ES2865511T3

ES2865511T3 - Inmunoanálisis que usa al menos dos agentes de unión específica a analito pegilado

Info

Publication number: ES2865511T3
Application number: ES18703282T
Authority: ES
Inventors: Ralf Bollhagen; Barbara Upmeier; Werner Naser; Toralf Zarnt
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2017-02-02
Filing date: 2018-01-31
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2038-01-31
Also published as: CN110234995A; EP3577460B1; US11099180B2; EP3577460A1; JP2020506386A; US20190346432A1; WO2018141768A1; JP7068323B2

Abstract

Un procedimiento para la medición de un analito en un ensayo de unión específica a analito basado en micropartículas, en el que dichas micropartículas se recubren con el primer compañero de un par de unión, comprendiendo dicho procedimiento a) mezclar las micropartículas recubiertas, al menos dos agentes de unión específica a analito, en el que cada uno de dichos agentes de unión específica a analito se une a un segundo compañero del par de unión, y una muestra que se sospecha que comprende o que comprende el analito, en el que dicho segundo compañero del par de unión se une a cada uno de dichos agentes de unión específica a analito por medio de un conector que comprende de 12 a 30 unidades de etilenglicol (PEG 12 a 30), uniendo de este modo el analito por medio de dichos agentes de unión específica a analito a las micropartículas recubiertas, b) separar de la mezcla las micropartículas que comprenden el analito unido por medio del par de unión y el agente de unión específica a analito y c) medir el analito unido a las micropartículas.

Description

DESCRIPCIÓN

Inmunoanálisis que usa al menos dos agentes de unión específica a analito pegilado

La presente invención se refiere a un procedimiento para la medición de un analito en un ensayo de unión específica a analito basado en micropartículas, en el que dichas micropartículas se recubren con el primer compañero de un par de unión, comprendiendo el procedimiento mezclar las micropartículas recubiertas, al menos dos agentes de unión específica a analito, unidos al segundo compañero del par de unión, y una muestra que se sospecha que comprende o que comprende el analito, en el que dicho segundo compañero del par de unión se une a dichos agentes de unión específica a analito por medio de un conector que comprende de 12 a 30 unidades de etilenglicol (PEG 12 a 30), uniendo de este modo el analito por medio de los agentes de unión específica a analito a las micropartículas recubiertas, separar de la mezcla las micropartículas que comprenden el analito unido por medio del par de unión y los agentes de unión específica a analito y medir el analito unido a las micropartículas. Además, la invención se refiere a la detección de varias variantes de un analito aplicando el concepto anterior, en particular la detección de antígenos víricos.

Antecedentes de la invención

Se han desarrollado numerosos procedimientos y sistemas para la detección y cuantificación de analitos de interés en muestras bioquímicas y biológicas. Los procedimientos y sistemas que pueden medir cantidades mínimas de microorganismos, productos farmacéuticos, hormonas, virus, anticuerpos, ácidos nucleicos y otras proteínas son de gran valor para los investigadores y médicos.

Muchos procedimientos de ensayo hacen uso de un agente de unión específica de analito para capturar una molécula diana específica de interés de una muestra y permitir la determinación de la molécula diana.

Se ha desarrollado un conjunto sustancial de conocimientos basado en reacciones de unión, por ejemplo, reacciones de antígeno-anticuerpo, técnicas de hibridación de ácido nucleico y sistemas de proteína-ligando. El alto grado de especificidad en muchos sistemas de unión bioquímicos y biológicos ha dado lugar a muchos procedimientos de ensayo y sistemas de valor en investigación y diagnóstico. Típicamente, la existencia de un analito de interés se indica por la presencia o ausencia de un "marcador" observable unido a uno o más de los agentes de unión específica a analito.

La sensibilidad de los ensayos está limitada en gran medida por fenómenos de unión inespecífica. Por tanto, la principal dificultad es concebir una tecnología de ensayo que sea muy sensible y que, al mismo tiempo, no sufra intrínsecamente de una señal de fondo alta, por ejemplo, causada por el fluido de muestra que se somete a prueba. La unión inespecífica da lugar, típicamente, a una señal de fondo incrementada, a una detección inexacta y a un límite de detección más alto (peor). En particular, la unión inespecífica es incluso más problemática cuando se usan matrices biológicas complejas tales como muestras de plasma o suero humano como fluidos de muestra.

En los últimos años se han desarrollado ensayos más exactos y sensibles que se basan en el uso de micropartículas (por ejemplo, superparamagnéticas). Especialmente en dichos ensayos basados en partículas, las importantes contribuciones a señales inespecíficas provienen de interacciones de partícula-partícula y/o de interacciones de partícula-superficie.

El documento US 5.212.063 divulga un procedimiento para la detección de analitos en líquidos corporales que contienen biotina libre mediante inmunoanálisis que hace uso de conjugados de biotina. El documento menciona micropartículas de polímero que consisten en un centro y que contienen un polímero que tiene una pluralidad de sitios de unión para biotina y, como recubrimiento, al menos una capa de proteína.

El documento WO 2013/001447 describe una micropartícula prerrecubierta que tiene un recubrimiento que comprende una estructura de cubierta, en la que dicha estructura de cubierta comprende una primera capa que comprende una o más moléculas de afinidad (es decir, un agente de unión específica a analito) y, además, una segunda capa que se acopla a la primera capa, y en la que dicha primera y segunda capa comprenden moléculas espaciadoras no afines que forman una malla, en la que dicha una o más moléculas de afinidad se incrustan dentro de la estructura de recubrimiento y en la que dicha malla genera un impedimento estérico para moléculas inespecíficas. Usando dichas micropartículas especialmente tratadas/recubiertas, el fondo causado por la unión inespecífica se podría reducir. Sin embargo, incluso los ensayos más avanzados todavía presentan niveles significativos de unión inespecífica que afectan al límite de detección (LDD) inferior, al intervalo de medición o a ambos. Los desarrolladores de pruebas a menudo tienen que alcanzar un compromiso entre la sensibilidad del ensayo, el intervalo de medición y la especificidad del ensayo. Al mismo tiempo, las pruebas tienen que ser rápidas, sensibles, cuantitativas, exactas e incluso rentables. Además, la plataforma en la que se va a realizar la prueba debe ser fácil de usar y fiable.

Otro desafío para los procedimientos de diagnóstico in vitro es el hecho de que un analito existe en más de una forma o variación. Dado que determinados analitos aparecen como diferentes variantes, como diferentes mutantes, isoformas, diferentes genotipos y/o diferentes serotipos, el diseño del ensayo de diagnóstico in vitro a menudo requiere más de un agente de unión específica a analito para garantizar una sensibilidad suficiente del ensayo. Normalmente, un componente de captura tiene una mayor afinidad hacia una determinada variante del analito que el otro o más componentes de captura. En particular, en el entorno del diagnóstico de enfermedades infecciosas, normalmente se tienen que detectar todas las variantes de un analito para cumplir con el grado de sensibilidad requerido.

Además, siempre existe un deseo de mejorar los ensayos incrementando la proporción de la señal frente al ruido de fondo y, por lo tanto, la sensibilidad del ensayo. Incrementar la señal de un ensayo también tiene varias ventajas instrumentales, que incluyen: i) se requieren sistemas de detección menos sensibles (y menos costosos); ii) se requieren cantidades más pequeñas de muestras valiosas; iii) el instrumental se puede miniaturizar para permitir instrumentos que sean más pequeños y/o dispositivos que ejecuten muchos ensayos simultáneamente en un área pequeña.

Sin embargo, especialmente en ensayos basados en partículas, las contribuciones importantes a las señales inespecíficas provienen de interacciones de partícula-partícula e interacciones de partícula-superficie.

Por tanto, existe la necesidad de diseñar estructuras y procedimientos novedosos para procedimientos de ensayo basados en partículas mejorados, en particular para procedimientos de ensayo que detectan un analito que aparece en diferentes variaciones. Existe una gran necesidad de evitar la unión inespecífica a micropartículas y su agrupamiento, que es un factor limitante en un gran número de ensayos de detección.

Se ha descubierto ahora sorprendentemente que las moléculas conectoras que comprenden entre 12 y 30 unidades de polietilenglicol, unidas por una parte a un miembro de un par de unión y por otra parte a un agente de unión específica a analito, se pueden usar con gran ventaja en un ensayo de unión basado en micropartículas, en el que las micropartículas se recubren con el otro miembro del par de unión. Además, se ha descubierto inesperadamente que estos compuestos, en comparación con las estructuras conectoras cortas descritas en la técnica anterior, proporcionan una sensibilidad de ensayo superior cuando se usan al menos dos agentes de unión específica a analito que se unen a las moléculas conectoras anteriores, proporcionando de este modo una detección sensible y fiable de analitos, en particular en el área de enfermedades infecciosas.

El documento WO 2017/029346, publicado después de la presentación de la solicitud n.° EP 17154294.7, prioridad que se reivindica para la presente solicitud de patente, divulga un procedimiento para detectar un analito en un ensayo basado en micropartículas que usa moléculas conectoras que comprenden entre 12 y 30 unidades de polietilenglicol que conectan un agente de unión específica a analito a un compañero de un par de unión (tal como, por ejemplo, biotina). Las micropartículas se recubren con el otro compañero del par de unión, tal como, por ejemplo, estreptavidina. El documento WO 2017/029346 describe el concepto general de aplicar estos conectores de PEG, pero no detalla el número de agentes de unión específica que se requieren para detectar con alta sensibilidad analitos que existen en más de una forma o variación.

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

Se divulga un procedimiento para la medición de un analito en un ensayo de unión específica a analito basado en micropartículas, en el que dichas micropartículas se recubren con el primer compañero de un par de unión, comprendiendo el procedimiento a) mezclar las micropartículas recubiertas, al menos dos agentes de unión específica a analito, en el que cada uno de dichos agentes de unión específica a analito se une al segundo compañero del par de unión, y una muestra que se sospecha que comprende o que comprende el analito, en el que dicho segundo compañero del par de unión se une a dichos agentes de unión específica a analito por medio de un conector que comprende de 12 a 30 unidades de etilenglicol (PEG 12 a 30), uniendo de este modo el analito por medio de los agentes de unión específica a analito a las micropartículas recubiertas, b) separar de la mezcla las micropartículas que comprenden el analito unido por medio del par de unión y los agentes de unión específica a analito y c) medir el analito unido a las micropartículas. También se divulga dicho procedimiento para la medición de un analito que aparece en varias variantes.

