CN108254571A - 一种抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒,包括第一试剂、第二试剂、磁微粒分离试剂、化学发光底物、校准品、质控品以及清洗液;所述第一试剂为包含偶联有生物素的混合双链DNA抗原的溶液,所述混合双链DNA抗原由取自大肠杆菌中的双链DNA抗原、取自小牛胸腺中的双链DNA抗原以及取自鲱鱼精子中的双链DNA抗原组合而成;所述第二试剂为包含偶联有碱性磷酸酶的抗人IgG抗体的溶液。本发明的一种抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒的抗原试剂中抗原为偶联有生物素的混合双链DNA抗原,多来源抗原之间的互补性大大提高临床灵敏度以及线性范围。本发明完成所有流程出结果时间标准为45min,相比酶联免疫吸附法大大缩短了反应时间。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断技术领域,具体涉及一种抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒及该检测试剂盒的检测方法。
背景技术
系统性红斑狼疮(SLE)是一种侵犯全身结缔组织和多数器官的自身免疫疾病,多发于育龄期青年女性,该病致病原因并不十分明确,临床变化多端,诊治难度大,死亡率高,是急需研究解决的一种医学疾病,也是研究的热点之一。
临床研究发现SLE患者血液中存在多种自身抗体,尤其是抗核抗体,在疾病活动期常伴随有自身抗体滴度升高的现象。其中,抗双链DNA抗体是SLE患者中最为常见的一种自身免疫性抗核抗体,其阳性率约为50%-80%。因此,检测血液中抗双链DNA抗体的含量成为诊断SLE患者的一种有效手段。
抗双链DNA抗体在SLE的发病中起重要作用。抗体与双链DNA结合后形成的免疫复合物可存留在循环中或是沉积在组织局部,后者激活补体导致组织炎症性损害,引起SLE。此外,抗双链DNA抗体可能与组织结构蛋白,如肾小球基底膜中的硫酸乙酰肝素结合,引起基底膜损伤。因此狼疮性肾炎与高亲和力的抗双链DNA抗体密切相关。
早在1957年,Ceppelini等人首先发现了SLE患者血清中存在与脱氧核糖核酸(DNA)反应的成分。目前,检测血清中抗双链DNA抗体的方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、间接免疫荧光法(IIF)、放射性免疫法(Farr)、斑点免疫金渗滤法(DIGFA)等。其中,放射性免疫法被认为是检测抗双链DNA抗体的金标准,虽然重复性较好,但是只能检测高亲和力的抗体,不能区分抗体的亚型,并且需要特定的仪器设备,同位素污染较为严重。间接免疫荧光法可作为半定量测定,但其存在主观判断误差,标准化困难;并且在分析结果时无法根据分子量的大小区分非特异性识别。斑点免疫金渗滤法虽检测简便快速,但特异性较低,不能作定量检测。酶联免疫吸附法可以用于高通量样本检测,方法简单,易标准化,可测定不同类型的抗体,高、低亲和力抗体可以同时测定,被广泛认可,但是该方法依然存在一定的局限性:(1)检测试剂在检测过程中为开放方式,容易引起各种试剂之间的交叉污染而影响检测结果;(2)酶联免疫吸附法检测范围较窄和灵敏度较低;(3)酶联免疫吸附法的检测时间较长,完成一个测试所需的总时间一般在2h以上,不能完全满足临床上的快速诊断的需求;(4)酶联免疫吸附法不能随机进样检测,检测结果存在滞后性。
近年来,纳米磁微粒化学发光检测技术得到了广泛使用,将其应用到检测抗双链DNA抗体中,不仅能具有酶联免疫吸附法的所有优点,并且灵敏度更高,线性范围更宽。
如中国专利申请号201610249121.9,专利名称“一种抗双链DNA抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒及制备和检测方法”的发明专利,其将磁微粒化学发光定量检测技术应用于抗双链DNA抗体的检测中,实现了灵敏度和线性范围的提升,但是其并没有公开双链DNA抗原的来源和化学发光底物的组成。而本案发明人在研究过程中发现,双链DNA抗原的来源对检测的灵敏度有着非常重要的影响,且多种来源组成的混合双链DNA抗原可以更加显著地提高检测的灵敏度和线性范围。
发明内容
有鉴于此,为了达到上述目的,本发明提供了一种抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒,其第一试剂中多种来源抗原之间的互补性大大提高了临床灵敏度以及线性范围,该试剂盒灵敏度高、特异性强。
