CN101688230A

CN101688230A - 免疫调节剂的筛选方法

Info

Publication number: CN101688230A
Application number: CN200780053501A
Authority: CN
Inventors: 金圣勋; 韩政旼
Original assignee: Imagene Co Ltd
Current assignee: Imagene Co Ltd
Priority date: 2007-04-27
Filing date: 2007-04-27
Publication date: 2010-03-31
Also published as: JP2010525362A; WO2008133359A1; KR20100005116A; US20100138941A1

Abstract

本发明涉及一种免疫调节剂的筛选方法，具体涉及利用AIMP1的54－192部位和SEQ ID NO：18所示gp96的699－799部位的结合来调节gp96的细胞表面表达水平的免疫调节剂的筛选方法、抗癌剂筛选方法及自身免疫疾病治疗剂的筛选方法，进一步涉及利用上述结合诊断自身免疫疾病的方法。

Description

免疫调节剂的筛选方法

技术领域

本发明涉及一种免疫调节剂的筛选方法，具体涉及利用AIMP1的54-192部位和SEQ ID NO：18所示gp96的699-799部位的结合来调节gp96的细胞表面表达水平的免疫调节剂的筛选方法、抗癌剂筛选方法及自身免疫疾病治疗剂的筛选方法，进一步涉及利用上述结合诊断自身免疫疾病的方法。

背景技术

gp96是存在于内质网的属于HSP90蛋白(热休克蛋白90)家族的蛋白质。gp96蛋白的C端存在内质网残留信号即KDEL序列。虽然存在有所述KDEL序列，但是在正常的胚胎成纤维细胞没有观察到gp96的细胞表面表达，而在小鼠Meth-A肉瘤细胞中观察到这一表达(AltmeyerA，et.al.，Int J Cancer，69：340-349，1996)。另外还有报道称包括gp96在内的HSP蛋白质类等还在小鼠的胸腺细胞表面表达(Wiest D，et.al.，Proc Natl Acad Sci，94：1884-1889，1997)，因此认为gp96的细胞表面表达不只限定于癌细胞。gp96参与到天然免疫和适应性免疫，因此认为gp96的细胞表面表达与免疫有关联性。此外，已知gp96参与到树突细胞(DC)的激活和成熟。近来有报道称，在细胞表面表达gp96的转化小鼠中，DC被过度活化并引发了如狼疮等自身免疫疾病(Liu B，et.al.，Proc Natl Acad Sci，100：15824-15829，2003)。上述结果表明，从内质网输出的gp96在免疫调节中起到重要的作用，并且为了避免不必要的免疫反应，gp96的细胞表面表达应受到严格调节。

如上所述的gp96蛋白作为具有肿瘤疫苗效果的肿瘤排斥抗原首次被发现(Srivastava，P.K.，et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.83，3407-3411，1985)，如今作为针对转移性黑色素瘤(metastatic melanoma)的有效蛋白质医药被开发，正在进行临床3期试验(Pilla L，et.al.，CancerImmunol Immunother.Aug；55(8)：958-68，2006)。gp96蛋白之所以具有上述抗癌效果是由于具有活化免疫细胞的能力(Arnold-Schild D.et al.，J Immunol.，1：162(7)：3757-60，1999)和作为一种伴侣蛋白(chaperone)与肽结合的能力(Linderoth NA，et.al.，J Biol Chem.，25；275(8)：5472-7，2000：Singh-Jasuja H，et.al.，J Exp Med.5；191(11)：1965-74，2000)，在癌细胞中，gp96由于能够与癌细胞特异性抗原结合而应用于肿瘤疫苗(Heikema A，et.al.，Immunol Lett.1；57(1-3)：69-74，1997)。但动物实验结果显示，在正常细胞中如果过多地暴露于细胞表面，则会引发自身免疫疾病(Liu B，et.al.，Proc Natl Acad Sci.，23；100(26)：15824，2003)。因此，对gp96的细胞表面表达水平的调节，不仅在癌细胞中很重要，在正常细胞中也很重要，对此起调节作用的物质可开发为抗癌剂或者自身免疫治疗剂。

另外，AIMP1(ARS相互作用多功能蛋白1)以前被称为p43蛋白，由本发明者重新命名(Sang Gyu Park，et al.，Trends in BiochemicalSciences，30：569-574，2005)。所述AIMP1是由312个氨基酸构成的蛋白质，与多重tRNA合成酶复合物(mult-tRNA synthetase complex)结合(Deutscher，M.P.，Method Enzymol，29，577-583，1974；Dang C.V.etal.，Int.J.Biochem.14，539-543，1982；Mirande，M.et al.，EMBO J.1，733-736，1982；Yang D.C.et al.，Curr.Top Cell.Regul.26，325-335，1985)来增强所述多重tRNA合成酶的催化活性(catalytic activity)(ParkS.G.et al.，J.Biol.Chem.274，16673-16676，1999)。AIMP1由包括前列腺癌细胞、免疫细胞及转化细胞等多种形态的细胞分泌，其分泌通过TNF及热休克等多种刺激而被诱导(Park S.G.et al.，Am.J.Pathol.，166，387-398，2005；Barnett G.et al.，Cancer Res.60，2850-2857，2000)。已知分泌的AIMP1作用到单核细胞(monocyte)/巨噬细胞(macrophage)，内皮细胞及成纤维细胞等多种靶细胞。

发明内容

技术问题

本发明的发明人发现，SEQ ID NO：4所示AIMP1的54-192部位与SEQ ID NO：18所示gp96的699-799部位的直接结合会调节gp96的细胞表面表达水平，一旦破坏上述结合就会诱发自身免疫疾病，因而在自身免疫疾病患者的血样中，免疫细胞表面的gp96水平与血清内AIMP1的水平均比正常人的要高，从而完成了本发明。

本发明的目的在于提供一种探索调节gp96的细胞表面表达水平的免疫调节剂的方法，并提供一种自身免疫疾病的诊断方法。

为了实现上面所述的目的，本发明提供包括如下步骤的免疫调节剂筛选方法：

(a)使包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的分离的多肽与试验制剂接触；

(b)测试上述试验制剂是否与上述分离多肽结合。另外，本发明还提供以包含以下追加步骤为特征的免疫调节剂筛选方法：使所述(b)步骤中测试的候补物质与包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的分离多肽接触；

测试上述试验制剂是否与包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的分离多肽结合。

为了实现本发明的另一目的，本发明提供以包括以下步骤为特征的免疫调节剂筛选方法：

(a)使表达包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的分离多肽及包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的分离多肽的细胞或组织与试验制剂接触；并

(b)测定在接触上述试验制剂的细胞或组织中gp96的细胞表面表达水平相对于在没有接触上述试验制剂的细胞中gp96的细胞表面表达水平的变化。

为了实现本发明的另一目的，本发明还提供包含以下步骤的抗癌剂筛选方法：

(a)使包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的分离多肽与试验制剂接触；

(b)测定上述试验制剂是否与上述分离多肽结合；

(c)将上述试验制剂给予癌细胞或癌症动物模型；并

(d)在给予了上述试验制剂的癌细胞或癌症动物模型中测定癌症的进程变化。

因此，为了实现本发明的另一目的，还提供包括以下步骤的抗癌剂筛选方法：

(a)使试验制剂与表达包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽的细胞或组织接触；

(b)将与上述试验制剂接触的细胞或组织中的gp96的细胞表面表达水平和没有与试验制剂接触的细胞中的gp96的细胞表面表达水平进行比较，并测定是否增加；

(c)将上述试验制剂给予癌细胞或癌症动物模型；并

另外，为实现另一目的，本发明进一步提供包括以下步骤的自身免疫疾病治疗剂的筛选方法：

(a)使包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的分离多肽与试验制剂接触；

(d)测定上述试验制剂是否与包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的分离多肽结合；

(e)将上述试验制剂给予免疫细胞或自身免疫疾病动物模型中；并

(f)在给予了上述试验制剂的免疫细胞或自身免疫疾病动物模型中，测定免疫抑制程度。

另外，本发明为实现另一目的进一步提供包括以下步骤的自身免疫疾病治疗剂的筛选方法：

(a)使试验制剂与表达包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的分离多肽的细胞或组织接触；

(b)将与上述试验制剂接触的细胞或组织中的gp96的细胞表面表达水平和没有与试验制剂接触的细胞中的gp96的细胞表面表达水平进行比较，并测定是否减少；

(c)将上述试验制剂给予免疫细胞或自身免疫疾病动物模型；并

(d)在给予了上述试验制剂的免疫细胞或自身免疫疾病动物模型中，测定免疫抑制程度。另外，为了实现本发明的另一目的，本发明还提供包含SEQ ID NO：1的AIMP1蛋白特异性抗体的自身免疫疾病诊断用组合物，以及包括以下步骤的自身免疫疾病诊断方法：(a)使AIMP1蛋白特异性抗体与检测样本接触；(b)形成抗原-抗体复合物；以及(c)将上述抗原-抗体复合物的形成量与对照组比较。

技术解决方法

定义

如没有其他定义，则本说明书中所使用的所有技术及科学用语均具有与本领域技术人员通常所理解的相同含义。下面的参考文献为本领域的技术人员提供了本发明说明书中所使用的多个用语的一般性定义。Singleton et al.，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOTY(2d ed.1994)；THE CAMBRIDGEDICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker ed.，1988)；及Hale & Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY。此外，下面的定义是为本发明的实施而给读者提供帮助而提供。

本发明的“表达(expression)”是指蛋白质或核酸在细胞中的生成。

本发明的“宿主细胞(host cell)”是指利用任意方法(例如电穿孔法、钙磷酸酶沉淀法、微注射法、转化法、病毒感染法等)在细胞内导入有异源DNA的原核细胞或真核细胞。

本发明的“分离的(isolated)”是指物质从其起源环境(例：如果是自然生成的就指自然环境)中取出。例如，自然生成的核酸、多肽、或存在于活体动物内的细胞虽不是分离的，但是同一多核苷酸、多肽或从共同存在的物质的部分或全部分离(separated)的细胞，此后再将其重新导入到自然系统也算作是分离的。上述核酸可以是载体的一部分且/或上述核酸或多肽是组合物的一部分，上述载体和组合物不是自然环境的一部分而是分离的。

本发明的“免疫调节剂”是指增加或减少gp96的细胞表面表达水平从而增强或抑制免疫的制剂。

本发明的“调节gp96的细胞表面表达水平”是指可上调(up-regulation)(即活化或促进)或者下调(down-regulation)(即阻碍或抑制)gp96的细胞表面表达水平。例如，下调是AIMP1与gp96蛋白质结合从而抑制gp96向细胞表面的移动从而阻碍免疫反应，而上调是除去AIMP1时增加了gp96蛋白质向细胞表面的移动从而诱导免疫反应的增强。

本发明的“一种多肽(polypeptide)”可与“多种多肽(polypeptides)”或“一种或多种蛋白质”互换使用，通常是指例如自然状态的蛋白质中存在的氨基酸残基的聚合体。

本发明的分离的多肽是指包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽或包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的多肽。具有SEQ ID NO：4的上述氨基酸序列的多肽是具有AIMP1蛋白质的部分氨基酸序列(SEQ IDNO：1的54-192部位)的肽，具有SEQ ID NO：18的上述氨基酸序列的多肽是具有gp96蛋白的C-端氨基酸的部分序列(SEQ ID NO：13的699-799部位)的多肽。

此外，本发明的多肽范围包括含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽的功能性等同物及它们的盐，或含有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的多肽的功能性等同物及它们的盐。

本说明书的序列同源性及同一性被定义为将SEQ ID NO：4的氨基酸序列或SEQ ID NO：18的氨基酸序列和候补序列进行比对并引入空位后，候补序列对应于SEQ ID NO：4的氨基酸序列或SEQ ID NO：18的氨基酸序列的氨基酸残基的百分比。必要时，为了获得最大百分比的序列同一性，不考虑将保守置换作为序列同一性的一部分。SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：18的氨基酸序列的N-末端、C-末端或内部伸长、缺失或插入不解释为影响序列同一性或同源性的序列。此外，上述序列同一性可根据比较两个多肽氨基酸序列的相似部分而使用的普通标准方法而决定。如BLAST或FASTA的计算机软件可以最佳匹配的方式将两个多肽各自的氨基酸进行比对(按照一个或两个序列的全长序列或者按照一个或两个序列的预测部分)。上述软件提供默认开放罚分(defaultopening penalty)及默认空位罚分(default gap penalty)，还提供可与计算机软件一起连接使用的PAM250(标准得分矩阵；Dayhoff et al.，inAtlas of Protein Sequence and Structure，vol 5，supp.3，1978)等得分矩阵。例如，同一性百分比可按如下方法计算：相同匹配物(indenticalmatches)的总数乘以100，然后除以相应匹配空间内较长序列的长度与为比对两个序列而引入较长序列内的空位(gaps)数之和。

本发明的多肽可从自然界提取或通过基因工程法制备。例如，根据通常的方法制备编码上述SEQ ID NO：4或其功能性等同物的核酸(例：SEQ ID NO：5)。还制备编码上述SEQ ID NO：18或其功能性等同物的核酸(例：SEQ ID NO：19)。上述核酸可使用适当的引物(例：SEQ IDNO：26/27)通过PCR扩增制备。通过本领域公知的标准方法，例如，可使用自动DNA合成仪(Biosearch或Applied Biosystems公司售出)合成DNA序列。将制得的核酸插入含有一个以上表达调控序列(expression control sequence)(例如启动子、增强子等)的载体中，所述表达调控序列可调节与之有效连接(operatively linked)的核酸的表达，并用藉此获得的重组表达载体转化宿主细胞。生成的转化体在适于上述核酸表达的培养基及条件下培养，从培养物中回收由上述核酸表达的、基本上纯的多肽。上述回收可利用本领域公知的方法(例如色谱法)进行。上述“基本上纯的多肽”(substantially pure polypeptide)是指本发明的多肽基本上不包含源自宿主细胞的任何其他蛋白质。用于合成本发明多肽的基因工程方法可参考下面的文献：Maniatis et al.，Molecular Cloning；A laboratory Manual，Cold Spring Harborlaboratory，1982；Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.，Second(1998)and Third(2000)Editions；Gene Expression Technology，Method in Enzymology，Genetics and Molecular Biology，Method in Enzymology，Guthrie &Fink(eds.)，Academic Press，San Diego，Calif，1991；及Hitzeman et al.，J.Biol.Chem.，255：12073-12080，1990.

