CN104232577A - 一种获得自身反应性b细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获得自身反应性B细胞的方法，本发明所述的方法材料包括生物素铰链的dsDNA和链亲和素化的免疫磁珠。利用本发明所述的dsDNA免疫磁珠方法分选系统性红斑狼疮小鼠模型和病人的自身反应性B细胞，结果显示本发明所述的方法能够有效地分选出高纯度的自身反应性B细胞。高纯度的自身反应性B细胞对自身抗原dsDNA的刺激能快速增殖并有效地产生自身抗体。本发明所述的方法有效地从系统性红斑狼疮小鼠模型和病人体内获得了高纯度的自身反应性B细胞。这为研究体内稀少的自身反应性B细胞的特性和将来自身反应性B细胞的应用建立细胞分选平台。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种从自身免疫性疾病中获得自身反应性B细胞的方法。具体而言，本发明所述的方法材料包括生物素铰链的dsDNA和链亲和素化的免疫磁珠，应用dsDNA免疫磁珠(生物素铰链的dsDNA和链亲和素化的免疫磁珠联用)方法所分选的自身反应性B细胞体外实验表明所述分选方法能有效分选出高纯度的反应性B细胞。
背景技术
随着我国社会经济的发展，自身免疫病的发病率日益上升，而且自身免疫病后期对人们生产、生活乃至生命健康造成的危害是非常严重的。加强该领域的基础性研究将会进一步了解自身免疫性疾病的发生、发展、转归，进而提高对它的诊断、治疗和预防。这对保障人类健康生活，促进经济社会的发展均有着重要的理论及现实意义。
自身免疫性疾病根据组织损伤机制分为两大类：一类是T细胞介导的自身免疫性疾病如多发硬化(MS)，另一类是自身抗体通过结合组织表面的抗原或与可溶性抗原形成免疫复合物而介导的自身免疫性疾病。自身抗体相关的疾病如系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力(MG)和sjogren氏综合症等由于自身抗原特异性B细胞耐受缺失而造成的。在自身抗体如IgG相关的众多的疾病中，辅助性T细胞可促进自身反应性B细胞的反应。近来，许多证据显示，在T细胞驱动的自身免疫紊乱疾病如多发性硬化症、I型糖尿病中，自身反应性B细胞也有着不可忽视的作用。因此，现在清楚众多自身免疫紊乱是由自身反应性T、B细胞协调和共同介导的。
为了研究自身反应性T细胞，人们利用自身反应性T细胞的特性来使用四聚体(tetramer)技术分选。四聚体(tetramer)技术是一种可直接对抗原特异性T细胞(antigen specific T cells，AST)进行标记和检测的方法。该技术利用1个分子的链霉亲合素与4个分子的生物素化主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility comples，MHC)-抗原肽单聚体连接成四聚体复合物，显著增加了其与T细胞受体(T-cell receptor，TCR)的亲和力，因而使AST的测定敏感性大为提高，被诺贝尔奖获得者Doherty教授称之为定量检测AST的金标准(包括抗原特异性效应T细胞和记忆性T细胞)[Altman JD，Moss PAH，Goulder PJR，et al.Science，1996，274：94]。除此之外，四聚体技术结合细胞表面标志分子、细胞内效应分子染色(如各种细胞因子、趋化因子和细胞毒素)，以及通过对四聚体阳性T细胞的进一步分选等，可实现对AST活化增殖、凋亡老化及功能的评估，为阐明特定AST在疾病发生、发展及防治中的作用提供重要的研究手段[Bodinier M，Peyrat MA，Tournay C，et al.Nature Med.2000，6：707.]。MHC-肽与TCR作用的分子基础MHC-肽与TCR作用的分子基础是基于T细胞膜上表位特异性TCR对抗原呈递细胞(APC)、靶细胞表面并与MHC分子结合成复合物[Romero P，Dunbar PR，Valmori D，et al.J Exp Med，1998，188：1641.]。