También se divulga un kit que comprende, en recipientes separados o en compartimentos separados de una unidad de recipiente único, al menos micropartículas recubiertas con el primer miembro de un par de unión y al menos dos agentes de unión específica a analito unidos al segundo miembro de este par de unión, en el que dicho segundo miembro de dicho par de unión se une a dichos agentes de unión específica a analito por medio de un conector que comprende de 12 a 30 unidades de etilenglicol (PEG 12 a 30).

Divulgación detallada de la invención

En un modo de realización, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para la medición de un analito en un ensayo de unión específica a analito basado en micropartículas, en el que dichas micropartículas se recubren con el primer compañero de un par de unión, comprendiendo el procedimiento a) mezclar las micropartículas recubiertas, al menos dos agentes de unión específica a analito unidos al segundo compañero del par de unión, y una muestra que se sospecha que comprende o que comprende el analito, en el que dicho segundo compañero del par de unión se une a dichos agentes de unión específica a analito por medio de un conector que comprende de 12 a 30 unidades de etilenglicol (PEG 12 a 30), uniendo de este modo el analito por medio de los agentes de unión específica a analito a las micropartículas recubiertas, b) separar de la mezcla las micropartículas que comprenden el analito unido por medio del par de unión y los agente de unión específica a analito y c) medir el analito unido a las micropartículas.

Los ensayos de unión específica a analito basados en partículas se usan ampliamente en, por ejemplo, determinados ensayos nefelométricos, determinados ensayos de aglutinación en látex y muchos ensayos sensibles de tipo sándwich que emplean una amplia variedad de técnicas de marcaje o detección.

Una "partícula", como se usa en el presente documento, significa un objeto pequeño y localizado al que se le puede atribuir una propiedad física tal como volumen, masa o tamaño promedio. En consecuencia, las micropartículas pueden ser de conformación simétrica, globular, esencialmente globular o esférica, o pueden tener una forma o conformación irregular y asimétrica. El tamaño de una partícula prevista por la presente invención puede variar. En un modo de realización usado, son de conformación globular, por ejemplo, micropartículas con un diámetro en el intervalo de nanómetros y micrómetros. En un modo de realización, las micropartículas usadas en un procedimiento de acuerdo con la presente divulgación tienen un diámetro de 50 nanómetros a 20 micrómetros. En otro modo de realización, las micropartículas tienen un diámetro de entre 100 nm y 10 pm. En un modo de realización, las micropartículas usadas en un procedimiento de acuerdo con la presente divulgación tienen un diámetro de 200 nm a 5 pm o de 750 nm a 5 pm.

Las micropartículas como se definen anteriormente en el presente documento pueden comprender o consistir en cualquier material adecuado conocido por el experto en la técnica, por ejemplo, pueden comprender o consistir en o consistir esencialmente en material orgánico o inorgánico. Típicamente, pueden comprender o consistir en o consistir esencialmente en metal o una aleación de metales, o un material orgánico, o comprender o consistir en o consistir esencialmente en elementos glucídicos. Los ejemplos de material previsto para micropartículas incluyen agarosa, poliestireno, látex, poli(alcohol vinílico), sílice y metales ferromagnéticos, aleaciones o materiales de composición. En un modo de realización, las micropartículas son metales magnéticos o ferromagnéticos, aleaciones o composiciones. En otros modos de realización, el material puede tener propiedades específicas y, por ejemplo, ser hidrófobo o hidrófilo. Dichas micropartículas se dispersan típicamente en soluciones acuosas y retienen una pequeña carga superficial negativa que mantiene las micropartículas separadas y evita su agrupación inespecífica.

En un modo de realización de la presente invención, las micropartículas son micropartículas paramagnéticas y la separación de dichas partículas en el procedimiento de medición de acuerdo con la presente divulgación se facilita mediante fuerzas magnéticas. Se aplican fuerzas magnéticas para extraer las partículas paramagnéticas o magnéticas de la solución/suspensión y para retenerlas según se desee, mientras que el líquido de la solución/suspensión se puede eliminar y las partículas, por ejemplo, se pueden lavar.

Las micropartículas usadas en un procedimiento de acuerdo con la presente invención se recubren con el primer miembro de un par de unión específica.

Un "par de unión", como se usa en el presente documento, consiste en dos compañeros que se unen entre sí con alta afinidad, es decir, con una afinidad nanomolar o mejor. Los modos de realización para los pares de unión son, por ejemplo, los pares de unión que consisten en receptor y ligando, hapteno y anticuerpo antihapteno, y pares de unión basados en los pares de unión de alta afinidad naturales.

Un ejemplo de un par de unión de receptor-ligando es un par que consiste en un receptor de hormona esteroidea y la hormona esteroidea correspondiente.

Un tipo de par de unión que es adecuado para el procedimiento de acuerdo con la presente invención es un par de unión de hapteno y anticuerpo antihapteno. Un hapteno es una molécula orgánica con un peso molecular de 100 a 2000 dalton, preferentemente de 150 a 1000 dalton. Dicha molécula pequeña se puede volver inmunógena al acoplarla a una molécula transportadora y se pueden generar anticuerpos antihapteno de acuerdo con procedimientos estándar. El hapteno se puede seleccionar del grupo que comprende esteroles, ácidos biliares, hormonas sexuales, corticoesteroides, cardenólidos, glucósidos cardenólidos, bufadienólidos, sapogeninas esteroideas y alcaloides esteroideos, cardenólidos y glucósidos cardenólidos. Los representantes de estas clases de sustancias son digoxigenina, digitoxigenina, gitoxigenina, estrofantidina, digoxina, digitoxina, ditoxina y estrofantina. Otro hapteno adecuado es, por ejemplo, fluoresceína.

Los ejemplos de pares de unión basados en pares de unión de alta afinidad naturales son biotina o análogos de biotina, tales como aminobiotina, iminobiotina o destiobiotina, y avidina o estreptavidina, así como el par de unión de FimG y DsF. El par de unión biotina-(estrept)avidina es bien conocido en la técnica. Los principios básicos del par de unión FimG-DsF se describen, por ejemplo, en el documento WO 2012/028697.

En un modo de realización, los pares de unión se seleccionan de hapteno y anticuerpo antihapteno, biotina o análogos de biotina tales como aminobiotina, iminobiotina o destiobiotina y avidina o estreptavidina, FimG y DsF, y receptor y ligando.

En un modo de realización, los pares de unión se seleccionan de hapteno y anticuerpo antihapteno, y biotina o análogos de biotina tales como aminobiotina, iminobiotina o destiobiotina/avidina o estreptavidina, FimG y DsF.

En un modo de realización, el par de unión es biotina (o análogos de biotina tales como aminobiotina, iminobiotina o destiobiotina) y avidina o estreptavidina.

En un modo de realización, el par de unión consiste en biotina y estreptavidina.

En un modo de realización, el par de unión de acuerdo con la presente invención consiste en un primer compañero de dicho par de unión que tiene un peso molecular de 10 kDa o más y de un segundo compañero de dicho par de unión que tiene un peso molecular de 1 kDa o menos. Como se indica anteriormente, el primer compañero de un par de unión, en un modo de realización que tiene un peso molecular de 10 kDa o más, se une a (recubre) las micropartículas usadas en un procedimiento de acuerdo con la presente divulgación.

En un modo de realización, en el procedimiento basado en micropartículas de acuerdo con la presente divulgación, dicho primer compañero del par de unión se selecciona de avidina y/o estreptavidina, y FimG, respectivamente, y en el que dicho segundo compañero del par de unión se selecciona de biotina o análogos de biotina tales como aminobiotina, iminobiotina o destiobiotina y DsF, respectivamente.

En un modo de realización, en el procedimiento basado en micropartículas de acuerdo con la presente divulgación, dicho primer compañero del par de unión es avidina y/o estreptavidina y en el que dicho segundo compañero del par de unión es biotina.

Las micropartículas usadas en un procedimiento de acuerdo con la presente invención se "recubren" con el primer compañero de un par de unión. Dicho recubrimiento se realiza de acuerdo con procedimientos del estado de la técnica. El primer compañero del par de unión se puede unir a la superficie de la partícula por adsorción, por unión covalente o una combinación de ambos procedimientos. Opcionalmente, las micropartículas se pueden incubar además, por ejemplo, con proteínas, como seroalbúmina bovina, para reducir la unión inespecífica de otros componentes del ensayo. El experto en la técnica es plenamente consciente de los procedimientos usados para dicho bloqueo opcional de la unión inespecífica. De acuerdo con la terminología usada en la técnica, dichas micropartículas recubiertas y bloqueadas también se denominan simplemente micropartículas recubiertas.

Las moléculas del primer compañero del par de unión están presentes en la micropartícula en estrecha proximidad, lo que proporciona muchos sitios de unión cercanos para el segundo compañero de este par de unión. Para las aplicaciones más prácticas/rutinarias, el primer compañero del par de unión se aplica como recubrimiento de las micropartículas a una concentración de saturación, lo que da como resultado una densidad de recubrimiento óptima. Como los expertos en la técnica aprecian, la densidad de recubrimiento, si se desea, se podría reducir usando concentraciones subóptimas del primer compañero de un par de unión. En caso de que se usara para el recubrimiento una concentración subóptima del primer compañero de un par de unión, el experto en la técnica elegiría la densidad de recubrimiento promedio para que se ajuste a la longitud del conector usado para la unión del agente de unión específica a analito al segundo compañero del par de unión. En términos generales: La distancia promedio entre las moléculas de un primer compañero de un par de unión en una micropartícula recubierta será, como máximo, el doble de la longitud del conector usado para unir el agente de unión específica a analito al segundo compañero del par de unión. La distancia según el presente documento es desde el centro de una molécula al centro de otra molécula. Como ejemplo: la longitud promedio de una unidad de polietilenglicol es de aproximadamente 0,38 nm. Por tanto, un conector con 12 unidades de PEG tiene aproximadamente 4,5 nm de longitud. Para permitir que las moléculas del segundo compañero de un par de unión se unan a los primeros compañeros de dicho par de unión en la misma micropartícula, la distancia promedio entre las moléculas del primer compañero del par de unión en la partícula sería de 9 nm o menos. En un modo de realización, la distancia promedio de las moléculas del primer compañero de un par de unión es de 9 nm o menos. En un modo de realización, la distancia promedio de las moléculas del primer compañero de un par de unión es de 9 nm u 8 nm, respectivamente. En un modo de realización, se usan micropartículas que se han recubierto a una concentración de saturación de/con el primer compañero de un par de unión.

