CN101282989A - 用于诊断风湿性疾病的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及与风湿病相关抗体反应的多肽。本发明还涉及包含这些多肽之一的诊断剂，包含所述诊断剂的诊断试剂盒，以及用于体外检测风湿性疾病的方法。此外，本发明还涉及包含这些多肽之一的药物，以及所述多肽在制备用于预防和/或治疗风湿性疾病的药物中的用途。
Description
本发明涉及与风湿病相关抗体反应的多肽。本发明还涉及包含这些多肽之一的诊断剂，包含所述诊断剂的诊断试剂盒，以及用于体外检测风湿性疾病的方法。此外，本发明还涉及包含这些多肽之一的药物，以及所述多肽在制备用于预防和/或治疗风湿性疾病的药物中的用途。
风湿性疾病，特别是关节和运动系统范围内的疼痛，属于在德国最常见的疾病。至今仍然未知这样的实验室测试，其使得能够将所述疼痛归类为无害的肌肉痉挛、关节病或最常见和最严重的疾病(类风湿性关节炎(RA))。
类风湿性关节炎是自身免疫疾病，其中人体的防御机制错误地将内源关节软骨当作外来的和敌对的并攻击所述软骨。在西欧国家大约100个人中有一个患有类风湿性关节炎。该疾病在头几个月进展特别迅速。
因此，现代风湿病学中的一个基本的关键策略是早期使用改变病程的生物药物。大量的临床研究已显示，使用合适的活性物质例如TNF拮抗剂可获得非常好的治疗效果和应答率，如果在早期就已经在患者中使用所述化合物。风湿病学家试图利用在疾病开始和出现结构性关节损伤之间的狭窄时间窗。然而，迄今在现有技术中未公开在所述时间窗内可靠且灵敏地检测类风湿性关节。
按照ACR(美国风湿病学会)的分类标准来诊断类风湿性关节炎。根据ACR的标准，类风湿因子目前是用于诊断类风湿性关节炎(RA)的基本血清学指标。类风湿因子是一小组免疫球蛋白，其特征在于对于免疫球蛋白G(IgG)的Fc-区的免疫交叉反应。
然而，类风湿因子的存在并不局限于风湿性形式群(Formenkreis)(鉴别诊断的依据)的疾病，类风湿因子也在患有传染病、高球蛋白血症、淋巴组织增生性B细胞疾病的患者的血清中发现，通常在老年群体中发现。
通常，升高的类风湿因子的浓度与更严重的病程相关。在此，所述浓度与活动度(
)和治疗效果不相关。基于类风湿因子的浓度不能对类风湿性关节炎发生作出灵敏且明确的预后。健康的人具有升高的类风湿因子浓度而不生病，与此相反，无类风湿因子的患者具有极具攻击性形式的类风湿性关节炎。
其他血清学标记例如抗瓜氨酸抗体(CCP)，或者用于评估日常生活能力的初始HAQ-得分，或者X射线或计算机体层摄影术(CT)图像在早期形式时只提供很少的信息，并且它们各自并不能有效力地足以能够评估患者的预后如何。
为了优化ACR的现有分类标准，美国风湿病学会提出7个表示不良预后的分类标准：
1.持续超过1个小时的关节晨僵，
2.3个或更多个关节的关节炎，
3.在相同的时间内至少3个关节区域的关节炎症，
4.手关节或指关节同样受到影响，
5.掌指关节的双侧压痛，
6.X光照片上的侵蚀，
7.特定类风湿因子的检测和抗核周因子阳性(APF)。
针对所谓的“抗核周因子”的自身抗体首次由Young等人在具有类风湿性关节炎的患者中进行了描述(Young，B.J.J.等人，Antikeratin antibodies in rheumatoid arthritis，B.M.J.，2(1979)，97-99)。由于它们对大鼠食道区段上的角质层的角质化上皮具有特异性反应，角蛋白长期以来被认为是相应的抗原(Vincent，C.H.等人；High diagnostic value in rheumatoid arthritis ofantibodies to the stratum corneum of rat Oesophagus epithelium，so-called″antikeratin antibodies″，Ann.Rheumat.Dis.48(1989)，712-722)。因此，所述抗体直到今天还称为抗角蛋白抗体(AKA)(Vincent，C.H.等人，Natural IgG to EpidermalCytokeratins vs IgG to the Stratum Corneum of the Rat OesophagusEpithelium，so-called″Antikeratin Antibodies″，in RheumatoidArthritis and other Rheumatic Diseases；J.of Autoimmunity 4(1991)，493-505；Paimela，L.等人，Antikeratin antibodies：diagnostic and prognostic markers for early rheumatoidArthritis，Ann.Rheuma t.Dis.，51(1992)743-746)。
此外，后来的研究证明，AKA或APF也被抗聚丝蛋白抗体识别。因此，将碱性蛋白质聚丝蛋白鉴定为靶抗原。40 kDa的蛋白聚集成细胞角蛋白微丝，并且帮助形成角质化细胞的细胞外纤维基质(Simon，M.等人，The Cytokeratin FilamentAggregating Protein Filaggrin isthe Target of the So-called″Antikeratin Antibodies″，Autoantibodies Specific for Rheumatoid Arthritis，J.Clin.Invest.，92(1993)，1387-93)。
因为包含APF、AKA和抗聚丝蛋白抗体的血清以相同的方式反应，因而这些抗体系统似乎是一致的。具有超过99％的特异性的IgG型抗聚丝蛋白抗体是类风湿性关节炎的高度特异性标记。原则上可在早期和在临床症状出现之前检测到所述抗体。在几个研究中，可以发现与疾病的严重度和活动度的正相关。抗聚丝蛋白抗体与年龄、性别或疾病持续时间无关。可在大约34％的类风湿因子阴性患者中检测到它们，并且它们在此是有价值的诊断辅助物。
然而，通过使用当前的常用方法，只在大约40％的病例中在血清中发现所述抗体。
因此本发明的目的是提供新型多肽以用于检测与风湿性疾病相关的抗体，特别是与类风湿性关节炎相关的抗体，其使得能够对风湿性疾病特别是关节和运动系统范围内的疼痛进行灵敏且特异性的诊断、分类和预后。
当分析抗体与天然波形蛋白的结合，即APF阳性或抗Sa反应性时(E.R.Vossenaar等人；Rheumatoid arthritis specific anti-Saantibodies targetcitrullinated vimentin；Arthritis Res.Ther.6(2)，(2004)，142-150)，我们现已发现，在现有技术中已知为非免疫反应性的天然波形蛋白(C.A.Hitchon等人；Immune features ofseronegative and seropositive arthritis in early synovitisstudies；Curr.Opin.Rheumatol.14(4)，(2002)，348-353)以突变的免疫反应性变体的形式存在。该发现是出人意料的，因为根据迄今的现有技术认为，为了具有免疫反应性，必须将波形蛋白瓜氨酸化。通过差异免疫亲和层析(differenzielle
)从人单核细胞富集具有突变的序列的免疫反应性波形蛋白变体，我们能够证明这种看法是错误的。天然波形蛋白的这些突变变体与天然波形蛋白的差异在于存在额外的精氨酸残基，和任选地，进一步的序列差异。它们与人RA相关抗体反应，并且令人吃惊地具有比现有技术中已知的瓜氨酸化的肽更高的特异性和灵敏度。
因此，本发明的目的是来源于具有SEQ ID No.1的天然波形蛋白的多肽，该多肽与天然序列的差异在于存在至少一个额外的精氨酸残基。
所述额外的精氨酸残基优选地通过置换天然人波形蛋白的其他氨基酸残基而插入该序列中。所述多肽优选在位置16、17、19、41、58、59、60、68、76、140、142、147、363、406或452中的至少一个位置上具有精氨酸残基。特别优选的位置是41、58、59、60和/或68。例如，所述多肽在至少1、2、3或4个位置上具有额外的精氨酸残基。
在另一个实施方案中，与天然序列相比，所述多肽此外还在位置3、20、33、36、37、94、165、361、399或426中的至少一个位置上，优选在位置33、36和/或37上具有额外的亮氨酸残基。例如，所述多肽在至少1、2、3或4个位置上具有额外的亮氨酸残基。