然而，对于自身反应性B细胞没有很好的分选方法，这极大的限制对自身反应性B细胞的基础研究和临床应用。为了开展对自身反应性B细胞的基础研究，现在一般使用某个自身反应性B细胞的转基因小鼠[Pasquali JL，Soulas-Sprauel P，Korganow AS，Martin T，Auto-reactive B cells in transgenic mice.J Autoimmun.2007.29：250-256.]。抗dsDNA抗体的自身反应性B细胞特异地在SLE病人体内存在，而在正常健康人体中则检测不到[Erikson J，Radic MZ，Camper SA，Hardy RR，Carmack C，Weigert M.Expression of anti-DNAimmunoglobulin transgenes in non-autoimmune mice.Nature 1991.349：331-344.]。多种针对dsDNA自身反应性B细胞转基因小鼠被建立来研究抗dsDNA抗体的自身反应性B细胞的特性，发育等[Xu H，Li H，Suri-Payer E，Hardy RR，Weigert M.Regulation of anti-DNA B cells in recombination-activating gene-deficient mice.JExp Med.1998，188：1247-54.]。尽管，通过对自身反应性B细胞转基因小鼠的研究获得了大量的有关自身反应性B细胞的知识。然而，仍然不能很好地分选自身反应性B细胞，进而，限制对自身反应性B细胞的临床应用，如分选人自身反应性B细胞通过体外诱导产生调节性B细胞然后回输调节性B细胞进行治疗自身免疫性疾病的研究。
发明内容
为解决分选自身反应性B细胞的技术难题，本发明公开了一种分选自身反应性B的方法——dsDNA免疫磁珠法，所述方法材料包括生物素铰链的dsDNA和链亲和素化的免疫磁珠。
本发明通过上述dsDNA免疫磁珠(生物素铰链的dsDNA和链亲和素化的免疫磁珠联用)分选自身反应性B细胞，具体包括以下步骤：
1)寡DNA片段通过3’末端标记生物素
获得胎牛胸腺，通过研磨获得细胞悬液，应用Trizol方法获得全基因组DNA。全基因组DNA通过超声破碎获得寡脱氧核糖核酸。最后通过argrose分选出100pb-1000bp的寡脱氧核糖核酸。
DNA探针的生物素标记反应体系为：
| Ultrapure water | 29μl |
| TdT buffer(5X) | 10μl |
| 待标记的100pb-1000bp的寡脱氧核糖核酸(1μm) | 5μl |
| Biotin-11-dUTP(5μm) | 5μl |
| TdT(10U/μl) | 1μl |
| 总体积 | 50μl |
用枪轻轻吹打混匀，37℃孵育30分钟。加入2.5μl探针标记终止液，轻轻混匀终止反应。
TdT的去除：探针标记反应终止后，加入52.5μl氯仿-异戊醇(24∶1)，vortex使有机相和水相充分混合以抽提TdT。12000-14000g离心1-2分钟。吸取上清即为被生物素标记的寡脱氧核糖核酸。
生物素标记的寡脱氧核糖核酸的纯化。对于100μl标记好的寡脱氧核糖核酸，加入1/4体积即25μl的5M醋酸铵，再加入2体积即200μl的无水乙醇，混匀。-70℃至-80℃沉淀1小时。4℃，12000-16000g离心30分钟，小心去除上清。4℃，12000-16000g离心1分钟，小心吸去残余液体。微晾干沉淀。加入50μl TE，完全溶解沉淀。标记好的寡脱氧核糖核酸可以-20℃保存。
2)链亲和素化的免疫磁珠
链亲和素(Streptavidin)和免疫磁珠Magnetic Bead(1-2um)通过化学铰链剂铰链。
链亲和素(Streptavidin)和免疫磁珠Magnetic Bead(1-2um)铰链反应体系为：
| 铰链buffer(5X) | 10μl |
| 链亲和素(1μm) | 10μl |
| 免疫磁珠(5μm) | 10μl |
| 化学铰链剂(10μm) | 20μl |
| 总体积 | 50μl |
链亲和素免疫磁珠再悬在10mM Tris，0.15M Nacl，0.1％BSA，1mMEDTA，pH7.4，0.1％ NaN3溶液中供使用。
