CN103502515A - 自身免疫疾病的抗原替代物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了针对自身免疫疾病寻常天疱疮的天然抗原的抗原替代物的鉴定。使用针对自身免疫疾病的已知抗体所筛选的大的随机类肽或环状类肽文库发现配体。所述配体可用作治疗此类疾病的药物，并且可结合与自身免疫障碍相关的T细胞的伴随去除进行使用。

Description

自身免疫疾病的抗原替代物
本申请要求2011年1月10日提交的美国临时申请序列No.61/431,328的优先权，该临时申请通过引用整体并入本文。
发明背景
1.发明领域
本发明总体上涉及分子生物学、免疫学和医学领域。更具体地，本发明涉及被存在于自身免疫疾病和病况中的自身抗体识别的类肽的鉴定。这些类肽或其它配体可用于鉴定患有自身免疫疾病或处于发生所述疾病的风险中的受试者，以及用于防止自身抗体攻击天然抗原，从而治疗疾病或病况。
2.相关领域描述
许多自身免疫疾病的分子基础尚不清楚。对自身免疫疾病的诊断试剂和有效疗法的开发的现有技术水平远非最佳，部分原因是由于这种分子水平理解的缺乏。例如，不存在用于诊断大多数自身免疫疾病的高度可靠的血清蛋白质。几乎没有例外，用于治疗此类病况的药物会抑制自身免疫反应本身的下游事件例如炎症，或试图非选择性地调节或抑制整个免疫系统(Hemmer & Hartung,2007)，两者均具有显著的不期望的副作用。对于诊断和治疗性应用，理想的是具有直接靶向自体反应B细胞(以及它们产生的抗体)和T细胞，但忽略识别外来抗原的B和T细胞的分子。本申请已提交了涵盖某些此类分子和方法的专利申请美国序列No.12/789,711，该申请通过引用并入本文。此类分子可用作诊断试剂和用于检测和富集自身免疫抗体、B细胞和T细胞的研究工具。此外，此类分子可用作用于目的在于清除此类自体反应的细胞而不影响免疫系统的正常功能的新颖药物开发项目的基础。还已知微阵列上的某些随机配体文库可筛选各种疾病相关生物标志物。美国专利申请序列No.11/433,069(也据此通过引用并入本文)教导了可针对具有疾病相关生物标志物(包括抗体和与自身免疫疾病相关的抗体)的生物样品制备和筛选的各种随机配体文库。本发明在另一个方面涉及筛选针对自身抗体的配体文库，以发现用于结合自身抗体以防止其引起或激发特定自身免疫疾病的抗原替代物的方法，已知所述自身抗体与特定自身免疫疾病相关。此外，此类配体还可用作筛选个体的自身免疫疾病和病况的诊断试剂。在优选实施方案中，本发明涉及筛选针对至少一种与免疫疾病相关的自身抗体的环状类肽配体的文库。美国专利申请序列No.12/905,605(据此通过引用并入本文)教导了环状类肽文库的制备。在另一个优选实施方案中，筛选可以是组合筛选，其中根据专利申请序列号12/789,711中公开的方法，针对配体文库筛选B细胞、T细胞或产生此类抗体或引起此类抗体产生的其它细胞以发现此类B细胞或T细胞的高亲和力配体，其中所述配体对于产生此类自身抗体的B细胞和/或帮助刺激此类抗体产生性细胞的产生的T细胞具有高度选择性，但对于健康细胞或与此类自身免疫障碍无关的细胞无选择性。将用于将此类B细胞和/或T细胞拉出需要此治疗的患者的血液或体液的方法与利用根据本文中公开的方法发现的高亲和力配体进行的这类患有这样的自身免疫障碍的患者的治疗(通过针对与疾病相关的已知自身抗体筛选配体文库以除去从此类B细胞产生的或在T细胞帮助下由B细胞产生的自身抗体和/或减轻所述自身抗体的作用)组合。针对此类已知自身抗体筛选的文库大小，取决于支持系统，可在10,000至100万个配体之间的范围内。通过本领域中所公开的方法来制备配体文库。此类参考文献可见于例如美国序列No.11/433,069，其据此通过引用并入本文中。
发明概述
本发明提供了使用合成分子(即配体，其结合配体结合部分)，例如蛋白质、核酸、碳水化合物或存在于复杂生物混合物中的非贴壁细胞作为用于治疗自身免疫障碍的药物的方法。通过与自身免疫疾病或障碍相关的已知的自身抗体的文库筛选发现此类配体。根据本文中描述的方法发现的具有高度选择性的配体可具有广泛的结构，并且包括结合自身抗体或对自身抗体具有亲和力的任何配体。
因此，根据本发明，提供了鉴定被自身抗体特异性识别的配体或类肽的方法，其包括：(a)提供选自肽、核酸、类肽、环状类肽、碳水化合物或其它化学文库的合成或天然分子的配体文库，和(b)将所述配体文库暴露于与任何特定自身免疫疾病或障碍相关的自身抗体；和(c)鉴定结合自身免疫抗体的那些配体。
本发明还包括此类鉴定的配体用于治疗相关的自身免疫疾病或病况的用途。所述配体对于自身抗体通常可具有至少微摩尔的亲和力，优选纳摩尔的亲和力。所述用途包括治疗有此需要的患者的方法，其包括以药物组合物的形式给患者施用配体。药物组合物包含与药学上可接受的赋形剂组合的在筛选方法中发现的配体。递送方法可以是通过任何已知的方法，其包括口服递送或胃肠外递送。
自身免疫疾病可以是多发性硬化或类风湿关节炎或许多其它自身免疫疾病或障碍，包括寻常天疱疮。
配体或类肽可以是3聚体、4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9聚体或10聚体或更大的寡聚体(例如，11聚体或16聚体)。配体可以是任何类型的限制性寡聚体。具体地，类肽的限制性寡聚体优选用于本发明。本发明从而涉及利用限制性寡聚体治疗自身障碍或病况的方法。术语“限制性”是相对术语，在本申请中，更具限制性的寡聚体包括相对地比例如线性类肽或线性类肽样部分更具限制性的环状类肽和其它寡聚体。用于治疗自身免疫障碍例如寻常天疱疮的更优选化合物包括此类限制性寡聚体如环状类肽。本发明从而涉及治疗自身障碍或病况的方法，其包括施用治疗有效量的限制性配体，其选自类肽或类肽样分子，包括环状类肽或其它此类分子(所述分子相对更硬并且与这样的分子的“结合构象”相似)。术语“结合构象”意指当分子结合至自身抗体上的特定靶受体部位或活性部位时分子的构象。结合的配体或限制性配体在本文中也称为抗原替代物。限制性的或“更硬的”类肽具体地见于美国申请No.12/905,605(公布为US2011/0092384)中，该申请明确地通过引用并入本文。
还可将根据本文中引用的筛选方法发现的抗原替代物与通过鉴定被自身免疫T或B细胞特异性识别的配体的方法发现或发现的配体组合使用，包括：
(a)提供来自健康受试者的第一Ｔ细胞或B细胞群体，其中所述群体利用第一可检测标记物进行标记；
(b)提供来自患有自身免疫疾病的受试者的第二T细胞或B细胞群体，其中所述群体利用第二可检测标记物进行标记；
(c)使所述第一和第二T细胞或B细胞群体与多种候选配体接触；和
(d)评价所述第一和第二T细胞或B细胞群体与所述候选配体的结合，其中如果所述配体结合所述第二T细胞或B细胞群体但不结合所述第一T细胞或B细胞群体，则所述配体被自身免疫但非健康T细胞或B细胞识别。
上述第一和第二标记物可以是荧光标记物或化学发光标记物或量子点或本领域已知的任何其它已知标记物。
可将本文中描述的过程或方法的任一个中使用的类肽或配体结合至载体，例如珠粒、芯片、滤纸、浸渍片(dipstick)、微阵列、膜、聚合物基质或孔。接触步骤，在当与自身抗体筛选的使用组合使用时筛选T细胞的情况下，可包括将所述载体与所述第一和第二T细胞群体同时接触。T细胞群体可包含CD4+T细胞。受试者可以是人或动物。
在另一个实施方案中，提供了从患有自身免疫疾病的受试者除去自身抗体的方法，所述方法包括施用特异性结合自身免疫抗体的配体或类肽。自身免疫疾病可以是多发性硬化或类风湿性关节炎或其它众多自身免疫疾病或病况的任一种。
配体或类肽可以是3聚体、4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9聚体或10聚体或更大。图1中显示的“R”基团可以是本文中引用的或美国申请No.12/789,711或美国申请No.12/791,389中描述的任何类肽取代基，所述美国申请据此通过引用并入本文。图1中显示的结构中的“n”优选为3，但可以为2-7。
配体或类肽可以是3聚体、4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9聚体或10聚体。对于一些联合疗法实施方案，当与本文中公开的配体组合使用或组合时，毒素可以是蓖麻蛋白、白喉毒素或霍乱毒素。或者毒素可以是光活化毒素例如三联吡啶钌(Ⅱ)，步骤(b)还可包括将所述样品暴露于可见光。样品可以是血液、脑脊髓液或精液。所述方法还可包括从所述受试者获得所述样品。受试者可以是人或动物。
在另一个实施方案中，提供了联合疗法，其包括(1)杀伤获自或存在于患有自身免疫疾病的受试者中的自身免疫T细胞的方法，所述方法包括(a)提供特异性结合自身免疫T细胞的配体或类肽，其中将所述配体或类肽缀合至含IgG Fc的分子；和(b)使自身免疫T细胞群体与所述缀合物接触足以允许至少一种自身免疫T细胞与所述缀合物结合的时间，其中所述缀合物将免疫效应物募集至所述自身免疫T细胞，从而导致其死亡。可先体外后体内处理自身免疫T细胞群体，所述方法还可包括将步骤(b)的样品回送至所述受试者，以及(2)利用抗原替代物治疗所述患者。自身免疫疾病可以是多发性硬化或类风湿性关节炎或任何自身免疫疾病。在本发明中，实施方案包括将该方法(1)与利用通过本文中引用的方法发现的抗原替代物进行的患者的治疗组合使用。
配体或类肽可以是3聚体、4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9聚体或10聚体或更大。含IgG Fc的分子可以是抗体、单链抗体或Fc片段，例如将抗体或单链抗体，将所述配体或类肽附着至所述抗体的抗原结合位点或缺乏IgG可变区的Fc片段，将所述配体或类肽附着至所述Fc片段的羧基末端。如果筛选T细胞或其它细胞，样品可以是血液、脑脊髓液或血清。所述方法还可包括从所述受试者获得所述样品。受试者可以是人或动物。在自身抗体配体的初始筛选的情况下，样品是已知的或分离的自身抗体或包含所述抗体。该自身抗体可以是标记的或非标记的结合至配体抗体的自身抗体，所述配体抗体可用标记第二抗体检测。样品优选是稀释的具有已知的自身抗体的样品。
为了诊断目的，一旦检测到和鉴定抗原替代物，就可将所述抗原替代物单独地或与T细胞试剂盒组合地或与T细胞配体组合地用于诊断试剂盒以检测患者样品的自身免疫疾病。
在某些实施方案中，将本发明的化合物与抗原替代物组合使用，其中用于自身免疫T细胞检测的化合物具有下式：
式II
Figure BDA0000373564180000061
式III
Figure BDA0000373564180000071
其中n是0-8；L是接头；Y是毒素或抗体片段；Z是NH2、N(C1-C6烷基)2、OH或O(C1-C6烷基)；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8(大于4的n的每一个值将下一个R基团按数字顺序添加至式II或式III)可以是氢；烷基；烯丙基；甲基；乙基；正丙基；异丙基；正丁基；异丁基；仲丁基；叔丁基；戊基；己基；异戊基；芳基；杂芳基；呋喃基；吲哚基；硫苯基；噻唑基；咪唑基；异噁唑基；噁唑基；胡椒基；吡唑基；吡咯基；吡嗪基；吡啶基；嘧啶基；嘧啶基；嘌呤基；噌啉基；苯并呋喃基；苯并噻吩基；苯并三唑基；苯并噁唑基；喹啉；异噁唑基；异喹啉环烷基；烯基；环烯基；苯基；吡啶基；甲氧基乙基；(R)-甲基苄基；未被取代或被NH2、OH或SH取代的C1-C6烷基；未被取代或被NH2、OH或SH取代的C2-C6炔基。
在某些方面，R1是末端被NH2取代的C1-C6烷基，特别是4氨基丁烷。
在其它方面，R2是末端被NH2取代的C1-C6烷基，特别是4氨基丁烷。
在其它方面，R3是C1-C6烷基，特别是异丁基。
在某些方面，R4是末端被NH2取代的C1-C6烷基，特别是4氨基丁烷。
在其它方面，R5是(R)-甲基苄基。
在其它方面，R6是呋喃基。
在某些方面，R7是末端被NH2取代的C1-C6烷基，特别是4氨基丁烷。
在其它方面，R8是C1-C6烷基，特别是异丁基。
本发明的某些实施方案包括8聚体，其中R1、R2、R4和R7是4-氨基丁烷；R3和R8是异丁基；R5是(R)-甲基苄基；R6是呋喃基(化合物AG12A)。AG12A可以赖氨酰(4-氨基丁烷)、羟基或羧基封端。
在其它方面，末端R基以赖氨酰基、羧基或羟基封端。
在本发明的其它实施方案中，通过本发明的方法发现的抗原替代物(包括候选类肽或环状类肽)也可在类肽的胺上具有上面指定的R基团的任一个作为取代基。当本发明包含针对寻常天疱疮的自身抗体的抗原替代物时，优选化合物是式I的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0000373564180000081
其中R1-R5独立地选自氢；烷基；烯丙基；甲基；乙基；正丙基；异丙基；正丁基；异丁基；仲丁基；叔丁基；戊基；己基；异戊基；芳基；杂芳基；呋喃基；吲哚基；硫苯基；噻唑基；咪唑基；异噁唑基；噁唑基；胡椒基；吡唑基；吡咯基；吡嗪基；吡啶基；嘧啶基；嘧啶基；嘌呤基；噌啉基；苯并呋喃基；苯并噻吩基；苯并三唑基；苯并噁唑基；喹啉；异噁唑基；异喹啉环烷基；烯基；环烯基；苯基；吡啶基；甲氧基乙基；(R)-甲基苄基；C1-C6烷基；其各自可独立地未被取代或被以下各项取代：卤素(Cl、F、Br、I)、-NH2、-OH、-OC1-C6烷基或-SH；未被取代或被NH2、OH或SH取代的C2-C6炔基。将环状类肽通过上文中显示的分子的左侧上的酰胺部分的NH2基团连接至载体例如微阵列或其它载体。
在优选实施方案中，在寻常天疱疮中用作抗原替代物的环状类肽是：
Figure BDA0000373564180000091
本发明还涉及治疗患有自身免疫障碍的患者的方法，其包括施用选自限制性寡聚体的抗原替代物。所述方法优选涉及治疗其中自身免疫障碍选自寻常天疱疮的所述患者的方法。优选地，在所述方法中，限制性寡聚体选自类肽或类肽样部分。
本发明还包括药物组合物，其包含选自限制性寡聚体的抗原替代物和药学上可接受的赋形剂。
本发明还包括鉴定被自身免疫T细胞特异性识别的限制性配体的方法，其包括：
(a)提供来自健康受试者的第一T细胞群体，其中所述群体利用第一可检测标记物进行标记；
(b)提供来自怀疑患有或患有自身免疫疾病或障碍的受试者的第二T细胞群体，其中所述群体利用第二可检测标记物进行标记；
(c)使所述第一和第二T细胞群体与多种限制性配体或限制性配体与非限制性配体的组合接触；和
(d)评价所述第一和第二T细胞群体与所述限制性配体或限制性配体与非限制性配体的组合的结合。
在所述方法中，优选的自身免疫疾病或障碍是寻常天疱疮。
本发明还包括从患有自身免疫疾病或障碍的受试者除去自身免疫T细胞的方法，其包括：
(a)提供特异性结合自身免疫T细胞的限制性配体，其中将所述限制性配体结合至载体；
(b)将使来自所述受试者的含T细胞样品与所述载体结合的限制性配体接触足以允许自身免疫T细胞与述载体结合的限制性配体结合的时间；和
(c)将所述载体与所述样品分离。
所述方法还包括将步骤(c)的所述样品回送至所述样品。
在所述方法中，优选的自身免疫疾病或障碍是寻常天疱疮。
本发明还涉及用于治疗自身免疫疾病或病况的疫苗，其包含限制性寡聚体。当作为单独的疫苗或与疫苗佐剂组合的疫苗施用时所述疫苗或抗原替代物的施用足以治疗自身免疫疾病或病况。
本发明还涉及杀伤从患有自身免疫疾病或障碍的受试者获得的自身免疫T细胞的方法，其包括：
(a)提供特异性结合自身免疫T细胞的限制性配体，其中所述配体缀合至毒素；
(b)将来自所述受试者的所述含T细胞的样品与所述缀合物接触足以允许至少一种自身免疫T细胞与所述缀合物结合的时间，其中所述缀合物引起所述自身免疫T细胞的死亡。
所述方法还包括先体外后体内处理样品，并且将样品回送至所述受试者。
上述优选治疗方法涉及选自寻常天疱疮的自身免疫疾病或障碍。
本发明还涉及杀伤获自或存在于患有自身免疫疾病或障碍的受试者中的自身免疫T细胞的方法，其包括：
(a)提供特异性结合自身免疫T细胞的限制性配体，其中将所述限制性配体缀合至含IgG Fc的分子；和
(b)使自身免疫T细胞群体与所述缀合物接触足以允许至少一种自身免疫T细胞与所述缀合物结合的时间，其中所述缀合物将免疫效应物募集至所述自身免疫T细胞，从而导致其死亡。
所述方法还包括先体外后体内处理所述自身免疫T细胞群体，并且将所述样品回送至所述受试者。
上述方法中的优选自身免疫疾病或障碍是寻常天疱疮。优选的抗原替代物或限制性配体是类肽或类肽样部分。
本发明还包括其中所述含IgG Fc的分子是抗体、单链抗体或Fc片段的上述方法。
本发明还包括其中所述含IgG Fc的分子是抗体或单链抗体，并且将所述限制性配体附着至所述抗体的抗原结合位点的上述方法。
本发明还涉及其中所述含IgG Fc的分子是缺乏IgG可变区的Fc片段并且将所述限制性配体系连至所述Fc片段的羧基末端的上述方法。
本发明还涉及治疗需要此治疗的患者的特定自身免疫疾病或障碍的方法，所述方法包括步骤：
(a)针对与特定自身免疫疾病或病况相关的特定自身抗体筛选配体文库，以发现高亲和力配体；
(b)鉴定针对与所述特定自身免疫疾病或障碍相关的所述特定自身抗体的高亲和力配体；
(c)从所述文库分离所述高亲和力配体；和
(d)利用分离的高亲和力配体治疗所述患者。
优选的特定自身免疫疾病或障碍是寻常天疱疮。
本发明还涉及包含按照前述段落中的上述方法鉴定的高亲和力配体的药物组合物。
在优选实施方案中，组合物包含选自限制性寡聚体的高亲和力配体。
在优选实施方案中，组合物包含选自类肽、类肽样部分或环状类肽的限制性寡聚体。
本发明还涉及鉴定针对与特定自身免疫疾病或障碍相关的自身抗体的高亲和力配体的方法，其包括如下步骤：(1)选择与特定自身免疫疾病或障碍相关的自身抗体和(2)针对所述自身抗体筛选配体文库和(3)鉴定选择性结合所述自身抗体的高亲和力配体。本发明还涉及所述高亲和力配体在治疗所述自身免疫疾病或障碍或诊断这样的疾病或障碍中的用途。
本发明还涉及联合疗法，其包括利用组合治疗需要此治疗的患有特定自身免疫疾病或障碍的患者，所述组合包含(a)对与所述特定自身免疫疾病或障碍相关的自身抗体具有特异性的高亲和力配体和(b)对与所述特定自身免疫疾病或障碍相关的T细胞具有特异性的配体。
预期可就本文中描述的任何其它方法和组合物来实施本文中描述的任何方法或组合物。
当与权利要求和/或说明书中的术语“包含”结合使用时，措辞“一个（种）”的使用可意指“一个（种）”，但其还与“一个/一种或多个/多种”、“至少一个/一种”和“一个/一种或一个/一种以上”的含义一致。
预期可对本发明的任何方法或组合物实施本说明书中讨论的任何实施方案，反之亦然。此外，本发明的组合物和试剂盒可用于实现本发明的方法。
在本申请的通篇中，术语“约”用于表示值包括设备、用于测定值的方法的固有误差变化，或存在于研究主题之间的变化。
附图简述
下列附图形成本说明书的部分并且并入以用于进一步显示本发明的某些方面。通过参考与本文中所示的具体实施方案的详细说明结合的这些附图中的一个或多个可更好地理解本发明。
图1-用于产生其中每一个珠粒携带环状类肽和类似的线性编码链的文库的一般策略的示意图。只有环状分子才包含巯基，从而将偶联至马来酰亚胺活化的载玻片。
图2-通过一珠两化合物策略进行的编码的环状类肽文库的合成。亚单体类肽合成中使用的胺类示于图的底部(1,4-二氨基丁烷中的胺之一和乙醇胺中的羟基得以保护)。
图3A-3C-含Cys环状类肽至马来酰亚胺活化的载玻片的连接。(图3A)在对巯基侧链进行裂解和脱保护之前在每一个珠粒上产生的环状和线性分子的一般结构。下面：经挑选用于点样实验(spottingexperiment)的5种类肽的可变区的序列。(图3B)其中5个类肽的每一种已被点在活化的表面上的微阵列的荧光图像。将每一种类肽的DMSO溶液(≈2mM)点样2次，将溶液稀释3倍，再次点样等。在洗涤和干燥后，将阵列与缀合有Cy3的链霉抗生物素蛋白杂交，洗涤，随后用荧光扫描仪扫描载玻片(关于细节参见参考文献30)。点是伪绿色(false-colored green)。(图3C)Cys是将类肽保留在微阵列上所必需的。合成2种类肽。每一种类肽具有序列荧光素-Nlys-Nser-Nleu-Nser-Nall-Npip-Nlys-Nlys。一种类肽也包含C末端半胱氨酸，然而另一种类肽不包含C末端半胱氨酸。将两种类肽点在马来酰亚胺活化的载玻片上。在洗涤后，使用荧光扫描仪扫描载玻片。荧光强度是伪蓝色。
图4-珠粒上的模型类肽的环化反应。
图5-在环化之前和环化之后通过使用PyBOP进行的类肽的RP-HPLC示踪。
图6-在N-末端具有Nmea的来自环状类肽文库的随机成员的序列分析：(a)Nmea-Nffa-Nall-Nlys-Nleu-Npip-Nlys。
图7-在N-末端具有Nmea的来自环状类肽文库的随机成员的序列分析：(b)Nmea-Nlys-Nall-Nffa-Nala-Nleu-Nlys。
图8-在N-末端具有Nmea的来自环状类肽文库的随机成员的序列分析：(c)Nmea-Nlphe-Nala-Nphe-Nall-Nleu–Nlys。还显示了环状类肽和编码的线性类肽的RP-HPLC示踪。
图9-在N末端具有Nmea的生物素标记的环状类肽(1)的MS、MS/MS数据。
图10-在N末端具有Nmea的生物素标记的环状类肽(2)的MS、MS/MS数据。
图11-在N末端具有Nmea的生物素标记的环状类肽(3)的MS、MS/MS数据。
图12-在N末端具有Nmea的生物素标记的环状类肽(4)的MS、MS/MS数据。
图13-在N末端具有Nmea的生物素标记的环状类肽(5)的MS、MS/MS数据。
图14-在N末端具有Nmea的生物素标记的环状类肽(6)的MS、MS/MS数据。
图15-在N末端具有Nmea的生物素标记的环状类肽(7)的MS、MS/MS数据。
图16-在N末端具有Nmea的生物素标记的环状类肽(8)的MS、MS/MS数据。
图17-在N末端具有Nmea的生物素标记的环状类肽(9)的MS、MS/MS数据。
图18-在N末端具有Nmea的生物素标记的环状类肽(10)的MS、MS/MS数据。
图19-生物素标记的环状类肽微阵列与链霉抗生物素-Cy3的杂交。制备由在N末端具有Nmea的生物素标记的环状类肽组成的微阵列。利用约2mM溶液的3倍系列稀释物将生物素标记的环状类肽点在马来酰亚胺功能化的玻璃载玻片上。利用1×TBST(50mM Tris/150mM NaCl/0.1%Tween20,PH8.0)在4℃平衡微阵列，进行30分钟。在轻轻摇动的条件下，在4℃用1×TBST(总共1mL溶液)中的链霉抗生物素蛋白-Cy3(10μL，Sigma)和BSA(50μL，2mg/mL)温育微阵列载玻片，将载玻片在4℃用1×TBST（3×5min）洗涤，随后通过离心干燥。利用GenePix4000B扫描仪扫描杂交的微阵列。
示例性实施方案描述
本发明在此处描述了鉴定以高度特异性结合自身抗体以及结合结合自身抗体和自体反应CD4+T细胞或B细胞的配体的组合的合成分子的方法。为了这样的组合发明的目的，在此处在实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)(人多发性硬化(MS)的动物模型，并且不需要先前的天然抗原的性质的知识)的背景中描述了方案。相反地，其应用其中同时评价文库中每一种化合物结合天然群体中的自身反应性T细胞和正常T细胞的能力的比较结合策略。只有显示对于自身反应性T细胞的高度选择性的化合物才被选择为“命中物(hit)”，可将所述命中物与来自结合与自身免疫疾病或障碍相关的自身抗体的配体的筛选的“命中物”组合使用。或者或此外，可按照本文中描述的方法直接筛选针对T细胞的限制性寡聚体。经发现选择性结合T细胞的此类限制性寡聚体也在本发明的范围内。联合疗法可包括利用具有对于疾病引起的自身抗体的亲和力的配体的连续治疗和利用具有对于与自身免疫疾病或病况相关的T细胞的亲和力的配体的治疗。本领域技术人员将基于患者个体的状况确定适当的方案。
