SI24638A - Fluorometrična imunska metoda za določanje protiteles proti dvojnoverižni DNA - Google Patents

Abstract

Izum sodi v področje imunoloških metod, bolj natančno v področje metod za določanje anti-dsDNA za potrebe diagnostike kroničnih avtoimunskih bolezni, kot je npr. sistemski lupus eritematozus (SLE). S fluorometrično imunsko metodo določanja anti-dsDNA je rešen tehnični problem zasnove metode določanja teh avtoprotiteles, ki bo hitrejša, cenejša in manj toksična kot standardna metoda Farr-RIA ob enaki diagnostični specifičnosti (ki je 100 odstotkov) in izboljšani diagnostični občutljivosti (za 3 odstotke).Določanje anti-dsDNA temelji na zaznavanju fluorescence v dveh frakcijah vzorcev, to je v supernatantu ter v vzorcu z oborino, v katerem se nahajajo imunski kompleksi sestavljeni iz dodane dsDNA in anti-dsDNA prisotnih v serumu bolnika, pri čemer je zaznana fluorescenca posledica vezave fluorescentnih barvil z dsDNA, tako vezane v imunski kompleks, kot tudi proste dsDNA. Metoda po izumu omogoča pridobivanje zanesljivih rezultatov, hitro analizo vzorcev in dostopnost rezultatov lečečemu zdravniku,odpravljanje uporabe človeku in okolju nevarnih kemikalij ter nižanje stroškov testiranja v primerjavi s starejšo radioimunsko metodo Farr-RIA.

Description

Fluorometrična imunska metoda za določanje protiteles proti dvojnoverižni DNA

Področje izuma

Izum sodi v področje imunoloških metod, bolj natančno v področje metod za določanje protiteles proti dvojnoverižni DNA (dsDNA) za potrebe diagnostike kroničnih avtoimunskih bolezni, kot je npr. sistemski lupus eritematozus (SLE).

Tehnični problem

SLE je kronična avtoimunska bolezen s pojavnostjo med prebivalstvom približno 4 do 250 bolnikov na 100000 oseb. Bolezen lahko prizadane katerikoli del telesa, najpogosteje pa prizadane kožo, sklepe, ledvica, pljuča, srce in živčevje. V letu 1957 so odkrili protitelesa proti dsDNA (anti-dsDNA) in ugotovili, da so prisotna pri 70 do 80 odstotkih bolnikov, ko je bolezen aktivna. Zaradi prisotnosti omenjenih protiteles v krvi in tkivih se tvorijo imunski kompleksi dsDNA/anti-dsDNA tako v krvi, kot tudi v tkivih. Zaradi zmanjšanega števila in zmanjšane funkcije receptorjev je njihovo odstranjevanje pomankljivo, kar posledično povzroča vnetje in poškodbe tkiv. AntidsDNA se uporabljajo kot eden izmed diagnostičnih kriterijev za SLE. Vrednosti antidsDNA izmerjene v serumih bolnikov s SLE se poleg diagnostike uporabljajo tudi za spremljanje aktivnosti in napovedovanje poslabšanja bolezni, saj količina anti-dsDNA korelira z aktivnostjo SLE. Tako je v akutni fazi bolezni njihova količina v serumu znatno povišana. Poleg tega se lahko pred poslabšanjem bolezni pojavijo povišane vrednosti anti-dsDNA, lahko tudi več kot eno leto pred poslabšanjem stanja bolnika.

Laboratorijska diagnostika je izjemno pomembna, saj so znaki in simptomi SLE izredno raznoliki in pogosto podobni kot pri drugih boleznih. Anti-dsDNA v serumu določamo z različnimi tehnikami in metodami. Zlati standard je radioimunska metoda po Farru (Farr-RIA), pri kateri izmerimo prisotnost anti-dsDNA v serumu bolnika z radioaktivno označeno bakterijsko, bakteriofagno ali človeško dsDNA. Prisotnost anti-dsDNA v serumu bolnika se določi z razmerjem radioaktivne dsDNA vezane v komplekse z anti-dsDNA in celokupne radioaktivnosti dodane dsDNA.