在另一个实施方案中，与天然序列相比，所述多肽在至少一个位置上，例如在位置21、41、43、50、54、62、64或89之一上，优选在位置41、43、50、54、62和/或64上具有额外的脯氨酸残基。例如，所述多肽在至少1、2、3或4个位置上具有脯氨酸残基。
在另一个实施方案中，与天然序列相比，所述多肽在至少一个位置上，例如在位置24、35或99之一上具有额外的苏氨酸残基。例如，所述多肽在至少1、2或3个位置上具有苏氨酸残基。
在另一个实施方案中，与天然序列相比，所述多肽在至少一个位置上，例如在位置25、39、42、49、55或67之一上具有额外的酪氨酸残基。例如，所述多肽在至少1、2、3或4个位置上具有酪氨酸残基。
在另一个实施方案中，在所述多肽中，存在至少一个以瓜氨酸残基形式的精氨酸残基，例如在位置4、12、23、28、36、45、50、64、71、100、320、364或378中的至少一个位置上。例如，所述多肽在至少1、2、3或4个所述位置上具有瓜氨酸残基。然而，另一方面，所述多肽也可以是不含瓜氨酸的多肽。
人波形蛋白的突变蛋白的优选实例具有含有SEQ ID No.2、3、4、5、6、7、8或9的序列。
本发明的另一个目的为任何上述多肽的片段，所述片段来源于具有SEQ ID No.1的天然波形蛋白，包含至少一个含有至少一个精氨酸残基的区域，并且展示出对于与类风湿性疾病相关的自身抗体的反应性。所述片段优选位于位置10-145的区域内。特别优选地，所述片段位于位置30-70的区域内。片段的优选实例是片段51-65(C2)。所述片段的长度优选为至少6个，特别优选至少8个氨基酸至120个，优选100个，特别优选50个氨基酸。
本发明的另一个目的为上述多肽或片段的肽衍生物。例如，所述肽衍生物可以是逆(Retro-)/反(Inverso-)多肽，即按照所述多肽的镜像由D-氨基酸制备的上述多肽的反转多肽(inversesPolypeptid)，具有“相反”序列的逆多肽(Retro-Polypeptid)，以及作为上述多肽的镜像并且还具有“相反”序列的逆-反多肽(Retro-Inverso-Polypeptid)。
肽衍生物的其他实例是侧链基团、氨基末端或/和羧基末端经修饰的多肽，例如在氨基上用例如羧酸或烷基修饰的多肽，或者在羧酸基团上用氨基或酯基团进行修饰的多肽。所述多肽和/或肽衍生物还可以作为环肽存在。
本发明的另一个目的为编码上述多肽的核酸。作为核酸可以考虑例如DNA和RNA，特别是cDNA。为了重组制备所述多肽，可以将所述核酸克隆入常用的真核或原核载体中并在合适的宿主细胞中进行表达。
本发明的另一个目的为包含一种或多种上述多肽或其片段的诊断剂。所述诊断剂可以以游离的或者与载体结合的形式包含所述多肽或所述片段。
下列事实是非常令人吃惊的，本发明的多肽经证明对于检出在具有风湿性疾病(特别是具有关节和运动系统的炎性疾病，特别优选具有类风湿性关节炎)的患者的体液中的抗体来说是高度特异性和高度灵敏的抗原。在本发明的范围内，优选的体液是血液、血清和血浆，特别优选的是血清。
本发明的诊断剂具有一系列优点。因为所述多肽包含多个抗体结合位点，因而可以有效地结合单体以及多聚体的抗体。突变的多肽的另一个优点是，其使得能够提供诊断剂，所述诊断剂可以以99％的特异性和85％的灵敏度来鉴定具有关节和运动系统的炎性和慢性疾病(特别是具有类风湿性关节炎)的患者。
迄今为止现有技术未公开任何具有相当的特异性或灵敏性的诊断剂，所述诊断剂使得能够使用不含瓜氨酸的蛋白或肽来检测风湿性疾病，特别是类风湿性关节炎(P.J.Utz，Death，autoantigenmodifications，and tolerance；Arthritis Res.，2，(2000)，101-114)。
本发明的另一个目的为用于检测风湿性疾病特别是类风湿性关节炎的诊断试剂盒，该试剂盒包含上述诊断剂。此外，该诊断试剂盒可包含常规组分，例如缓冲剂、溶剂和/或标记基团。
合适的载体是大分子例如DNA、RNA，医药学相容性聚合物例如聚乙烯、聚D，L-丙交酯、聚D，L-丙交酯-共聚-乙交酯，合成的生物聚合物例如聚赖氨酸和葡聚糖，以及蛋白质例如血清白蛋白和血蓝蛋白。优选地，在所谓的“水涂覆(Hydrocoating)-涂覆方法”中使用葡聚糖(Gregorius，K.，Mouritsen，S.和Elsner，H.I.，Hydrocoating：a new method for coupling biomolecules to solid phases，J.Immunol.Methods 12(1995)，65-73)。
本发明的另一个目的为用于体外检测风湿性疾病特别是类风湿性关节炎的方法，在所述方法中测定体液中自身抗体的浓度。所述方法允许进行疾病的诊断、分类和/或严重度的评价。上述诊断剂或上述诊断试剂盒用作检测试剂。
在本发明的方法中，作为检测方法可以使用诊断领域内常用的任何方法，例如
(a)酶学方法，
(b)基于发光的方法，或
(c)放射化学方法。
作为优选的检测方法，在本发明的方法中可以考虑放射免疫测定法、化学发光免疫测定法、免疫印迹测定法或酶免疫测定法例如ELISA。
在本发明方法的一个实施方案中，将待分析的体液作为样品加入至上述与载体结合的多肽。在所述样品进行温育后，洗去未结合的组分。通过具有标记基团的二抗来检测待检测的自身抗体与所述多肽的特异性结合。
本发明方法中的合适的二抗的例如为这样的抗体，其针对人抗体例如IgG、IgM、IgA或/和IgE，例如人IgG的Fc部分。
本发明方法中的合适的标记基团的例如为酶例如过氧化物酶或碱性磷酸酶，放射性标记，或发光标记基团例如吖啶鎓化合物。
备选地，也可以实施使用本发明多肽的竞争性抑制测试，在所述测试中在样品存在的情况下抑制经标记的类风湿性关节炎(RA)-自身抗体的结合，如果在所述样品中同样存在RA-自身抗体。
本发明的肽也可用作在风湿性疾病特别是类风湿性关节炎的治疗中用于预后或/和进程控制的试剂。此处优选的预后试剂是来自位置30至65或/和位置55至70的区域的肽。
本发明的另一个目的为提供药物，所述药物选择性地抑制或防止与风湿性疾病特别是炎症过程相关的自身免疫复合物的形成(特别优选地在发炎的关节中)，但不导致抗体产生的总体阻断。
根据本发明，通过使用包含上述多肽或片段并且适合于在人医学或兽医学中使用的药物而实现了该目的。所述药物可例如用于体液(例如血液或血浆)的体外处理，以为了使用与固相结合的抗体来捕获其中包含的自身抗体，并将经处理的体液再导入患者中。
本发明的实施例令人惊奇地显示，本发明的多肽是主要与病程相关的抗原，或者甚至是主要起始所述疾病的蛋白质。通过从患者的体液中选择性地除去抗体可以有益地影响病程。
此外，还可以直接以药物组合物的形式施用所述多肽或其片段，所述药物组合物可包含药学上相容的载体、溶剂和/或助剂。
可以以片剂、胶囊剂、溶液、混悬剂、气雾剂、喷雾剂(鼻腔喷雾剂或咽喉喷雾剂)、凝胶、硬膏剂等形式施用所述药物组合物。
可根据任何已知的方法来施用药物，其中特别优选口服给药和静脉内给药。
剂量可根据疾病的类型和严重度而变化，通常在1至200mg/天，优选在10至200mg/天的范围内。
此外，RA患者还可用上述多肽的经鉴定的短的、合成的蛋白质表位(尤其是C2-表位)进行治疗，所述蛋白质表位来源于天然波形蛋白的氨基酸序列。
RA患者的B细胞表位的分析产生了令人惊奇的发现：91％的所有患者与本发明多肽的短的、合成的线性肽表位(C2-表位)相互作用。
此外，通过小鼠实验发现，在这样的治疗后，小鼠产生了成功地抑制抗原特异性免疫细胞的分裂的免疫细胞。
按照只依靠疾病活动度得分(Disease activity score)(DAS)这种费力且费时的方法的目前常用诊断方法，可以控制风湿性疾病特别是类风湿性关节炎的治疗的过程和效果。在这种方法中，计算肿胀关节的数目、疼痛关节的数目、炎症参数(BSR或CRP)，并且根据视觉模拟评分法(visuellen Analog-Skala)记录患者的状态。
按照公式将所述4个单独的组成部分加起来。所得的数值提供了相对可靠和客观的关于在患者中疾病的实际活动度和治疗质量的信息。
本发明的多肽现在使得能够控制风湿性疾病特别是类风湿性关节炎的治疗的过程和效果。
例如，在与处于位置30至65处的多肽交叉反应的患者中观察到快速且有效的治疗，所述治疗部分地在2年后以完全治愈的形式获得阳性结果。
