CN105963681B - 热休克蛋白gp96在治疗系统性红斑狼疮中的应用 - Google Patents

热休克蛋白gp96在治疗系统性红斑狼疮中的应用 Download PDF

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CN105963681B CN201610301471.5A CN201610301471A CN105963681B CN 105963681 B CN105963681 B CN 105963681B CN 201610301471 A CN201610301471 A CN 201610301471A CN 105963681 B CN105963681 B CN 105963681B
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Abstract

本发明公开了热休克蛋白gp96在治疗系统性红斑狼疮中的应用。本发明所提供的热休克蛋白gp96为a1)或a2)或a3)或a4)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2自N末端起第2位至783位所示的蛋白质；a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a3)在a1)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a4)将序列表中序列2自N末端起第2位至783位或序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。实验证明，热休克蛋白gp96对治疗系统性红斑狼疮和/或缓解系统性红斑狼疮的症状有重要的应用价值。

Description

热休克蛋白gp96在治疗系统性红斑狼疮中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及热休克蛋白gp96在治疗系统性红斑狼疮中的应用。
背景技术
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)属于自身免疫类疾病，常发生于20～40岁女性。大量研究显示遗传、内分泌、感染、免疫异常和一些环境因素与SLE的发病有关，但病因至今尚未肯定。在遗传因素、环境因素、雌激素水平等各种因素相互作用下，SLE患者的T淋巴细胞减少，T抑制细胞功能降低，B细胞过度增生，并产生大量的自身抗体。这些自身抗体可与体内相应的自身抗原结合形成相应的免疫复合物，沉积在皮肤、关节、小血管、肾小球等部位，引起急慢性炎症及组织坏死(如狼疮肾炎)；这些自身抗体也可直接与组织细胞抗原作用，引起细胞破坏(如红细胞、淋巴细胞和血小板壁的特异性抗原与相应的自身抗体结合，分别引起溶血性贫血、淋巴细胞减少症和血小板减少症)，从而导致机体的多系统受到损害。
目前，SLE不论采用中医还是西医治疗均不可能根治，只能通过药物缓解病情，给SLE患者及其家属带来巨大的经济和精神负担。
热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)是一类在生物进化中高度保守且广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质。HSP根据同源程度和分子量大小可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、小分子HSP和泛素等多个亚家族。热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)gp96属于HSP90亚家族的成员，该蛋白是细胞内质网上含量最丰富的热休克蛋白。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何治疗系统性红斑狼疮。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了热休克蛋白gp96在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下A1)至A10)中的至少一种：
A1)治疗系统性红斑狼疮；
A2)缓解系统性红斑狼疮的症状；
A3)诱导调节性T细胞的产生；
A4)降低抗双链DNA抗体滴度；
A5)降低抗核抗体滴度；
A6)降低尿蛋白浓度；
A7)延长生存时间；
A8)提高血小板的数量；
A9)使抗核抗体和/或抗U1RNP抗体和/或抗SSA抗体和/或抗核糖体P蛋白抗体由阳性转为阴性；
A10)预防系统性红斑狼疮。
上述应用中，所述A1)、所述A2)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、所述A6)、所述A7)和所述A10)中，所述热休克蛋白gp96的剂量可为向哺乳动物注射100μg～500μg所述热休克蛋白gp96(如100μg所述热休克蛋白gp96或500μg所述热休克蛋白gp96)。
上述应用中，所述A8)和所述A9)中，所述热休克蛋白gp96的剂量具体可为向哺乳动物注射100μg所述热休克蛋白gp96。
上述应用中，所述A4)中，所述双链DNA可为Sigma Aldrich公司的小牛胸腺dsDNA标准品。
所述哺乳动物可为人、鼠。所述鼠具体可为雌性MRL/MpJ-Faslpr/J小鼠。
上述应用中，所述热休克蛋白gp96可为a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2自N末端起第2位至783位所示的蛋白质；
a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a3)在a1)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a4)将序列表中序列2自N末端起第2位至783位或序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
上述应用中，编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子可为d1)或d2)或d3)或d4)：
d1)核苷酸序列是序列表中序列1自5’端起第4位至2352位所示的DNA分子；
d2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述热休克蛋白gp96的DNA分子；
d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述热休克蛋白gp96的DNA分子。
上述应用中，所述热休克蛋白gp96的获得方式可为D1)或D2)：
D1)从离体哺乳动物的胎盘组织中提取；
D2)将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中，培养，纯化。
所述D1)中，所述哺乳动物可为人、鼠。所述鼠具体可为雌性MRL/MpJ-Faslpr/J小鼠。