·* · ......... .

Problem metode Farr-RlAje uporaba dragih radioaktivnih, toksičnih in kancerogenih reagentov, ki močno obremenjujejo zdravje in okolje.

Nadomestni metodi za določanje anti-dsDNA, indirektna imunofluorescenca in encimsko imunska tehnika na trdnem nosilcu (ELISA), nista najprimernejši za rutinsko določanje, saj sta manj diagnostično specifični in bolj občutljivi, kar daje več lažno pozitivnih rezultatov. Poleg tega rezultati slabše sledijo aktivnost bolezni. Semikvantitativni imunofluorescenčni test s protistom Crithidia luciliae (CLIFT) se bolj pogosto uporablja le kot prvostopenjska metoda. Posledično je potrebno dodatno testiranje pozitivnih rezultatov z metodo Farr-RIA, da se izločijo klinično neuporabni pozitivni rezultati. Korelacija anti-dsDNA z aktivnostjo bolezni je pri metodi Farr-RIA bistveno boljša kot pri metodi CLIFT, saj je slednja kvalitativna ali semikvantitativna.

V zadnjih letih so številni avtorji predlagali več različnih metod za laboratorijsko diagnostiko SLE, ki nadomeščajo detekcijo anti-dsDNA, kot na primer spremljanje izražanja genov, določanje markerskih nukleotidnih zaporedij ter določanje aktivnosti različnih bioloških označevalcev, ki so ponavadi encimi ali komponente imunskega sistema. Kljub razvoju alternativnih metod pa rutinska diagnostika še vedno temelji na zaznavanju anti-dsDNA, zato je smiselno razvijati in nadgrajevati že znane in klinično uporabne metode.

Tehnični problem, ki ga rešuje pričujoči izum, je zasnova metode določanja antidsDNA, ki temelji na principu standardizirane radioimunske metode Farr-RIA, vendar se razlikuje v tem, da mora omogočati uporabo materialov in kemikalij, ki so človeku in okolju bolj prijazne. Metoda mora imeti občutljivost, specifičnost in ponovljivost enako ali boljšo kot pri standardizirani radioimunski metodi ali drugih alternativnih diagnostičnih metodah. Poleg tega mora biti metoda tudi cenejša, kar je ključnega pomena v rutinski diagnostiki.

Stanje tehnike

Pincus in sod. so leta 1969 v članku »Measurement of Serum DNA-Binding Activity in Systemic Lupus Erythematosus« (N Engl J Med) opisali radioimunsko metodo za določanje anti-dsDNA, ki je bila najbolj diagnostično učinkovita za določanje SLE.

·· ···· «··

Metoda temelji na obarjanju imunskih kompleksov, ki nastanejo po inkubaciji seruma bolnika z radioaktivno označeno bakterijsko, bakteriofagno, telečjo (iz telečjega priželjca) ali človeško dsDNA. Imunski kompleksi se oborijo z amonijevim sulfatom, saj le-ta spremeni topnost molekul. Odčitavanje rezultatov pri Farr-RIA metodi temelji na določanju razmerja izmerjene radioaktivnosti supematanta in vzorca z oborino, ki se poveča zaradi oborjenih imunskih kompleksov.

Slater in sodelavci so leta 1976 v članku »The Crithidia luciliae kinetoplast immunofluorescence test in systemic lupus erythematosus« (Ciin Exp Immunol) opisali tehniko CLIFT, s katero se določi prisotnost anti-dsDNA v serumu bolnika, saj ima protist Crithidia luciliae kinetoplast z visoko koncentracijo dvojnoverižne DNA, nima pa drugih antigenov, in zato omogoča visoko specifičnost metode. Pripravljenim vzorcem se doda s fluorokromom označeno molekulo, ki se bo vezala na protitelesa. Fluoresciranje kinetoplasta pod fluorescenčnim mikroskopom pomeni pozitiven rezultat. Posledica razvoja tega testa so tudi številni komercialno dostopni kompleti za detekcijo anti-dsDNA.

