ではあるが、選択できるものとして、他の真菌宿主も用いてよい。

哺乳動物組織細胞培養も、本発明のポリペプチドの発現および生成に使用することができる。無傷の変異体を分泌しうるいくつかの適切な宿主細胞系が当業界で開発されており、ＣＨＯ細胞系、種々のＣＯＳ細胞系、ＮＳＯ細胞、シリアンハムスター卵巣細胞系、ＨｅＬａ細胞、またはヒト胎児由来腎臓細胞系（すなわち、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ）が挙げられる。

哺乳動物細胞用の発現ベクターは、複製開始点、プロモーター、エンハンサーなどの発現制御配列、およびリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位などの必要なプロセシング情報部位、および転写停止配列を含む場合がある。好ましい発現制御配列は、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス、ラウス肉腫ウイルスなどに由来するプロモーターである。好ましいポリアデニル化部位としては、ＳＶ４０およびウシ成長ホルモン由来の配列が挙げられる。

対象となる（たとえば、本発明の組成物および発現制御配列をコードする）ポリヌクレオチドを含んでいるベクターは、細胞宿主の種類に応じて様々となる、よく知られた方法によって、宿主細胞にトランスフェクトすることができる。たとえば、原核細胞には、塩化カルシウムトランスフェクションがよく利用されるのに対し、他の細胞宿主には、リン酸カルシウム処理または電気穿孔法を使用することができる。

種々のタンパク質精製法を用いることができ、そのような方法は、当業界で知られており、たとえば、Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990)およびScopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982)に記載されている。選択される精製ステップは、たとえば、本発明の組成物に使用された生成方法の性質に応じて決まる。

ポリペプチドは、（たとえば、他のポリペプチドを含まない）実質的に純粋または単離された形で調製することができる。ポリペプチドは、存在しうる他の成分（たとえば、他のポリペプチドまたは他の宿主細胞成分）に比べてポリペプチドが富化されている組成物として存在する場合もある。たとえば、他の発現タンパク質を実質的に含まない、たとえば、他の発現タンパク質が組成物の９０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満しか占めていない組成物としてポリペプチドが存在するような、精製ポリペプチドを提供することができる。

方法のステップｂ）：（ステップａからの）修飾タンパク質／ペプチドへの部位特異的コンジュゲーション−修飾ペプチド／タンパク質のＮ末端におけるアミノ基の選択的アセチル化
標的タンパク質またはペプチドのＮ末端アミノ基のアシル化は、以下のスキーム６によって表すことができる。

式中、Ｐ_Ｍは、ステップａ）による修飾ペプチドまたはタンパク質であり、Ｒ^１、Ｌ^１、およびｎは、上で規定したとおりである。

活性化型の酸６Ａは、ＮＨＳ−エステルであることが好ましい。アシル化反応は、水性媒質中にて６未満のｐＨで実施する。別の実施形態では、アシル化反応は、５未満のｐＨで実施する。さらに別の実施形態では、アシル化反応は、約４のｐＨで実施する。さらに別の実施形態では、アシル化反応は、約４．５のｐＨで実施する。さらに別の実施形態では、アシル化反応は、４．５〜４．８の間のｐＨで実施する。さらに別の実施形態では、ｐＨは、約４．６である。さらに別の実施形態では、ｐＨは、約４．７５である。ｐＨは、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、もしくはリン酸カリウム、またはこれらの組合せである緩衝液を使用して調整することができる。緩衝液の非限定的な例は、ＮａＯＡｃ、リン酸水素ナトリウムまたはリン酸二カリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４またはＫ_２ＨＰＯ_４）である。

Ｒ^１は、生体相互作用薬または分析用薬剤の場合がある。

別法として、Ｒ^１は、生体相互作用薬もしくは分析用薬剤への共有結合を促進する反応性基を含む部分である場合もある。

Ｒ１が、反応性基を含む部分であるとき、本発明の方法のステップｂ）は、以下のスキーム７によって表すことができる。

式中、Ｐ_Ｍ、Ｌ^１、およびｎは、上で規定しており、Ｍは、化学的部分であり、Ｒ_ｇは、反応性基である。Ｒ_ｇの例は、アシル、エステルまたは混合無水物、アルキン、テトラジン、マレイミド、イミデート、カルボキシである。

本発明の方法は、生体相互作用薬または分析用薬剤を、コンジュゲート７Ｂの反応性基Ｒ_ｇと反応させるステップをさらに含んでもよく、前記生体相互作用薬または生体分析用薬剤は、対応する官能基を介して、場合によりリンカーＬ２を介して反応させる。

このステップは、以下のスキーム８によって表すことができる。

式中、Ｐ_Ｍは、得られるタンパク質またはペプチドがＮ末端アミノ酸に隣接する位置にヒスチジンアミノ酸を含有するように、ステップａ）に従って修飾されている、標的タンパク質または標的ペプチドであり、
Ｌ^１およびＬ^２は、リンカーであり、
Ｒ_ｇは、反応性基であり、
Ｆ_ｇは、官能基であり、
Ｇは、Ｒ_ｇをＦ_ｇと反応させた結果として生成された得られる化学基であり、
Ｒ’１は、生体相互作用薬または分析用薬剤であり、
ｎおよびｔは、独立して、０または１である。

官能基（Ｆｇ）の例は、アミノ基、アジド基、アルケン基、チオール基、またはヒドラジン、ヒドロキシルアミン基である。

官能基（Ｆｇ）としては、１．マレイミド、トシルスルホン、ピリジン−２−イルジスルファニルなどの反応性基と反応させるためのチオール基；２．カルボン酸または活性化型カルボン酸（たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド化学によるアミド結合形成）、ホスホリル基、アシル基、混合無水物などの反応性基と反応させるためのアミノ基（たとえば、アミノ酸のアミノ官能基）；３．アルキン、より詳細にはシクロオクチン反応性基とのＨｕｉｓｇｅｎ付加環化（より一般的にはクリックケミストリーとして知られる）にかけるためのアジド；４．ヒドロキシルアミンまたはヒドラジンから選択される反応性基と反応させて、それぞれオキシムまたはヒドラジンを生成するためのカルボニル基；５．アザ［４＋２］付加においてテトラジン反応性基と反応させるためのアルケンが挙げられる。リンカーおよび官能基／反応性基のいくつかの例を本明細書で述べてはいるが、本発明は、リンカーまたはいずれの長さおよび組成を企図する。

一実施形態では、本発明は、Ｒ^１が、アジド官能基を含んでいる生体相互作用薬への共有結合を促進するアルキン反応性基を含んでいる部分である（すなわち、Ｒ_ｇは、アルキンまたはシクロアルキンまたはビシクロアルキンである）（すなわち、化合物８Ａにおいて、ｔは、０であり、Ｆ_ｇは、アジドである）、実施形態１８〜２１のいずれか１つに従う方法に関する。別法として、生体相互作用薬または分析用薬剤は、末端位にアジド官能基を含んでいるリンカーＬ^２に付着していてもよい（すなわち、化合物８Ａにおいて、ｔは、１であり、Ｆ_ｇは、アジドである）。アルキン反応性基を含んでいる部分は、市販品供給元から容易に入手可能である。特に重要なのは、シクロアルキン部分である。タンパク質標識のためのクリックケミストリーにおける環状アルキンの使用の例は、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／００６８７３８号明細書に記載されている。詳細な例は、上で実施形態２０に記載している。

この化学事象には、より一般的にはクリックケミストリーとして知られる、アジド−アルキンＨｕｉｓｇｅｎ付加環化が伴う。この特定の実施形態では、アジド−アルキン付加環化の結果として生成する、得られる化学基Ｇは、スキーム９に示されるとおり、トリアゾールである。

式中、すべての変数は、上述しており、Ｃ１は、フッ素で場合により置換されている単環式、二環式、または三環式の炭素環またはヘテロ環系である。一実施形態では、Ｌ^１は、アルキレン鎖がオキソ（＝Ｏ）で場合により置換されており、１個または複数の炭素がＯまたはＮＨで置き換えられている、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレンリンカーである。

別の実施形態では、本発明は、Ｒ１が、アルケン官能基（好ましくは、歪みアルケン）を含んでいる生体相互作用薬／分析用薬剤への共有結合を促進するためのテトラジン反応性基を含んでいる部分である（すなわち、化合物８Ａにおいて、ｓは、０であり、Ｆ_ｇは、アルケンまたはシクロアルケンである）、実施形態１８〜２１のいずれか１つに従う方法に関する。別法として、生体相互作用薬または分析用薬剤は、末端位にアルケン官能基を含んでいるリンカーＬ^２に付着していてもよい（すなわち、化合物８Ａにおいて、ｓは、１であり、Ｆ_ｇは、アルケンまたはシクロアルケンである）。テトラジン部分は、市販品供給元から容易に入手可能であり、非限定的な例は、実施形態１９に記載している。この化学事象は、アザ［４＋２］付加環化として知られている。この特定の実施形態では、テトラジン−アルケン付加環化の結果として生成する、得られる化学基Ｇは、式：

［式中、ｕは、０〜２の整数であり、ｖは、０〜３の整数である］
の多環式の基である。

スキーム１０に、テトラジン−アルケン付加環化を使用する、このさらなる誘導体化を示す。

式中、変数は、上で規定したとおりであり、Ｄは、歪みアルケン、すなわち、モノまたはビシクロアルケニル環系である。

別の実施形態では、本発明は、Ｒ１が、チオール官能基を含んでいる生体相互作用薬／分析用薬剤への共有結合を促進するためのマレイミド反応性基を含んでいる部分である（すなわち、化合物８Ａにおいて、ｓは、０であり、Ｆ_ｇは、−ＳＨである）、実施形態１８〜２１のいずれか１つに従う方法に関する。別法として、生体相互作用薬または分析用薬剤は、末端位にアルケン官能基を含んでいるリンカーＬ^２に付着していてもよい（すなわち、化合物８Ａにおいて、ｓは、１であり、Ｆ_ｇは、−ＳＨである）。マレイミドを含んでいる部分は、市販品供給元から容易に入手可能であり、非限定的な例は、実施形態１９に記載している。この特定の実施形態において、チオール−マレイミド反応の結果として生成する、得られる化学基Ｇは、式：

である。

スキーム１１に、このさらなるマレイミド−チオール誘導体化を示す。

上述の化学および試薬を使用して、構築物Ｆ_ｇ−（Ｌ^２）_ｔ−Ｒ’^１および／または活性化型のＨＯ−Ｃ（Ｏ）−（Ｌ^１）_ｎ−Ｒ^１および／または活性化型のＨＯ−Ｃ（Ｏ）−（Ｌ^１）_ｎ−Ｒ_ｇが生成される。各連結単位は、その末端に、適切な反応性基／官能基を有することができる。アルキン（シクロアルキン）、マレイミド、またはテトラジン反応性基を、反応性パートナー上に存在する官能基（それぞれ、アジド、チオール、およびアルケン）と反応させる。

本発明の方法の医学および診断への適用
このように、タンパク質／ペプチドの物理化学的性質を変化させる、たとえば、溶解性を増大（または低下）させて、治療用タンパク質の生物学的利用能が加減されるように、タンパク質を修飾することが望ましい場合がある。別の実施形態では、血漿タンパク質、たとえばアルブミンに結合する、またはタンパク質のサイズを大きくするタンパク質／ペプチドに化合物をコンジュゲートさせて、腎臓からの排泄を妨げまたは遅らせることにより、身体におけるクリアランス速度を加減することが望ましい場合もある。コンジュゲーションは、タンパク質／ペプチドの、加水分解、たとえば、ｉｎ ｖｉｖｏタンパク質分解に対する感受性を変化させる、特に低下させるものでもよい。

別の実施形態では、タンパク質／ペプチドの分析を容易にするために、標識をコンジュゲートさせることが望ましい場合もある。そのような標識の例としては、放射性同位体、すでに述べた蛍光体などの蛍光マーカー、および酵素基質が挙げられる。

さらに別の実施形態では、タンパク質の単離を容易にするために、化合物がタンパク質にコンジュゲートされる。たとえば、特定のカラム材料に特異的な親和性を有する化合物をタンパク質にコンジュゲートさせることができる。たとえば、タンパク質にある１つまたは複数の免疫原性エピトープが隠れ、マスキングされ、または弱まるようにタンパク質をコンジュゲートすることにより、タンパク質の免疫原性を加減することが望ましい場合もある。