来自EAE筛选的一个命中物的详细表征表明其结合T细胞受体(TCR)。此外，已显示该化合物为抗原驱动的T细胞体外增殖的拮抗剂。最终，当将该化合物缀合至能够介导对附近蛋白质的氧化破坏(当光解时)的钌复合物时(Lee等，2008)，缀合物抑制自身反应性T细胞在过继转移实验(adoptive transfer experiment)中介导疾病的能力。综上所述，这些数据证明了该技术鉴定能够结合并且抑制抗原特异性自身反应性T细胞的合成化合物的能力。一旦此类T细胞被鉴定，就可将它们用于本文中描述的联合疗法。
I.自身免疫疾病
本发明，如上所述，提供了与结合来自多种疾病状态的自身免疫T细胞的分子组合使用的可结合自身抗体或自体的分子的鉴定。在某些方面，疾病状态包括但不限于疾病例如急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性坏死性出血性白质脑炎、阿狄森氏病(Addison’sdisease)、无丙种球蛋白血症、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗-GBM/抗-TBM肾炎、抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性家族性自主神经失调、自身免疫肾炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病变、特发性血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫性甲状腺病、轴突及神经元神经病、巴洛病(Balo disease)、白塞病(Behcet’s disease)、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯曼病(Castlemendisease)、乳糜泻(非热带性的)、Chagas病、慢性疲劳综合征、慢性炎症脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、变应性肉芽肿性血管炎、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮、克罗恩病、Cogan综合征、冷凝集素疾病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎、CREST综合征(CREST disease)、原发性混合型冷球蛋白血症(essential mixed cryoglobulinemia)、脱髓鞘性神经病(demyelinating neuropathies)、皮肌炎、Devic’s病(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、Dressler综合征、子宫内膜异位症、嗜酸细胞性筋膜炎、结节性红斑、实验性过敏性脑脊髓炎、伊文氏综合征、纤维肌痛、纤维化肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、肾小球肾炎、肺出血肾炎综合症(Goodpasture’s syndrome)、格雷夫斯病(Grave’s disease)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本脑病(Hashimoto’s encephalitis)、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、溶血性贫血、Henock-Schoniein紫癜、妊娠疱疹、低丙种球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、免疫调节脂蛋白类(immunoregulatory lipoproteins)、包涵体肌炎、1型胰岛素依赖性糖尿病(insulin-dependent diabetes)、间质性膀胱炎、青少年类关节炎(juvenile arthritis)、小儿糖尿病(juvenilediabetes)、川崎病、兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton syndrome)、白细胞分裂性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔癣、木样结膜炎、线状IgA疾病(LAD)、狼疮(SLE)、莱姆病、梅尼埃病(Meniere’s disease)、显微型多血管炎、混合结缔组织病(MCTD)、蚕蚀性角膜炎、穆-哈二氏病(Mucha-Habermann disease)、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、嗜眠病(narcolepsy)、视神经脊髓炎(Devic’s)、中性粒细胞缺乏症、眼型瘢痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿病、PANDAS(因链球菌属引起的儿童自身免疫性神经精神障碍(Pediatric AutoimmuneNeuropsychiatric Disorders Associated))、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、Parry-Romberg综合征(Parry Rombergsyndrome)、臂丛神经炎(Parsonnage-Turner syndrome)、睫状体平坦部炎(pars plantis)(周边葡萄膜炎)、天疱疮、周围神经病变、静脉周围性脑脊髓炎(perivenous encephalomyelitis)、恶性贫血、POEMS综合征、节性多动脉炎、I、II和III型自身免疫性多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗死后综合征(postmyocardial infarction syndrome)、心包切开术后综合征、黄体酮皮炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、银屑病、银屑病关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍、雷诺现象(Raynaud’s phenomena)、反射性交感神经性营养不良、瑞特综合征(Reiter’s syndrome)、复发性多软骨炎、不宁腿综合征、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿关节炎、结节病、施密特综合征(Schmidt syndrome)、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征(Slogren’s syndrome)、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、交感性眼炎、多发性大动脉炎(Takayasu’sarteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TPP)、Tolosa-Hunt综合征(Tolosa-Hunt syndrome)、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、脉管炎、水疱性皮肤病(vesiculobullous dermatosis)、白癜风或韦格纳肉芽肿病或、慢性活动型肝炎、原发性胆汁性肝硬变、扩张性心肌病(cadilatedcardiomyopathy)、心肌炎、I型身免疫性多内分泌腺病综合征(APS-I)、囊性纤维化血管炎、获得性甲状旁腺功能减退症、冠状动脉疾病、落叶性天疱疮、寻常性天疱疮、Rasmussen脑炎(Rasmussen encephalitis)、自体免疫性胃炎、胰岛素低血糖综合征(insulin hypoglycemicsyndrome)(Hirata病)、B型胰岛素抵抗综合征(Type B insulinresistance)、棘皮症、系统性红斑狼疮(SLE)、恶性贫血、抗治疗性莱姆关节炎(treatment-resistant Lyme arthritis)、多发性周围神经病、脱髓鞘疾病、异位性皮炎、自身免疫性甲状腺炎、白癫风、甲状腺相关眼病、自身免疫性腹腔疾病、ACTH缺乏症(ACTH deficiency)、皮肌炎、干燥综合征
Figure BDA0000373564180000191
系统性硬化病、进行性系统性硬化症、硬斑病、原发性抗磷脂综合征、慢性特发性荨麻疹、结缔组织综合征、坏死性肾小球肾炎和新月体性肾炎(NCGN)、系统性血管炎、雷诺综合征(Raynaud syndrome)、慢性肝病、内脏利什曼病、自身免疫C1缺乏、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)、凝血时间延长(prolongedcoagulation time)、免疫机能缺陷(immunodeficiency)、动脉粥样硬化、神经元病、副肿瘤性天疱疮、副肿瘤性僵人综合征、副肿瘤性脑脊髓炎、亚急性自主神经病变、癌相关性视网膜病变、副肾上腺斜视眼阵挛-肌阵挛运动失调症、下运动神经元损害综合征和Lambert-Eaton肌无力综合征。
A.强直性脊柱炎
AS是更广泛的脊椎关节病分类中的疾病亚组。患有各种亚组的脊椎关节病的患者具有通常极不相同的从细菌感变化染至遗传的疾病病因学。然而，在所有亚组中，疾病过程的最终结果是轴关节炎。尽管在各种患者群体中看到早期临床差异，但它们中的许多在10至20年的疾病过程后几乎以相同的方式告终。最近的研究表明从疾病的疾病发病至强直性脊柱炎的临床诊断的平均时间为7.5年(Khan,1998)。这类相同的研究表明脊椎关节病可具有与类风湿性关节炎的患病率相近的患病率(Feldtkeller等，2003；Doran等，2003)。
AS是具有或不具有骨外表现的中轴骨骼的慢性全身性炎性类风湿性障碍。骶髂关节和脊柱首先受到影响，但髋和肩关节以及不太常见地外周关节或某些关节外结构例如眼、脉管系统、神经系统和胃肠道系统也受到牵连。其病因学还不十分清楚(Wordsworth,1995；Calin和Taurog,1998)。其与主要组织相容性I类(MHC I)HLA-B27等位基因强相关(Calin和Taurog,1998)。AS影响个体的生命最旺盛时期，并且由于其引起腱、韧带、关节和骨骼的慢性疼痛和不可逆损害的潜而是非常可怕的(Brewerton等，1973；Brewerton等，1973；Schlosstein等，1973)。AS可单独发生或与另一种脊椎关节病形式例如反应性关节炎、银屑病、牛皮癣关节炎、起止点炎、溃疡性结肠炎、肠易激综合征或克罗恩病联合发生，在该情况下，其被分类为继发性AS。
通常，患病部位包括脊柱的腰椎、骨突、肋椎和肋横突关节以及脊旁韧带结构。作为肌腱或韧带附着至骨的部位的肌腱末端的炎症在该疾病中也是显著的(Calin和Taurog,1998)。已知起止点炎的部位被浆细胞、淋巴细胞和多形核细胞浸润。炎症过程通常导致渐进纤维性和骨性关节强硬，(Ball,1971；Khan,1990)。
诊断延误是常见的，因为症状通常归因于更常见的背部问题(back problem)。腰椎的灵活性的显著丢失是AS的早期体征。其它常见症状包括腰部(lower back)(通常始于下脊柱与骨盆或髋连接的地方)的慢性疼痛和僵硬。
虽然大多数症状始于腰部和骶尾部区域，但它们也可牵涉颈和上背部。关节炎也可在肩、髋和足中发生。一些患者具有眼炎症，对于心脏瓣膜损害(heart valve involvement)必定观察到更严重的病例。
最频繁呈现的是背痛，但疾病可非典型地始于外周关节，特别是在儿童和妇女中，并且罕有急性虹膜炎(前葡萄膜炎)。其它早期症状和体征是因弥漫性肋椎损害(diffuse costovertebral involvement)引起的胸部扩张减少(diminished chest expansion)、低热(low-grade fever)、疲劳、厌食症、体重减轻和贫血。复发性背痛-通常夜间的并且具有不同强度的-是最终的抱怨，对于通常通过活动减轻的晨僵亦如此。屈曲或弯腰姿势减轻背痛和脊柱旁肌肉痉挛；因此，一定程度的脊柱后凸在未治疗的患者中是常见的。
全身性表现在1/3的患者中发生。复发性，通常自我限制的急性虹膜炎(前葡萄膜炎)被罕见地延长并且严重至足以损害视力。神经病学体征偶尔可由压迫神经根炎或坐骨神经痛、脊椎骨折或半脱粒以及马尾受压综合征(其由无力、夜间尿失禁、膀胱和直肠感觉减少和踝反射的不存在组成)引起。心脏血管表现可包括主动脉瓣关闭不全、咽痛、心包炎和ECG传导异常。罕见肺发现是肺上叶纤维化，偶尔具有可被误认为TB并且可并发曲霉菌属(Aspergillus)引起的感染的空洞形成。
AS的特征在于与几乎不活动或完全不活动的炎症期交替的轻度或中度主动性脊柱炎耀斑。大多数患者的适当治疗导致最低程度的失能或消除失能以及导致完全的、能生产的生活(尽管存在背后僵硬)。偶尔地，过程是严重的并且是进行性的，导致明显的失能性畸形。预后对于具有难治性虹膜炎的患者和对于具有继发性淀粉样变性的罕见患者是前景暗淡的。
ESR和其它急性期反应物(例如，C反应性蛋白和血清Ig水平)在大多数具有活跃AS的患者被适度升高。IgM类风湿因子和抗核抗体的测试是阴性的。HLA-B27的阳性测试是常见的但不是不变的并且不是特异性的(阴性测试在帮助排除AS中比阳性测试在诊断其中更有用)。该测试在具有典型疾病的患者中不是必需的。
必须通过x射线来确认诊断。最早的异常(因软骨下侵蚀引起的假-变宽、硬化症或晚期变窄)发生在骶髂关节中。脊柱的早期变化是上腰椎矩形化和去矿质作用、零星韧带钙化和一个或两个正在发展的韧带骨赘。具有显著的韧带骨赘和弥漫性脊柱旁韧带钙化的经典竹节样脊柱对于早期诊断是没有用的；这些变化在少数患者中要经历平均10年的时期发展而来。
关节受累的严重度和全身性症状的程度在个体之间变化极大。早期准确诊断和疗法可使疼痛和失能的年数减少至最少。
关节不适可利用药物缓解。治疗计划通常专注于畸形的防止、延迟或矫正以及社会心理和康复需要。为了适当的姿势和关节运动，每日运动和其它支持措施(例如，姿势训练、治疗性运动)对于增强与潜在性畸形相反的肌群(即，增强伸肌而非屈肌群)是至关重要的。俯卧阅读并因此延伸颈部可帮助保持背部柔韧。
NSAID通过抑制关节炎症、疼痛和肌痉挛有利于锻炼和其它支持措施。大多数NSAID已证明在AS中的价值，但耐受性和毒性而非效力的边际差异决定药物选择。应当监测和警告患者的潜在有害反应。NSAID的日剂量应当尽可能低，但对于活动性疾病，可能需要药物例如吲哚美辛的最大剂。在活动疾病的全身性和关节体征已被抑制数月后，应当只能缓慢地尝试停药。几种新颖NSAID(称为COX-2药，因为它们抑制环氧化酶-2)给药物提供相等的抑制COX-1的效力同时减少对胃粘膜的副作用和血小板聚集的机会。
皮质类固醇的治疗价值有限；长期使用与许多严重有害作用相关，包括脊强的骨质疏松症。对于急性虹膜炎，局部皮质类固醇(和散瞳药)通常就足够了；罕见显示需要口服皮质类固醇的治疗。关节内皮质类固醇可以是有益的，特别地当一个或两个周围关节比它关节更严重发炎，从而有损锻炼和康复时。
大多数RA的缓作用(缓和)药(例如，难得的IM)不是从未被研究过就是对AS无效。柳氮磺吡啶可以是有帮助的，特别地当周围关节受累时。剂量应当始于500mg/日并且以500mg/日（间隔1周）增加至1g（维持每日两次）(也参见Rheumatoid Arthritis in Ch.50)。最常见副作用主要是恶心，但肠溶衣片被更好地耐受。剂量减少可以是有帮助的。
麻醉药、其它强镇痛药和肌肉松弛药缺乏抗炎性质，并且应当仅短期用作附加成分来帮助控制严重背痛和痉挛。对脊柱的放射疗法，尽管是有效的，被推荐作为最后的手段，因为其使患急性髓性白血病的风险增加至10倍。
康复疗法是必要的。适当的睡眠和行走位置，加上腹部和背部运动，帮助维持姿势。锻炼帮助维持关节灵活性。呼吸锻炼增强肺活量，游泳提供有氧训练。即使对于优化处理，一些人仍将发生脊强或“关节强硬的”脊柱，但如果该结合在垂直位置发生，则其仍可保持功能。连续的护理至关重要。AS是终生问题，人们通常不能接受持续治疗，在该情况下会发生永久性姿势和运动能力丧失发生。
B.银屑病关节炎
银屑病是具有1.5-3%的患病率的炎症性和增生性皮肤障碍。约20%的银屑病患者发生了具有几种模式的特征形式的关节炎(Gladman,1992；Jones等，1994；Gladman等，1995)。一些个体首先呈现关节症状，但在大部分人中，首先呈现皮肤银屑病。约1/3的患者具有它们的皮肤和关节疾病的同时恶化(Gladman等，1987)并且在指甲与远端指间关节疾病之间存在局部解剖关系(topographicrelationship)(Jones等，1994；Wright,1956)。虽然将皮肤、指甲和关节疾病连系起来的炎症过程仍然不清楚，但牵涉免疫介导的病理学。
银屑病关节炎(PsA)特征在于关节炎与银屑病的联合的慢性炎症性关节炎，并且在1964年(Blumberg等，1964)被公认为与类风湿性关节炎(RA)不同的临床实体。随后的研究已显示PsA与其它脊椎关节病(SpA)(一组包括强直性脊柱炎、反应性关节炎和肠病性关节炎的疾病)共有许多遗传性、病原性和临床特征(Wright,1979)。PsA属SpA组的理念最近从影像研究获得进一步支持，所述研究在包括PsA但非RA中显示广泛的起止点炎(McGonagle等，1999；McGonagle等，1998)。更具体地，起止点炎已被假定为在SpA中最早发生的事件之一，其在脊柱中导致骨重建和关节强直，以及当发炎的肌腱末端接近周围关节时导致关节滑膜炎。然而，起止点炎与PsA的临床表现之间的联系仍然很不清楚，因为PsA可呈现具有不同程度严重度的关节受累的相当异质的模式(Marsal等，1999；Salvarani等，1998)。因此，必须设想其它因素来解释PsA的各式各样的特征，其中仅有少数因素(例如HLA-B27分子的表达，这与轴向病强相关)已得到鉴定。因此，仍然难以将疾病表现映射至特定致病机制，这意味着该病况的治疗使仍然依赖于经验。
家族研究已表明遗传对PsA的发展的贡献(Moll & Wright,1973)。关节炎的其它慢性炎症形式例如强直性脊柱炎和类风湿性关节炎被认为具有复杂的遗传基础。然而，因为若干原因，PsA的遗传组分已难以评估。有强有力的证据表明存在可掩盖对于PsA的发展是非常重要的遗传因素的针对单独的银屑病的遗传倾向性。虽然大多数人可接受PsA为独特的疾病实体，有时存在表型与类风湿性关节炎和强直性脊柱炎重叠。同样地，PsA本身也不是同质的病况，并且已提出了不同的亚组。尽管在本研究中未克服所有这些混杂因素，但我们集中在于涵盖疾病谱的三大类PsA患者中研究候选基因。
TNFA区域的启动子区域中的多态性是相当吸引人的，因为它们可影响TNF-α分泌的水平(Jacob等，1990；Bendzen等，1988)。已在银屑病皮肤(Ettehadi等,1994)和滑液(Partsch等，1997)中报导了增加的量的TNF-α。
最近的试验已显示抗-TNF治疗在PsA(Mease等，2000)和强直性脊柱炎(Brandt等，2000)中的积极益处。此外，TNF-α的基因座存在于MHC的III类区域内，从而可提供比由I类和II类侧翼区域提供的与PsA的关联性更紧密的与PsA的关联性。在我们的总的PsA组中与TNFA等位基因的关联性相对较弱。在具有周围多关节炎的组中罕有的TNFA-238A等位基因的频率增加，但在具有脊柱炎的那些患者中不存在，尽管该发现可通过与HLA-Cw*0602的连锁不平衡来解释。是否存在与TNFA-238等位基因上的多态性相关的功能性序列还不清楚(Pociot等，1995)。然而，在银屑病患者中发展的关节炎的模式可能可与该特定的等位基因直接或间接相关。
Hohler等(1997)在PsA患者中以及在青少年银屑病中发现TNFA-238A等位基因的频率的增加。TNFA-238A与青少年银屑病和PsA的关联性强于与所述疾病与HLA-Cw6的关联性。类似地，在我们的研究中，在青少年银屑病与HLA-Cw*0602和TNFA-238A之间存在强关联性，尽管两个等位基因都对关节炎发病的年龄没有任何关系。在我们的研究中，所有具有至少一个TNFA-238A等位基因的PsA患者都是HLA-Cw6-阳性的，强调了PsA中此类等位基因之间的紧密联系。然而，与Hohler等(1997)的研究相反，以及可通过与HLA-Cw*0602的紧密连锁解释的，TNFA-238A等位基因仅在周围关节炎患者中得以增加。也有趣的是，在单独的强直性脊柱炎研究中，相同的研究小组发现罕有的TNFA-308A和-238A等位基因对脊椎炎的发展具有保护性作用(Hohler等，1998)。
C.反应性关节炎
在反应性关节炎(ReA)中，关节损伤的机制还不清楚，但细胞因子可能起着关键作用。已报导了更普遍的Th1类高水平的干扰素-γ(IFN-γ)和低水平的白细胞介素4(IL-4)(Lahesmaa等，1992；Schlaak等，1992；Simon等，1993；Schlaak等，1996；Kotake等，1999；Ribbens等，2000)，但若干研究已显示与类风湿性关节炎(RA)患者相比较，在反应性关节炎患者的滑膜(Simon等，1994；Yin等，1999)和滑液(SF)(Yin等，1999；Yin等，1997)中IL-4和IL-10相对占优并且IFN-γ和肿瘤坏死因子α(TNF-α)相对缺乏。还已报导，在外周血单核细胞(PBMC)的先体外后体内刺激后反应性关节炎患者中TNF-α分泌水平比RA患者中的低(Braun等，1999)。
一直存在争议的是反应性关节炎相关细菌的清除需要适当水平的IFN-γ和TNF-α的产生，然而IL-10通过抑制此类反应起作用(Autenrieth等，1994；Sieper & Braun,1995)。IL-10是通过活化的巨噬细胞(de Waal等，1991；Hart等，1995；Chomarat等，1995)抑制IL-12和TNF-γ的合成和通过T细胞(Macatonia等，1993)抑制IFN-γ的合成的调节性细胞因子。
D.肠病性关节炎
肠病性关节炎(EA)与炎性肠病(IBD)例如克罗恩病或溃疡性结肠炎组合发生。其还可影响脊柱和骶髂关节。肠病性关节炎影响通常在下肢例如膝或踝中的周围关节。其通常仅影响少数或有限数量的关节并且可紧跟肠病况发生。这存在于约11%的溃疡性结肠炎患者和21%的克罗恩病患者中。滑膜炎通常是自限的和非致畸形的。