使用前轻摇链亲和素免疫磁珠液。取出要用的量到Ep管中。放Ep管到磁性分选仪上。让液体静止2-3分钟直到上清变清。用同样的方法用PBS洗磁珠两次备用。
3)生物素铰链的dsDNA和链亲和素化的免疫磁珠联用分选自身反应性B细胞
每50μl链亲和素化的免疫磁珠混合5-10μg生物素化的dsDNA。加1ml结合buffer(1XPBS，0.1％ BSA，pH7.4)到反应管中。在室温摇动30分钟。然后放反应管到磁性分选仪上。让液体静止1-3分钟，然后完全去除上清。用同样的方法重复洗2-4次。加入合适量的buffer再悬dsDNA-免疫磁珠(dsDNA通过生物素和链亲和素铰链到免疫磁珠上)。
分离人外周血或小鼠脾中淋巴细胞，让每ml 1X107细胞再悬在buffer(1XPBS，0.1％BSA，pH7.4)中，加入抗小鼠CD43-FITC，用流式细胞仪分选出CD43-B细胞。CD43-B细胞再悬在buffer(1XPBS，0.1％ BSA，pH7.4)中，然后加入dsDNA-免疫磁珠，在4℃放置20分钟。然后放反应管到磁性分选仪上。让液体静止1-3分钟，然后完全去除上清。用同样的方法重复洗2-4次。加入合适量的buffer再悬dsDNA-免疫磁珠(含有结合到dsDNA的自身反应性B细胞)。
4)分选的自身反应性B细胞的评价：
本发明用dsDNA免疫磁珠(生物素铰链的dsDNA和链亲和素化的免疫磁珠)联合分选SLE小鼠自身反应性B细胞在体外对自身抗原dsDNA的刺激产生有效的增殖效应。
本发明用dsDNA免疫磁珠分选SLE小鼠自身反应性B细胞在体外对自身抗原dsDNA的刺激产生大量的自身抗体。
本发明用dsDNA免疫磁珠分选SLE病人自身反应性B细胞在体外对自身抗原dsDNA的刺激产生有效的增殖效应。
本发明用dsDNA免疫磁珠分选SLE病人自身反应性B细胞在体外对自身抗原dsDNA的刺激产生大量的自身抗体。
本发明通过上述实验检测了本发明用dsDNA免疫磁珠分选自身反应性B细胞的效果，显示本发明的分选方法能有效地分选自身反应性B细胞。
附图说明
图1从SLE小鼠中分选的自身反应性B细胞在体外对自身抗原dsDNA的增殖效应；
图2自身抗原dsDNA诱导分选的SLE小鼠自身反应性B细胞的抗体产生；
图3从SLE病人中分选的自身反应性B细胞在体外对自身抗原dsDNA的增殖效应；
图4自身抗原dsDNA诱导分选的SLE病人自身反应性B细胞的抗体产生。
实施例1dsDNA免疫磁珠分选的SLE小鼠自身反应性B细胞的增殖能力
一材料和方法
1、材料
NZB/W(杂交1代)小鼠、BXSB小鼠及MRL/1Pr小鼠三种品系自发SLE的小鼠模型购买自军事医学科学院动物中心；3H-TdR购自原子能研究所。
2、方法
2.1、淋巴组织的预处理
a)将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水；
b)用剪刀将组织剪至匀浆状；
c)加入10ml生理盐水；
d)用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中；
e)离心沉淀1000rpm，3-5min，再用生理盐水洗3遍，每次以低速(500-800rpm)短时离心沉淀去除细胞碎片；
f)以300目尼龙网滤去细胞团块；
g)细胞保存备用。
2.2、细胞样品处理
a)取2×107个细胞，用冷的PBS2ml洗涤细胞一次，800rpm离心5min；
b)用2ml冷的PBS重悬细胞；
c)用CD43标记淋巴细胞；
d)细胞流式仪分选CD43-B细胞；
e)用2ml冷的PBS重悬细胞，PBS洗涤两次；
f)用dsDNA磁珠分选B细胞。
2.3、实验分组
dsDNA免疫磁珠分选SLE小鼠后得到：
(1)dsDNA阳性B细胞
(2)dsDNA阴性B细胞。
2.4、B细胞对自身抗原dsDNA反应性的检测
a)将(1)dsDNA阳性B细胞；(2)dsDNA阴性B细胞-再培养
b)用一系列浓度(0，5，10，20μg/ml)的自身抗原dsDNA刺激细胞3天；；
c)在第三天加入0.5μCi3H-TdR；；
d)16小时后，用细胞闪烁仪读取数据，结果表示为CPM±S.E.