通过基于本发明多肽的ELISA(平均＜300 U/ml)可以鉴定具有低疾病活动度(平均DAS得分为2.8)的患者。与使用柳氮磺吡啶或可的松的治疗的效果(在治疗后DAS得分低于1.5)相关，抗体滴度在1-2年的过程中平均减少至起始值的1/6。
患有严重类风湿性关节炎(平均DAS得分为4.9)的患者平均具有＞1000 U/ml的抗体滴度。由于DAS得分通过使用英夫利昔单抗(Remicade)和/或甲氨蝶呤进行治疗没有显著改变，在50％的患者中针对本发明多肽的抗体的量减少了大约30-50％。与改变的抗体滴度相平行地，患者在既往病历记录中报告了明显更正面的关于主观疾病状况的总体评价，即本发明的诊断剂也适合用于严重的类风湿性关节炎的治疗的质量控制。
一个显著的优点是，第一次可能在数分钟内定性和定量地提供关于类风湿性关节炎的类型、进程和治疗的可靠信息。
该惊人的发现导致这样的认识，即可治疗性地使用本发明的多肽，因为，通过它们的使用令人吃惊地可以预期减少以前不希望的药物作用，而同时保持药物的功效。
特别地，本发明的多肽令人吃惊地使得能够提供用于治疗风湿性疾病特别是炎症的新型的以前未知的作用原理。本发明多肽的作用谱与炎症的迄今已知的抑制剂的作用谱不同，因为选择性地只有抗体依赖性介体(Mediator)可以以数目减少的方式来产生。本发明多肽的另一个优点是，副作用谱可能显著小于现有技术中已知的药物的副作用谱，因为未曾观察到与健康血液供体的抗体的交叉反应。
因而，上述的本发明诊断剂和治疗剂可用于诊断、预防或治疗基于波形蛋白依赖性过程的任何症状。
本发明的另一个目的为牙周炎病原体福赛斯拟杆菌(Bacteroidesforsythus)和中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)的假定的蛋白质BF0786和BF0713，已发现所述蛋白质是风湿性疾病特别是关节和运动系统的慢性炎性疾病的抑制剂。
因此，这些蛋白质和其片段适合用于制备用于检测、预防和/或治疗风湿性疾病特别是关节和运动系统中的疼痛的诊断剂、诊断试剂盒或药物。关于诊断和药物应用，参考上面关于波形蛋白类似物的详述。
蛋白质BF0786和其序列已由Kuwahara，T.等人描述(Kuwahara，T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 101(41)，14919-14924(2004))。蛋白质BF0713和其序列已由Cerdeno-Tarraga，A.M.等人描述(Cerdeno-Tarraga，A.M.等人，Science 307(5714)，1463-1465(2005))。迄今未曾公开在诊断和治疗领域内的医学应用。
本发明的另一个目的为发现选择性地阻断形成由风湿病相关自身抗体与自身抗原特别是波形蛋白组成的自身免疫复合物的物质，即所述物质只阻止参与发病机理的抗体的反应，但通常不影响抗体产生和抗体反应，从而使得能够灵敏且特异性地治疗或预防在关节和运动系统范围内的风湿病相关性疼痛疾病。
现已发现，绿茶的成分可实现该目的。Tariq，M.等人，″Prevention of collagen-induced arthritis in mice by apolyphenolic fraction from green tea″，Proc.Natl.Acad.Sei.USA，第96卷，第4524-4529页，(1999)公开了绿茶的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)这种成分。所述成分结合波形蛋白并阻断磷酸化(S.Ermakova等人，The intermediate filament protein vimentinis a new target for epigallocatechin gallate；J.Biol.Chem.280(17)，(2005)，16882-16890)。使用表没食子儿茶素没食子酸酯可以显示，可以以浓度依赖性的方式阻断抗体对突变的波形蛋白的自身免疫复合物的形成。
在竞争实验中可以证明，非结合性物质表儿茶素(EC)阻断抗体结合只达10％的最大值。使用表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)可以显示，在10-100μg/ml的浓度下阻断最大45％的抗体结合。
然而，如果用合适的有机或有机-水溶剂或溶剂混合物例如二甲亚砜(DMSO)、乙醇和水的混合物来提取绿茶，那么使用少量的所述提取物令人吃惊地获得对自身免疫复合物形成的几乎完全的阻断。此外，也可以使用例如通过干燥、冻干、分级分离等从此类提取物中获得的产物。所述提取物的作用与现有技术相反，因为对于已知的单种绿茶物质和对于天然物质混合物，迄今都没有公开过对抗体反应的特异性阻断。本发明的提取物不能显著改变在患有其他自身免疫疾病的患者的血清中的抗体复合物形成。
可以认为这些结果是极其令人吃惊的，因为迄今在现有技术中未公开对突变的波形蛋白的独立的结合。此外，在现有技术中未公开绿茶的成分与抗体的相互作用。
此外，迄今对于EGCG已知，其a)具有抗氧化作用，b)捕获致癌物质的反应性中间物，c)抑制激活致癌物的酶，和d)抑制亚硝化作用和细胞增殖(特别是肿瘤细胞的)。
最后，本发明的另一个目的为上述肽、上述肽片段、上述逆-反多肽或环肽用于发现针对抗体驱动的炎症反应的阻断性天然物质和/或化学物质的用途。
此外，基于本发明的肽，可以开发出生物测定法，使用所述生物测定法可就消炎物质的存在来分析天然物质文库、组合文库和化学文库。通过使用疾病相关抗体，可以从上述混合物中鉴定和纯化出通过阻断所述抗体来直接或间接阻断本发明抗原的物质。对于这些物质，在动物实验中观察到延迟类风湿关节炎的治疗和在更高剂量下的完全治愈。
此外，将通过下列附图和实施例进一步阐明本发明。
图表说明
图1：使用突变的波形蛋白(●)来检测RA-自身抗体的诊断特异性与使用瓜氨酸化的肽(CCP)(▲)的诊断特异性的比较。
图2：分离的CD4-阳性T细胞在肽免疫治疗后抑制CD4-阴性细胞的增殖应答。
图3：来自绿茶的提取物、突变的波形蛋白和其组合对于来自RA血清的抗体的反应的抑制。
图4：来自绿茶的提取物在阻断来自RA患者的自身抗体中的选择性。
图5：关节炎动物模型的概括性描述。
图6-8：来自绿茶的提取物在体内的功效
实施例
实施例1：鉴定作为RA相关抗原的人波形蛋白的突变变体
从U937细胞(人单核细胞系)中制备细胞提取物。通过使用商购的抗瓜氨酸抗体进行预吸收来除去瓜氨酸化的蛋白质。随后进行使用鸡抗波形蛋白抗体的亲和层析，从而提供了可以从中分离出波形蛋白变体的洗脱物，所述波形蛋白变体与具有RA的患者的抗体交叉反应。通过反相层析、蛋白酶消化和氨基酸测序进一步表征获得的波形蛋白变体。作为其结果，可以鉴定出下面描述的具有氨基酸序列SEQ ID No.2-9的多肽。
实施例2：使用突变的波形蛋白作为检测抗原来检测RA相关自身抗体
在大肠杆菌(E.coli)中表达来自实施例1的天然波形蛋白的重组突变变体(SEQ ID No.9)，然后通过亲和层析使用His-标签进行纯化。用展开缓冲液(Entfaltungspuffer)(50mM Tris、2M盐酸胍、5mM CaCl2、2mM DTT、0.5mM EDTA、5mM氯化甲胺，pH 7.4)预处理2mg/ml纯化的蛋白质的溶液，在4℃下进行至少14小时，然后在PBS中以1∶1000进行稀释。将100μl该溶液在4℃下导入微量滴定板(厂商：COSTAR)的孔中过夜。通过3次洗涤(175μl，缓冲液PBS/0.05％Tween)除去未结合的多肽。通过用150μl在PBS中的3％牛血清白蛋白(BSA)溶液温育孔来封闭可能非特异性的交叉反应。将封闭的、倒空的板在37℃下干燥30分钟，然后在干燥条件下于4℃下保存。
根据间接酶免疫测定法的原理，将如此制备的微量滴定板用于定量检测针对突变的波形蛋白的自身抗体。作为比较，进行针对CCP(瓜氨酸化的肽)的自身抗体的检测。为此，将健康的受试者和/或具有不同疾病的患者的血清样品用1％BSA/PBS以1∶100进行稀释，然后在孔中温育30分钟。通过用PBS/0.05％Tween重复洗涤以除去未结合的血清抗体。然后，温育酶标记的检测抗体(特别是缀合有过氧化物酶的抗人IgG抗体，以1∶10000稀释)15分钟。