一実施形態では、本発明は、標的タンパク質の薬理学的性質を改善する方法を提供する。改善は、対応する未修飾タンパク質に対してのものである。そのような薬理学的性質の例としては、いずれかの詳細なタンパク質の、機能ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、免疫原性、腎臓濾過、プロテアーゼ保護、およびアルブミン結合または他の血漿タンパク質結合が挙げられる。

修飾タンパク質の治療的使用
未修飾タンパク質／ペプチドが治療用タンパク質である限り、本発明はまた、修飾タンパク質の治療における使用、特に、修飾タンパク質を含む医薬組成物に関する。したがって、本明細書で使用するとき、用語「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」および「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療すること）」とは、疾患や障害などの状態の抑制に努める目的での患者の管理および手当を意味する。この用語は、患者が罹患している所与の状態についての全範囲の治療、たとえば、症状もしくは合併症を緩和する、疾患、障害、もしくは状態の進行を遅らせる、症状および合併症を緩和もしくは軽減する、および／または疾患、障害、もしくは状態を治癒させ、もしくは解消する、ならびに状態を予防するための活性化合物の投与を包含するものであり、予防とは、疾患、状態、または障害の抑制に努める目的での患者の管理および手当であると理解され、症状または合併症の発症を予防するための活性化合物の投与を包含する。治療を受ける患者は、哺乳動物、特にヒトであることが好ましいが、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタなどの動物も含めてよい。それでもなお、治療レジメンおよび予防（防止的）レジメンは、本明細書で開示され、治療を行う医師または獣医師が考える使用について、別個の側面を呈すると認識すべきである。

本明細書で使用する、修飾タンパク質の「治療有効量」とは、所与の疾患およびその合併症の臨床的発現を治癒させ、緩和し、または部分的に抑止するのに十分な量を意味する。これの実現にかなう量が「治療有効量」と定義される。各目的についての有効量は、たとえば、疾患または傷害の重症度、ならびに対象の体重、性別、年齢、および全般的状態に応じて決まる。適切な投与量の決定は、値の行列を構築し、行列の異なる点を試験することにより、型通りの実験を使用して実現することができ、これらがすべて、訓練された医師または獣医師の技量の範囲内であることは理解されよう。

本明細書で開示する方法および組成物により、治療において使用される修飾タンパク質が提供される。そのため、典型的な非経口用量は、投与１回あたり１０−９ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。典型的な投与服用量（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｄｏｓｅ）は、投与１回あたり約０．００００００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。正確な用量は、たとえば、投与の指示、医薬、頻度、および方式、治療を受ける対象の性別、年齢、および全般的状態、治療する疾患または状態の性質および重症度、所望の治療効果、ならびに当業者には明白である他の要素に応じて決まる。典型的な投与頻度は、１日２回、１日１回、１日おき（ｂｉ−ｄａｉｌｙ）、１週間に２回、１週間に１回であり、またはさらに長い投与間隔がとられる。活性化合物の半減期が、コンジュゲートされていない対応するタンパク質に比べて延長されているため、１週間に２回、１週間に１回などの長い投与間隔、またはさらに長い投与間隔の投与レジメンは、特定の実施形態である。多くの疾患は、治療の中で、同時に投与または順次投与される２種以上の医薬を使用して治療される。したがって、疾患の１種類を治療する治療方法における修飾タンパク質が、疾患の治療において普通に使用される１種または複数の他の治療用活性化合物と組み合わせて使用される場合があることが予期される。疾患の治療において普通に使用される他の治療用活性化合物と組み合わされた修飾タンパク質が、その疾患用の医薬の製造において使用されることも予期される。

医薬組成物
本発明のコンジュゲートは、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、吸入、鼻腔内、経口などを始めとする様々な手段のいずれかにおいて投与することができる。本発明の特に好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは塩の連続的な静脈内投与を用いる。本発明におけるコンジュゲートは、ボーラスとして、または一定期間にわたる連続注入として投与することができる。移植可能なポンプを使用してもよい。本発明のある特定の実施形態では、断続的または連続的なコンジュゲート投与を、１日〜数日間（たとえば、２〜３日間以上）またはより長期間、たとえば、数週間、数か月、もしくは数年間継続する。一部の実施形態では、断続的または連続的なコンジュゲート投与を少なくとも約３日間、好ましくは少なくとも約６日間施す。別の実施形態では、断続的または連続的なコンジュゲート投与を少なくとも約１週間施す。他の実施形態では、断続的または連続的なコンジュゲート投与を少なくとも約２週間施す。投与中または複数回の投与の合間に、特定の閾値を上回る平均血漿コンジュゲート濃度を維持することが望ましい場合もある。望ましい濃度は、たとえば、対象の生理的状態、疾患重症度などに基づき決定することができる。そのような望ましい値（複数可）は、標準の臨床試験を実施して割り出すことができる。代わりに、ペプチドおよびそのコンジュゲートは、ＦｃＲｎ機序によって、経口的に送達することができるはずである（Nat Rev Immunol. 7(9), 715-25, 2007、Nat Commun. 3;3:610, 2012、Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 304: G262-G270, 2013）。

別の態様では、本発明は、本発明のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは塩と、１種または複数の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、経口投与、皮下投与、非経口投与、直腸投与などの特定の投与経路用に製剤化することができる。加えて、本発明の医薬組成物は、固体形態（限定はせず、カプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒、凍結乾燥剤、粉末、または坐剤を含める）、または液体形態（限定はせず、溶液、懸濁液、または乳濁液を含める）に仕立てることができる。医薬組成物は、無菌製造、滅菌などの従来の製薬業務にかけることができ、かつ／または、従来の不活性希釈剤、膜形成剤、等張化剤、滑沢剤、または緩衝剤、ならびに保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液などの佐剤を含有してよい。

注射用途に適する医薬組成物は、通常、滅菌注射溶液または分散液を即座に調製するための、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液と滅菌粉末を含む。

静脈内の投与については、適切な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は、滅菌とすべきであり、容易な注射適用性（syringability）が存在する程度に流動的にすべきである。好ましい医薬製剤は、製造および貯蔵の条件下で安定しており、細菌や真菌などの微生物による汚染作用に対抗して保存しなければならない。一般に、妥当な担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒でよい。適正な流動度は、たとえば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合では必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物による作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現することができる。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖、マンニトールなどのポリアルコール、アミノ酸、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅らせる薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンを組成物に含めることにより実現できる。一部の実施形態では、コンジュゲート生成物の分解に対する安定化を促進し、投与および活性化合物の放出を支援するために、組換えアルブミンなどの多機能賦形剤を製剤工程に織り込んでもよい（BioPharm International, 2012, Vol 23, Issue 3, pp 40-44）。

ある特定の注射用組成物は、水性の等張性溶液または懸濁液であり、坐剤は、脂肪質の乳濁液または懸濁液から調製することが有利である。前記組成物は、滅菌され、かつ／または保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、溶解促進剤（solution promoter）、浸透圧調節用の塩、および／または緩衝液などの佐剤を含有するものでよい。加えて、前記組成物は、治療上価値のある他の物質も含有してよい。前記組成物は、従来の混合、造粒、またはコーティング法に従って調製され、それぞれ、約０．１〜７５％、または約１〜５０％の活性成分を含有する。

滅菌注射溶液は、必要に応じて、上で列挙した成分の１つまたは組合せを含有する適切な溶媒に、必要な量の活性化合物を混ぜた後、濾過滅菌することにより調製できる。分散液は、一般に、基礎の分散媒、および上で列挙したものからの他の必要な成分を含有する滅菌ビヒクルに、活性化合物を混ぜることにより調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であるが、この方法では、活性成分の粉末と、所望の任意の追加成分が、予め滅菌濾過されたその溶液から得られる。

経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または可食担体を含む。治療的経口投与の目的では、活性化合物は、賦形剤と混ぜ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、たとえばゼラチンカプセル剤の形で使用することができる。経口組成物は、含嗽液として使用するために流動性担体を使用して調製することもできる。薬学的に適合する結合剤、および／または佐剤材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、次の成分、すなわち、微結晶性セルロース、トラガカントゴム、ゼラチンなどの結合剤、デンプンやラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、コーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムやＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑沢剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースやサッカリンなどの甘味剤、またはハッカ、サリチル酸メチル、オレンジ香料などの着香剤のいずれか、または同様の性質の化合物を含有してよい。経口送達用の製剤は、消化管内での安定性を向上させ、かつ／または吸収を強化するための薬剤が組み込まれていると有利な場合もある。

吸入による投与について、発明治療薬は、適切な噴射剤、たとえば、二酸化炭素などの気体を含有する加圧容器もしくは計量分配装置、またはネブライザーから、エアロゾルスプレーの形で送達することが好ましい。治療薬の全身送達のために、肺が広い表面積を備えていることは注目される。

薬剤は、たとえば、米国特許出願公開第２００４／００９６４０３号明細書に記載のものなどのポリマー系微小粒子に、または当業界で知られている他の広範な薬物送達ビヒクルのいずれかと共同して、カプセル封入することができる。本発明の他の実施形態では、たとえば、米国特許出願公開第２００４／００６２７１８号明細書に記載されているように、薬剤を荷電脂質と共同して送達する。後者の系は、治療用ポリペプチドであるインスリンの投与に使用されており、ペプチド剤の投与についてこの系の実益を示していることが注目される。

全身投与は、経粘膜的または経皮的手段によるものでもよい。

経皮的適用に適する組成物は、有効量の本発明のコンジュゲートを適切な担体と共に含む。経皮送達に適する担体として、ホストの皮膚を介した透過を手助けする薬理学的に許容される被吸収性溶媒が挙げられる。経皮的デバイスは、たとえば、裏部材と、化合物を場合により担体と共に含有するレザバーと、場合により、ホストの皮膚の化合物を、長期間にわたって、制御され、予め決められた速度で送達するための速度制御バリアと、デバイスを皮膚に固定するための手段とを備えた絆創膏の形態である。

たとえば皮膚および眼への局所適用に適する組成物には、水溶液、懸濁液、軟膏、クリーム、ゲル、または、たとえばエアロゾルなどによる送達のためのスプレー製剤が含まれる。このような局所送達系は、特に、皮膚への適用に相応しくなる。すなわち、こうした局所送達系は、当業界でよく知られている美容製剤を含めた局所的使用に特に適する。このような組成物は、可溶化剤、安定剤、張性増強剤（tonicity enhancing agent）、緩衝剤、および保存剤を含有してもよい。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、皮下投与用である。ポリペプチド治療薬（たとえば、抗体、融合タンパク質など）の皮下投与に適する製剤成分および方法は、当業界で知られている。たとえば、米国特許出願公開第２０１１／００４４９７７号明細書、米国特許第８，４６５，７３９号明細書、および米国特許第８，４７６，２３９号明細書を参照されたい。通常、皮下投与用の医薬組成物は、適切な安定剤（たとえば、メチオニンなどのアミノ酸、およびまたはスクロースなどの糖）、緩衝剤、および等張化剤（tonicifying agent）を含有する。

本明細書で使用するとき、局所適用は、吸入または鼻腔内適用にも関連することがある。こうした適用は、乾燥粉末吸入器から乾燥粉末（単独、混合物、たとえばラクトースとの乾燥ブレンドとして、またはたとえばリン脂質との混合型要素粒子としてのいずれか）の形で、または加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、もしくはネブライザーからエアロゾルスプレー体裁の形で、適切な噴射剤を使用しまたは使用せずに、好都合に送達することができる。

本発明はさらに、活性成分としての本発明の化合物が分解する速度を減速する１種または複数の薬剤を含む医薬組成物および剤形を提供する。本明細書では「安定剤」と呼ぶ、そのような薬剤として、限定はしないが、アスコルビン酸などの酸化防止剤、ｐＨ緩衝液、または塩緩衝液、組換えアルブミンが挙げられる。

本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容される塩」とは、本発明のコンジュゲートの生物学的有効性および特性を保持し、通常は生物学的または別な意味で望ましい塩を指す。多くの場合、本発明のコンジュゲートは、アミノ基および／もしくはカルボキシル基またはそれと同様の基が存在するおかげで、酸および／または塩基の塩を形成することができる。

薬学的に許容される酸付加塩、たとえば、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、臭化物／臭化水素酸塩、炭酸水素塩／炭酸塩、硫酸水素塩／硫酸塩、カンファースルホン酸塩、塩化物／塩酸塩、クロルテオフィリン酸塩（chlortheophyllonate）、クエン酸塩、エタンジスルホン酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、馬尿酸塩、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフトエ酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オクタデカン酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素塩／リン酸二水素塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、スルホサリチル酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、およびトリフルオロ酢酸塩は、無機酸および有機酸に対して生成することができる。