肠病性关节病包括共有与GI病理学的联系的类风湿性病况的集合。此类病况包括因细菌(例如，志贺菌属(Shigella)、沙门菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、耶尔森菌属(Yersinia)的种类、难辨梭菌(Clostridium difficile))、寄生虫(例如，粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)、无钩绦虫、兰伯贾第虫、人蛔虫、隐孢子虫属种类)而引起的反应性(即，感染相关的)关节炎和与炎性肠病(IBD)相关的脊椎关节病。其它病况和障碍包括肠旁路术(空肠回肠的)、关节炎、乳糜泻、Whipple病和胶原性结肠炎。
肠病性关节病的准确原因是未知的。胃肠道的炎症可增加通透性，从而导致抗原性物质包括细菌抗原的吸收。随后可将此类关节源性抗原定位在肌骨骼组织(包括肌腱末端和滑膜)中，从而引发炎症反应。或者，自身免疫反应可通过分子模拟来诱导，其中宿主对此类抗原的免疫反应与滑膜中的自身抗原交叉反应。
特别吸引人的是反应性关节炎与HLA-B27(HLAI类分子)之间的强关联性。潜在的关节源性、细菌源性抗原肽可放进B27分子的抗原呈递沟，从而导致CD8+T细胞反应。HLA-B27转基因大鼠产生具有关节炎和肠炎症的特征的肠病性关节病的特征。
E.溃疡性结肠炎
溃疡性结肠炎是引起大肠的衬里的炎症和疮(称为溃疡)的疾病。炎症通常在直肠和结肠的下部分中发生，但其可影响整个结肠。除称为回肠末端的末端部分外，溃疡性结肠炎极少影响小肠。溃疡性结肠炎还可称为结肠炎或直肠炎。炎症使结肠频繁排空，从而引起腹泻。溃疡在其中炎症已杀死结肠衬里细胞的地方形成；溃疡出血并且产生脓。
溃疡性结肠炎是炎性肠病(IBD)，在引起小肠和结肠的炎症的疾病的一般名称。溃疡性结肠炎可以难以诊断，因为其症状与其它肠障碍和另一种类型的IBD克罗恩病相似。克罗恩病与溃疡性结肠炎不同，因为其在肠壁内更深的地方引起炎症。同样地，克罗恩病通常在小肠中发生，尽管其也可在口、食管、胃、十二指肠、大肠、阑尾和肛门中发生。
溃疡性结肠炎可在任何年龄的人中发生，但最常见地其始于15至30岁之间，或不太常见地始于50至70岁之间。儿童和青少年有时发生疾病。溃疡性结肠炎同样地影响男性和女性，并且似乎在一些家族中发生。关于什么引起溃疡性结肠炎的理论非常多，但都未得到证明。最流行的理论是身体的免疫系统通过引发肠壁的长期炎症来对病毒或细菌作出反应。具有溃疡性结肠炎的人的免疫系统异常，但医生不知道此类异常是疾病的病因还是疾病的结果。溃疡性结肠炎不是由精神痛苦(emotional distress)或对某些食物或食品的敏感引起的，但此类因素可在一些人中触发症状。
溃疡性结肠炎的最常见症状是腹痛和血性腹泻。患者还可感觉疲劳、体重减轻、食欲缺乏、直肠出血以及体液和营养物丢失。约一半的患者具有轻度症状。其它患者遭受频的发热、血性腹泻、恶心和严重腹部痉挛。溃疡性结肠炎还可引起问题例如关节炎、眼睛的炎症、肝病(肝炎、肝硬化和原发性硬化性胆管炎),骨质疏松症,皮疹和贫血。没有人确切知道为什么问题在结肠外发生。科学家认为当免疫系统在身体的其它部分触发炎症时，此类并发症可发生。当治疗结肠炎时，此类问题的一些问题消失。
诊断溃疡性结肠炎可能需要彻底的体格检查和一系列测试。可进行血液测试来检查贫血，所述贫血可表明结肠或直肠中存在出血。血液测试还可显示高白细胞计数，这是身体中某些部位的炎症的体征。通过测试粪便样品，医生可检测结肠或直肠中的出血或感染。医生可进行结肠镜检查或乙状结肠镜检查。对于任一测试，医生将内窥镜-连接至计算机和TV监测器的长的柔软光调制管-插入肛门以观察结肠和直肠的内部。医生将能够在结肠壁上看见任何炎症、出血或溃疡。在检查期间，医生可进行活组织检查，这包括从结肠内膜获取组织样品以利用显微镜观察。还可能需要结肠的钡灌肠x射线。该方法包括用钡(粉白色溶液)灌注结肠。钡在x射线胶片上显露出白色，从而允许医生清楚地观察结肠，包括可能存在于其中的任何溃疡或其它异常。
溃疡性结肠炎的治疗取决于疾病的严重性。大多数人利用药物治疗。在严重的病例中，患者可能需要手术来除去患病结肠。手术是对溃疡性结肠炎的唯一治愈。一些其症状由某些食物触发的人能够通过避免扰乱他们的肠的食物如刺激性大的食物、生果和蔬菜或奶糖(乳糖)来控制症状。每一个人可经历不同的溃疡性结肠炎，因此调整对每一个体的治疗。感情和心理支持非常重要。一些人具有缓解-当症状消失时的时期-该时期持续数月或数年。然而，大多数患者的症状最终复发。疾病的该变化模式意味着不能总是告知什么时候需要治疗帮助。一些具有溃疡性结肠炎的人可能需要医疗护理一段时间，需要定期的医生拜访以监测病况。
疗法的目的是诱导和维持缓解，以及改善具有溃疡性结肠炎的人的生活质量。可获得的几种类型的药物是：
·氨基水杨酸盐-包含5-氨基水杨酸(5-ASA)的药物，帮助控制炎症。柳氮磺吡啶是磺胺吡啶与5-ASA的组合，用于诱导和维持缓解。磺胺吡啶组分将抗炎性5-ASA运载至肠中。然而，磺胺吡啶可导致副作用例如包括恶心、呕吐、胃灼热、腹泻和头痛。其它5-ASA试剂例如奥沙拉秦、美沙拉秦和巴柳氮具有不同的载体，提供更少的副作用，并且被不能服用柳氮磺胺吡啶的人使用。通过灌肠剂口服提供5-ASA，或在栓剂中提供其，这取决于结肠中炎症的位置。大多数具有轻度或中度溃疡性结肠炎的人首先利用该组药物进行治疗。
·皮质类固醇-例如泼尼松和氢化可的松也减轻炎症。它们可被具有中度至严重溃疡性结肠炎或对5-ASA药物不起反应的人使用。皮质类固醇，也称为类固醇，可通过灌肠剂口服、静脉内提供，或于栓剂中提供，这取决于炎症的位置。此类药物可引起副作用例如体重增长、痤疮、面毛、高血压、心境不稳以及增加的发生感染的风险。为此原因，不推荐长期使用其。
·免疫调节剂–例如硫唑嘌呤和6-巯基-嘌呤(6-MP)通过影响免疫系统减轻炎症。它们用于对5-ASA或皮质类固醇不起反应或依赖于皮质类固醇的患者。然而，免疫调节剂作用缓慢，并且可能要花费6个月才看到完全益处。监测采用此类药物的患者的并发症，包括胰腺炎和肝炎、减少的白细胞计数和增加的发生感染的风险。可将环孢霉素A与6-MP或硫唑嘌呤一起使用来治疗对静脉内皮质类固醇不起反应人的活动的严重溃疡性结肠炎。
其它药物可提供来放松患者或减轻疼痛、腹泻或感染。
偶尔地，症状严重至足以使人必须住院。例如，人可具有严重出血或引起脱水的严重腹泻一。在这类情况下，医生尝试终止腹泻和血液、体液和矿物盐的损失。患者可能需要特殊饮食，通过静脉进食、药物或有时手术。
约25-40%的溃疡性结肠炎患者因大量出血、严重疾病、结肠的破裂或癌症风险必须最终切除它们的结肠。有时如果医学治疗失败或如果皮质类固醇或其它药物的副作用威胁患者的健康，医生会推荐切除结肠。在切除结肠和直肠的手术(称为直肠与结肠切除术)后进行下列手术的任一手术：
·回肠造口术，其中手术医生在腹部产生小的开口(称为细孔(stoma))，然后将小肠的末端(称为回肠)与其系连。废物将通过小肠并且通过细孔排出身体。细孔为约二毛五硬币25分硬币的尺寸并且通常位于靠近腰围的腹部的右下部分中。将小袋戴在开口上以收集废物，并且需要时患者排空小袋。
·回肠肛管吻合术或拖出术，其允许患者具有正常的肠运动，因为其保留肛门的部分。在该手术中，手术医生切除了结肠的患病部分和直肠的内侧，留下直肠的外部肌肉。手术医生随后将回肠与结肠和肛门的内侧系连，从而产生小袋(pouch)。废物被贮存在小袋中并且以通常的方式通过肛门。肠运动可能比手术前更频繁和稀薄。小袋的炎症(隐窝炎)是可能的并发症。
并非每一种手术适合于每一个人。需要何种手术取决于疾病的严重度和患者的需要、期望和生活方式。面临该决断的人应当通过与他们的医生、与结肠手术患者合作的护士(肠造口术的治疗者)以及其它结肠手术患者交谈获得尽可能多的信息。患者倡导组织(Patientadvocacy organization)可将人引导至支持小组和其它信息来源。
大多数具有溃疡性结肠炎的人将永不需要进行手术。然而，如果手术确实是必需的，一些人在了解到在手术后，结肠炎被治愈并且大多数人继续过着正常积极的生活时获得安慰。
F.克罗恩病
已尝试对其进行免疫抑制的另一个障碍是克罗恩病。克罗恩病症状包括肠炎症和肠狭窄和瘘的产生：神经病通常伴有此类症状。通常开具抗炎药例如5-氨基水杨酸盐(例如，美沙拉秦)或皮质类固醇来进行治疗，但并不总是有效(综述于Botoman等，1998中)。利用环孢霉素的免疫抑制有量对于抗皮质类固醇或不耐受其的患者是有益的(Brynskov等，1989)。
然而，在90%的患者中最终需要手术矫正；50%经历结肠切除术(Leiper等，1998；Makowiec等，1998)。手术后复发率较高，50%在5年内需要进一步手术(Leiper等，1998；Besnard等，1998)。
克罗恩病的病因学的一个假说是肠粘膜屏障的失效(可能因遗传易感性和环境因子(例如，吸烟)引起的)使免疫系统暴露于来自肠腔的抗原，包括细菌和食物抗原(例如Soderholm等，1999；Hollander等，1986；Hollander,1992)。另一个假说是由病原体例如副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)、单核细胞增生利斯特菌(Listeriamonocytogenes)、异常大肠杆菌或副粘液病毒产生的持久肠感染刺激免疫系统；或可选择地，症状由失调的对遍在抗原例如正常肠道菌群以及它们产生的代谢产物和毒素的免疫反应引起(Sartor,1997)。发现IgA和IgG抗-酿酒酵母抗体(ASCA)在血清中的存在是小儿克罗恩病的高度诊断(Ruemmele等，1998；Hoffenberg等，1999)。
在克罗恩病中，失调的免疫反应偏向于细胞介导的免疫病理学(Murch,1998)。但免疫抑制药例如环孢霉素、他克莫司(tacrolimus)和美沙拉秦已被用于治疗克罗恩病的抗皮质类固醇病例，结果好坏参半(Brynskov等，1989；Fellerman等，1998)。
最近开发针对克罗恩病的诊断和治疗工具的努力已集中在细胞因子的中心作用(Schreiber,1998；van Hogezand & Verspaget,1998)。细胞因子是对细胞间相互作用、细胞间通讯或其它细胞的行为具有特殊作用的小的分泌性蛋白质或因子(5至20kD)。细胞因子由淋巴细胞，特别地TH1和TH2淋巴细胞、单核细胞、肠巨噬细胞、粒细胞、上皮细胞和成纤维细胞产生(综述于Rogler &.Andus,1998；Galley &Webster,1996中)。一些细胞因子是促炎性的(例如，TNF-α、IL-1(α和β)、IL-6、IL-8、IL-12或白血病抑制因子或LIF)；其它细胞因子是抗炎性的(例如，IL-1受体拮抗剂、IL-4、IL-10、IL-11和TGF-β)。然而，在某些炎症性病况下它们的作用可存在重叠和功能性丰余。
在克罗恩的活动病例中，升高的浓度的TNF-α和IL-6被分泌进入血液循环、TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8由粘膜细胞局部过量产生(同上；Funakoshi等，1998)。此类细胞因子可对生理系统包括骨发育、造血作用以及肝、甲状腺和神经精神性功能具有深远影响。同样地，还已在具有克罗恩(Rogler & Andus,1998；Saiki等，1998；Dionne等，1998；但参见Kuboyama,1998)的患者中观察到在IL-1β/IL-1ra比率的不平衡(偏向于促炎性IL-1β)。一个研究表明粪便样品中的细胞因子谱可以是有用的克罗恩的诊断工具(Saiki等，1998)。
已提出用于克罗恩病的治疗包括各种细胞因子拮抗剂(例如，IL-1ra)、抑制剂(例如，IL-1β转化酶的抗氧化剂的)和抗细胞因子抗体(Rogler和Andus,1998；van Hogezand & Verspaget,1998；Reimund等，1998；Lugering等，1998；McAlindon等，1998)的使用。具体地，已尝试用抗TNF-α单克隆抗体治疗克罗恩病，获得一定的成功(Targan等，1997；Stack等，1997；van Dullemen等，1995)。
治疗克罗恩病的另一种方法集中在至少部分清除可触发炎症反应的细菌菌群并且将其用非病原性菌群替代。例如，美国专利5,599,795公开了用于预防和治疗人患者的克罗恩的方法。他们的方法涉及利用至少一种抗生素和至少一种抗真菌剂对肠道灭菌以杀灭现有细菌群落，随后用取自正常人的不同的选择的良好表征的细菌替代它们。Borody教导了通过利用灌洗法至少部分除去现有肠道菌群，随后利用新的细菌菌落(利用来自经历疾病筛查的人供体的排泄接种物或利用包含拟杆菌属(Bacteroides)和大肠杆菌种类的组合物引入的)进行替代来治疗克罗恩病的方法。(美国专利5,443,826)。然而，一直以来都不清楚诊断和/或治疗所针对的克罗恩病的病因。
G.类风湿性关节炎
RA的确切病因学还不清楚，但关节疾病的第一体征在滑膜衬里层中出现：滑膜成纤维细胞的增殖以及它们至关节边缘上的关节面的附着(Lipsky,1998)。随后，巨噬细胞、T细胞和其它炎症性细胞被募集至关节内，其中它们产生许多介体，包括细胞因子白细胞介素-1(IL-1)，所述介体促成导致骨和软骨破坏的慢性后遗症，和肿瘤坏死因子(TNF-α)，所述因子在炎症中起作用(Dinarello,1998；Arend &Dayer,1995；van den Berg,2001)。在具有RA的患者中血浆的IL-1浓度比健康个体中的高，值得注意的是，血浆IL-1水平与RA疾病的活动相关(Eastgate等，1988)。此外，滑液的IL-1的水平与RA的各种放射照相和组织学特征相关(Kahle等，1992；Rooney等，1990)。
在正常关节中，此类和其它促炎细胞因子的作用被多种抗炎细胞因子和调节因子平衡(Burger & Dayer,1995)。该细胞因子平衡的重要性在青少年RA患者中得以举例说明，所述患者在一天当中具有周期性的发热的增加(Prieur等，1987)。在发热的每一个峰值后，在血清和尿中发现了阻断IL-1的作用的因子。该因子已被分离、克隆，并且被鉴定为IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)，其为IL-1基因家族的成员(Hannum等，1990)。IL-1ra，如其名称所示，是与IL-1竞争对I型IL-1受体的结合，从而阻断IL-1的作用的天然受体拮抗剂(Arend等，1998)。可能需要10至100倍过量的IL-1ra来有效地阻断IL-1；然而，从RA患者分离的滑膜细胞似乎未产生足够的IL-1ra来抵消IL-1的作用(Firestein等，1994；Fujikawa等，1995)。
H.系统性红斑狼疮
自身免疫疾病例如系统性红斑狼疮的病因一直以来也不清楚。系统性红斑狼疮(SLE)是特征在于自身抗体和免疫复合物在组织中沉积(从而导致组织损伤)的自身免疫风湿性疾病(Kotzin,1996)。与自身免疫疾病例如MS和1型糖尿病相反，SLE潜在地直接影响多个器官系统，并且其临床表现是多种多样的和可变的(由Kotzin & O’Dell,1995所综述的)。例如，一些患者可显示原发性皮疹和关节疼痛，显示自行缓解(spontaneous remission)，几乎不需要药物治疗。在谱系的另一端是显示严重的进行性肾损害的患者，所述患者需要利用高剂量的类固醇和细胞毒性药物例如环磷酰胺的疗法(Kotzin,1996)。
SLE和可获得的主要诊断测试的血清学标志物是针对细胞核的组分例如双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ss-DNA)和染色质的IgG抗体的升高的血清水平。在此类自身抗体当中，IgG抗-dsDNA抗体在狼疮性肾小球性肾炎(G N)的发展中起着主要作用(Hahn & Tsao,1993；Ohnishi等，1994)。肾小球肾炎是其中肾脏的血液净化肾小球的毛细血管壁因肾小球基底膜在上皮侧上的堆积而变厚的严重病况。疾病通常是慢性的和进行性的并且可导致最终的肾功能衰竭。
在此类自身免疫疾病中籍以诱导自身抗体的机制仍然不清楚。由于一直以来不清楚诊断和/或治疗所针对的SLE的病因，因此治疗一直以来指向抑制免疫反应(例如利用大环内酯抗生素)，而非根本病因。(例如，美国专利4,843,092)。
I.肠易激综合征
肠易激综合征(IBS)是特征在于腹痛和改善的肠排便习惯的功能性障碍。该综合征可始于成年早期并且可与显著的失能相关联。该综合征不是同质的障碍。相反地，已基于主要症状-腹泻、便秘或疼痛描述了IBS的亚型。在"报警"症状例如发热、体重减轻和胃肠道出血不存在的情况下，需要有限的病情检查(workup)。一旦产生了IBS的诊断，综合治疗法就可有效地减轻症状的严重度。IBS是常见障碍，尽管其患病率已变化。一般而言，IBS影响约15%的美国成人，并且在女性中的发病率通常为在男性中的约3倍(Jailwala等，2000)。
IBS导致医师每年要接待240万至350万次寻访。其不仅是胃肠病学家所见到的最常见病况而且还是由基层医生(primary carephysicians)所见到的最常见的胃肠道病况之一(Everhart等，1991；Sandler,1990)。
IBS也是花费很大的障碍。与未患肠症状的人相比较，具有IBS的人损失了3倍的工作日并且更可能被报告病至难以工作(Drossman等，1993；Drossman等，1997)。此外，具有IBS的人在医疗花费上比不具有肠性障碍的人多花数百美元(Talley等，1995)。
没有特定的异常表明由IBS患者经历的腹部疼痛和改变的肠排便习惯的恶化和缓解。IBS的演化理论表明脑-肠轴的多个水平上的失调。运动障碍、内脏超敏反应、中枢神经系统(CNS)的异常调节以及感染都已被牵涉。此外，社会心理因素起着重要的修改作用。异常的肠运动很久以来被认为是IBS的发病机制中的因素。已显示进餐后通过小肠的通过时间在腹泻型肠易激综合征(diarrhea-predominant IBS)患者中比在具有便秘型或疼痛型亚型的患者中的短(Cann等，1983)。
在对禁食期间的小肠研究中，已报导在IBS患者中存在群集性收缩(discrete,clustered contraction)和延迟扩布收缩(prolonged,propagated contraction)(Kellow & Phillips,1987)。他们经历比健康人更频繁的无规律收缩引起的疼痛(Kellow & Phillips,1987；Horwitz &Fisher,2001)。
此类运动发现不能解释IBS患者的整个症候群；实际上，大多数这类患者不具有可表明的异常(Rothstein,2000)。IBS患者具有增强的对内脏痛的敏感性。关于直肠乙状结肠的球囊扩张(balloon distention)的研究已显示IBS患者在比对照受试者低得多的压力和容积下经历疼痛和胃气胀(Whitehead等，1990)。此类患者保持正常的躯体刺激感觉。
已提出许多理论来解释该现象。例如，内脏中的受体在对膨胀或管腔内的内容物的反应中具有增加的敏感性。脊髓的背侧解中的神经元可具有增强的兴奋性。此外，可牵涉感觉的CNS处理的改变(Drossman等，1997)。功能性磁共振成像研究最近已显示与对照受试者相比较，IBS患者在对疼痛的直肠刺激的反应中具有增加的前扣带回皮质(重要的疼痛中心)的活化(Mertz等，2000)。
日益增加的证据显示了传染性肠火与IBS的随后发展之间的关系。炎症性细胞因子可以起作用。在具有确认的细菌性胃肠炎(Neal等，1997)的历史的患者的观察中，25%报导了肠排便习惯的持久改变。症状的持久性可能归因于急性感染时的心理应激(psychologicstress)(Gwee等，1999)。
最近的数据表明小肠菌过度生长(bacterial overgrowth in the smallintestine)可在IBS症状中具有作用。在一个研究中(Pimentel等，2000)，被提及进行氢呼吸测试的202个IBS患者中有157个(78%)具有对于细菌过度生长为阳性的试验结果。在47个进行随访检查的受试者中，25个(53%)报告了利用抗生素治疗的症状(腹痛和腹泻)的改善。
IBS可呈现一系列症状。然而，腹痛和改变的肠排便习惯仍然是主要特征。腹部不适通常被描述为本质上痉挛，位于左下腹部，尽管严重度和位置可相差极大。患者可报告腹泻，或腹泻与便秘的交替发作。腹泻症状通常被描述为小体积稀便，粪便有时伴随粘液性排出物。患者还可以报告胃气胀、便急(fecal urgency)、排便后有残便感(incomplete evacuation)和腹胀。还可呈现上胃肠道症状例如胃食管反流、消化不良或恶心(Lynn & Friedman,1993)。
症状的持久性不是进一步测试的指征；其是IBS的特征并且本身是综合征的预期症状。在其症状恶化或改变的患者中显示了更广泛的诊断评价。进一步测试的指征还包括警告症状的存在、50岁后症状的发作以及结肠癌的家族史。测试可包括结肠镜检查、腹部和骨盆的计算机断层摄影术，以及小肠或大肠的钡研究。
J.青少年类风湿性关节炎
青少年类风湿性关节炎(JRA)，儿童中最流行的关节炎形式的术语，适用于特征在于滑膜的慢性炎症和过度生长的疾病的家族。该术语与在欧洲称为青少年慢性关节炎(juvenile chronic arthritis)和/或青少年特发性关节炎(juvenile idiopathic arthritis)的疾病的家族重叠，但不完全同义。
Jarvis(1998)和其它人(Arend,2001)已提出成人和儿童的类风湿疾病的发病机制牵涉先天性与适应性免疫之间的复杂相互作用。该复杂性在于解开疾病发病机制的困难的核心。
先天性和适应性免疫系统都使用多种细胞类型、广泛的细胞表面和分泌性蛋白质以及正负反馈的互联网络(Lo等，1999)。此外，虽然可分开考虑，但免疫系统的先天性和适应性翼在功能上交叉(Fearon &Locksley,1996)，并且在这些交叉点上发生的病理学事件可能与我们对慢性关节炎的成人和儿童的发病机制的理解高度相关(Warrington,等，2001)。
多关节JRA是特征在于多个关节(4个或更多个)包括手的小关节(Jarvis,2002)的炎症和滑膜增生的独特的临床亚型。该亚型的JRA因其多个关节受累以及其随时间过去快速进展的能力而可以是严重的。尽管临床上独立，但多关节JRA不是同质的，患者在疾病表现、发病年龄、预后和治疗反应上是变化的。这些差异极可能反映可在该疾病中发生的免疫和炎症性攻击的性质的变化谱(Jarvis,1998)。
K.斯耶格伦综合征(Sjogren's syndrome)
原发性斯耶格伦综合征(SS)是慢性缓慢进展的全身性自身免疫疾病，其主要影响中年女性(女性对男性的比率为9：1)，虽然其可见于所有年龄(包括儿童)(Jonsson等，2002)。其特征在于淋巴细胞浸润和外分泌腺的破坏，所述外分泌腺被单核细胞包括CD4+、CD8+淋巴细胞和B细胞浸润(Jonsson等，2002)。此外，在1/3的患者中看到腺外(全身性)表现(Jonsson等，2001)。
腺性淋巴细胞浸润是进展性特征疾病(Jonsson等,1993)，当广泛时，其可替换大部分器官。有意思的是，在一些患者中腺浸润与唾液腺中的异位淋巴显微结构(称为异位生发中心(ectopic germinalcenters))(Salomonsson等，2002；Xanthou & Polihronis,2001)十分相似。在SS中，异位GC被定义为具有滤泡树突细胞与活化的内皮细胞的网络的增殖细胞的T细胞与B细胞聚积体。靶组织内形成的此类GC样结构还表现了产生自身抗体(抗-Ro/SSA和抗-La/SSB)的功能性质(Salomonsson &,Jonsson,2003)。