在洗去过量的检测抗体后，加入100μl底物溶液(溶解在10ml0.05M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中的TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)片剂，并在即将使用前加入8ml过氧化氢)并保持15分钟。加入100μl 1M HCl来终止反应，反应产物染成了黄色。在450nm处通过光度法测定黄色染色的强度，其中吸光度与所寻找的自身抗体浓度成正比。
在此获得下列测量结果：
| 血清编号 | 诊断 | 突变的波形蛋白在450nm处的OD | CCP[U/ml] |
| 1 | 正常血清 | 0.127 | |
| 2 | 血液供体 | 0.089 | 6.5 |
| 3 | 肝炎 | 0.107 | 12.5 |
| 4 | 疏螺旋体关节炎(Borrelien-Arthritis) | 0.167 | 17.7 |
| 5 | 类风湿性关节炎 | 0.784 | 4.6 |
| 6 | 类风湿性关节炎 | 0.984 | 361.4 |
| 7 | 类风湿性关节炎 | 2.456 | 1156.5 |
| 8 | 类风湿性关节炎 | 1.709 | 8.6 |
| 9 | 类风湿性关节炎 | 1.342 | 1453.1 |
当在Tecan“SPECTRA”光度计中测量时，被诊断为“类风湿性关节炎”的所有患者血清显示出与正常血清和患有其他疾病的患者的血清相比而言显著提高的吸收值。
实施例3：基于天然波形蛋白的突变变体的诊断剂的开发
为了开发基于突变的波形蛋白的诊断剂，克隆了天然波形蛋白的不同的突变多肽变体(参见实施例1)，并在大肠杆菌中表达。为了鉴定对于检测在RA中的自身抗体具有最高灵敏度的多肽变体，使用按照ACR标准定义的类风湿性关节炎(RA)患者(大约100位)集体的血清。为此，类似于实施例2，将表达并纯化的蛋白质包被在微量滴定板中，并在常规的ELISA测定法中分析在RA患者中自身抗体的交叉反应。
为了获得最大可能的灵敏度，将在第一轮筛选过程中获得的突变序列组合在进一步的反应混合物中。对于研究所发现的作为RA诊断剂的突变多肽变体的特异性，使用34位具有其他自身免疫疾病(尤其是，SLE、舍格伦综合征、IDDM)的患者的血清和53位健康的人的血清。类似于实施例2，将最终获得的突变多肽变体包被在微量滴定板中。
通过使用实施例2的突变变体，令人惊奇地可以在分析RA患者和具有其他自身免疫疾病的患者的自身抗体中获得比在现有技术中对于瓜氨酸化的肽(CCP)所已知的特异性和灵敏度更高的特异性(＞98％)和灵敏度(图1)。
实施例4：确定突变的波形蛋白中的自身表位(Autoepitope)
就它们结合突变波形蛋白的重叠的、生物素化的、合成的17聚体肽的能力，在ELISA中测试抗波形蛋白抗体(参见实施例2)。此处的主要问题是，具有RA的患者的抗体是否针对相同的B细胞表位。
令人惊奇地，在102位具有RA和不同抗波形蛋白抗体滴度的患者群组中，91％的血清与来自波形蛋白的氨基末端区域的线性肽序列反应。没有观察到对羧基末端区域或者在中央的α-螺旋型的杆状结构域的交叉反应。健康的受试者和具有其他自身免疫疾病(尤其是，舍格伦综合征、全身性红斑狼疮或脉管炎)的患者的血清没有显示出对波形蛋白肽序列的反应。
在氨基酸30至70的区域中，特别是在氨基酸50至65的区域中，发现特别高的反应性。
实施例5：对RA患者进行预后
RA以非常不同的方式发展，并且对于治疗方案的决定不是最终的，而是必须连续地控制并在需要时进行调整。因此，就对于本发明多肽的反应来分析21位接受RA的药物疗法的患者。在追踪观察分析(在1至2年内，每位患者进行至少7次)中，在ELISA中表征对于突变波形蛋白的重叠的、生物素化的、合成的肽的交叉反应(参见实施例4)。在此可以确定，例如在与波形蛋白序列的位置30至65中的肽发生交叉反应的RA患者的情况下，观察到快速且有效的治疗，其部分地导致阳性结果(在2年后完全治愈)。相反地，在与位置55至70中的肽发生交叉反应的RA患者的情况下，在任何所研究的情形中不能在患者档案中记录治疗成功。健康患者对任何所分析的肽都未显示出交叉反应。
基于这些数据，本发明的多肽可用作诊断剂，以控制类风湿疾病特别是类风湿性关节炎的治疗的过程和结果。也就是说，使用本发明的肽的定量ELISA可将患者在开始进行治疗时就分成药物“应答者”和“非应答者”。
实施例6：肽的治疗功效
特定的信使物质负责关节粘膜、软骨和骨中的炎症过程。最熟知的代表是肿瘤坏死因子(TNF)。多年来，对于慢性多关节炎存在转基因小鼠模型，其从一开始就极大地支持抗TNF疗法。这些小鼠过表达人TNF，并且足以导致小鼠形成严重的、慢性的、破坏性的多关节炎。
在该背景下，只用生理盐水处理所述转基因小鼠或用1μg突变波形蛋白的肽(50至65)的溶液注射所述转基因小鼠(类似于PugaYung等人，Epitope-specific immunotherapy induces immunedeviation of proinflammatory Tcells in rheumatoid arthritis，PNAS 2004 101：4228-4233；和Zwerina等人，Single and combinedinhibition of tumor necrosis factor，interleukin-1，and RANKLpathways in tumor necrosis factor-induced arthritis：effectson synovial inflammation，bone erosion，and cartilagedestruction.Arthritis Rheum.2004 Jan；50(1)：277-90)。然后，测量关节的肿胀，并在精细组织水平上检查关节粘膜以及对骨和软骨的损害。通过注射波形蛋白肽，关节肿胀被抑制达41％，和关节粘膜的炎症被抑制达38％，生理盐水没有显示任何作用。然而，当组合突变波形蛋白的多种肽时，可以几乎完全控制所述炎症。
调节性T淋巴细胞被认为是很有希望的外周耐受的介导者。因此，在这些所研究的动物中，进一步调查有限的同种异体免疫应答是否以抗原特异性方式诱导调节细胞的形成。在此发现，所述小鼠在这样的处理后产生免疫细胞，所述免疫细胞成功地抑制抗原特异性免疫细胞的分裂，其中涉及具有CD4+CD45RCneg表型的肝内T细胞(图2)。
实施例7：在体外阻断自身抗体复合物的形成
为了阻断抗体与突变的波形蛋白的结合，以1μg/ml的终浓度单独地或组合地使用下列物质：
1.表儿茶素(EC)
2.表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)
3.来自绿茶的DMSO提取物
4.突变的波形蛋白1.4mg/ml
5.突变的波形蛋白0.7mg/ml
6.瓜氨酸化的波形蛋白1.5mg/ml。
为了制备来自绿茶的提取物，用10ml 80％DMSO覆盖5g任何可商购获得的茶并搅拌过夜。以13000rpm离心溶液10分钟，并将其定义为茶提取物。与上面的固体物质1、2和4至6相反，使用10μl/ml该制备的茶提取物。在ELISA中分析在物质存在和不存在的情况下的抗体结合，为此类似于实施例2来准备微量滴定板。以1∶100至1∶400的稀释度使用RA患者的不同的血清。通过将100μl稀释的血清与指定的物质或茶溶液预温育10分钟来诱导抗体结合的阻断。然后，通过将100μl血清-物质混合物转移至给定微量滴定板的孔中来分析剩下的交叉反应。根据常规的ELISA实施方案，借助于缀合有HRP的抗人IgG来检测结合的抗体。在图3中，举例描述了使用患者血清号400725而获得的结果。
在图4显示了来自绿茶的提取物对于来自RA患者的自身抗体(针对突变波形蛋白的抗体)的抑制的特异性。
实施例8：在体内阻断自身抗体复合物的形成
在口服摄入的情况下绿茶的儿茶素的口部吸收是非常低的，从而当正常饮茶时可能只获得最小的血清浓度(Zhu等人，Oralabsorption and bioavailability of tea catechins.Planta Medica66(2000)444-7；还参见Schrader等人，Bioverfügbarkeitverschiedener Tee-Catechine im Plasma in von derDarreichungsform.Proc.Germ.Nutr.Soc.3(2001)36)。