为了达到上述目的,本发明采用以下的技术方案:
一种抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒,包括第一试剂、第二试剂、磁微粒分离试剂、化学发光底物、校准品、质控品以及清洗液;所述第一试剂为包含偶联有生物素的混合双链DNA抗原的溶液,所述混合双链DNA抗原由取自大肠杆菌中的双链DNA抗原、取自小牛胸腺中的双链DNA抗原以及取自鲱鱼精子中的双链DNA抗原组合而成;所述第二试剂为包含偶联有碱性磷酸酶的抗人IgG抗体的溶液。
优选地,所述混合双链DNA抗原中取自大肠杆菌的双链DNA抗原、取自小牛胸腺的双链DNA抗原和取自鲱鱼精子的双链DNA抗原的质量比为1:0.5-2:0.5-2。
优选地,所述磁微粒分离试剂为表面偶联有亲和素的磁微粒悬浮液,所述亲和素为链霉亲和素,所述磁微粒的直径为0.1-5μm。
优选地,所述第一试剂的制备方法如下:
将取自大肠杆菌的双链DNA抗原与光敏生物素混合,制备生物素化的大肠杆菌的双链DNA抗原,保存备用;
将取自小牛胸腺的双链DNA抗原与光敏生物素混合,制备生物素化的小牛胸腺的双链DNA抗原,保存备用;
将取自鲱鱼精子的双链DNA抗原与光敏生物素混合,制备生物素化的鲱鱼精子的双链DNA抗原,保存备用;
将生物素化的大肠杆菌的双链DNA抗原、生物素化的小牛胸腺的双链DNA抗原以及生物素化的鲱鱼精子的双链DNA抗原混合,并用pH为7-7.5的磷酸盐缓冲液稀释,即得所述的第一试剂,所述第一试剂中双链DNA抗原的浓度为0.5-8ug/mL。
具体的,制备生物素化的大肠杆菌的双链DNA抗原的具体过程为:将大肠杆菌的双链DNA抗原与光敏生物素混合,在紫外光的作用下反应20-40min,加入物质的量浓度为0.01-0.11mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液,在15-30℃下静置10-20min,再加入甘油,获得生物素化的大肠杆菌的双链DNA抗原,在-30-0℃保存备用。
制备生物素化的小牛胸腺的双链DNA抗原的具体过程为:将小牛胸腺的双链DNA抗原与光敏生物素混合,在紫外光的作用下反应20-40min,加入物质的量浓度为0.01-0.11mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液,在15-30℃下静置10-20min,再加入甘油,获得生物素化的小牛胸腺的双链DNA抗原,在-30-0℃保存备用[请检查修改]。
制备生物素化的鲱鱼精子的双链DNA抗原的具体过程为:将鲱鱼精子的双链DNA抗原与光敏生物素混合,在紫外光的作用下反应20-40min,加入物质的量浓度为0.01-0.11mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液,在15-30℃下静置10-20min,再加入甘油,获得生物素化的鲱鱼精子的双链DNA抗原,在-30-0℃保存备用。
优选地,所述第二试剂的制备方法如下:
将抗人IgG抗体加入偶联剂2-亚胺基硫烷盐酸盐中,在15-40℃下静置18-25min,加入甘氨酸溶液,在15-40℃下静置4-5min,用G-25凝胶柱除盐,收集活化的抗人IgG抗体,2-8℃保存备用;
将碱性磷酸酶溶液加入到4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液中,在15-40℃下静置25-35min,用G-25凝胶柱除盐,收集活化的碱性磷酸酶,2-8℃保存备用;
将活化后的抗人IgG抗体和活化后的碱性磷酸酶混合,在2-8℃下静置12-24h,用Supperdex200凝胶纯化柱纯化,获得连接物浓溶液,2-8℃保存备用;
将所述连接物浓溶液用缓冲液稀释,即得所述的第二试剂,所述第二试剂中碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体的浓度为0.1-2.5μg/mL
具体的,所述缓冲液为含质量比为0.1-3%的牛血清白蛋白、pH为7.8-8.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
本发明还提供了一种如上所述的检测试剂盒用于检测抗双链DNA抗体IgG含量的检测方法,包括以下步骤:
步骤1:在检测管中依次加入所述磁微粒分离试剂与第一试剂,然后加入待测样本,混匀,进行第一次温育,其中所述磁微粒分离试剂、第一试剂和待测样本的体积比为1:0.5-2:0.2-0.5;
步骤2:添加磁场,使步骤1温育后的体系在磁场中沉降,去除上清液后,采用所述清洗液清洗;
步骤3:去除磁场,然后向步骤2清洗后的体系中加入所述第二试剂,混匀,进行第二次温育,所述待测样本与第二试剂的体积比为1:4-8;
步骤4:重复步骤2进行再次清洗,去除上清液,去除磁场,然后加入所述化学发光底物,充分混悬后在36-38℃下温育5-10min检测相对发光强度值
相较于现有技术,本发明的一种抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒的有益效果在于:本发明的检测试剂盒的抗原试剂中抗原为偶联有生物素的混合双链DNA抗原,混合双链DNA抗原由取自大肠杆菌中的双链DNA抗原、取自小牛胸腺中的双链DNA抗原和取自鲱鱼精子中的双链DNA抗原组合而成,多来源抗原之间的互补性大大提高临床灵敏度以及线性范围;本发明完成所有流程出结果时间标准为45min,相比酶联免疫吸附法大大缩短了反应时间。
附图说明
图1为实施例六中抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒的检测原理图;
图2为实施例五的抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒与国外知名公司同类产品样本比对相关性结果图;
图3为实施例五的抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒的实际检测浓度与理论浓度的线性回归图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明优选的实施方式进行详细说明。
实施例一第一试剂的制备
1、材料与仪器:
材料:取自大肠杆菌中的双链DNA抗原、取自小牛胸腺中的双链DNA抗原、取自鲱鱼精子中的双链DNA抗原、光敏生物素、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘油、磷酸盐缓冲液;
仪器:试剂低温保存箱。
2、制备步骤:
步骤1:将0.8mg取自大肠杆菌的双链DNA抗原与0.05mg光敏生物素混合,在25℃下静置30min;
步骤2:加入12uL的物质的量浓度为0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液,在25℃下静置15min;
步骤3:加入350uL的甘油,获得生物素化的取自大肠杆菌的双链DNA抗原,在-20℃保存备用;
步骤4:将0.8mg取自小牛胸腺的双链DNA抗原与0.05mg光敏生物素混合,在25℃下静置30min;
步骤5:加入12uL的物质的量浓度为0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液,在25℃下静置15min;
步骤6:加入350uL的甘油,获得生物素化的取自小牛胸腺的双链DNA抗原,在-20℃保存备用;
步骤7:将0.8mg取自鲱鱼精子的双链DNA抗原与0.05mg光敏生物素混合,在25℃下静置30min;
步骤8:加入12uL的物质的量浓度为0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液,在25℃下静置15min;
步骤9:加入350uL的甘油,获得生物素化的取自鲱鱼精子的双链DNA抗原,在-20℃保存备用;
步骤10:将步骤3中制备的生物素化的大肠杆菌的双链DNA抗原、步骤6中制备的生物素化的小牛胸腺的双链DNA抗原以及步骤9中制备的生物素化的鲱鱼精子的双链DNA抗原混合,用pH为7-7.5、物质的量浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液将混合双链DNA抗原稀释成浓度为3ug/mL,即得第一试剂。
实施例二第二试剂的制备
1、材料与仪器:
材料:抗人IgG抗体、2-亚胺基硫烷盐酸盐偶联剂、甘氨酸、碱性磷酸酶、三羟甲基氨基甲烷缓冲液;
仪器:试剂低温保存箱、G-25凝胶柱、Supperdex200凝胶纯化柱。
2、制备步骤:
步骤1:将3mg抗人IgG抗体加入到40mL浓度为10mg/mL的2-亚胺基硫烷盐酸盐偶联剂中,在20℃下静置20min;