所述D2)中，所述“将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中”可通过向受体中导入重组载体实现；所述重组载体可为将所述热休克蛋白gp96的编码基因插入出发质粒得到的重组质粒。所述重组载体具体可为重组质粒pFastBac1-gp96。所述重组质粒pFastBac1-gp96具体可为在质粒pFastBac1的多克隆位点插入序列表中序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。
所述重组质粒pFastBac1-gp96具体可为将质粒pFastBac1的EcoRⅠ和XbaⅠ识别序列间的片段(质粒pFastBac1被限制性核酸内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。
所述D2)中，所述受体可为Sf9细胞。
上述应用中，所述调节性T细胞可为CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞。
上述应用中，所述产品可为药物。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种产品。
本发明所提供的产品，其活性成分为热休克蛋白gp96；所述产品的功能为如下A1)至A10)中的至少一种：
A1)治疗系统性红斑狼疮；
A2)缓解系统性红斑狼疮的症状；
A3)诱导调节性T细胞的产生；
A4)降低抗双链DNA抗体滴度；
A5)降低抗核抗体滴度；
A6)降低尿蛋白浓度；
A7)延长生存时间；
A8)提高血小板的数量；
A9)使抗核抗体和/或抗U1RNP抗体和/或抗SSA抗体和/或抗核糖体P蛋白抗体由阳性转为阴性；
A10)预防系统性红斑狼疮。
上述产品中，所述A1)、所述A2)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、所述A6)、所述A7)和所述A10)中，所述热休克蛋白gp96的剂量可为向哺乳动物注射100μg～500μg所述热休克蛋白gp96(如100μg所述热休克蛋白gp96或500μg所述热休克蛋白gp96)。
上述产品中，所述A8)和所述A9)中，所述热休克蛋白gp96的剂量具体可为向哺乳动物注射100μg所述热休克蛋白gp96。
上述产品中，所述A4)中，所述双链DNA可为Sigma Aldrich公司的小牛胸腺dsDNA标准品。
所述哺乳动物可为人、鼠。所述鼠具体可为雌性MRL/MpJ-Faslpr/J小鼠。
上述产品中，所述热休克蛋白gp96可为a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2自N末端起第2位至783位所示的蛋白质；
a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a3)在a1)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a4)将序列表中序列2自N末端起第2位至783位或序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
上述产品中，编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子可为d1)或d2)或d3)或d4)：
d1)核苷酸序列是序列表中序列1自5’端起第4位至2352位所示的DNA分子；
d2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述热休克蛋白gp96的DNA分子；
d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述热休克蛋白gp96的DNA分子。
上述产品中，所述热休克蛋白gp96的获得方式可为D1)或D2)：
D1)从离体哺乳动物的胎盘组织中提取；
D2)将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中，培养，纯化。
所述D1)中，所述哺乳动物可为人、鼠。所述鼠具体可为雌性MRL/MpJ-Faslpr/J小鼠。
所述D2)中，所述“将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中”可通过向受体中导入重组载体实现；所述重组载体可为将所述热休克蛋白gp96的编码基因插入出发质粒得到的重组质粒。
所述重组载体具体可为重组质粒pFastBac1-gp96。所述重组质粒pFastBac1-gp96具体可为在质粒pFastBac1的多克隆位点插入序列表中序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。
所述重组质粒pFastBac1-gp96具体可为将质粒pFastBac1的EcoRⅠ和XbaⅠ识别序列间的片段(质粒pFastBac1被限制性核酸内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。
所述D2)中，所述受体可为Sf9细胞。
上述产品中，所述调节性T细胞可为CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞。
上述产品中，所述产品可为药物。
实验证明，所述热休克蛋白gp96具有治疗系统性红斑狼疮、缓解系统性红斑狼疮的症状、诱导调节性T细胞的产生、降低抗双链DNA抗体滴度、降低抗核抗体滴度、降低尿蛋白浓度、延长生存时间、提高血小板的数量、使抗核抗体和/或抗U1RNP抗体和/或抗SSA抗体和/或抗核糖体P蛋白抗体由阳性转为阴性和预防系统性红斑狼疮的功能。因此，热休克蛋白gp96对治疗系统性红斑狼疮和/或缓解系统性红斑狼疮的症状具有重要的应用价值。
附图说明
图1为pgp96的Western blot鉴定结果。
图2为rgp96的SDS-PAGE和Western Blot的鉴定结果。
图3为用pgp96或rgp96免疫的小鼠的脾脏淋巴细胞中CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞的频率。
图4为用pgp96或rgp96免疫小鼠的抗双链DNA抗体滴度的检测结果。
图5为用pgp96或rgp96免疫小鼠的抗核抗体滴度的检测结果。
图6为用pgp96或rgp96免疫小鼠的尿蛋白浓度的检测结果。
图7为用pgp96或rgp96免疫小鼠的生存率统计结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
雌性MRL/MpJ-Faslpr/J小鼠为上海斯莱克实验动物有限责任公司产品；雌性MRL/MpJ-Faslpr/J小鼠在下文中简称小鼠。
获取小鼠脾脏淋巴细胞的具体方法参考如下文献：Zhen Liu，Xinghui Li，LipengQiu，et al.Treg suppress CTL responses upon immunization with HSPgp96.Eur.J.mmunol，2009，39(11)：3110–3120.