因此，将我们制备的茶提取物(参见实施例7)冷冻干燥，并用可可油或鲑鱼油重构。在给大鼠口服施用从5g绿茶制备的提取物(5g/kg体重)后，每半小时采集血液并采用HPLC和GC/MC进行分析。在大鼠中，于摄入后大约2小时，可以测量到75μg/ml EC和EGCG(提取物质量的5-13％)以及大约245μg/ml EGCG(至提取物中50％的含量)的最大血浆浓度。在为期1个月的研究期内，在这些动物实验中未出现毒性作用。
若将这些结果转移至人，那么能够得出，使用该剂型获得这样的茶成分(尤其是儿茶素)的血浆浓度，该浓度可以使自身抗体复合物的形成能够被完全阻断。
实施例9：绿茶提取物的体外功效
分别以每kg体重10和100mg的浓度腹膜外施用绿茶提取物在关节炎动物模型(图5：测定在施用佐剂后的爪肿胀)中显示出显著的阳性效果。图6至8显示了结果。
序列表
<110>Orgentec Diagnostika GmbH
<120>用于诊断风湿性疾病的方法
<130>34478PWO
<160>9
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>466
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>肽
<222>(1)..(466)
<223>天然波形蛋白的肽序列
<400>1
Met Ser Thr Arg Ser Val Ser Ser Ser Ser Tyr Arg Arg Met Phe Gly
1 5 10 15
Gly Pro Gly Thr Ala Ser Arg Pro Ser Ser Ser Arg Ser Tyr Val Thr
20 25 30
Thr Ser Thr Arg Thr Tyr Ser Leu Gly Ser Ala Leu Arg Pro Ser Thr
35 40 45
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50 55 60
Ser Ser Ala Val Arg Leu Arg Ser Ser Val Pro Gly Val Arg Leu Leu
65 70 75 80
Gln Asp Ser Val Asp Phe Ser Leu Ala Asp Ala Ile Asn Thr Glu Phe
85 90 95
Lys Asn Thr Arg Thr Asn Glu Lys Val Glu Leu Gln Glu Leu Asn Asp
100 105 110
Arg Phe Ala Asn Tyr Ile Asp Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn
115 120 125
Lys Ile Leu Leu Ala Glu Leu Glu Gln Leu Lys Gly Gln Gly Lys Ser
130 135 140
Arg Leu Gly Asp Leu Tyr Glu Glu Glu Met Arg Glu Leu Arg Arg Gln
145 150 155 160
Val Asp Gln Leu Thr Asn Asp Lys Ala Arg Val Glu Val Glu Arg Asp
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Asn Leu Ala Glu Asp Ile Met Arg Leu Arg Glu Lys Leu Gln Glu Glu
180 185 190
Met Leu Gln Arg Glu Glu Ala Glu Asn Thr Leu Gln Ser Phe Arg Gln
195 200 205
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Glu Ile Gln Glu Leu Gln Ala Gln Ile Gln Glu Gln His Val Gln Ile
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275 280 285
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Asn Asn Asp Ala Leu Arg Gln Ala Lys Gln Glu Ser Thr Glu Tyr Arg
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325 330 335
Asn Glu Ser Leu Glu Arg Gln Met Arg Glu Met Glu Glu Asn Phe Ala
340 345 350
Val Glu Ala Ala Asn Tyr Gln Asp Thr Ile Gly Arg Leu Gln Asp Glu
355 360 365
Ile Gln Asn Met Lys Glu Glu Met Ala Arg His Leu Arg Glu Tyr Gln
370 375 380
Asp Leu Leu Asn Val Lys Met Ala Leu Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr
385 390 395 400
Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Ser Arg Ile Ser Leu Pro Leu Pro
405 410 415
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Leu Val Asp Thr His Ser Lys Arg Thr Leu Leu Ile Lys Thr Val Glu
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Thr Arg Asp Gly Gln Val Ile Asn Glu Thr Ser Gln His His Asp Asp
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Leu Glu
465
<210>2
<211>466
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>肽
<222>(1)..(466)
<223>突变体I的肽序列
<400>2
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Arg Pro Arg Thr Ala Ser Arg Pro Ser Ser Ser Arg Ser Tyr Val Thr
20 25 30
Thr Ser Thr Arg Thr Tyr Ser Leu Arg Ser Ala Leu Arg Pro Ser Thr
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Ser Arg Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Pro Arg Arg Val Tyr Ala Thr Arg
50 55 60
Ser Ser Ala Val Arg Leu Arg Ser Ser Val Pro Arg Val Arg Leu Leu
65 70 75 80
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85 90 95
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Leu Glu
465
<210>3
<211>466
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>肽
<222>(1)..(466)
<223>突变体II的肽序列
<400>3
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Asn Leu Ala Glu Asp Ile Met Arg Leu Arg Glu Lys Leu Gln Glu Glu
180 185 190
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Leu Glu