Metoda ELISA je poznana že vrsto let in se v številnih različicah uporablja za diagnostiko številnih bolezni, vključno z avtoimunskimi. Sestavljena je iz petih korakov. Najprej se na trdni nosilec veže antigen, nato se blokira nezapolnjena vezavna mesta, doda primarno protitelo, ki se ga zazna preko sekundarnega protitelesa označenega s kromogenim, fluorogenim ali kemiluminiscentnim reporterjem, ki po dodatku substrata omogoča spektrofotometrično detekcijo. Dostopni so komercialni kompleti ELISA testov namenjenih detekciji anti-dsDNA (Ouanta Lite dsDNA, INOVA; Anti-dsDNA DIASTAT, EURO DIAGNOSTICA), ki imajo kot antigen dodano dsDNA iz telečjega priželjca. Nekateri komercialni kompleti uporabljajo tudi plazmidno DNA. Blount in sod. (Reactive oxygen species modify human DNA, eliciting a more discriminating antigen for the diagnosis of systemic lupus erythematosus, Ciin Exp Immunol, 1990) so z uporabo denaturirane DNA dosegli večjo diagnostično občutljivost in specifičnost rezultatov pridobljenih z metodo ELISA pri laboratorijski diagnostiki SLE. S to metodo zaznamo nizko in visoko avidna anti-dsDNA.

............ .

Kot antigen za zaznavanje anti-dsDNA se lahko uporablja tudi telomerna DNA, kot je znano iz patentov VVO9627131 in US5700641. Telomerne sekvence so vključene v diagnostične komplete ali v farmacevtske pripravke za inhibicijo ali zmanjšanje aktivnosti anti-dsDNA za zdravljenje bolnikov.

Po patentu US4690905 so znana monoklonska protitelesa proti človeškim antidsDNA, ki se lahko uporabijo za določanje prisotnosti človeških anti-dsDNA v serumu ali za odstranjevanje teh protiteles pri bolnikih s SLE. Tehnika zaznavanja vezave je lahko radioimunska, encimsko imunska, imunofluorescenčna ali katera druga.

Pred desetletjem je bila razvita komercialno dostopna fluorescenčna imunska metoda (EliA dsDNA, Pharmacia Diagnostics, Nemčija), ki temelji na zaznavanju imunskih kompleksov, ki so nastali po prepoznavanju na trdni nosilec vezane plazmidne DNA s pomočjo protiteles značilnih za določeno avtoimunsko bolezen.

Imunski kompleksi se zaznajo s sekundarnimi protitelesi z vezanim encimom, ki omogoča fluorescenčno detekcijo po dodatku substrata.

Med zgoraj omenjenimi postopki so bile opravljene številne analize uporabnosti posameznih metod, pri katerih je bilo ugotovljeno, da je najbolj zanesljiva standardizirana metoda Farr-RIA, medtem ko po rezultatih Salingue-Canonne in sod. (Detection of anti-DNA antibodies for the diagnosis of disseminated lupus erythematosus. Comparative study of immunoenzyme methods and a Farr test,

Pathol Biol (Pariš), 2001) ter Suh-Lailam in sod. (Evaluation of a high avidity antidsDNA IgG enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of systemic lupus erythematosus, Int J Ciin Exp Pathol, 2011) ELISA in druge encimsko imunske metode kljub izboljšavam ne dosegajo dovolj visoke analizne specifičnosti. Tudi pred komercialno dostopnim fluorescentnim imunskim testom EliA dsDNA ima metoda Farr-RIA prednost. Kot so objavili Žigon in sod. (Comparison and evaluation of different methodologies and tests for detection of anti-dsDNA antibodies on 889 Slovenian patients' and blood donors’ sera, Croat Med J, 2011) se lahko metodo CLIFT uporabi kot primarni test, ki izloči negativne vzorce in zato zmanjša število preiskav z metodo Farr-RIA. Zato prevladuje mnenje, da bi bilo koristno izboljšati metodo Farr-RIA tako, da se izogne uporabi zdravju in okolju škodljivih kemikalij.