此外，本发明的多肽可通过本领域公知的化学合成方法(Creighton，Proteins；Structures and Molecular Principles，W.H.Freeman and Co.，NY，1983)容易地被制备。典型的方法可包括液体相或固体相合成、片段凝缩、F-MOC或T-BOC化学法(Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Proteins，Williams et al.，Eds.，CRC Press，Boca Raton Florida，1997；A Practical Approach，Atherton & Sheppard，Eds.，IRL Press，Oxford，England，1989)，但不限于此。

本发明中的“核酸”、“DNA序列”或“多核苷酸”是指单链或双链形态的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。如没有其他限制，还包括与自然生成的核苷酸以相似的方法杂交到核酸的自然核苷酸的公知类似物。

本发明中的核酸序列包括所有的DNA、cDNA及RNA序列。即，上述多核苷酸可具有编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列的碱基序列或与上述碱基序列互补的碱基序列。优选具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：19所示的碱基序列。上述核酸可通过从自然界分离或如上所述的基因工程的方法制备。

本发明中的“类似物”(analog)是指在结构上与参照分子(referencemolecule)类似，但是参照分子的特定取代基通过置换被取代，从而其靶标或调节方法发生改变的物质。与参照分子相比，类似物如本领域所预想的一样具有相同、类似或得到提高的效用(utility)。为鉴定具有得到提高的性质(如对靶物质更高的结合亲和力)的公知化合物的变体的类似物的合成及筛选是药理化学领域公知的方法。

本发明中的“同源物”(homologues)是指提及蛋白质及/或蛋白序列时，表示自然地或者人工地来源于共同的祖蛋白(common ancestralprotein)或蛋白序列。类似地，核酸及/或核酸序列在自然地或者人工地来源于它们共同的祖核酸或核酸序列时是相同的。

本发明中的“接触”(contacting)是它的一般性含义，是指使两个以上的制剂(例如2个多肽)结合(combine)，或使制剂和细胞(例如蛋白质和细胞)结合。接触可在体外(in vitro)发生。例如，在试管或容器中使两个以上制剂结合，或使试验制剂的细胞或者细胞裂解物和试验制剂结合。另外，接触可在细胞内或在原位(in situ)发生。例如：通过使编码2个多肽的重组多核苷酸在细胞内共表达(coexpression)，从而使两个多肽在细胞或细胞裂解物中相接触。

本发明中的“制剂”(agent)或者“试验制剂”(test agent)包括任意的物质(substance)、分子(molecule)、元素(element)、化合物(compound)、实体(entity)或者它们的组合。例如，但不限于此，包括蛋白质、多肽、小的有机分子(small organic molecule)、多糖(polysaccharide)、多核苷酸等。另外，也可为自然产物(naturalproduct)、合成化合物或化学化合物或者两个以上物质的组合。若非另外明示，否则可以互换地使用制剂、物质和化合物。

更具体地，可通过本发明的筛选方法筛选的试验制剂包括多肽、β转角模拟物(beta-turn mimetics)、多糖类、磷酯类、激素、前列腺素(prostaglandin)、类固醇、芳香族化合物、杂环化合物(heterocyclic)、苯二氮(Benzodiazepines)、低聚N-取代甘氨酸(oligomeric N-substitutedglycines)、寡聚氨基甲酸酯(oligocarbamates)、糖类(saccharides)、脂肪酸、嘌呤、嘧啶或它们的衍生物、结构类似物或组合。有的试验制剂可以是合成物质，其他的试验制剂可以是天然物质。上述试验制剂可从包括合成或自然化合物的文库(library)的广泛而又多样出处中获得。可生产得到可以分步方式合成的种类繁多的化合物的组合文库(combinatorial library)。多数的组合文库的化合物可通过ESL(编码合成文库(encoded synthetic libraries))方法(WO 95/12608、WO93/06121、WO 94/08051、WO 95/395503和WO 95/30642)而制备。肽文库(peptide library)可通过噬菌体展示(Phage display)(WO91/18980)方法来制备。细菌、霉菌、植物及动物提取物形式的自然化合物的文库可通过商购获得或从野外收集。为了制备结构类似物，可以酰化、烷化、酯化反应、氨化(amidification)方式将公知的药理学制剂进行定向(direct)或随机的化学修饰。

上述试验制剂可以是自然生成的蛋白质或其片段。这种试验制剂可获自自然来源(natural source)，例如细胞或组织裂解物。多肽制剂的文库可通过例如常规方法生成，或通过可商购的cDNA库获得。上述试验制剂还可以是多肽，例如具有约5-30个、优选约5-20个、更优选约7-15个氨基酸的肽。上述肽可以是自然生成的蛋白质、随机肽或偏好(biased)随机肽的消化产物。

此外，上述试验制剂可以为“核酸”。核酸试验制剂可以是自然生成的核酸、随机核酸或偏好随机核酸。例如，原核或真核基因组的消化产物可以与上述方法类似的方法使用。

此外，上述试验制剂可以是小分子(例如具有约1000以下分子量的分子)。在筛选小分子调节制剂的方法中，优选使用高通量筛选技术(high throughput assay)。如上所记载，可容易地应用小分子试验制剂的组合库筛选p53的小分子调节因子。很多分析都可用于上述筛选(Shultz，Bioorg.Med.Chem.Lett.，8：2409-2414，1998；Weller，Mol.Drivers.，3：61-70，1997；Fernandes，Curr.Opin.Chem.Biol.，2：597-603，1998；and Sittampalam，Curr.Opin.Chem.Biol.，1：384-91，1997)。

本发明方法中被筛选的试验制剂文库可根据对AIMP1或其片段或类似物的结构研究及gp96或其片段或类似物的结构研究而制备。这种结构研究能够鉴定与AIMP1或gp96能够结合的试验制剂。AIMP1或gp96的三维结构可通过多种方法例如结晶学结构及分子建模来研究。通过利用X-射线的结晶学研究蛋白质结构的方法详细记载在以下文献中：

Physical Bio-Chemistry，Van Holde，K.E.(Prentice-Hall，NewJersey 1971)，pp.221-239，and Physical Chemistry with Applications tothe Life Sciences，D.Eisengerg & D.C.Crothers(Benjamin Cummings，Menlo Park 1979)。对AIMP1结构的计算机建模为筛选调节gp96细胞表面表达水平的免疫调节剂提供了设计试验制剂的手段。分子建模方法记载于文献美国专利No.5，612,894和美国专利No.5,583,973。此外，蛋白质结构可通过中子衍射(neutron diffraction)及NMR(nuclearmagnetic resonance)确定：Physical Chemistry，4th Ed.Moore，W.J.(Prentice-Hall，New Jersey 1972)and NMR of Proteins and NucleicAcids，K.Wuthrich(Wiley-Interscience，New York 1986)。

在本发明中的“抗体”是指对抗原性部位显示特异性的蛋白质分子。根据本发明的目的而言，抗体是指特异性识别AIMP1的抗体。包括所有的多克隆抗体及单克隆抗体。利用AIMP1生成特异性抗体容易通过本领域的广泛公知的技术制备。上述本发明中使用的AIMP1可具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列。

多克隆抗体可通过本领域公知的方法生产，即将上述AIMP1蛋白质抗原注射给动物，采集动物血液并收集包含抗体的血清。这种多克隆抗体可在山羊、兔、羊、猴、马、猪、牛、狗等任意的动物宿主中制备。

单克隆抗体可通过本领域广泛公知的融合方法(fusion method)(参照Kohler及Milstein(1976)European Jounral of Immunology6：511-519)、重组DNA方法(美国专利第4816567号)或噬菌体抗体文库技术(Clackson et al，Nature，352：624-628，1991；Marks et al，J.Mol.Biol.，222：58，1-597，1991)来制备。

本发明中用于检测AIMP1蛋白质的抗体不仅包含具有两个全长轻链(light chain)及两个全长重链(heavy chain)的完整形态，还包括抗体分子的功能性片段。抗体分子的功能性片段是指至少保留了抗原结合功能的片段，有Fab、F(ab′)、F(ab′)2及Fv等。

本发明中的“检测样本”是指能够检测出由于自身免疫疾病的发生所致标记蛋白质的表达量的差别的组织、细胞、全血、血清、血浆、唾液、精液、脑脊髓液或尿等生物学样本，通过本领域广泛公知的方法处理制备。

本发明中的“抗原-抗体复合物”是指生物学样本中的AIMP1蛋白和特异性识别它的抗体的结合物。研究抗原-抗体复合物形成的试验方法有组织免疫染色、放射性免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹(Western Blotting)、免疫沉淀分析(Immunoprecipitation Assay)、免疫扩散分析(Immunodiffusionassay)、补体结合试验(Complement Fixation Assay)、FACS、蛋白质芯片技术等，但不限于此。

下面，详细说明本发明。

首先，本发明者通过结合亲和力(binding affinity)试验确认了AIMP1和gp96的结合(参照图1)，并通过蛋白质印迹和免疫共沉淀法再次确认，结果确认gp96和AIMP1能直接结合(参照图2-4)。为了研究由于与AIMP1的结合，gp96在细胞内的位置如何改变，在AIMP1野生型小鼠(AIMP1+/+)和缺陷型小鼠(AIMP1-/-)中分别分离MEF细胞，并测定gp96在细胞内的位置，结果显示，在AIMP1野生型小鼠中，gp96主要存在于细胞核周边的ER，而在AIMP1缺陷型小鼠中存在于质膜(参照图5)。在AIMP1缺陷型小鼠中，一旦过表达AIMP1，则显示为gp96再次存在于ER(参照图6)。从上述结果得知gp96在细胞内的位置受AIMP1调节。

此外，用FACS分析AIMP1所致的gp96细胞表面表达水平，结果发现，缺陷型小鼠(AIMP1-/-)的MEF细胞和脾细胞中的gp96细胞表面表达水平与野生型小鼠(AIMP1+/+)MEF细胞和脾细胞中的gp96细胞表面表达水平相比得到增加(参照图7-9)。可以确认，用AIMP1siRNA处理HeLa细胞从而抑制内在AIMP1时，gp96的细胞表面表达水平增加(参照图10)，而在293细胞中过表达AIMP1则gp96的细胞表面表达水平减少(参照图11)。由此得知gp96的细胞表面表达水平受AIMP1调节，这可由AIMP1缺陷型小鼠出现自身免疫疾病表型得到再次确认。(参照图12-14)。即，可知gp96的细胞表面表达水平受AIMP1的调节，一旦AIMP1缺失，则gp96的细胞表面表达水平会增加，并产生较强的免疫反应，因此发生自身免疫疾病。

如上述记载确认AIMP1与gp96相结合并且gp96的细胞表面表达水平受AIMP1调节。本发明者鉴定了AIMP1和gp96的结合部位。结果表明，SEQ ID NO：1的54-192部位(SEQ ID NO：4)与SEQ ID NO：13的gp96的699-799部位(SEQ ID NO：18)相结合(参照图18)。

简而言之，SEQ ID NO：4所示AIMP1的54-192部位与SEQ IDNO：18所示gp96的699-799部位直接结合，帮助gp96保留在内质网(ER)，从而抑制向细胞表面移动。相反，若除去AIMP1，则会增加gp96向细胞表面的移动，从而诱导免疫反应的增加。因此，弱化或强化所述片段之间的结合的物质有可能开发为免疫抗癌疫苗或免疫抑制物质。利用SEQ ID NO：4所示AIMP1的54-192部位和SEQ ID NO：18所示gp96的699-799部位的结合的免疫调节剂筛选系统在本发明中首次公开。

如上所述，AIMP1与gp96结合从而调节gp96在细胞内的位置，结果，存在于细胞表面的gp96的量和与之相伴的免疫反应受到调节。动物实验结果表明，虽然已知gp96在细胞表面过多暴露时会诱导自身免疫疾病(Liu B，et.al.，Proc Natl Acad Sci，100：15824-15829，2003)，然而对于自身免疫疾病患者，在细胞内gp96和AIMP1的结合被破坏，gp96在细胞表面上大量表达，AIMP1被分泌到细胞外，大量存在于血液内(参照图19)。即能够确认SLE患者的血清中AIMP1的水平高于正常人的血清中AIMP1的水平(参照图19)。由此可知，可以将可测定AIMP1的血液内水平的AIMP1抗体作为诊断自身免疫病患的新指标。