465
<210>4
<211>466
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>肽
<222>(1)..(466)
<223>突变体III的肽序列
<400>4
Met Ser Thr Arg Ser Val Ser Ser Ser Ser Tyr Arg Gly Met Phe Gly
1 5 10 15
Arg Pro Gly Thr Ala Ser Gly Pro Ser Ser Ser Arg Ser Tyr Val Thr
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260 265 270
Arg Gln Gln Tyr Glu Ser Val Ala Ala Lys Asn Leu Gln Glu Ala Glu
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Leu Glu
465
<210>5
<211>466
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>肽
<222>(1)..(466)
<223>突变体IV的肽序列
<400>5
Met Ser Thr Arg Ser Val Ser Ser Ser Ser Tyr Arg Gly Met Phe Gly
1 5 10 15
Arg Pro Gly Thr Ala Ser Arg Pro Ser Ser Ser Arg Ser Tyr Val Thr
20 25 30
Thr Ser Thr Arg Thr Tyr Ser Leu Pro Ser Ala Leu Gly Pro Ser Thr
35 40 45
Ser Pro Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Pro Gly Gly Arg Tyr Ala Thr Pro
50 55 60
Ser Ser Tyr Arg Gly Leu Arg Ser Ser Val Pro Arg Val Gly Leu Leu
65 70 75 80
Gln Asp Ser Val Asp Phe Ser Leu Ala Asp Ala Ile Asn Thr Glu Phe
85 90 95
Lys Asn Thr Arg Thr Asn Glu Lys Val Glu Leu Gln Glu Leu Asn Asp
100 105 110
Arg Phe Ala Asn Tyr Ile Asp Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn
115 120 125
Lys Ile Leu Leu Ala Glu Leu Glu Gln Leu Lys Gly Gln Gly Lys Ser
130 135 140
Arg Leu Gly Asp Leu Tyr Glu Glu Glu Met Arg Glu Leu Arg Arg Gln
145 150 155 160
Val Asp Gln Leu Thr Asn Asp Lys Ala Arg Val Glu Val Glu Arg Asp
165 170 175
Asn Leu Ala Glu Asp Ile Met Arg Leu Arg Glu Lys Leu Gln Glu Glu
180 185 190
Met Leu Gln Arg Glu Glu Ala Glu Asn Thr Leu Gln Ser Phe Arg Gln
195 200 205
Asp Val Asp Asn Ala Ser Leu Ala Arg Leu Asp Leu Glu Arg Lys Val
210 215 220
Glu Ser Leu Gln Glu Glu Ile Ala Phe Leu Lys Lys Leu His Glu Glu
225 230 235 240
Glu Ile Gln Glu Leu Gln Ala Gln Ile Gln Glu Gln His Val Gln Ile
245 250 255
Asp Val Asp Val Ser Lys Pro Asp Leu Thr Ala Ala Leu Arg Asp Val
260 265 270
Arg Gln Gln Tyr Glu Ser Val Ala Ala Lys Asn Leu Gln Glu Ala Glu
275 280 285
Glu Trp Tyr Lys Ser Lys Phe Ala Asp Leu Ser Glu Ala Ala Asn Arg
290 295 300
Asn Asn Asp Ala Leu Arg Gln Ala Lys Gln Glu Ser Thr Glu Tyr Arg
305 310 315 320
Arg Gln Val Gln Ser Leu Thr Cys Glu Val Asp Ala Leu Lys Gly Thr
325 330 335
Asn Glu Ser Leu Glu Arg Gln Met Arg Glu Met Glu Glu Asn Phe Ala
340 345 350
Val Glu Ala Ala Asn Tyr Gln Asp Thr Ile Gly Arg Leu Gln Asp Glu
355 360 365
Ile Gln Asn Met Lys Glu Glu Met Ala Arg His Leu Arg Glu Tyr Gln
370 375 380
Asp Leu Leu Asn Val Lys Met Ala Leu Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr
385 390 395 400
Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Ser Arg Ile Ser Leu Pro Leu Pro
405 410 415
Asn Phe Ser Ser Leu Asn Leu Arg Glu Thr Asn Leu Asp Ser Leu Pro
420 425 430
Leu Val Asp Thr His Ser Lys Arg Thr Leu Leu Ile Lys Thr Val Glu
435 440 445
Thr Arg Asp Gly Gln Val Ile Asn Glu Thr Ser Gln His His Asp Asp
450 455 460
Leu Glu
465
<210>6
<211>466
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>肽
<222>(1)..(466)
<223>突变体V的肽序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(466)
<223>Xaa＝瓜氨酸
<400>6
Met Ser Thr Arg Ser Val Ser Ser Ser Ser Tyr Arg Arg Met Phe Arg
1 5 10 15
Arg Pro Arg Thr Pro Ser Arg Pro Ser Ser Ser Arg Ser Tyr Val Thr
20 25 30
Thr Ser Thr Arg Thr Tyr Ser Leu Arg Ser Pro Leu Arg Pro Ser Thr
35 40 45
Ser Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ser Pro Thr Arg Arg Tyr Pro Thr Xaa
50 55 60
Ser Ser Ala Val Arg Leu Arg Ser Ser Val Pro Arg Val Arg Leu Leu
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Arg Phe Ala Asn Tyr Ile Asp Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn
115 120 125
