CN105749251A

CN105749251A - 热休克蛋白gp96在预防和治疗1型糖尿病中的应用

Info

Publication number: CN105749251A
Application number: CN201610216671.0A
Authority: CN
Inventors: 孟颂东; 陈密; 郑华国
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2016-04-08
Filing date: 2016-04-08
Publication date: 2016-07-13

Abstract

本发明公开了热休克蛋白gp96在预防和/或治疗1型糖尿病中的应用。本发明所提供的热休克蛋白gp96为a1)或a2)或a3)或a4)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2自N末端起第2位至783位所示的蛋白质；a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a3)在a1)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a4)将序列表中序列2自N末端起第2位至783位或序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。实验证明，热休克蛋白gp96对预防1型糖尿病和/或延缓1型糖尿病的发生和/或治疗1型糖尿病有重要的应用价值。

Description

热休克蛋白gp96在预防和治疗1型糖尿病中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及热休克蛋白gp96在预防和/或治疗1型糖尿病中的应用。

背景技术

随着现代生活水平的提高和生活方式、生活环境的改变，在全球范围内，1型糖尿病(Type1diabetes，T1D)的患病率正呈现快速上升的趋势。2011年国际糖尿病联盟(InternationalDiabetesFederation，IDF)的统计结果显示，全球1.9亿0～15岁的儿童中，T1D患者约有490100名，每年新诊断约77800名，年增加率约为3.0％。

T1D是一种自身免疫性疾病(Autoimmunedisease，AID)，由自身反应性T细胞持续活化并破坏胰岛β细胞，使胰岛素分泌功能受损而引发的代谢紊乱综合征。T1D的确切病因迄今尚未阐明，但自身免疫异常是其最主要的致病因素。CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞(RegulatoryTcells，Tregs)是一类免疫抑制性T淋巴细胞，它在防止自身免疫性疾病及维持自身免疫耐受中发挥重要作用：一、研究发现，T1D患者体内的CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞出现数量减少或者调节能力减弱的现象；二、针对非肥胖型糖尿病(non-obesediabetic，NOD)小鼠的研究也发现患NOD的小鼠体内的CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞水平降低；三、一些动物实验和临床研究发现，体外扩增的多克隆或抗原特异性调节性T细胞的过继性转移疗法能够有效地预防或缓解T1D。上述结果表明，调节性T细胞在T1D的发病和疾病进程中发挥重要作用。

热休克蛋白(Heatshockprotein，HSP)gp96属于HSP90家族的成员，该蛋白是细胞内质网上含量最丰富的热休克蛋白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何预防和/或治疗1型糖尿病。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了热休克蛋白gp96在制备产品中的应用；所述产品的功能可为如下A1)至A8)中的至少一种：

A1)预防1型糖尿病；

A2)延缓1型糖尿病的发生；

A3)治疗1型糖尿病；

A4)诱导调节性T细胞的产生；

A5)提高调节性T细胞的增殖能力；

A6)提高调节性T细胞分泌IL-10的能力；

A7)提高调节性T细胞中Foxp3蛋白的表达水平；

A8)增强调节性T细胞对效应T细胞的抑制能力。

上述应用中，所述A1)、所述A2)和所述A3)中，所述热休克蛋白gp96的剂量可为高剂量。所述高剂量可为向哺乳动物注射60μg以上所述热休克蛋白gp96。所述高剂量具体可为向哺乳动物注射100μg所述热休克蛋白gp96。

上述应用中，所述A4)、所述A5)、所述A6)、所述A7)和所述A8)中，所述热休克蛋白gp96的剂量可为高剂量或低剂量。所述高剂量可为向哺乳动物注射60μg以上所述热休克蛋白gp96。所述高剂量具体可为向哺乳动物注射100μg所述热休克蛋白gp96。所述低剂量可为向哺乳动物注射小于60μg所述热休克蛋白gp96。所述低剂量具体可为向哺乳动物注射10μg或50μg所述热休克蛋白gp96。

所述哺乳动物可为人、鼠。所述鼠具体可为雌性NOD小鼠。

上述应用中，所述热休克蛋白gp96可为a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2自N末端起第2位至783位所示的蛋白质；

a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a3)在a1)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a4)将序列表中序列2自N末端起第2位至783位或序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