因此，本发明提供包含如下步骤的免疫调节剂筛选方法：

(a)使包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的分离多肽与试验制剂相接触；

(b)测定所述试验制剂与所述分离多肽是否结合。

此外，还提供一种免疫调节剂筛选方法，其特征在于进一步包括如下步骤：使上述(b)步骤中测试的候补物质与包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列的分离多肽相接触；

测定所述候补物质与包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列的分离多肽是否结合。

本领域公知的多种多样的生化技术及分子生物学技术可以应用于所述方法的实施。所述技术公开于以下的文献：Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.，Second(1998)and Third(2000)Editions；and Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，NewYork(1987-1999)。

首先，为了筛选本发明的免疫调节剂，使包含AIMP1的部分片段(SEQ ID NO：1的54-192)的SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的分离多肽和试验制剂接触，检测所述分离多肽和试验制剂是否结合。对于试验制剂和所述分离多肽的结合，可以多种方法进行测定，例如标记的体外蛋白质-蛋白质结合测定、EMSA(电泳迁移率变动分析)、检测蛋白质结合的免疫测定、功能性检测(磷酸化测定等)(美国专利4,366,241、4,376,110、4,517,288和4,837,168；以及Bevan et al.，Trends inBiotechnology，13：115-122，1995；Ecker et al.，Bio/Technology，13：351-360，1995；and Hodgson，Bio/Technology，10：973-980，1992)。

试验制剂可通过测定与包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的分离多肽的直接结合而确认。例如通过借助于包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的AIMP1蛋白质的抗体测定与AIMP1多肽的共沉淀(co-immunoprecipitation)而确认。而且，试验制剂可通过检测显示所述本发明的分离多肽或AIMP1和试验制剂的结合的信号例如荧光淬灭(quenching)而被确认。

竞争检测(competition assay)为鉴定与本发明的分离多肽或AIMP1特异性结合的试验制剂提供了适当的形式(format)。所述形式中，试验制剂通过同业已公知与AIMP1相结合的化合物竞争而被筛选。公知的结合化合物也可以是合成化合物。此外，也可以是特异性识别本发明的分离多肽或AIMP1的抗体，例如有可能是AIMP1的单克隆抗体。如果试验制剂阻碍公知的本发明的分离多肽或AIMP1和公知的化合物的结合，那么所述试验制剂也和本发明的分离多肽或AIMP1结合。

多种种类的竞争检测已在本领域中公开。例如，固相直接或间接酶放射免疫测定法(solid phase direct or indirect radioimmunoassay，RIA)、固相直接或间接酶免疫测定法(EIA)、夹层竞争检测(Stahli et al.，Methods in Enzymology，9：242-2453，1983)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Kirkland et al.，J.Immunol.，137：3614-3619，1986)；固相直接标记的检测、固相直接标记的夹层检测(Harlow and Lane，Antibodies，Alaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，1988)；利用¹²⁵I的固相直接标记RIA(Morel et al.，Mol.Immuno.，25(1)：7-15，1988)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung et al.，Virology，176：546-552，1990)；及直接标记的RIA(Moldenhauer et al.，Sacnd.J.Immunol.，32：77-82，1990)。一般而言，所述检测包括利用与包含未标记的试验制剂以及标记的对照化合物的细胞或固体表面结合的纯化多肽。竞争阻碍通过在试验制剂存在下确定结合在固体表面或细胞的标记的量而测定。通过竞争检测鉴定的调节制剂包括与对照化合物结合同一表位的制剂，以及因位阻(steric hindrance)出现而同与对照化合物结合的表位十分接近的相邻表位结合的制剂。通常，竞争抑制过度存在时，对照化合物与共有目标多肽的特异性结合会被抑制至少50或75％。

上述筛选分析可以为非溶性或溶解性形式。在非溶性检测的一个实例中，将本发明的分离多肽或AIMP1在固相矩阵中固定。此后，在制剂充分结合的时间内，使固相矩阵与试验制剂接触。然后，洗涤除去未与固相矩阵相结合的物质，然后确认与固相相结合的制剂的存在。所述方法可进一步包括从固相矩阵洗脱结合的制剂从而分离制剂的步骤。二者择一地，固定本发明的分离多肽或AIMP1的其他方法为使试验制剂结合于固体矩阵，然后添加本发明的分离多肽或AIMP1。

溶解性检测包括以上所记载的几种结合文库筛选方法。溶解性检测形式下，试验制剂或本发明的分离多肽或AIMP1都不与固体支持物结合。本发明的分离多肽或AIMP1对试验制剂的结合可通过例如本发明的分离多肽或AIMP1及/或试验制剂的荧光测定。荧光可以是固有的(intrinsic)，或者通过用具有荧光物质(fluorophor)的成分进行标记而获得。

在多种结合测定中，本发明的分离多肽或AIMP1、试验制剂或第3种物质(例如与AIMP1结合的抗体)以标记状态提供，目的是为了在给定的条件下更容易确认、检测和定量所述多肽。即，可以与可检测的标记或基团、或可交联的基团共价结合或者连接的状态提供。这些可检测的基团包含可检测的多肽基团，例如可检测(assayable)的酶或抗体表位。二者择一地，上述可检测的基团可从如放射性同位元素(例：¹²⁵I、³²P、³⁵S)或化学发光基团或荧光基团等其他可检测的基团或标记中选择。类似地，上述可检测的基团也可以为底物(substrate)、辅因子(cofactor)、抑制剂或亲和配体。

所述分离多肽和gp96结合，从而调节gp96的细胞表面表达水平，因此通过上述方法，与包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的分离多肽相结合的试验制剂使gp96的细胞表面表达水平增加，从而成为增强免疫的免疫调节剂。

如果试验制剂不与包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的分离多肽结合，则使所述试验制剂与包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的分离多肽相接触，并测定所述试验制剂是否与包含所述SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的分离多肽结合。如果所述试验制剂结合所述分离多肽，则能作为通过减少包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的gp96蛋白质的细胞表面表达水平来抑制免疫的免疫调节剂。

针对试验试剂是否结合所述分离多肽的方法与上述方法相同。

本发明的筛选方法包括如下步骤：

(a)使试验制剂与表达分离多肽的细胞或组织相接触，所述分离多肽为包括SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的分离多肽以及包括SEQ IDNO：18所示氨基酸序列的分离多肽；及

(b)测定接触上述试验制剂的细胞或组织中的gp96细胞表面表达水平相对于没有接触试验制剂的细胞中的gp96细胞表面表达水平的变化(change)。

所述细胞可以为所述多肽本身就表达的细胞，也可以为用下述分离多核苷酸同时转染所获得的重组细胞，所述分离多核苷酸为包含编码SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的核酸序列的分离多聚核苷酸，以及包含编码SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的核酸序列的分离多核苷酸。

gp96的细胞表面表达水平通过公知的方法测定。例如，使诸如免疫荧光物质的标记物质与gp96的抗体结合，然后用显微镜观察或进行FACS分析，从而可测定gp96的细胞表达水平。

AIMP1的54-192部位和gp96的699-799部位直接结合，有助于gp96保留于内质网中，从而抑制向细胞表面的移动，其结果是抑制了免疫反应。因此，调节包含所述SEQ ID NO：4的氨基酸序列(AIMP1的54-192部位)的分离多肽和包含所述SEQ ID NO：18的氨基酸序列(gp96的699-799部位)的分离多肽之间的相互作用的试验制剂有可能成为调节gp96细胞表面表达水平的免疫调节剂。所述制剂可成为促进或强化所述肽之间的相互作用从而抑制免疫的免疫调节剂，相反抑制或弱化所述相互作用从而可成为增强免疫的免疫调节剂。

如前所述，所述筛选方法可通过本领域公知的多种方法进行，如标记的体外蛋白质-蛋白质结合测定(体外融合蛋白沉淀测定(invitropull-down assay))、EMSA(电泳迁移率变动分析)、检测蛋白质结合的免疫测定、功能性测定(磷酸化测定等)、酵母双杂合体测定、非免疫沉淀测定、免疫沉淀蛋白质印迹测定、免疫共定位测定(immuno-co-localization)等。

例如，可利用表达如下物质的酵母进行酵母双杂合体分析：包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的AIMP1的部分片段多肽以及/或AIMP1和包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的gp96的部分片段多肽及/或gp96，或其蛋白质的部分或同源物(homologues)，上述物质分别与细菌阻抑物LexA或酵母GAL4的DNA结合域和酵母GAL4蛋白质的反式激活域中融合(KIM，M.J.et al.，Nat.Gent.，34：330-336，2003)。包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的AIMP1的部分片段及/或AIMP1和包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的gp96的部分片段及/或gp96的相互作用可以重构诱导报告基因的表达的反式作用子(transactivator)，所述报告基因受控于具有结合于LexA蛋白或GAL4的DNA结合域的调节序列的启动子。

如前所述，在所述报告基因中，可使用编码本领域公知的任何可检测的多肽例如CAT(氯霉素乙酰转移酶)、萤光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶及GFP(绿色荧光蛋白)等的基因。如果AIMP1和gp96，或这些蛋白质的部分或同源物的相互作用被试验制剂促进或强化，则所述报告基因的表达与正常条件相比增加。相反，所述相互作用被试验制剂抑制或弱化时，所述报告基因不能表达或比正常条件下表达更少。

并且在报告基因中，可选择编码使酵母能够成长的蛋白质(即所述报告基因没有表达时会抑制酵母的成长)的基因。例如，可以为编码与氨基酸或含氮碱基的生物合成过程相关联的酶的营养缺陷型(auxotrophic)基因(例：ADE3、HIS3等酵母基因或来源于其他物种的同等基因)。在由此系统表达的AIMP1和gp96或这些蛋白质的部分或同源物的相互作用受试验制剂抑制或弱化时，报告基因不表达或表达更少。因此，所述条件下酵母的成长被停止或减缓。根据这种报告基因的表达的效果可通过肉眼或装置(例如显微镜)观察。

本发明提供了抗癌剂筛选方法，包含如下步骤：

(b)测定上述试验制剂是否与上述分离多肽结合；

(c)将上述试验制剂给予癌细胞或癌症动物模型；及

(d)在给予了上述试验制剂的癌细胞或癌症动物模型中测定癌的进程变化。

还提供了抗癌剂筛选方法，包括如下步骤：

(b)测定上述与试验制剂接触的细胞或组织中的gp96的细胞表面表达水平与没有与试验制剂接触的细胞中的gp96的细胞表面表达水平相比是否有增加；

(c)将上述试验制剂给予癌细胞或癌症动物模型；并

如上所述，如果试验制剂与包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的分离多肽结合，或使表达所述多肽的细胞的gp96的细胞表面表达水平增加，则可作为使gp96向细胞表面移动从而诱导免疫反应的增加的免疫调节剂，并且若将前述试验制剂给予公知的癌细胞或癌症动物模型并确定可以抑制癌症的进程，则可用作新的抗癌剂。目前正在进行临床3期试验的gp96癌症疫苗存在不得不从癌症患者获得的问题：不仅存在量方面的问题，还存在费用问题，但是根据本发明的方法筛选的抗癌剂能够开发为替代所述gp96癌症疫苗的抗癌剂。所述癌细胞或癌症动物模型可保藏于保藏机构，或可以购买使用，或根据公知的方法制作使用。所述癌的种类可以是例如(不限定于此)黑素瘤、乳腺癌、大肠癌、肺癌、小细胞肺癌、胃癌、肝癌、血癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门附近的癌、结肠癌、输卵管癌瘤、子宫内膜癌瘤、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、何杰金(氏)病、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴球淋巴瘤、膀胱癌、肾脏或输尿管癌、肾细胞癌、肾脏骨盆癌、CNS肿瘤、原发性CNS淋巴癌、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤和垂体腺瘤等癌或这些癌中一种以上的组合。优选黑素瘤(melanoma)。

本发明还提供了自身免疫疾病治疗剂的筛选方法，包含如下步骤：

(e)将上述试验制剂给予免疫细胞或自身免疫疾病动物模型；并

(f)在给予了上述试验制剂的免疫细胞或自身免疫疾病动物模型中，测定免疫抑制的程度。

本发明还提供了自身免疫疾病治疗剂的筛选方法，包括如下步骤：

(c)将上述试验制剂给予免疫细胞或自身免疫疾病动物模型；及

(d)在给予了上述试验制剂的免疫细胞或自身免疫疾病动物模型中测定免疫抑制程度。

一种自身免疫疾病治疗剂的筛选方法，包含如下步骤：

(a)使包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的分离多肽或表达所述多肽的细胞或组织和候补物质相接触；

(b)测试所述候补物质是否与所述分离多肽或表达所述多肽的细胞或组织结合；

(c)使所述(b)步骤中测试的候补物质与包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的分离多肽或表达所述多肽的细胞或组织接触；

(d)测定所述候补物质与包含SEQ ID NO：18所示氨基酸的分离多肽或表达所述多肽的细胞或组织是否结合；

(e)将所述候补物质给予免疫细胞或自身免疫疾病动物模型；及

(f)在给予了所述候补物质的免疫细胞或自身免疫疾病动物模型中测定免疫抑制程度。

如上所述，如果试验制剂与包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的分离多肽结合，或使表达上述多肽的细胞的gp96的细胞表面表达水平减少，则可作为抑制gp96向细胞表面移动从而抑制免疫反应的免疫调节剂，并且若将前述试验制剂给予公知的免疫细胞或自身免疫疾病动物模型并确定有免疫抑制程度，则可用作新的自身免疫疾病治疗剂。