在其它全身性自身免疫疾病例如RA中，已鉴定了对于异位GC是至关重要的因子。已显示具有GC的类风湿性滑膜组织产生趋化因子CXCL13、CCL21和淋巴毒素(LT)-β(在滤泡中心和套区型B细胞上检测到的)。此类分析物的多变量回归分析将CXCL13和LT-β鉴定为预测类风湿性滑膜炎中的GC的孤独细胞因子(solitarycytokine)(Weyand & Goronzy,2003)。最近，已显示唾液腺中的CXCL13和CXCR5通过募集B和T细胞，从而在SS中促成淋巴新生和异位GC形成，在炎症过程中起着至关重要的作用(Salomonsson&Larsson,2002)。
L.早期关节炎
不同炎性关节病的临床表现在疾病过程的早期是相似的。因此，通常难以区分处于发展导致糜烂性关节损伤的严重且持久的滑膜炎的风险中的患者与其关节炎是更自限的患者。为了将疗法适当地靶向，从而侵袭性地治疗具有糜烂性疾病的患者和在具有更自限的疾病的患者中避免不必要的毒性，这样的区分是至关重要的。目前用于诊断糜烂性关节病例如类风湿性关节炎(RA)的临床标准在早期疾病中不太有效，并且疾病活动的常规标志例如关节计数和急性期反应不足以鉴定可能具有不良结果的患者(Harrison & Symmons等，1998)。反映在滑膜中发生的病理事件的参数最可能具有重大的预后价值。
近来对鉴定早期炎症性关节炎的不良结果的预测物(predictor)的努力已鉴定了RA特异性自身抗体特别地针对瓜氨酸肽的抗体的存在与早期炎症性关节炎组群中的糜烂性持久疾病关联。在此基础上，环状瓜氨酸肽(CCP)已被开发来帮助鉴定患者血清中的抗-CCP抗体。通过使用该方法，已显示抗-CCP抗体的存在对于RA是特异性和敏感的，可区分RA与其它关节病，并且可在此类结果在临床上变得明显之前，潜在地预测持久的糜烂性滑膜炎(Schellekens等，2000)。重要地，抗-CCP抗体在表现临床症状之前许多年在血清中通常是可检测的，从而表明它们可反映亚临床免疫事件(Nielen等，2004；Rantapaa-Dahlqvist等，2003)。
不同炎症性关节病的临床表现在疾病过程的早期是相似的。因此，通常难以区分处于发展导致糜烂性关节损伤的严重且持久的滑膜炎的风险中的患者与其关节炎是更自限的患者。为了将疗法适当地靶向，从而侵袭性地治疗具有糜烂性疾病的患者和在具有更自限的疾病的患者中避免不必要的毒性，这样的区分是至关重要的。目前用于诊断糜烂性关节病例如类风湿性关节炎(RA)的临床标准在早期疾病中不太有效，并且疾病活动的常规标志例如关节计数和急性期反应不足以鉴定可能具有不良结果的患者(Harrison等，1998)。反映在滑膜中发生的病理事件的参数最可能具有重大的预后价值。
近来对鉴定早期炎症性关节炎的不良结果的预测物的努力已鉴定了RA特异性自身抗体特别地针对瓜氨酸肽的抗体的存在与早期炎症性关节炎组群中的糜烂性持久疾病关联。在此基础上，环状瓜氨酸肽(CCP)已被开发来帮助鉴定患者血清中的抗-CCP抗体。通过使用该方法，已显示抗-CCP抗体的存在对于RA是特异性和敏感的，可区分RA与其它关节病，并且可在此类结果在临床上变得明显之前，潜在地预测持久的糜烂性滑膜炎。重要地，抗-CCP抗体在表现临床症状之前许多年在血清中通常是可检测的，从而表明它们可反映亚临床免疫事件(Nielen等，2004；Rantapaa-Dahlqvist等，2003)。
M.银屑病
银屑病是具有脱皮和炎症的慢性皮肤病，其影响2至2.6%的美国人口，或580万至750万人。虽然疾病在所有年龄组中发生，但其主要影响成年人。其在男性和女性中表现大致相当。当皮肤细胞从它们低于皮肤表面的起始点快速上升并且在它们具有机会成熟之前堆积在表面上时，银屑病发生。通常该移动(也称为周转)花费约1个月，但在银屑病中，其可以仅在数天内发生。在其典型形式中，银屑病导致成块的覆盖有银色鳞屑的厚厚的发红(发炎的)皮肤。此类小块(其有时称为斑块)通常发痒或感觉到疼痛。它们最常见在存在于肘、膝、腿的其它部分、头皮、腰部、脸、手掌和足底，但它们可存在于身体上任何地方的皮肤上。该疾病还可影响指甲、脚趾甲以及生殖器的软组织和嘴的内部。虽然围绕患病关节的皮肤破裂是不常见的，但约100万银屑病患者经历产生关节的症状的关节炎症。该病况称为银屑病关节炎。
银屑病是由免疫系统(特别地称为T细胞的一种类型的白细胞)驱动的皮肤障碍。在正常情况下，T细胞帮助保护身体免受感染和疾病侵袭。在银屑病的情况下，T细胞被错误地操作，并且变得如此活跃以至于它们触发了其它免疫反应，这导致了炎症和皮肤细胞的快速周转。在约1/3的病例中，存在银屑病的家族史。研究人员已研究了大量受银屑病影响的家族，并且鉴定了与该疾病关联的基因。具有银屑病的人可能注意到有时他们的皮肤会恶化，随后又好转。可引起发红的病况包括感染、应激和使皮肤干燥的气候的改变。同样地，某些药物，包括被用来治疗高血压的锂和β-阻滞剂，可触发疾病的暴发或恶化。
N.多发性硬化
多发性硬化(缩写为MS，也称为弥漫性硬化或脑脊髓炎)是其中免疫系统攻击中枢神经系统，从而导致脱髓鞘的自身免疫病况。疾病发病通常发生在年轻成人中，更常见地在女性中。其具有范围在2至150/100,000的范围内的发病率。MS最早由Jean-Martin Charcot在1868年进行了描述。
MS影响脑和脊髓中的神经细胞彼此通讯的能力。神经细胞通过沿着称为轴突的长纤维传送称为动作电位的电信号来进行通讯，所述纤维被包裹在称为髓磷脂的绝缘物质中。在MS中，身体自己的免疫系统攻击和破坏髓磷脂。当髓磷脂失去时，轴突不能再有效地传导信号。名称多发性硬化是指脑和脊髓的白质中的瘢痕(硬化–最好称为斑块或损伤)，其主要由髓磷脂组成。虽然关于参与疾病过程的机制了解不少，但原因仍然不清楚。理论包括遗传学或感染。还已发现不同的环境危险因子。
几乎任何神经学症状可随疾病出现，并且通常进展至肢体残疾和认知障碍。MS采取几种形式，新的症状在不连续的攻击中产生(复发型)或随时间过去缓慢积累(进行型)。在攻击之间，症状可完全消失，但永久性神经学问题通常发生，特别地随着疾病进展。
尚无已知的MS的治愈方法。治疗试图在攻击后恢复功能，预防新的攻击以及防止失能(参政下面的详细论述)。MS药剂可具有不利的作用或不能被良好地耐受，并且许多患者寻求替代治疗，尽管缺乏支持性科学研究。预后难以预测；其取决于疾病的亚型、个体患者的疾病特征、初始症状以及随着时间进展人经历的失能程度。患者的寿命几乎与未患病群体的寿命相同。
MS的症状通常以不定期发生的急性恶化期(复发、恶化、发作或攻击)、以逐渐加重的神经功能退化，或以两种方式的组合出现。
MS的最常见表现是临床孤立综合征(CIS)。在CIS中，患者具有脱髓鞘的攻击暗示，但不满足多发性硬化的标准。仅有30至70%的经历CIS的人后来发生MS。该疾病通常呈现感觉(46%的病例)、视觉(33%)、小脑(30%)和运动(26%)症状。还报导了许多罕见初始症状，包括失语症、精神病和癫痫。首先寻求药物治疗的患者通常呈现多个症状。MS的初始体征和症状通常是短暂的、轻度的和自限的。此类体征和症状通常不会促使人寻求药物治疗，并且在已取得MS的诊断后有时仅回顾性地进行鉴定。MS的病例有时在为了其它原因进行的神经病学检查过程中被附随地鉴定。此类病例被称为亚临床MS。
具有MS的人可遭受几乎任何神经症状或体征，包括感觉的改变(感觉减退和感觉异常)、肌无力、肌肉痉挛或行动困难；协调和平衡的困难(共济失调)；说话(构音困难)或吞咽(吞咽困难)问题、视觉问题(眼球震颤、视神经炎或复视)、疲劳、急性或慢性疼痛以及膀胱和肠困难。不同程度的认知障碍和抑郁或不稳定的情绪的情绪症状也是常见的。失能进展和症状严重度的主要临床测量是展开残疾状态量表(Expanded Disability Status Scale)或EDSS。
多发性硬化复发通常是不可预测的，在无警告和无明显诱发因子的情况下发生。然而，一些攻击由常见诱因引发。复发在春季和夏季更频繁地发生。感染例如普通感冒、流感或胃肠炎增加复发的风险。应激也可触发攻击。妊娠可影响对复发的易感生，例如在妊娠末期提供保护作用。然而，在分娩后前几个月中，复发的风险增加。总体上，妊娠似乎不影响长期失能。许多潜在诱因已被检查并且发现不影响MS复发率。没有证据表明流感、乙型肝炎、水痘、破伤风或结核病的预防接种增加复发的风险。身体创伤不触发复发。对高于常规环境温度的暴露可加重现存症状，一种称为Uhthoff现象的效应。然而，Uhthoff现象不是已确定的复发诱因。
已描述了若干种亚型或进展模式。亚型使用过去的疾病过程以试图预测将来的过程。它们不仅对于预后而且对于治疗决策也是非常重要的。在1996年，国家多发性硬化症学会标准化了4个亚型定义：复发缓解型(relapsing remitting)、继发进展型(secondary progressive)、原发进展型(primary progressive)和进展复发型(progressive relapsing)。
复发缓解型亚型的特征在于不可预测的复发，和随后数月至数年的无疾病活动的新体征的相对平静(缓解)。在攻击过程中遭受的缺损可消退或留下后遗症。这描述了85-90%的具有MS的个体的初始过程。当缺损在攻击之间总是消退时，这有时称为良性MS。
继发进行性MS描述了具有初始复发缓解型MS，随后开始在急性攻击之间具有进行性神经衰弱(progressive neurologic decline)而无任何明确的缓解期的人。偶尔复发和轻度缓解可出现。疾病发病与从复发缓解型至继发进行性MS的转化之间的中位时间为19年。
原发进展型亚型描述了约10-15%的在它们的初始MS症状后从未具有缓解的个体。其特征在于从发病至失能的进展，不具有或仅具有偶尔和轻度的缓解和改善。原发进展型亚型的发病年龄晚于其它亚型。
进展复发型MS描述了从发病开始具有稳定的神经衰弱但也遭受明显的叠加攻击的那些个体。这是所有亚型中最不常见的亚型。
还已描述了具有非标准行为的病例。有时称为多发性硬化的界线类，此类病例包括德维克氏病、Balo同心圆性硬化症、Schilder弥漫性硬化和Marburg多发性硬化。多发性硬化在儿童中也差异地表现。此类疾病是MS的非典型变型还是不同的疾病尚存争议。
多发性硬化可以难诊断，因为其体征和症状可以与许多其它医学问题相似。卫生组织已建立了诊断标准来使执业医生容易地进行诊断法和标准化诊断法。历史上，Schumacher和Poser标准都是广为接受的。目前，McDonald标准集中在利用MS损伤在时间和空间上的传播的临床、实验室和放射学数据进行的论证。在其它可能的病况已被排除并且存在在解剖学上和时间上分离的脱髓鞘事件的证据之前，不能进行诊断。
如果个体已遭受MS的神经症状特征的单独发作，则单独的临床数据可以足以诊断MS。由于一些人在仅一次攻击后寻求药物治疗，其它测试可促进和易化诊断。最常使用的诊断工具是神经影像学、脑脊髓液的分析和诱发电位检查。脑和脊柱的磁共振成像显示脱髓鞘(损伤或斑块)的区域。可静脉内施用钆作为造影剂来突显活动斑块，以及通过消除，显示与目前评价的症状无关的历史损伤的存在。获自腰椎穿刺术的脑脊髓液的测试可提供中枢神经系统的慢性炎症的证据。测试脑脊髓液的少克隆带，其为在75-85%的具有MS的人中发现的炎症标志。具有MS的人的神经系统通常因此类途径的脱髓鞘而不太活跃地响应视神经和感觉神经的刺激。可使用视觉和感觉诱发电位检查此类脑反应。
MS目前被认为是具有初始诱因的免疫介导的障碍，其可具有病毒病因学，虽然该理念多年来一直存在争议并且一些人仍然对其持反对意见。损伤据认为由患者自己的免疫系统引起。免疫系统攻击神经系统，可能是因对具有与其自已的分子相似的结构的分子的暴露引起。
MS损伤最常见地牵涉靠近小脑的脑室、脑干、基底核(basalganglia)和脊髓的白质区域；以及视神经。白质细胞的功能是在其中进行处理的灰质区域与身体的其余部分之间传送信号。周围神经系统鲜被牵涉。
更具体地，MS破坏少突神经胶质细胞，其为负责产生和维持称为髓鞘的脂肪层，所述髓鞘帮助神经元运送电信号。MS导致髓磷脂的变薄或完全丢失，并且随着疾病进展，切断(横切)神经元的延伸或轴突。当髓磷脂丢失时，神经不再能够有效地传导电信号。称为髓鞘再生的修复过程在疾病的早期发生，但少突神经胶质细胞不能完全重建细胞的髓鞘。反复的攻击导致连续递减的有效髓鞘再生，直至围绕损伤的轴突建立瘢痕样斑块。已描述了4个不同的损伤模式。
除髓鞘再生外，疾病的其它病理标志是炎症。根据MS的严格免疫学解释，炎症过程由T细胞(一种类型的淋巴细胞)引起。淋巴细胞是在身体防御中起着重要作用的细胞。在MS中，T细胞通过血脑屏障(应当阻止T细胞进入神经系统的毛细血管系统)获得进入脑。除非因感染或病毒(所述感染或病毒减少了形成屏障的紧密连接的完整性)触发，否则血脑屏障通常对于这些类型的细胞是不可透过的。当血脑屏障再次获得其完整性时，通常在已清除感染或病毒后，T细胞被截留在脑内。T细胞将髓磷脂识别为外来物并且攻击其，就如同其是入侵病毒。这触发了炎症过程，从而刺激其它免疫细胞和可溶性因子如细胞因子和抗体。渗漏在血脑屏障中形成，这反过来引发许多其它破坏效应例如肿胀、巨噬细胞的活化以及更多的细胞因子和其它破坏性蛋白质的活化。
虽然不存在多发性硬化的已知治愈方法，但几种疗法已证明是有帮助的。疗法的主要目标是在攻击后恢复功能，阻止新的攻击，并且防止失能。关于任何医学治疗，在MS的治疗中使用的药剂具有几个有害作用。一些患者寻求替代性治疗，尽管靠近支持性、可比较的重复的科学研究。
在有症状的攻击过程中，高剂量的静脉内皮质类固醇例如甲基泼尼松龙的施用是用于急性复发的常规疗法。该类型的治疗的目标是尽快终止攻击并且在患者中留更少的持久缺损。虽然通常在短期中对于缓解症状是有效的，但皮质类固醇治疗似乎对长期恢复不具有显著影响。潜在副作用包括骨质疏松症和记忆力缺损，后者是可逆的。
疾病调节治疗是昂贵的并且大多数此类疗法需要频繁的(多达每日一次)注射。其它治疗需要以1-3个月为间隔的IV输注。复发缓解MS(RRMS)的最早临床表现是临床孤立综合征(临床孤立综合征)(CIS)。几个研究已显示在初次攻击过程中利用干扰素的治疗可减少患者将发生临床MS的概率。
自2007年起，已由不同国家的管理机构批准了RRMS的6个疾病调节治疗。3个是干扰素：两种干扰素β1a制剂(商品名称Avonex、CinnoVex、ReciGen和Rebif)和一种干扰素β1b制剂(美国商品名称Betaseron,在欧洲和日本为Betaferon)。第四种药剂是格拉默醋酸盐(Copaxone)。第五种药剂米托蒽醌是也用于癌症化学疗法的免疫抑制剂，仅在美国被批准并且很大程度上用于继发进行性MS。第六种药剂是那他珠单抗(以Tysabri市售)。所有6种药剂在减少攻击次数和减缓至失能的进展中效果适中，虽然它们的有效率不同，并且它们的长期作用的研究仍然缺乏。免疫调节剂(除米托蒽醌外)之间的比较显示在降低复发率和停止失能进展方面最有效的是那他珠单抗，还已显示其减小MS的严重度。米托蒽醌可以是它们所有当中最有效的；然而，通常不考虑将其用作长期疗法，因为其使用受到严重的心脏毒性限制。
通过频繁的注射(从每日一次(对于格拉默醋酸盐)变化至每周一次(但肌内注射)(对于Avonex))递送干扰素和格拉默醋酸盐。以每月1次的间隔通过IV输注施用那他珠单抗和米托蒽醌。
进行性MS的治疗比复发缓解型MS更困难。米托蒽醌已在具有继发进展型和进展复发型过程的患者显示阳性作用。其在短期随访中在减缓疾病的进展和患者的复发频率上效果适中。已证明治疗不改变原发进行性MS的过程。
与任何医学治疗一样，此类治疗具有几个副作用。最常见之一是在进行格拉默醋酸盐和干扰素治疗的注射位置上的刺激。随着时间过去，可在注射位置产生称为脂肪萎缩的可见凹痕(因脂肪组织的局部破坏而产生的)。干扰素产生与流感类似的症状；一些采用格拉默醋酸盐的患者经历表现为潮红、胸部紧迫感、心悸、呼吸急促困难和焦虑的注射后反应，所述反应通常持续少于30分钟。更危险的是来自干扰素和米托蒽醌的肝损伤，后者的免疫抑制作用和心脏毒性；和那他珠单抗进行性多病灶脑白质病的一些病例之间的假定联系。
疾病调节治疗减缓疾病的进展速率，但不终止其。随着多发性硬化进展，症候群(symptomatology)倾向于增加。疾病与多种症状和功能缺陷相关，所述缺陷导致一系列进行性损伤和失能。此类缺陷的治疗因而非常重。已显示药物疗法和神经康复都减轻一些症状的负荷，尽管都不影响疾病的进展。关于具有神经病学缺陷的任何患者，多学科方法是限制和克服失能的关键；然而，在指定“核心群组(core team)”中存在具体的困难，因为具有MS的人在一些点上可能需要来自几乎任何卫生职业和服务的帮助。类似地，对于每一种症状，存在不同的治疗选项。因此取决于患者和医生，治疗应当是个性化的。
与大多数慢性疾病一样，一些患者寻求替代性治疗，尽管缺乏支持性、可比较的重复科学研究。实例是食疗(dietary regimens)、草药，包括使用医用大麻(medical cannabis)帮助减轻症状，以及高压氧疗法。武术(martial arts)例如太极、放松训练例如瑜珈或一般锻炼的治疗性实践似乎减轻疲劳，但对认知功能没有影响。
O.寻常天疱疮
如Merck手册中所描述的，寻常天疱疮是罕有的潜在地致命的自身免疫疾病，其特征在于表皮内水疱(intraepidermal blisters)和明显地健康皮肤和粘膜上的广泛糜烂。诊断是通过利用直接免疫荧光测试的皮肤活组织检查。治疗是利用皮质类固醇和有时免疫抑制剂。
寻常天疱疮通常在中年或老年患者中发生，在儿童中十分罕见。一种变型副肿瘤性天疱疮在具有恶性肿瘤(原发性淋巴网状内皮细胞的)的老年人中发生；结果是不良的。
疾病的特征在于针对细胞间粘附分子桥粒芯糖蛋白-1和桥粒芯糖蛋白-3的自身抗体在表皮中的存在。它们是依赖于Ca的钙粘蛋白，参与粘附和表皮细胞之间的细胞信号转导。皮肤棘层松解由通过自身抗体结合产生的对桥粒芯糖蛋白的功能的直接抑制，或由导致细胞间粘附和水疱形成的下调的自身抗体-诱导的细胞信号传导造成。此类自身抗体存在于处于活动疾病的过程中的血清和皮肤中。复层鳞状上皮的任何区域可被影响，包括粘膜表面。目前已知的治疗方案包括与血浆置换疗法(plasmpheresis)和IV免疫球蛋白一起的或包括血浆置换疗法(plasmpheresis)和IV免疫球蛋白的药物例如皮质类固醇、免疫抑制剂的使用。因此需要可用作这样的药物，所述药物可用作桥粒芯糖蛋白替代物并且结合造成问题的自身抗体，以及阻止所述抗体攻击桥粒芯糖蛋白和引起与所述病况相关的症状。在PV的治疗中还需要抗原替代物的组合，所述治疗包括利用一小组配体进行的治疗，所述配体具有对存在于受累患者的血清中的每一种不同的自身抗体的亲和力。本发明从而包括联合疗法，其包括使用组合了针对抗原A的抗原替代物A、针对抗原B的抗原替代物B和针对抗原C的抗原替代物C等的组合。可使用例如US2007/0003954中描述的筛选方法发现配体或抗原替代物。许多自身抗原可被发现，从而可将许多针对自身抗体(所述抗体响应存在于PV中此类自身抗原的)的高亲和力配体用于治疗病况或疾病。还可将响应与疾病状态或病况相关的或所述疾病状态或病况呈现的未知自身抗体或与所述抗体反应的高亲和力配体，与在本文中鉴定的针对已知的自身抗体例如抗桥粒芯糖蛋白3的配体组合使用。
本发明还包括配体的筛选和/或检测配体的方法，所述配体包括类肽和类肽样部分(例如环状类肽)，和/或结合线粒体自身抗体和与寻常天疱疮及其它天疱疮相关疾病或病况相关的其它角质形成细胞自身抗体的其它寡聚体。本文中应用的筛选法可针对患有或怀疑患有寻常天疱疮或天疱疮相关疾病或病况的患者的生物液体(血清等)中的已知自身抗体以及未知自身抗体。筛选法可使用针对载体上的配体文库筛选溶液中的已知自身抗体的方法。一旦配体被鉴定为选择性配体，应可针对载体上或溶液中的自身抗体评价/验证该配体以测定配体抗体复合物的Kd或结合亲和力。类似地，可针对一小组与自身免疫障碍例如寻常天疱疮相关的已知的自身抗体筛选特定的配体或类肽。
还需要与除去造成问题的T细胞或任何免疫学来源或自身抗体的催化剂结合包含针对相关抗体的高亲和力配体(抗原替代物)的治疗的联合疗法的需要。还需要用于治疗自身免疫疾病和病况的诊断和治疗法的组合，所述组合包括根据未决申请美国专利申请No.12/789,711中描述的方法发现与与自身免疫障碍相关的T细胞或B细胞的方法、与使用在所述初始筛选中发现的配体除去此类T细胞(或B细胞)的方法，以及还与通过利用根据本文中公开的方法发现的高亲和力抗原替代物治疗患者来阻止自身抗体攻击天然抗原的方法的组合。
II.自身免疫疾病的诊断测定
本发明，在一个方面，可提供自身免疫疾病例如上述的自身免疫疾病的诊断。这将允许医生更容易地辨别具有重叠症状组，从而具有正确地鉴定的患者症状的根本生理学基础的各种疾病，打开早期干预和疾病管理。实际上，因为许多自身免疫疾病的治疗减缓了进展并且消除了症状但不阻止或治愈疾病，所以提供此类疾病的早期诊断的能力对于延迟更严重症状的发作是至关重要的。此外，能够给患者提供正确的药物来消除他们的症状而无需有时由错误的诊断引起的“反复试验”，将大大减少医疗费用，并且使患者避免不适和可能的伤害。
在使用本发明的抗原替代物进行的诊断测定的情况下，测定将利用血液或血清样品测试相关自身抗体的存在。在使用双重策略检测自身抗体和T细胞的测定中，此类测定将使用含T细胞的患者样品。最常使用的生物样品将是血液和血清(因为其中存在大量的T细胞)。然而，可证明其它样品例如眼泪、唾液、痰、脑脊髓液、精液或尿也同样有用。
在评价自身反应性T细胞或自身抗体在受试者中的存在中，可将观察到的反应性模式与标准相比较。标准可依赖于已知的针对患病和正常受试者建立的类肽结合模式，从而可以不需要用户提供除反应对照(即显示阳性反应存在所必需的试剂和条件的对照)外的任何东西。或者，可选择运行包含来自具有已知的健康或患病状态的实际人的相似样品的实际对照。此外，可随时间过去运行一系列来自相同受试者的样品，以寻找作为疾病进展的指征的自身抗体或自身反应性T细胞递增的趋势。
存在许多不同的检测根据本发明的自身抗体或自身反应性T细胞的方法。一个类型的测定可包括基于抗体的测定或模仿基于抗体的测定，包括形式例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射分析(immunoradiometric assays)、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定、FACS、FRET和Western印迹等等。各种免疫检测法的步骤已描述于科学文献中，例如Doolittle和Ben-Zeev(1999),Gulbis和Galand(1993),De Jager等(1993),和Nakamura等(1987)。一般而言，此类测定将包括排列在载体上的类肽的使用。类肽可以先前已被鉴定为自身反应性T细胞群体的相关配体，或相反地，其可以是未表征的类肽的阵列的部分，预测疾病或健康的总体T细胞结合模式。
固体载体可以柱基质、珠粒、滤纸、膜、条状物、平板或孔的形式存在，并且可将样品可施用于固定的类肽。在与样品接触后，可从载体洗掉不期望的(非特异性结合的)组分，留下与类肽复合的自身抗体或T细胞，随后使用各种方法，例如随后添加识别结合至载体的T细胞(例如，CD4、CD8)上的表面标志物或识别自身抗体或标记类肽的抗体，来检测所述自身抗体或T细胞。
在有效条件下将选择的生物样品与类肽接触并且进行足以允许类肽-T细胞形成或类肽-自身抗体复合物形成的一段时间，通常是简单地将样品与类肽接触并且将混合物温育长至足以使T细胞或自身抗体结合类肽的一段时间的问题。此后，通常洗涤样品-类肽组合物例如平板、滤纸或迹印，以除去任何非特异性结合的细胞种类或碎片，从而仅允许特异性结合至固定的类肽的那些细胞或自体抗体被检测到。