上述应用中，所述Foxp3蛋白可为b1)或b2)或b3)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质；

b2)在序列表中序列3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

b3)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

上述应用中，所述IL-10可为c1)或c2)或c3)：

c1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

c2)在序列表中序列4所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

c3)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

上述应用中，所述调节性T细胞可为CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞。

上述应用中，所述产品可为药物。

上述应用中，编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子可为d1)或d2)或d3)或d4)：

d1)核苷酸序列是序列表中序列1自5’端起第4位至2352位所示的DNA分子；

d2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述热休克蛋白gp96的DNA分子；

d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述热休克蛋白gp96的DNA分子。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种产品。

本发明所提供的产品，其活性成分为热休克蛋白gp96；所述产品的功能可为如下A1)至A8)中的至少一种：

A1)预防1型糖尿病；

A2)延缓1型糖尿病的发生；

A3)治疗1型糖尿病；

A4)诱导调节性T细胞的产生；

A5)提高调节性T细胞的增殖能力；

A6)提高调节性T细胞分泌IL-10的能力；

A7)提高调节性T细胞中Foxp3蛋白的表达水平；

A8)增强调节性T细胞对效应T细胞的抑制能力。

上述产品中，所述A1)、所述A2)和所述A3)中，所述热休克蛋白gp96的剂量可为高剂量。所述高剂量可为向哺乳动物注射60μg以上所述热休克蛋白gp96。所述高剂量具体可为向哺乳动物注射100μg所述热休克蛋白gp96。

上述产品中，所述A4)、所述A5)、所述A6)、所述A7)和所述A8)中，所述热休克蛋白gp96的剂量可为高剂量或低剂量。所述高剂量可为向哺乳动物注射60μg以上所述热休克蛋白gp96。所述高剂量具体可为向哺乳动物注射100μg所述热休克蛋白gp96。所述低剂量可为向哺乳动物注射小于60μg所述热休克蛋白gp96。所述低剂量具体可为向哺乳动物注射10μg或50μg所述热休克蛋白gp96。

所述哺乳动物可为人、鼠。所述鼠具体可为雌性NOD小鼠。

上述产品中，所述热休克蛋白gp96可为a1)或a2)或a3)或a4)：

a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a3)在a1)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

上述产品中，所述Foxp3蛋白可为b1)或b2)或b3)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质；

上述产品中，所述IL-10可为c1)或c2)或c3)：

c1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

上述产品中，所述调节性T细胞可为CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞。

上述产品中，所述产品可为药物。

上述产品中，编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子可为d1)或d2)或d3)或d4)：

d2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

上述产品中，所述哺乳动物可为人、鼠。

上述产品中，所述小鼠具体可为雌性NOD小鼠。

实验证明，所述热休克蛋白gp96具有诱导调节性T细胞的产生、提高调节性T细胞的增殖能力、提高调节性T细胞分泌IL-10的能力、提高调节性T细胞中Foxp3蛋白的表达水平和增强调节性T细胞对效应T细胞的抑制能力的功能，高剂量的热休克蛋白gp96(如向雌性NOD小鼠注射100μg所述热休克蛋白gp96)还具有预防1型糖尿病、延缓1型糖尿病的发生和治疗1型糖尿病功能。因此，热休克蛋白gp96对预防1型糖尿病和/或延缓1型糖尿病的发生和/或治疗1型糖尿病有重要的应用价值。

附图说明

图1为重组热休克蛋白gp96的SDS-PAGE和WesternBlot的鉴定结果。

图2为用重组热休克蛋白gp96免疫的小鼠的脾脏淋巴细胞中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的频率。

图3为用重组热休克蛋白gp96免疫的小鼠的血糖值检测结果。

图4为用重组热休克蛋白gp96免疫的小鼠的T1D患病率。

图5为重组热休克蛋白gp96对CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的增殖的影响。

图6为重组热休克蛋白gp96对CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞培养的上清液中IL-10的含量的影响。

图7为重组热休克蛋白gp96对CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞中Foxp3蛋白表达水平的影响。

图8为重组热休克蛋白gp96对调节性T细胞抑制能力的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

获取小鼠脾脏淋巴细胞的具体方法参考如下文献：ZhenLiu，XinghuiLi，LipengQiu，etal.TregsuppressCTLresponsesuponimmunizationwithHSPgp96.Eur.J.mmunol，2009，39(11)：3110–3120.