·· ··· ·φ · ···

Tovrstni poskusi segajo v leto 2003, ko so Bjorkman in sod. v članku »The use oT” ’ fluorometric assays to assess the immune response to DNA in murine systemic lupus erythematosus« (Scand J Immunol) proučevali imunopatogenezo SLE stimulirano v mišjih modelih tako, da so določali količino proste DNA, DNA vezane v imunske komplekse in prostih anti-DNA. Imunske komplekse so kot pri metodi Farr-RIA oborili z amonijevim sulfatom. Koncentracijo dsDNA so izmerili s komercialno dostopnim fluorescentnim barvilom PicoGreen na podlagi umeritvene krivulje. Omenjeno barvilo so za določanje koncentracije dsDNA uporabili tudi Jiang in sod. (The expression of plasma nucleosomes in mice undergoing in vivo apoptosis, Clinical Immunol, 2003) in Chen in sod. (Sensitive detection of plasma/serum DNA in patients with systemic lupus erythematosus, Autoimmunity, 2007).

Opis rešitve tehničnega problema

Bistvo fluorometrične imunske metode (FIA) za določanje anti-dsDNA za namen diagnostike avtoimunskih bolezni, še posebno SLE po izumu je v tem, da temelji na zaznavanju fluorescence v dveh frakcijah vzorcev, to je v supernatantu ter v vzorcu z oborino, v katerem se nahajajo imunski kompleksi sestavljeni iz dsDNA in antidsDNA, pri čemer je zaznana fluorescenca posledica vezave fluorescentnih barvil v dsDNA.

Metoda vključuje sledeče korake:

a. pridobivanje in dekomplementacija seruma bolnika ter kontrolnih serumov;

b. izolacija dsDNA iz primernega vira;

c. dodatek izolirane dsDNA iz koraka b skupaj s primerno pufrsko raztopino dekomplementiranim serumom;

d. inkubacija mešanice iz koraka c na toplem ter dodatna inkubacija na hladnem;

e. obarjanje v koraku d nastalih imunskih kompleksov z nasičeno raztopino amonijevega sulfata ali raztopino polietilenglikola (PEG);

f. ločevanje oborjenih imunskih kompleksov od nevezane dsDNA s centrifugiranjem;

g. segrevanje vzorcev na sobno temperaturo;

• · ···· ·,«

h. barvanje supernatanta in vzorca z oborino iz koraka f s primernim fluorescentnim barvilom;

i. meritev fluorescence vzorcev;

j. izračun rezultatov, ki predstavljajo relativno koncentracijo anti-dsDNA in

k. opredelitev pozitivnih in negativnih rezultatov, pri čemer je spodnja meja določena s količino dodane dsDNA.

Metoda za določanje anti-dsDNA bo v nadaljevanju podrobneje opisana s pomočjo Slike 1, ki prikazuje:

Slika 1 Blok-shema protokola za določanje protiteles po izumu.

Pri bolniku s sumom na avtoimunsko bolezen ali potrjenim SLE se odvzame kri in iz nje pripravi serum tako, da se koagulirano kri centrifugira 10 minut pri 1800 xg. Serum je za potrebe diagnostike bolj primeren kot plazma, saj ni visokega ozadja pri testu. Hkrati se pripravijo tudi kontrolni serumi, ki so v negativnem, srednje pozitivnem in visoko pozitivnem območju. Lahko so sveže pripravljeni ali odmrznjeni predhodno shranjeni vzorci, njihove vrednosti pa se določijo glede na pražno vrednost, ki je odvisna od količine dodane dsDNA.

Serumi (vzorci in kontrole) se nato dekomplementirajo tako, da se vzorce inkubira 30 minut v vodni kopeli pri 56 °C. S tem se deaktivirajo komponente komplementa, ki bi motile določanje prisotnosti protiteles.