Un "analito" o "analito de interés" o "molécula diana" puede ser cualquier molécula que se pueda unir por un agente de unión específica a analito. En un modo de realización, un analito dentro del contexto de la presente invención es una molécula de ácido nucleico (ADN o ARN), un péptido, una proteína, una molécula de fármaco, una hormona o una vitamina. En un modo de realización, un analito dentro del contexto de la presente invención es un péptido, una proteína, una molécula de fármaco, una hormona o una vitamina.

En otro modo de realización, un analito comprende varias variantes, en un modo de realización, diferentes genotipos, isoenzimas, isoformas, serotipos o mutantes de un analito. En un modo de realización, un analito es un antígeno de un agente infeccioso. Los ejemplos de agentes infecciosos son virus, bacterias y patógenos protozoicos que infectan a los seres humanos. En un modo de realización, un analito es un antígeno vírico, en un modo de realización, un antígeno del virus de la hepatitis o un antígeno de retrovirus humano. En un modo de realización, un analito es un antígeno del virus de la hepatitis C o del virus de la hepatitis B o del VIH.

Aún en otro modo de realización, un analito es el antígeno central, NS3 o NS4 del virus de la hepatitis C. En un modo de realización, un analito es un antígeno presente en SEQ ID NO:1 que muestra la secuencia de aminoácidos completa del antígeno central del virus de la hepatitis C, genotipo 1a. En un modo de realización, un analito tiene la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:1 que muestra la secuencia de aminoácidos del virus de la hepatitis C genotipo 1a (aislado 1), también accesible por medio de la base de datos UniProt, n.° de acceso P26664. En un modo de realización, un analito es una secuencia parcial de SEQ ID NO:1, en un modo de realización, una secuencia parcial de al menos 10 aminoácidos consecutivos, en un modo de realización, de al menos 20 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO:1. Aún en otro modo de realización, un analito es una variante del antígeno mostrado en SEQ ID NO:1. Se han descrito variantes y genotipos del centro del VHC en la literatura, véase, por ejemplo, Choo et al., PNAS 88 (1991), pág. 2451-2455. En otro modo de realización, un analito tiene la secuencia de aminoácidos completa de una de la proteína central de los genotipos 1-7 del VHC o una secuencia parcial de la misma de al menos 20 residuos aminoacídicos. Los genotipos del VHC, su prevalencia y distribución global se han descrito bien y resumido en la técnica, por ejemplo, por Messina et al., Hepatology 201561 (1), pág. 77-87.

SEQ ID NO:1

MSTNPKPQKK NKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG

RRQPIPKARR PEGRTWAQPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSP RGSRPSWGPT DPRRRSRNLG KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV GAPLGGAARA LAHGVRVLED GVNYATGNLP GCSFSIFLLA

LLSCLTVPAS A

En un modo de realización, un analito es una variante de SEQ ID NO:1, en el que dicha variante comprende una secuencia parcial de al menos 10, en un modo de realización, de al menos 20 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO:1 y tiene un 90 % de identidad de secuencia sobre dicha secuencia parcial. Por ejemplo, en una secuencia parcial que comprende 50 aminoácidos, 45 aminoácidos son idénticos a SEQ ID NO:1 y 5 se han sustituido por otros aminoácidos. En un modo de realización, los residuos aminoacídicos sustituidos se han remplazado por intercambios conservadores, por ejemplo, remplazando valina por isoleucina o remplazando un aminoácido ácido por otro aminoácido ácido (ácido glutámico/ácido aspártico).

Se pueden usar muestras líquidas en un procedimiento para la detección in vitro específica de un analito en un procedimiento de acuerdo con la presente divulgación. Se puede saber que la muestra comprende el analito o se puede sospechar que comprende el analito. En un modo de realización, una muestra para diagnóstico in vitro usada en un procedimiento de acuerdo con la presente divulgación es un líquido corporal seleccionado de sangre completa, suero sanguíneo, plasma sanguíneo, líquido amniótico, orina o saliva. En un modo de realización, la muestra que se sospecha que comprende o que comprende el analito es suero, plasma o líquido amniótico. En un modo de realización, la muestra que se sospecha que comprende o que comprende el analito es suero o plasma.

El procedimiento para la medición de un analito de acuerdo con la presente divulgación hace uso de al menos dos agentes de unión específica a analito. El término "agente de unión específica a analito" se refiere a una molécula que se une específicamente al analito de interés.

La expresión "al menos dos agentes de unión específica a analito" se refiere a al menos dos moléculas, que se unen específicamente cada una al analito de interés, pero que tienen diferentes afinidades por el analito. En un modo de realización, dichos al menos dos agentes de unión específica a analito pueden ser dos anticuerpos diferentes, que reconocen cada uno un epítopo diferente en un analito. En un modo de realización, dichos epítopos son epítopos distintos, es decir, sus secuencias de aminoácidos o sus sitios de unión reconocidos no se solapan, de modo que los al menos dos anticuerpos no compiten en la unión a su epítopo respectivo, de modo que se puedan fijar o unir al analito en paralelo, al mismo tiempo. En caso de que un anticuerpo sea el analito de interés, al menos dos agentes de unión específica a analito son cada uno antígenos basados en un polipéptido. En ese caso, los antígenos difieren en su secuencia polipeptídica hasta tal punto que el anticuerpo analito se une a ambos de los al menos dos antígenos (actuando como agentes de unión específica a analito), pero con diferente afinidad. Las definiciones de un "agente de unión específica a analito" proporcionadas más adelante se aplican mutatis mutandis a cada uno de los "al menos dos agentes de unión específica a analito".

Un agente de unión específica a analito en el sentido de la presente divulgación comprende típicamente moléculas de unión o captura que se pueden unir a un analito (otros términos son analito de interés; molécula diana). En un modo de realización, el agente de unión específica a analito tiene al menos una afinidad de 107 l/mol por su molécula diana correspondiente, es decir, el analito. El agente de unión específica a analito, en otros modos de realización, tiene una afinidad de 108 l/mol o incluso de 109 l/mol por su molécula diana. En un modo de realización, la afinidad de un agente de unión específica a analito por su molécula diana es de al menos 1010 l/mol. Como el experto en la técnica apreciará, el término específico se usa para indicar que otras biomoléculas presentes en la muestra no se unen significativamente al agente de unión específico para el analito. En algunos modos de realización, el nivel de unión a una biomolécula distinta de la molécula diana da como resultado una afinidad de unión que es solo un 10 %, más preferentemente solo un 5 % de la afinidad de la molécula diana o menos. En un modo de realización, no se puede medir la afinidad de unión a otras moléculas distintas del analito. En un modo de realización, el agente de unión específica a analito cumplirá con los criterios mínimos anteriores tanto para la afinidad como para la especificidad.

En un modo de realización, el agente de unión específica a analito se selecciona del grupo que consiste en aptámeros, aptámeros peptídicos, proteínas, oligonucleótidos y polímeros de impresión molecular.

Un "aptámero", como se usa dentro del contexto de un agente de unión específica a analito, puede ser una molécula de ácido nucleico corta, por ejemplo, una molécula de ARN, ADN, APN, ANC, ANH, ANB o ANA o cualquier otro formato de ácido nucleico adecuado conocido por experto en la técnica, que se pueda unir a un analito.

Los aptámeros peptídicos son aptámeros que se pueden unir específicamente a proteína(s), polipéptido(s) o péptido(s) que comprenden una secuencia de aminoácidos específica. Típicamente, un aptámero peptídico tiene un bucle peptídico, que comprende, por ejemplo, de 10 a 20 aminoácidos. En el contexto de la presente divulgación, un aptámero peptídico se puede unir, en modos de realización específicos, en uno o ambos extremos a una estructura de andamiaje. La estructura de andamiaje puede ser cualquier molécula, preferentemente una proteína, por ejemplo, una proteína, que tenga buenas propiedades de solubilidad. Las moléculas de andamiaje adecuadas serían conocidas por el experto en la técnica. Los ejemplos de moléculas de andamiaje adecuadas se basan en la proteína bacteriana tiorredoxina A, y las chaperonas FkpA o SlyD, respectivamente. El bucle peptídico del aptámero se puede insertar preferentemente dentro de un sitio activo reductor de la molécula de andamiaje. De forma alternativa, la proteína A estafilocócica y dominios de la misma y derivados de estos dominios, tales como proteína Z o lipocalinas, se pueden usar como aptámeros peptídicos.

Los aptámeros de ácido nucleico o peptídicos se pueden generar de acuerdo con cualquier procedimiento adecuado conocido por el experto en la técnica, por ejemplo, por medio de PCR o enfoques de síntesis molecular o enfoques de doble híbrido de levaduras.

Un "péptido", como se usa dentro del contexto de un agente de unión específica a analito, puede comprender o, de forma alternativa, consistir en un tramo de 2 a 49 aminoácidos, derivados aminoacídicos o una mezcla de los mismos. El péptido puede ser lineal, ramificado, circular o una mezcla de los mismos. Un agente de unión específica a analito peptídico también se puede unir a una estructura de andamiaje como se define anteriormente en el presente documento.

Un "polipéptido" o "proteína", como se usa dentro del contexto de un agente de unión específica a analito, puede comprender o, de forma alternativa, consistir en un tramo de más de aproximadamente 50 aminoácidos, derivados aminoacídicos o una mezcla de los mismos. La proteína puede tener una forma lineal, ramificada y circular o estar compuesta de una mezcla de estas formas.

En un modo de realización, el agente de unión específica a un analito es un polipéptido de al menos 50 aminoácidos. Aunque en teoría no hay un límite superior para la longitud del polipéptido de un agente de unión específica a analito, en un modo de realización tendrá, como máximo, 10.000 aminoácidos.

Un "oligonucleótido", como se usa dentro del contexto de un agente de unión específica a analito, puede comprender o, de forma alternativa, consistir en un tramo de 10 a 120 nucleótidos, o de 12 a 60, o de 15 a 40 nucleótidos.

Un agente de unión específica a analito que sea un oligonucleótido puede ser una molécula de ARN o una molécula de ADN, o una mezcla de ambas.