所述免疫细胞或自身免疫疾病模型可保藏于保藏机构，或可以购入使用，或者根据公知的方法制作使用。所述免疫细胞可以是例如树突细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞等，但不限定于此；所述自身免疫疾病动物模型可以为AIMP1缺陷型小鼠((Cecconi，F. & Meyer，B.I.，FEBSLett.，480：63-71，2000)或细胞表面表达gp96的转基因小鼠(Liu B，et.al.，Proc Natl.Acad.Sci.USA，100：15824-15829，2003)，但不限定于此。所述自身免疫疾病可以为全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、银屑病、硬皮病、炎性肠病(inflammatory bowel disease)和重症肌无力(myastheniagravis)。

另外，本发明提供了自身免疫疾病诊断用组合物，所述组合物含有能测定AIMP1蛋白质水平的AIMP1特异性抗体。

本发明的自身免疫疾病诊断用组合物不仅包含选择性识别AIMP1蛋白质的抗体，还包含用于免疫学分析的领域中通常使用的工具、试剂等。这种工具/试剂包括适当的载体、能够产生可检测信号的标记物质、增溶剂、洗涤剂、缓冲剂、稳定剂等，但并不限定于此。标记物质为酶时，可包含能够测定酶活性的底物及反应终止剂。适当的载体包括可溶性载体，例如本领域中公知的生理学上许可的缓冲液，例如PBS；适当的载体还包括不溶性载体，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟碳树脂、交联葡聚糖、多糖、在胶乳上渡金属的诸如磁性微粒的高分子、其他纸、玻璃、金属、琼脂糖以及它们的组合，但不限于此。

本发明的自身免疫疾病诊断用组合物的形式可以是ELISA板、浸渍型装置(dip-stick device)、免疫层析试验带以及径向分离免疫测定装置、及流通(flow-through)设备等，但不限于此。

另外，本发明提供了自身免疫疾病诊断方法，通过使AIMP1特异性抗体与检测样本接触，形成抗原-抗体复合物，并将抗原-抗体复合物的形成量与对照组相比较。

能够定性地或者定量地测定抗原-抗体复合物的形成的标记包括酶、荧光物、配体、发光物、微粒子(microparticle)、氧化还原分子及放射性同位元素等，但并不限定于此。可用作检测标记的酶有β-葡糖醛酸苷酶(B-glucuronidase)、β-D-葡糖苷酶(β-D-glucosidase)、β-D-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)、尿素酶、过氧物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱脂酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶、GDP酶(GDPase)、RNA酶(RNase)、葡萄糖氧化酶、荧光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧酶、天冬氨酸转氨酶、磷酸烯醇丙酮酸、β-内酰胺酶等，但并不限于此。荧光物有荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲酸酯和荧光胺(Fluorescamine)等，但并不限于此。配体有生物素衍生物等，但不限于此。发光物有吖啶酯、荧光素和萤光素酶等，但并不限于此。微粒子有胶体金和有色胶乳等，但不限定于此。氧化还原分子有二茂铁、镥复合物、紫精(Viologen)、醌、Ti离子、Cs离子、二酰亚胺、1，4-苯醌、氢醌、K₄W(CN)₈、[Os(bpy)₃]²⁺，[Ru(bpy)₃]²⁺、[Mo(CN)₈]^4-等，但不限于此。放射性同位元素有³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、³⁶Cl、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁹⁰y、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁸⁶Re等，但不限于此。

可以依照绝对差值(例如μg/ml)或相对差值(例如信号相对强度)观察对照区和检测样本中抗原-抗体复合物形成量之间是否存在显著的差异而诊断自身免疫疾病。

有利的效果

如上观察，本发明者首次发现，SEQ ID NO：4所示AIMP1的54-192部位与SEQ ID NO：18所示gp96的699-799部位直接结合，有助于使gp96保留在内质网(ER)，从而抑制其向细胞表面的移动，进而调节存在于细胞表面的gp96的量和与之相伴的免疫反应。因此，可利用AIMP1的54-192部位和SEQ ID NO：18所示gp96的699-799部位的结合来筛选免疫调节剂、抗癌剂以及自身免疫疾病治疗剂。而且，结合被破坏时，不能进行免疫调节，因而会诱发自身免疫疾病，因此用于测定AIMP1蛋白质水平的AIMP1蛋白质特异性抗体可用作诊断自身免疫疾病的新指标。

附图说明

图1是将从小鼠胰腺中分离的蛋白质用附着有生物素的AIMP1分离纯化并进行银染的结果(箭头表示AIMP1结合蛋白质)。

图2是将从小鼠胰腺中分离的蛋白质利用附着有生物素的AIMP1分离纯化并进行蛋白质印迹试验的结果。

图3是将从AIMP1缺陷型小鼠-/-)和野生型小鼠(+/+)胰腺中分离的蛋白质用GST-AIMP1分离纯化并进行蛋白质印迹试验的结果。

图4是将从HeLa细胞中分离的蛋白质用抗-gp96抗体进行共免疫沉淀的结果。

图5是观察来自AIMP1缺陷型小鼠-/-)和野生型小鼠(+/+)的MEF中的gp96在细胞内的位置的免疫荧光染色结果(ER：内质网，PM：质膜)。

图6是观察来自AIMP1缺陷型-/-)的MEF由myc-AIMP1转化后gp96在细胞内的位置的免疫荧光染色结果。

图7是对来自野生型小鼠(+/+)和AIMP1缺陷型小鼠(-/-)的MEF的细胞表面gp96进行染色并用FACS分析的结果。

图8是对来自野生型小鼠(+/+)和AIMP1缺陷型小鼠(-/-)的脾细胞的细胞表面gp96进行染色并用FACS分析的结果。

图9是对来自野生型小鼠(+/+)和AIMP1缺陷型小鼠-/-)的脾细胞用抗-gp96抗体(绿色)或抗-Fas抗体(绿色)进行免疫荧光染色的结果(细胞核用PI(红色)染色)。

图10是HeLa细胞用对照组或AIMP1siRNA处理并用FACA分析gp96细胞表面表达水平的结果(左图)及蛋白质印迹试验的结果(右图)。

图11是293细胞用空载体(EV)或AIMP1载体转化后，用FACA分析gp96的细胞表面表达水平的结果(左图)及蛋白质印迹试验的结果(右图)。

图12是从野生型小鼠(+/+)及AIMP1缺陷型小鼠(-/-)的肝脏中分离的核蛋白用自身血清进行蛋白免疫印迹的结果。

图13是观察野生型小鼠(+/+)及AIMP1缺陷型小鼠(-/-)的血清中是否存在抗核抗体(ANA)的免疫荧光染色的结果(上部分)，和观察肾脏的肾小球中免疫复合物(immune complex)沉淀的结果(下面部分)。

图14示出野生型小鼠(+/+)及AIMP1杂合型小鼠(+/-)及AIMP1缺陷型小鼠(-/-)的血清Ig水平的结果。

图15是分析纯化的GST-AIMP1片段和gp96结合程度的蛋白质印迹试验的结果。

图16是分析纯化的GST-gp96片段和AIMP1的结合程度的蛋白质印迹试验的结果。

图17是分析gp96变体(E791)是否与AIMP1结合的蛋白质印迹试验的结果。

图18是示出AIMP1和gp96各自的功能结构域的模式图。

图19是示出从正常人和SLE患者中分离的血清中的AIMP1水平的曲线图。

具体实施方式

下面，通过实施例详细说明本发明。

但是，下面的实施例只是对本发明的例示，本发明的内容并不限于此。

<实施例1>

gp96作为AIMP1结合蛋白的鉴定

<1-1>借助于亲和力纯化AIMP1结合蛋白质

为了分离与AIMP1结合的蛋白质，进行AIMP1亲和纯化，用质谱鉴定与AIMP1一起纯化的蛋白质，结果显示gp96和AIMP1蛋白质结合。具体地，重组AIMP1蛋白质和BSA根据制造商(Pierce)的方法利用硫代-NHS-生物素试剂使生物素附着。小鼠胰腺在含有1％TritonX-100的匀浆缓冲液(25mM Tris，pH 7.4，10mM NaCl，0.5mM EDTA，0.5mM苯甲磺酰氟，1μg/ml亮肽素(leupeptin)，1μg/ml胃酶抑素A(pepstatin A)和5μg/ml抑肽酶(aprotinin))中匀浆。附着有生物素的AIMP1和BSA预先固定在链霉亲和素磁珠(streptavidin bead)，然后将上述磁珠与10mg的蛋白质提取物一起在4℃培养12小时，然后进行洗涤，并将共同沉淀的蛋白质进行SDS-PAGE，切下主条带，并在37℃进行6小时的胰蛋白酶(Roche Molecular Biochemicals)处理。然后用Voyager DE时间飞行质谱仪(Voyager DE time-of-flight massspectrometer)(Perceptive Biosystems，Inc.，Framingham，MA))分析胰蛋白酶处理的肽片段，结果在图1中示出。

如图1所示，gp96、已知可与AIMP1形成复合物的tRNA合成酶(EPRS、LRS、QRS)及COPI复合物亚基都是与AIMP1结合的蛋白质。

<1-2>蛋白质印迹试验

为再度确认AIMP1和gp96或β-COP的结合，利用通过上述<1-2>的方法分离的附着有生物素的AIMP1和BSA纯化从小鼠胰腺中提取的蛋白质。然后利用兔抗gp96抗体(Santa Crus.CA)和β-COP抗体进行蛋白质印迹试验，结果在图2中示出。另外，通过由SDS-PAGE分离的GST或者GST-AIMP1纯化从小鼠胰腺中提取的蛋白质，并利用兔抗gp96抗体(Santa Cruz.CA)和小鼠抗GST抗体(Santa Cruz.CA)进行蛋白质印迹试验，结果在图3中示出。

根据图2和图3所示，确认AIMP1和gp96可以直接结合。

<1-3>免疫共沉淀(Co-immuniprecipitation)

将用编码AIMP1的质粒(Ko YG，et.al.，J Biol Chem.，22；276(25)：23028-33，2001)转染的HL-60细胞(美国典型微生物保藏中心，Manassas，VA)用细胞裂解缓冲液(lysis buffer)(25mM Tris-HCl，pH7.4，10mM NaCl，10％甘油，1mM EDTA，0.5％Triton X-100，2mMDTT，1mM PMSF和抑肽酶)裂解。用超声粉碎机将细胞粉碎5秒，利用离心机在14000rpm离心15分钟，取上层液作为蛋白质提取液。将提取的蛋白质与预先结合蛋白A琼脂糖的兔抗gp96抗体(Santa Cruz.CA)混合，然后使沉淀的蛋白质与兔抗gp96抗体(Santa Cruz.CA)及抗-AIMP1抗体(Park S.G.，et al.，J.Biol.Chem.274：16673-16676，1999)进行免疫沉淀，结果确认AIMP1和gp96发生免疫共沉淀(图4)。

从上述结果可知gp96与AIMP1结合。

<实施例2>

研究与AIMP1结合与否对gp96在细胞内的位置的影响

<2-1>AIMP1影响gp96在细胞内的位置

本发明者在AIMP1+/+及AIMP1-/-的MEF中观察了gp96在细胞内的位置。上述AIMP1-/-小鼠用基因陷阱方法(gene trap method(Cecconi，F.& Meyer，B.I.，FEBS Lett.，480：63-71，2000))制备。首先，利用基因陷阱载体VICTR20(Lexicon Genetics，USA)使SvEvBrd小鼠(Lexicon Genetics，USA)的基因组DNA发生突变。将上述突变的基因组DNA导入到来自129/SvEvBrd小鼠(Omnibank)的胚胎干细胞中，制备了突变体文库。从上述文库中筛选含有由于导入基因陷阱载体而被破坏的AIMP1基因的克隆，并将上述克隆命名为“OST58507”。然后，利用上述克隆根据制造商(Lexicon Genetics)的说明制备了杂合(heterozygous)C57/BL6小鼠(Samtako)。将上述杂合小鼠进行交配，获得了145只野生型小鼠(AIMP1+/+)，323只杂合突变小鼠(AIMP+/-)及59只纯合突变小鼠(AIMP1-/-)。

AIMP1+/+及AIMP1-/-的MEF通过Park等人的文献(Park SG，et.al.，Am J Pathol.，166(2)：387-98，2005)记载的方法从12.5日的胚胎中获得。利用1×PBS溶液洗涤MEF细胞，并用100％甲醇溶液固定5分钟。再用1×PBS溶液洗涤，并将抗gp96抗体用含有1％CAS-1的PBS缓冲液以1/100稀释，并使之与细胞反应。再用1×PBS溶液洗涤，现在使之与FITC-(绿色)结合的二抗反应，并观察AIMP1+/+及AIMP1-/-的MEF中gp96在细胞内的位置，结果显示在图2a中。发现在野生型小鼠的MEF中，gp96主要存在于细胞核周边的ER中，而在AIMP1缺陷型小鼠的MEF中，则存在于质膜中(参考图5)。