塩を導くことのできる無機酸としては、たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。
塩を導くことのできる有機酸としては、たとえば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルホサリチル酸などが挙げられる。薬学的に許容される塩基付加塩は、無機塩基および有機塩基に対して生成することができる。

塩を導くことのできる無機塩基としては、たとえば、アンモニウム塩、および周期表のＩ〜ＸＩＩ列の金属が挙げられる。ある特定の実施形態では、塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、銀、亜鉛、および銅から導かれ、特に適切な塩として、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、およびマグネシウム塩が挙げられる。

塩を導くことのできる有機塩基としては、たとえば、第一級、第二級、および第三級アミン、自然に存在する置換アミンを始めとする置換アミン、環状アミン、塩基性イオン交換樹脂などが挙げられる。ある特定の有機アミンとして、イソプロピルアミン、ベンザチン、コリネート（cholinate）、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、リシン、メグルミン、ピペラジン、およびトロメタミンが挙げられる。

本発明の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって、親化合物、塩基性または酸性部分から合成することができる。一般に、そのような塩は、遊離酸形態のこうした化合物を化学量論量の相応しい塩基（Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ、またはＫの水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩など）と反応させる、または遊離塩基形態のこうした化合物を化学量論量の相応しい酸と反応させることにより調製できる。こうした反応は通常、水もしくは有機溶媒中または二者の混合物中で実施される。一般に、実用可能な場合、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒質の使用が望ましい。追加の適切な塩の一覧は、たとえば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985)ならびにStahlおよびWermuthによる“Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use” (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)で見ることができる。

本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容される担体」は、当業者に知られているであろうが、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（たとえば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、着香剤、色素、組換えアルブミンなどの多機能賦形剤など、およびこれらの組合せを包含する（たとえば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照されたい）。従来のいかなる担体も、活性成分と相容れない範囲にあるものを除き、治療組成物または医薬組成物におけるその使用を企図する。

本発明の実施例（Example of the invention）
実験方法
略語
ＡＣＮ アセトニトリル
ＢＯＣ ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＩＥＡ ジイソプロピルエチルアミン
ＤＩＰＥＡ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＴＴ ジチオトレイトール
Ｆｍｏｃ フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド
ＨＡＴＵ １−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム−３−オキシドヘキサフルオロホスフェート
ＨＣＴＵ ２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルホロホスフェート
ＨＯＢｔ ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＣＬ 高速液体クロマトグラフィー
ＨＰＦ６ ヘキサフルオロリン酸
ＬＣ 液体クロマトグラフィー
ＭＡＬＤＩ マトリックス支援レーザー脱離イオン化法
ＭＳ 質量分析
ＮＨＳ Ｎ−ヒドロスクシンイミド
ＮＭＰ Ｎ−メチルピロリドン
ＮＭＲ 核磁気共鳴
ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ＰＳ ペプチド合成
ＰＧ 保護基
ＲＰ−ＨＰＬＣ 逆相ＨＰＬＣ
ＳＭ 出発材料
ＳＣＦ 超臨界流体
ＳＰＰＳ 固相ペプチド合成
ＴＩＣ 全イオン電流（total in current）
ＴＩＰＳ トリイソプロピルシラン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
Ｔｒｔ トリチル
ＵＰＬＣ 超高速液体クロマトグラフィー

ＵＰＬＣ ＨＲＭＳ方法Ｆ：
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ３００ Ｃ４ １．７μｍ、２．１×５０ｍｍ
溶離液Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）
溶離液Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）
流れ：０．５ｍＬ／分
温度：４０℃
勾配：２０％で０．５分保持、１０分で８０％ＡＣＮまでの勾配

一般的なペプチド合成（本発明の方法のステップａ：得られるペプチドが、Ｎ末端アミノ酸に隣接する位置でヒスチジンを含有するようにペプチドを修飾するステップ）
ペプチドは、標準の固相Ｆｍｏｃ化学によって合成した。ペプチドは、Ｌｉｂｅｒｔｙマイクロ波ペプチド合成装置（ＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国ノースカロライナ州）において組み立てた。Ｃ末端上に非置換カルボキサミドを有するペプチドは、Ｆｍｏｃ保護されたＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−ＡＭ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、米国）から合成した。
合成サイクル：樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。２０％ピペリジン／ＤＭＦでの処理（通常は、０．１ｍｍｏｌあたり７ｍｌ ２回）によって、Ｆｍｏｃを除去した。樹脂をＤＭＦで洗浄した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸（５当量、０．２Ｍ ＤＭＦ溶液）、ＨＣＴＵ（５当量、０．５Ｍ ＤＭＦ溶液）、およびＤＩＰＥＡ（１０当量、２Ｍ ＮＭＰ溶液）を加えた後、懸濁液を、窒素中にて、特定の要件に応じて、マイクロ波電力を０〜２０ワットとして、通常は５〜５０分間、７５℃で混合することにより、カップリングを行った。ＤＭＦで洗浄した後、カップリングステップを、特定の要件に応じて１回繰り返すとよい。樹脂をＤＭＦで洗浄した。

ペプチドは、分取逆相ＨＰＬＣによって精製した。次のカラムを使用した：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ３０×５０ｍｍ ５ｕｍカラム。移動相は、溶離液Ａ（５ｍＭのＮＨ４ＯＨ Ｈ２Ｏ水溶液）と溶離液Ｂ（ＡＣＮ）からなるものとした。勾配は、分離の問題の特定の要件に基づき設計した。純粋な生成物をＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥した。

以下では、代表的な実施例の合成について記載する。
ペプチド１：ＡＨＮＧＤＬＫＦ−ＮＨ２
ＡＨＮＧＤＬＫＦ−ＮＨ２の合成

Ａ−Ｈ（Ｔｒｔ）−Ｎ（Ｔｒｔ）−Ｇ−Ｄ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｌ−Ｋ（Ｂｏｃ）−Ｆ−ＮＨ−ＰＳの調製
Ｆｍｏｃ保護されたＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−ＡＭ樹脂（３１６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を、Ｌｉｂｅｒｔｙマイクロ波ペプチド合成装置での固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）にかけた。

カップリングを以下のとおりに実施した：

ペプチド１の調製
（保護基の除去を伴う樹脂からの切断、次いで精製）
中間体（０．２５ｍｍｏｌ）に、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）の混合物（３ｍＬ、０．２ｇのＤＴＴを含有する）を加え、懸濁液を室温で３時間振盪した。切断溶液を濾別し、樹脂を９５％ＴＦＡ（１ｍＬ）水溶液で洗浄した。合わせた切断および洗浄溶液を冷ジエチルエーテル（３０ｍＬ）上へ注いで、沈殿を得た。懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。残渣にジエチルエーテル（３０ｍＬ）を加え、懸濁液を３分間ボルテックスし、遠心分離し、上清を廃棄した。洗浄過程を２回繰り返した。固体を真空中で乾燥させた。粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し（勾配：３．２分かけて５〜２０％のＢ）、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、実施例１（４９ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ３．５μｍ、３．０×３０ｍｍ、４０℃、溶離液Ａ：水＋５ｍＭのＮＨ４ＯＨ、溶離液Ｂ：ＡＣＮ、勾配 ２分かけて５％〜９５％のＢ／Ａ）：保持時間：０．７０分；測定値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝９００．８；計算値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝９０１．０）。

ペプチド２および３は、似たようにして合成した。
ペプチド２．ＡＬＮＧＤＬＫＦ−ＮＨ２
ＬＣＭＳ保持時間：０．８１分；測定値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝８７６．８；計算値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝８７７．０）。
ペプチド３．ＭＨＮＧＤＨＬＦ−ＮＨ２
ＬＣＭＳ保持時間：０．６８分；測定値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝９６９．８；計算値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝９７０．１）。

一般的なＮＨＳ反応性アッセイ：（本発明のステップｂ）
スルホ−ＮＨＳ−ＬＣビオチン（５当量）をｐＨ４の３０ｍＭ ＮａＯＡｃ緩衝液中のペプチド（０．２ｍｇ／ｍｌ）に加え、反応液を室温で静置する。１時間後、反応液を２００当量のヒドラジン水和物で失活させ、変換をＬＣＭＳによってモニターし、ＭＡＬＤＩまたはＮＭＲによってマッピングする。化合物の比率を、２１４ｎｍでのＵＶ吸収に基づいて推定した。

ＳＭ＝出発材料
＋１＝Ｎ末端における反応性
＋１’＝リシンでの反応性
＋２＝Ｎ末端およびリシンの両方での反応性
配列 ＬＣ−ＭＳによる結果（ＳＭ：＋１：＋１’：＋２） ^＊

ＡＨＮＧＤＬＫＬ ０：９：１：０
ＡＬＮＧＤＬＫＦ ７：１：０：０
ＭＨＮＧＤＨＬＦ ０：１０：ｎ／ａ：０

アシル化剤としてＡＨＮＧＤＬＫＦ−ＮＨ２およびスルホ−ＮＨＳ−ＬＣビオチンを使用する本発明のステップｂ
ＬＣＭＳ生成物保持時間：１．８１分；測定値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝１２３９．６３；計算値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝１２３９．６２００）。
マッピングデータ（ＭＡＬＤＩ ＬＩＦＴ法を使用する）：ビオチン＋アラニン：測定値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝約４１１；計算値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４１１．２１）。ビオチン＋ＡＨ：測定値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝５４８．２７；計算値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝５４８．２７）。アラニン単独の質量は検出されなかった。

アシル化剤としてＡＬＮＧＤＬＫＦ−ＮＨ２およびスルホ−ＮＨＳ−ＬＣビオチンを使用する本発明のステップｂ
ＬＣＭＳ生成物保持時間：１．２９分；測定値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝８７６．５０；計算値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝８７７．０）。ほんのわずかの添加（ほとんどが出発材料）

アシル化剤としてＭＨＮＧＤＨＬＦ−ＮＨ２およびスルホ−ＮＨＳ−ＬＣビオチンを使用する本発明のステップｂ
ＬＣＭＳ生成物保持時間：２．０５分；測定値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝１３０８．５９７２；計算値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝１３０８．５９）。
マッピングデータ（ＭＡＬＤＩ ＬＩＦＴ法を使用する）：マッピングデータ（ＭＡＬＤＩ ＬＩＦＴ法を使用する）：ビオチン＋メチオニン：測定値：［Ｍ−Ｈ］＝４７０．６４；計算値：［Ｍ−Ｈ］＝４７０．６６）。メチオニン単独の質量は検出されなかった。

スルホ−ＮＨＳ−ＬＣビオチンのＡＰＪアゴニストペプチドへの部位特異的コンジュゲーション（中間体ｃ）：
ステップ１：Ａ−Ｈ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｃ−Ｌ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｄ−Ｎｌｅ）−フェネチルアミン中間体ａの合成

フェネチルアミン−ＡＭＥＢＡ樹脂（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、０．１ｍｍｏｌ、１．０ｍｍｏｌ／ｇ）を自動ペプチド合成装置（ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ）で、Ａｒｇ残基に対して２倍の標準ＡｒｇとＤ−Ｎｌｅを用い、２倍の時間でカップリングさせることにより固相ペプチド合成にかけた。アミノ酸は、０．２ＭのＤＭＦ中溶液として調製した。標準のカップリングサイクルは、次のとおりに定めた。
− アミノ酸カップリング：ＡＡ（５当量）、ＨＡＴＵ（５当量）、ＤＩＥＡ（２５当量）
− 洗浄：ＤＭＦ（３×７ｍＬ）
− Ｆｍｏｃ脱保護：２０％ピペリジン／０．１Ｍ ＨＯＢｔ（２×７ｍＬ）
− 洗浄：ＤＭＦ（４×７ｍＬ、次いで１×５ｍＬ）

ペプチドを組み立てた後、樹脂をＤＭＦ（２×５０ｍＬ）およびＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で洗浄し、次いで真空中で乾燥させて、中間体ａ（２７６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を得た。