El término "polímero de impresión molecular", como se usa en el presente documento, se refiere a un polímero que se formó en presencia de una molécula que se extrae posteriormente, dejando una cavidad complementaria (una impresión) detrás. Típicamente, un polímero de impresión molecular muestra una determinada afinidad química por la molécula original. Un polímero de impresión molecular puede estar compuesto de cualquier unidad polimérica adecuada conocida por el experto en la técnica. Las técnicas para su producción incluyen técnicas de polimerización tales como polimerización en masa, por precipitación, por emulsión, por suspensión, por dispersión, por gelación, por hinchamiento en múltiples etapas y procedimientos de impresión jerárquica.

Un "anticuerpo", como se usa en el contexto de un agente de unión específica a analito, se refiere a una molécula de inmunoglobulina y a una parte (fragmento) inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina, es decir, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que contienen un sitio de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente al analito. Las moléculas de inmunoglobulina usadas en un procedimiento de acuerdo con la presente invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de moléculas de inmunoglobulina. Los anticuerpos se pueden describir o especificar en términos del/de los epítopo(s) o parte(s) de un polipéptido que reconocen o al/a los que se unen específicamente. Los epítopos específicos y su interacción con anticuerpos serían conocidos por los expertos en la técnica.

El término "unión específica a analito", como se usa en el contexto de un anticuerpo, se refiere a la unión inmunoespecífica de un anticuerpo a un epítopo en el analito. El concepto de unión específica a analito de un anticuerpo por medio de su epítopo en un analito está completamente claro para el experto en la técnica.

El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos diferentes, y fragmentos de anticuerpo, siempre que presenten la actividad biológica deseada. Un anticuerpo, en el sentido de la presente divulgación, también puede formar parte de una molécula de fusión más grande, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo con otra u otras proteínas o péptidos.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con los usos de investigación, de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En algunos modos de realización, un anticuerpo se purifica a más de un 95 % en peso de anticuerpo y, en algunos modos de realización, a más de un 99 %, según se determina por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando, por ejemplo, tinción con azul de Coomassie o plata.

Los anticuerpos de la clase de inmunoglobulina G son normalmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se une a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, aunque el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de isotipos de inmunoglobulina diferentes. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V^l) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos aminoacídicos particulares forman una superficie de contacto entre los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada.

La "región variable" o el "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios aminoterminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada se puede denominar "VH". El dominio variable de la cadena ligera se puede denominar "VL". Estos dominios son, en general, las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de unión a antígeno.

El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas partes de los dominios variables difieren ampliamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente por todos los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables (HVR), en los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones estructurales (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera naturales comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina beta, conectadas por tres HVR, que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de lámina beta. Las HVR en cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad mediante las regiones FR y, con las HVR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos.

Se pueden asignar las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa ^{( k )}y lambda (A), basados en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Los anticuerpos usados en un procedimiento de acuerdo con la presente invención pueden ser de cualquier origen animal. En un modo de realización, los anticuerpos son anticuerpos humanos, murinos (por ejemplo, de ratón y rata), de burro, mono, conejo, cabra, cobaya, camello, caballo o pollo.

Dependiendo de las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) se pueden asignar a clases diferentes. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas humanas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG¹, IgG², IgG3, IgG4, IgA¹e IgA². Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, ó, £, ^yy M, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas y se describen en general en, por ejemplo, Abbas et al., Cellularand Mol. Immunology, 4.a ed. (W. B. Saunders, Co., 2000). Un anticuerpo puede formar parte de una molécula de fusión más grande, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo con otra u otras proteínas o péptidos.

La expresiones "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo inalterado" y "anticuerpo completo" se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente inalterada, no a fragmentos de anticuerpo como se define a continuación. Las expresiones se refieren en particular a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen una región Fc.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una parte de un anticuerpo inalterado, que comprende preferentemente la región de unión a antígeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')²y Fv; moléculas de anticuerpo monocatenarias; scFv, sc(Fv)²; diacuerpos; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento "Fc" residual, denominación que refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')²que tiene dos sitios de combinación con antígeno y todavía se puede reticular con el antígeno.

El fragmento Fab contiene los dominios variables de la cadena pesada y ligera y también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxílico del dominio CH1 de la cadena pesada, que incluyen una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para un Fab' en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes tienen un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')²se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También son conocidos otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión a antígeno completo. En un modo de realización, una especie de Fv bicatenario consiste en un dímero de un dominio variable de la cadena pesada y uno de la ligera en asociación estrecha y no covalente. En una especie de Fv monocatenario (scFv) se puede unir covalentemente un dominio variable de la cadena ligera y uno de la cadena pesada mediante un conector peptídico flexible, de modo que las cadenas ligera y pesada se puedan asociar en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie de Fv bicatenario (sc(Fv)²). Es en esta configuración en la que las tres HVR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Conjuntamente, las seis HVR confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres HVR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo los fragmentos un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Usar un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, fuerza el emparejamiento de los dominios con los dominios complementarios de otra cadena y crea dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Los diacuerpos se describen más detalladamente, por ejemplo, en el documento EP 404097; el documento WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Holliger etal, PNAS USA 90: 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones naturales, que pueden estar presentes en cantidades menores. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo no es una mezcla de distintos anticuerpos. En determinados modos de realización, dicho anticuerpo monoclonal incluye típicamente un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une a una diana, en el que la secuencia polipeptídica de unión a la diana se obtuvo mediante un procedimiento que incluye la selección de una única secuencia polipeptídica de unión a la diana entre una pluralidad de secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, el procedimiento de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de clones, tal como un grupo de clones de hibridoma, clones de fago o clones de ADN recombinante. Se debe entender que una secuencia de unión a la diana seleccionada se puede alterar además, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de unión a la diana, para mejorar su producción en un cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de unión a la diana alterada es también un anticuerpo monoclonal que se va a usar en la presente invención. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales son ventajosas al no estar típicamente contaminadas por otras inmunoglobulinas.

El modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiera la producción del anticuerpo por algún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden producir mediante una variedad de técnicas, que incluyen, por ejemplo, el procedimiento del hibridoma (por ejemplo, Kohler y Milstein., Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.a ed. 1988); Haemmerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.816.567), tecnologías de presentación en fagos (véase, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Sidhuet al., J. Mol. Biol.

338(2): 299-310 (2004); Leeet al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse,PNAS USA 101 (34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004), y tecnologías para producir anticuerpos humanos o similares a los humanos en animales que tienen partes o todos los locus o genes de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, el documento WO 1998/24893; el documento WO 1996/34096; el documento WO 1996/33735; el documento WO 1991/10741; Jakobovits et al., PNAS USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7: 33 (1993); las patentes de EE. UU. n.° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016; Markset al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger,Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol.13: 65-93 (1995).

Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 4.816.567 y Morrison et al., PNAS USA 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos incluyen anticuerpos PRIMATIZED® en los que la región de unión a antígeno del anticuerpo se obtiene de un anticuerpo producido, por ejemplo, por la inmunización de macacos con el antígeno de interés.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En un modo de realización, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la que los residuos de una HVR del receptor se remplazan por residuos de una HVR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos FR de la inmunoglobulina humana se remplazan por los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se pueden realizar para refinar más el rendimiento del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente comprenderá también al menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr.Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Véase también, por ejemplo, Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); y las patentes de EE. UU. n.° 6.982.321 y 7.087.409.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha preparado usando cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos como se divulga en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo colecciones de presentación en fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). También están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos los procedimientos descritos en Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Véase también van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Los anticuerpos humanos se pueden preparar administrando el antígeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir dichos anticuerpos en respuesta a la exposición antigénica, pero con locus endógenos que se han desactivado, por ejemplo, xenorratones inmunizados (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 6.075.181 y 6.150.584 con respecto a la tecnología XENOMOUSE™). Véase también, por ejemplo, Li et al. PNAS USA, 103:3557-3562 (2006) con respecto a anticuerpos humanos generados por medio de una tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos.

El término "región hipervariable", "HVR" o "HV", cuando se usa en el presente documento, se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son de secuencia hipervariable y/o forman bucles estructuralmente definidos. En general, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). En anticuerpos naturales, H3 y L3 presentan la mayor diversidad de las seis HVR, y se cree que H3 en particular desempeña un papel exclusivo al conferir una especificidad precisa a los anticuerpos. Véase, por ejemplo, Xu et al.Immunity 13:37-45 (2000); Johnson y Wu en Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). De hecho, los anticuerpos de camélido naturales que consisten solo en una cadena pesada son funcionales y estables en ausencia de cadena ligera. Véanse, por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993) y Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

Varias delimitaciones de HVR están en uso y se engloban en el presente documento. Las HVR que son regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de Kabat se basan en la variabilidad de secuencia y son las más comúnmente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Chothia se refiere, en cambio, a la localización de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las HVR de AbM representan un término medio entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y se usan en el programa informático de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las HVR de "contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los residuos de cada una de estas HVR se indican a continuación.

Bucle Kabat AbM Chothia Contacto

L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36

L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55

L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96

H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (numeración de Kabat)

H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (numeración de Chothia)

H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58

H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

Las HVR pueden comprender "HVR extendidas" como sigue: 24-36 o 24-34 (L1), 46-56 o 50-56 (L2) y 89-97 o 89-96 (L3) en el VL y 26-35 (H1), 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102, o 95-102 (H3) en el VH. Los residuos del dominio variable se numeran de acuerdo con Kabat et al., supra, para cada una de estas definiciones de HVR ampliadas.

La expresión "numeración de residuos del dominio variable según Kabat" o "numeración de posición de aminoácidos según Kabat", y las variaciones de la misma, se refieren al sistema de numeración usado para dominios variables de la cadena pesada o dominios variables de la cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., supra. Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento de o inserción en una FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir un inserto de un solo aminoácido (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 de FR de la cadena pesada. La numeración de residuos de Kabat se puede determinar para un anticuerpo dado por alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada según Kabat "estándar".