Potem se serumu doda primerna puferska raztopina, ki je lahko 100 do 200 mM boratni pufer (pH med 7,0 in 9,0), in dsDNA. Slednja je lahko različnih izvorov. Preferenčno je izolirana dsDNA iz človeške venske krvi, lahko pa je tudi bakterijska, bakteriofagna, živalska, plazmidna ali sintetična. Pri tem je pomembno, da dsDNA ustreza priporočenim parametrom, kot so dolžina (10⁵ do 10⁷ bp), konformacija, čistost (razmerje A₂₆o/A₂so med 1,8 in 2), in primerno izkazuje izpostavljanje epitopa, ki ga prepozna anti-dsDNA. Končna koncentracija dodane dsDNA v vzorcih je med 1 in 10 mg/L, preferenčno 1 mg/L. Najboljšo primerljivost rezultatov se zagotovi tako, da se v vzorec doda 100 ng DNA v 5 pL seruma. Tvorba imunskih kompleksov je omogočena z inkubacijo v vodni kopeli pri temperaturi 37 °C 1 uro ter dodatno ·· ···· ...

inkubacijo pri 4 °C, ki lahko traja med 0 in 24 urami, preferenčno 20 ur. Dodatna inkubacija na hladnem je potrebna zato, da se doseže dinamično ravnovesje reakcije antigen - protitelo (dsDNA - anti-dsDNA).

Imunske komplekse oborimo z dodatkom nasičene raztopine amonijevega sulfata ali z 3 do 8 % raztopino PEG, pri čemer inkubacija poteka 1 uro pri 4 °C. Po inkubaciji se vzorec centrifugira pri 4 °C 10 do 60 minut, preferenčno 15 minut, pri 400 do 2500 xg, preferenčno 1800 xg. Tako se ločijo imunski kompleksi, ki so v oborini, in nevezana dsDNA, ki ostaja v supernatantu, saj se ne obori z amonijevim sulfatom oziroma s PEG. Supernatant se loči od oborine tako, da se pazljivo odpipetira iz epruvete. Vzorci se segrejejo na sobno temperaturo (22 do 26 °C). Ta korak je namenjen optimizaciji merjenja fluorescence, saj se s tem zmanjšajo ali izločijo napake, ki so posledica vpliva temperature vzorca na izmerjeno fluorescenco.

Oba dela vzorca, supernatant in vzorec z oborino, se barvata s fluorescentnim barvilom, ki je primerno za zaznavanje in določanje koncentracije dsDNA, kot so na primer PicoGreen, Hoechst, SYBR Green, SYBR Gold, DAPI ali Cy3. Preferenčno se uporabi barvilo PicoGreen, za katerega je že bilo pokazano učinkovito barvanje dsDNA. Barvanje superantanta in vzorca z oborino je namenjeno natančnejšemu določanju rezultatov, saj se s tem izognemu napakam zaradi izgub ali sistemskim napakam pri meritvah. To je še posebej pomembno v primerih mejno pozitivnih rezultatov. Barvilo se veže v strukturo dsDNA, ne glede na to, če je le-ta vezana s proteini (protitelesi) ali ne. Za barvilo PicoGreen je valovna dolžina ekscitacije 485 nm, valovna dolžina emisije pa 520 nm. Postopek barvanja se izvede po navodilih proizvajalca. Po barvanju se rezultati odčitajo fluorimetrično, spektrofotometrično, z aparatom za verižno reakcijo s polimerazo v realnem času, pretočnim citometrom ali mikroskopom. Način detekcije je odvisen od izbrane tehnike za določanje antidsDNA in s tem tudi uporabo različnega laboratorijskega materiala (mikrotitrske plošče, epruvete, predmetna stekelca ipd.)

Rezultati testa, ki predstavljajo relativni delež anti-dsDNA, se izračunajo po formuli:

fluorescenco P-fluorescenco S fluorescenco P+fluorescenca S pri čemer je fluorescenca P izmerjena fluorescenca v vzorcu z oborino in je fluorescenca S izmerjena fluorescenca v vzorcu supernatanta.