雌性NOD小鼠记载在如下文献中：MarkS.AndersonandJeffreyA.Bluestone,THENODMOUSE:AModelofImmuneDysregulation，AnnualReviewofImmunology,2005,Vol.23:447-485.雌性NOD小鼠在下文中简称小鼠。

HepG2细胞(人肝癌细胞)为ATCC公司产品，产品目录号为HB-8065^TM。Sf9细胞为Invitrogen公司产品，产品目录号为11496-015。CellfectinIIreagent为Lifetechnologies公司产品，产品目录号为10362-100。质粒pFastBac^TM1为Invitrogen公司产品，产品目录号为10359-016。gp96单克隆抗体为SantaCruz公司产品，产品目录号为sc-56399。辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，产品目录号为ZB-2307。Foxp3单克隆抗体为武汉爱博泰克生物科技有限公司产品，产品目录号为A5706。Insect-XPRESS^TMProtein-freeInsectCellsmediumwithL-Glutamine为LONZA公司产品，产品目录号为12-730Q。超滤管为MerckMillipore公司产品，产品目录号为UFC905096。CFSE细胞增殖试剂盒为Invitrogen公司产品，产品目录号为C34554。ELISA试剂盒为eBioscience公司产品，产品目录号为BMS614INST。血糖仪为德国罗氏公司产品，产品型号为Performa。HiTrap-QSepharose离子交换层析柱为GE公司产品，产品目录号为17-5053-01。Superdex20010/300GL分子筛层析柱为GE公司产品，产品目录号为17517501。大肠杆菌DH10Bac感受态细胞为北京原平皓生物技术有限公司产品，产品目录号为CL108-01。FITC-anti-CD3、PE-anti-CD4、Percp-Cy5.5-anti-CD25、固定/破膜剂、APC-anti-Foxp3、anti-CD3、anti-CD28、Percp-Cy5.5-anti-CD4、PE-anti-CD25和Percp-Cy5.5-anti-CD3均为eBioscience公司产品，产品目录号分别为11-0031-63、12-0041-81、45-0251-80、00-5521-00、17-5773-80、16-0032-81、16-0281-81、45-0042-80、12-0251-81和45-0031-80。IL-2为PeproTech公司产品，产品目录号为212-12。

实施例1、重组热休克蛋白gp96的制备

一、重组质粒pFastBac^TM1-gp96的构建

1、采用Trizol法提取HepG2细胞的RNA，然后进行反转录获得cDNA。

2、根据人gp96基因(GenBank号为AY040226.1)的序列，人工合成引物F1：5’-GGAATTCATGGACGATGAAGTTGAT-3’(下划线为限制性内切酶EcoRⅠ识别序列)和R1：5’-GCTCTAGACTATTAGAATTCATCTTTTTC-3’(下划线为限制性内切酶XbaⅠ识别序列)。

3、完成步骤1和2后，以步骤1获得的cDNA为模板，以步骤2合成的F1和R1为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

4、用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。

5、用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切质粒pFastBac^TM1，回收约4700bp的载体骨架。

6、将酶切产物与载体骨架连接，得到连接产物。

7、将步骤6获得的连接产物转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，得到重组大肠杆菌，然后提取该重组大肠杆菌的质粒，获得重组质粒pFastBac^TM1-gp96。

根据测序结果，对重组质粒pFastBac^TM1-gp96进行结构描述如下：将质粒pFastBac^TM1的EcoRⅠ和XbaⅠ识别序列间的片段(质粒pFastBac^TM1被限制性核酸内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中序列1所示的双链DNA分子。重组质粒pFastBac^TM1-gp96表达gp96蛋白，gp96蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

二、重组热休克蛋白gp96的表达

1、将步骤一构建的重组质粒pFastBac^TM1-gp96共转染Sf9细胞(每1×10⁶个Sf9细胞约转染4μg重组质粒pFastBac^TM1-gp96；共转染过程中，转染试剂为CellfectinIIreagent)，27℃孵育72h，离心，上清液即为P1代病毒。

2、将Sf9细胞悬浮液1(含1×10⁸个Sf9细胞)27℃培养8～10h，得到培养细胞；然后向所述培养细胞中加入P1代病毒(剂量为0.05～0.1MOI)，27℃孵育72h，4000rpm离心5min，上清液即为P2代病毒。