Lys Ile Leu Leu Ala Glu Leu Glu Gln Leu Lys Arg Gln Arg Lys Ser
130 135 140
Arg Leu Arg Asp Leu Tyr Glu Glu Glu Met Arg Glu Leu Arg Arg Gln
145 150 155 160
Val Asp Gln Leu Thr Asn Asp Lys Ala Arg Val Glu Val Glu Arg Asp
165 170 175
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180 185 190
Met Leu Gln Arg Glu Glu Ala Glu Asn Thr Leu Gln Ser Phe Arg Gln
195 200 205
Asp Val Asp Asn Ala Ser Leu Ala Arg Leu Asp Leu Glu Arg Lys Val
210 215 220
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225 230 235 240
Glu Ile Gln Glu Leu Gln Ala Gln Ile Gln Glu Gln His Val Gln Ile
245 250 255
Asp Val Asp Val Ser Lys Pro Asp Leu Thr Ala Ala Leu Arg Asp Val
260 265 270
Arg Gln Gln Tyr Glu Ser Val Ala Ala Lys Asn Leu Gln Glu Ala Glu
275 280 285
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290 295 300
Asn Asn Asp Ala Leu Arg Gln Ala Lys Gln Glu Ser Thr Glu Tyr Arg
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Leu Glu
465
<210>7
<211>466
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>肽
<222>(1)..(466)
<223>突变体VI的肽序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(466)
<223>Xaa＝瓜氨酸
<400>7
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
Glu Ile Gln Glu Leu Gln Ala Gln Ile Gln Glu Gln His Val Gln Ile
245 250 255
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275 280 285
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290 295 300
Asn Asn Asp Ala Leu Arg Gln Ala Lys Gln Glu Ser Thr Glu Tyr Xaa
305 310 315 320
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325 330 335
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355 360 365
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385 390 395 400
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Leu Glu
465
<210>8
<211>466
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>肽
<222>(1)..(466)
<223>突变体VII的肽序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(466)
<223>Xaa＝瓜氨酸
<400>8
Met Ser Thr Arg Ser Val Ser Ser Ser Ser Tyr Arg Arg Met Phe Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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165 170 175
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195 200 205
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225 230 235 240
Glu Ile Gln Glu Leu Gln Ala Gln Ile Gln Glu Gln His Val Gln Ile
245 250 255
Asp Val Asp Val Ser Lys Pro Asp Leu Thr Ala Ala Leu Arg Asp Val
260 265 270
Arg Gln Gln Tyr Glu Ser Val Ala Ala Lys Asn Leu Gln Glu Ala Glu
275 280 285
Glu Trp Tyr Lys Ser Lys Phe Ala Asp Leu Ser Glu Ala Ala Asn Arg
290 295 300
Asn Asn Asp Ala Leu Arg Gln Ala Lys Gln Glu Ser Thr Glu Tyr Arg
305 310 315 320
Arg Gln Val Gln Ser Leu Thr Cys Glu Val Asp Ala Leu Lys Gly Thr
325 330 335
Asn Glu Ser Leu Glu Arg Gln Met Arg Glu Met Glu Glu Asn Phe Ala
340 345 350
Val Glu Ala Ala Asn Tyr Gln Asp Thr Ile Gly Arg Leu Gln Asp Glu
355 360 365
Ile Gln Asn Met Lys Glu Glu Met Ala Arg His Leu Arg Glu Tyr Gln
370 375 380
Asp Leu Leu Asn Val Lys Met Ala Leu Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr
385 390 395 400
Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Ser Arg Ile Ser Leu Pro Leu Pro
405 410 415
Asn Phe Ser Ser Leu Asn Leu Arg Glu Thr Asn Leu Asp Ser Leu Pro
420 425 430
Leu Val Asp Thr His Ser Lys Arg Thr Leu Leu Ile Lys Thr Val Glu
435 440 445
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450 455 460
Leu Glu
465
<210>9
<211>466
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>肽
<222>(1)..(466)
<223>突变体VIII的肽序列
<400>9
Met Ser Thr Arg Ser Val Ser Ser Ser Ser Tyr Arg Arg Met Phe Arg
1 5 10 15
Gly Thr Gly Thr Ala Ser Arg Thr Ser Ser Ser Arg Ser Tyr Val Thr
20 25 30
Thr Ser Thr Arg Thr Tyr Ser Leu Arg Ser Ala Leu Arg Thr Ser Thr