Na podlagi rezultatov zdravih ljudi je bila določena meja med pozitivnim in negativnim rezultatom pri koncentraciji dodane dsDNA v območju od 1 do 10 mg/L. Če je rezultat zgornje formule nad pražno vrednostjo, je vzorec pozitiven. Prazna vrednost je odvisna od razmerja med količino dodane DNA in uporabljenim volumnom seruma. Pri uporabljeni 100 ng dsDNA in 5ul seruma je pražna vrednost 0,35. Rezultat testa je zanesljiv, če imajo negativna kontrola in srednje ter visoko pozitivna kontrola primerne vrednosti.

Rezultati pridobljeni z metodo FIA po izumu so bili primerjani z rezultati pridobljenimi z doslej uporabljanimi metodami. Analiziranih je bilo 465 vzorcev, ki so prišli v laboratorij na potrditev ali izključitev diagnoze SLE. Vsi vzorci so bili analizirani s tremi metodami, in sicer s standardizirano metodo Farr-RIA, metodo CLIFT in metodo FIA po izumu. Rezultati so prikazani v Tabeli 1.

Kot kaže Tabela 1 je bilo z metodo CLIFT določenih 63 pozitivnih in 402 negativna vzorca, medtem ko je bilo z metodo Farr-RIA določenih 22 pozitivnih in 443 negativnih vzorcev. Z metodo FIA po izumu je bilo 37 pozitivnih in 425 negativnih rezultatov. Ko je bil test z metodo CLIFT negativen, s potrditvenim testom Farr-RIA ni bilo pozitivnega vzorca. Kot je razvidno iz Tabele 1 je pri metodi FIA po izumu prišlo do 3 lažno pozitivnih rezultatov, saj je bilo negativnih vzorcev 399. Kljub temu je zanesljivost metode FIA po izumu primerna, saj je ujemanje rezultatov 99 odstotno. Metoda CLIFT je pokazala 63 pozitivnih vzorcev, pozitivnost pa je bila potrjena le za 22 vzorcev z metodo Farr-RIA in 37 z metodo FIA po izumu. Primerjave rezultatov Farr-RIA in FIA v območju negativnih vrednosti ni smiselno zaradi velike razpršenosti rezultatov, ki je posledica večje analizne občutljivosti FIA. Primerjava pozitivnih rezultatov s Farr-RIA in FIA z Wilcoxonovim testom predznačenih rangov je pokazala, da ni statistično značilnih razlik med rezultati obeh metod (p=0,24).

Tabela 1: Število vzorcev analiziranih s presejalnim testom CLIFT in preverjenih z metodama Farr-RIA in FIA po izumu.

	CLIFT
Pozitiven	Negativen
Potrditev z metodami	pozitiven	negativen	pozitiven	negativen
Farr-RIA	22	41	0	402
FIA po izumu	37	26	3	399

Izvedbeni primer I

Metodo po izvedbenem primeru I se izvaja po sledečem protokolu. Vzorci in kontrolni serumi se dekomplementirajo 30 minut v vodni kopeli pri 56 °C. V steklene epruvete se napipetira 95 pL 155 mM boratnega pufra (pH 8), 5 pl_ seruma in izolirano dsDNA do končne koncentracije 1 mg/L. Raztopine se dobro zmešajo in epruvete zamašijo ter inkubirajo v vodni kopeli pri 37 °C 1 uro, potem pa še v hladilniku na 4 °C 20 ur. Po inkubaciji se v vsako epruveto doda 100 pl_ nasičene raztopine amonijevega sulfata in premeša z mešalom. Nato se epruvete inkubirajo v hladilniku pri 4 °C 1 uro. Sledi centrifugiranje pri temperaturi 4 °C, ki traja 15 minut, in poteka pri 1800 xg. Po centrifugiranju se vzorci segrejejo na temperaturo med 22 in 26 °C. Iz 100 pl_ supernatanta, ki se previdno odpipetira v sveže steklene epruveto, se oddeli 20 μΙ_ v mikrocentrifugirko, v katero se doda 180 pL delovne raztopine fluorescentnega barvila PicoGreen. Koncentracijo delovne raztopine in njeno pripravo definira proizvajalec. Iz 100 pL preostanka supernatanta in oborine se prenese 20 pL suspenzije v drugo mikrocentrifugirko in se ji doda 180 pL delovne raztopine barvila PicoGreen.