一般而言，生物复合物形成的检测在本领域是公知的并且可通过应用许多方法来实现。此类方法通常基于标记物或标志物例如放射性标记、荧光标记、生物及酶促标记的任一种的检测。关于此类标记物的使用的专利包括美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。当然，通过使用第二结合配体例如第二抗体和/或生物素/抗生物素蛋白配体结合安排可发现其它优点，这在本领域是已知的。
本领域技术人员设想了各种其它形式，所述形式对于本领域技术人员来说是公知的。下面论述预期对于本发明具有立即适应性的3个特定测定。
A.ELISA
免疫测定，在它们最简单和直接的意义上，是结合测定。特别地用于本发明的某些免疫测定是本领域已知的各种类型的酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。
在一个示例性ELISA中，将本发明的类肽固定至选择的表面(例如聚苯乙烯微量滴定板中的孔)上。随后，将怀疑包含自身抗体或T细胞的测试组合物添加至孔。在结合并且洗涤以除去非特异性结合的复合物后，可检测结合的T细胞或结合的自身抗体。检测可通过添加偶联至可检测标记物的另一种类肽来实现。该类型的测定与简单“夹心ELISA”类似，除标记试剂的结合直接在T细胞受体的抗原结合部分或自身抗体的结合位点上外。检测还可通过添加标记抗体来实现，所述标记抗体结合任何T细胞特异性表面抗原，例如识别对于一般性T细胞或特定种类的T细胞是独特的结构，或结合任何抗体。任选地，不标记抗体，随后添加对于第一抗体(Fc)具有结合亲和力的第二抗体，第二抗体偶联至可检测的标记物。
在另一个示例性ELISA中，将怀疑包含T细胞的样品固定至孔表面，随后与本发明的标记类肽接触。在结合并且洗涤以除去非特异性结合的免疫复合物后，检测结合的标记类肽。
无论使用的形式如何，ELISA具有某些共同特征，例如包被、温育和结合，希望除去非特异性结合的种类，以及检测结合的免疫复合物。由于类肽的简单和可预测的化学，可通过特殊化学反应将它们附着连至载体。
“在有效地允许免疫复合物形成的条件下”意指条件优选包括利用溶液例如BSA、牛γ球蛋白(BGG)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)/Tween稀释T细胞或自身抗体。此类添加的试剂也倾向于帮助减小非特异性本底。“适当的”条件还表示温育在足以允许有效结合的温度进行或进行足以允许有效结合的一段时间。温育步骤通常为在约25℃至27℃的温度进行约1至2至4小时左右，或可在约4℃左右进行过夜。
在进行了ELISA的所有温育步骤后，洗涤接触的表面以除去非特异性结合的材料。优选洗涤法包括利用溶液例如PBS/Tween或硼酸盐缓冲液的洗涤。在于测试样品与初始结合的材料之间形成特异性免疫复合物以及随后洗涤后，可测定即使少量的免疫复合物的存在。
检测可利用在与适当的生色底物温育后显色的酶。因此，例如，将期望将免疫复合物与缀合有尿素酶、葡糖氧化酶、碱性磷酸酶或过氧化氢酶的抗体或类肽在有利于该免疫复合物显色的条件下，接触或一起温育一段时间(例如在室温下在含PBS的溶液例如PBS-Tween中温育2小时)。
在利用标记抗体或类肽温育以及随后洗涤以除去未结合的材料后，例如，在过氧化酶作为酶标记物的情况下，通过与生色底物例如尿素或溴甲酚紫或2,2'-联氮-二-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)或H2O2一起温育来定量标记物的量。随后通过例如使用可见光谱分光光度计测量产生的颜色的程度来实现定量。
B.量子点
与使用抗原替代物治疗自身免疫疾病和使用除去与自身免疫疾病相关的T细胞或B细胞的方法的组合结合，本发明有利地在本发明的某些方面使用量子点标记细胞群体。量子点是其激子(exciton)被限制在所有3个空间维度中的半导体。因此，它们具有介于散装半导体(bulk semiconductor)的性质与离散分子的性质之间的性质。它们由当时在贝尔实验室的Louis E.Brus发现。研究者已在晶体管、大阳能电池、LED和激光二极管中研究了量子点。他们还已研究了作为用于医学成像的量子点并且希望将它们用作量子位元(qubit)。
存在几种产生量子点的方法。一般而言，利用先进外延生长技术在通过化学方法或通过离子注入产生的纳米晶体中，或在通过现有技术水平的平版印刷技术产生的纳米器件中生长量子线(quantumwire)、量子孔和量子点。
与常规化学法十分类似地，从溶解在溶液中的前体化合物合成胶体半导体纳米晶体。胶体量子点的合成基于由如下物质组成的三组分系统：前体、有机表面活性剂和溶剂。当加热反应介质至足够高的温度时，前体化学地转化成单体。一旦单体达到高至足以过饱和的水平，纳米晶体的生长就可始于成核过程。生长过程中的温度是决定纳米晶体生长的最适条件的至关重要的因素之一。其必需高至足以允许原子在合成过程中重排和退火(annealing)同时又低至足以促进晶体生长。在纳米晶体生长过程中必须严格控制的另一个至关重要的因子是单体浓度。纳米晶体的生长过程可在两个不同的方案“聚焦”和“散焦(defocusing)”中进行。在高单体浓度下，临界尺寸(critical size)(当纳米晶体既不生长也不收缩时的尺寸)相对较小，从而导致几乎所有颗粒的生长。在该方案中，更小的颗粒比大的颗粒生长更快(因为更大的晶体需要比小晶体更多的原子来生长)，从而导致粒径分布的“聚焦”以产生几乎单分散的颗粒。当保持单体浓度以便存在的平均纳米晶体尺寸总是比临界尺寸略大时，尺寸聚集(size focusing)是最佳的。当单体浓度在生长过程中消耗时，临界尺寸变得比存在的平均尺寸大，作为奥斯瓦尔德熟化(Ostwald ripening)的结果，分布“散焦”。
存在产生许多不同半导体包括有硒化镉、硫化镉、砷化铟和磷化铟的胶体法。此类量子点可在量子点容积(直径为10至50个原子)内包含少至100至100,000个原子。这对应于约2至10纳米，以10nm的直径，将近300万个量点可首尾相接排成一排并且适合人姆指的宽度。
可通过胶体合成法合成大量量子点。胶体法到目前为止是最便宜的，并且具有能够在实验台条件下进行的优点。其被公认为所有不同合成形式中毒性最低的形式。
自组装量子点在尺寸上通常介于10和50nm之间。通过平版印刷图案转印的栅电极或通过在半导体异质结构中在二维电子气上刻蚀定义的量子点可具有超过100nm的水平尺寸。
一些量子点是包埋在具有更大的带隙的另一种材料中的一种材料的小区域。此类量子点可以是所谓的核心-外壳结构(例如，CdSe在核心中，ZnS在外壳中)，或者来自称为ormosil的二氧化硅的专用形式。
量子点有时因阱厚的单层波动而在量子阱结构中自发产生。
当材料在与其晶格不匹配的基质上生长时，自组装量子点在分子束外延(molecular beam epitaxy)(MBE)和金属有机蒸气相外延(metallorganic vapor phase epitaxy)(MOVPE)的过程中在特定条件下自发成核。所得的品种(strain)在二维“湿润层(wetting-layer)”的顶部产生一致应变的岛(coherently strained island)。该生长模式称为Stranski-Krastanov生长。岛随后可被包埋以形成量子点。该制造法具有用于量子密码(即，单电子源)和量子计算的潜能。该方法的主要限制是制造成本和缺乏对单个点的定位的控制。
可从存在于远处掺杂量子阱或称为横向量子点(lateral quantumdot)半导体异质结构中的二维电子或空穴气产生单个量子点。用一薄层防蚀用涂料涂覆样品表面。随后通过电子束平印术在防蚀用涂料中确定横向模式。随后可通过蚀刻，或通过沉积金属电极(剥离程序)将该模式转移至电子或空穴气，所述沉积金属电极允许在电子气与电极之间施加外部电压。此类量子点对于牵涉电子或空穴传输即电流的实验和应用是非常有益的。
量子点的能量谱可通过控制几何尺寸、形状和约束势(confinement potential)的强度来进行工程化。同样地，与原子相反，通过隧道结(tunnel barriers)将量子点连接至导电铅(conducting lead)是相对容易的，这允许将穿隧能谱(tunneling spectroscopy)的技术用于它们的研究。量子点的约束(Confinement in quantum dot)还可因静电势(通过外部电极、掺杂、应力(strain)或杂质产生)产生。
量子点的高度有序的阵列还可通过电化学技术自组装。通过在电解质-金属界面上引起离了反应来产生模板，这导致纳米结构包括量子点至金属上的自发装配，随后将所述金属用作用于将此类纳米结构台面刻蚀(mesa-etching)在选择的基质上的掩模。
常规的小规模量子点制造依赖于称为“高温双重注射(hightemperature dual injection)”的方法，该方法不适用于大多数需要大量量子点的商业应用。用于产生更大量的一致的高质量量子点的可重复方法包括在分子簇化合物存在的情况下，在其中分子簇的完整性得到维持并且用作预制种子模板(prefabricated seed template)的条件下，从化学前体产生纳米颗粒。簇化合物的单个分子用作纳米颗粒的生长可始于其的种子或成核点。这样，高温成核步骤不是起始纳米颗粒生长所必需的，因为适当的成核位置已由分子簇提供于系统中。该方法的显著优点是其是高度可扩展的。
在现代生物学分析中，使用各种类型的有机染料。然而，此类染料一年比一年需要更大的灵活性，常规染料通常不能满足期望。为此目的，量子点已迅速地填补了该作用，经发现在一些方面优于常规有机染料，最明显的一个是亮度(归因于高量子产率)以及它们的稳定性(允许少得多的光漂白)。据估计量子点亮度和稳定性分别为常规荧光报道分子的20倍和100倍。对于单颗粒示踪，量子点的无规律闪烁是个小缺点。
量子点在高灵敏细胞成像中的应用在过去十年已显现出巨大的进步。量子点的改善的耐光性例如允许获得许多连续的焦平面图像，所述焦平面图像可被重构成高分辨率三维图像。利用量子点探针的惊人的耐光性的另一个应用是在一段很长的时期中实时对分子和细胞进行示踪。研究人员能够在小鼠的淋巴结中观察到量子点超过4个月。
半导体量子点还已被用于预标记细胞的体外成像。对单细胞迁移实时成像的能力预期对于几个研究领域例如胚胎发生、癌症转移、干细胞治疗和淋巴细胞免疫学是十分重要的。
C.检测试剂盒
在其它实施方案中，本发明涉及与上述组合方法一起使用的检测试剂盒。根据本发明的类肽或环状类肽或其它配体将包括在试剂盒中。试剂盒从而在适当的容器装置中包括一种或多种配体(类肽)，所述配体结合自身抗体或结合自身抗体和自身反应性T细胞，任选地连接于检测试剂和/或载体。试剂盒优选包括结合与这样的自身免疫疾病相关的自身抗体的配体。本发明从而涉及试剂盒，所述试剂盒使用通过两种不同的筛选方法发现的两种不同的配体，一种方法应用量子点或其它类似的装置来发现针对T细胞或与自身抗体的产生相关的其它细胞的高亲和力配体；另一种方法使用用作针对与这样的自身免疫障碍相关的自身抗体的抗原替代物的高亲和力配体。在该情况下，药物也被用作诊断试剂。
在其中将类肽或其它配体预结合至固体载体的某些实施方案中，提供载体，并且所述载体包括柱基质、珠粒、条状物或微量滴定板的孔。试剂盒的免疫检测试剂可采取多种形式的任一种，包括与给定的类肽或抗体缔合或连接至其的那些可检测标记物。在本发明的情况下示例性抗体是对T细胞受体上的表面抗原具有结合亲和力的那些抗体。
试剂盒的容器装置通常包括至少一个可将类肽置于其中，或优选地等分于其中的小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器装置。本发明的试剂盒通常还以密闭的方式包括用于包含类肽、抗体的装置和任何其它试剂容器以用于商业销售。此类容器可包括将期望的小瓶保持在其中的注射或吹模塑料容器。
环状类肽：
发明人已发展了可用于在基质外表面上同时合成环状分子/线性分子对的策略。此外，描述的方法适合用于产生用于在微阵列上展示的环状类肽文库。此类阵列用于发现结合疾病特异性抗体的类肽以及其它目的。所述方法通常包括利用包含附着残基(attachmentresidue)(例如，Fmoc-保护的Cys)和起始类肽残基(例如，ivDde-保护的β丙氨酸残基)的溶液处理类肽引发的Rink amide珠粒。保护基团保护残基的胺，并且可被除去，从而允许环状和线性分子的共合成。附着残基提供了可与功能化或活化的阵列基质(例如，半胱酸的巯基)偶联的反应性基团，所述反应性基团在后来的步骤中用于将分子系连或固定至阵列基质(例如，马来酰亚胺活化的显微镜载玻片)。因此，为了产生纯环状分子的阵列(几乎无或无线性化合物)-仅有环化类肽包含附着残基。
为了环化类肽，环化残基将包含可用形成环状类肽的末端类肽残基(例如，谷氨酸或天冬氨酸)偶联的侧链。对应的线性类肽链不具有环化残基。在除去保护基团后，两条链用作用于类肽链的合成或聚合的位点。此类方法消除了对在文库构建的每一个步骤上进行两个合成操纵(这在Pei法中是必需的)的需要。一旦合成了线性类肽，就立即将珠粒暴露于促进环化残基的侧链基团与类肽文库的N末端氮偶联的条件。由于线性类肽链不存在环化残基，因此其不能环化。
本发明的一个方面是在筛选一珠一化合物文库后测定命中物的序列。由于环肽或类肽不存在游N末端，因此不能使用Edman测序。此外，虽然类肽，与肽一样，可通过串联质谱法(Paulick等，2006)来进行测序，但环状分子将在多个位置片段化，使MS/MS谱的解释严重复杂化。该问题已限制了合成环肽文库的开发。Pei和同事最近通过开发“两化合物一珠”法解决了该问题，在所述方法中，每一个珠粒包含含有相同肽序列的线性和环状分子(Joo等，2006)。换句话说，线性分子编码环状分子。这可使用Lam(Liu等，2002)的策略来实现，在所述策略中，将两种不同的溶剂用于将珠粒分隔至两个不同的区域(内部和表面暴露的)中，所述区域附着至具有差异保护的羧化物侧链的谷氨酸残基。随后从内部和外部Glu残基延伸相同的肽链。最后，仅对表面暴露的Glu侧链脱保护，从而允许利用肽的末端氨基将它们环化。内层中的肽保持线性，从而用作编码链。
本发明的实施方案涉及被定制来产生微阵列(用于蛋白质指纹图谱和文库筛选的有用平台)的独特的一珠两化合物策略(one-bead-two-compound strategy)(MacBeath等，1999；Uttamchandani等，2005)。所述方法使用差异脱保护来产生两条链，所述两条链都包含目标类肽，但其中仅有一条链包含支持环化的环化残基以及仅允许环状类肽分子特异性缀合至活化的或功能化的基质的附着残基(Reddy和Kodadek,2005)(图1)。线性分子不偶联至基质，但被提供来支持基于串联MS的测序。
环状类肽文库和阵列
在一个实例中，将7:1比例的Fmoc-Cys(Trt)-OH与ivDde-β-Ala-OH添加至β-Ala-预处理的Rink amide树脂。按经验最优化该比例以从单个珠粒提供足够的线性类肽用于串联MS测序，而且产生尽可能多的环状类肽。在对Fmoc选择性脱保护后，再次将Fmoc-β-Ala-OH附着至Cys，在除去该Fmoc后，添加Fmoc-Glu(O-2-PhiPr)-OH。在该点上，除去Fmoc和ivDde保护基团，在两条链上进行类肽合成。使用常规亚单体化学掺入类肽残基例如甲胺(Nala)、烯丙胺(Nall)、异丁胺(Nleu)、2-甲氧乙胺(Nmea)、乙醇胺(Nhse)、胡椒胺(Npip)、糠胺(Nffa)、苄胺(Nphe)和1,4-二氨基丁烷(Nlys)。可使用微波(1000W)辅助合成方案合成类肽。可将珠等同地分配至类肽合成反应容器中，于二甲基甲酰胺(DMF)中膨胀，用2M溴乙酸和3.2M二-异丙基碳二亚胺(DIC)处理每一个反应容器。可在微玻炉中进行偶联。在用DMF洗涤珠粒后，可用可在微波炉中偶联的独特的伯胺处理每一个容器。可洗涤珠粒，将其混合，随机化，随后等同地重新分配至肽合成容器中，可重复进行该方法直至获得期望的长度。
随后利用1%TFA选择性除去Glu侧链上的2-PhiPr保护基团。最后，使用Kirshenbaum及同事的方法(PyBOP(3当量)、HOBt(3当量)和DIPEA(10当量)(Shin等，2007)进行大环化(macrocyclization)。注意，线性分子没有存在于环状分子中的两个残基，从而可容易区分来自每一种分子的质量峰，有利于分析和序列测定。
为了测定该方法的效率，分离单个珠粒，用酸处理以从珠粒裂解分子，随后进行HPLC、MS和MS/MS分析。发明人发现在几乎每一个情况下，特定珠粒上的类肽的序列可通过线性分子的串联MS分析来容易地测定。对于一些分子，质谱和HPLC分析显示含Cys-Glu分子的环化明显不完全，因为可清楚地检测到线性起始材料。这并不令人惊讶，因为环状文库的产生中的一般问题是并非所有序列都以相等的效率环化(Marthandan等，2005)。可假定N末端残基的性质对环化具有最大影响。实际上，利用MS/MS对超过50种类肽的分析显示如果N末端残基是Nmea，则环化产率几乎是定量的。因此，优选末端残基之一是Nmea。
可产生许多环状类肽，其中可在残基的侧链中引入适当的改变以试图改善环状类肽的该区域与结合靶的“适配性(fit)”。可在针对疾病或病况的体内测定或体外测定中评估环状类肽的变体的活性。
在本发明中预期还可使用环状类肽的变体或类似物。序列变体可通过在鉴定的环状类肽中产生保守置换来产生。置换型变体通常在分子内的一个或多个位点上包含另一个类肽残基对一个类肽残基的交换，并且可被设计来调节分子的一个或多个性质，特别地分子对于靶的亲和力，而不失去其它功能或性质。
类肽可使用修饰的、非天然的和/或稀有氨基酸。化学合成可用于将此类残基掺入目标化合物。非天然残基包括但不限于Aad(2-氨基己二酸)、EtAsn(N-乙基天冬酰胺)、Baad(3-氨基己二酸)、Hyl(羟赖氨酸)、Bala(β-丙氨酸)、Ahyl(别-羟赖氨酸丙酸)、Abu(2-氨基丁酸)、3Hyp(3-羟脯氨酸)、4Abu(4-氨基丁酸)、4Hyp(4-羟脯氨酸哌啶酸)、Acp(6-氨基己酸)、Ide(异锁链赖氨素)、Ahe(2-氨基庚酸)、Aile(别-异亮氨酸)、Aib(2-氨基异丁酸)、MeGly(N-甲基甘氨酸)、Baib(3-氨基异丁酸)、MeIle(N-甲基异亮氨酸)、Apm(2-氨基庚二酸)、MeLys(6-N-甲基赖氨酸)、Dbu(2,4-二氨基丁酸)、MeVal(N-甲基缬氨酸)、Des(锁链素)、Nva(正缬氨酸)、Dpm(2,2'-二氨基庚二酸)、Nle(正亮氨酸)、Dpr(2,3-二氨基丙酸)、Orn(鸟氨酸)和EtGly(N-乙基甘氨酸)。
除了上述变体外，发明人还预期可配制结构上相似的化合物来模拟本发明的类肽的关键部分。此类类肽化合物可以相同的方式用作肽并且可以是其功能等同物。模拟蛋白质二级和三级结构的组件的某些模拟物描述于Johnson等(1993)中。肽模拟物的使用的背后的根本原理是蛋白质的肽骨架主要存在来以这样的如有利于分子相互作用的方式给氨基酸侧链定向。在一个方面，类肽因此被设计来允许与天然分子相似的分子相互作用。
预期类肽或环状类肽中的胺基氮上的R基团可以是本文中一般性地或专门地描述的任何R基团。类肽或环状类肽可沿着类肽链具有取代基，如在例如美国申请No.10/190,308(将其通过引用并入本文)中提供的。
如本文中所用，术语“附着”或“附着的”是指通过键、连接、力或系连物(tie)连接或联合以使两个或更多个组分保持在一起，其包括直接或间接附着，以便例如其中第一分子直接结合至第二分子或材料，以及其中一个或多个中间分子被置于第一分子与第二分子或材料之间的实施方案。
“保护基团”是结合至分子并且被设计来封闭分子中的一个反应部位，但可在选择性暴露于激活剂或脱保护试剂后从空间上除去的部分。保护基团的几个实例在文献中是已知的。可通过用于合成的所有方法来控制用于特定合成的保护基团(也称为保护基)的正确选择。激活剂包括例如电磁辐射、离子束、电场、磁场、电子束、x射线等。脱保护试剂可包括例如酸、碱或自由基。保护基是结合单体、接头分子或预先形成的分子以保护单体、接头分子或预先形成的分子上的反应性功能性的材料，其在选择性暴露于激活剂例如电化学发生试剂后可被除去。可按照本发明的实施方案使用的保护基优选包括所有酸和碱不稳定性保护基团。例如，胺基可用叔丁氧羰基(BOC)或苄氧羰基(CBZ)(这两种保护基团都是酸不稳定性的)，利用9-芴甲氧羰基(FMOC)(其为碱不稳定性的)来保护。此外，亚磷酰胺上的羟基可利用酸不稳定性二甲氧三苯甲基(DMT)来保护。
可在合成反应过程中的任何点上对任何未反应的脱保护的化学官能团封端，以避免或防止在这样的分子上进一步键合。封端基团通过例如与未反应的氨基官能团结合以形成酰胺来对脱保护的官能团进行“封端”。适用于本发明的实施方案的封端剂包括：乙酸酐、正-乙酰基咪唑、异丙烯基甲酸盐、荧光胺、3-硝基邻苯二甲酸酐和3-硫代丙酸酐。
可按照本发明的实施方案使用的其它保护基团包括用于保护氨基部分的酸不稳定性基团：叔丁氧羰基、-叔-戊氧基羰基、金刚烷氧基羰基(adamantyloxycarbonyl)、1-甲基环丁氧羰基、2-(对-联苯)丙基(2)氧羰基、2-(对-苯基偶氮苯基基)丙基(2)氧羰基、α,α-二甲基-3,5-甲氧基苄氧基-羰基、2-苯丙基(2)氧羰基、4-甲氧基苄氧羰基、苄氧羰基、糠基氧羰基、三苯甲基、对-甲苯磺酰氨基羰基、二甲基硫膦基、二苯基硫膦基、2-苯甲酰-1-甲乙烯基、邻硝基苯基硫烯基和1-亚萘基；例如用于保护氨基部分的碱不稳定性基团：9-芴甲氧羰基、甲磺酰基乙氧基羰基和5-苯并异噁唑亚甲基氧羰基；例如当还原时为不稳定性的用于保护氨基部分的基团：对-二硫杂琥珀酰基(dithiasuccinoyl)、对-甲苯磺酰基和哌啶基-氧羰基；例如当氧化时是不稳定的用于保护氨基部分的基团：(乙硫代)羰基；例如对混合试剂(miscellaneous reagent)是不稳定的用于保护氨基的基团，适当的试剂列于基团后的括号内：邻苯二甲酰基(肼)、三氟乙酰基(哌啶)和氯乙酰基(2-氨基苯硫酚)；用于保护羧基的酸不稳定性基团：叔-丁酯；用于保护羟基的酸不稳定性基团：二甲基三苯甲基；和用于保护磷酸三酯基团的碱不稳定性基团：氰乙基。
类肽的纯化
可能期望纯化类肽。纯化技术对于本领域技术人员来说是公知的。此类技术通常包括层析和电泳技术来实现部分或完全纯化(或纯化至同质)。特别适合于纯类肽的制备的分析法是离子交换层析、排阻层析；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚焦。纯化类肽的特别高效的方法是快速蛋白质液相色谱法或甚至HPLC。
本发明的某些方面涉及类肽的纯化，在具体的实施方案，类肽的大体上纯化。如本文中所用，术语“纯化的类肽”意欲指可从其它组分分离的组合物，其中将类肽纯化至相对于其通常可获得的状态的任何程度。纯化的类肽因而还指不含其可通常存在于其中的环境的类肽。
一般而言，“纯化的”是指已经历分级分离以除去各种其它组分的类肽组合物，并且该组合物大体上保留其表达的生物活性。当使用术语“大体上纯化的”时，该名称是指其中类肽形成组合物的主要组分，例如构成按重量计约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%或更多的组合物的组合物。