HepG2细胞(人肝癌细胞)为ATCC公司产品，产品目录号为HB-8065TM。Sf9细胞为Invitrogen公司产品，产品目录号为11496-015。Cellfectin II reagent为Lifetechnologies公司产品，产品目录号为10362-100。质粒pFastBacTM1为Invitrogen公司产品，产品目录号为10359-016。gp96单克隆抗体为Santa Cruz公司产品，产品目录号为sc-56399。辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，产品目录号为ZB-2307。HiTrap-Q Sepharose离子交换层析柱为GE公司产品，产品目录号为17-5053-01。Superdex 200 10/300GL分子筛层析柱为GE公司产品，产品目录号为17517501。大肠杆菌DH10Bac感受态细胞为北京原平皓生物技术有限公司产品，产品目录号为CL108-01。FITC-anti-CD3、PE-anti-CD4、Percp-Cy5.5-anti-CD25、固定/破膜剂和APC-anti-Foxp3均为eBioscience公司产品，产品目录号分别为11-0031-63、12-0041-81、45-0251-80、00-5521-00和17-5773-80。Insect-XPRESSTM Protein-free Insect Cellsmedium with L-Glutamine为LONZA公司产品，产品目录号为12-730Q。
溶液A：溶质及其浓度为PMSF 1mM、NaHCO3 30mM；溶剂为蒸馏水；pH值为7.4。
溶液B：溶质及其浓度为2mM MnCl2、2mM CaCl2、500mM NaCl、PMSF 1mM；溶剂为pH7.4、20mM Tris-HCl缓冲液。
溶液C：溶质及其浓度为10％(质量体积比)α-D-吡喃葡萄糖、500mM NaCl、1mMPMSF；溶剂为pH7.4、20mM Tris-HCl缓冲液。
清洗液：用蒸馏水将溶液B稀释至10倍体积。
ConA琼脂糖凝胶柱为GE公司公司产品，产品目录号为17-0440-01，该柱的规格为1.6×2.5cm，填充介质为Con A-Sepharose 4B。Hitrap Q阴离子交换柱为GE公司产品，产品目录号为17-1153-01，该柱的的规格为0.7×2.5cm。HRP标记的IgG抗体为SEROTEC公司产品，产品目录号为STAR117P。1×洗涤液为含0.1％(体积百分比)Triton-X100的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液。小牛胸腺dsDNA标准品为Sigma Aldrich公司产品。96孔酶标板为美国Nunc公司产品。抗dsDNA抗体标准品为美国Chemicon International公司产品。牛血清白蛋白为Invitrogen公司产品。1×TMB ELISA Substrate Solution为eBioscience公司产品，产品目录号为00-4201-56。细胞核抗体ELISA检测试剂盒为ADI公司产品，产品目录号为5210。尿蛋白检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，货号为C035-2。超滤管为MerckMillipore公司产品，产品目录号为UFC905096。
实施例1、pgp96的提取
组织中热休克蛋白gp96(以下简称pgp96)的提取步骤如下：
(1)分离分娩前的小鼠的胎盘组织，得到小鼠离体胎盘组织。取小鼠离体胎盘组织或人离体胎盘组织，剪碎，按质量体积比1g：4mL加入溶液A，然后用玻璃匀浆器磨碎。
(2)完成步骤(1)后，16500g离心1h，得到上清液甲。
(3)完成步骤(2)后，取上清液甲，16500g离心50min，得到上清液乙。
(4)完成步骤(3)后，取上清液乙，按体积比9：1加入溶液B，混匀后得到上样液。
(5)完成步骤(4)后，将上样液上样至ConA琼脂糖凝胶柱。
(6)完成步骤(5)后，用清洗液洗脱所述ConA琼脂糖凝胶柱，洗脱过程中实时监测紫外吸收值，检测波长为280nm，直至洗脱产物的紫外吸收值低于0.01。
(7)完成步骤(6)后，用溶液C洗脱所述ConA琼脂糖凝胶柱，弃去首先流出的过柱后溶液0.5个柱体积，然后收集之后流出的过柱后溶液1个柱体积；将所述ConA琼脂糖凝胶柱孵育50min后，再收集过柱后溶液1.5个柱体积。将两次收集的过柱后溶液合并，即为ConA洗脱液。