此外，将含有myc标记的AIMP1的载体使用Lipofectamine2000(Invitrogen)转染AIMP1缺陷型小鼠的MEF，并使之与兔抗gp96抗体(Santa Cruz.CA)或抗myc抗体(9E10)(Santa Cruz.CA)反应，再使之与结合有FITC-(绿色)和TRITC-(红色)的二抗反应，其结果显示在图6。

AIMP1缺陷型小鼠的MEF过表达AIPM1时，gp96又重新出现在ER中(图6)。从上述结果可知，gp96在细胞内的位置受AIMP 1调节。

<2-2>研究AIMP 1对gp96的细胞表面表达水平的影响

gp96是通常存在于ER的HSP90家族成员(Li Z，Dai J，et.al.，Front.Biosci，7：d731-751，2002)。但是已知在灭活或感染条件下gp96在细胞表面表达(Basu，S.，et.al.，Int.Immunol.12：1539-1546，2000；Hilf，N.et al.，Blood 99：3676-3682，2002；Banerjee，P.P.et al.，J.Immunol.，169：3507-3518，2002)。

由于上述实施例<2-1>中确定了gp96在细胞内的位置受AIMP1调节，因此本发明人还观察了gp96的细胞表面表达水平是否也受AIMP1调节。

a.在MEF细胞中分析gp96的细胞表面表达水平

以与上述实施例<2-1>中记载的方法相同的方法分离MEF细胞，并用1×PBS洗涤，然后使之在FACS缓冲液(1×PBS，含有2％FBS、1％BSA和0.1％叠氮钠(sodium azide))悬浮。然后用普通的山羊抗体进行预处理。MEF细胞用1×PBS溶液洗涤，然后在FACS缓冲液中反应30分钟，防止抗体的非特异性反应，之后使以1/100在FACS缓冲液稀释的抗gp96抗体与细胞结合30分钟。之后用1×PBS溶液洗涤，再使之与将二抗以1/200在FACS缓冲液中稀释的溶液反应，并用FACS分析。

结果表明，AIMP1缺陷型小鼠的MEF中，gp96的细胞表面表达水平与野生型小鼠的MEF中的gp96的细胞表面表达水平相比有所增加(参考图7)。

b.脾细胞中gp96的细胞表面表达水平的分析

从以与上述实施例<2-1>中记载的方法相同的方法制备的12周龄的小鼠中分离脾脏，利用细胞过滤网(cell strainer，Becton Dickinson)使细胞悬浮于1×PBS，洗涤后再次用1×PBS悬浮。

从AIMP1+/+及AIMP1-/-中分离的脾脏细胞中的细胞表面水平用FACS分析，结果显示在图8中。

且，在脾脏细胞的细胞表面表达的gp96的水平利用多克隆抗体gp96或抗FAS抗体进行免疫荧光染色，用PI(碘化丙啶，红色)对细胞核染色，并通过免疫荧光显微镜观察，结果显示在图9中。Fas用作细胞表面标记。

上述结果显示，AIMP1-/-脾细胞与AIMP1+/+脾细胞相比，其gp96的细胞表面表达水平高，相反，Fas的细胞表面表达水平没有差异(参考图8及图9)。

c.HeLa细胞中的内在AIMP1被抑制时，对gp96的细胞表面表达水平的分析

将HeLa细胞(ATCC)铺于六孔板，在其50％融合时，按照制造商的指导，利用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)，以使SEQ ID NO：15的AIMP1 siRNA双链(Invitrogen，Carlsbad，CA)的最终浓度为50nm的方式对其进行转染。在对细胞活力没有影响的情况下进行转染后，48小时时内在的AIMP1减少最多。没有用AIMP1的siRNA处理的HeLa细胞作为对照组。

gp96的细胞表面表达水平通过与上述实施例<2-2>b.中记载的方法一样通过FACS分析，其结果在图10的左图显示，并通过与上述实施例1记载的方法一样进行蛋白质印迹试验，其结果显示在图10的右图。

从上述结果可知，利用siRNA抑制HeLa细胞中内在的AIMP1时，gp96的细胞表面表达水平增加。

d.293细胞中AIMP1过表达时gp96的细胞表面表达水平的分析

用含有AIMP1的载体或空载体转染293细胞(ATCC)，然后gp96的细胞表面表达水平通过与上述实施例<2-2>b.记载的方法一样进行FACS分析，其结果显示在图11的左图。

然后，利用Myc抗体和gp96的抗体用与上述实施例1中记载的方法一样进行蛋白质印迹试验，结果显示在图11的右图。

从上述结果可知，AIMP1过表达时gp96的细胞表面表达水平减少。

即，内在地抑制AIMP1时，gp96的细胞表面表达水平增加，而AIMP1在细胞内过表达时，gp96的细胞表面表达水平减少，由此可知gp96的细胞表面表达水平受AIMP1调节。

<实施例3>

对AIMP1缺陷型小鼠的自身免疫疾病表现型的观察

有报道称，制备得到在细胞表面表达gp96的转基因小鼠，上述小鼠的树突细胞(dentric cell)被过度活化，并且上述小鼠发生自身免疫疾病(Liu B，et.al.，Proc Natl.Acad.Sci.USA，100：15824-15829，2003)。

在上述实施例2中确认了gp96的细胞表面表达水平受AIMP1调节，因此本发明人观察了AIMP1缺陷型小鼠是否像上述gp96转染的小鼠一样发生自身免疫疾病。

<3-1>AIMP1缺陷型小鼠中自身抗体的生成与否

利用促凝剂(Becton Dickinson)从通过上述实施例<2-1>记载的方法制备的AIMP1+/+及AIMP1-/-小鼠的血液中分离血清。然后从上述5周龄、9周龄、10周龄、12周龄、15周龄的小鼠肝脏中分离了细胞核，并利用SDS-PAGE分离核蛋白质。然后利用上述自身血清进行蛋白质印迹试验，结果显示在图12。

如图12所示，AIMP1-/-小鼠的核蛋白质与9周龄以后的小鼠的自身血清反应。因此，对于AIMP1-/-小鼠，与野生型小鼠不同，发生了自身免疫疾病。

<3-2>AIMP1缺陷型小鼠中是否生成抗核抗体与肾小球中是否有免疫复合物沉淀

在以上述实施例<3-1>中记载的方法分离的血清中是否可以检出抗核抗体(Antinuclear antibodies(ANA))可通过利用HEP-2包被的切片(slide)(INOVA Diagnostics，Inc，San Diego，CA)的间接免疫荧光方法进行观察。首先将上述切片与用PBS以1∶40稀释的小鼠血清一起孵育30分钟。用PBS洗涤后，添加FITC标记的山羊抗小鼠lg(BDBiosciences，Mountain View，CA)，并继续孵育30分钟。所有试验均在RT的潮湿的暗室进行。然后洗涤切片利用封片剂(Biomeda，FosterCity，CA)封片。然后用荧光显微镜观察。

然后利用低温控制器(cryostat)从上述小鼠中切取肾脏，将这些低温片段用山羊血清封闭，然后用FITC标记的山羊抗小鼠Ig(BDBiosciences，Mountain View,CA)染色，并用免疫荧光显微镜分析。

从上述结果可知，AIMP1-/-小鼠血清中不仅存在抗核抗体(ANA)(图13的上部分)，肾脏的肾小球中也有免疫复合物沉淀(图13的下部分)。

<3-3>AIMP1缺陷型小鼠中是否生成高γ-球蛋白血症

利用夹心ELISA试剂盒(Southern Biotechnology Associates，Birmingham，AL)测定以上述实施例<3-1>中记载的方法分离的血清(分别在五只野生型、五只AIMP1-/-小鼠、四只AIMP1+/-小鼠中分离的血清)中的IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3及IgM的水平。然后利用ELISA试剂盒(BD Bioscience，Mountain View，CA)测定的IgE水平。

其结果如图14所示，AIMP1缺陷型小鼠的血清中的IgG1、IgG2a、IgM及IgE增加，上述小鼠表现出高γ-球蛋白血症。

上述结果显示，AIMP1缺损时会发生狼疮等自身免疫疾病。即，AIMP1与gp96结合可调节gp96的细胞表面表达水平，而AIMP1缺损时gp96的细胞表面表达水平增加，从而导致强烈的免疫反应，产生自身免疫疾病。

<实施例4>

AIMP1与gp96的结合部位鉴定

<4-1>AIMP1或其片段与gp96的结合

如上所述，确认了AIMP1与gp96结合，gp96的细胞表面表达水平受AIMP1调节。本发明人鉴定AIMP1与gp96的结合部位。

由312个氨基酸构成的AIMP1蛋白质(SEQ ID NO：1)是根据本领域公知的Park等人的方法(Park S.G.et al.，J.Biol.Chem.，277：45243-45248，2002)制备。

分别制备了AIMP1的片段，即片段AIMP1-(1-53；SEQ ID NO：3)、AIMP1-(54-192；SEQ ID NO：4)及AIMP1-(193-312；SEQ ID NO：6)。

上述各个片段以AIMP1的cDNA为模板，利用各个片段的特异性引物对(表1)通过PCR扩增合成。PCR反应条件如下：在95℃加热2分钟使模板DNA预变性后，进行25个如下循环：95℃ 30秒、56℃ 30秒及72℃ 1分钟；最后在72℃反应5分钟。上述PCR产物及上述AIMP1蛋白质用EcoRI及XhoI剪切，并连接到用同样的酶剪切的pGEX4T3载体(Amersham biosience公司)。利用上述载体转化大肠杆菌(E.coli)BL21，随后对其进行培养并诱导肽的表达。用GSH琼脂糖纯化表达为GST-tag融合蛋白质的各肽。为了除去脂多糖，将蛋白质溶液用无热原添加的缓冲液(10mM磷酸钾缓冲液，pH 6.0，100mM氯化钠)透析。透析后将蛋白质上样至用相同的缓冲液平衡的多粘菌素树脂(Bio-Rad)，然后孵育20分钟，然后洗脱，制得各AIMP1片段。

【表1】

AIMP1片段制备中使用的引物对

引物	序列	SEQID NO：
引物	序列	SEQID NO：	AIMP1-(1-53)正义	5′-CGG AAT TCA TGG CAA ATA ATG ATG CTG TTC TGAAG-3′	7
AIMP1-(1-53)反义	5′-GTC TCG AGT TAA GCA TTT TCA ACT CGA AGT TTC-3′	8	AIMP1-(1-53)正义	5′-CGG AAT TCA TGG CAA ATA ATG ATG CTG TTC TGAAG-3′	7
AIMP1-(1-53)反义	5′-GTC TCG AGT TAA GCA TTT TCA ACT CGA AGT TTC-3′	8	AIMP1-(54-192)正义	5′-CGGAATTCAAACTGAAGAAA GAAATTGAAG AACTG-3′	9
AIMP1-(54-192)反义	5′-GTCTCGAGTT AGCCACTGAC AACTGTCCTT GG-3′	10	AIMP1-(54-192)正义	5′-CGGAATTCAAACTGAAGAAA GAAATTGAAG AACTG-3′	9
AIMP1-(54-192)反义	5′-GTCTCGAGTT AGCCACTGAC AACTGTCCTT GG-3′	10	AIMP1-(193-312)正义	5′-CGG AAT TCC TGG TGA ATC ATG TTC CTC TTG AAC-3′	11
AIMP1-(193-312)反义	5′-GTC TCG AGT TAT TTG ATT CCA CTG TTG CTC ATG-3′	12	AIMP1-(193-312)正义	5′-CGG AAT TCC TGG TGA ATC ATG TTC CTC TTG AAC-3′	11

纯化的GST-AIMP1片段与HeLa(ATCC)细胞裂解物一起孵育，利用兔抗gp96抗体(Santa Cruz.CA)进行蛋白质印迹试验。精氨酰-tRNA合成酶(RRS)抗体(Jeongwoo Kang，et.al.，J.Biol.Chem.，275：31682-31688，200)为对照组进行了实验。在含有120mM NaCl、10mM KCl和0.5％Triton X-100的25mM Tris-HCl缓冲液中进行了结合分析。

试验结果如图15所示，AIMP1与gp96结合的部位与用作对照组的RRS的结合部位不同。即，AIMP1的54-192部位与gp96结合。

<4-2>gp96片段和AIMP1的结合

gp96分为3个功能结构域。即，已知SEQ ID NO：11的gp96的22至287部位是与核苷酸/格尔得霉素(Geldanamycin)结合关联的部位，而288至368部位为酸性结构域(Li Z，Dai J，Zheng H，Liu B，Caudill M：An integrated view of the roles and mechanisms of heatshock protein gp96-peptide complex in eliciting immune response.Front.Biosci 2002，7：d731-751)。

此外，已知699-799部位是参与gp96聚合和自体组装(self assembly)的结构域(Li Z，Dai J，Zheng H，Liu B，Caudill M：An integrated viewof the roles and mechanisms of heat shock protein gp96-peptidecomplex in eliciting immune response.Front.Biosci 2002，7：d731-751.)。

因此，为了研究上述gp96的功能性结构域对gp96和AIMP1的结合起到何种影响，分别制备了gp96-(22-287；SEQ ID NO：15)、gp96-(288-368；SEQ ID NO：16)、gp96-(369-698；SEQ ID NO：17)及gp96-(699-799；SEQ ID NO：18)的片段。