En un modo de realización, los al menos dos agentes de unión específica a antígeno son anticuerpos que se unen a un epítopo del analito. Un epítopo es la parte de un antígeno que se une específicamente por un anticuerpo. Los epítopos pueden ser lineales (aminoácidos contiguos o adyacentes en una cadena polipeptídica) o bien conformacionales (estructura polipeptídica tridimensional que interactúa con el parátopo/sitio de unión a antígeno del anticuerpo). En un modo de realización, dichos epítopos son epítopos distintos, es decir, sus secuencias de aminoácidos o sus sitios de unión reconocidos no se solapan, de modo que los al menos dos anticuerpos no compiten en la unión a su epítopo respectivo, de modo que se puedan fijar o unir al analito en paralelo, al mismo tiempo. En un modo de realización de la invención, los al menos dos agentes de unión específica a antígeno vírico son anticuerpos, de los que uno de ellos se une a un epítopo dentro de las posiciones aminoacídicas 140 a 172, en un modo de realización, dentro de las posiciones aminoacídicas 157-169 de SEQ ID NO:1 y de los que uno de ellos se une a un epítopo dentro de las posiciones aminoacídicos 20 a 80, en un modo de realización, dentro de las posiciones aminoacídicas 65-71, en un modo de realización, dentro de las posiciones aminoacídicas 32-36, en un modo de realización, dentro de las posiciones aminoacídicas 37-46 de SEQ ID NO:1.

Como se divulga en el presente documento, el segundo compañero del par de unión se une al agente de unión específica a analito por medio de un conector que comprende de 12 a 30 unidades de etilenglicol (PEG 12 a 30).

El término "conector" indica un resto bifuncional o multifuncional que se puede usar para conjugar (enlazar) un primer resto con un segundo resto o más restos. Se pueden preparar convenientemente conjugados que comprenden un primer y un segundo resto unidos entre sí usando un conector que tiene dos funcionalidades reactivas. En dicho conjugado, los dos restos se unen "por medio de" este conector. Como es obvio para el experto en la técnica, en dicho conjugado, los restos funcionales del conector están presentes como parte de un enlace y no como un resto funcional sin reaccionar.

Se cree que el conector que comprende de 12 a 30 unidades de etilenglicol es clave para los hallazgos sorprendentes divulgados en el presente documento. En la técnica anterior en ensayos basados en micropartículas para la medición de un analito solo se consideran seriamente las moléculas conectoras cortas que contienen PEG. El documento US 5.521.319 divulga un reactivo novedoso que demostró ser muy útil para la biotinilación de biomoléculas. Se enseña que la longitud del conector es corta, es decir, hasta 5 unidades de óxido de etileno, preferentemente de solo 1 a 3 unidades de óxido de etileno y lo más preferente de dos de dichas unidades. Contrariamente a esta enseñanza, ahora se ha descubierto sorprendentemente que, en un ensayo de unión específica a analito basado en micropartículas, las moléculas conectoras largas, que comprenden entre 12 y 30 unidades de óxido de etileno (= PEG 12 a 30), son ventajosas si se usan para acoplar el segundo miembro de un par de unión, por ejemplo, una biotina, al agente específico de analito.

Un reactivo apropiado para unir o acoplar biotina por medio de un conector de PEG a una molécula diana es, por ejemplo, un reactivo de acuerdo con la fórmula I

Los procedimientos de la invención se pueden construir en una amplia variedad de formatos. Dichos formatos incluyen formatos conocidos en la técnica, tales como ensayos de tipo sándwich (véanse, por ejemplo, las siguientes referencias: Nonradioactive Labeling and Detection of Molecules, Kessler, C., ed., Springer-Verlag: Berlín 1992; The Immunoassay Handbook, Wild, D., ed., Stackton Press: Nueva York 1994; Keller, G.H. y Manak, M.M. DNA Probes, 2.a Ed., MacMillan Publishers Ltd.: Londres, 1993; Tietz Textbook of Clinical Chemistry 2.a edición, Burtis et al. Ed., W.B. Saunders and Co.: Filadelfia, 1994).

En un procedimiento de acuerdo con la presente divulgación se mide un analito. Como el experto en la técnica apreciará fácilmente, la medición del analito unido a las micropartículas se realiza normalmente mediante la medición de una señal transportada o generada por un marcador en un componente de ensayo apropiado y calculando la concentración del analito a partir de una curva de calibración para el analito, es decir, midiendo de este modo el analito. El componente de ensayo al que normalmente se une un marcador es otro agente de unión específica a analito (ensayos de tipo sándwich). Antes de medir el marcador, las micropartículas que comprenden parte del componente de ensayo marcado se separan de la parte del componente de ensayo marcado que no está unido a las micropartículas.

En un modo de realización, los procedimientos de la presente divulgación se practican en un formato de ensayo de tipo sándwich.

Un formato de ensayo de tipo sándwich típico incluye mezclar una micropartícula recubierta con el primer compañero de un par de unión, al menos dos agentes de unión específica a analito, cada uno unido al segundo compañero del par de unión, una muestra que se sospecha que comprende o que comprende el analito, en el que dicho segundo compañero del par de unión se une a cada uno de dichos agentes de unión específica a analito por medio de un conector que comprende de 12 a 30 unidades de etilenglicol (PEG 12 a 30), y otro agente de unión específica a analito que está marcado de manera detectable. Como es obvio para el experto en la técnica, estos componentes se mezclan e incuban durante un periodo de tiempo suficiente para unir el agente de unión específica a analito marcado de manera detectable por medio del analito, los agentes de unión específica a analito (unidos a) el segundo compañero del par de unión y el primer compañero del par de unión a las micropartículas. En un modo de realización, un ensayo de tipo sándwich sin etapa de lavado, dicha mezcla/incubación se realiza en un solo recipiente de reacción. La secuencia de adición y mezcla de los cuatro ingredientes (micropartículas recubiertas, muestra, agentes de unión específica a analito cada uno unido al segundo compañero del par de unión y agente de unión específica a analito marcado de manera detectable, respectivamente) no es crucial. En un modo de realización, un ensayo de tipo sándwich con una etapa de lavado, la adición y mezcla de micropartículas recubiertas con el primer miembro de un par de unión, la muestra y el agente de unión específica a analito unido al segundo compañero del par de unión se realizan en un solo recipiente de reacción. Después de esta primera etapa (captura de analito), se lavan las micropartículas a las que ahora está unido el analito antes de añadir el agente de unión específica a analito marcado de manera detectable. La secuencia de adición y mezcla de los tres primeros ingredientes (micropartículas recubiertas, muestra y agente de unión específica a analito unido al segundo compañero del par de unión, respectivamente) no es crucial.

En un formato de ensayo de tipo sándwich en un modo de realización, los al menos dos agentes de unión específica a analito, cada uno unido al segundo compañero del par de unión y el agente de unión específica a analito marcado de manera detectable, respectivamente, se unen cada uno al analito en epítopos diferentes y no superponibles.

Los procedimientos para marcar un agente de unión específica a analito o un analito son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen abundantemente, por ejemplo, en Haugland (2003) Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley (1992) Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labeling: A Practical Approach, Academic Press, Londres; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al. Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work y E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., Nueva York; Lundblad, R. L. y Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I y II, CRC Press, Nueva York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGruyter, Berlín y Nueva York; y Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.); DeLeon-Rodriguez et al., Chem. Eur. J. 10 (2004) 1149-1155; Lewis et al., Bioconjugate Chem. 12 (2001) 320-324; Li et al., Bioconjugate Chem. 13 (2002) 110-115; Mier et al. Bioconjugate Chem. 16 (2005) 240-237.

El término marcado de forma detectable engloba marcadores que se pueden detectar directa o indirectamente.

Marcado indirectamente de forma detectable se refiere, por ejemplo, al marcaje con un hapteno y a la detección de dicho compuesto haptenilado por un anticuerpo antihapteno que porta un marcador directamente detectable o al marcaje con una enzima y a la detección de dicha enzima por su actividad enzimática correspondiente que da como resultado la conversión de un sustrato de tinción apropiado. Se encuentran disponibles o se divulgan diversos marcadores enzimáticos de sustrato (véase, por ejemplo, el documento US 4.275.149). En general, la enzima cataliza una alteración química de un sustrato cromógeno que se puede medir usando diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que se puede medir espectrofotométricamente. De forma alternativa, la enzima puede alterar la fluorescencia o la quimioluminiscencia del sustrato. El sustrato quimioluminiscente se excita electrónicamente por una reacción química y puede a continuación emitir luz que se puede medir (usando un quimioluminómetro, por ejemplo) o dona energía a un aceptador fluorescente. Los ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; documento US 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalacindionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP), p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tal como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Las técnicas para conjugar enzimas con polipéptidos se describen en O'Sullivan et al. "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", en Methods in Enzym. (ed. por J. Langone e IT Van Vunakis), Academic Press, Nueva York, 73 (1981) 147-166.

Los ejemplos de combinaciones enzima-sustrato (documento US 4.275.149; documento US 4.318.980) incluyen, por ejemplo: peroxidasa de rábano picante (HRP) con hidrógeno peroxidasa como sustrato, en la que la hidrógeno peroxidasa oxida un precursor de tinte (por ejemplo, ortofenilendiamina (OPD) o clorhidrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB)); fosfatasa alcalina (AP) con fosfato de para-nitrofenilo como sustrato cromógeno; y p-D-galactosidasa (p-D-Gal) con un sustrato cromógeno (por ejemplo, p-nitro-fenil-p-D-galactosidasa) o sustrato fluorógeno 4-metilumbeliferil-p-D-galactosidasa.

Los marcadores directamente detectables proporcionan una señal detectable o interactúan con un segundo marcador para modificar la señal detectable proporcionada por el primero o el segundo marcador, por ejemplo, para dar FRET (transferencia de energía fluorescente por resonancia). Marcadores tales como tintes fluorescentes y tintes luminiscentes (incluyendo quimioluminiscentes y electroquimioluminiscentes) (Briggs et al. "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids", J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1 (1997) 1051-1058) proporcionan una señal detectable y son aplicables, en general, para el marcaje. En un modo de realización, marcado de forma detectable se refiere a un marcador que proporciona o inducible para que proporcione una señal detectable, es decir, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente o un marcador electroquimioluminiscente, respectivamente.

En un modo de realización de acuerdo con la presente divulgación, el ensayo de unión específica a analito basado en micropartículas hace uso de un marcador quimioluminiscente o electroquimioluminiscente y un sistema de detección de luz correspondiente. La luz producida por el marcador se mide e indica directa o indirectamente la presencia o la cantidad del analito.