(8)完成步骤(7)后，将ConA洗脱液上样至Hitrap Q阴离子交换柱。
(9)完成步骤(8)后，用含NaCl的pH7.4、12mM的PBS缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为1mL/min。梯度洗脱程序：在pH7.4 12mM的PBS缓冲液中使NaCl含量由300mM匀速增至800mM，线性梯度洗脱20个柱体积。收集合并NaCl含量为400～450mM的洗脱液，即为洗脱液甲。
(10)完成步骤(9)后，取洗脱液甲，用超滤管甲进行超滤浓缩，得到pgp96的溶液。pgp96的溶液中，pgp96浓度为5mg/mL。
将pgp96的溶液进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot(以gp96单克隆抗体作为一抗，HRP标记的IgG抗体作为二抗)，实验结果见图1(箭头为pgp96)。结果表明，pgp96的溶液显示单一分子量条带，对应的分子量为96kDa。
实施例2、重组热休克蛋白gp96的制备
一、重组质粒pFastBacTM1-gp96的构建
1、采用Trizol法提取HepG2细胞的RNA，然后进行反转录获得cDNA。
2、根据人gp96基因(GenBank号为AY040226.1)的序列，人工合成引物F1：5’-GGAATTCATGGACGATGAAGTTGAT-3’(下划线为限制性内切酶EcoRⅠ识别序列)和R1：5’-GCTCTAGACTATTAGAATTCATCTTTTTC-3’(下划线为限制性内切酶XbaⅠ识别序列)。
3、完成步骤1和2后，以步骤1获得的cDNA为模板，以步骤2合成的F1和R1为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
4、用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。
5、用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切质粒pFastBacTM1，回收约4700bp的载体骨架。
6、将酶切产物与载体骨架连接，得到连接产物。
7、将步骤6获得的连接产物转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，得到重组大肠杆菌，然后提取该重组大肠杆菌的质粒，获得重组质粒pFastBac1-gp96。
根据测序结果，对重组质粒pFastBac1-gp96进行结构描述如下：将质粒pFastBac1的EcoRⅠ和XbaⅠ识别序列间的片段(质粒pFastBac1被限制性核酸内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中序列1所示的双链DNA分子。重组质粒pFastBac 1-gp96表达重组热休克蛋白gp96(以下简称rgp96)，rgp96的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
二、rgp96的表达
1、将步骤一构建的重组质粒pFastBac1-gp96共转染Sf9细胞(每1×106个Sf9细胞约转染4μg重组质粒pFastBac1-gp96；共转染过程中，转染试剂为Cellfectin II reagent，培养基为Insect-XPRESSTM Protein-free Insect Cells medium with L-Glutamine，27℃孵育72h，离心，上清液即为P1代病毒。
2、将Sf9细胞悬浮液1(含1×108个Sf9细胞)27℃培养8～10h，得到培养细胞；然后向所述培养细胞中加入P1代病毒(剂量为0.05～0.1MOI)，27℃孵育72h，4000rpm离心5min，上清液即为P2代病毒。
3、向Sf9细胞悬浮液2(含1.6×108个Sf9细胞)中加入P2代病毒(剂量为0.05～0.1MOI)，27℃、100～120rpm培养72h，4000rpm离心5min，上清液即为P3代病毒。
以gp96单克隆抗体作为一抗，辣根过氧化酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体作为二抗，对P3代病毒进行western杂交，western杂交具体步骤参考如下文献：张悦鸣，段跃强，罗德炎，姚惠娟，王希良，李志奎.小鼠可溶性IL-5α受体在Bac-to-Bac系统中的表达及其鉴定[J].中国生物制品学杂志，2013，26：5.