ステップ２：中間体ｂの調製（樹脂からのペプチドの切断）

中間体ａ（２７６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を４ｍＬのＴＦＡ溶液（３７ｍＬのＴＦＡ、１ｍＬの水、１ｍＬのＴＩＰＳ、３．０６ｇのＤＴＴ）と合わせて、室温で３時間振盪した。溶液を樹脂から除去し、４０ｍＬの冷Ｅｔ_２Ｏ中に沈殿させた。溶液をボルテックスし、氷上に１０分間静置した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。溶媒を除去し、白色固体を冷Ｅｔ_２Ｏ（各回４０ｍＬ）でさらに２回洗浄し、遠心分離し（各回５分）、デカントした。固体を真空中で終夜乾燥させ、中間体ｂ−バッチ１（１７．４ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ（ＳＱ２ 生成物分析−酸性−ペプチド−極性、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、５０℃）：Ｒ_ｔ＝１．８３分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］１５１３．５。

ステップ３：中間体ｃの調製（システイン残基の環化）

中間体ｂ−バッチ１および２（２９．６ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）を水（３ｍＬ）および１０滴のＤＭＳＯに溶解させて、わずかに濁った溶液を得た。ヨウ素（ＨＯＡｃ中５０ｍＭ、０．７８３ｍＬ、０．０３９ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下添加し、反応液を室温で終夜混合した。粗製反応液のＬＣＭＳ分析により、出発材料の完全な変換が示された。色が消失するまで、０．５Ｍのアスコルビン酸を滴下添加した。材料を、ＭＳ起動式ＨＰＬＣによって精製した。プールした画分の凍結乾燥により、７ｍｇの所望の生成物を白色粉末（４．６３μｍｏｌ、２４％）として得た。ＬＣＭＳ（ＳＱ２ 生成物分析−酸性−ペプチド、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、５０℃）：Ｒ_ｔ＝０．９０分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］１５１１．８。

ステップ４：中間体ｄの調製（ＮＨＳ／ペプチドの反応性）

スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、０．７３７ｍｇ、１．３２４μｍｏｌ、５当量）を３０ｍＭのｐＨ４ ＮａＯＡｃ緩衝液（２６６μＬ）に溶解させ、中間体ｃ（０．４ｍｇ、０．２６５ｍｍｏｌ）に加えた。反応液を、室温で１６時間混合した。３３μｌの反応混合物を除去し、ヒドラジン一水和物（０．６μＬ、２００当量）で失活させた。出発材料の＋１生成物への完全な変換が、ＬＣＭＳによって観察された。Ｎ末端のＡｌａ残基での標識は、製造業者のプロトコールに従って反応混合物をＴｒｙｐｓｉｎ Ｇｏｌｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化することおよびＬＣＭＳ分析によって確認された。ＬＣＭＳ（ＳＱ２ 生成物分析−酸性−ペプチド、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、５０℃）：Ｒ_ｔ＝２．２９分、ＭＳ［Ｍ＋２／２］９２５．８。

ステップ５：中間体ｄのＴｒｙｐｓｉｎ Ｇｏｌｄでの消化（Ｎ末端標識）

Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｇｏｌｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ パート番号ＴＢ３０９）の溶液を、５０ｍＭ酢酸（１μｇ／μＬ）中で調製した。中間体ｄ（１００μＬ、０．０８１μｍｏｌ）の粗製の混合物を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ_２ ｐＨ７．４（２００μｌ）で希釈して、０．５ｍｇ／ｍＬの溶液を得た。Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｇｏｌｄ（３μＬ）を加え、反応液を３７℃で１６時間混合した。ＬＣＭＳ分析により、各断片にビオチンを１回加えると、中間体ｄのＣ末端のＲおよびＫ位で切断が起こったことが示された。ＬＣＭＳ（ＳＱ４ 生成物分析−２０分−酸性−ＸＸ極性、Ａｃｑｕｉｔｙ ＣＳＨ １．７μｍ ２．１×１００ｍｍ、５０℃）：断片１：ＡＨＱＲ＋１ ビオチン Ｒ_ｔ＝５．９２分、ＭＳ［Ｍ＋２／２］計算値：４２５．７１５、実測値：４２６．１；断片２：ＡＨＱＲＰＣＬＳＣＫ＋１ ビオチン Ｒ_ｔ＝１１．４０分、ＭＳ［Ｍ＋２／２］計算値：７４０．３４５、実測値：７４０．９、ＭＳ［Ｍ＋３／３］計算値：４９３．８９６、実測値：４９４．４。

治療用タンパク質の例（ＧＤＦ１５）：本発明の方法のステップａ）：得られるペプチドが、Ｎ末端アミノ酸に隣接する位置でヒスチジンを含有するようにペプチドを修飾するステップ
大腸菌（E.coli）細胞中でのヒトＧＤＦ−１５タンパク質の発現
大腸菌（E.coli）株ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、それぞれ配列番号１〜７の構築物および構築物ＭＡＨＡ−（２００−３０８）−ｈＧＤＦ１５で形質転換し、ｐＥＴ２６ｂベクターにクローニングした。形質転換した細胞を、ＯＤ６００が１．５に到達するまで、最初は３ｍｌ、次いで５０ｍｌのＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５／Ｌ、グルコース６ｇ／Ｌ）中で抗生物質選択下で増殖させた。予備培養物を使用して、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（ＮＨ４ＳＯ４ １．２ｇ／Ｌ、Ｈ２ＰＯ４ ０．０４１ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０５２ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １２ｇ／Ｌ、酵母エキス ２４ｇ／Ｌ）で満たした２つの１Ｌ発酵槽に接種した。ｐＨが７．１を超えて上昇したときに、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の自動添加によって、培養物を誘導した。他の発酵パラメータは以下であった：温度＝３７℃；２ＮのＮａＯＨ／Ｈ２ＳＯ４の添加によってｐＨ７．０＋／−０．２に調整された；撹拌機の速度のカスケードでｐＯ２＞３０％、空気流および酸素添加。誘導の５時間後、培養物を１０℃に冷却し、細胞を遠心分離によって回収した。

ＧＤＦ１５変異体の精製およびリフォールディング
ａ）封入体
目的のタンパク質を発現する組換え大腸菌（E.coli）のペレットを、５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４／１５０ｍＭのＮａＣｌ／５ｍＭのベンズアミジンＨＣｌ／５ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０、４℃に再懸濁させ（５％ｗ／ｖ）、ホモジナイズし、Ｆｒｅｎｃｈプレス（８００および８０バール）を２回通して溶解させた。封入体（ＩＢ）を、４℃にて１２，０００ｒｐｍ（12’000 rpm）で６０分間遠心分離することによって単離した。

ｂ）フォールディングされていない粗製タンパク質の精製
ＩＢを、６Ｍのグアニジン／１００ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４／１０ｍＭのＴｒｉｓ／２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール ｐＨ８．０中に可溶化し（５％ｗ／ｖ）、室温で２時間撹拌した。デブリを１２，０００ｒｐｍでの遠心分離によって除去した。可溶化したＩＢをＮｉ−ＮＴＡ−Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗでさらに精製した（Ｈｉｓタグを有さない構築物は、高いヒスチジン含有量によりこの樹脂に同様に結合する）。６Ｍのグアニジン／１００ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４／１０ｍＭのＴｒｉｓ／５ｍＭのβ−メルカプトエタノール ｐＨ８．０でのベースライン洗浄後、結合した材料を、ｐＨ４．５に調整した同じ緩衝液で溶出させた。溶出液をｐＨ８．０に調整し、１００ｍＭのＤＴＴを加え、溶液を４℃で終夜撹拌した。次いで、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、水中１０％の保存溶液）の添加によって、ｐＨを２に調整し、水中０．１％のＴＦＡで、溶液を１：１にさらに希釈した。粗製のタンパク質溶液を、５０分で０〜５０％のアセトニトリルの勾配を使用して、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｐｏｒｏｓ）によりさらに精製した。画分を含有するＧＤＦ−１５を、プールし、凍結乾燥させた。

ｃ）タンパク質のフォールディング
方法１：凍結乾燥した材料を１００ｍＭの酢酸中に２ｍｇ／ｍｌで溶解させ、フォールディング緩衝液（１００ｍＭのＣＨＥＳ／１ＭのＮａＣｌ／３０ｍＭのＣＨＡＰＳ／５ｍＭのＧＳＨ／０．５ｍＭのＧＳＳＧ／２０％のＤＭＳＯ、ｐＨ９．５、４℃）中で１５〜２０倍に希釈し、溶液を４℃で３日間穏やかに撹拌した。３日後に、３体積の１００ｍＭ 酢酸を加え、溶液を限外濾過（５ｋＤａカットオフ）によって約１００〜２００ｍｌまで濃縮し、１００ｍＭの酢酸で１０倍に希釈し、再濃縮した。リフォールディングされた材料を、５０℃で作動する、Ｖｙｄａｃ Ｃ４カラムでの分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（緩衝液Ａ：水中０．１％のＴＦＡ、緩衝液Ｂ：アセトニトリル中０．０５％のＴＦＡ）によってさらに精製した。ローディング後、カラムを１５％の緩衝液Ｂで洗浄し、５０分で１５％のＢ〜６５％のＢの勾配で溶出した。目的のタンパク質を含有する集めた画分を、等体積の緩衝液Ａで希釈し、凍結乾燥した。リフォールディング収率は、両方のタンパク質に対して約２５％であった。

方法２：フォールディング緩衝液：１００ｍＭのＣＨＥＳ、ｐＨ９．４、０．９Ｍのアルギニン、０．５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２．５ｍＭのＧＳＨ、１ｍＭのＧＳＳＧ（最終濃度）を用いた方法１に従うプロトコール。

以下のＧＤＦ−１５変異体を、上記手順に従って調製した。

Ｍ−（Ｈｉｓ）_６−ｈＧＤＦ１５

ＬＣＭＳ：計算質量値：２６４６２ 実測質量値：２６４６４

ＭＨ−（１９９−３０８）−ｈＧＤＦ１５

ＬＣＭＳ：計算質量値：２４６３６ 実測質量値：２４６３８

Ｍ−（Ｈｉｓ）_６−Ｍ−ｈＧＤＦ１５

ＬＣＭＳ：計算質量値：２６７２４ 実測質量値：２６７２５

Ｍ−（Ｈｉｓ）_６−ｃｙｎｏＧＤＦ１５

ＬＣＭＳ：計算質量値（二量体）：２６６６４ 実測質量値：２６６６５

Ｈｉｓ−ｄＧＤＦ１５：

ＬＣＭＳ：計算質量値（二量体）：２６３６８ 実測質量値：２６３６３

ＡＨ−（１９９−３０８）−ｈＧＤＦ１５

ステップ１：構築物Ｍ−Ｈｉｓ_６−ＴＥＶ（ＥＮＬＹＦＱ／Ａ）−Ｈ−ｈｓＧＤＦ１５ ａａ１９９−３０８の調製
構築物Ｍ−Ｈｉｓ６−ＴＥＶ（ＥＮＬＹＦＱ／Ａ）−Ｈ−ｈｓＧＤＦ１５ ａａ１９９−３０８は、上記手順（ステップａ、ｂおよびｃ）に従って調製した。
ステップ２：ステップ１からのタンパク質のＴＥＶ切断
凍結乾燥したタンパク質を水中に可溶化させて、最終濃度１．７５ｍｇ／ｍｌとした。タンパク質を、６ＭのＧｕａｎ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０＋５０ｍＭのＤＴＴ中で１：１に希釈することによって再度アンフォールディングさせ、室温で１時間撹拌した。材料を、Ｖｙｄａｃ Ｃ４カラムでの分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって再精製し、凍結乾燥した。２６ｍｇの凍結乾燥物を、２６ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／３Ｍ ＵＲＥＡ、ｐＨ７，５＋３０００ユニットのＡｃＴＥＶプロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２５７５−０２３）中に可溶化させ、４日間インキュベートした。次いで、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、水中１０％の保存溶液）の添加によって、ｐＨをｐＨ２．０に調整し、溶液を、水中０．１％のＴＦＡで１５０ｍｌまでさらに希釈した。０．２２ｕｍの膜を介した濾過の後、材料を、Ｖｙｄａｃ Ｃ４カラムでの分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって再度精製して、上手く切断されたタンパク質を単離した。画分を手動で集め、標的タンパク質を含有する画分を単離し、凍結乾燥した。次いで、切断されたＧＤＦ１５タンパク質をリフォールディングさせ、リフォールディングしたタンパク質を上述のように精製した。
ＬＣＭＳ：計算質量値（二量体）：２４５１６ 実測質量値：２４５１８