上述各片段是以gp96的cDNA为模板、利用各片段的特异性引物对(表2)进行PCR扩增而合成。PCR反应条件如下：在95℃加热2分钟使模板DNA预变性后，进行30个如下循环：95℃ 30秒、56℃ 30秒及72℃ 1分钟；最后在72℃最终反应5分钟。上述PCR产物用EcoRI及SalI剪切，并连接到用同样的酶剪切的pGEX4T3载体(Amershambiosience公司)。利用上述载体转化大肠杆菌BL21，随后对其进行培养并诱导肽的表达。用GSH琼脂糖纯化表达为GST-tag融合蛋白质的各肽。为了除去脂多糖，将蛋白质溶液用无热原添加的缓冲液(10mM磷酸钾缓冲液，pH 6.0，100mM氯化钠)透析。透析后将蛋白质上样至用缓冲液平衡的多粘菌素树脂(Bio-Rad)，然后孵育20分钟，然后洗脱，制得各gp96片段。

【表2】

gp96的片段制备中所使用的引物对

引物	序列	SEQ IDNO：
引物	序列	SEQ IDNO：	gp96-(22-287)正义	5′-GCC GAA TTC GAT GGA CGA TGA AGT TGA TGT GGA TGG-3′	20
gp96-(22-287)反义	5′-CTT GTC GAC TTA TTC AGT CTT GCT GCT CCA TAC-3′	21	gp96-(22-287)正义	5′-GCC GAA TTC GAT GGA CGA TGA AGT TGA TGT GGA TGG-3′	20
gp96-(22-287)反义	5′-CTT GTC GAC TTA TTC AGT CTT GCT GCT CCA TAC-3′	21	gp96-(288-368)正义	5′-GCC GAA TTC GAT GAC TGT TGA GGA GCC CAT GGA GG-3′	22
gp96-(288-388)反义	5′-CTT GTC GAC TTA GTC ATC ACT TTC CTT TGA AAA TGA TTG-3′	23	gp96-(288-368)正义	5′-GCC GAA TTC GAT GAC TGT TGA GGA GCC CAT GGA GG-3′	22
gp96-(288-388)反义	5′-CTT GTC GAC TTA GTC ATC ACT TTC CTT TGA AAA TGA TTG-3′	23	gp96-(369-698)正义	5′-GCC GAA TTC GAT GCC CAT GGC TTA TAT TCA CTT TAC TG-3′	24
gp96-(369-698)反义	5′-CTT GTC GAC TTA CAT GTC TCT GAT CAG CGG GTG-3′	25	gp96-(369-698)正义	5′-GCC GAA TTC GAT GCC CAT GGC TTA TAT TCA CTT TAC TG-3′	24
gp96-(369-698)反义	5′-CTT GTC GAC TTA CAT GTC TCT GAT CAG CGG GTG-3′	25	gp96-(699-799)正义	5′-GCC GAA TTC GAT GCT TCG ACG AAT TAA GGA AGA TGA AG-3′	26
gp96-(699-799)反义	5′-CTT GTC GAC TTA TTC AGC TGT AGA TTC CTT TGC TG-3′	27	gp96-(699-799)正义	5′-GCC GAA TTC GAT GCT TCG ACG AAT TAA GGA AGA TGA AG-3′	26

纯化的GST-gp96片段与AIMP1一起培养后，利用抗AIMP1抗体进行蛋白质印迹试验，结果在图16中显示。

结果发现，参与gp96的低聚反应的结构域gp96-(699-799；SEQ IDNO：18)与AIMP1结合。

从上述结果可知，SEQ ID NO：4的AIMP1的54至192部位与SEQID NO：18的gp96的99-799部位结合。

<4-3>对gp96变体和AIMP1的结合程度的观察

本发明者在上述实施例<2-2>中确认SEQ ID NO：1的AIMP1的54至192部位与SEQ ID NO：13的gp96的699-799部位结合。为了对此进一步确认，观察作为在GenBank中记载的gp96的SNP即E791(E791Δ)变体是否与AIMP1结合，所述gp96的SNP为在gp96与AMPI1的结合部位699-799部位中有一个变异的SNP。为了观察E791(E791Δ)变体是否与AIMP1结合，分别制备了野生型gp96-(288-799)片段和变体gp96-(288-799，E791Δ)片段。

上述各片段以gp96的cDNA为模板、利用各片段的特异性引物对(表3)进行PCR扩增来合成。PCR反应条件如下：在95℃加热2分钟使模板DNA预变性后，以95℃ 30秒、56℃ 30秒及72℃ 2分钟为一个循环，一共进行30个循环，最后在72℃反应5分钟。上述PCR产物用EcoRI及SalI剪切，并连接到用同样的酶剪切的pET28c载体(Novagen)。利用上述载体转化大肠杆菌BL21，然后对其进行培养并诱导肽的表达。用镍柱纯化表达为His-tag融合蛋白质的各肽。为了除去脂多糖，将蛋白质溶液用热原添加的缓冲液(10mM磷酸钾缓冲液，pH6.0，100mM氯化钠)透析。透析后将蛋白质上样至用相同的缓冲液平衡的多粘菌素树脂(Bio-Rad)，然后孵育20分钟，然后洗脱，制得各gp96蛋白质片段。

【表3】

gp96的片段制备中所使用的引物对

引物	序列	SEQ IDNO：
引物	序列	SEQ IDNO：	gp96-(288-799)正义	5′-GCC GAA TTC GAT GGA CGA TGA AGT TGA TGT GGA TGG-3′	28
gp96-(288-799)反义	5′-CTT GTC GAC TTA TTC AGC TGT AGA TTC CTT TGC TG-3′	29	gp96-(288-799)正义	5′-GCC GAA TTC GAT GGA CGA TGA AGT TGA TGT GGA TGG-3′	28
gp96-(288-799)反义	5′-CTT GTC GAC TTA TTC AGC TGT AGA TTC CTT TGC TG-3′	29	gp96-(E791Δ)反义	5′-CTT gTC gAC TTA TTC AgC TgT AgA TTC CTT TgC TgT TTC TTCTTC ATC TgT TCC CAC ATC CAT TTC TTC ATC-3′	30

纯化的gp96蛋白质与GST或GST-AIMP1一起培养后，使其与兔抗gp96抗体(Santa Cruz.CA)进行免疫共沉淀，结果显示在图17中。如图17所示，E791(E791Δ)变体与野生型gp96相比，与AIMP1的亲和度显著下降。由此可知，在gp96与AIMP1的结合中gp96的699-799部位是重要的。

<实施例5>

自身免疫疾病患者的血液中AIMP1水平的测定

由于本发明人已经在上述<实施例3>中确认AIMP1缺陷型小鼠会发生自身免疫疾病，因此观察自身免疫疾病患者的血液样本中的AIMP1水平将如何变化。

取158名SLE(全身性红斑狼疮)患者和99名正常人的血液，用ELISA方法测定AIMP1蛋白质的水平。通过如下方法制备了识别AIMP1的N端的AIMP1单克隆抗体和识别C端的AIMP1单克隆抗体。将100μg AIMP1蛋白质抗原注射到小鼠腹腔中。为了增加B细胞克隆，以约一个月为间隔实施3～4次免疫，实施最后免疫3日后，将小鼠处死摘取脾脏。将脾脏细胞和骨髓瘤细胞(myeloma cell)混合，然后加入50％的PEG1000(聚乙二醇，分子量为1000)，从而产生细胞融合制得杂交瘤。细胞融合后用培养液洗涤PEG，然后将细胞在HAT培养液的悬液(suspension)均匀地分配至96孔板。这里选择阳性克隆(特异性识别AIMP1的N端和C端的克隆)培养后，将培养细胞注射到小鼠腹腔中培养。约10日后取小鼠的腹水(约5～6ml)，分别提纯识别AIMP1的N端的单克隆抗体和识别AIMP1的C端的单克隆抗体。

将如此制备的识别AIMP1的N端的单克隆抗体溶解到PBS缓冲液(pH 7.4)中，并以200ng/孔涂布96孔板(Maxisorp.，F96；Nunc)。洗涤后，使之与阻断缓冲液(含1％BSA(牛血清白蛋白)的PBS缓冲液)反应1小时。从上述采取的各血液样本中分离血清，并将各血清放入各孔中，加入含1％BSA的1×PBS调为100μl。培养2小时后，洗涤培养板，并与识别AIMP1的C端的结合有HRP的AIMP1单克隆抗体一起培养。洗涤上述培养板，并在各孔中添加底物反应溶液，在450nm测定吸光度。另外，图19示出了通过将纯化的AIMP1蛋白质的浓度调整为0、0.31、0.63、1.25、2.5、5、10、20ng/ml同时进行ELISA方法测得的吸光度值作为标准的血清内AIMP1蛋白质水平。

如上所述，AIMP1与gp96结合，从而调节gp96在细胞内的位置，结果是细胞表面存在的gp96的量和与之相伴的免疫反应被调节。据动物实验结果推测，虽然已知gp96在细胞表面过度暴露时会诱导自身免疫疾病，但是对于自身免疫患者，细胞内gp96和AIMP1的结合被破坏，则gp96更多地在细胞表面表达，AIMP1被分泌到细胞外，大量存在于血液内，这已经通过图19所示结果被确认。即。可以确认SLE患者血清中的AIMP1的水平比正常人血清中的AIMP1水平要高(参考图19)。从上述结果可知AIMP在血液内的水平可作为诊断自身免疫疾病的新指标。

[工业上的利用]

如上所述，本发明人首次发现：SEQ ID NO：4所示AIMP1的54-192部位与SEQ ID NO：18所示gp96的699-799部位直接结合，帮助gp96保留在内质网(ER)，从而抑制其向细胞表面的移动，进而调节存在于细胞表面的gp96的量及与之相伴的免疫反应。因此，可利用AIMP1的54-192部位和SEQ ID NO：18所示gp96的699-799部位的结合筛选免疫调节剂、抗癌剂及自身免疫疾病治疗剂。此外，上述结合被破坏时不能进行免疫调节，因而会诱发自身免疫疾病，因此用于测定AIMP1蛋白质水平的AIMP1蛋白质特异性抗体可用作诊断自身免疫疾病的新指标。

序列表

<110>伊玛吉恩有限公司(Imagene Co.，LTD.)