western杂交实验结果表明，rgp96在Sf9细胞中表达。
三、rgp96的纯化
1、向300ml的Sf9细胞悬浮液3(含4.5×108个Sf9细胞)中加入P3代病毒(剂量为5MOI)，27℃、100～120rpm培养72h，得到悬浮液。
2、取所述悬浮液，7000rpm离心20min，获得上清液1。
3、取所述上清液1，经0.22mm滤膜过滤，获得上样液。
4、将所述上样液上样于HiTrap-Q Sepharose离子交换层析柱(流速为1mL/min)，然后先用5mL的pH7.5、200mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)；再用10mL的pH7.5、300mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)；最后用3mL的pH7.5、600mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)，收集过柱后溶液并采用截留分子量为50KD的超滤管进行超滤浓缩，得到1mL左右的浓缩液。所述浓缩液即含有rgp96。
5、将步骤4得到的浓缩液上样于Superdex 200 10/300GL分子筛层析柱(流速为0.25mL/min)，然后用pH7.5、150mM的PBS缓冲液洗涤(流速为0.25mL/min)，收集为9～12mL处的穿透液，进一步采用截留分子量为50KD的超滤管进行超滤浓缩，得到rgp96的溶液。采用BCA法测定rgp96的溶液中的蛋白浓度，最后分装，贮存于-80℃。
将步骤5得到的rgp96的溶液进行SDS-PAGE电泳分析，实验结果见图2中左图(泳道1为高分子量标准蛋白质，泳道2为rgp96，箭头为rgp96)。将步骤5得到的重组热休克蛋白gp96的溶液进行Western blot(以gp96单克隆抗体作为一抗，辣根过氧化酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体作为二抗)，实验结果见图2中右图。结果表明，rgp96的溶液显示单一分子量条带，对应的分子量与预期一致。
实施例3、pgp96或rgp96在活化调节性T细胞中剂量的确定
一、小鼠分组免疫
将90只九周龄体重为18～22g的小鼠随机分成pgp96处理组1、pgp96处理组2、pgp96处理组3、pgp96处理组4、rgp96处理组1、rgp96处理组2、rgp96处理组3、rgp96处理组4和对照组(每组10只)，分别进行如下处理：
pgp96处理组1：实验第1天，腹腔注射实施例1制备的pgp96的溶液；实验第8天，再次腹腔注射实施例1制备的pgp96的溶液；实验第22天，再次腹腔注射实施例1制备的pgp96的溶液。每次注射剂量均为10μg pgp96/只。
pgp96处理组2：按照pgp96处理组1的操作步骤进行，仅将注射剂量10μg pgp96/只替换为50μg pgp96/只。
pgp96处理组3：按照pgp96处理组1的操作步骤进行，仅将注射剂量10μg pgp96/只替换为100μg pgp96/只。
pgp96处理组4：按照pgp96处理组1的操作步骤进行，仅将注射剂量10μg pgp96/只替换为100μg pgp96/只。
rgp96处理组1：实验第1天，腹腔注射实施例2制备的rgp96的溶液；实验第8天，再次腹腔注射实施例2制备的rgp96的溶液；实验第22天，再次腹腔注射实施例2制备的rgp96的溶液。每次注射剂量均为10μg pgp96/只。
rgp96处理组2：按照rgp96处理组1的操作步骤进行，仅将注射剂量10μgrgp96/只替换为50μgrgp96/只。
rgp96处理组3：按照rgp96处理组1的操作步骤进行，仅将注射剂量10μgrgp96/只替换为100μgrgp96/只。
rgp96处理组4：按照rgp96处理组1的操作步骤进行，仅将注射剂量10μgrgp96/只替换为500μgrgp96/只。
对照组：实验第1天腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，实验第8天，再次腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液；实验第22天，再次腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液。每次注射剂量均为100μL/只。
二、小鼠淋巴细胞分离
取完成步骤一后第8天的小鼠，获取小鼠脾脏淋巴细胞(每只小鼠取3×106个脾脏淋巴细胞)。
三、pgp96或rgp96在活化调节性T细胞中剂量的确定
1、取步骤二获取的小鼠脾脏淋巴细胞(少于1×106个)，1000rpm离心10min，收集小鼠脾脏淋巴细胞。
2、完成步骤1后，取所述小鼠脾脏淋巴细胞，加入100μL含5％(质量体积比)BSA的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液重悬，4℃封闭20min；然后1000rpm离心10min，用100μL上清液重悬沉淀，得到混合液甲。