35 40 45
Ser Arg Ser Leu Tyr Tyr Ser Ser Pro Gly Arg Val Tyr Ala Thr Arg
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Lys Ile Leu Leu Ala Glu Leu GIu Gln Leu Lys Gly Gln Gly Lys Ser
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Asp Val Asp Asn Ala Ser Leu Ala Arg Leu Asp Leu Glu Arg Lys Val
210 215 220
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225 230 235 240
Glu Ile Gln Glu Leu Gln Ala Gln Ile Gln Glu Gln His Val Gln Ile
245 250 255
Asp Val Asp Val Ser Lys Pro Asp Leu Thr Ala Ala Leu Arg Asp Val
260 265 270
Arg Gln Gln Tyr Glu Ser Val Ala Ala Lys Asn Leu Gln Glu Ala Glu
275 280 285
Glu Trp Tyr Lys Ser Lys Phe Ala Asp Leu Ser Glu Ala Ala Asn Arg
290 295 300
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Arg Gln Val Gln Ser Leu Thr Cys Glu Val Asp Ala Leu Lys Gly Thr
325 330 335
Asn Glu Ser Leu Glu Arg Gln Met Arg Glu Met Glu Glu Asn Phe Ala
340 345 350
Val Glu Ala Ala Asn Tyr Gln Asp Thr Ile Gly Arg Leu Gln Asp Glu
355 360 365
Ile Gln Asn Met Lys Glu Glu Met Ala Arg His Leu Arg Glu Tyr Gln
370 375 380
Asp Leu Leu Asn Val Lys Met Ala Leu Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr
385 390 395 400
Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Ser Arg Ile Ser Leu Pro Leu Pro
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420 425 430
Leu Val Asp Thr His Ser Lys Arg Thr Leu Leu Ile Lys Thr Val Glu
435 440 445
Thr Arg Asp Gly Gln Val Ile Asn Glu Thr Ser Gln His His Asp Asp
450 455 460
Leu Glu
465
Claims (33)
1. 来源于具有SEQ ID No.1的天然波形蛋白的多肽，其特征在于，与天然序列相比，所述多肽包含至少一个额外的精氨酸残基。
2. 权利要求1的多肽，其特征在于，所述多肽在位置16、17、19、41、58、59、60、68、76、140、142、147、363、406或452中的至少一个位置上具有额外的精氨酸残基。
3. 权利要求2的多肽，其特征在于，所述多肽在所述位置中的至少两个位置上具有额外的精氨酸残基。
4. 权利要求1的多肽，其特征在于，与天然序列相比，所述多肽在位置3、20、33、36、37、94、165、361、399或426中的至少一个位置上具有额外的亮氨酸残基。
5. 权利要求4的多肽，其特征在于，所述多肽在所述位置中的至少两个位置上具有额外的亮氨酸残基。
6. 权利要求1的多肽，其特征在于，与天然序列相比，所述多肽在位置21、41、43、50、54、62、64或89中的至少一个位置上具有额外的脯氨酸残基。
7. 权利要求6的多肽，其特征在于，所述多肽在所述位置中的至少两个位置上具有额外的脯氨酸残基。
8. 权利要求1的多肽，其特征在于，与天然序列相比，所述多肽在位置24、35或99中的至少一个位置上具有额外的苏氨酸残基。
9. 权利要求8的多肽，其特征在于，所述多肽在所述位置中的至少两个位置上具有额外的苏氨酸残基。
10. 权利要求1的多肽，其特征在于，与天然序列相比，所述多肽在位置25、39、42、49、55或67中的至少一个位置上具有额外的酪氨酸残基。
11. 权利要求10的多肽，其特征在于，所述多肽在所述位置中的至少两个位置上具有额外的酪氨酸残基。
12. 权利要求1的多肽，其特征在于，至少一个精氨酸残基作为瓜氨酸残基存在。
13. 权利要求12的多肽，其特征在于，所述多肽在位置4、12、23、28、36、45、50、64、71、100、320、364或378中的至少一个位置上具有瓜氨酸残基。
14. 权利要求13的多肽，其特征在于，所述多肽在所述位置中的至少两个位置上具有瓜氨酸残基。
15. 由来源于具有SEQ ID No.1的天然波形蛋白的至少6个氨基酸组成的片段，其特征在于，所述片段包含至少一个具有至少一个额外的精氨酸残基的区域，并且展示出对风湿病相关自身抗体的反应性。
16. 权利要求1至15中任一项的多肽或片段的肽衍生物。
17. 权利要求16的肽衍生物，其特征在于，所述肽衍生物选自逆或/和反多肽和环肽。
18. 诊断剂，其特征在于，所述诊断剂包含权利要求1至17中任一项之中定义的多肽或肽衍生物。
19. 用于检测风湿性疾病的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包含权利要求18中定义的诊断剂。
20. 权利要求19的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒用于检测类风湿性关节炎。
21. 权利要求19或20的诊断试剂盒，其特征在于，所述载体是DNA、RNA、医药学相容性聚合物、合成的生物聚合物或蛋白质。
22. 用于风湿性疾病的体外检测的方法，在所述方法中，测定体液中自身抗体的浓度，并任选地将所述浓度用于所述疾病的诊断、分类和严重度评价，其特征在于，使用权利要求18中定义的诊断剂或者权利要求19和20中任一项之中定义的诊断试剂盒。
23. 权利要求22的方法，其特征在于，所述方法用于检测类风湿性关节炎。
24. 药物，其特征在于，所述药物包含权利要求1至17中任一项之中定义的多肽或肽衍生物。
25. 权利要求1至17中任一项之中定义的多肽或肽衍生物在制备用于预防和/或治疗风湿性疾病的药物中的用途。
26. 权利要求25的用途，其特征在于，所述风湿性疾病是类风湿性关节炎。
27. 蛋白质BF0786或/和BF0713在制备用于预防和/或治疗风湿性疾病特别是类风湿性关节炎的药物中的用途。
28. 蛋白质BF0786或/和BF0713作为用于检测风湿性疾病特别是类风湿性关节炎的诊断试剂的用途。
29. 权利要求1至17中任一项之中定义的多肽或肽衍生物的用途，所述用途为用于发现针对由所述抗体或/和所述抗原驱动的炎症反应的阻断性天然物质和/或化学物质。
30. 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)用于预防或/和治疗风湿性疾病特别是类风湿性关节炎的用途。
31. 绿茶提取物用于预防或/和治疗风湿性疾病特别是类风湿性关节炎的用途。
32. 权利要求31的用途，其特征在于，使用有机提取物或有机-水提取物，或者可从这样的提取物中获得的产品。
33. 权利要求要求31或32的用途，其特征在于，所述提取物含有表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)作为活性成分。
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