<120>免疫调节剂的筛选方法

<130>OP07-0006

<160>30

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>312

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

Met Ala Asn Asn Asp Ala Val Leu Lys Arg Leu Glu Gln Lys Gly Ala

1 5 10 15

Glu Ala Asp Gln Ile Ile Glu Tyr Leu Lys Gln Gln Val Ser Leu Leu

20 25 30

Lys Glu Lys Ala Ile Leu Gln Ala Thr Leu Arg Glu Glu Lys Lys Leu

35 40 45

Arg Val Glu Asn Ala Lys Leu Lys Lys Glu Ile Glu Glu Leu Lys Gln

50 55 60

Glu Leu Ile Gln Ala Glu Ile Gln Asn Gly Val Lys Gln Ile Ala Phe

65 70 75 80

Pro Ser Gly Thr Pro Leu His Ala Asn Ser Met Val Ser Glu Asn Val

85 90 95

Ile Gln Ser Thr Ala Val Thr Thr Val Ser Ser Gly Thr Lys Glu Gln

100 105 110

Ile Lys Gly Gly Thr Gly Asp Glu Lys Lys Ala Lys Glu Lys Ile Glu

115 120 125

Lys Lys Gly Glu Lys Lys Glu Lys Lys Gln Gln Ser Ile Ala Gly Ser

130 135 140

Ala Asp Ser Lys Pro Ile Asp Val Ser Arg Leu Asp Leu Arg Ile Gly

145 150 155 160

Cys Ile Ile Thr Ala Arg Lys His Pro Asp Ala Asp Ser Leu Tyr Val

165 170 175

Glu Glu Val Asp Val Gly Glu Ile Ala Pro Arg Thr Val Val Ser Gly

180 185 190

Leu Val Asn His Val Pro Leu Glu Gln Met Gln Asn Arg Met Val Ile

195 200 205

Leu Leu Cys Asn Leu Lys Pro Ala Lys Met Arg Gly Val Leu Ser Gln

210 215 220

Ala Met Val Met Cys Ala Ser Ser Pro Glu Lys Ile Glu Ile Leu Ala

225 230 235 240

Pro Pro Asn Gly Ser Val Pro Gly Asp Arg Ile Thr Phe Asp Ala Phe

245 250 255

Pro Gly Glu Pro Asp Lys Glu Leu Asn Pro Lys Lys Lys Ile Trp Glu

260 265 270

Gln Ile Gln Pro Asp Leu His Thr Asn Asp Glu Cys Val Ala Thr Tyr

275 280 285

Lys Gly Val Pro Phe Glu Val Lys Gly Lys Gly Val Cys Arg Ala Gln

290 295 300

Thr Met Ser Asn Ser Gly Ile Lys

305 310

<210>2

<211>936

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

atggcaaata atgatgctgt tctgaagaga ctggagcaga agggtgcaga ggcagatcaa 60

atcattgaat atcttaagca gcaagtttct ctacttaagg agaaagcaat tttgcaggca 120

actttgaggg aagagaagaa acttcgagtt gaaaatgcta aactgaagaa agaaattgaa 180

gaactgaaac aagagctaat tcaggcagaa attcaaaatg gagtgaaaca aataccattt 240

ccatctggta ctccactgca cgctaattct atggtttctg aaaatgtgat acagtctaca 300

gcagtaacaa ccgtatcttc tggtaccaaa gaacagataa aaggaggaac aggagacgaa 360

aagaaagcga aagagaaaat tgaaaagaaa ggagagaaga aggagaaaaa acagcaatca 420

atagctggaa gtgccgactc taagccaata gatgtttccc gtctggatct tcgaattggt 480

tgcatcataa ctgctagaaa acaccctgat gcagattctt tgtatgtgga agaagtagat 540

gtcggagaaa tagccccaag gacagttgtc agtggcctgg tgaatcatgt tcctcttgaa 600

cagatgcaaa atcggatggt gattttactt tgtaacctga aacctgcaaa gatgagggga 660

gtattatctc aagcaatggt catgtgtgct agttcaccag agaaaattga aatcttggct 720

cctccaaatg ggtctgttcc tggagacaga attacttttg atgctttccc aggagagcct 780

gacaaggagc tgaatcctaa gaagaagatt tgggagcaga tccagcctga tcttcacact 840

aatgatgagt gtgtggctac atacaaagga gttccctttg aggtgaaagg gaagggagta 900

tgtagggctc aaaccatgag caacagtgga atcaaa 936

<210>3

<211>53

<212>pRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>3

Met Ala Asn Asn Asp Ala Val Leu Lys Arg Leu Glu Gln Lys Gly Ala

1 5 10 15

Glu Ala Asp Gln Ile Ile Glu Tyr Leu Lys Gln Gln Val Ser Leu Leu

20 25 30

Lys Glu Lys Ala Ile Leu Gln Ala Thr Leu Arg Glu Glu Lys Lys Leu

35 40 45

Arg Val Glu Asn Ala

50

<210>4

<211>139

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>4

Lys Leu Lys Lys Glu Ile Glu Glu Leu Lys Gln Glu Leu Ile Gln Ala

1 5 10 15

Glu Ile Gln Asn Gly Val Lys Gln Ile Ala Phe Pro Ser Gly Thr Pro

20 25 30

Leu His Ala Asn Ser Met Val Ser Glu Asn Val Ile Gln Ser Thr Ala

35 40 45

Val Thr Thr Val Ser Ser Gly Thr Lys Glu Gln Ile Lys Gly Gly Thr

50 55 60

Gly Asp Glu Lys Lys Ala Lys Glu Lys Ile Glu Lys Lys Gly Glu Lys

65 70 75 80

Lys Glu Lys Lys Gln Gln Ser Ile Ala Gly Ser Ala Asp Ser Lys Pro

85 90 95

Ile Asp Val Ser Arg Leu Asp Leu Arg Ile Gly Cys Ile Ile Thr Ala

100 105 110

Arg Lys His Pro Asp Ala Asp Ser Leu Tyr Val Glu Glu Val Asp Val

115 120 125

Gly Glu Ile Ala Pro Arg Thr Val Val Ser Gly

130 135

<210>5

<211>417

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>5

aaactgaaga aagaaattga agaactgaaa caagagctaa ttcaggcaga aattcaaaat 60

ggagtgaagc aaataccatt tccatctggt actccactgc acgctaattc tatggtttct 120

gaaaatgtga tacagtctac agcagtaaca accgtatctt ctggtaccaa agaacagata 180

aaaggaggaa caggagacga aaagaaagcg aaagagaaaa ttgaaaagaa aggagagaag 240

aaggagaaaa aacagcaatc aatagctgga agtgccgact ctaagccaat agatgtttcc 300

cgtctggatc ttcgaattgg ttgcatcata actgctagaa aacaccctga tgcagattct 360

ttgtatgtgg aagaagtaga tgtcggagaa atagccccaa ggacagttgt cagtggc 417

<210>6

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>6

Leu Val Asn His Val Pro Leu Glu Gln Met Gln Asn Arg Met Val Ile

1 5 10 15

Leu Leu Cys Asn Leu Lys Pro Ala Lys Met Arg Gly Val Leu Ser Gln

20 25 30

Ala Met Val Met Cys Ala Ser Ser Pro Glu Lys Ile Glu Ile Leu Ala

35 40 45

Pro Pro Asn Gly Ser Val Pro Gly Asp Arg Ile Thr Phe Asp Ala Phe

50 55 60

Pro Gly Glu Pro Asp Lys Glu Leu Asn Pro Lys Lys Lys Ile Trp Glu

65 70 75 80

Gln Ile Gln Pro Asp Leu His Thr Asn Asp Glu Cys Val Ala Thr Tyr

85 90 95

Lys Gly Val Pro Phe Glu Val Lys Gly Lys Gly Val Cys Arg Ala Gln

100 105 110

Thr Met Ser Asn Ser Gly Ile Lys

115 120

<210>7

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AIMP1-(1-53)正义引物

<400>7

cggaattcat ggcaaataat gatgctgttc tgaag 35

<210>8

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AIMP1-(1-53)反义引物

<400>8

gtctcgagtt aagcattttc aactcgaagt ttc 33

<210>9

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AIMP1-(54-192)正义引物

<400>9

cggaattcaa actgaagaaa gaaattgaag aactg 35

<210>10

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AIMP1-(54-192)反义引物

<400>10

gtctcgagtt agccactgac aactgtcctt gg 32

<210>11

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AIMP1-(193-312)正义引物

<400>11

cggaattcct ggtgaatcat gttcctcttg aac 33

<210>12

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AIMP1-(193-312)反义引物

<400>12

gtctcgagtt atttgattcc actgttgctc atg 33

<210>13

<211>803

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>13

Met Arg Ala Leu Trp Val Leu Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Thr Phe

1 5 10 15

Gly Ser Val Arg Ala Asp Asp Glu Val Asp Val Asp Gly Thr Val Glu

20 25 30

Glu Asp Leu Gly Lys Ser Arg Glu Gly Ser Arg Thr Asp Asp Glu Val

35 40 45

Val Gln Arg Glu Glu Glu Ala Ile Gln Leu Asp Gly Leu Asn Ala Ser

50 55 60

Gln Ile Arg Glu Leu Arg Glu Lys Ser Glu Lys Phe Ala Phe Gln Ala

65 70 75 80

Glu Val Asn Arg Met Met Lys Leu Ile Ile Asn Ser Leu Tyr Lys Asn

85 90 95

Lys Glu Ile Phe Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu

100 105 110

Asp Lys Ile Arg Leu Ile Ser Leu Thr Asp Glu Asn Ala Leu Ser Gly

115 120 125

Asn Glu Glu Leu Thr Val Lys Ile Lys Cys Asp Lys Glu Lys Asn Leu

130 135 140

Leu His Val Thr Asp Thr Gly Val Gly Met Thr Arg Glu Glu Leu Val

145 150 155 160

Lys Asn Leu Gly Thr Ile Ala Lys Ser Gly Thr Ser Glu Phe Leu Asn

165 170 175

Lys Met Thr Glu Ala Gln Glu Asp Gly Gln Ser Thr Ser Glu Leu Ile

180 185 190

Gly Gln Phe Gly Val Gly Phe Tyr Ser Ala Phe Leu Val Ala Asp Lys

195 200 205

Val Ile Val Thr Ser Lys His Asn Asn Asp Thr Gln His Ile Trp Glu

210 215 220

Ser Asp Ser Asn Glu Phe Ser Val Ile Ala Asp Pro Arg Gly Asn Thr

225 230 235 240

Leu Gly Arg Gly Thr Thr Ile Thr Leu Val Leu Lys Glu Glu Ala Ser

245 250 255

Asp Tyr Leu Glu Leu Asp Thr Ile Lys Asn Leu Val Lys Lys Tyr Ser

260 265 270

Gln Phe Ile Asn Phe Pro Ile Tyr Val Trp Ser Ser Lys Thr Glu Thr

275 280 285

Val Glu Glu Pro Met Glu Glu Glu Glu Ala Ala Lys Glu Glu Lys Glu

290 295 300

Glu Ser Asp Asp Glu Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys

305 310 315 320

Pro Lys Thr Lys Lys Val Glu Lys Thr Val Trp Asp Trp Glu Leu Met

325 330 335

Asn Asp Ile Lys Pro Ile Trp Gln Arg Pro Ser Lys Glu Val Glu Glu

340 345 350

Asp Glu Tyr Lys Ala Phe Tyr Lys Ser Phe Ser Lys Glu Ser Asp Asp

355 360 365

Pro Met Ala Tyr Ile His Phe Thr Ala Glu Gly Glu Val Thr Phe Lys

370 375 380

Ser Ile Leu Phe Val Pro Thr Ser Ala Pro Arg Gly Leu Phe Asp Glu

385 390 395 400

Tyr Gly Ser Lys Lys Ser Asp Tyr Ile Lys Leu Tyr Val Arg Arg Val

405 410 415

Phe Ile Thr Asp Asp Phe His Asp Met Met Pro Lys Tyr Leu Asn Phe

420 425 430

Val Lys Gly Val Val Asp Ser Asp Asp Leu Pro Leu Asn Val Ser Arg

435 440 445

Glu Thr Leu Gln Gln His Lys Leu Leu Lys Val Ile Arg Lys Lys Leu

450 455 460

Val Arg Lys Thr Leu Asp Met Ile Lys Lys Ile Ala Asp Asp Lys Tyr

465 470 475 480

Asn Asp Thr Phe Trp Lys Glu Phe Gly Thr Asn Ile Lys Leu Gly Val

485 490 495

Ile Glu Asp His Ser Asn Arg Thr Arg Leu Ala Lys Leu Leu Arg Phe

500 505 510

Gln Ser Ser His His Pro Thr Asp Ile Thr Ser Leu Asp Gln Tyr Val

515 520 525

Glu Arg Met Lys Glu Lys Gln Asp Lys Ile Tyr Phe Met Ala Gly Ser

530 535 540

Ser Arg Lys Glu Ala Glu Ser Ser Pro Phe Val Glu Arg Leu Leu Lys

545 550 555 560

Lys Gly Tyr Glu Val Ile Tyr Leu Thr Glu Pro Val Asp Glu Tyr Cys

565 570 575

Ile Gln Ala Leu Pro Glu Phe Asp Gly Lys Arg Phe Gln Asn Val Ala

580 585 590

Lys Glu Gly Val Lys Phe Asp Glu Ser Glu Lys Thr Lys Glu Ser Arg

595 600 605

Glu Ala Val Glu Lys Glu Phe Glu Pro Leu Leu Asn Trp Met Lys Asp

610 615 620

Lys Ala Leu Lys Asp Lys Ile Glu Lys Ala Val Val Ser Gln Arg Leu

625 630 635 640

Thr Glu Ser Pro Cys Ala Leu Val Ala Ser Gln Tyr Gly Trp Ser Gly

645 650 655

Asn Met Glu Arg Ile Met Lys Ala Gln Ala Tyr Gln Thr Gly Lys Asp

660 665 670

Ile Ser Thr Asn Tyr Tyr Ala Ser Gln Lys Lys Thr Phe Glu Ile Asn

675 680 685

Pro Arg His Pro Leu Ile Arg Asp Met Leu Arg Arg Ile Lys Glu Asp

690 695 700

Glu Asp Asp Lys Thr Val Leu Asp Leu Ala Val Val Leu Phe Glu Thr

705 710 715 720

Ala Thr Leu Arg Ser Gly Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Lys Ala Tyr Gly