3、完成步骤2后，取所述混合液甲，加入FITC-anti-CD3、PE-anti-CD4和Percp-Cy5.5-anti-CD25，4℃避光孵育20min。
4、完成步骤3后，取所述混合液甲，加入1mL pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，震荡混匀，1000rpm离心10min，收集小鼠脾脏淋巴细胞，然后用400μL pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液重悬，得到混合液乙。
5、完成步骤4后，取所述混合液乙，加入600μL固定/破膜剂，4℃破膜30min(实际操作过程中不超过1h即可)；然后1000rpm离心10min，收集沉淀，得到沉淀1。
6、完成步骤5后，取所述沉淀1，加入1mL 1×洗涤液重悬，1000rpm离心10min，得到沉淀2和上清液丙。取100μL上清液丙重悬沉淀2，得到混合液丙；向混合液丙中加入APC-anti-Foxp3，4℃避光孵育30min。
7、完成步骤6后，取所述混合液丙，加入1mL 1×洗涤液重悬，1000rpm离心10min，收集沉淀，得到沉淀3。取400μL含4％(质量体积比)多聚甲醛的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液重悬沉淀3，然后用流式细胞仪分析小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞的频率。
实验结果见图3(小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞的频率即FOXP3+细胞在CD4+细胞中比例)。结果表明，pgp96处理组1、pgp96处理组2、pgp96处理组3、pgp96处理组4、rgp96处理组1、rgp96处理组2、rgp96处理组3和rgp96处理组4中小鼠的脾脏淋巴细胞中CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞的频率均高于对照组，尤其是pgp96处理组3、pgp96处理组4、rgp96处理组3和rgp96处理组4中小鼠的脾脏淋巴细胞中CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞的频率均显著高于对照组。因此，100μgrgp96、500μgrgp96、100μgpgp96或500μgpgp96均可以显著诱导CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞的产生。
实施例4、pgp96或rgp96在治疗系统性红斑狼疮中的应用
一、小鼠分组免疫
1、发病小鼠的获得
取九周龄体重为18～22g的小鼠，挑选淋巴结肿大的小鼠，即为发病小鼠。
2、小鼠分组免疫
按照步骤1的方法，选取将50只九周龄的体重为18～22g的发病小鼠，随机分成pgp96处理组5、pgp96处理组6、rgp96处理组5、rgp96处理组6和对照组(每组10只)，分别进行如下处理：
pgp96处理组5：实验第1天，腹腔注射实施例1制备的pgp96的溶液；实验第8天，再次腹腔注射实施例1制备的pgp96的溶液；实验第22天，再次腹腔注射实施例1制备的pgp96的溶液。每次注射剂量均为100μg pgp96/只。
pgp96处理组6：按照pgp96处理组5的操作步骤进行，仅将注射剂量100μg pgp96/只替换为500μg pgp96/只。
rgp96处理组5：实验第1天，腹腔注射实施例2制备的rgp96的溶液；实验第8天，再次腹腔注射实施例2制备的rgp96的溶液；实验第22天，再次腹腔注射实施例2制备的rgp96的溶液。每次注射剂量均为100μg pgp96/只。
rgp96处理组6：按照rgp96处理组5的操作步骤进行，仅将注射剂量100μg pgp96/只替换为500μg pgp96/只。
对照组：实验第1天腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，实验第8天，再次腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液；实验第22天，再次腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液。每次注射剂量均为100μL/只。
二、抗双链DNA抗体滴度的分析
小鼠血清中抗双链DNA抗体滴度采用酶联免疫吸附方法测定，具体步骤如下：
1、取完成步骤一中2后第22天的小鼠，通过眼眶取血200μL，然后室温静置30min，3000rpm离心20min，取上清液并用pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液稀释至50倍体积，得到上清稀释液。