根据本公开，用于定量类肽的纯化程度的各种方法对本领域技术人员来说是已知的。此类方法包括例如测定活性级分的比活性，或通过SDS/PAGE分析估量级分内的类肽的量。用于估量级分的纯度的优选方法是计算组分的比活性，将其与初始提取物的比活性相比较，以此方式计算纯度，在本文中通过“纯化倍数(fold purification number)”来估量。用于代表活性的量的实际单位当然可取决于被选择用以进行纯化的具体测定技术以及类肽是否展示可检测的活性。
类肽阵列
如本文中所用，术语“基质”表示可在其上进行加工以修饰或合成基底材料的表面上的分子的基底材料，或可将分子的阵列附着至其上以用于筛选方法的基底材料(阵列基质)。基质的示例性化学修饰包括将类肽或类肽的初始残基或碱基功能化和/或置于基底材料的表面层上，所述表面层能够化学偶联至本发明的类肽或这样的类肽的起始子。
用于本发明的实施方案的载体材料包括例如硅、生物相容性聚合物例如聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻璃、SiO2(例如，热氧化硅晶片，例如由半导体工业使用的热氧化硅晶片)、石英、氮化硅、功能化玻璃、金、铂和铝。功能化表面包括例如氨基功能化玻璃、羧基功能化玻璃、羟基功能化玻璃、和酰胺基功能化珠粒。此外，可用将载体覆盖一层或多层以提供用于分子附着或功能化的表面、增强或减弱的反应性、结合检测或其它专门应用。载体材料和/或层可以是多孔或无孔的。例如，载体可由多孔硅组成。此外，载体可以是硅晶片或芯片例如半导体设备制造工业中使用的硅晶片或芯片。本领域技术人员将知道如何选自适当的载体材料。
如本文中使用，术语“功能化”涉及固基质的修饰(以在基质表面上提供多种官能团)。如本文中所用，“功能化表面”意指已被修饰以便其上存在多种官能团的基质表面。如本文中所用，术语“官能团”表示负责分子结构的特征化学反应的分子结构内的特定原子团。示例性官能团包括烃、包含卤素的基团、包含氧的基团、包含氮的基团和包含磷和硫的基团，其全都可由本领域技术人员鉴定。
可将存在于阵列上的类肽共价或非共价地连接至阵列，可通过可裂解的接头将所述类肽附着至阵列载体(例如，硅或其它相对扁平的材料)。接头分子可以是载体与待合成的类肽之间插入的分子，接头分子可以不一定给所得的多肽传送功能性，例如分子识别功能性，而是延长载体表面与类肽功能性之间的距离以增强类肽功能性在载体表面上的暴露。优选地，接头应当为约4至约40个原子长。接头分子可以是例如芳基乙炔、包含2-10个单体单位的乙二醇寡聚体(PEG)、二胺、二酸、氨基酸等等及其组合。二胺的实例包括乙二胺和二氨基丙烷。或者，接头可以是与待合成的分子相同的分子，例如类肽。本领域技术人员知道如何设计适当的接头。
通常对底物进行化学修饰以连接一个或多个官能团。如本文中所用，术语“附着”或“附着的”是指通过键、连接、力或系连物连接或联合以使两个或更多个组分保持在一起，其包括直接或间接附着，以便例如其中第一分子直接结合至第二分子或材料，以及其中一个或多个中间分子，特别是分子被置于第一分子与第二分子或材料之间的实施方案。
具体地，在聚合物阵列中，将选择的官能团(其能够与形成聚合物阵列的选择的聚合物反应)附着至功能化基质表面，以便它们存在于表面上。如本文中针对化合物或官能团所用的，术语“存在”表示进行以维持附着的化合物或官能团的化学反应性的附着。因此，存在于表面上的官能团能够在适当的条件下进行一个或多个化学表征官能团的化学反应。
在其中阵列包括两个以上固定在固体载体的相同表面上的特征的那些实施方案中，阵列可被称为是可寻址的。当其具有多个区域的不同部分(例如，不同类肽)以便在阵列上的特定的预定位置(例如，“地址”)上的区域(例如，阵列的“特征”或“点”)可检测特定靶或靶的种类(虽然特征可偶尔检测具有该特征的非靶)时，阵列是“可寻址的”。阵列特征通常但不必被区隔空间(intervening space)分开。在阵列的情况下，“靶”可表示为流动相(通常地液体)中的待用结合至不同的区域上的基质的探针(“靶探针”)检测的部分。然而，“靶”或“探针”的任一个可以是有待用另一个评价的一个(因此，任一个可以是有待通过与另一个结合来进行评价的分析物例如抗体的未知混合物)。
在一个方面，本发明提供了在本文中称为“小分子打印”的用于产生高密度阵列的方法以及所得的组合物，其中使用与活化的基质上的化学基团反应的化学部分将小分子附着至固体载体。
本发明的某些方面包括其中将环状类肽的集合“打印”至载体上以产生高密度阵列的方法。一般而言，该方法包括(1)提供固体载体以形成阵列附着，其中利用能够与化合物或化合物的集合的期望的化学基团反应的部分功能化固体载体；(2)提供一种或多种待附着至固体载体的相同或不同环状类肽的溶液；(3)将一种或多种相同或不同环状类肽的溶液递送至固体载体；和(4)将环状类肽捕获在载体上，由此产生化合物的阵列。
如本领域技术人员将认识到的，虽然可使用能够与固体载体形成附着的任何期望的化合物，但优选地利用从分裂混合文库(split-and-pool library)或并行合成法(parallel syntheses)产生的那些类肽。如将被本领域技术人员所理解的，分裂混合文库的使用使得能够更高效地产生和筛选化合物。然而，通过并行合成法和通过常规方法合成的类肽分子还可用于本发明的组合物和方法。
如上所述，并行合成法的使用也是适用的。并行合成技术常规地包括产物在它们自己的反应容器中的单独装配。例如，可使用包含n行和m列小孔的微量滴定板，所述小孔能够装载小体积的可在其中进行反应的溶剂。因此，可将A型反应物的n个变体与B型反应物的m个变体反应以获得n×m个化合物的文库。
随后，一旦已使用适当的方法提供了期望的化合物，就可制备期望的化合物的溶液。在某些方面，在固体载体上合成化合物，随后将所得的合成珠粒以每孔1珠的密度分配至聚丙烯微量滴定板中。通常，随后将附着的化合物从它们的珠粒释放出来，将其溶解在小体积的适当溶剂中。在具体的实施方案中，可使用高精度阵列机器人(Schena等，1995；Shalon等，1996)；将其每一篇通过引用并入本文)从每一个孔取出小体积的溶解的化合物，反复地将适当体积的溶液递送至一系列功能化的玻璃基质上的确定位置。这导致化合物的微型点在阵列基质上形成。除了高精度阵列机器人(例如，
Figure BDA0000373564180000661
100Microarrayer(Genomic Solutions))外，还可使用用于递送化合物的其它装置，包括但不限于喷墨打印机、压电打印机和小容量吸液机器人。
每一种环状类肽可包含介导与载体表面的附着的常见官能团。优选，形成的附着是非常强劲的，例如共价酯、硫酯或酰胺附着。除了链的牢固外，其它考虑包括待使用的固体载体和待附着至载体的化合物的具体种类。载体包括但不限于载玻片、聚合物载体或其它固体材料载体以及柔性膜载体。适合用于本发明的实施方案的载体的实例描述于美国专利5,617,060和PCT申请WO98/59360中，将所述专利或申请的每一个通过引用并入本文。
在另一个实施方案中，通过将待排列的化合物的官能团亲核加成至亲电体例如异氰酸盐或异硫氰酸盐来附着化合物。用于添加异氰酸盐或异硫氰酸盐的官能团包括伯醇、仲醇、酚类、硫醇、苯胺、氧肟酸、脂肪族胺、伯酰胺和磺酰胺。在某些实施方案中，亲核加成反应由蒸气例如吡啶来催化。还可使用其它挥发性亲核试剂。在某些实施方案中，亲核试剂包括胺。在某些实施方案中，使用杂芳基试剂。
可任选洗涤和干燥载体，可在筛选之前将其于-20℃贮存数月。
用于本发明的阵列可包括约10、100、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、12,500至25,000、50,000、75,000、至100,000种不同的环状类肽，包括其间的值和范围。
接头
本发明可包括通过接头连接至不同基质和/或分子的类肽。可将众多种接头的任一种用于实现类肽的连接。基于不同的药理学特征和容量，某些接头相对于其它接头通常是优选的。具体地，可将接并没有附着在类肽的游离-OH基上。
将交联剂用于形成将两个分子的官能系连在一起的分子桥接(molecular bridge)。用于组合类肽或将类肽偶联至各种基质的联接/偶联剂包括连接例如例如抗生物素蛋白-生物素、酰胺、酯、硫酯、醚、硫醚、磷酸酯、磷酰胺、酐、二硫化物以及离子和疏水性相互作用。
示例性异型双功能交联剂包含两个反应基团：一个与伯胺基团反应(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)，另一个与巯基反应(例如，吡啶基二硫化物、马来酰亚胺、卤素等)。通过伯胺反应基团，交联剂可与表面或基质反应，以及通过巯基反应基团，可与包含具有巯基的附着残基的类肽组合物反应。可成功地用于本文中描述的方法的许多类型的含二硫键的接头是已知的。
另一种交联剂是SMPT，其是包含被相邻的苯环和甲基“立体位阻”的二硫键的双功能交联剂。据信二硫键的立体位阻起着保护键免受可存在于组织和血液中的硫醇盐阴离子例如谷胱甘肽攻击的功能，从而在附着的试剂体内递送之前阻止缀合物的解偶联。SMPT交联剂，与许多其它已知的交联剂一样，赋予交联官能团例如半胱氨酸的SH或伯胺(例如，赖氨酸的ε氨基)的能力。另一种可能类型的交联剂包括包含可裂解的二硫键的异型双功能光反应性叠氮苯例如磺酰基琥珀酰亚胺基-2-(对-叠氮基水杨酰氨基)乙基-1,3'-二硫代丙酸盐。N-羟基-琥珀酰亚胺基与伯胺基反应，叠氮苯(当光解时)非选择性地与任何氨基酸残基反应。
除了受阻交联剂(hindered cross-linker)外，还可据此使用非受阻接头。其它有用的交联剂，不考虑包含或产生受保护的二硫化物，包括SATA、SPDP和2-亚氨基硫烷(Wawrzynczak & Thorpe,1988)。此类交联剂的用途在本领域是公知的。另一个实施方案包括柔性接头的使用。美国专利4,680,338描述了对于产生配体与含胺聚合物和/或蛋白质的缀合物，特别是对于与螯合剂、药物、酶、可检测标记物等形成抗体缀合物是有用的双功能接头。美国专利5,141,648和5,563,250公开了包含在多种温和条件下可被裂解的不稳定性键的可裂解的缀合物。该交联剂特别有用，因为目标试剂可被直接键合至接头，裂解导致活性剂的释放。
还涉及了包括优选位于肿瘤环境内或在肿瘤环境内具有活性的酶的裂解位点的肽接头。此类肽接头的示例性形式是被尿激酶、纤溶酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa或金属蛋白酶例如胶原酶、明胶酶或基质降解酶裂解的那些肽接头。
诊断方法
可将通过测试样品的组分的检测产生的数据与对照数据相比较来确定测试样品中的靶是否正常。对照数据是指从可比较的来自已知在样品组分或样品状况方面具有确定的特征谱的正常细胞、样品或人的样品获得的数据。对于每一种待检测的组分，可测定来自正常或标准化样品的组分的对照量。优选，基于大量采自样品例如正常细胞或人的样品测定组分的对照量，以便其反映在正常细胞或群体中看到的此类靶的量的变化。
如果特定组分的测试量相较于组分的对照量显著增加或减少，则这是测试样品具有潜在缺陷或包含特定测试物质或生物体的阳性指征，或是特定病况或疾病的诊断。例如，如果生物途径组分的测试量相较于对照量增加或减少至少5倍或超过10倍，则这是测试样品与标准或对照样品不同或具有生物或非生物系统的改变的指征。阵列上至少1、5、10%或更多的要素（包括其间的所有值和范围）可满足10倍的阈值。
在某些实施方案中，用于检测生物途径例如信号转导途径的组分的方法可包括：提供包含多种固定在载体的表面上的环状类肽的载体，其中环状类肽特异性结合样品的一种或多种靶组分，将样品与载体接触，检测结合至它们的对应捕获试剂的生物途径的组分。在一些实施方案中，可将从测试样品产生的数据与对照相比较来确定在测试样品的生物途径中是否存在任何缺陷。样品制备法描述于美国专利申请2002/0137106中，该专利申请据此通过引用并入本文。
检测方法
用于检测捕获或结合在固体载体上的靶的方法通常分为光度测定检测法和非光度测定检测法。
光度测定检测法包括但不限于检测或测量吸光度、荧光、屈光指数、极化或光散射的那些方法。牵涉吸光度的方法包括直接(相较于本底的增加的吸光度)或间接(测量相较于本底减小的吸光度)测量分析物的光吸光度。紫外线、可见光和红外线的测量全都是已知的。牵涉荧光的方法还包括直接和间接荧光测量。牵涉荧光的方法包括例如免疫法例如ELISA或夹心测定法中的荧光标记。牵涉测量屈光指数的方法包括例如表面等离子体共振术("SPR")、光栅耦合法(例如，传感器均匀光栅耦合器、波长检测型光学传感器("WIOS")和啁啾光栅耦合器)、谐振镜像和干涉技术。包括测量极化的方法包括例如椭圆光度法。还可使用光散射法(比浊法)。
非光度测定检测法包括但不限于磁共振成像、气相离子光谱、原子力显微镜术和多极耦合共振光谱。磁共振成像(MRI)基于核磁共振(NMR)(由科学家使用以获得关于分子的微观化学和物理学信息的光谱技术)的原理。气相离子光谱仪包括质谱仪、离子迁移光谱和总离子电流测量设备。
质谱仪测量可被转换成离子的质荷比的参数。通常，目标离子具有单个电荷，质荷比通常简称为质量。质谱仪包括进样系统、电离源、离子光学组件、质谱分析器和检测器。几种不同的电离源已被用于从质谱仪中的载体或生物芯片的表面解吸和电离分析物。此类方法包括激光解吸/电离(MALDI,SELDI)、快原子轰击、等离子解吸和二次离子质谱仪。在此类质谱仪中，进样系统包括能够使载体啮合并且将其以与电离源存在可检测的关系放置，同时与质谱仪，例如，离子光学组件、质谱分析器和检测器保持通讯。通常具有用于捕获靶和经改造灵活地用作检测装置的平面的用于生物测定的固体载体通常称为生物芯片。
数据分析
可使用任何适当的方法分析通过定量结合至阵列上的每一种类肽的目标(靶)样品组分(例如，信号转导组分、免疫组分、质膜的酶调节剂、细胞周期组分、发育周期组分或病原体组分)的量产生的数据。在一个实施方案中，通过使用可编程数字计算机分析数据。计算机程序通常包括存储代码的可读介质。某些代码可被提供给内存，包括每一个特征在载体上的位置、该特征上的结合元件的身份以及用于洗涤载体表面的洗脱条件。计算机还可包括接收为关于载体上不同的可寻址位置上的信号的强度的输入数据的代码。该数据可显示检测的靶的编号，包括由每一个靶产生的信号的强度。
数据分析可包括测定检测的靶的信号强度(例如，峰的高度)和除去“异常值”(偏离预定统计分布的数据)的步骤。可标准化观察到的峰，通过该方法可计算每一个峰相对于一些参照的高度。例如，参照可以是在标度上设置为零的由仪器和化学药品(例如，能量吸收分子)产生的本底噪音。随后可在期望的标度上以相对强度的形式展示对于每一个靶检测的信号强度。或者，对于样品，可接纳标准，以便来自标准的峰可用作计算对于每一个检测的靶观察到的信号的相对强度的参照。
随后可通过计算机软件分析通过检测器例如质谱仪产生的数据。软件可包括将来自检测器的信号转换成计算机可读形式的代码。软件还可包括将算法用于分析信号以确定信号是否代表信号中对应于靶的“峰”的代码。软件还可包括执行算法的代码，所述算法比较来自测试样品的信号与“正常”或标准样品的典型信号特征并且测定两种信号之间的拟合的密切性。软件还可包括显示测试样品是否具有靶的正常特征谱或其是否具有异常特征谱的代码。
病况或疾病状态
一种或多种样品组分(生物标志物)的结合特征谱可用于预测、诊断或评价样品所获自的受试者的病况或疾病状态。病症状态或病况包括但不限于癌症、自身免疫疾病、炎性疾病、感染性疾病、神经变性疾病、心血管病、细菌感染、病毒感染、真菌感染、朊病毒感染、生理状态、污染状态或一般健康。本发明的方法可使用结合特征和类肽配体来区分疾病状态的不同形式，包括疾病前状态或疾病状态的严重度。
本发明特别地涉及各种动物模型的用途。例如，癌症的各种动物模型可用于确定修饰类肽是抑制细胞生长、转移或复发还是影响其逃避其它药物的作用的能力。利用测试化合物治疗此类动物包括以给动物施用以适当的形式存在的化合物。施用可通过任何途径，可用于临床或非临床目的，包括但不限于口服、经鼻、经口腔或甚至局部施用。或者，施用可通过口服、舌下、气管内灌注、支气管灌注、直皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射。本发明还涉及包含选自通过本文中所述的筛选法鉴定的环状类肽的高亲和力配体和药学上可接受的赋形剂。还可通过上文中鉴定的用于给动物施用测试化合物的方法的任一种递送此类组合物。
基于细胞的筛选形式
可使用基于细胞的筛选测定来鉴定靶特异性配体例如环状类肽。差异地标记(例如，两种不同颜色的量子点)具有不同特征(例如细胞表面受体的存在或不存在)但在别的方面具有相同特征的细胞。随后将细胞以适当地1:1的比例混合，随后暴露于展示在基质上的分子的文库。在适当地温育和洗涤后，挑拣仅结合一种颜色细胞的珠粒。处理珠粒以除去细胞和其它碎片，通过适当的分析技术鉴定结合的分子。该两色测定需要极高的特异性。如果珠粒展示分子结合细胞表面上除靶外的任何其它分子，则两种着色的细胞将被保留，分子将不被鉴定为命中物。参见Udugamasooriya等(2008)。
可改进测定以适应多种不同形式。例如，三细胞类型测定可用于区分结合高度相关分子的配体。例如，当两种受体几乎相同时，提供为无效或具有一个或另一个相关受体的细胞。利用不同试剂(例如，有色量子点)标记每一个细胞类型(无效、包含受体1和包含受体2)。将细胞以约1:1:1的比率混合在一起，暴露于珠粒文库。挑拣仅结合一种颜色的细胞的珠粒，表征它们展示的化学药品。
可区分的结构的实例包括抗体或各种免疫细胞的T细胞受体、生长因子受体、细胞基质蛋白、凝集素、碳水化合物、脂质、来自各种病原体的细胞表面抗原。此外，细胞的差异不在于细胞表面分子的组成，而在于它们的排列。例如在一个细胞类型上，两个给定的细胞表面分子可能彼此结合在一起，从而为配体提供唯一的结合位点，所述结合位点不存在于此类受体不结合于其上的不同细胞类型中。标记可利用比色标记物、荧光标记物、生物发光标记物或化学发光标记物。
还可改进测定以鉴定结合仅存在于两种或更多种不同细胞群的一种中的细胞的配体。例如，可用一种颜色的染料标记所有来自健康个体或个体的群体的CD4+T细胞，并且用不同颜色的染料标记来自患有自身免疫疾病的个体或患有自身免疫疾病的个体的群体的CD4+T细胞。随后将两个群体的T细胞与珠粒文库混合，可选择仅保留来自自身免疫患者的细胞的珠粒。此类T细胞可以是展示结合自身抗原，从而促成疾病的T细胞受体(TCR)的自身免疫T细胞的候选者，因为此类细胞应当仅在自身免疫样品中丰富但在获自健康个体的细胞中不丰富。
在另一应用中，两个或更多个细胞群体可仅在基因突变存在或不存在上存在差异，所述基因突变可导致细胞表面上分子的组成和/或组织的改变。
试剂盒
可在试剂盒中包括本文中描述的任何组合物。在非限定性实例中，在试剂盒中提供环状类肽、环状类肽阵列和相关载体、缓冲液、接头和试剂。试剂盒还可包括用于处理样品和/或样品组分的试剂。试剂盒还可包括可用于利用放射性同位素或荧光基团标记样品的阵列的各种组分的试剂。
特别地涉及了用于执行本文中描述的本发明的方法的试剂盒。在一个实施方案中，存在用于合成、处理和检测环状类肽阵列的试剂盒。
用于检测样品组结合的试剂可包括如下试剂的一种或多种：阵列基底、环状类肽和/或检测试剂。
可将试剂盒的组分以液体介质或以冻干形式进行包装。试剂盒的容器装置通常包括至少一个可将组分置于其中，优选地，适当地附着至其中的小瓶、试管、平板、烧瓶、瓶子、阵列基底(array substrate)、注射器或其它容器装置。当试剂盒中存在超过一种组分时(可将标记试剂和标记物包装在一起)，试剂盒通常还包括第二、第三或其它额外的容器，可将另外的组分分别地放置在所述容器中。然而，可在单个小瓶中包含组分的各种同组合。本发明的试剂盒通常还以密闭的方式包括用于包含结合成分或用于合成此类结合成分的试剂的装置和任何其它试剂容器以用于商业销售。此类容器可包括将期望的小瓶保持在其中的注射或吹模塑料容器。
当在一个和/或多个液体溶液中提供试剂盒的组分时，液体溶液通常是无菌和无蛋白酶的水溶液。在一些情况下，可将蛋白质性质组合物冷冻干燥以防止降解和/或可在低温(即，低于约
Figure BDA0000373564180000741
)贮存试剂盒或其组分。当以干粉和/或片剂提供试剂和/或组分时，可通过添加适当的溶剂重建粉剂。预期还可在另一个容器装置中提供所述溶剂。
IV.疗法
本发明还涉及具有对于自身反应性T细胞的结合特异性的类肽在治疗的背景中的用途，所述治疗是与利用高亲和力配体(用作抗原替代物)的患者的治疗组合的治疗。本发明涉及单独的抗原替代物在治疗此类自身免疫疾病中的用途，或可将此类抗原替代物与其它已知的用于特定自身免疫疾病或病况的治疗方案组合使用。在自身免疫疾病中，身体自已的免疫反应取决于其自已。最常见地，该过程始于变得对宿主自己的抗原敏感的某些T细胞-不在健康受试者中发生的过程。如果可选择性减少或消除此类自身反应性T细胞，即不影响正常免疫监督和活性所必需的其它T细胞，则自身免疫疾病的症状应当至少得到缓解，如果不是完全消除的话。本文中所述和公开的组合治疗一定能够用于通过除去T细胞或其它抗体生成/催化细胞以及通过使用抗原替代物阻止自身抗体对天然抗原的破坏，缓解或消除疾病的所有症状。在优选实施方案中，抗原替代物是环状类肽。本发明还涉及这样的联合疗法，其中可从结合T细胞并且将免疫毒素导向造成问题的T细胞的类肽或配体形成免疫缀合物，将所述联合疗法与根据本文中公开的方法发现的高亲和力抗原替代物组合用于治疗自身免疫病况或疾病。取决于医生开具的治疗方法，可组合使用所有本文中公开的方法。
A.用于消除T细胞的基于附着的方法
在一个实施方案中，提出利用已证明对于自身反应性T细胞具有特异性的类肽涂覆的载体可用于“淘选(pan)”患有自身免疫疾病的受试者的血液。该方法遵循参数并且使用与用于其它背景中(例如在癌症疗法或干细胞的收集中)的相同的用于白细胞除去法的设备。
更通常地，白细胞除去法是其中将白细胞从血液样品分离的实验室方法。可进行该方法以减少具有癌症(白血病)的个体的极高的白细胞计数或除去白细胞以进行输液。或者，可仅除去粒细胞、巨噬细胞和单核细胞，使淋巴细胞计数没有大的改变。这用作自身免疫疾病例如溃疡性结肠炎和类风湿性关节炎的治疗，其中此类细胞在炎症过程中起着活性部分的作用。
类肽将结合至血液从其通过的载体，从而使得自身反应性T细胞能够结合至载体，并且在返回患者之前从样品去除。相反地，不结合类肽的T细胞不被结合，可被送返患者。通过静脉注射管(intravenousline)从患者获得血液，通常在另一臂上以相同的方式将其返回。通常利用泵来驱动血液通过载体。该过程的典型持续时间为3-4小时。
本文中预期可将这样的方法与利用通过针对已知的自身抗体筛选配体文库发现的抗原替代物的患者的治疗组合使用。此类抗体可从抗体文库商业提供商商购获得。
B.毒素和免疫缀合疗法
在另一个实施方案中，将本发明的抗原替代物类肽与作为靶向试剂的T细胞类肽组合使用，所述靶向试剂将有效载荷特异性递送至它们结合的T细胞。在一个实施方案中，有效载荷可以是毒素，可使用标准交联化学药品将其附着至类肽。毒素具有许多种形式和作用，如下文中进一步讨论的。另一个选择是将免疫效应物连接至类肽以靶向T细胞。一个这样的免疫效应物是含IgG Fc的分子。下面还提供了含Fc分子的讨论。
可利用从多种接头的任一种来实现类肽的连接。基于不同的药理学特征和能力，某些交联剂通常优于其它交联剂，但通常，本领域技术人员已知的任何连接/偶联剂可用于组合本发明的类肽与毒素，例如，抗生物素蛋白-生物素连接、酰胺连接、酯连接、硫酯连接、醚连接、硫醚连接、磷酸酯连接、磷酰胺连接、酸酐连接、二硫链接、离子和疏水性相互作用。