Za umeritev fluorometra se dodatno pripravi še dve standardni raztopini s koncentracijo 0 in 10 pg/L s končnim volumnom 200 pL.

Fluorescenco vzorcev supernatanta in oborine se izmeri s fluorometrom in rezultate izračunamo po zgoraj opisani formuli.

• ·

Izvedbeni primer II

Metoda po izvedbenem primeru II se do priprave vzorcev za meritev fluorescence izvaja tako, kot po izvedbenem primeru I. In sicer, vzorci in kontrolni serumi se dekomplementirajo 30 minut v vodni kopeli pri 56 °C. V steklene epruvete se napipetira 95 pL 155 mM boratnega pufra (pH 8), 5 pl_ seruma in izolirano dsDNA do končne koncentracije 1 mg/L. Raztopine se dobro zmešajo in epruvete zamašijo ter inkubirajo v vodni kopeli pri 37 °C 1 uro, potem pa še v hladilniku na 4 °C 20 ur. Po inkubaciji se v vsako epruveto doda 100 pL nasičene raztopine amonijevega sulfata in premeša z mešalom. Nato se epruvete inkubirajo v hladilniku pri 4 °C 1 uro. Sledi centrifugiranje pri temperaturi 4 °C, ki traja 15 minut, in poteka pri 1800 xg. Po centrifugiranju se vzorci segrejejo na temperaturo med 22 in 26 °C. Iz 100 pL supernatanta, ki se previdno odpipetira v sveže steklene epruvete, se 10 pL prenese v mikrotitrsko ploščo, ki je primerna za meritev fluorescence. Tem vzorcem se doda 90 pL delovne raztopine fluorescentnega barvila PicoGreen. Iz 100 pL preostanka supernatanta in oborine se prenese 10 pL suspenzije na mikrotitrsko ploščo in se ji doda 90 pL delovne raztopine barvila PicoGreen. Fluorescenco vzorcev supernatanta in vzorca z oborino se izmeri s spektrofotometrom, ki je nastavljen tako, da je vzbujevalna valovna dolžina 485 nm in emisijska valovna dolžina 520 nm, meritev se izvede v času med 5 in 180 minut. Valovne dolžine vzbujevanja in emisije so prilagojene barvilu PicoGreen. Rezultati se izračunajo po zgoraj opisani formuli.

S fluorometrično imunsko metodo za določanje anti-dsDNA za potrebe serološke diagnostike avtoimunskih bolezni po izumu je omogočena uporaba za človeka in okolje manj obremenjujočih in toksičnih kemikalij, kar tudi bistveno zniža stroške, saj ni potrebno posebno odstranjevanje radioaktivnih odpadkov in dodatno usposabljanje delavcev za delo z radioaktivnimi snovmi. Pri tem so rezultati testa enako zanesljivi kot pri metodi Farr-RIA. Poleg tega so rezultati po metodi po izumu dostopni zdravniku v dveh dnevih, v nujnih primerih pa lahko tudi v istem dnevu, če se odvzem krvi izvede zjutraj. S tem so doseženi kriteriji za izboljšavo že znanih in uveljavljenih metod za določanje anti-dsDNA, saj je fluorometrična imunska metoda po izumu hitra, cenejša in manj nevarna za človeka in okolje.

Claims (11)

1. Patentni zahtevki

   1. Fluorometrična imunska metoda za določanje protiteles proti dvojnoverižni DNA (anti-dsDNA), ki obsega obarjanje imunskih kompleksov z nasičeno raztopino amonijevega sulfata ali raztopino polietilenglikola (PEG), pri čemer so imunski kompleksi posledica inkubacije dekomplementiranega seruma bolnika z dsDNA na toplem, značilna po tem, da vključuje zaznavanje fluorescence v dveh frakcijah vzorcev, to je v supernatantu ter v vzorcu z oborino, v katerem se nahajajo imunski kompleksi sestavljeni iz dsDNA in anti-dsDNA, pri čemer je zaznana fluorescenca posledica vezave fluorescentnih barvil v dsDNA.
2. 2. Fluorometrična imunska metoda za določanje anti-dsDNA po zahtevku 1, značilna po tem, da vključuje naslednje korake:

   a. pridobivanje in dekomplementacija seruma bolnika ter kontrolnih serumov;

   b. izolacija dsDNA iz primernega vira;

   c. dodatek izolirane dsDNA iz koraka b skupaj s primerno pufrsko raztopino dekomplementiranim serumom;

   d. inkubacija mešanice iz koraka c na toplem ter dodatna inkubacija na hladnem;

   e. obarjanje v koraku d nastalih imunskih kompleksov z nasičeno raztopino amonijevega sulfata ali z 3 do 8% raztopino PEG;

   f. ločevanje oborjenih imunskih kompleksov od nevezane dsDNA s centrifugiranjem;

   g. segrevanje vzorcev na sobno temperaturo;

   h. barvanje supematanta in ¹ vzorca z oborino iz koraka f s primernim fluorescentnim barvilom;

   i. meritev fluorescence vzorcev;

   j. izračun rezultatov, ki predstavljajo relativno koncentracijo anti-dsDNA; in

   k. opredelitev pozitivnih in negativnih rezultatov, pri čemer je spodnja meja pozitivnega rezultata odvisna od prazne vrednosti, ta pa od dodane količine dsDNA.
3. 3. Metoda po zahtevku 1 in 2, značilna po tem, da je dsDNA v koraku b lahko človeška, živalska, bakterijska, bakteriofagna, plazmidna ali sintetična DNA, ki je primerna za detekcijo anti-dsDNA, preferenčno dsDNA izolirana iz človeške venske krvi.
4. 4. Metoda po kateremkoli izmed predhodnih zahtevkov, značilna po tem, da je končna koncentracija dodane dsDNA v vzorcu med 1 in 10 mg/L, preferenčno 1 mg/L, in da je volumen dodanega seruma med 0,05 in 50 μΙ_, preferenčno 5 pL.
5. 5. Metoda po kateremkoli izmed predhodnih zahtevkov, značilna po tem, da je primerna puferska raztopina v koraku c 100 do 200 mM boratni pufer s pH vrednostjo med 7,0 in 9,0.
6. 6. Metoda po kateremkoli izmed predhodnih zahtevkov, pri kateri inkubacija mešanice v koraku d traja 1 uro na 37 °C in je značilna po tem, da inkubacija dodatno traja 0 do 24 ur, preferenčno 20 ur, na temperaturi 4 °C.
7. 7. Metoda po kateremkoli izmed predhodnih zahtevkov, značilna po tem, da centrifugiranje v koraku e poteka pri temperaturi 4 °C 10 dp 60 minut, preferenčno 15 minut, in pri 400 do 2500 xg, preferenčno pri 1800 xg, ter pri čemer je želena temperatura segretih vzorcev po centrifugiranju med 22 in 26 °C.
8. 8. Metoda po kateremkoli izmed predhodnih zahtevkov, značilna po tem, da je v koraku f uporabljeno fluorescentno barvilo lahko katerokoli fluorescentno barvilo, ki je primerno za določanje koncentracije dsDNA v imunskih kompleksih, kot tudi koncentracije nevezane dsDNA, preferenčno fluorescentno barvilo PicoGreen.
9. 9. Metoda po kateremkoli izmed predhodnih zahtevkov, značilna po tem, da se rezultate izračuna tako, da se razliko v fluorescenci vzorca z oborino in supernatanta deli s seštevkom fluorescence v vzorcu z oborino in supernatantu, pri čemer je mejni rezultat odvisen od določene pražne vrednosti, in vse vrednosti nad to številko predstavljajo pozitiven rezultat.
10. 10. Uporaba metode po kateremkoli izmed predhodnih zahtevkov pri diagnosticiranju in/ali spremljanju poteka avtoimunskih bolezni.
11. 11. Uporaba metode po kateremkoli izmed predhodnih zahtevkov pri diagnosticiranju in/ali spremljanju poteka sistemskega lupus eritematozusa (SLE).