步骤2:加入2mL的0.08mol/L甘氨酸溶液,在20℃下静置4min,用G-25凝胶柱除盐,收集活化后抗人IgG抗体,5℃保存备用;
步骤3:将3mg碱性磷酸酶溶液加入到4mg/mL的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液中,在25℃下静置30min,用G-25凝胶柱除盐,收集活化后碱性磷酸酶,5℃保存备用;
步骤4:将活化后的抗人IgG抗体和活化后的碱性磷酸酶混合,在5℃下静置20h,用Supperdex200凝胶纯化柱纯化,获得连接物浓溶液,在5℃保存备用;
步骤5:将步骤4中的连接物浓溶液用含质量比为1%的牛血清白蛋白、pH为7.8-8.0、物质的量浓度为0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释到含碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体的浓度为1μg/mL,即得第二试剂。
实施例三校准品的制备
1、材料与仪器:
材料:抗双链DNA抗体、磷酸盐缓冲液、标准品;
2、制备步骤:
选取抗双链DNA抗体,用pH为7-7.5、物质的量浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液按一定的比例稀释,参照标准品,配制成浓度分别为10RU/mL与400RU/mL的校准品。
实施例四质控品的制备
1、材料与仪器:
材料:抗双链DNA抗体、磷酸盐缓冲液、标准品。
2、制备步骤:
选取抗双链DNA抗体,用pH为7-7.5、物质的量浓度为0.005-0.1mol/L的磷酸盐缓冲液按一定的比例稀释,参照标准品,配制成浓度分别为5RU/mL与80RU/mL的质控品。
实施例五一种抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒
本实施例中的一种抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒,包括:
按照实施例一方法制备的第一试剂(浓度为0.5-8μg/mL),5mL;
按照实施例二方法制备的第二试剂(浓度0.1-2.5μg/mL),30mL;
磁微粒分离试剂,5mL;
按照实施例三方法制备的校准品,1mL;
按照实施例四方法制备的质控品,1mL。
实施例六
实施例五中的检测试剂盒使用全自动化学发光测定仪进行测试,具体包括以下步骤:
步骤1:实施例五的检测试剂盒与本公司全自动化学发光测定仪配套使用,将试剂盒放入全自动化学发光测定仪试剂仓相应位置,试剂盒信息通过条形码扫描仪输入仪器系统或通过仪器配套软件设定。
步骤2:将校准品置于仪器样本仓。通过条形码扫描仪识别校准品信息,并在仪器系统中分配校准品位置。
步骤3:将质控物/待测样本置于仪器样本仓,通过仪器配套软件编辑相应检测信息。
步骤4:启动运行程序,所有校准品/质控物/待检样本处理步骤将自动执行。
当检测试剂盒配合全自动化学发光测定仪配套使用时,从稀释、加样、孵育、清洗以及检测步骤均实现了全自动化,可以无人值守流水操作。全自动封闭操作系统,不仅操作简易方便、可靠性高、稳定性好、检测结果重复性好,避免了人为操作带来的结果偏差,同时有效的提高了检测效率及节省人力成本。
对比例一
本对比例与实施例五制备的试剂盒除了第一试剂的抗原来源不同外,其余成分及来源均相同。
本对比例中的双链DNA抗原为商业化购买所得,且为大肠杆菌中天然提取的单一组分的双链DNA抗原。
对比例二
本对比例与实施例五制备的试剂盒除了第一试剂的抗原来源不同外,其余成分及来源均相同。
本对比例中的双链DNA抗原为商业化购买所得,且为取自小牛胸腺的单一组分的双链DNA抗原。
对比例三
本对比例与实施例五制备的试剂盒除了第一试剂的抗原来源不同外,其余成分及来源均相同。
本对比例中的双链DNA抗原为商业化购买所得,且为取自鲱鱼精子的单一组分的双链DNA抗原。
实施例七
本实施例对实施例五制备的抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒与对比例一、对比例二和对比例三制备的检测试剂盒进行性能评价。
1.样本对比
用实施例五的检测试剂盒对200例血清(100例阴性,100例阳性)检测抗双链DNA抗体的含量,并与国外知名公司同类产品进行临床比对。分别比较了对比例一、对比例二和对比例三的单一抗原及实施例五的混合抗原在符合率之间的差异,结果见下表:
表1临床样本比对符合情况