3、向Sf9细胞悬浮液2(含1.6×10⁸个Sf9细胞)中加入P2代病毒(剂量为0.05～0.1MOI)，27℃、100～120rpm培养72h，4000rpm离心5min，上清液即为P3代病毒。

以gp96单克隆抗体作为一抗，辣根过氧化酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体作为二抗，对P3代病毒进行western杂交，western杂交具体步骤参考如下文献：张悦鸣，段跃强，罗德炎，姚惠娟，王希良，李志奎.小鼠可溶性IL-5α受体在Bac-to-Bac系统中的表达及其鉴定[J].中国生物制品学杂志，2013，26：5.

western杂交实验结果表明，重组热休克蛋白gp96在Sf9细胞中表达。

三、重组热休克蛋白gp96的纯化

1、向300mL的Sf9细胞悬浮液3(含4.5×10⁸个Sf9细胞)中加入P3代病毒(剂量为5MOI)，27℃、100～120rpm培养72h，得到悬浮液。

2、取所述悬浮液，7000rpm离心20min，获得上清液1。

3、取所述上清液1，经0.22mm滤膜过滤，获得上样液。

4、将所述上样液上样于HiTrap-QSepharose离子交换层析柱(流速为1mL/min)，然后先用5mL的pH7.5、200mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)；再用10mL的pH7.5、300mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)；最后用3mL的pH7.5、600mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)，收集过柱后溶液并采用截留分子量为50KD的超滤管进行超滤浓缩，得到1mL左右的浓缩液。所述浓缩液即含有重组热休克蛋白gp96。

5、将步骤4得到的浓缩液上样于Superdex20010/300GL分子筛层析柱(流速为0.25mL/min)，然后用pH7.5、150mM的PBS缓冲液洗涤(流速为0.25mL/min)，收集为9～12mL处的穿透液，进一步采用截留分子量为50KD的超滤管进行超滤浓缩，得到重组热休克蛋白gp96的溶液。采用BCA法测定重组热休克蛋白gp96的溶液中的蛋白浓度，最后分装，贮存于-80℃。

将步骤5得到的重组热休克蛋白gp96的溶液进行SDS-PAGE电泳分析，实验结果见图1中左图(泳道1为高分子量标准蛋白质，泳道2为重组热休克蛋白gp96)。将步骤5得到的重组热休克蛋白gp96的溶液进行Westernblot(以gp96单克隆抗体作为一抗，辣根过氧化酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体作为二抗)，实验结果见图1中右图。结果表明，重组热休克蛋白gp96的溶液显示单一分子量条带，对应的分子量为96kDa。

实施例2、重组热休克蛋白gp96在预防和/或治疗1型糖尿病中的应用

一、小鼠分组免疫

将40只六周龄体重为14～16g的小鼠随机分成高剂量实验组、对照组、低剂量实验组1和低剂量实验组2(每组10只)，分别进行如下处理：

高剂量实验组：实验第1天，腹腔注射实施例1制备的重组热休克蛋白gp96的溶液；实验第8天，再次腹腔注射实施例1制备的重组热休克蛋白gp96的溶液；实验第22天，再次腹腔注射实施例1制备的重组热休克蛋白gp96的溶液。每次注射剂量均为100μg重组热休克蛋白gp96/只。

对照组：实验第1天腹腔注射pH7.2、0.01mol/LPBS缓冲液，实验第8天，再次腹腔注射pH7.2、0.01mol/LPBS缓冲液；实验第22天，再次腹腔注射pH7.2、0.01mol/LPBS缓冲液。每次注射剂量均为100μL/只。

低剂量实验组1：按照高剂量实验组的操作步骤进行，仅将注射剂量100μg重组热休克蛋白gp96/只替换为10μg重组热休克蛋白gp96/只。

低剂量实验组2：按照高剂量实验组的操作步骤进行，仅将注射剂量100μg重组热休克蛋白gp96/只替换为50μg重组热休克蛋白gp96/只。

二、免疫相关因子的分析

1、取完成步骤一后第8天的小鼠，获取小鼠脾脏淋巴细胞(每只小鼠取3×10⁶个脾脏淋巴细胞)。

2、取所述小鼠脾脏淋巴细胞，用pH7.2、0.01mol/LPBS缓冲液清洗两次。

3、完成步骤2后，取所述小鼠脾脏淋巴细胞，加入含5％BSA的pH7.2、0.01mol/LPBS缓冲液封闭30min。

4、完成步骤3后，取所述小鼠脾脏淋巴细胞，加入FITC-anti-CD3、PE-anti-CD4和Percp-Cy5.5-anti-CD25，4℃避光孵育30min。