二结果
数据分析：采用SPSS16.0软件对数据进行统计分析，两组间的比较采用t检验法。
图1显示与dsDNA阴性B细胞相比，dsDNA阳性B细胞对自身抗原dsDNA反应显著增强(P＜0.01)。这显示dsDNA免疫磁珠分选的SLE小鼠自身反应性B细胞有高能力的自身反应性。
实施例2dsDNA免疫磁珠分选的SLE小鼠自身反应性B细胞的抗体分泌能力
一材料和方法
1、材料
NZB/W(杂交1代)小鼠、BXSB小鼠及MRL/1Pr小鼠三种品系自发SLE的小鼠模型购买自军事医学科学院动物中心；抗小鼠二抗-HRP购自R&D公司。
2、方法
2.1、淋巴组织的预处理
a)将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水；
b)用剪刀将组织剪至匀浆状；
c)加入10ml生理盐水；
d)用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中；
e)离心沉淀1000rpm，3-5min，再用生理盐水洗3遍，每次以低速(500-800rpm)短时离心沉淀去除细胞碎片；
f)以300目尼龙网滤去细胞团块；
g)细胞保存备用。
2.2、细胞样品处理
a)取2×107个细胞，用冷的PBS2ml洗涤细胞一次，800rpm离心5min；
b)用2ml冷的PBS重悬细胞；
c)用CD43标记淋巴细胞；
d)细胞流式仪分选CD43-B细胞；
e)用2ml冷的PBS重悬细胞，PBS洗涤两次；
f)用dsDNA磁珠分选B细胞。
2.3、实验分组
dsDNA免疫磁珠分选SLE小鼠后得到：
(1)dsDNA阳性B细胞
(2)dsDNA阴性B细胞。
2.4、血清中抗双链DNA抗体的检测
a)设1孔只加入100μL的稀释液作为空白对照，2孔加入100μL阴性质控物作为阴性对照，2孔加入100μL阳性质控物作为阳性对照，按1～5顺序加入5种校准品，每种2孔，每孔100μL，用于绘制浓度曲线。将待检血清稀释液加入剩余的孔中，每孔加入100μL稀释后的样品；
b)将样品板放入摇床中，室温震荡1小时；
c)弃去各孔内的液体，向孔中加入200μL洗涤缓冲液，静置数秒，弃去，将板在吸水纸上拍干。重复洗涤3次；
d)向各孔中加入100μL酶联物，放入摇床中，室温震荡45分钟；
e)重复步骤(3)；
f)向各孔中加入100μLTMB底物，置于阴暗处显色10分钟；
g)向各孔中加入50μL终止液，10分钟内测定450nm波长的OD值，参考波长为630nm。
h)通过绘制校准品的OD值与其标示浓度(IU/mL)的线性曲线，可由样本OD值计算其对应的抗体浓度。
二结果
数据分析：采用SPSS16.0软件对数据进行统计分析，两组间的比较采用t检验法。
图2显示与dsDNA阴性B细胞相比，dsDNA阳性B细胞对自身抗原dsDNA的刺激显著地分泌自身抗体(P＜0.01)。这显示dsDNA免疫磁珠分选的SLE小鼠自身反应性B细胞有高能力的自身反应性。
实施例3dsDNA免疫磁珠分选的SLE病人自身反应性B细胞的增殖能力
一材料和方法
1、材料
SLE病人来自北京协和医院和朝阳医院；3H-TdR购自原子能研究所。
2、方法
2.1、SLE病人外周血分离
a)将SLE病人外周血加入等量生理盐水；
b)用人淋巴细胞分离液分离人淋巴细胞；
2.2、细胞样品处理
a)取2×107个细胞，用冷的PBS2ml洗涤细胞一次，800rpm离心5min；
b)用2ml冷的PBS重悬细胞；
c)用CD43标记淋巴细胞；
d)细胞流式仪分选CD43-B细胞；
e)用2ml冷的PBS重悬细胞，PBS洗涤两次；
f)用dsDNA磁珠分选B细胞。
2.3、实验分组
dsDNA免疫磁珠分选SLE病人外周血的B淋巴细胞后得到：
(1)dsDNA阳性B细胞
(2)dsDNA阴性B细胞。
2.4、B细胞对自身抗原dsDNA反应性的检测
a)将(1)dsDNA阳性B细胞；(2)dsDNA阴性B细胞-再培养
b)用一系列浓度(0，5，10，20μg/ml)的自身抗原dsDNA刺激细胞3天；；c)在第三天加入0.5μCi 3H-TdR；；
d)16小时后，用细胞闪烁仪读取数据，结果表示为CPM±S.E.