表1–异型双功能交联剂
Figure BDA0000373564180000771
示例性异型双功能交联剂包含两个反应基团：一个与伯胺基反应(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)，另一个与巯基反应(例如，吡啶基二硫化物、马来酰亚胺、卤素等)。通过伯胺反应性基团，交联剂可与一个蛋白质(例如，选择的抗体或片段)的赖氨酸残基反应，通过巯基反应性基团，已系连至第一蛋白质的交联剂与其它蛋白质(例如，选择剂)的半胱氨酸残基(游离巯基)反应。
特别地，使用在血液内具有合理的稳定性的交联剂。已知许多类型的含二硫键的接头，所述接头可成功地用于缀合靶向和治疗性/预防性试剂。包含被立体位阻的二硫键的接头可证明产生更大的体内稳定性，从而在到达作用部位之前阻止靶向肽的释放。此类接头从而是一组连接剂。
另一种交联剂是SMPT，其为包含被相邻的苯环和甲基“立体位阻”的二硫键的双功能交联剂。据信二硫键的立体位阻起着保护键免受可存在于组织和血液中的硫醇盐阴离子例如谷胱甘肽攻击的功能，从而在将附着的试剂体内递送至靶部位之前阻止缀合物的解偶联。
SMPT交联剂，与许多其它已知的交联剂一样，赋予交联官能团例如半胱氨酸的SH或伯胺(例如，赖氨酸的ε氨基)的能力。另一种可能类型的交联剂包括包含可裂解的二硫键的异型双功能光反应性叠氮苯例如磺酰基琥珀酰亚胺基-2-(对-叠氮基水杨酰氨基)乙基-1,3'-二硫代丙酸盐。N-羟基-琥珀酰亚胺基与伯胺基反应，叠氮苯(当光解时)非选择性地与任何氨基酸残基反应。
除了受阻交联剂外，还可据此使用非受阻接头。其它有用的交联剂，不考虑包含或产生受保护的二硫化物，包括SATA、SPDP和2-亚氨基硫烷(Wawrzynczak & Thorpe,1986)。此类交联剂的用途在本领域是公知的。另一个实施方案包括柔性接头的使用。
美国专利4,680,338描述了对于产生配体与含胺聚合物和/或蛋白质的缀合物，特别是对于与螯合剂、药物、酶、可检测标记物等形成抗体缀合物是有用的双功能接头。美国专利5,141,648和5,563,250公开了包含在多种温和条件下可被裂解的不稳定性键的可裂解的缀合物。该交联剂特别有用，因为目标试剂可被直接键合至接头，裂解导致活性剂的释放。优选用途包括将游离氨基或游离巯基添加至蛋白质例如抗体或药物。
美国专利5,856,456提供了用于连接肽组分以产生融合蛋白例如单链抗体的肽接头。接头在长度上达到约50个氨基酸，包含至少一个带电荷的氨基酸(优选精氨酸或赖氨酸)的存在，随后脯氨酸，特征在于更大的稳定性和减少的聚集。美国专利5,880,270公开了用于多种免疫诊断和分离技术的含氨基氧的接头。
还涉及包含酶(优选位于细胞环境内或在细胞环境内具有活性的)的裂解位点的肽接头。此类肽接头的示例性形式是被尿激酶、纤溶酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa或金属蛋白酶例如胶原酶、明胶酶或溶基质素(stromelysin)。
然而，类肽还为包括与肽和蛋白质相比较更简单和更有效的附着点(是合成的)提供了唯一机会。
1.毒素
可按照本发明使用多种生物毒素。如本文中所用，术语“生物毒素”是指生物来源的毒素。由微生物产生的毒素是促成微生物致病性和/或宿主免疫反应的逃脱的原因的重要毒力决定因子。生物毒素在目的和机制上变化极大，并且可以是高度复杂的(鸡心螺(cone snail)的毒液包含数打小蛋白质，每一种小蛋白质靶向特定的神经通道或受体)，或相对较小的蛋白质。生物毒素本质上具有两个主要功能-捕食(蜘蛛、蛇、蝎子、海蜇、黄蜂)和防御(蜂、蚂蚁、白蚁、蜜蜂、黄蜂、毒箭蛙)。一些更有名的类型的生物毒素包括蓝藻毒素(由蓝细菌产生的)、出血毒素(靶向和破坏红细胞；颊窝毒蛇例如响尾蛇)、坏死毒素(引起坏死；褐色蜘蛛、“鼓腹巨蝰”-鼓腹咝蝰(Bitis arietans))、神经毒素(黑寡妇、蝎子、箱水母)。
根据本发明特别关注的是细胞毒素，例如来自蓖麻子豆植物的蓖麻蛋白。还有用的是细菌毒素包括来自梭菌属(Clostridium)的细菌毒素：破伤风(破伤风痉挛毒素)、产气荚膜杆菌(perfringens)(α毒素，肠毒素)、难辨梭菌(difficile)(A,B)、肉毒梭菌(botulinum)(保妥适(botox)、葡萄球菌属(Staphylococcus)(金黄色葡萄球菌(S.aureus)α/β/δ、剥脱素、中毒性休克综合征毒素、SEB)以及炭疽毒素、李斯特菌溶血素、链球菌溶血素、PV杀白细胞素(Panton-Valentine leukocidin)、索状因子(cord factor)、白喉毒素、志贺毒素(shiga toxin)、志贺样毒素/志贺样毒素(shiga-like toxin)(大肠杆菌)、大肠杆菌热稳定性肠毒素/肠毒素、霍乱毒素、百日咳毒素、假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、细胞外腺苷酸环化酶I型(超抗原(Superantigen))、II型(成孔毒素)、III型(AB毒素/AB5)、脂多糖(脂质A)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)δ内毒素、聚集因子A和纤连蛋白结合蛋白A。
蛋白质的发色团辅助光失活(Chromophore assisted lightinactivation)(CALI)包括使用光产生高度反应性的种类(通常单线态氧(singlet oxygen))。反应性种类破坏靶蛋白的，使其生物功能失活。此类分子可用于敲除蛋白质的功能。
由本发明进行的实验已显示基于钌的发色团是有效的弹头(warhead)。它们显示钌发色团可进入细胞并且使靶失活，从而允许体内和先体外后体内地CALI治疗活细胞。
2.含Fc分子
抗体双价由4条多肽链(2个具有可变区的短区段和2个具有可变区和恒定区的更长的区段)组成。长链与短链通过二硫键相互作用并且组成正常抗体的一半，可变部分负责抗原结合(Fv，或可变片段)。两个抗体半部分通过存在于Fc(片段，可结晶的)部分中的不同二硫键相互作用。
Fc部分在调节免疫细胞活性例如对不同细胞受体和免疫分子(例如补体蛋白质)的结合中起着重要作用。通过这样作用，其调节不同的生理效应，包括调理素作用、细胞裂解以及肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的脱粒。具体地，其可标记被其它免疫组分破坏的细胞。本发明寻求利用抗体或其含Fc片段将T细胞靶向破坏。
可使用的一种具体技术由Popkov等(2009)描述。作者将抗体工程化以包含整联蛋白α(v)β(3)和α(v)β(5)衔接头配体(adapter ligand)，其可自组装发动瞬间的化学编程的抗具有此类靶的植入肿瘤的多克隆反应。在不寻求佐剂疗法帮助的情况下观察到显著的治疗性反应。化学编程免疫反应由抗体依赖性细胞的细胞毒作用和补体导向的细胞毒作用(complement-directed cytotoxicity)驱动。这显示小分子配体通过更改它们的结合特异性“劫持(hi-jack)”抗体的能力。可将该方法与利用抗原替代物治疗患者组合使用。
C.组合疗法
可将上文中讨论的疗法与用于治疗自身免疫疾病的另一种试剂组合施用。通过组合试剂，可获得累积效应，同时不增加与单一疗法相关的毒性(如果有的话)。此外，还可能观察到超出累加效应(“协同作用”)。因此，组合治疗是开发新的治疗方案的常用方式。
类肽治疗可其其它试剂之前、与之同时和/或在其之后进行，间隔数分钟至数周。在其中施用类肽治疗和其它试剂的实施方案中，通常要确保每一次递送的时间之间具有充分长的时间，以便类肽治疗和其它试剂仍然能够对受试者产生有利的组合作用。例如，在此类情况下，预期可与类肽治疗大体上同时地(即，在约1分钟以内)提供2、3、4或更多个治疗方式。在其它方面，可在施用类肽之前和/或之后在从大体上同时，约1分钟、约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约22小时、约23小时、约24小时、约25小时、约26小时、约27小时、约28小时、约29小时、约30小时、约31小时、约32小时、约33小时、约34小时、约35小时、约36小时、约37小时、约38小时、约39小时、约40小时、约41小时、约42小时、约43小时、约44小时、约45小时、约46小时、约47小时、约48小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7或约8周或更长时间内，以及可从其推导的任何范围内，施用一种或多种试剂。
可使用类肽治疗和一种或多种试剂的各种组合方案。此类组合的非限定性方案示于下面，其中类肽治疗是“A”并且第二试剂是“B”：
A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  A/B/B  B/A/A  A/B/B/B  B/A/B/B
B/B/B/A  B/B/A/B  A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A
B/A/B/A  B/A/A/B  A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A
因此，可将本发明的类肽疗法与用于治疗上述障碍的其它疗法(但包括各种抗炎症和免疫抑制治疗)结合使用。
存在对开发寻常天疱疮和类似障碍或病况的新颖治疗的需要，所述治疗可避免使用或过度使用全身性皮质类固醇。PV抗体与桥粒芯糖蛋白3(Dsg3)和其它自身抗原反应。引发引起细胞皱缩、从相邻细胞脱离和变成圆球的下游信号转导事件。PV中的皮肤棘层松解可被信号转导激酶的抑制阻断，所述激酶包括p38MAPK、雷帕霉素的哺乳动物靶(mTOR)、Src和表皮生长因子受体(EGFR)。其还可被其它酪氨酸激酶、钙调蛋白、磷脂酶C和执行者天胱蛋白酶的抑制剂阻断。因此，本发明还涉及联合疗法，所述联合疗法包括使用T细胞配体、自身抗体配体和抑制导致或负责和/或部分负责PV的发生和进展下游信号转导事件的药物，包括本段落中提及的靶/蛋白质的每一种的抑制剂。与本发明的配体组合使用的可能药物的具体实例列于下文表1中。
表1
Figure BDA0000373564180000822
Figure BDA0000373564180000831
Figure BDA0000373564180000841
V.实施例
下面的实施例被并入来说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，下面在实施例中公开的技术代表了由发明人发现的在本发明的实施中运行良好的技术，从而可被认为构成用于其实施的优选模式。然而，本领域技术人员应当，根据本公开，理解可在公开的具体实施方案中进行许多改变，并且仍然获得类似的或相似的结果而不背离本发明的精神和范围。
实施例1–方法
类肽文库的合成。关于类肽文库的设计的详细内容先前已被公开(Udugamasooriya等，2008)。简而言之，在TentaGel大珠粒(直径140-170μM；替代物：0.48mmol/g树脂；Rapp Polymere)上合成文库。使用8种不同的胺进行文库的合成，从而导致262,144种化合物的理论多样性。使用微波(1000W)辅助合成方案以及分裂混合文库法(Olivos等,2002)合成9聚体文库。在文库合成完成时，利用95%TFA、2.5%三异丙基硅烷和2.5%水的混合物处理珠粒2小时以除去侧链保护基团，随后用10%的DMF中的二异丙基乙胺中和。利用二氯甲烷洗涤珠粒，干燥，随后于4℃贮存直至使用。
可溶性类肽的再合成。使用标准微波辅助方案(Olivos等，2002)(1000W的微波炉,10%的功率递送2X15秒，中间短暂地混合)在Knorr酰胺MBHA树脂(Novabiochem)上进行类肽配体和无规对照类肽的再合成。对于生物素化类肽或生物素-DOPA类肽，随后使用Fmoc化学(Udugamasooriya等，2008)，通过标准肽合成方案将Fmoc-Glu(生物素基-PEG)-OH(Novabiochem)和Fmoc-DOPA(Novabiochem)偶联在Knorr酰胺MBHA树脂上。将标准微波辅助方案用于产生上述分子的类肽部分。利用95%TFA、2.5%三异丙基硅烷和2.5%的水从树脂裂解类肽，进行2小时，使用WatersBreeze HPLC系统纯化所述类肽。使用MALDI-Voyager DE Pro质谱仪检测类肽的质量。
环状类肽文库的合成。
下列实例是为了举例说明本发明的各种实施方案而给出的并且无意以任何方式限定本发明。本领域技术人员将容易地理解，本发明被良好地改造来进行目标和获得提及的终点和优点，以及其中固有的目标、终点和优点。本实施例与本文中描述的方法一起目前代表了优选实施方案，是举例性的，并且无意作为对本发明的限制。由权利要求的范围确定的其中的改变和包括在本发明的精神内的其它用途对于本领域技术人员来说是可想到的。
材料和设备。将所有商业试剂以获得的形式使用而无需进一步纯化。O-叔丁基-2-氨基乙醇购自CSPS Pharmaceuticals。甲胺以2M的THF中的溶液使用。聚苯乙烯AM RAM大珠(500-560μm；0.52mmol/g)和Rink Amide AM LL(100-200目,0.35mmol/g)树脂分别获自Rapp Polymere和Novabiochem。在Varian300MHz光谱仪上记录NMR谱。利用使用0.1%TFA的水/乙腈的梯度洗脱，在具有C18反相柱的Waters binary HPLC系统上进行制备型HPLC。在Voyager-DEPRO活组织分光度测量术工作站(biospectrometry workstation)和4700Proteomics分析仪(Applied Biosystems)上，利用α-氰基-4-羟基桂皮酸作为基质分别进行MS和串联MS(MALDI-TOF)。在New BrunswickScientific Innova4000振荡培养箱中进行肽的合成。在1000WWhirlpool微波炉(MT1130SG型)中，利用10%的功率在微波条件下进行类肽的合成。标准玻璃肽合成容器(Chemglass)用于在振荡培养箱和微波炉中进行合成。通过使用SpotArray 72 Microarray Printing系统(PerkinElmer)在马来酰亚胺功能化载玻片上制备微阵列。利用GenePix4000B扫描仪扫描杂交微阵列。
Figure BDA0000373564180000861
ivDde-β-Ala-OH的合成。为了将H-β-Ala-OH(1.02g,11.4mmol)和ivDde-OH(5ml,22.9mmol)搅拌悬浮在EtOH中，在室温下添加TFA(88μL,1mmol)。1随后将混合物回流24小时。在真空蒸发溶剂后，利用CH3OH/CH2Cl2(0.1%TFA)梯度通过柱层析纯化粗制产物以提供ivDde-β-Ala-OH(3.3g,97.6%).1H NMR(CDCl3)δ1.02(m,12H),1.90-2.03(m,1H),2.39(s,4H),2.75(t,J=6.0Hz,2H),3.06(brd,J=6.0Hz,2H),3.78(q,J=6.0Hz,2H)；13C NMR(CDCCl3)δ22.8,28.4,29.4,30.2,34.1,37.4,39.6,52.9,107.4,173.0,177.2；MS(MALDI)：m/z:C16H26NO4计算值296.2；实测值296.5[M+H]+。
珠粒上类肽的环化反应。在不同条件下测试珠粒上类肽的初步环化反应。利用PyBOP的产生最佳结果的典型方法如下。环化产率还取决于类肽的长度，高产率需要至少6个单体单位。通过使用Fmoc化学药品，将Fmoc-Cys(Trt)-OH和Fmoc-Glu(O-2-PhiPr)-OH相继地偶联至Rink Amide AM树脂。通过使用微波辅助亚单体方案进行类肽的合成。2利用1%TFA和2%的DCM中的三异丙基硅烷将2-PhiPr基团脱保护，进行2*30分钟。在利用5%的DCM中的DIPEA和DCM充分洗涤树脂后，在DMF中的PyBOP(3当量)、HOBt(3当量)和DIPEA(10当量)的条件下进行环化，进行2*10小时。在从珠粒裂解后通过MALDI-MS和HPLC确认环状类肽。
用于构建编码的环状类肽文库的一般工序。
使DMF中的聚苯乙烯AM RAM大珠粒在室温下膨胀1小时。在排出DMF后，用20%哌啶温育珠粒30分钟。用DMF(8×3mL)充分洗涤珠粒，随通过使用DMF中的HBTU(5当量),HOBt(5当量)和DIPEA(10当量)利用Fmoc-P-Ala-OH(5当量)处理2小时。在用DMF(8×3mL)充分洗涤珠粒和利用20%哌啶温育珠粒30分钟后，利用DMF(8×3mL)充分洗涤它们，随后通过使用DMF中的HBTU(4.6当量)和NMM(10当量)，利用ivDde-β-Ala-OH(0.6当量)和Fmoc-Cys(Trt)-OH(4当量)处理它们。2小时后，利用DMF(8×3mL)充分洗涤珠粒，随后用DMF中的Ac2O(10当量)和DIPEA(10当量)处理珠粒1小时以封闭可能的未反应的胺。在用DMF(8×3mL)充分洗涤珠粒和通过20%哌啶处理30分钟选择性除去Fmoc基团后，通过使用DMF中的HBTU(5当量)、HOBt(5当量)和DIPEA(10当量)利用Fmoc-β-Ala-OH(5当量)再次偶联它们，进行2小时。在用DMF(8×3mL)充分洗涤珠粒和利用20%哌啶温育30分钟后，通过使用DMF中的HATU(3当量)、HOBt(3当量)和DIPEA(10当量)，利用Fmoc-Glu(O-2-PhiPr)-OH(3当量)处理它们。2小时后，利用DMF(8×3mL)充分洗涤珠粒，随后利用DMF中的Ac2O(10当量)和DIPEA(10当量)处理1小时以封闭可能的未反应的胺。通过2.5%肼(进行2*10分钟)和20%哌啶(进行30分钟)的连续处理除去ivDde和Fmoc基团。在用DMF(8×3mL)充分洗涤珠粒后，通过使用溴乙酸和伯胺例如甲胺、烯丙胺、2-甲氧基乙胺、O-叔丁基-2-氨基乙醇、胡椒胺、糠胺、苄胺、1-正-叔丁氧羰基-1,4-二氨基丁烷，基于微波辅助亚单体方案制备由7聚体组成的分裂混合线性类肽文库。2利用DCM中的1%TFA和2%三异丙基硅烷(TIS)对2-PhiPr基团选择性脱保持，进行2*30分钟。在利用DCM中的5%DIPEA和DCM充分洗涤树脂后，在DMF中的PyBOP(3当量，～30mM)、HOBt(3当量，～30mM)和DIPEA(10当量)的条件下进行环化，进行2*10小时。环化产率娶愉于N末端上的残基。N末端由Nmea组成的环状类肽提供好得多的结果，几乎完全环化。在于95%TFA和5%TIS的条件下进行1.5小时从树脂裂解后，通过MS、串联MS(MALDI)或HPLC确认环状类肽。
生物素标记的环状类肽微阵列与链霉抗生物素-Cy3的杂交。制备由生物标记的在N末端上具有Nmea的环状类肽组成的微阵列。利用约2mM溶液的3倍系列稀释物，将生物素标记的环状类肽点在马来酰亚胺功能化的载玻片上。利用1×TBST(50mM Tris/150mMNaCl/0.1%Tween20,pH8.0)在4℃平衡微阵列，进行30分钟。在轻轻振荡的条件下，在4℃利用1×TBST(总共1mL溶液)中的链霉抗生物素-Cy3(10μL,Sigma)和BSA(50μL的2mg/mL)温育微阵列载玻片，进行45分钟。利用1×TBST(3×5分钟)在4℃洗涤载玻片，随后通过离心干燥。利用GenePix4000B扫描仪扫描杂交的微阵列。
制备10种类肽形式：β-Ala-Cys-Glu(生物素)-环状(Glu-X-X-X-X-X-X-Nmea)(参见图3A-C)，其中生物素-Glu具有缀合有侧链的生物素，X来源于图2中显示的胺之一。从树脂裂解分子，通过HPLC和串联MS进行分析。在每一种情况下，发明人能够容易地通过串联质谱仪对线性种类进行测序。此外，所有可检测的含Cys分子以环状形式存在。此外，还通过类似方法制备式1a的类肽。
将图3A-C中显示的5种类肽的系列稀释物以自控制方式点在PEG化的马来酰亚胺活化的显微镜玻璃载玻片(Marthandan等，2005)上，随后严荷地洗涤载玻片。为了显示环状类肽的固定，用Cy3-标记的链霉抗生物素蛋白温育载玻片，随后进行扫描。如所预期的，捕获的蛋白质的量随着点渍的类肽的量减少而减少，从而确认荧光确实是因类肽对蛋白质的特异性捕获而产生的(图3B)。为了证明Cys残基使环状类肽保留在马来酰亚胺衍生的载玻片，发明人合成两种缀合有荧光素的线性类肽，所述类肽除Cys的存在和不存在外是相同的。将此类类肽点在载玻片，随后在洗涤后进行扫描。如图3C中所示，仅在点渍含Cys类肽的地方才看到可检测的荧光。该研究确认了当将其与含Cys环状分子的混合物点在载玻片时，线性编码分子(参见图1)将不保留在载玻片上，从而不干扰筛选实验。
实施例2
EAE中的特异性自身反应性T细胞配体的筛选。为了使用式I的抗原替代物和使用T细胞配体的组合治疗的目的，提供下列实验。多发性硬化(MS)(Noseworthy等，2000)-与EAE的情况一样，通常通过利用髓磷脂蛋白或肽的免疫，或通过髓磷酯特异性CD4+T细胞的被动转移(Zamvil和Steinman,1990)来在遗传上易感的菌株中进行诱导。EAE的研究显示在外周已被激活并且产生促炎细胞因子的髓磷脂特异性CD4+T细胞在MS的疾病发病机制中起着要作用(Zamvil和Steinman,1990)。此外，此类T细胞表达据信优先识别患病个体的中枢神经系统中的髓磷脂碱性蛋白的T细胞受体，从而导致髓鞘的破坏和，最终神经缺损(neurological deficit)(Zamvil和Steinman,1990)。因此，仅特异性靶向自身反应性T细胞的治疗策略对于研究MS以及其它T细胞介导的疾病是令人感兴趣。作为第一步骤，发明人集中在能够高度特异性结合EAE中的自身反应性T细胞的合成化合物的分离。
为了实现该目的，发明人改造先前在他们的实验室中发展的筛选策略以适合用于分离类肽(Simon等，1992)，所述类肽以高度特异性结合完整膜受体(Udugamasooriya等，2008)。在该方案中，分别用红色和绿色量子点标记表达或不表达靶受体的细胞，所述细胞除表达或不表达靶受体外是相同的。随后将两个细胞类型混合物，利用数千亲水珠粒温育，所述珠粒的每一个展示独特的类肽。随后收集仅结合红色标记细胞并且不结合绿色细胞的珠粒，假定是这反映了对靶受体的高度特异性结合，因为类肽必须忽略细胞表面上的所有其它分子以排除绿色细胞并且被记录为“命中物”(图1A)。
为了将该两色筛选技术用于本问题，通过利用髓磷脂碱性蛋白肽Ac1-11(MBP Ac1-11)的免疫来在B10.PL小鼠中诱导EAE。利用该髓磷脂肽的免疫导致表达MBP Ac1-11特异性Vα2.3/Vβ8.2TCR的CD4+T细胞的活化和扩增(Ando等，1989)。在开展了临床确诊的EAE(图5A)后，处死EAE和健康对照小鼠，分离CD4+T细胞。用发射红色的量子点标记来自EAE小鼠的CD4+T细胞，利用发射绿色的量子点标记来自对照小鼠的T细胞。随后将细胞以1:1的比率混合在一起，利用包含约300,000种类肽的珠粒展示类肽文库温育所述混合物(图5B)。本发明的假说是数百万种不同的T细胞在总的群体中应当都以低水平存在并且两个群体应当十分相似。主要例外是增加的MBP Ac1-11-特异性自身反应性T细胞数目，所述T细胞在EAE小鼠中响应自身抗原的免疫而扩增。这表明如果发现珠粒仅结合红色细胞，则此类细胞极可能是自身反应性T细胞(图1A)。