5、完成步骤4后，取所述小鼠脾脏淋巴细胞，用pH7.2、0.01mol/LPBS缓冲液清洗一次，然后加入250μL固定/破膜剂，4℃孵育20min。

6、完成步骤5后，取所述小鼠脾脏淋巴细胞，用破膜/清洗剂清洗2次。

7、完成步骤6后，取所述小鼠脾脏淋巴细胞，加入APC-anti-Foxp3，4℃避光孵育30min，然后用破膜/清洗剂清洗2次，用流式细胞仪分析小鼠脾脏淋巴细胞中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的频率。

实验结果见图2(左图为小鼠脾脏淋巴细胞中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的频率，右图为小鼠脾脏淋巴细胞中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的统计结果)，结果表明，高剂量实验组中的小鼠的脾脏淋巴细胞中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的频率为9.180±0.09644％，对照组中的小鼠的脾脏淋巴细胞中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的频率为4.857±0.1384％，低剂量实验组1中的小鼠的脾脏淋巴细胞中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的频率为5.673±0.4478％，低剂量实验组2中的小鼠的脾脏淋巴细胞中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的频率为6.327±0.2079％。因此，高剂量重组热休克蛋白gp96可以显著诱导CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的产生。

二、效果评价

取完成步骤一的小鼠，利用血糖仪检测小鼠的血糖值并统计各处理组的T1D患病率(每次间隔1周，共检测11周，第一次检测的时间为完成步骤一的第1周，即10周龄小鼠)。T1D的诊断标准为小鼠的血糖值≥13.3mmol/L且持续时间为两周以上。T1D患病率＝检测为T1D的小鼠数量(只)/10(只)×100％。

小鼠的血糖值检测结果见图3。结果表明，高剂量实验组中小鼠的血糖值基本保持稳定且维持在正常范围内，而对照组、低剂量实验组1和低剂量实验组2中小鼠的血糖值显著升高；小鼠为13周龄时，对照组、低剂量实验组1和低剂量实验组2中小鼠的血糖值约为高剂量实验组中小鼠的3倍(P<0.01)。对照组、低剂量实验组1和低剂量实验组2中小鼠的血糖值无显著差异。

小鼠的T1D患病率统计结果见图4。结果表明，高剂量实验组中小鼠的T1D患病率明显低于对照组、低剂量实验组1和低剂量实验组2：小鼠为14周龄至20周龄时，对照组、低剂量实验组1和低剂量实验组2中小鼠的T1D患病率均为100％，而高剂量实验组中小鼠的T1D患病率为40％。而且高剂量实验组中小鼠的T1D发病时间为12周龄，对照组、低剂量实验组1和低剂量实验组2中小鼠的T1D发病时间均为10周龄，可见，经过高剂量重组热休克蛋白gp96处理后，T1D发病时间有所延缓。

上述结果表明，用高剂量重组热休克蛋白gp96免疫小鼠，能够有效的预防或延缓小鼠的T1D发生。

实施例3、重组热休克蛋白gp96对调节性T细胞的增殖和功能的影响

一、重组热休克蛋白gp96对调节性T细胞的增殖的影响

A、高剂量实验组

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

1、取小鼠，获取小鼠脾脏淋巴细胞(每只小鼠约取3×10⁶个)。

2、采用CFSE细胞增殖试剂盒，将步骤1获取的小鼠脾脏淋巴细胞进行CFSE标记，得到CFSE标记的小鼠脾脏淋巴细胞。

3、取96孔培养板(圆底)，加入CFSE标记的小鼠脾脏淋巴细胞(每孔约3×10⁵个)，再加入anti-CD3、anti-CD28和IL-2，获得培养体系。该培养体系中，anti-CD3和anti-CD28的浓度均为1μg/mL，IL-2的浓度为50IU/mL。

4、完成步骤3后，向培养体系中加入实施例1制备的重组热休克蛋白gp96的溶液，使所述热休克蛋白gp96在体系中的浓度为100μg/mL，在37℃、5％CO₂的条件下孵育72h，离心，收集细胞。