2、取96孔酶标板，每孔加入100μL浓度为2.5μg/mL的小牛胸腺dsDNA标准品，4℃包被过夜。
3、完成步骤2后，取所述96孔酶标板，每孔加入100μL 2％牛血清白蛋白，37℃孵育60min。
4、完成步骤3后，取所述96孔酶标板，每孔加入50μL步骤1制备的上清稀释液或不同浓度的抗dsDNA抗体标准品溶液(用pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液稀释，浓度分别为2000μg/mL、1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL和0μg/mL)，37℃孵育60min。
5、完成步骤4后，取所述96孔酶标板，弃上清，每孔加入200μL的1×洗涤液，静置30s，甩干，重复洗涤5次；最后在吸水纸上拍干。
6、完成步骤5后，取所述96孔酶标板，每孔加入50μL的辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体稀释液(用pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液将辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体稀释至5000倍体积)，37℃孵育60min。
7、重复步骤5一次。
8、完成步骤7后，取所述96孔酶标板，每孔加入100μL的1×TMB ELISA SubstrateSolution，37℃孵育15min。
9、完成步骤8后，取所述96孔酶标板，每孔加入50μL的2M H2SO4水溶液，混匀，于15min内在酶标仪测量在450nm波长下的吸光值。以抗dsDNA抗体标准品溶液的浓度为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
根据步骤9制备的标准曲线，计算完成步骤一中2后第22天的小鼠血清中抗双链DNA抗体的滴度。
三、抗核抗体(ANA)滴度的分析
采用细胞核抗体ELISA检测试剂盒测定小鼠血清中抗核抗体滴度，酶标板、抗核抗体标准品和酶结合物均为该试剂盒中组分。具体步骤如下：
1、将细胞核抗体ELISA检测试剂盒平衡至室温。
2、完成步骤1后，取所述细胞核抗体ELISA检测试剂盒中的酶标板，每孔加入50μL步骤二中1制备的上清稀释液或不同浓度的抗核抗体标准品溶液(用pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液稀释，浓度分别为2000μg/mL、1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL或0μg/mL)，37℃孵育60min。
3、完成步骤2后，取所述酶标板，每孔加入50μL酶结合物，充分混匀，封板，置于37℃孵育30min。
4、完成步骤3后，取所述酶标板，弃上清，每孔加入200μL的1×洗涤液，静置30s，甩干，重复洗涤5次；最后在吸水纸上拍干。
5、完成步骤4后，取所述酶标板，每孔加入100μL的1×TMB ELISA SubstrateSolution，37℃孵育15min。
6、完成步骤5后，取所述酶标板，每孔加入50μL的2M H2SO4水溶液，混匀，于15min内在酶标仪测量在450nm波长下的吸收值。以抗核抗体标准品溶液的浓度为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
根据标准曲线，计算完成步骤一中2后第22天的小鼠血清中抗核抗体滴度。
四、尿蛋白浓度的检测
采用尿蛋白检测试剂盒检测尿蛋白，操作步骤按照尿蛋白检测试剂盒的说明书进行,CBB试剂为尿蛋白检测试剂盒中的组件。具体步骤如下：
取三个EP管，依次标记为空白管、标准管和测定管：空白管中加入双蒸水0.05mL和CBB试剂3.0mL；标准管中加入浓度为563mg/L的蛋白标准液0.05mL和CBB试剂3.0mL；测定管中加入完成步骤一中2后第22天的小鼠尿液0.05mL和CBB试剂3.0mL。各管充分混匀后放置5min，然后使用分光光度计检测在595nm处各管的吸光度，按照下述公式计算步骤一中2后第22天的小鼠尿液中的尿蛋白浓度：
尿蛋白浓度(mg/L)＝测定管的OD值－空白管的OD值/标准管的OD值－空白管的OD值×563mg/L。
五、小鼠生存率的统计
完成上述步骤一后，统计各组的小鼠的生存率和小鼠的死亡时间。
小鼠的抗双链DNA抗体滴度的检测结果见图4。结果表明，pgp96处理组5、pgp96处理组6、rgp96处理组5和rgp96处理组6中小鼠血清中抗双链DNA抗体滴度显著小于对照组(P<0.01)。pgp96处理组5和rgp96处理组5中小鼠血清中抗双链DNA抗体滴度无显著差异。pgp96处理组6和rgp96处理组6中小鼠血清中抗双链DNA抗体滴度无显著差异。pgp96处理组5和rgp96处理组5中小鼠血清中抗双链DNA抗体滴度均小于pgp96处理组6和rgp96处理组6，因此，最佳免疫剂量为100μg pgp96/只或100μgrgp96/只。