以下のＧＤＦ１５変異体を、上記手順に従って調製した。

ＭＨＡ−（２００−３０８）−ｈＧＤＦ１５

ＬＣＭＳ：計算質量値（二量体）：２４７５２

以下のＧＤＦ１５変異体を、上記手順に従って調製した。

ＡＨＡ−（２００−３０８）−ｈＧＤＦ１５

ＬＣＭＳ：計算質量値（二量体）：２４４３０；実測質量値（二量体）：２４４３２

脂肪酸アシル化剤を用いたＭＨ−（１９９−３０８）ＧＤＦ１５の部位特異的コンジュゲーション
ステップ１：脂肪酸−リンカーアシル化剤の調製
ステップ１ａ：１−ベンジル３−ｔｅｒｔ−ブチル２ウンデシルマロネート

０℃で、Ｎ_２中にて、ＤＭＦ（８ｍＬ）中ＮａＨ（１６０ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＤＭＦ（２ｍＬ）中ベンジルｔｅｒｔ−ブチルマロネート（１．０ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５０分間撹拌し、その後、ＤＭＦ（２ｍＬ）中１−ブロモウンデカンを加えた。さらに１時間撹拌した後、反応液を室温に温めた。反応液を終夜維持した。Ｅｔ_２Ｏ（１００ｍＬ）および水（２０ｍＬ）を反応液に分配して加えた。水性相をＥｔ_２Ｏ（１００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュカラム（Ｃ１８ １２ｇ、４０〜１００％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、表題化合物を無色の油状物（１．１４ｇ、２．８２ｍｍｏｌ、７１％）として得た：ＬＣＭＳ方法Ａ Ｒｔ＝１．５８分、

ステップ１ｂ：１，１１−ジベンジル１１−ｔｅｒｔ−ブチルドコサン−１，１１，１１−トリカルボキシレート

ＤＭＦ（１ｍＬ）中Ｉ−１（６５０ｍｇ、１．６１ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃で、Ｎ_２中にて、ＤＭＦ（６ｍＬ）中ＮａＨ（７０．７ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ）の懸濁液にゆっくりと加えた。混合物を４０分間撹拌し、その後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中ベンジル１１−ブロモウンデカノエート（５７１ｍｇ、１．６１ｍｍｏｌ）を加えた。添加の際に、反応液を室温に温め、終夜撹拌した。反応液をＥｔ_２Ｏ（１００ｍＬ）で希釈し、水（２０ｍＬ）で抽出した。水性相をＥｔ_２Ｏ（１００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶媒を蒸発させた。残渣をフラッシュカラム（シリカ ８０ｇ、０〜１０％のＥｔＯＡｃ／ＨＥＰ）によって精製して、Ｉ−２を無色の油状物（８２３ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ、７５％）として得た：

ステップ１ｃ：１３−（ベンジルオキシ）−２−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−１３−オキソ−２−ウンデシルトリデカン酸

ＤＣＭ（３ｍＬ）中中間体Ｉ−２（２００ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．６ｍＬ）を加え、反応液を室温で３時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュカラム（シリカ １２ｇ、０〜１５％のＥｔＯＡｃ／ＨＥＰ）によって精製して、表題化合物（１７７ｍｇ、０．２８４ｍｍｏｌ、９６％）を得た：

ステップ１ｄ：１，１１−ジベンジル１１−（２，５−ジオキソシクロペンチル）ドコサン−１，１１，１１−トリカルボキシレート

ＤＣＭ（１ｍＬ）中ＤＣＣ（５８．６ｍｇ、０．２８４ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｎ_２中にて、ＤＣＭ（２ｍＬ）およびＴＨＦ（０．３ｍＬ）中Ｉ−３（１７７ｍｇ，０．２８４ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３２．７ｍｇ、０．２８４ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応液を室温で４時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュカラム（シリカ １２ｇ、０〜３５％のＥｔＯＡｃ／ＨＥＰ）によって精製して、Ｉ−４を無色の油状物（１５３ｍｇ、０．２１３ｍｍｏｌ、７５％）として得た：

ステップ１ｅ：脂肪酸−リンカー構築物（中間体５）

ＴＨＦ（１．５ｍＬ）およびＤＣＭ（１．５ｍＬ）中中間体Ｉ−４（１４５ｍｇ、０．２０１ｍｍｏｌ）の溶液を、アミノ−ＰＥＧ２４−酸を入れたバイアルに加えた。ＤＩＰＥＡ（８８μＬ、０．５０４ｍｍｏｌ）を加え、反応液をシェーカープレート上で１５時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を超臨界流体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ ＨＩＬＩＣ ２０×１５０ｍｍ、１５〜２５％のＭｅＯＨ／ＣＯ２）によって精製して、中間体Ｉ−５（１５１ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ、４３％）を得た：ＬＣＭＳ方法Ｃ Ｒｔ＝１．３０分、

ステップ１ｆ：中間体６

ＤＣＭ（０．２６５ｍＬ）中ＤＣＣ（２２ｍｇ、０．１０３ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１．５ｍＬ）中中間体Ｉ−５（１５０ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドの溶液に加えた。反応液を１．５時間撹拌した。さらなるＴＨＦ（０．５ｍＬ）中Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１０ｍｇ）およびＤＣＭ（０．２６５ｍＬ）中ＤＣＣ（２２ｍｇ）を加え、反応液を終夜撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュカラム（シリカ １２、０〜５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、中間体Ｉ−６（１５９ｍｇ、定量）を白色の固体として得た：ＬＣＭＳ方法Ａ Ｒｔ＝１．５５分、［Ｍ＋Ｈ_３Ｏ＋Ｈ］^＋２ ９３３．９。

ステップ１ｇ：脂肪酸−リンカーアシル化剤（中間体７）

ＴＨＦ（５ｍＬ）中中間体Ｉ−６（１５９ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（１ｍＬ）中１０％の炭素担持Ｐｄ（４．６ｍｇ、４．３μｍｏｌ）の懸濁液を加えた。反応液を水素中に置き、４０分間撹拌した。さらに炭素担持Ｐｄ（７ｍｇ、６．５μｍｏｌ）を加え、次いで、水素中にてもう１時間撹拌した。反応液をメンブレンフィルターに通し、濾液を蒸発させた。残渣をＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ、４５〜７０％ ＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、表題の脂肪酸−リンカーアシル化剤（８３ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ、５４％）を得た：ＬＣＭＳ方法Ａ Ｒｔ＝１．０３分、

ステップ２：ＭＨ−（１９９−３０８）−ｈＧＤＦ１５の脂肪酸−リンカーアシル化剤との選択的コンジュゲーション

ＭＨ−（１９９−３０８）−ｈＧＤＦ１５（０．３９３ｍＬ、０．０２８μｍｏｌ、１．７８ｍｇ／ｍＬ）を１．５ｍｌの３０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）に加え、ＮＨＳ脂肪酸（Ｉ−７：４７４ｕｇ、０．２８４ｕｍｏｌ、１０ｍｇ／ｍｌ）を溶液に加えた。５時間後、反応をＭＡＬＤＩにより完了した。生成物を、アミコン限外濾過１０ｋＤを使用して５回洗浄することによって精製して、５７５ｕｇのコンジュゲートを７３％の収率で得た。ＭＡＬＤＩ：ｓｍ（１８％）、予想質量値：２４６３８ 実測質量値：２４７３５；＋１脂肪酸（３８％） 予想質量値：２６１９２ 実測質量値：２６２６８；＋２脂肪酸（４０％） 予想質量値：２７７４６ 実測質量値：２７７９８；＋３脂肪酸（４％） 予想質量値：２９３００ 実測質量値：２９３３３。

ステップ２：Ｍ−（Ｈｉｓ）６−ｈＧＤＦ１５−（１９９−３０８）の脂肪酸−リンカーアシル化剤との部位特異的コンジュゲーション

Ｍ−（Ｈｉｓ）_６−ｈＧＤＦ１５（０．４９３ｍＬ、０．０２６μｍｏｌ、１．４２ｍｇ／ｍＬ）を１．５ｍｌの３０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に加え、ＮＨＳ脂肪酸（Ｉ−７：０．２２１ｍｇ、０．１３２ｕｍｏｌ、１０ｍｇ／ｍＬ）を溶液に加えた。終夜反応が完了しなかったため、さらに２．５当量の脂肪酸ＮＨＳ（０．１１０ｍｇ、０．０６６ｕｍｏｌ、１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、５時間後、Ｍａｌｄｉは主要な生成物として＋２コンジュゲートを示した。生成物を、アミコン限外濾過１０ｋＤを使用して５回洗浄することによって精製して、５６５ｕｇのコンジュゲートを７６％の収率で得た。ＭＡＬＤＩ：ｓｍ（１８％）、予想質量値：２６４６８ 実測質量値：２６５５３；＋１脂肪酸（３８％） 予想質量値：２８０２２ 実測質量値：２８０９９；＋２脂肪酸（４０％） 予想質量値：２９５７６ 実測質量値：２９６４９；＋３脂肪酸（４％） 予想質量値：３１１３０ 実測質量値：３１２０１。

ＡＨ−ＧＤＦ１５＋Ｉ−７：

配列（単量体）：

脂肪酸Ｉ−７の１０ｍｇ／ｍＬ溶液をＨ_２Ｏ中で調製した。ＡＨ−ｈＧＤＦ１５（１．１２ｍｇ／ｍＬ、１７５μＬ、０．００８０μｍｏｌ）を２０２μＬの３０ｍＭ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４．０）と合わせ、Ｉ−７のアリコート（１３．３３μＬ）を加えた。反応液を室温で１６時間混合し、この時点で、ＭＡＬＤＩ分析により出発材料の３０％の変換が示された。さらに６．６７μＬのＩ−７のアリコートを加え、反応液を１６時間混合し、１３．３３μＬのＩ−７のアリコートを加えた。室温で１６時間混合した後、Ｉ−７（１３．３３μＬ）を加え、反応液を室温で３日間混合した。１３．３３μＬのＩ−７のアリコートを加え、反応液を室温で１６時間混合し、この時点で、ＭＡＬＤＩ分析により９５％超の変換が示された。１０ｋＤａ ＭＷＣＯアミコン遠心濾過器を使用して、反応液を５回希釈および濃縮して０．２ｍＬの体積にすることによって、溶液を３０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４．０）に交換した。濃度は、Ａ_２８０（３００４０Ｍ−１ｃｍ−１；２６０７２ｇ／ｍｏｌ）によって、０．３１ｍｇ／ｍＬ、３０％であることが測定された。
[実施例６Ａ]

ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５−（２００−３０８）の脂肪酸−リンカーアシル化剤との部位特異的コンジュゲーション

分子生物学グレードの水中の脂肪酸（中間体７）の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５（３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）中６．６７ｍｇ／ｍＬ、５．２４７ｍＬ、１．４３３μｍｏｌ）に、３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．６）（許容される範囲４．５〜５．０）を加えて、最終タンパク質濃度０．８８ｍｇ／ｍＬを得た。中間体７（１０当量、２．３９ｍＬ、０．０１４ｍｍｏｌ）を加え、反応液を室温で１８時間混合した。反応バイアル中に沈殿が形成された。反応混合物を、４×１５ｍＬの１０ｋＤａアミコン遠心濾過器の中で分割して、それぞれを、３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）で１５ｍＬに希釈した。材料を、３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）に４回緩衝液交換し、サンプルを合わせて、２５．６ｍＬの体積とし、洗浄の間に、フィルターの沈殿をピペットチップで撹拌した。沈殿が溶液中に残ったので、混合物を４℃で終夜静置した。濃度は、Ａ２８０（３００４０ｃｍ^−１Ｍ^−１；２７５３８ｇ／ｍｏｌ）によって、１．６２ｍｇ／ｍＬ（１００％）であることが測定された。ＵＰＬＣ分析により、＋１および＋２生成物の６０％の回収が示された（方法Ｆ）。

精製：
粗生成物を、逆相クロマトグラフィー（緩衝液Ａ 水中０．１％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ ＡＣＮ中０．１ＭＴＦＡ 勾配；９９％〜８０％緩衝液Ａ）、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ３００ １３０Å、３．５μｍ、４．６ｍｍ×１００ｍｍ 流量２．５ｍｌ／分によって精製した。

画分１：未反応ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５：Ｒｔ＝１７．３３分
画分２：ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５＋１ＦＡ：Ｒｔ＝２０．２０分（およそ１５％の収率）
画分３：ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５＋２ＦＡ：Ｒｔ＝２１．６０分（およそ１５％の収率）
画分４：ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５＋３ＦＡ：Ｒｔ＝２３．０分（およそ５％の収率）