Los ensayos de electroquimioluminiscencia (ECL) proporcionan una medición sensible y precisa de la presencia y concentración de un analito de interés. Dichas técnicas usan marcadores u otros reactantes en los que se puede inducir luminiscencia cuando se oxidan o reducen electroquímicamente en un entorno químico apropiado. Dicha electroquimioluminiscencia se activa por una tensión impuesta sobre un electrodo de trabajo en un momento particular y de una manera particular. La luz producida por el marcador se mide e indica la presencia o la cantidad del analito.

Para una descripción más completa de dichas técnicas de ECL, se hace referencia a la patente de EE. UU. n.° 5.221.605, la patente de EE. UU. n.° 5.591.581, la patente de EE. UU. n.° 5.597.910, la solicitud publicada PCT WO90/05296, la solicitud publicada PCT WO92/14139, la solicitud publicada PCT WO90/05301, la solicitud publicada PCT WO96/24690, la solicitud publicada PCT US95/03190, la solicitud PCT US97/16942, la solicitud publicada PCT US96/06763, la solicitud publicada PCT WO95/08644, la solicitud publicada PCT WO96/06946, la solicitud publicada PCT WO96/33411, la solicitud publicada PCT WO87/06706, la solicitud publicada PCT WO96/39534, la solicitud publicada PCT WO96/41175, la solicitud publicada PCT WO96/40978, el documento PCT/US97/03653 y la solicitud de patente de EE. UU. 08/437.348 (patente de EE. UU. n.° 5.679.519). También se hace referencia a una revisión de 1994 de las aplicaciones analíticas de ECL por Knight, et al. (Analyst, 1994, 119: 879-890) y las referencias citadas en la misma. En un modo de realización, el procedimiento de acuerdo con la presente descripción se practica usando un marcador electroquimioluminiscente.

Como se menciona anteriormente, la electroquimioluminiscencia se activa por una tensión impuesta en un electrodo de trabajo en un momento particular y de una manera particular. Lo que no se menciona en detalle en la técnica anterior es el hecho de que la distribución de micropartículas en el electrodo de trabajo tiene un impacto importante en la calidad de un ensayo. Cuantos más agregados haya presentes entre las micropartículas, como regla general, menor será la calidad de una o más características del ensayo. Las partículas agregadas a menudo dan lugar a un mayor coeficiente de variación entre mediciones, a señales de fondo más altas y/o a sensibilidad de ensayo reducida.

Como se puede imaginar fácilmente, el uso de al menos dos agentes de unión específica a analito, cada uno unido al segunda compañero del par de unión y que comprenden dos o más moléculas del segundo compañero de unión por cada molécula del agente de unión específica a analito puede fácilmente dar lugar a agregación de micropartículas recubiertas con (muchas moléculas de) el primer compañero del par de unión. Por lo tanto, en la técnica anterior se han hecho muchos intentos de producir conjugados que consisten en una molécula de agente de unión específica a analito y una molécula del segundo compañero del par de unión. Los procedimientos apropiados para obtener dichos conjugados 1:1 se describen, por ejemplo, en el documento US 6.391.571.

Uno de los enfoques recientes más importantes para el marcaje de proteínas específico de sitio, especialmente el monomarcaje de proteínas específico de sitio, consiste en incorporar funcionalidades bioortogonales a estas proteínas en sitios específicos por medio de reacciones enzimáticas. Para una revisión reciente sobre el "marcaje enzimático de proteínas", véase M. M. Rashidian et al., Bioconjugate Chemistry 24 (2013) 1277-1294. Las enzimas usadas para la conjugación específica de sitio que se trata en esta revisión incluyen la enzima generadora de formilglicina, sialiltransferasas, fosfopanteteiniltransferasas, modificación postraduccional con O-GlcNAc, transpeptidación mediada por sortasa ("sortagging"), transglutaminasa, farnesiltransferasa, biotina ligasa, ácido lipoico ligasa y ácido N-miristoiltransferasa.

Sorprendentemente, como se muestra a lo largo de la sección de ejemplos, los al menos dos agentes de unión específica a analito, cada uno unido a una única molécula del segundo compañero del par de unión por medio de un conector que comprende de 12 a 30 unidades de etilenglicol (PEG 12 a 30), por ejemplo, un anticuerpo monobiotinilado, dan lugar a un rendimiento de ensayo muy bueno, en particular con respecto a la sensibilidad del ensayo. Esto es muy importante en diversos campos de diagnóstico, tales como en el área de enfermedades infecciosas, donde las infecciones ser deben detectar de manera fiable en las etapas iniciales y posteriores después de la infección.

Además, el uso de al menos dos agentes de unión específica a analito, cada uno unido al segundo compañero del par de unión, en el que dicho segundo compañero del par de unión se une a cada uno de dichos agentes de unión específica a analito por medio de un conector que comprende de 12 a 30 unidades de etilenglicol (PEG 12 a 30), parece no requerir monobiotinilación o eliminación de conjugados de una estequiometría superior a 1:1 obtenida mediante el uso de la química de acoplamiento estándar. Como se esperaba, las preparaciones de conjugados que comprenden conjugados de estequiometría superior a 1:1 tienden a dar lugar a agregación en microesferas. Sin embargo, este efecto es mucho menos visible y pronunciado si el segundo compañero del par de unión se une a dicho agente de unión específica a analito por medio de un conector que comprende de 12 a 30 unidades de etilenglicol (PEG 12 a 30), incluso a una estequiometría superior a 1:1.

Una posible explicación podría ser que estos conectores de PEG relativamente largos y flexibles permiten la unión rápida de muchos de los segundos compañeros del par de unión a los sitios de unión del primer compañero de dicho par de unión presente y dentro del alcance de las micropartículas recubiertas. Por el contrario, los varios segundos compañeros de un par de unión en un agente de unión específica a analito pueden tener conectores demasiado cortos para que se unan a otro primer compañero de unión en la misma micropartícula y, en su lugar, tienden a encontrar un primer compañero de unión apropiado en una segunda micropartícula, promoviendo obviamente de este modo una tendencia a la agregación en microesferas.

Para evitar el "sobremarcaje" con el segundo compañero del par de unión, la química hasta ahora estándar debe usar una proporción relativamente baja del agente de unión específica a analito y del segundo miembro del par de unión. Para lograr una estequiometría 1:1 de una preparación de conjugado en promedio, el segundo compañero del par de unión (por ejemplo, biotina en un reactivo de biotinilación) se usa normalmente en un exceso de 1,3 veces con respecto al agente de unión específica a analito (por ejemplo, un anticuerpo). En dichas condiciones de acoplamiento de 1,3 a 1, la preparación de conjugado resultante comprende aproximadamente un 37 % de anticuerpo no conjugado; aproximadamente un 37 % de anticuerpo monobiotinilado, pero también un 18 %, un 6 % y un 2 % de anticuerpo con biotinilación doble, triple o más que triple, respectivamente. Normalmente, la fracción que representa el conjugado 1:1 se debe purificar para lograr resultados óptimos en un inmunoensayo comercial.

Por el contrario, si el segundo compañero del par de unión se une a dicho agente de unión específica a analito por medio de un conector que comprende de 12 a 30 unidades de etilenglicol (PEG 12 a 30), se puede usar la química de acoplamiento estándar, incluso con el segundo miembro del par de unión que se va a acoplar/unir en proporciones molares más altas, y sin que se requiera el aislamiento de la fracción que comprende los conjugados 1:1. Como es obvio, además del rendimiento de dichos conjugados en los procedimientos divulgados en el presente documento, esto es una tremenda ventaja en la producción de dichos conjugados.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un agente de unión específica conjugado unido al segundo compañero del par de unión comprendido en una composición, en el que en dicha composición la proporción molar promedio entre el segundo compañero del par de unión unido al agente de unión específica a analito es 1,1 o más.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un agente de unión específica conjugado unido al segundo compañero del par de unión comprendido en una composición, en el que en dicha composición la proporción molar promedio entre el segundo compañero del par de unión unido al agente de unión específica a analito es entre 1,1 y 10.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un agente de unión específica conjugado unido al segundo compañero del par de unión comprendido en una composición, en el que en dicha composición la proporción molar promedio entre el segundo compañero del par de unión unido al agente de unión específica a analito es entre 1,2 y 6.

En un modo de realización, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para la medición de un analito en un ensayo de unión específica a analito basado en micropartículas, en el que dichas micropartículas se recubren con el primer compañero de un par de unión, comprendiendo el procedimiento a) mezclar las micropartículas recubiertas, al menos dos agentes de unión específica a analito, cada uno unido al segundo compañero del par de unión, y una muestra que se sospecha que comprende o que comprende el analito, en el que dicho segundo compañero del par de unión se une a cada uno de dichos agentes de unión específica a analito por medio de un conector que comprende de 12 a 30 unidades de etilenglicol (PEG 12 a 30), uniendo de este modo el analito por medio de los al menos dos agentes de unión específica a analito a las micropartículas recubiertas y en el que dichos agente de unión específica conjugados, cada uno unido al segundo compañero del par de unión están comprendidos en una composición, en el que en dicha composición la proporción molar promedio entre el segundo compañero del par de unión unido al agente de unión específica a analito es 1,1 o más, b) separar de la mezcla las micropartículas que comprenden el analito unido por medio del par de unión y los agentes de unión específica a analito y c) medir el analito unido a las micropartículas.

En un modo de realización, la presente invención se refiere a un kit que comprende, en recipientes separados o en compartimentos separados de una unidad de recipiente único, al menos micropartículas recubiertas con un primer compañero de un par de unión y al menos dos agentes de unión específica a analito, cada uno unido al segundo compañero de dicho par de unión, en el que dicho segundo compañero del par de unión se une a cada uno de dichos agentes de unión específica a analito por medio de un conector que comprende de 12 a 30 unidades de etilenglicol (PEG 12 a 30).

El término unidad de recipiente único se refiere al hecho de que para muchos analizadores automáticos, como la serie de analizadores Elecsys® de Roche Diagnostics, los reactivos necesarios para medir un determinado analito se proporcionan en forma de un "paquete de reactivos", es decir, como una unidad de recipiente que se coloca en el analizador y que contiene en diferentes compartimentos todos los reactivos clave necesarios para la medición del analito de interés.