从表1可以看出,实施例五的抗双链DNA抗体试剂盒阴性符合率为99.0%(99/100),阳性符合率为91%(91/100),说明本发明的抗双链DNA抗体试剂盒临床符合率高,并且本发明试剂盒检测的浓度值与国外知名公司同类产品检测浓度值具有良好的相关性,结果如图2所示。
2.灵敏度
实施例五的抗双链DNA抗体检测试剂盒的LOD为0.01IU/mL,对比例一的检测试剂盒的LOD为0.11IU/mL,对比例二的检测试剂盒的LOD为0.16IU/mL,对比例三的检测试剂盒的LOD为0.03IU/mL,而酶联免疫法的LOD为1IU/mL。
以上结果表明,采用了混合双链DNA抗原的检测试剂盒的灵敏度要高于对比例一、对比例二或对比例三中采用单一组分抗原的灵敏度。
3.线性范围
将一份高值血清按照1/4、1/16、1/64、1/256、1/1028的比例稀释,用实施例五的抗双链DNA抗体检测试剂盒检测稀释样本,以理论浓度与实际检测浓度做线性回归,结果见图3。
4.准确度
在一份基础血清按照9:1的比例都分别添加高值血清、中值血清,各形成2个浓度水平的血清添加样本,检测样本浓度,按下述公式计算回收率。本方法的血清加样回收率在85%-115%之间,数据见表2。
加样回收率=添加后样板值/(0.9*样本A+0.1*样本B)*100%
式中:样本A为基础血清,样本B为添加高值血清、中值血清。
表2血清加样回收率
5.精密度
用实施例五中的试剂盒对三种不同浓度的质控品进行检测,每天两次,分上下午检测,每次重复4次,共检测10天,每种浓度共测定80次,计算变异系数,结果表明变异系数在10%以内,结果见表3。
表3精密度结果
浓度(IU/mL) | 测定次数 | 分析间CV(%) |
10 | 80 | 3.6 |
20 | 80 | 2.7 |
100 | 80 | 5.1 |
6.稳定性
将实施例五中的抗双链DNA抗体检测试剂盒37℃放置7天后,测定高、中、低3个浓度的质控,结果表明3种质控的检测浓度均在质控的浓度范围内。表明抗双链DNA抗体检测试剂盒稳定性好,符合临床要求。
7.特异性
在高、中、低不同浓度值的血清中添加不同浓度的胆红素、血红蛋白、甘油三酯、类风湿因子、人抗小鼠抗体后进行检测,检测结果见表4。
表4特异性结果
干扰物 | 添加浓度 | 交叉反应率(%) |
胆红素 | 20mg/dL | 0.31 |
血红蛋白 | 1000mg/dL | 0.53 |
甘油三酯 | 2000mg/dL | 0.26 |
人抗小鼠抗体 | 2000ng/mL | 0.28 |
类风湿因子 | 1000IU/mL | 0.35 |
上表结果表明,以上各添加物质对实施例五的抗双链DNA抗体检测试剂盒的检测结果没有影响。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围,凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒,其特征在于,包括第一试剂、第二试剂、磁微粒分离试剂、化学发光底物、校准品、质控品以及清洗液;所述第一试剂为包含偶联有生物素的混合双链DNA抗原的溶液,所述混合双链DNA抗原由取自大肠杆菌中的双链DNA抗原、取自小牛胸腺中的双链DNA抗原以及取自鲱鱼精子中的双链DNA抗原组合而成;所述第二试剂为包含偶联有碱性磷酸酶的抗人IgG抗体的溶液。
2.根据权利要求1所述的一种抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒,其特征在于,所述混合双链DNA抗原中取自大肠杆菌的双链DNA抗原、取自小牛胸腺的双链DNA抗原和取自鲱鱼精子的双链DNA抗原的质量比为1:0.5-2:0.5-2。
3.根据权利要求1所述的一种抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒,其特征在于,所述磁微粒分离试剂为表面偶联有亲和素的磁微粒悬浮液,所述亲和素为链霉亲和素,所述磁微粒的直径为0.1-5μm。
4.根据权利要求1所述的一种抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒,其特征在于,所述第一试剂的制备方法如下:
将取自大肠杆菌的双链DNA抗原与光敏生物素混合,制备得到生物素化的大肠杆菌的双链DNA抗原,保存备用;
将取自小牛胸腺的双链DNA抗原与光敏生物素混合,制备得到生物素化的小牛胸腺的双链DNA抗原,保存备用;