あるいは、反応は、ｐＨ４．７３で、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４−７Ｈ_２Ｏおよび３０ｍＭのＮａＯＡｃ中で行ってもよく、分子生物学グレードの水中中間体７の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５（３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）中１２．０４ｍｇ／ｍＬ、４．１５μＬ、０．００２μｍｏｌ）に、３０ｍＭのＮａＯＡｃ １０ｍＭのＮａ_２ＨＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ４．７３）を加えて、最終タンパク質濃度０．８８ｍｇ／ｍＬを得た。中間体７（２０当量、６．８３μＬ、０．０４１μｍｏｌ）を加え、反応液を室温で１８時間混合した。反応混合物は、沈殿によって濁った。ＵＰＬＣ分析により、５８％の＋１および＋２生成物が示された（方法Ｆ）。

反応はまた、ｐＨ４．６で、３０ｍＭのＮａＯＡｃおよび１０ｍＭのＫ_２ＨＰＯ_４中で行ってもよく、分子生物学グレードの水中中間体７の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５（３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）中６．２１ｍｇ／ｍＬ、５．２６１ｍＬ、１．３３７μｍｏｌ）に、３０ｍＭのＮａＯＡｃ １０ｍＭのＫ_２ＨＳＯ_４（ｐＨ４．６）（許容される範囲４．５〜５．０）を加えて、最終タンパク質濃度０．８８ｍｇ／ｍＬを得た。中間体７（１０当量、６８．３μＬ、０．４０９μｍｏｌ）を加え、反応液を室温で７時間混合した。反応混合物は、沈殿によって濁った。反応混合物を、１５ｍＬの１０ｋＤａアミコン遠心濾過器の中４つの９ｍＬ部分に分割して、３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）で１５ｍＬに希釈した。材料を、３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）に４回緩衝液交換し、各洗浄の間に、沈殿をピペットチップで撹拌した。反応混合物を７５ｍＬの体積まで濃縮した。沈殿が残ったので、材料を４℃で２日間保存した。濃度は、Ａ２８０（３００４０ｃｍ^−１Ｍ^−１、２７５３８ｇ／ｍｏｌ）によって、０．４ｍｇ／ｍＬ（９７％）であることが測定された。ＵＰＬＣ分析により、＋１および＋２生成物の６１％の回収率が示された（方法Ｆ）。

Ｎ末端標識を確認するための、マッピングを用いたＭ（Ｈｉｓ）_６Ｍ−ＧＤＦ１５のビオチン化

３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４）酢酸ナトリウム緩衝液中ＭＨＨＨＨＨＨＭ−ｈＧＤＦ１５（０．５３ｍｇ／ｍＬ、８ｍＬ）の溶液に、ＮＨＳエステルの溶液（ｐＨ４ ３０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液中１．５ｍｇ／ｍＬ）を、以下の量で、２時間おきに連続して加えた、１１８ｕＬ、１７７ｕＬ。ｐＨ４のＮａＯＡｃ緩衝液を用いるアミコン濃縮装置を使用して混合物を濃縮／洗浄し（３回）、タンパク質の高回収率を達成するため、カートリッジを繰り返し洗浄した。５．８ｍＬの０．６４ｍｇ／ｍＬの生成物が得られた。ＬＣＭＳ；予想値（＋１）：２７０６６、実測値（＋１）：２７０６６；予想値（＋２）：２７４０６、実測値（＋２）：２７４０５。

Ｇｌｕ−Ｃ消化およびマッピングを使用して、Ｎ末端で９０％のビオチン化が確認された。
このプロトコールの目的は、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（高速液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析）またはＭＡＬＤＩ ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析）のいずれかによる次の分析のために、タンパク質を還元し、アルキル化させ、Ｇｌｕ−Ｃ（Ｓ．アウレウス（S. aureus）Ｖ８）で消化することである。簡潔には、純粋なタンパク質は、カオトロープで再構成され、ジチオトレイトールで還元され、ヨードアセトアミドでアルキル化され、次いでＧｌｕ−Ｃで消化される。Ｇｌｕ−Ｃは、炭酸水素アンモニウムまたは酢酸アンモニウム緩衝液で緩衝されると、グルタミン酸残基に特異性を有する。Ｇｌｕ−Ｃは、リン酸緩衝液の存在下で、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかを切断する。

１．実験方法
１．１．再構成／変性（２５ｕＬ中４ＭのＧｎＨＣｌ）
１．１．１．２５ｕＬの４Ｍ塩酸グアニジン（ＧｎＨＣｌ）を、乾燥タンパク質のアリコートに加える。
１．１．２．およそ２分間、穏やかに撹拌、振盪またはタップして、タンパク質を再構成および変性させる。

１．２．還元（５０ｕＬ中２ＭのＧｎＨＣｌ、１００ｍＭのＡＢＣ、１０ｍＭのＤＤＴ）
１．２．１． ２０ｕＬの調製したばかりの２５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ＡＢＣ）を加える。
１．２．２． ５ｕＬの調製したばかりの水中１００ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加える。
１．２．３．穏やかに振盪しながら、３７℃で１時間インキュベートする。

１．３．アルキル化（６０ｕＬ中１．６ＭのＧｎＨＣｌ、８３．３ｍＭのＡＢＣ、８．３ｍＭのＤＤＴ、３５ｍＭのＩＡＡ）
１．３．１． ４．７５ｕＬの水を加える。
１．３．２． ５．２５ｕＬの調製したばかりの水中４００ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を加える。
１．３．３．簡単にかつ穏やかに撹拌または振盪させてサンプルを混合する。
１．３．４．暗室で、室温で４０分間インキュベートする。

１．４．浄化
１．４．１．少なくとも１０００ｕＬの氷冷エタノールを加える。
１．４．２．穏やかに撹拌または振盪させて混合する。
１．４．３． −２０℃で２時間インキュベートしてタンパク質を沈殿させる。
１．４．４． ４℃で、１０，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離する。
１．４．５．上清の大部分を除去する。
１．４．６．Ｓｐｅｅｄｖａｃで完了まで乾燥させる。

１．５．Ｇｌｕ−Ｃ消化（１００ｕＬ中０．２５ＭのＧｎＨＣｌ、２５ｍＭのＡｍＡｃ（約ｐＨ６．５）、２０：１のタンパク質：Ｇｌｕ−Ｃ）
１．５．１． １０ｕＬの２．５ＭＧｎＨＣｌ中で乾燥タンパク質を再構成する。
１．５．２．およそ１分間、穏やかに撹拌、振盪またはタップしてタンパク質を再構成する。
１．５．３． １０ｕＬの調製したばかりの２５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液を加える。
１．５．４． １００ｕＬのｍｉｌｌｉＱ水中で１０ｕｇのＧｌｕ−Ｃを再構成する。
１．５．５．（１ｕｇのＧｌｕ−Ｃ：２０ｕｇのタンパク質）の比を達成するために、適切な量の０．１ｕｇ／ｕＬのＧｌｕ−Ｃを加える。たとえば、２０ｕｇのタンパク質に対して１０ｕＬを加える。
１．５．６． １００ｕＬの最終反応液体積を達成するために水を加える。
１．５．７．穏やかに振盪しながら、３７℃で４時間インキュベートする。
１．５．８．Ｇｌｕ−Ｃは、ｐＨ４．０〜９．０で酵素活性を有するため、酸または塩基を加えて活性を失活させることは不可能である。直ちに分析することを推奨する。

ビオチン化ＧＤＦ１５サンプルにより、３３９ｄａの質量がシフトしたＧｌｕＣペプチドが得られるはずである。

化学的ビオチン化ＧＤＦ１５のＮ末端ＧｌｕＣ消化生成物。配列：ＬＣ−ビオチン−Ｍ（Ｈｉｓ）_６ＭＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥ。３つのシステインのアルキル化で計算されたモノアイソトピック質量＝４３１１．９７５５Ｄａ Ｍ３＋チャージ＋１計算値＝１４３８．３３２５ 実測質量値＝１４３８．３３３１。

Ｍ（Ｈｉｓ）_６−ｈＧＤＦ１５の部位特異的ビオチン化

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋ビオチン−ＰＥＧ_２４−ＮＨＳエステル：

３０ｍＭのｐＨ４のＮａＯＡｃ中ビオチン−ＰＥＧ_２４−ＮＨＳ（Ｂｉｏｍａｔｒｉｋ，Ｉｎｃ．）の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。ＭＨＨＨＨＨＨ−ｈＧＤＦ１５（１．００７ｍＬ、０．０５４μｍｏｌ）を３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４）（１．５ｍＬ）およびビオチン−ＰＥＧ_２４−ＮＨＳ（Ｂｉｏｍａｔｒｉｋ，Ｉｎｃ．、３９７μＬ、２．７０μｍｏｌ）と合わせた。混合物を室温で１６時間振盪し、この時点で、さらに１０当量（７９．４μＬ）のＮＨＳ溶液を加え、反応液を室温で１６時間混合した。さらに１０当量（７９．４μＬ）のＮＨＳ溶液を加え、反応液を室温で１６時間混合した。反応液を３７℃に加熱し、１０時間撹拌し、この時点で、１０ｋＤａ ＭＷＣＯアミコン遠心濾過器を使用して、サンプルを５回希釈および濃縮して２ｍＬの体積にすることによって、混合物を３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４）に交換した。ＬＣＭＳ分析により、出発材料、＋１および＋２生成物の存在が示された。濃度は、Ａ_２８０（２９０９０Ｍ^−１ｃｍ^−１；２７８１８ｇ／ｍｏｌ）によって、１．２０ｍｇ／ｍＬ（１００％）であることが測定された。ＬＣＭＳ方法Ｄ：Ｒ_ｔ＝２．４８分；ＭＳ［Ｍ＋１＋１ビオチン］、［Ｍ＋１＋２ビオチン］：実測値：２７８１８．００００、２９１７４．００００、計算値：２７８２３．７、２９１７９．４。
[実施例８Ａ]

Ｍ（Ｈｉｓ）６−ｈＧＤＦ１５の部位特異的ビオチン化

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋スルホ−ＮＨＳ−ビオチン

３０ｍＭのｐＨ４のＮａＯＡｃ中スルホ−ＮＨＳ−ビオチン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５Ｂ８（１００μＬ、０．００７６μｍｏｌ）を、３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４）（２９３．３μＬ）およびスルホ−ＮＨＳ−ビオチン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、６．７０μＬ、０．１５１μｍｏｌ）と合わせた。混合物を室温で１６時間振盪した。１０ｋＤａ ＭＷＣＯアミコン遠心濾過器を使用して、サンプルを５回希釈および濃縮して１５０μＬの体積にすることによって、混合物を３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４）に交換した。ＬＣＭＳ分析により、出発材料、＋１および＋２生成物の存在が示された。濃度は、Ａ_２８０（２９０９０Ｍ^−１ｃｍ^−１；２６９１７ｇ／ｍｏｌ）によって、１．０８ｍｇ／ｍＬ（８０％）であることが測定された。ＬＣＭＳ方法Ｅ：Ｒ_ｔ＝５．０５分；ＭＳ［Ｍ＋１＋１ビオチン］実測値：２６６９０、計算値：２６６９２、［Ｍ＋１＋２ビオチン］：実測値：２６９１８、計算値：２６９２０、［Ｍ＋１＋３ビオチン］：実測値：２７１４３、計算値：２７１４８。

Ｍ（Ｈｉｓ）６Ｍ−ｈＧＤＦ１５を用いたＢＣＮアシル化剤の部位特異的コンジュゲーション

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５（０．６ｍＬ、４．８ｍｇ／ｍＬ）の保存溶液を、３０ｍＭのＮａＯＡｃ ｐＨ４．５緩衝液（５．２ｍＬ）で０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈した。ＤＭＳＯ（２５１μＬ）中（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート（ＮＨＳ−ＢＣＮ）の１０ｍｇ／ｍＬ保存溶液をゆっくり加え、反応液を２４℃で２１時間シェーカープレートに置いた。反応液を、３０ｍＭのＮａＯＡｃ ｐＨ４．５緩衝液で３０ｍＬまで希釈し、１０ｋＤａ ＭＷＣＯアミコン遠心濾過器を使用して（４回繰り返す）、２ｍＬまで濃縮して、２．５ｍＬの濃縮物を得た。Ａ_２８０（ε＝２９０９０Ｍ^−１ｃｍ^−１、２６７３０ｇ／ｍｏｌ）に基づくと、濃度は０．９３ｍｇ／ｍＬ（２．３３ｍｇ、８０％）であった：ＬＣＭＳ ＱＴ２＿１５−６０ｋＤａ＿１５分＿極性