小鼠的抗核抗体滴度的检测结果见图5。结果表明，pgp96处理组5、pgp96处理组6、rgp96处理组5和rgp96处理组6中小鼠血清中抗核抗体滴度显著小于对照组(P<0.01)。pgp96处理组5和rgp96处理组5中小鼠血清中抗核抗体滴度无显著差异。pgp96处理组6和rgp96处理组6中小鼠血清中抗核抗体滴度无显著差异。pgp96处理组5和rgp96处理组5中小鼠血清中抗核抗体滴度均小于pgp96处理组6和rgp96处理组6，因此，最佳免疫剂量为100μgpgp96/只或100μgrgp96/只。
小鼠尿液中的尿蛋白浓度的检测结果见图6。结果表明，pgp96处理组5、pgp96处理组6、rgp96处理组5和rgp96处理组6中小鼠尿液中尿蛋白浓度显著小于对照组(P<0.01)。pgp96处理组5和rgp96处理组5中小鼠尿液中尿蛋白浓度无显著差异。pgp96处理组6和rgp96处理组6中小鼠尿液中尿蛋白浓度无显著差异。pgp96处理组5和rgp96处理组5中小鼠尿液中尿蛋白浓度均小于pgp96处理组6和rgp96处理组6，因此，最佳免疫剂量为100μgpgp96/只或100μgrgp96/只。
小鼠的生存率统计结果见图7。结果表明，pgp96处理组5、pgp96处理组6、rgp96处理组5和rgp96处理组6中的小鼠开始死亡的时间为30周龄；对照组中的小鼠开始死亡的时间为20周龄。因此，经过pgp96或rgp96处理后，小鼠的生存时间显著延长。而且pgp96处理组5和rgp96处理组5中小鼠的生存期均高于pgp96处理组6和rgp96处理组6，因此，最佳免疫剂量为100μg pgp96/只或100μgrgp96/只。
上述结果表明，用pgp96或rgp96免疫发病小鼠，能够有效的治疗或减轻SLE症状，同时发病小鼠的生存时间延长。
实施例5、pgp96对系统性红斑狼疮患者的影响
1位于2014年7月南京军区南京总医院确诊为系统性红斑狼疮的患者(为知情同意的志愿者)，女，44岁。自身免疫性溶血贫血3年余。自身指标如下：血小板52，抗核抗体1:320，抗U1RNP抗体阳性，抗SSA抗体、抗核糖体P蛋白抗体阳性。将患者进行如下治疗：实验第1天，肌肉注射实施例1制备的pgp96的溶液；实验第8天，再次肌肉注射实施例1制备的pgp96的溶液；实验第22天，再次肌肉注射实施例1制备的pgp96的溶液。每次注射剂量均为100μgpgp96/只。完成最后一次注射后半年，检测该患者的指标，结果如下：血小板152，抗核抗体，抗U1RNP抗体，抗SSA抗体、抗核糖体P蛋白抗体全部转阴性。
上述结果表明，pgp96可治疗系统性红斑狼疮。

Claims (8)

1. 如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的热休克蛋白gp96在制备缓解系统性红斑狼疮的症状和/或治疗系统性红斑狼疮的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缓解系统性红斑狼疮的症状和/或治疗系统性红斑狼疮包括A1~A6中至少一种;
A1)降低抗双链DNA抗体滴度；
A2)降低抗核抗体滴度；
A3)降低尿蛋白浓度；
A4)延长生存时间；
A5)提高血小板的数量；
A6)使抗核抗体和/或抗U1RNP抗体和/或抗SSA抗体和/或抗核糖体P蛋白抗体由阳性转为阴性。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述热休克蛋白gp96的获得方式为D1)或D2)：
D1)从离体哺乳动物的胎盘组织中提取；
D2)将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中，培养，纯化。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述D2)中，所述受体为Sf9细胞。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中通过向受体中导入重组载体实现；所述重组载体为将所述热休克蛋白gp96的编码基因插入出发质粒得到的重组质粒。
6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述重组载体为重组质粒pFastBac1-gp96；所述重组质粒pFastBac1-gp96为在质粒pFastBac1的多克隆位点插入SEQ ID NO:1所示的DNA分子得到的重组质粒。
7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述重组质粒pFastBac1-gp96为将质粒pFastBac1的EcoRⅠ 和XbaⅠ 识别序列间的片段替换为SEQ ID NO:1所示的DNA分子得到的重组质粒。
8.如权利要求1至7任一所述的应用，其特征在于：所述产品为药物。
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