725 730 735

Asp Arg Ile Glu Arg Met Leu Arg Leu Ser Leu Asn Ile Asp Pro Asp

740 745 750

Ala Lys Val Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Glu

755 760 765

Asp Thr Thr Glu Asp Thr Glu Gln Asp Glu Asp Glu Glu Met Asp Val

770 775 780

Gly Thr Asp Glu Glu Glu Glu Thr Ala Lys Glu Ser Thr Ala Glu Lys

785 790 795 800

Asp Glu Leu

<210>14

<211>2409

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>14

atgagggccc tgtgggtgct gggcctctgc tgcgtcctgc tgaccttcgg gtcggtcaga 60

gctgacgatg aagttgatgt ggatggtaca gtagaagagg atctgggtaa aagtagagaa 120

ggatcaagga cggatgatga agtagtacag agagaggaag aagctattca gttggatgga 180

ttaaatgcat cacaaataag agaacttaga gagaagtcgg aaaagtttgc cttccaagcc 240

gaagttaaca gaatgatgaa acttatcatc aattcattgt ataaaaataa agagattttc 300

ctgagagaac tgatttcaaa tgcttctgat gctttagata agataaggct aatatcactg 360

actgatgaaa atgctctttc tggaaatgag gaactaacag tcaaaattaa gtgtgataag 420

gagaagaacc tgctgcatgt cacagacacc ggtgtaggaa tgaccagaga agagttggtt 480

aaaaaccttg gtaccatagc caaatctggg acaagcgagt ttttaaacaa aatgactgaa 540

gcacaggaag atggccagtc aacttctgaa ttgattggcc agtttggtgt cggtttctat 600

tccgccttcc ttgtagcaga taaggttatt gtcacttcaa aacacaacaa cgatacccag 660

cacatctggg agtctgactc caatgaattt tctgtaattg ctgacccaag aggaaacact 720

ctaggacggg gaacgacaat tacccttgtc ttaaaagaag aagcatctga ttaccttgaa 780

ttggatacaa ttaaaaatct cgtcaaaaaa tattcacagt tcataaactt tcctatttat 840

gtatggagca gcaagactga aactgttgag gagcccatgg aggaagaaga agcagccaaa 900

gaagagaaag aagaatctga tgatgaagct gcagtagagg aagaagaaga agaaaagaaa 960

ccaaagacta aaaaagttga aaaaactgtc tgggactggg aacttatgaa tgatatcaaa 1020

ccaatatggc agagaccatc aaaagaagta gaagaagatg aatacaaagc tttctacaaa 1080

tcattttcaa aggaaagtga tgaccccatg gcttatattc actttactgc tgaaggggaa 1140

gttaccttca aatcaatttt atttgtaccc acatctgctc cacgtggtct gtttgacgaa 1200

tatggatcta aaaagagcga ttacattaag ctctatgtgc gccgtgtatt catcacagac 1260

gacttccatg atatgatgcc taaatacctc aattttgtca agggtgtggt ggactcagat 1320

gatctcccct tgaatgtttc ccgcgagact cttcagcaac ataaactgct taaggtgatt 1380

aggaagaagc ttgttcgtaa aacgctggac atgatcaaga agattgctga tgataaatac 1440

aatgatactt tttggaaaga atttggtacc aacatcaagc ttggtgtgat tgaagaccac 1500

tcgaatcgaa cacgtcttgc taaacttctt aggttccagt cttctcatca tccaactgac 1560

attactagcc tagaccagta tgtggaaaga atgaaggaaa aacaagacaa aatctacttc 1620

atggctgggt ccagcagaaa agaggctgaa tcttctccat ttgttgagcg acttctgaaa 1680

aagggctatg aagttattta cctcacagaa cctgtggatg aatactgtat tcaggccctt 1740

cccgaatttg atgggaagag gttccagaat gttgccaagg aaggagtgaa gttcgatgaa 1800

agtgagaaaa ctaaggagag tcgtgaagca gttgagaaag aatttgagcc tctgctgaat 1860

tggatgaaag ataaagccct taaggacaag attgaaaagg ctgtggtgtc tcagcgcctg 1920

acagaatctc cgtgtgcttt ggtggccagc cagtacggat ggtctggcaa catggagaga 1980

atcatgaaag cacaagcgta ccaaacgggc aaggacatct ctacaaatta ctatgcgagt 2040

cagaagaaaa catttgaaat taatcccaga cacccgctga tcagagacat gcttcgacga 2100

attaaggaag atgaagatga taaaacagtt ttggatcttg ctgtggtttt gtttgaaaca 2160

gcaacgcttc ggtcagggta tcttttacca gacactaaag catatggaga tagaatagaa 2220

agaatgcttc gcctcagttt gaacattgac cctgatgcaa aggtggaaga agagcccgaa 2280

gaagaacctg aagagacagc agaagacaca acagaagaca cagagcaaga cgaagatgaa 2340

gaaatggatg tgggaacaga tgaagaagaa gaaacagcaa aggaatctac agctgaaaaa 2400

gatgaattg 2409

<210>15

<211>266

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>15

Asp Asp Glu Val Asp Val Asp Gly Thr Val Glu Glu Asp Leu Gly Lys

1 5 10 15

Ser Arg Glu Gly Ser Arg Thr Asp Asp Glu Val Val Gln Arg Glu Glu

20 25 30

Glu Ala Ile Gln Leu Asp Gly Leu Asn Ala Ser Gln Ile Arg Glu Leu

35 40 45

Arg Glu Lys Ser Glu Lys Phe Ala Phe Gln Ala Glu Val Asn Arg Met

50 55 60

Met Lys Leu Ile Ile Asn Ser Leu Tyr Lys Asn Lys Glu Ile Phe Leu

65 70 75 80

Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu Asp Lys Ile Arg Leu

85 90 95

Ile Ser Leu Thr Asp Glu Asn Ala Leu Ser Gly Asn Glu Glu Leu Thr

100 105 110

Val Lys Ile Lys Cys Asp Lys Glu Lys Asn Leu Leu His Val Thr Asp

115 120 125

Thr Gly Val Gly Met Thr Arg Glu Glu Leu Val Lys Asn Leu Gly Thr

130 135 140

Ile Ala Lys Ser Gly Thr Ser Glu Phe Leu Asn Lys Met Thr Glu Ala

145 150 155 160

Gln Glu Asp Gly Gln Ser Thr Ser Glu Leu Ile Gly Gln Phe Gly Val

165 170 175

Gly Phe Tyr Ser Ala Phe Leu Val Ala Asp Lys Val Ile Val Thr Ser

180 185 190

Lys His Asn Asn Asp Thr Gln His Ile Trp Glu Ser Asp Ser Asn Glu

195 200 205

Phe Ser Val Ile Ala Asp Pro Arg Gly Asn Thr Leu Gly Arg Gly Thr

210 215 220

Thr Ile Thr Leu Val Leu Lys Glu Glu Ala Ser Asp Tyr Leu Glu Leu

225 230 235 240

Asp Thr Ile Lys Asn Leu Val Lys Lys Tyr Ser Gln Phe Ile Asn Phe

245 250 255

Pro Ile Tyr Val Trp Ser Ser Lys Thr Glu

260 265

<210>16

<211>81

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>16

Thr Val Glu Glu Pro Met Glu Glu Glu Glu Ala Ala Lys Glu Glu Lys

1 5 10 15

Glu Glu Ser Asp Asp Glu Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys

20 25 30

Lys Pro Lys Thr Lys Lys Val Glu Lys Thr Val Trp Asp Trp Glu Leu

35 40 45

Met Asn Asp Ile Lys Pro Ile Trp Gln Arg Pro Ser Lys Glu Val Glu

50 55 60

Glu Asp Glu Tyr Lys Ala Phe Tyr Lys Ser Phe Ser Lys Glu Ser Asp

65 70 75 80

Asp

<210>17

<211>330

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>17

Pro Met Ala Tyr Ile His Phe Thr Ala Glu Gly Glu Val Thr Phe Lys

1 5 10 15

Ser Ile Leu Phe Val Pro Thr Ser Ala Pro Arg Gly Leu Phe Asp Glu

20 25 30

Tyr Gly Ser Lys Lys Ser Asp Tyr Ile Lys Leu Tyr Val Arg Arg Val

35 40 45

Phe Ile Thr Asp Asp Phe His Asp Met Met Pro Lys Tyr Leu Asn Phe

50 55 60

Val Lys Gly Val Val Asp Ser Asp Asp Leu Pro Leu Asn Val Ser Arg

65 70 75 80

Glu Thr Leu Gln Gln His Lys Leu Leu Lys Val Ile Arg Lys Lys Leu

85 90 95

Val Arg Lys Thr Leu Asp Met Ile Lys Lys Ile Ala Asp Asp Lys Tyr

100 105 110

Asn Asp Thr Phe Trp Lys Glu Phe Gly Thr Asn Ile Lys Leu Gly Val

115 120 125

Ile Glu Asp His Ser Asn Arg Thr Arg Leu Ala Lys Leu Leu Arg Phe

130 135 140

Gln Ser Ser His His Pro Thr Asp Ile Thr Ser Leu Asp Gln Tyr Val

145 150 155 160

Glu Arg Met Lys Glu Lys Gln Asp Lys Ile Tyr Phe Met Ala Gly Ser

165 170 175

Ser Arg Lys Glu Ala Glu Ser Ser Pro Phe Val Glu Arg Leu Leu Lys

180 185 190

Lys Gly Tyr Glu Val Ile Tyr Leu Thr Glu Pro Val Asp Glu Tyr Cys

195 200 205

Ile Gln Ala Leu Pro Glu Phe Asp Gly Lys Arg Phe Gln Asn Val Ala

210 215 220

Lys Glu Gly Val Lys Phe Asp Glu Ser Glu Lys Thr Lys Glu Ser Arg

225 230 235 240

Glu Ala Val Glu Lys Glu Phe Glu Pro Leu Leu Asn Trp Met Lys Asp

245 250 255

Lys Ala Leu Lys Asp Lys Ile Glu Lys Ala Val Val Ser Gln Arg Leu

260 265 270

Thr Glu Ser Pro Cys Ala Leu Val Ala Ser Gln Tyr Gly Trp Ser Gly

275 280 285

Asn Met Glu Arg Ile Met Lys Ala Gln Ala Tyr Gln Thr Gly Lys Asp

290 295 300

Ile Ser Thr Asn Tyr Tyr Ala Ser Gln Lys Lys Thr Phe Glu Ile Asn

305 310 315 320

Pro Arg His Pro Leu Ile Arg Asp Met Leu

325 330

<210>18

<211>101

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>18

Arg Arg Ile Lys Glu Asp Glu Asp Asp Lys Thr Val Leu Asp Leu Ala

1 5 10 15

Val Val Leu Phe Glu Thr Ala Thr Leu Arg Ser Gly Tyr Leu Leu Pro

20 25 30

Asp Thr Lys Ala Tyr Gly Asp Arg Ile Glu Arg Met Leu Arg Leu Ser

35 40 45

Leu Asn Ile Asp Pro Asp Ala Lys Val Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu

50 55 60

Pro Glu Glu Thr Ala Glu Asp Thr Thr Glu Asp Thr Glu Gln Asp Glu

65 70 75 80

Asp Glu Glu Met Asp Val Gly Thr Asp Glu Glu Glu Glu Thr Ala Lys

85 90 95

Glu Ser Thr Ala Glu

100

<210>19

<211>303

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>19

cgacgaatta aggaagatga agatgataaa acagttttgg atcttgctgt ggttttgttt 60

gaaacagcaa cgcttcggtc agggtatctt ttaccagaca ctaaagcata tggagataga 120

atagaaagaa tgcttcgcct cagtttgaac attgaccctg atgcaaaggt ggaagaagag 180

cccgaagaag aacctgaaga gacagcagaa gacacaacag aagacacaga gcaagacgaa 240

gatgaagaaa tggatgtggg aacagatgaa gaagaagaaa cagcaaagga atctacagct 300

gaa 303

<210>20

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gp96-(22-287)正义引物

<400>20

gccgaattcg atggacgatg aagttgatgt ggatgg 36

<210>21

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gp96-(22-287)反义引物

<400>21

cttgtcgact tattcagtct tgctgctcca tac 33

<210>22

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gp96-(288-368)正义引物

<400>22

gccgaattcg atgactgttg aggagcccat ggagg 35

<210>23

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gp96-(288-368)反义引物

<400>23

cttgtcgact tagtcatcac tttcctttga aaatgattg 39

<210>24

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gp96-(369-698)正义引物

<400>24

gccgaattcg atgcccatgg cttatattca ctttactg 38

<210>25

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gp96-(369-698)反义引物

<400>25

cttgtcgact tacatgtctc tgatcagcgg gtg 33

<210>26

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gp96-(699-799)正义引物

<400>26

gccgaattcg atgcttcgac gaattaagga agatgaag 38

<210>27

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gp96-(699-799)反义引物

<400>27

cttgtcgact tattcagctg tagattcctt tgctg 35

<210>28

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gp96-(288-799)正义引物

<400>28

gccgaattcg atggacgatg aagttgatgt ggatgg 36

<210>29

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gp96-(288-799)反义引物

<400>29

cttgtcgact tattcagctg tagattcctt tgctg 35

<210>30

<211>72

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>gp96-(E791)反义引物

<400>30

cttgtcgact tattcagctg tagattcctt tgctgtttct tcttcatctg ttcccacatc 60

catttcttca tc 72

Claims

1.一种免疫调节剂的筛选方法，包括如下步骤：

(b)测试上述试验制剂是否与上述分离多肽结合。

2.根据权利要求1所述的免疫调节剂的筛选方法，其特征在于还包括如下步骤：

使所述(b)步骤中测试的候补物质与包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的分离多肽接触；

3.一种免疫调节剂的筛选方法，其特征在于包括如下步骤：

(a)使表达包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的分离多肽及包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的分离多肽的细胞或组织与试验制剂接触；及

4.根据权利要求3所述的免疫调节剂的筛选方法，其特征在于，上述细胞或组织中用包含编码SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的核酸序列的分离多核苷酸及包含编码SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的核酸序列的分离多核苷酸同时转化。

5.根据权利要求4所述的免疫调节剂的筛选方法，其特征在于，编码所述SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的核酸序列表示为SEQ IDNO：5。

6.根据权利要求4所述的免疫调节剂的筛选方法，其特征在于，编码所述SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的核酸序列表示为SEQ IDNO：19。

7.一种抗癌剂的筛选方法，包括如下步骤：

(b)测定上述试验制剂是否与上述分离多肽结合；

(c)将上述试验制剂给予癌细胞或癌症动物模型；并

8.一种抗癌剂的筛选方法，包括如下步骤：

(c)将上述试验制剂给予癌细胞或癌症动物模型；并且

9.一种自身免疫疾病治疗剂的筛选方法，包括如下步骤：

(e)将上述试验制剂给予免疫细胞或自身免疫疾病动物模型；并且

10.一种自身免疫疾病治疗剂的筛选方法，包括如下步骤：

(d)在给予了上述试验制剂的免疫细胞或自身免疫疾病动物模型中，测定免疫抑制程度。

11.一种自身免疫疾病诊断用组合物，所述组合物含有AIMP1蛋白质的特异性抗体。

12.一种自身免疫疾病诊断方法，包括如下步骤：

(a)使AIMP1蛋白特异性抗体与检测样本接触；

(b)形成抗原-抗体复合物；并

(c)将上述抗原-抗体复合物的形成量与对照组比较。