＋１ＢＣＮおよび＋２ＢＣＮは、単量体および二量体部分のＮ末端アミノ基のアシル化を指す。＋３ＢＣＮは、非選択的アシル化を指す。

Ｍ（Ｈｉｓ）_６−ｈＧＤＦ１５を用いたＢＣＮアシル化剤の部位特異的コンジュゲーション

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５配列：

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１（７．０４ｍＬ、１．４２ｍｇ／ｍＬ）の保存溶液を、３０ｍＭのＮａＯＡｃ ｐＨ４．５緩衝液（１２．９５ｍＬ）で０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈した。ＤＭＳＯ（０．８８ｍＬ）中（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート（ＮＨＳ−ＢＣＮ）の１０ｍｇ／ｍＬ保存溶液をゆっくり加え、反応液を２４℃で２１時間シェーカープレートに置いた。さらに一部のＮＨＳ−ＢＣＮ保存溶液（１７６μＬ）を加え、反応液を２４℃で２４時間維持した。反応液を、３０ｍＭのＮａＯＡｃ ｐＨ４．５緩衝液で６０ｍＬまで希釈し、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ限外濾過カートリッジを使用して４ｍＬまで濃縮して（４回繰り返す）、４．１ｍＬの濃縮物を得た。Ａ_２８０（ε＝２９０９０Ｍ^−１ｃｍ^−１、２６７００ｇ／ｍｏｌ）に基づくと、濃度は２．１９ｍｇ／ｍＬ（８．９８ｍｇ、８９％）であった：ＬＣＭＳ ＱＴ２＿１５−６０ｋＤａ＿１５分＿極性

＋１ＢＣＮおよび＋２ＢＣＮは、単量体および二量体部分のＮ末端アミノ基のアシル化を指す。＋３ＢＣＮは、非選択的アシル化を指す。

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５のフルオロフォア標識
ステップ１：フルオロフォア−リンカーアシル化剤（Ｉ−８）の調製

ＰＢＳ（１ｍＬ）中Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７−ＮＨＳエステル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、５ｍｇ、４．００μｍｏｌ）の溶液に、アジド−ｄＰＥＧ_２３−アミン（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｈ カタログ番号１０５２５、４．８４ｍｇ、４．４μｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で６．５時間混合し、この時点で、さらに２．５当量のアジド−ｄＰＥＧ_２３−アミン（１ｍｇ）を２滴のＤＩＰＥＡと共に加えた。反応液を室温で１６時間混合した。ＬＣＭＳ分析によって、完全な変換が観察された。混合物を、さらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ方法Ｅ：Ｒ_ｔ＝１．７３分；ＭＳ［Ｍ＋Ｈ／３］：実測値：６４６．１、計算値：６５５．３。

ステップ２：フルオロフォア剤（Ｉ−８）を用いたｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５−ＢＣＮ構築物（実施例１０）のさらなる誘導体化

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５−ＡＦ６４７：

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５−ＢＣＮ（５００μＬ、２．１９ｍｇ／ｍＬ、０．０４１μｍｏｌ）の溶液に、１（２０．５５μＬ、７．８６ｍｇ／ｍＬ、０．０８２μｏｌ）の溶液を加えた。反応液を室温で２日間混合し、この時点で、ＬＣＭＳ分析によって７５％の変換が観察された。１０ｋＤａ ＭＷＣＯアミコン遠心濾過器を使用して、サンプルを８回希釈および濃縮して２．２５ｍＬの容量にすることによって、混合物をＰＢＳに交換した。濃度は、Ａ_２８０（２９０９０Ｍ−１ｃｍ−１、２８６００ｇ／ｍｏｌ）によって０．３２ｍｇ／ｍＬ（６０％）であることが測定された。ＬＣＭＳ方法Ｂ：Ｒ_ｔ＝６．１９分；ＭＳ［Ｍ＋Ｈ＋１ＡＦ６４７］：実測値：２８５８０．００００、計算値：２８６０９．３３６。

Ｃｕ６４アイソトープキレーターのＧＤＦ１５への部位特異的コンジュゲーション

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５（１．１２ｍｇ／ｍＬ、２００ｕＬ）の溶液に、ＮＯＤＡ−ＧＡ−ＮＨＳ、ＨＰＦ６、ＴＦＡ塩（ＣｈｅＭａｔｅｃｈカタログ番号Ｃ０９８）（２０ｕＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）の溶液を加え、混合物を室温で２日間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ分析によって、部分的な変換（＋１の５０％）が観察された。２００ｕＬのｐＨ４ ＮａＯＡｃ緩衝液および２０ｕＬのＮＯＤＡ−ＧＡ−ＮＨＳ溶液を加え、混合物を室温でさらに２日間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ分析によって、＋１および＋２の約７０％の変換が観察された。さらにＮＯＤＡ−ＧＡ−ＮＨＳ溶液（２０ｕＬ）を加え、混合物を室温で終夜撹拌した。ＬＣ−ＭＳ分析によって、＋１および＋２の約８０％の変換が観察された。混合物を、アミコン１０ｋで４回洗浄して、１５０ｕＬの０．４０ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。

トキシンのＧＤＦ１５への部位特異的コンジュゲーション
ステップ１：トキシン構築物の調製

ＤＭＳＯ（１３０ｕＬ）中マレイミドＭＭＡＦ（Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ）（１．５７ｍｇ、１．２当量）の溶液に、７２．７ｕＬのＤＭＳＯ中２−アミノ−Ｎ−（３−アジドプロピル）−３−メルカプトプロピオンアミド（０．２ｍｇ、１当量）、およびＤＩＰＥＡ（１ｕＬ、６当量）の溶液を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ分析によって、部分的な変換が観察された。さらにアジドシステイン（１００ｕＬ）を加えた。反応液を３日撹拌した。

スケールアップ：１．７ｍｇのマレイミドＭＭＡＦ（Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ）（２００ｕＬのＤＭＳＯ中）を、ｃｙｓ−Ｎ３（１３０ｕＬ＋１００ｕＬ）およびＤＩＰＥＡ（２ｕＬ）に加え、反応液を３日かけて撹拌した。

両方の混合物を合わせて、１０〜９０％のＡＣＮ／水（０．１％ＴＦＡ）（室温＝１．１５分）で溶出するＳｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８によって精製して、２．９ｍｇのクリーンな生成物を９２％の収率で得た。

ステップ２：ＢＣＮのＨｉｓ−ｃｙｎｏＧＤＦ１５への部位特異的コンジュゲーション（本発明のステップｂに相当する）

ｈｉｓ−ｃｙｎｏＧＤＦ１５（Ｂ１、１５０ｕＬ、０．８７ｍｇ／ｍＬ）に、ｐＨ４の緩衝液（４５０ｕＬ）およびＤＭＳＯ（１０ｍｇ／ｍＬ、４．１２ｕＬ）中ＮＨＳ−ＢＣＮ（Ｂｅｒｒｙ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓカタログ番号ＬＫ４３２０）を加え、混合物を４Ｃで週末にかけて撹拌した。４Ｃで１日後に、６０％の変換が明らかになり、この時点で、７当量のＤＭＳＯ中ＮＨＳ−ＢＣＮ（１０ｍｇ／ｍｌ、４．１２ｕＬ）を加えた。さらに４Ｃで２４時間後、１３当量のＮＨＳ−ＢＣＮ（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ、８ｕｌ）を加え、反応液を室温で４時間インキュベートした。部分的な変換が観察された。混合物を室温でさらに４時間インキュベートした。完全な変換が観察され、混合物を１５ｍＬまで希釈し、アミコン１０Ｋカートリッジを４回通して洗浄／濃縮して、７ｍＬの０．６０ｍｇ／ｍＬ溶液（４．２ｍｇ）を８８％の収率で得た。ＬＣＭＳ：＋１ 予想質量値：２６８４４、実測質量値：２６８４２；＋２ 予想質量値：２７０２４ 実測質量値：２７０２０。

ステップ３：コンジュゲート構築物のさらなる修飾

ＢＣＮ−ＧＤＦ１５（７ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ）に、アジド−ＭＭＡＦ（２００ｕＬ、ＤＭＳＯ中７．２５ｍｇ／ｍＬ）を加え、混合物を室温で３日かけて、続いて３０℃で２日間撹拌した。モノ−およびビス−修飾生成物への約７０％の変換が得られた。生成物をアミコン１０ｋで洗浄して、ｐＨ４の３０ｍＭの酢酸ナトリウム中４．７ｍＬの１ｍｇ／ｍＬ生成物を、定量的収率で得た。Ｍａｌｄｉ：ｓｍ（２５％） 計算質量値：（＋１）２６８４４（＋２）２７０２４ 実測質量値：（＋１）２６６９９；＋１トキシン（５０％） 計算質量値：２８３７７ 実測質量値：（＋１）２８５２５；＋２トキシン（２５％） 計算質量値：３００８８ 実測質量値：２９９１０。

ＦｃのＡＰＪペプチドアゴニストへの部位特異的コンジュゲーション
一般スキーム：

ステップ１：ＮＨ２−アジドＬｙｓ−ＧＧＧＧＳ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｃ−Ｌ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−ＤＮｌｅ−フェネチルアミンの合成
中間体１４

フェニチルアミン−ＡＭＥＢＡ樹脂（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、０．２５ｍｍｏｌ、１．０ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ａｒｇ残基に２倍の標準Ａｒｇを用いた、自動ペプチド合成装置（ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ）での固相ペプチド合成にかけ、Ｄｎｌｅおよびアジドリジンを２回カップリングした。アミノ酸は、０．２ＭのＤＭＦ中溶液として調製した。標準のカップリングサイクルは、次のとおりに定めた：
− アミノ酸カップリング：ＡＡ（５当量）、ＨＡＴＵ（５当量）、ＤＩＥＡ（２５当量）
− 洗浄：ＤＭＦ（３×７ｍＬ）
− Ｆｍｏｃ脱保護：２０％ピペリジン／０．１Ｍ ＨＯＢｔ（２×７ｍＬ）
− 洗浄：ＤＭＦ（４×７ｍＬ、次いで１×５ｍＬ）

ペプチドを組み立てた後、樹脂をＤＭＦ（２×５０ｍＬ）およびＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で洗浄し、次いで真空中で乾燥させて、中間体１４ａ（７７０ｍｇ、０．２５０ｍｍｏｌ）を得た。

ステップ２：中間体１４ｂの調製（樹脂からのペプチドの切断）
中間体１４ａ（７７０ｍｇ、０．２５０ｍｍｏｌ）を半分に分け、各サンプルを６ｍＬのＴＦＡ溶液（３７ｍＬのＴＦＡ、１ｍＬのＨ２Ｏ、１ｍＬのＴＩＰＳ、２．５６９ｇ（２０当量）のＤＴＴ）と合わせ、室温で３時間振盪した。溶液を樹脂から除去し、４０ｍＬの冷Ｅｔ_２Ｏ中へ沈殿させた。溶液をボルテックスし、氷上に１０分間静置し、その後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。溶液を除去し、白色の固体を冷Ｅｔ_２Ｏ（各回４０ｍＬ）で２回以上洗浄し、遠心分離（各回５分）して、デカントした。固体を真空中で終夜乾燥させ、Ｍ−起動式ＨＰＬＣによって精製し、中間体１４ｂを白色の固体（８０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ、８０％）として得た。ＬＣＭＳ（ＳＱ２ 生成物分析−酸性−ペプチド−極性、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、５０℃）：Ｒ_ｔ＝２．３２分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ＋２／２］８８８．０。

ステップ３：中間体１４ｃの調製（システイン残基の環化）

中間体１４ｂ（８０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を水（１．２５ｍＬ）に溶解させ、ヨウ素（ＨＯＡｃ中５０ｍＭ、１．８０４ｍＬ、０．０９０ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下添加し、反応液を室温で３時間混合した。粗製の反応液のＬＣＭＳ分析により、出発材料の完全な変換が示された。色が消失するまで、０．５Ｍのアスコルビン酸を滴下添加した。材料を、ＭＳ−起動式ＨＰＬＣによって精製した。プールされた画分の凍結乾燥により、２０．１ｍｇの所望の生成物を白色の固体（０．０４５ｍｍｏｌ、２５％）として得た。ＬＣＭＳ（ＳＱ２ 生成物分析−酸性−ペプチド−極性、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、５０℃）：Ｒ_ｔ＝２．１７分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ＋２／２］８８６．８。