5、取所述细胞(约3×10⁶个)，用pH7.2、0.01mol/LPBS缓冲液清洗两次。

6、取所述细胞，加入含5％BSA的pH7.2、0.01mol/LPBS缓冲液封闭30min。

7、取所述细胞，加入Percp-Cy5.5-anti-CD4和PE-anti-CD25，4℃避光孵育30min。

8、取所述细胞，用pH7.2、0.01mol/LPBS缓冲液清洗一次，然后加入250μL固定/破膜剂，4℃孵育20min。

9、取所述细胞，用破膜/清洗剂清洗2次。

10、取所述细胞，加入APC-anti-Foxp3，4℃避光孵育30min，然后用破膜/清洗剂清洗2次，用流式细胞仪检测CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的CFSE荧光衰减情况，即为CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的增殖情况。

B、对照组

按照高剂量实验组的操作步骤进行，仅将步骤A中4的实施例1制备的重组热休克蛋白gp96的溶液替换为pH7.2、0.01mol/LPBS缓冲液。

C、低剂量实验组1

按照高剂量实验组的操作步骤进行，仅将步骤A中4的100μg/mL替换为10μg/mL。

D、低剂量实验组2

按照高剂量实验组的操作步骤进行，仅将步骤A中4的100μg/mL替换为50μg/mL。

实验结果见图5(左图为CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的CFSE荧光强度流式分析图，右图为CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的增殖率)。结果表明，高剂量实验组、低剂量实验组1和低剂量实验组2中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的增殖能力均有一定程度的提高，但高剂量实验组中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的增殖能力的提高程度显著高于低剂量实验组1和低剂量实验组2(P<0.01)。

二、重组热休克蛋白gp96对CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞培养的上清液中IL-10的含量的影响

A、高剂量实验组

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

1、取小鼠，获取小鼠脾脏淋巴细胞(每只小鼠取3×10⁶个)。

2、取96孔培养板(圆底)，加入小鼠脾脏淋巴细胞(每孔3×10⁵个)，再加入anti-CD3、anti-CD28和IL-2，获得培养体系。该培养体系中，anti-CD3和anti-CD28的浓度均为1μg/mL，IL-2的浓度为50IU/mL。

3、完成步骤2后，向培养体系中加入实施例1制备的重组热休克蛋白gp96的溶液，使重组热休克蛋白gp96在体系中的浓度为100μg/mL，在37℃、5％CO₂的条件下孵育24h，离心，收集上清液和沉淀。

4、取所述上清液，采用ELISA试剂盒的说明书步骤检测IL-10含量。

B、对照组

按照高剂量实验组的操作步骤进行，仅将步骤3的实施例1制备的重组热休克蛋白gp96的溶液替换为pH7.2、0.01mol/LPBS缓冲液。

C、低剂量实验组1

D、低剂量实验组2

实验结果见图6。结果表明，高剂量实验组、低剂量实验组1和低剂量实验组2中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞分泌IL-10的水平均有一定程度的提高，但高剂量实验组中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞分泌IL-10的水平的提高程度显著高于低剂量实验组1和低剂量实验组2(P<0.01)。

三、重组热休克蛋白gp96对CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞中Foxp3蛋白表达水平的影响

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

提取上述步骤二中各处理组收集的沉淀的蛋白，进行SDS-PAGE。然后以Foxp3单克隆抗体作为一抗，以辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体作为二抗，进行westernblot(以GAPDH蛋白为内参)。

实验结果见图7。结果表明，高剂量实验组、低剂量实验组1和低剂量实验组2中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞中Foxp3蛋白的表达水平均有一定程度的提高，但高剂量实验组中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞中Foxp3蛋白的表达水平的提高程度显著高于低剂量实验组1和低剂量实验组2(P<0.01)。

四、重组热休克蛋白gp96对调节性T细胞抑制能力的影响

A、高剂量实验组

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

1、取小鼠，参照磁珠分选试剂盒的操作步骤分离得到调节性T细胞和效应T细胞(CD4⁺CD25^-T细胞)。

2、向步骤1分离的调节性T细胞中加入实施例1制备的重组热休克蛋白gp96的溶液，得到处理体系，重组热休克蛋白gp96在处理体系中的浓度为100μg/mL，然后37℃、5％CO₂的条件下孵育24h，得到处理后的调节性T细胞。