二结果
数据分析：采用SPSS16.0软件对数据进行统计分析，两组间的比较采用t检验法。
图3显示与dsDNA阴性B细胞相比，dsDNA阳性B细胞对自身抗原dsDNA反应显著增强(P＜0.01)。这显示dsDNA免疫磁珠分选的SLE病人自身反应性B细胞有高能力的自身反应性。
实施例4dsDNA免疫磁珠分选的SLE病人自身反应性B细胞的抗体分泌能力
一材料和方法
1、材料
SLE病人来自北京协和医院和朝阳医院；抗人二抗-HRP购自R&D公司。
2、方法
2.1、SLE病人外周血分离
a)将SLE病人外周血加入等量生理盐水；
b)用人淋巴细胞分离液分离人淋巴细胞；
2.2、细胞样品处理
a)取2×107个细胞，用冷的PBS2ml洗涤细胞一次，800rpm离心5min；
b)用2ml冷的PBS重悬细胞；
c)用CD43标记淋巴细胞；
d)细胞流式仪分选CD43-B细胞；
e)用2ml冷的PBS重悬细胞，PBS洗涤两次；
f)用dsDNA磁珠分选B细胞。
2.3、实验分组
dsDNA免疫磁珠分选SLE病人外周血的B淋巴细胞后得到：
(1)dsDNA阳性B细胞
(2)dsDNA阴性B细胞。
2.4、血清中抗双链DNA抗体的检测
a)设1孔只加入100μL的稀释液作为空白对照，2孔加入100μL阴性质控物作为阴性对照，2孔加入100μL阳性质控物作为阳性对照，按1～5顺序加入5种校准品，每种2孔，每孔100μL，用于绘制浓度曲线。将待检血清稀释液加入剩余的孔中，每孔加入100μL稀释后的样品；
b)将样品板放入摇床中，室温震荡1小时；
c)弃去各孔内的液体，向孔中加入200μL洗涤缓冲液，静置数秒，弃去，将板在吸水纸上拍干。重复洗涤3次；
d)向各孔中加入100μL酶联物，放入摇床中，室温震荡45分钟；
e)重复步骤(3)；
f)向各孔中加入100μLTMB底物，置于阴暗处显色10分钟；
g)向各孔中加入50μL终止液，10分钟内测定450nm波长的OD值，参考波长为630nm。
h)通过绘制校准品的OD值与其标示浓度(IU/mL)的线性曲线，可由样本OD值计算其对应的抗体浓度。
二结果
数据分析：采用SPSS16.0软件对数据进行统计分析，两组间的比较采用t检验法。
图4显示与dsDNA阴性B细胞相比，dsDNA阳性B细胞对自身抗原dsDNA的刺激显著地分泌自身抗体(P＜0.01)。这显示dsDNA免疫磁珠分选的SLE病人自身反应性B细胞有高能力的自身反应性。
Claims (11)
1.一种自身反应性B细胞的分选方法，其特征在于，所述分选材料包括生物素铰链的dsDNA和链亲和素化的免疫磁珠。
2.权利要求1所述的自身反应性B细胞的分选方法，其特征在于，所述的生物素铰链的dsDNA为DNA通过3’端与生物素铰链。
3.权利要求1所述的自身反应性B细胞的分选方法，其特征在于，所述的dsDNA为大小不同的寡脱氧核糖核酸。
4.权利要求1所述的自身反应性B细胞的分选方法，其特征在于，所述的链亲和素化的免疫磁珠为链亲和素共价键铰链的免疫磁珠。
5.权利要求1-4中任意一项所述的细胞分选材料，其特征在于，生物素铰链的dsDNA和链亲和素化的免疫磁珠质量体积比(μg/ul)为0.5～10∶1。
6.权利要求1-4中任意一项所述的细胞分选材料，其特征在于，生物素铰链的dsDNA和链亲和素化的免疫磁珠的质量比为1∶4。
7.权利要求3所述的细胞分选材料，其特征在于，所述的大小不同的寡脱氧核糖核酸为100pb-1000pb dsDNA。
8.权利要求1-4所述的细胞分选材料，其特征在于，所述的大小不同的寡脱氧核糖核酸为100pb-1000pb dsDNA还包括其它的抗原分子如ssDNA等。
9.权利要求1-4中任意一项所述的细胞分选材料，在分选自身免疫性疾病中自身反应性B细胞的应用。
10.权利要求8所述的自身免疫性疾病，其特征在于，所述的自身免疫性疾病为自身抗体相关的免疫性疾病，包括系统性红斑狼疮、重症肌无力、干燥综合症。
11.权利要求1-4中任意一项所述的自身免疫性B细胞分选方法，其特征在于，所述分选方法所分选出的自身免疫性B的临床应用。
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Granted publication date: 20171201 Termination date: 20210620 |
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