将取自鲱鱼精子的双链DNA抗原与光敏生物素混合,制备得到生物素化的鲱鱼精子的双链DNA抗原,保存备用;
将生物素化的大肠杆菌的双链DNA抗原、生物素化的小牛胸腺的双链DNA抗原以及生物素化的鲱鱼精子的双链DNA抗原混合,并用pH为7-7.5的磷酸盐缓冲液稀释,即得所述的第一试剂,所述第一试剂中双链DNA抗原的浓度为0.5-8ug/mL。
5.根据权利要求4所述的一种抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒,其特征在于,制备生物素化的大肠杆菌的双链DNA抗原的具体过程为:将大肠杆菌的双链DNA抗原与光敏生物素混合,在紫外光的作用下反应20-40min,加入物质的量浓度为0.01-0.11 mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液,在15-30℃下静置10-20min,再加入甘油,获得生物素化的大肠杆菌的双链DNA抗原,在-30-0℃保存备用。
6.根据权利要求4所述的一种抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒,其特征在于,制备生物素化的小牛胸腺的双链DNA抗原的具体过程为:将小牛胸腺的双链DNA抗原与光敏生物素混合,在紫外光的作用下反应20-40min,加入物质的量浓度为0.01-0.11 mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液,在15-30℃下静置10-20min,再加入甘油,获得生物素化的小牛胸腺的双链DNA抗原,在-30-0℃保存备用。
7.根据权利要求4所述的一种抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒,其特征在于,制备生物素化的鲱鱼精子的双链DNA抗原的具体过程为:将鲱鱼精子的双链DNA抗原与光敏生物素混合,在紫外光的作用下反应20-40min,加入物质的量浓度为0.01-0.11 mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液,在15-30℃下静置10-20min,再加入甘油,获得生物素化的鲱鱼精子的双链DNA抗原,在-30-0℃保存备用。
8.根据权利要求1所述的一种抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒,其特征在于,所述第二试剂的制备方法如下:
将抗人IgG抗体加入到2-亚胺基硫烷盐酸盐偶联剂中,静置后加入甘氨酸溶液,再静置后收集活化的抗人IgG抗体,保存备用;
将碱性磷酸酶溶液加入到4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液中,静置后收集活化的碱性磷酸酶,保存备用;
将活化后的抗人IgG抗体和活化后的碱性磷酸酶混合,静置后纯化,获得连接物浓溶液,保存备用;
将所述连接物浓溶液用缓冲液稀释,即得所述第二试剂,所述第二试剂中碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体的浓度为0.1-2.5μg/mL。
9.根据权利要求8所述的一种抗双链DNA抗体IgG的检测试剂盒,其特征在于,所述缓冲液为含质量比为0.1-3%的牛血清白蛋白、pH为7.8-8.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
10.一种如权利要求1-9任意一项所述的检测试剂盒用于检测抗双链DNA抗体IgG含量的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1:在检测管中依次加入所述磁微粒分离试剂与第一试剂,然后加入待测样本,混匀,进行第一次温育,其中所述磁微粒分离试剂、第一试剂和待测样本的体积比为1:0.5-2:0.2-0.5;
步骤 2:添加磁场,使步骤1温育后的体系在磁场中沉降,去除上清液后,采用所述清洗液清洗;
步骤 3: 去除磁场,然后向步骤2清洗后的体系中加入所述第二试剂,混匀,进行第二次温育,所述待测样本与第二试剂的体积比为1:4-8;
步骤 4:重复步骤2进行再次清洗,去除上清液,去除磁场,然后加入所述化学发光底物,充分混悬后在36-38℃下温育5-10min检测相对发光强度值。
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