ステップ４：Ｆｃ−ＡＨ構築物の調製
ＡＨ−Ｆｃ構築物のクローン化：
以下に示すＤＮＡ断片は、ＣＭＶプロモーターの下流に、マウスＩｇκシグナル配列に続いてヒトＦｃを含んでいるベクターｐＰＬ１１４６を鋳型として使用する標準のＰＣＲ技術によって作製した。ＮｈｅＩ部位に続いて、ベクターｐＰＬ１１４６に含まれているシグナル配列の５’末端に対応する配列を収容する、順方向プライマー（５’−ＧＣＴ ＴＧＣ ＴＡＧ ＣＣＡ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＡＡ ＣＴＧ−３’）を設計した。逆方向プライマー

は、ＥｃｏＲＩ部位、アペリン配列、グリシンセリンリンカー、および、ｐＰＬ１１４６に含まれているヒトＦｃの３’末端に相補的な配列を収容するように設計した。増幅した後、断片を、ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ両方で制限消化し、アガロースゲルから単離および精製し、同じようにして消化および精製したベクターｐＰＬ１１４６に連結した。連結物を大腸菌（E coli）ＤＨ５□細胞に形質転換し、適正なプラスミドを含んでいるコロニーを、ＤＮＡ配列決定によって鑑別した。示す配列は、センス鎖についてのものであり、５’−から３’−方向に伸びている。

ネクレオチド配列

ＡＨ−Ｆｃのタンパク質発現および精製：
標準のポリエチレンイミン法を使用して、１ｍｌあたり１×１０^６細胞の密度で、ＡＨ−Ｆｃ発現プラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入した。次いで、５００ｍｌの培養物を、３Ｌフラスコ中のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において３７℃で４日間成長させた。

ＡＨ−Ｆｃタンパク質は、清澄化した条件培地から精製した。簡潔に述べると、５００ｍｌの条件培地を、４ｍｌ／分で、５ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に流した。０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４を含有する２０カラム体積のＰＢＳでカラムを洗浄し、次いで、Ｆｃ−ＡＨタンパク質を０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．７）で溶離させ、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）で中和し、ＰＢＳに対して透析した。タンパク質収量は、条件培地５００ｍｌあたり１０〜２０ｍｇであり、エンドトキシンレベルは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＥＮＤＯＳＡＦＥ ＰＴＳ試験によって測定したとき、１ＥＵ／ｍｇを下回った。

タンパク質は、還元されたＮ−脱グリコシルＡＨ−Ｆｃタンパク質のＬＣ／ＭＳによって特徴付けられた。Ｆｃ−ＡＨの分子量が予想された。

未変性ＡＨ−Ｆｃタンパク質のＬＣ／ＭＳ：ピークは、不均一であり、二量体について予想されるより約３ｋＤａ大きかった。これは、Ｎ連結型グリコシル化コンセンサス部位を有するＦｃについて予想されるＮ連結型グリコシル化の特性を示している。

Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００での分析的サイズ排斥：ＡＨ−Ｆｃタンパク質は、８９〜１００％の間の二量体、０〜１０％の四量体、および０〜１％の凝集体を有する。

還元ＳＤＳ／ＰＡＧＥ：タンパク質は、主に、予想されたサイズのモノマーとして移動した。

ステップ５：ＡＨ−Ｆｃ ＢＣＮの調製（Ｆｃ−ＨＡ Ｎ末端におけるクリックハンドルの設置）

ＡＨ−Ｆｃ配列：

ＡＨ−Ｆｃ（ステップ４に由来：１ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、０．１１７μｍｏｌ）を、３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）（４．３ｍＬ）に溶解させ、ＤＭＳＯ（０．７０ｍＬ）中（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート（ＢＣＮ）の１０ｍｇ／ｍＬの保存溶液をゆっくりと加え、反応液を室温で３日間シェーカープレートに置いた。ＢＣＮ（０．２５ｍＬ）を加え、反応液を室温で３日間混合した。ＢＣＮ（０．７０ｍＬ）を加え、反応液を室温で１６時間混合した。１０ｋＤａ ＭＷＣＯアミコン遠心濾過器を使用して、反応液を５回希釈および濃縮して９００μＬの体積にすることによって、溶液を３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）に交換した。溶液を遠心分離し、上清を除去した。濃度は、Ａ２８０によって、１．７３ｍｇ／ｍＬ（１．５６ｍｇ、２６％）であることが測定された。ＬＣＭＳ（ＱＴ２、タンパク質＿２０〜７０ｋＤａ＿３分、Ｐｒｏｓｗｉｆｔ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ４．６×５０ｍｍ、５０℃、溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離液Ｂ：ＣＡＮ＋０．１％ギ酸、２分かけて２〜９８％）Ｒ_ｔ＝１．５８分。

ステップ６：Ｆｃ−ＨＡ−ＢＣＮ＋中間体１４ｃ（ＣＮＭペプチドのＦＣへのコンジュゲーション）

Ｈ_２Ｏ中中間体１４ｃの５０ｍｇ／ｍＬの保存溶液を調製した。中間体１４ｃ（５３．７μＬ、１．５１５μｍｏｌ）を、３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）中Ｆｃ−ＨＡ−ＢＣＮ（１．７３ｍｇ／ｍＬ、１．５６ｍｇ、０．０３μｍｏｌ）の保存溶液に加え、反応液を室温で１６時間混合した。５０ｋＤａ ＭＷＣＯアミコン遠心濾過器を使用して、反応液を５回希釈および濃縮して２５０μＬの体積にすることによって、溶液を３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）に交換した。濃度は、Ａ２８０によって、３．３２ｍｇ／ｍＬ（８３０μｇ、５０％）であることが測定された。ＬＣＭＳ（ＱＴ２、タンパク質＿３５〜７０ｋＤａ＿３分、Ｐｒｏｓｗｉｆｔ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ４．６×５０ｍｍ、５０℃、溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離液Ｂ：ＣＡＮ＋０．１％ギ酸、２分かけて１０〜８０％）Ｒ_ｔ＝１．４３分、ＭＳ［Ｍ（グリコシル化）＋Ｈ］５４５２４．５。

Claims (33)

1. 標的タンパク質または標的ペプチドを、Ｎ末端アミノ酸のアミノ官能基において修飾する方法であって、
   ａ．得られるタンパク質またはペプチドが、前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する位置にヒスチジンアミノ酸を含有するように、前記標的タンパク質または標的ペプチドを修飾するステップと、
   ｂ．前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する前記位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドを、アシル化用化合物と６未満のｐＨで接触させて、修飾されたタンパク質またはペプチドを生成するステップと
   を含む、方法。
2. 前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する前記位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドの前記Ｎ末端アミノ酸に隣接するアミノ酸を、ヒスチジンアミノ酸で置き換えることにより調製される、請求項１に記載の方法。
3. 前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する前記位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドの前記Ｎ末端にある２つのアミノ酸を、アミノ酸配列ＸＨ−［式中、Ｈは、ヒスチジンであり、Ｘは、Ｍ、Ａ、Ｑ、ＮおよびＧから選択されるアミノ酸である］で置き換えることにより調製される、請求項１に記載の方法。
4. 前記アミノ酸配列ＸＨ−が、ＭＨ−またはＡＨ−である、請求項３に記載の方法。
5. 前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する前記位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端にある３つのアミノ酸を、アミノ酸配列ＸＨＸ’−［式中、Ｈは、ヒスチジンであり、ＸおよびＸ’は、独立して、Ｍ、Ａ、Ｑ、ＮおよびＧから選択されるアミノ酸である］で置き換えることにより調製される、請求項１に記載の方法。
6. 前記アミノ酸配列ＸＨＸ’−が、ＡＨＡ−およびＭＨＡから選択される、請求項５に記載の方法。
7. 前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する前記位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端に、式ＸＨの２つのアミノ酸配列または式ＸＨＸ’−の３つのアミノ酸配列［式中、Ｈは、ヒスチジンであり、ＸおよびＸ’は、Ｍ、Ａ、Ｑ、ＮおよびＧから独立して選択される］を追加することにより調製される、請求項１に記載の方法。
8. 前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する前記位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端にヒスチジンタグを追加することにより調製される、請求項１に記載の方法。
9. 前記Ｎ末端アミノ酸に隣接する前記位置にヒスチジンアミノ酸を含有する前記タンパク質またはペプチドが、前記標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端に、ＭＨＨＨＨＨＨ−またはＭＨＨＨＨＨＨＭ−から選択されるアミノ酸配列を追加することにより調製される、請求項８に記載の方法。
10. 前記アシル化剤が、活性化型の次式：
    ＨＯ−Ｃ（Ｏ）−（Ｌ^１）_ｎ−Ｒ^１［式中、
    Ｌ^１は、リンカーであり、
    Ｒ^１は、生体相互作用薬もしくは分析用薬剤への共有結合を促進する反応性基を含む部分であるか、またはＲ^１は、生体相互作用薬もしくは分析用薬剤であり、
    ｎは、０または１である］
    の酸である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記アシル化剤が、次式：
    

    

    ［Ｒは、ＨまたはＳＯ_３Ｎａである］
    のものである、請求項１０に記載の方法。
12. ｎが１であり、Ｌ^１が、１つまたは複数のアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、ヘテロ環基、ポリエチレングリコール、および／もしくは１つまたは複数の天然もしくは天然でないアミノ酸、またはこれらの組合せを含み、前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、および／もしくは天然もしくは天然でないアミノ酸はそれぞれ、場合により互いに合体および連結しているか、または前記生体相互作用薬／分析用薬剤および／もしくは前記標的タンパク質／ペプチドに、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｏ−、＝ＮＨ−Ｏ−、＝ＮＨ−ＮＨ−、もしくは＝ＮＨ−Ｎ（アルキル）−から選択される化学基を介して連結している、請求項１０または１１に記載の方法。
13. 前記リンカーが、線状もしくは分枝状アルキル、または分子量が１００ｋＤ〜５０００ｋＤの間であるポリエチレングリコールである、請求項１２に記載の方法。
14. Ｒ^１が生体相互作用薬または分析用薬剤である、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. Ｒ１がビオチンである、実施形態１４に記載の方法。
16. Ｒ１がアルブミン結合性部分である、実施形態１４に記載の方法。
17. 前記アシル化剤が、
    

    

    ［Ｒ８は、線状もしくは分枝状Ｃ６〜７０アルキル、線状もしくは分枝状Ｃ６〜７０アルケニル、または線状もしくは分枝状Ｃ６〜７０アルキニルであり、これらはそれぞれ、カルボキシおよびヒドロキシルから選択される１〜３つの置換基で場合により置換されており、
    ｓは、１〜３４である］
    である、実施形態１から１４および１６のいずれか１つに記載の方法。
18. Ｒ^１が、生体相互作用薬もしくは分析用薬剤への共有結合を促進する反応性基を含む部分である、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記反応性基が、アシル、エステルもしくは混合無水物、アルキン、テトラジン、マレイミド、イミデート、またはカルボキシから選択される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記反応性基がシクロオクチン部分である、請求項１８または１９に記載の方法。
21. 前記アシル化剤が
    

    

    である、請求項１から１３および１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 生体相互作用薬または分析用薬剤を、前記アシル化剤中に存在する前記反応性基と反応させるステップをさらに含み、前記生体相互作用薬または分析用薬剤は、官能基を介して、場合によりリンカーＬ^２を介して反応させる、請求項１８から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記官能基が、アミノ基、アジド基、アルケン基、チオール基、およびヒドラジン、ヒドロキシルアミン基から選択される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記官能基がアジドである、請求項２２または２３に記載の方法。
25. 前記生体相互作用薬または分析用薬剤が、ビオチン、蛍光体、毒素、キレーター、アルブミン結合性部分または血漿タンパク質結合性部分、未変性Ｆｃ、Ｆｃ変異体、画像処理試薬、およびペプチドから選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記標的タンパク質または標的ペプチドが、ＡＰＪアゴニストペプチド、未変性Ｆｃ、Ｆｃ変異体、またはＧＤＦ１５タンパク質もしくはその変異体である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記ｐＨが５未満である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記ｐＨが４である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
29. 請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法によって調製されるコンジュゲート。
30. 請求項２９に記載のコンジュゲートまたは請求項１から２８のいずれか一項に記載の修飾タンパク質もしくは修飾ペプチドを含む、ワクチン。
31. 請求項１から２８のいずれか一項に記載の修飾タンパク質または修飾ペプチドを含む、治療用タンパク質。
32. 請求項１から２８のいずれか一項に記載の修飾タンパク質または修飾ペプチドを含む、画像処理剤。
33. 請求項１から２８のいずれか一項に記載の修飾タンパク質または修飾ペプチドを含む、標識用ツール。