3、采用CFSE细胞增殖试剂盒，将步骤1分离的效应T细胞进行CFSE标记，得到CFSE标记的效应T细胞。

4、取96孔培养板(圆底)，加入CFSE标记的效应T细胞(每孔3×10⁵个)和步骤2得到的处理后的调节性T细胞(每孔1×10⁵个)，再加入anti-CD3、anti-CD28和IL-2，获得培养体系。该培养体系中，anti-CD3和anti-CD28的浓度均为1μg/mL，IL-2的浓度为50IU/mL。将该培养体系在37℃、5％CO₂的条件下培养72h。

5、完成步骤4后，离心，收集细胞。

6、取所述细胞，用pH7.2、0.01mol/LPBS缓冲液清洗两次。

7、取所述细胞，加入含5％BSA的pH7.2、0.01mol/LPBS缓冲液封闭30min。

8、取所述细胞，取所述细胞，加入Percp-Cy5.5-anti-CD3和PE-anti-CD4，4℃避光孵育30min。

9、取所述细胞，用pH7.2、0.01mol/LPBS缓冲液清洗一次，然后用流式细胞仪检测效应T细胞的CFSE荧光衰减情况。

B、对照组

按照高剂量实验组的操作步骤进行，仅将步骤A中2的实施例1制备的重组热休克蛋白gp96的溶液替换为pH7.2、0.01mol/LPBS缓冲液。

C、低剂量实验组1

按照高剂量实验组的操作步骤进行，仅将步骤A中2的100μg/mL替换为10μg/mL。

D、低剂量实验组2

按照高剂量实验组的操作步骤进行，仅将步骤A中2的100μg/mL替换为50μg/mL。

根据下述公式，计算调节性T细胞对效应T细胞的抑制率：

抑制率＝(对照组的CFSE荧光衰减程度-实验组的CFSE荧光衰减程度)/对照组的CFSE荧光衰减程度×100％

实验结果见图8。结果表明，高剂量实验组、低剂量实验组1和低剂量实验组2中调节性T细胞对效应T细胞的抑制能力均有一定程度的增强，但高剂量实验组中调节性T细胞对效应T细胞的抑制能力的增强程度显著高于低剂量实验组1和低剂量实验组2(P<0.01)。

Claims

1.热休克蛋白gp96在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下A1)至A8)中的至少一种：

A1)预防1型糖尿病；

A2)延缓1型糖尿病的发生；

A3)治疗1型糖尿病；

A4)诱导调节性T细胞的产生；

A5)提高调节性T细胞的增殖能力；

A6)提高调节性T细胞分泌IL-10的能力；

A7)提高调节性T细胞中Foxp3蛋白的表达水平；

A8)增强调节性T细胞对效应T细胞的抑制能力。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述热休克蛋白gp96为a1)或a2)或a3)或a4)：

a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a3)在a1)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述Foxp3蛋白为b1)或b2)或b3)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质；

b3)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

所述IL-10为c1)或c2)或c3)：

c1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

4.如权利要求1至3任一所述的应用，其特征在于：所述调节性T细胞为CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞。

5.如权利要求1至4任一所述的应用，其特征在于：所述产品为药物。

6.一种产品，其活性成分为热休克蛋白gp96；所述产品的功能为如下A1)至A8)中的至少一种：

A1)预防1型糖尿病；

A2)延缓1型糖尿病的发生；

A3)治疗1型糖尿病；

A4)诱导调节性T细胞的产生；

A5)提高调节性T细胞的增殖能力；

A6)提高调节性T细胞分泌IL-10的能力；

A7)提高调节性T细胞中Foxp3蛋白的表达水平；

A8)增强调节性T细胞对效应T细胞的抑制能力。

7.如权利要求6所述的产品，其特征在于：

所述热休克蛋白gp96为a1)或a2)或a3)或a4)：

a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a3)在a1)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

8.如权利要求6或7所述的产品，其特征在于：所述Foxp3蛋白为b1)或b2)或b3)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质；

所述IL-10为c1)或c2)或c3)：

c1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

9.如权利要求6至8任一所述的产品，其特征在于：所述调节性T细胞为CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞。

10.如权利要求6至9任一所述的产品，其特征在于：所述产品为药物。