En un modo de realización, dicho primer compañero de un par de unión es avidina o estreptavidina, y dicho segundo compañero de dicho par de unión se selecciona de biotina o los análogos de biotina aminobiotina, iminobiotina o destiobiotina.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un kit que comprende, en recipientes separados o en compartimentos separados de una unidad de recipiente único, al menos micropartículas recubiertas con avidina o estreptavidina, y al menos dos agentes de unión específica a analito biotinilados, en el que dicha biotina se une a cada uno de dichos agentes de unión específica a analito por medio de un conector que comprende de 12 a 30 unidades de etilenglicol (PEG 12 a 30).

En un modo de realización, la invención se refiere a un kit como se especifica anteriormente, en el que dichos al menos dos agentes de unión específica a analito son agentes de unión específica a antígeno vírico, en un modo de realización, anticuerpos específicos de antígeno vírico. Aun en otro modo de realización de la presente invención, uno de dichos al menos dos agentes de unión específica a antígeno vírico es un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de las posiciones aminoacídicas 140 a 172 de SEQ ID NO:1, en un modo de realización, que se une dentro de las posiciones aminoacídicas 157-169 de SEQ ID NO:1 y uno de dichos al menos dos agentes de unión específica a antígeno vírico es un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de las posiciones aminoacídicas 20 a 80, en un modo de realización, dentro de las posiciones aminoacídicas 65-71, en un modo de realización, dentro de las posiciones aminoacídicas 32-36, en un modo de realización, dentro de las posiciones aminoacídicas 37-46 de SEQ ID NO:1.

En otro modo de realización de la invención, todos los modos de realización de un kit comprenden adicionalmente otro agente de unión específica a analito que está marcado de manera detectable. En otro modo de realización, dicho anticuerpo marcado se une a un epítopo en las posiciones aminoacídicas 100-120 de SEQ ID NO:1.

Las definiciones y explicaciones realizadas anteriormente también se aplican a todos los modos de realización descritos en la presente memoria descriptiva mutatis mutandis.

Los siguientes ejemplos, figuras y secuencias se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, de la que su verdadero alcance se expone en las reivindicaciones adjuntas. Se entiende que se pueden realizar modificaciones en los procedimientos expuestos sin apartarse del alcance de la invención.

Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para los propósitos de claridad de comprensión, no se deben interpretar las descripciones y ejemplos como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Procedimientos

Anticuerpos monoclonales

El antígeno central del VHC recombinante necesario para la inmunización de animales apropiados se obtuvo usando técnicas estándar conocidas en la técnica insertando un fragmento de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos del antígeno deseada en un plásmido de expresión de E. coli seguido de sobreexpresión y purificación de la proteína. Estos procedimientos de biología molecular estándar se describen, por ejemplo, en Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989.

Se prepararon anticuerpos monoclonales murinos o de conejo contra el centro del VHC mediante tecnología de hibridoma estándar o mediante técnicas de ácido nucleico recombinante, que son conocidas por el experto en la técnica y de una manera análoga descrita, por ejemplo, en el documento WO2016/091755, respectivamente.

Los anticuerpos monoclonales contra la proteína central del VHC usados como compuestos de captura en los ejemplos a continuación se unen a los epítopos aa 157-169 o aa 32-36 o aa 37-46 o aa 65-71 de la proteína central del VHC (SEQ ID NO:1). En el documento EP1308507 ya se han descrito epítopos muy similares y su determinación. Como compuesto de detección, se eligió un anticuerpo monoclonal que se podía unir al epítopo central aa 102-112, un epítopo relacionado con los epítopos también descritos en los documentos EP0967484 y EP1308507. Para la inmunización de ratones y conejos, se usaron las secuencias antigénicas centrales del VHC de genotipo 1a de acuerdo con el n.° de acc. de Genbank: P26664.3 GI: 130455 (SEQ ID NO:1), que divulga la poliproteína completa codificada por el genotipo 1 del VHC.

En particular, se usaron péptidos de los aminoácidos 110-171 como proteína de fusión recombinante con SlyD de Escherichia coli siguiendo el procedimiento divulgado en los documentos WO 03/000878 A2, US 2009/0291892 A1, WO 2013/107633 A1 o péptidos de los aminoácidos 2-169 como proteína recombinante siguiendo el procedimiento descrito por Boulant, S. et al., 2005, J. Virol. 79:11353-11365 para la inmunización. En un enfoque adicional, se usaron múltiples péptidos de los aminoácidos 82-117 o 9-48 acoplados a KLH (hemocianina de lapa californiana) para la inmunización de acuerdo con procedimientos conocidos.

Determinación de proteínas

La concentración de proteína de los polipéptidos purificados se determinó midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado a partir de la secuencia de aminoácidos del polipéptido o usando el procedimiento de BCA colorimétrico.

Ejemplo 2: Síntesis de reactivos de biotinilación activados

La síntesis de conectores que comprenden biotina activada del estado de la técnica (reactivos de biotinilación) como el conector ampliamente usado Biotina-DDS se divulga en el documento EP 632810.

Los reactivos de biotinilación Biotina-PEGn-NHS (n.° CAS 365441-71-0; n = número de unidades de óxido de etileno) se obtuvieron de IRIS Biotech GmbH o se sintetizaron internamente.

En la síntesis de novo, el control del número diferenciado de unidades de óxido de etileno se garantizó mediante el alargamiento gradual de PEG más cortos, tal como tetraetilenglicol, siguiendo el procedimiento descrito por Chen y Baker, J. Org. Chem. 1999, 64, 6840-6873.

En una primera etapa se ha obtenido bis-tritil-PEGn 1 (como es obvio, n representa el número de unidades de etilenglicol).

La desprotección de 1 se llevó a cabo agitando en HCl 1 M en dioxano durante 1 h a temperatura ambiente. Después de la evaporación, el residuo se sometió a reflujo en metanol hasta que se obtuvo una solución transparente y el matraz se mantuvo a 4 °C durante la noche. Después de la filtración, se extrajo la solución con hexano, se evaporó la capa metanólica y se secó para obtener el correspondiente PEGn-diol 2 como un aceite o cera (la consistencia depende de la longitud/número de unidades (n) del PEG).

A continuación, se llevó a cabo la introducción de la función ácida mediante la adición catalizada por sodio de PEGndiol a acrilato de tere-butilo de acuerdo con Seitz y Kunz, J. Org. Chem. 1997, 62, 813-826. De esta manera se obtiene el compuesto 3.

A una solución de HO-PEGn-COOtBu 3 (1 equivalente) y trietilamina (2,5 equivalentes) en cloruro de metileno se le añadió cloruro de metilsulfonilo (2 equivalentes) gota a gota a 0 °C. Después de agitar durante 1 h, siguió un tratamiento acuoso y evaporación.

Se hizo reaccionar directamente el mesilato 4 (1 equivalente) con NaN3 (2 equivalentes) por agitación en dimetilformamida a temperatura ambiente durante dos días. Después de la retirada de los sólidos y de la dimetilformamida, siguió un tratamiento acuoso con éter dietílico y Na²CO³.

El producto 5 en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice en acetato de etilo/metanol 15/1. Se realizó la reducción de la acida 5 (1 equivalente) agitando durante 24 h con trifenilfosfina (1,1 equivalentes) en tetrahidrofurano/agua 4/1 a temperatura ambiente. Después de la evaporación, se suspendió el residuo en agua y se lavó con acetato de etilo varias veces. Se evaporó la capa acuosa y se secó para obtener la amina 6 como un aceite incoloro.

Se llevó a cabo la escisión del éster tere-butílico con ácido trifluoroacético al 5 % en agua. Se obtuvo amino-PEGnácido 7 por evaporación con agua varias veces.

Se introdujo biotina por acoplamiento con el correspondiente éster de W-hidroxisuccinimida 8 (1,05 equivalentes) con trietilamina (4 equivalentes) en dimetilformamida a temperatura ambiente durante la noche.

Después de la evaporación, se purificó el producto 9 en bruto por RP-HPLC en acetonitrilo/agua.

Finalmente, se formó el éster de W-hidroxisuccinimida 10 por reacción con W-hidroxisuccinimida (1,1 equivalentes) y etildimetilaminopropilcarbodiimida (1,1 equivalentes) en cloruro de metileno. Después de completarse la reacción, se diluyó la mezcla de reacción con cloruro de metileno y se lavó con agua. La evaporación y el secado dieron lugar a Biotina-PEGn-NHS 10 puro como un aceite, cera o sólido, respectivamente, dependiendo del número de unidades de óxido de etileno.

Esquema 1 Síntesis de Biotina-PEG(n)-NHS

Ejemplo 3: Mareaje de anticuerpos

Acoplamiento de restos de biotina y rutenio, respectivamente, a los anticuerpos:

Los anticuerpos se obtuvieron y purificaron de acuerdo con procedimientos del estado de la técnica que son completamente consabidos por un experto en la técnica.

Antes del marcaje, el anticuerpo de detección se escindió con pepsina para obtener un fragmento F(ab')²y para eliminar el fragmento Fc propenso a interferencias (el procedimiento se describe por A. Johnstone y R. Thorpe en Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific 1987). El fragmento F(ab')²purificado se polimerizó además con el reticulante homobifuncional suberato de disuccinimidilo (DSS) y se aplicó a una cromatografía de filtración en gel en S400 para acumular el intervalo de tamaño óptimo del polímero F(ab')²(el principio se describe en el documento DE3640412).

Para la unión del marcador respectivo, en general, se seleccionaron como diana los grupos £-amino de lisina de los anticuerpos por compuestos activados con N-hidroxisuccinimida. A una concentración de proteínas de 10 mg/ml, se hicieron reaccionar los anticuerpos con reactivos de biotinilación activados con N-hidroxisuccinimida (Biotina-DDS o Biotina-PEG24-NHS) y reactivos de marcaje de rutenio activados con N-hidroxisuccinimida, respectivamente. La proporción de marcador/proteína del reactivo de biotinilación o de marcaje de rutenio fue 5-6:1 o 15:1, respectivamente. El tampón de reacción fue fosfato de potasio 50 mM (pH 8,5), KCl 150 mM. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 15 minutos y se detuvo añadiendo L-lisina hasta una concentración final de 10 mM. Para evitar la inactivación hidrolítica de los marcadores, las soluciones madre respectivas se prepararon en DMSO seco (Sigma-Aldrich, Alemania). Después de la reacción de acoplamiento, se retiró la biotina o marcador de rutenio libre sin reaccionar haciendo pasar el conjugado de anticuerpo en bruto a través de una columna de filtración en gel (Superdex 200 HI Load) o por diálisis.