在利用类肽珠粒温育后，发明人鉴定了两种假定的命中类肽，所述类肽被观察到特异性结合来自EAE小鼠的CD4+T细胞并且不结合来自健康对照小鼠的T细胞(图1B，图框i和ii)。显示了描述非特异性结合至来自EAE小鼠和健康对照小鼠的CD4+T细胞的类肽珠粒的另外的照片(图1B，图框iii)。通过Edman降解(Alluri等，2003)对两种珠粒上被评分为命中物的类肽进行测序，它们的推断结构在图1C中示出。发现两个“命中物”具有一些序列相似性。发明人选择集中在类肽之一(AG12A)以进行更详尽的表征。
AG12A类肽是EAE自身反应性T细胞的配体。为了确定AG12A是否结合至自体反应TCR，发明人利用转基因小鼠的存在，其中绝大部分CD4+T细胞表达MBP Ac1-11特异性TCR(Vα2.3/Vβ2.2TCR)(Goverman等，1993)。从此类小鼠分离CD4+T细胞，测试它们对AG12A的结合。以几个方法进行该测试。首先，在珠粒上再合成AG12A，同样地合成未选择为T细胞配体的对照类肽(图6)。随后用红色量子点标记的T细胞温育珠粒。如图1D所示，来自MBP Ac1-11TCR转基因小鼠的CD4+T细胞结合至珠粒上展示的AG12A，然而野生型CD4+T细胞未结合(图1D)。
为了进一步探究AG12A对MBP Ac1-11特异性T细胞的结合，发明人进行了化学交联实验，该实验包括将附着至类肽的二羟基苯丙氨酸(DOPA)氧化成邻醌中间产物。该中间产物随后可交联靶受体蛋白质上的邻近亲核残基(Burdine等，2004；Liu等，2006；Lim等，2007)。只有当DOPA-AG12A与受体靶十分靠近时才可看到交联，因为广泛的对照实验已显示除非它们存在于复合物中，否则该化学药品不能偶联分子(Liu等，2006)。利用浓度递增的生物素标记的DOPA-AG12A或利用生物素标记的对照DOPA-类肽温育来自Vα2.3/Vβ8.2TCR转基因小鼠的CD4+T细胞。在利用高碘酸钠处理后，随后利用缀合有荧光色素的链霉抗生物素蛋白和缀合至不同荧光色素的抗-CD4+抗体对细胞进行染色。通过计算CD4+/链霉抗生物素蛋白+细胞的平均荧光强度来估量类肽对T细胞的结合。发现AG12A以约40μM的KD结合MBP Ac1-11特异性T细胞(图2A-B)。然而，未检测到生物素化的AG12A与获自野生型小鼠的T细胞之间的相互作用，也未检测到生物素化的对照类肽对Vα2.3/Vβ8.2TCR转基因T细胞的结合(图2B)。
还可通过SDS-PAGE和利用NeutrAvidin辣根过氧化物酶(NA-HRP)的Western印迹分析类肽-细胞相互作用。当利用TCR转基因T细胞温育生物素-DOPA-AG12A时，检测到具有45kDa的表观质量的含生物素产物，但对于CD4-细胞或来自野生型小鼠的CD4+T细胞未检测到所述产生(图2C)。TCRα和β链的分子质量分别为约45和40kDa(Zamvil和Steinman,1990)，这表明AG12A对TCR的交联。此外，当利用α-Vα2TCR抗体探测印迹时，在约45kDa(与利用NA-HRP检测的条带重叠)处观察到产物，进一步表明AG12A交联至MBP Ac1-11特异性TCR(图2C)。
AG12A是抗原介导的自身反应性T细胞增殖的特异性拮抗剂。为了测试类肽-TCR结合可能拮抗抗原特异性T细胞的增殖的可能性，利用浓度递增的AG12A或对照类肽温育来自MBP Ac1-11TCR转基因小鼠的CD4+T细胞，利用羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的，和利用MBP Ac-11肽和抗原呈递细胞进行刺激。CSFE是以配形式存在的细胞可透过的，但一旦化合物进入细胞，此类基团立即被水解，使其成为细胞不可透过的。因此，细胞分裂导致荧光基团的细胞内浓度的稀释。在温育5天后，使用流式细胞术测量细胞分裂。发现AG12A以剂量依赖性方式，以约60-80μM的IC50抑制MBPAc1-11自身反应性T细胞的增殖(图3A)。当在对照类肽存在的情况下刺激转基因T细胞时未看到增殖的该减少(图3A)，AG12A也不抑制B细胞的增殖(图3B)。最重要地，AG12A也不抑制抗原刺激的髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白(MOG)35-55特异性TCR转基因T细胞的增殖(图3C)。该实验明确地显示了AG12A的作用对于识别MBPAc1-11抗原的T细胞是持异性的，而不是归因于对于任何活化的T细胞的一定的一般亲和力。
使用钌-类肽缀合物进行的自身反应性T细胞的先体外后体内灭活。具有由AG12A展示的优于40μM IC50的效能(是初始筛选命中物的典型(Kodadek等，2004))的拮抗剂对于实践应用是非常期望的。为获得该拮抗剂，将AG12A缀合至钌(II)三联吡啶络合物，所述络合物是当利用可见光辐照时用于产生单线态氧的高效催化剂(Lee等，2008)。单线态氧是将修饰大多数蛋白质并且使所述蛋白质失活的高度反应性种类，但其具有仅
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的有限扩散半径。因此，只有紧挨着钌“弹头”的蛋白质才受影响。当被类肽配体递送至靶蛋白质时，可获得高度特异性的光触发蛋白质失活(photo-triggered proteininactivation)(Lee等，已提交用以发表的)。利用浓度递增的AG12A-钌缀合物或对照类肽-钌缀合物温育MBP Ac-1-11特异性TCR转基因T细胞(图4A)，利用可见光(<380nm的截止型滤光片)辐照细胞(图6)。在10分钟辐照后，在抗原呈递细胞存在的情况下，利用自身抗原MBPAc1-11活化T细胞。使用氚化胸腺嘧啶测定评估细胞增殖。如图4B中所示，AG12A-钌缀合物以100nM的浓度强有力地抑制MBPAc1-11特异性自身反应性T细胞的增殖(图4B)。这代表了为单独的类肽活性的约700倍的改善。当使用来自MOG35-55TCR转基因小鼠的CD4+T细胞时，未看到该抑制(图4C)，再次表明AG12A对于MBP Ac1-11特异性自身反应性T细胞的特异性。
存在光分离置换疗法(Photophoreresis therapy)，其中取出细胞，利用光反应性药物处理，暴露于UV光，将所述细胞重新输注回患者(Rostami等，1999；Besnier等，2002；Cavaletti等，2006)。因此，虽然触发钌三联吡啶催化的单线态氧产生所需的蓝光不能穿透进入活生物体，但鉴于该先例，类肽-钌缀合物对自身免疫T细胞的先体外后体内灭活似乎是可行的。为了测试该理论和确认在利用类肽-钌缀合物和光处理后使得自身反应性T细胞无反应，发明人使用EAE的采纳的转移模型。从MBP Ac1-11TCR转基因小鼠分离CD4+T细胞，利用AG12A-钌缀合物或对照类肽-钌缀合物处理所述细胞，辐照所述细胞，在抗原呈递细胞存在的情况下利用MBP Ac1-11肽刺激所述细胞，将所述细胞注射回首次用于实验的受体。随后观察此类动物的EAE的临床体征。如所预期的，利用抗原刺激的自身反应性T细胞(已暴露于对照类肽-钌缀合物或未暴露于类肽)注射的动物产生EAE(图4D)。当既不用抗原刺激刺激T细胞也不将T细胞暴露于类肽时，过继转移不导致EAE，如所预期的。意外的是，利用抗原刺激和利用AG12A-钌缀合物处理的MBP Ac1-11特异性CD4+T细胞不诱导受体动物的EAE(图4D)。该实验证明了使用自身反应性T细胞靶向钌类肽缀合物作为自身免疫T细胞先体外后体内活化的强有力光触发抑制剂的可行性。
实施例3-寻常天疱疮
根据本文中描述的一般方法在阵列上产生10,000种环状类肽的文库。针对标记的(或未标记的)天疱疮自身抗体筛选文库，发现某些配体结合至载体上的自身抗体。可使用桥粒芯糖蛋白3的可溶性重组细胞外结构域从例如寻常天疱疮(PV)患者的血清获得自体抗体，以获得亲和纯化的抗-桥粒芯糖蛋白3自身抗体，如Ding等，“TheAnti-Desmoglein 1 Autoantibodies in Pemphigus Vlugaris Sera arePathogenic”,The Journal of Investigative Dermatology,第112卷,No.5,pp739-743(1999)中所描述的。检测与特定配体相关的结合的自身抗体，随后根据其在阵列上的位置确定抗原替代物的特征。用作抗原替代物的优选环状类肽包含用R1-R5取代的5聚体，其中R1-R5独立地选自C1-C6烷基、利用至少一种选自–OH、-OR(其中R是C1-C6烷基)、-NR5R6的部分取代的C1-C6烷基；芳基或杂芳基或用至少一种选自卤素、CF3、-OH或-OR的部分取代的芳基或杂芳基。
优选的抗原替代物包括式I的化合物：
Figure BDA0000373564180000941
其中R1-R5在属类上如上文中所描述并且具体地如右边的结构中所显示的(化合物1a)。该化合物是寻常天疱疮的自身抗体的配体。上述化合物在溶液中具有约10-5M的对于针对Dsg自身抗原的寻常天疱疮自身抗体的结合亲和力。据信，根据本文中描述的方法发现的其它寡聚体可在溶液中具有10-5至10-9M的结合亲和力(KD)。在该实施例中，针对已知的寻常天疱疮自身抗体(Dsg3)筛选10,000种环状类肽，以发现优选命中物，所述命中物在溶液结合研究中具有10-5的结合亲和力。
实施例4–讨论
发明人已在此处显示了组合文库筛选方案，所述方案能够产生结合自身免疫疾病或病况例如寻常天疱疮和/或落叶型天疱疮的自身抗体的合成分子。寻常天疱疮和落叶型天疱疮的自身抗原分别包括桥粒芯糖蛋白3和桥粒芯糖蛋白1。针对此类自身抗原的每一种的自身抗体称为抗-桥粒芯糖蛋白1(在落叶型天疱疮中具有病原性)和抗-桥粒芯糖蛋白3(在寻常天疱疮中具有病原性)，并且包括多种变体。抗-桥粒芯糖蛋白1抗体也见于寻常天疱疮中。本发明从而包括使用本文中鉴定的筛选方案鉴定针对与自身免疫疾病或障碍相关的自身抗体的高亲和力配体的方法。还可将此类配体与具有高度特异性的针对抗原特异性自身免疫T细胞的配体组合使用。
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可产生本文中所公开和要求保护的所有组合物和方法，并且根据本公开在无需过度实验的情况下执行所述组合物和方法。虽然已根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员来说显而易见的是可在不背离本发明的理念、精神和范围的情况下对本文中描述的组合物物和方法，或用于所述方法的步骤或步骤的顺序进行改变。更具体地，显然可用在化学上和生理学上相关的某些试剂替换本文中描述的试剂同时获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员来说是显然的是，所有此类相似的替换和变动均认为在由所述权利要求定义的本发明的精神、范围和理念之内。
VI.参考文献
将下列参考文献，以其为本文中所示的示例性程序或内容提供示例性程序或其它内容补充的程度明确地通过引用并入本文。
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Claims (50)

1.一种鉴定被自身抗体特异性识别的抗原替代物配体的方法，其包括(1)将与选自寻常天疱疮的自身免疫疾病相关的自身抗体暴露于配体文库；(2)检测至少一种结合至所述自身抗体的配体和(3)鉴定所述结合的配体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述配体是3聚体、4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9聚体或10聚体。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述配体结合至载体。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述载体是珠粒、芯片、滤纸、条状物、膜、聚合物基质或孔。
5.一种用抗原替代物治疗自身免疫疾病患者的方法，其中所述抗原替代物包含根据根据权利要求1所述的方法鉴定的配体。
6.一种抗原替代物，其具有下式：
Figure FDA0000373564170000011
其中R1-R5独立地选自氢；烷基；烯丙基；甲基；乙基；正丙基；异丙基；正丁基；异丁基；仲丁基；叔丁基；戊基；己基；异戊基；芳基；杂芳基；呋喃基；吲哚基；硫苯基；噻唑基；咪唑基；异噁唑基；噁唑基；胡椒基；吡唑基；吡咯基；吡嗪基；吡啶基；嘧啶基；嘧啶基；嘌呤基；噌啉基；苯并呋喃基；苯并噻吩基；苯并三唑基；苯并噁唑基；喹啉；异噁唑基；异喹啉环烷基；烯基；环烯基；苯基；吡啶基；甲氧基乙基；(R)-甲基苄基；C1-C6烷基；其每一个可独立地未被取代或被以下各项取代：卤素(Cl、F、Br、I)、-NH2、-OH、-OC1-C6烷基或-SH；未被取代或被NH2、OH或SH取代的C2-C6炔基，或其药学上可接受的盐。
7.根据权利要求6所述的抗原替代物，其具有下式：
Figure FDA0000373564170000021
或其药学上可接受的盐
8.一种诊断试剂盒，其包括式I的抗原替代物和任选地，具有下式的类肽：
式II
Figure FDA0000373564170000031
式III
Figure FDA0000373564170000032
其中n是0-8；L是接头；Y是毒素或抗体片段；Z是NH2、N(C1-C6烷基)2、OH或O(C1-C6烷基)；并且R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8(大于4的n的每一个值将下一个R基团按数字顺序添加至式I或式II)可以是氢；烷基；烯丙基；甲基；乙基；正丙基；异丙基；正丁基；异丁基；仲丁基；叔丁基；戊基；己基；异戊基；芳基；杂芳基；呋喃基；吲哚基；硫苯基；噻唑基；咪唑基；异噁唑基；噁唑基；胡椒基；吡唑基；吡咯基；吡嗪基；吡啶基；嘧啶基；嘧啶基；嘌呤基；噌啉基；苯并呋喃基；苯并噻吩基；苯并三唑基；苯并噁唑基；喹啉；异噁唑基；异喹啉环烷基；烯基；环烯基；苯基；吡啶基；甲氧基乙基；(R)-甲基苄基；未被取代或被NH2、OH或SH取代的C1-C6烷基；未被取代或被NH2；OH或SH取代的C2-C6炔基。
9.一种治疗自身免疫疾病患者的方法，其包括给所述自身免疫疾病施用抗原替代物和，任选的自身免疫疾病相关T细胞选择性配体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述抗原替代物选自下式化合物：
Figure FDA0000373564170000041
其中R1-R5独立地选自氢；烷基；烯丙基；甲基；乙基；正丙基；异丙基；正丁基；异丁基；仲丁基；叔丁基；戊基；己基；异戊基；芳基；杂芳基；呋喃基；吲哚基；硫苯基；噻唑基；咪唑基；异噁唑基；噁唑基；胡椒基；吡唑基；吡咯基；吡嗪基；吡啶基；嘧啶基；嘧啶基；嘌呤基；噌啉基；苯并呋喃基；苯并噻吩基；苯并三唑基；苯并噁唑基；喹啉；异噁唑基；异喹啉环烷基；烯基；环烯基；苯基；吡啶基；甲氧基乙基；(R)-甲基苄基；C1-C6烷基；其每一个可独立地未被取代或被以下各项取代：卤素(Cl、F、Br、I)、-NH2、-OH、-OC1-C6烷基或-SH；未被取代或被NH2、OH或SH取代的C2-C6炔基，或其药学上可接受的盐。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述化合物选自
Figure FDA0000373564170000051
或其药学上可接受的盐。
12.一种治疗自身免疫障碍患者的方法，其包括施用选自限制性寡聚体的抗原替代物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述自身免疫障碍选自寻常天疱疮。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述限制性寡聚体选自类肽或类肽样部分。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述自身免疫障碍选自寻常天疱疮。
16.一种药物组合物，其包含选自限制性寡聚体的抗原替代物和药学上可接受的赋形剂。
17.一种鉴定被自身免疫T细胞特异性识别的限制性配体的方法，其包括：
(e)提供来自健康受试者的第一T细胞群体，其中所述群体利用第一可检测标记物进行标记；
(f)提供来自怀疑患有或患有自身免疫疾病或障碍的受试者的第二T细胞群体，其中所述群体利用第二可检测标记物进行标记；
(g)使所述第一和第二T细胞群体与多种限制性配体或限制性配体与非限制性配体的组合接触；和
(h)评价所述第一和第二T细胞群体与所述限制性配体或对限制性配体和非限制性配体的组合的结合。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述自身免疫疾病或障碍是寻常天疱疮。
19.一种除去患有自身免疫疾病或障碍的受试者的自身免疫T细胞的方法，其包括：
(d)提供特异性结合自身免疫T细胞的限制性配体，其中所述限制性配体结合至载体；
(e)使来自所述受试者的含T细胞样品与所述载体结合的限制性配体接触足以允许自身免疫T细胞与所述载体结合的限制性配体结合的时间；和
(f)将所述载体与所述样品分离。
20.根据权利要求19所述的方法，其还包括将步骤(c)的所述样品回送至所述受试者。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述自身免疫疾病或障碍是寻常天疱疮。
22.一种用于治疗自身免疫疾病或病况的疫苗，其包含限制性寡聚体。
23.一种杀伤获自患有自身免疫疾病或障碍的受试者的自身免疫T细胞的方法，其包括：
(c)提供特异性结合自身免疫T细胞的限制性配体，其中所述配体缀合至毒素；
(d)使来自所述受试者的所述含T细胞样品与所述缀合物接触足以允许至少一种自身免疫T细胞与所述缀合物结合的时间，其中所述缀合物引起所述自身免疫T细胞的死亡。
24.根据权利要求23所述的方法，其中先体外后体内处理所述样品，并且所述方法进一步包括将样品回送至所述受试者。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述自身免疫疾病或障碍是寻常天疱疮。
26.一种杀伤获自或存在于患有自身免疫疾病或障碍的受试者体内的自身免疫T细胞的方法，其包括：
(c)提供特异性结合自身免疫T细胞的限制性配体，其中所述限制性配体缀合至含IgGFc的分子；和
(d)使自身免疫T细胞群体与所述缀合物接触足以允许至少一种自身免疫T细胞与所述缀合物结合的时间，其中所述缀合物将免疫效应物募集至所述自身免疫T细胞，从而导致其死亡。
27.根据权利要求26所述的方法，其中先体外后体内处理所述自身免疫T细胞群体，并且进一步包括将所述样品回送至所述受试者。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述自身免疫疾病或障碍是寻常天疱疮。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述限制性寡聚体是类肽或类肽样部分。
30.根据权利要求26所述的方法，其中所述含IgG Fc的分子是抗体、单链抗体或Fc片段。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述含IgG Fc的分子是抗体或单链抗体，并且所述限制性配体系连至所述抗体的抗原结合位点。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述含IgG Fc的分子是缺乏IgG可变区的Fc片段并且所述限制性配体系连至所述Fc片段的羧基末端。
33.一种鉴定被自身抗体特异性识别的抗原替代物配体的方法，其包括(1)将与自身免疫疾病相关的自身抗体暴露于限制性配体文库或具有限制性配体和非限制性配体的组合文库；(2)检测至少一种结合至所述自身抗体的配体和(3)鉴定所述结合的配体。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述限制性配体和任选的非限制性配体是3聚体、4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9聚体或10聚体。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述限制性配体和任选的非限制性配体结合至载体。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述载体是珠粒、芯片、滤纸、条状物、膜、聚合物基质或孔。
37.一种用抗原替代物治疗自身免疫疾病患者的方法，其中所述抗原替代物包含根据权利要求33所述的方法鉴定的配体。
38.一种治疗需要治疗的患者的特定自身免疫疾病或障碍的方法，其包括以下步骤：
(e)针对与特定自身免疫疾病或病况相关的特定自身抗体筛选配体文库以发现高亲和力配体；
(f)鉴定针对与所述特定自身免疫疾病或障碍相关的所述特定自身抗体的高亲和力配体；
(g)从所述文库分离所述高亲和力配体；和
(h)利用所述分离的高亲和力配体治疗所述患者。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述特定自身免疫疾病或障碍是寻常天疱疮。
40.一种药物组合物，其包含根据权利要求38鉴定的高亲和力配体。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述高亲和力配体是限制性寡聚体。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述限制性寡聚体选自类肽、类肽样部分或环状类肽。
43.一种鉴定针对与特定自身免疫疾病或障碍相关的自身抗体的高亲和力配体的方法，其包括以下步骤：(1)选择与特定自身免疫疾病或障碍相关的自身抗体和(2)筛选针对所述自身抗体的配体的文库和(3)鉴定选择性结合所述自身抗体的高亲和力配体。
44.一种诊断试剂盒，其包括根据权利要求43鉴定的高亲和力配体。
45.一种用联合疗法治疗具有特定自身免疫疾病或障碍的患者的方法，其包括给所述患者施用药学上有效量的(a)对与所述特定自身免疫疾病或障碍相关的自身抗体具有特异性的高亲和力配体和(b)药学上有效量的对与所述特定自身免疫疾病或障碍相关的T细胞具有特异性的配体。
46.根据权利要求45所述的方法，其中先体外后体内地进行(b)。
47.根据权利要求45所述的方法，其中先体外后体内地进行(a)。
48.根据权利要求45所述的方法，其中所述自身免疫疾病或障碍选自寻常天疱疮。
49.根据权利要求45所述的方法，其中步骤(a)中的所述高亲和力配体是限制性寡聚体。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述限制性寡聚体选自类肽样部分、类肽或环状类肽。
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