Ejemplo 4: Ensayo de antígeno central del VHC de prototipo de Elecsys

Las mediciones de un ensayo de prototipo de antígeno central del VHC de Elecsys se llevaron a cabo en un formato de ensayo de tipo sándwich en un analizador automatizado Cobas® e601 (Roche Diagnostics GmbH). La detección de señales este analizador se basa en la electroquimioluminiscencia. En este ensayo de tipo sándwich, uno o más conjugados de anticuerpo de captura-biotina (es decir, agentes de unión específica a analito) se inmovilizan sobre la superficie de una microesfera magnética recubierta con estreptavidina. El anticuerpo de detección (otro agente de unión específica a analito) tiene un catión de rutenio en complejo como resto de señalización. En presencia de analito, el complejo de rutenio se une por puentes a la fase sólida y emite luz a 620 nm después de la excitación en el electrodo de platino comprendido en la cubeta de medición del analizador. La salida de señal está en unidades de luz arbitrarias. Las mediciones se realizaron con muestras de suero y plasma humanos positivas y negativas para el antígeno central del VHC adquiridas de varias fuentes.

El ensayo experimental de antígeno central del VHC se realizó como sigue. Se incubaron 50 pl de suero humano normal de muestra positiva al antígeno del VHC y 25 pl de un detergente que contenía reactivo de pretratamiento (PT: KOH 0,25 M, KCl 1,125 M, cloruro de hexadeciltrimetil-amonio (HTAC) al 1,5 %, octilglucósido al 0,75 %) juntos durante 9 minutos para liberar el antígeno, seguido de la adición de 35 pl de 2 pg/ml del conjugado de anticuerpo de captura-biotina respectivo o una mezcla de dos conjugados de anticuerpo-biotina diferentes (1 pg/ml cada uno) y 40 pl de 1 pg/ml de conjugado de anticuerpo de detección-marcador de rutenio en el mismo tampón de ensayo R1 y R2 (fosfato de potasio 200 mM, pH 6,5, KCl 225 mM, taurodesoxicolato de sodio al 0,5 %, Zwittergent 3-14 al 0,3 %, Oxypyrion al 0,1 %, metilisotiazolinona al 0,01 %, seroalbúmina bovina al 0,2 %, IgG bovina al 0,2 %, MAK33-IgG1 50 pg/ml, MAK33-F(ab')2-Poli 50 pg/ml, MAK IgG2b/Fab2a-Poli 50 pg/ml). Después de 9 minutos adicionales de incubación, se añadieron 50 pl de micropartículas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina y se incubaron durante otros 9 minutos. Posteriormente, se detectó el antígeno central del VHC (por medio de la señal electroquimioluminiscente generada en estos experimentos).

Los datos en la tabla 1 y 2 muestran los recuentos reales medidos en muestras positivas al antígeno del VHC y en una muestra normal (negativa), así como la recuperación con respecto a la referencia para anticuerpos de captura conjugados con el marcador de biotina corto Biotina-DDS (tabla 1, estado de la técnica) y con el marcador de biotina largo Biotina-PEG24-NHS (tabla 2, invención), respectivamente.

En esta configuración, el punto de corte (punto de decisión por encima del que una muestra se considera reactiva o positiva y por debajo del que una muestra se clasifica como no reactiva o negativa) para todas las mediciones se calculó como tres veces la señal de una muestra negativa (normal) en la misma configuración experimental. Por ejemplo, si la señal de fondo de una muestra normal (negativa) muestra alrededor de 700 recuentos, el límite se establece en aproximadamente 2100 recuentos. Como consecuencia, todas las muestras que muestran más recuentos de 2100 se clasifican como reactivas.

El anticuerpo de captura que reconoce el epítopo del antígeno central del VHC aa 157-169 genera las señales específicas más altas y se eligió como referencia. Como se puede observar en la tabla 2, al combinar cualquier otro anticuerpo de captura con el anticuerpo de referencia hasta una concentración total de 2 pg/ml (en R1), el nivel de señal está muy cercano al generado por el anticuerpo de referencia solo a 2 pg/ml siempre que se use el marcador de biotina largo Biotina-PEG24-NHS de acuerdo con la invención.

En contraste con esto y como se puede observar en la tabla 1, mezclas análogas de anticuerpos de captura conjugados con el marcador de biotina corto Biotina-DDS conocido en el estado de la técnica presentan una fuerte disminución de la señal con respecto al anticuerpo de referencia usado solo. La recuperación de la señal con respecto a la referencia es, dependiendo de las respectivas combinaciones de anticuerpos, solo de alrededor de un 40 % o como máximo de un 75 %, mientras que la recuperación usando el marcador de biotina de conector largo de acuerdo con la invención es de al menos un 92 %, valores medios de un 91 %, 95 % y 96 %, respectivamente (tabla 2). Esto podría indicar una competencia de los anticuerpos de captura biotinilados con la fase sólida recubierta con estreptavidina conjugada con marcadores de biotina cortos más fuerte que con los más largos.

Para evaluar el reconocimiento fiable de diferentes genotipos del antígeno central del VHC, se realizó el ensayo de antígeno central del VHC de prototipo de Elecsys usando uno o dos anticuerpos de captura conjugados con el marcador de biotina largo Biotina-PEG24-NHS. La concentración de anticuerpo de cada anticuerpo en R1 se optimizó más para la variante de mezcla. El panel de seroconversión de los genotipos 1 y 3 del VHC se adquirió de ZeptoMetrix Corporation. Los datos de la tabla 3 presentan claramente la ventaja de una mezcla de anticuerpos de captura sobre la variante de anticuerpo único. Usando dos anticuerpos que se unen al antígeno central del VHC (invención) ligados al marcador de biotina largo Biotina-PEG24-NHS en lugar de un anticuerpo, la señal se incrementa para la mayoría de las muestras de seroconversión, de modo que el ensayo detecta de manera fiable los genotipos 1 y 3 del VHC. El enfoque de acuerdo con la presente invención de uso de al menos dos agentes de unión específica a analito conjugados con el marcador de biotina largo da lugar a una señal más alta y, por tanto, a una sensibilidad mejorada, en particular a una sensibilidad de ensayo mejorada para la detección del antígeno central del VHC.

Tabla 3: Paneles de seroconversión del VHC

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la medición de un analito en un ensayo de unión específica a analito basado en micropartículas, en el que dichas micropartículas se recubren con el primer compañero de un par de unión, comprendiendo dicho procedimiento

a) mezclar las micropartículas recubiertas, al menos dos agentes de unión específica a analito, en el que cada uno de dichos agentes de unión específica a analito se une a un segundo compañero del par de unión, y una muestra que se sospecha que comprende o que comprende el analito,

en el que dicho segundo compañero del par de unión se une a cada uno de dichos agentes de unión específica a analito por medio de un conector que comprende de 12 a 30 unidades de etilenglicol (PEG 12 a 30), uniendo de este modo el analito por medio de dichos agentes de unión específica a analito a las micropartículas recubiertas,

b) separar de la mezcla las micropartículas que comprenden el analito unido por medio del par de unión y el agente de unión específica a analito y

c) medir el analito unido a las micropartículas.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha medición del analito unido a las micropartículas se basa en el uso de un marcador electroquimioluminiscente.

3. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho analito comprende varias variantes.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichas varias variantes son diferentes genotipos, isoenzimas, isoformas, serotipos o mutantes de dicho analito.

5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho analito es un antígeno de un agente infeccioso.

6. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho analito es un antígeno vírico.

7. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho analito es un antígeno del virus de la hepatitis o un antígeno de retrovirus humano.

8. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho analito es un antígeno del virus de la hepatitis C o uno del virus de la hepatitis B o uno del VIH.

9. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho analito es el antígeno central del virus de la hepatitis C.

10. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que uno de dichos al menos dos agentes de unión específica a antígeno es un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de las posiciones aminoacídicas 140 a 172, en un modo de realización, dentro de las posiciones aminoacídicas 157-169 de SEQ ID NO: 1 y uno de dichos al menos dos agentes de unión específica a analito es un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de las posiciones aminoacídicas 20 a 80, en un modo de realización, dentro de las posiciones aminoacídicas 65-71, en un modo de realización, dentro de la posiciones aminoacídicas 32-36, en un modo de realización, dentro de las posiciones aminoacídicas 37-46 de SEQ ID NO: 1.

11. Un kit que comprende en recipientes separados o en compartimentos separados de una unidad de recipiente único, al menos micropartículas recubiertas con un primer compañero de un par de unión y al menos dos agentes de unión específica a analito, cada uno unido al segundo compañero de dicho par de unión, en el que dicho segundo compañero del par de unión se une a cada uno de dichos agentes de unión específica a analito por medio de un conector que comprende de 12 a 30 unidades de etilenglicol (PEG 12 a 30).

12. El kit de la reivindicación 11, en el que dicho primer compañero de un par de unión es avidina o estreptavidina, y en el que dicho segundo compañero de dicho par de unión se selecciona de biotina o los análogos de biotina aminobiotina, iminobiotina o destiobiotina.

13. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en el que dichos al menos dos agentes de unión específica a analito son agentes de unión específica a antígeno vírico, en un modo de realización, anticuerpos específicos de antígeno vírico.

14. El kit de acuerdo con la reivindicación 13, en el que uno de dichos al menos dos agentes de unión específica a antígeno vírico es un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de las posiciones aminoacídicas 140 a 172, en un modo de realización, dentro de las posiciones aminoacídicas 157-169 de SEQ ID NO: 1 y uno de dichos al menos dos agentes de unión específica a antígeno vírico es un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de las posiciones aminoacídicas 20 a 80, en un modo de realización, dentro de las posiciones aminoacídicas 65 71, en un modo de realización, dentro de las posiciones aminoacídicas 32-36, en un modo de realización, dentro de las posiciones aminoacídicas 37-46 de SEQ ID NO: 1.

15. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, que comprende además, en un recipiente separado o en un compartimento separado de una unidad de recipiente único, otro agente de unión específica de analito que está marcado de manera detectable, en el que dicho otro agente de unión específica a analito que está marcado de manera detectable es un anticuerpo que se une a un epítopo en las posiciones aminoacídicas 100-120 de SEQ ID NO:1.