CN108578680A - 重组tra1蛋白在治疗肝衰竭的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了重组TRA1蛋白在治疗肝衰竭的应用。本发明的实验发现TRA1蛋白具有如下A1)至A7)中的至少一种功能：A1)诱导调节性T细胞的产生；A2)预防和/或治疗肝衰竭；A3)预防和/或治疗肝损伤；A4)降低血液中ALT的含量；A5)预防和/或治疗肝脏炎症；A6)降低血液中促炎性细胞因子的含量；A7)保护肝脏。因此，TRA1蛋白对预防和治疗肝衰竭和/或缓解肝衰竭的症状有重要的应用价值，可以用来制备相关药物。

Description

重组TRA1蛋白在治疗肝衰竭的应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域中，重组TRA1蛋白在治疗肝衰竭的应用。
背景技术
肝衰竭是指肝脏的合成和代谢功能发生严重障碍，临床上表现为黄疸、腹水、肝性脑病和凝血功能障碍，可导致多器官功能衰竭和死亡。临床上将肝衰竭分为四型：急性肝衰竭(ALF)、亚急性肝衰竭(SALF)、慢加急性肝衰竭(ACLF)及慢性肝衰竭(CLF)。在中国，以HBV为主的肝炎病毒及其他非嗜肝病毒的感染是导致肝衰竭的首要原因。在肝衰竭的发病过程中，肝细胞的大量坏死、炎性细胞的浸润以及肝脏缺血性损伤是其核心环节。研究表明，免疫应答，尤其是Kupffer细胞、树突状细胞(DC)、自然杀伤细胞(NK细胞)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)等免疫细胞的活化和细胞因子的产生在肝衰竭的发病中发挥了重要作用。在病毒介导的肝衰竭早期，天然免疫细胞会通过分泌大量炎性细胞因子或者通过直接接触的方式，诱发肝脏细胞的损伤；其中DC能够活化辅助T细胞，启动适应性免疫应答，在肝衰竭晚期，获得性免疫起主导作用，CTL通过Fas/FasL或穿孔素途径直接杀伤感染的肝细胞或通过分泌抗病毒因子清除病毒。调节性T细胞(Treg)是一类免疫抑制细胞，活化的Treg通过分泌IL－10和TGFβ，抑制效应T细胞增殖和功能的发挥，从而抑制适应性免疫应答。
目前针对肝衰竭的治疗主要包括:抗病毒治疗、支持器官功能人工肝、肝移植和免疫治疗。人工肝治疗主要发挥其替代肝脏解毒的功能，但它不具备肝脏的合成功能、生物转化功能等。虽然肝移植可以明显改善肝衰竭患者的生存率，但器官供体严重短缺、耗资巨大、术后各种并发症等缺点限制了其广泛应用。上述传统治疗肝衰竭方法的效果有一定的局限性，研究更为有效的干预手段已成为目前关注的热点。
TRA1蛋白是一类在生物进化中高度保守且广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质，该蛋白在细胞内质网上含量非常丰富。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何治疗肝衰竭。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了TRA1蛋白在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下A1)至A7)中的至少一种：
A1)诱导调节性T细胞的产生；
A2)预防和/或治疗肝衰竭；
A3)预防和/或治疗肝损伤；
A4)降低血液中ALT的含量；
A5)预防和/或治疗肝脏炎症；
A6)降低血液中促炎性细胞因子的含量；
A7)保护肝脏。
上述应用中，所述A1)、所述A2)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、所述A6)和所述A7)中，所述TRA1蛋白的剂量可为向哺乳动物注射100-500μg所述TRA1蛋白。所述TRA1蛋白的注射次数可为1-3次。所述哺乳动物可为人或鼠。所述鼠具体可为小鼠。
所述TRA1蛋白可为b1)或b2)：
b1)哺乳动物TRA1蛋白；
b2)人源TRA1蛋白。
进一步，所述TRA1蛋白可为a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2的第2-783位的蛋白质；
a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a3)在a1)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a4)将序列表中序列2的第2-783位或序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
所述TRA1蛋白的获得方式可为D1)：
D1)将编码所述TRA1蛋白的核酸分子导入受体中使所述TRA1蛋白得到表达，获得所述TRA1蛋白。
上述应用中，编码所述TRA1蛋白的核酸分子可为d1)或d2)或d3)或d4)：
d1)核苷酸序列是序列表中序列1自5’端起第4位至2352位所示的DNA分子；
d2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述TRA1蛋白的DNA分子；
d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述TRA1蛋白的DNA分子。
上述应用中，所述TRA1蛋白的获得方式为D1)：
D1)将编码所述TRA1蛋白的核酸分子导入受体中，培养，纯化。
所述D1)中，所述“将编码所述TRA1蛋白的核酸分子导入受体中”可通过向受体中导入重组载体实现；所述重组载体可为将所述TRA1蛋白的编码基因插入出发载体得到的重组载体。
所述重组载体具体可为重组质粒pFastBac 1-TRA1。所述重组质粒pFastBac1-TRA1可为在质粒pFastBacTM 1的多克隆位点插入序列表中序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。
所述重组质粒pFastBac 1-TRA1具体可为将质粒pFastBacTM 1的EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ识别序列间的片段(质粒pFastBac 1被限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。
所述D1)中，所述受体可为Sf9细胞。
所述调节性T细胞可为CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞；
所述肝损伤可为肝衰竭导致的肝损伤或ConA诱发的肝损伤；
所述肝衰竭可为ConA诱发的肝衰竭；
所述促炎性细胞因子可为TNF-α、IFN-γ和/或IL-6。
所述产品可为药物或疫苗。
本发明还提供了一种产品，所述产品含有所述TRA1蛋白；所述产品的功能为如下A1)至A7)中的至少一种：
A1)诱导调节性T细胞的产生；
A2)预防和/或治疗肝衰竭；
A3)预防和/或治疗肝损伤；
A4)降低血液中ALT的含量；
A5)预防和/或治疗肝脏炎症；
A6)降低血液中促炎性细胞因子的含量；
A7)保护肝脏。
上述产品中，所述A1)、所述A2)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、所述A6)和所述A7)中，所述TRA1蛋白的剂量可为向哺乳动物注射100-500μg所述TRA1蛋白。所述TRA1蛋白的注射次数可为1-3次。所述哺乳动物可为人或鼠。所述鼠具体可为小鼠。
上述产品中，所述调节性T细胞可为CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞；
所述肝损伤可为肝衰竭导致的肝损伤或ConA诱发的肝损伤；
所述肝衰竭可为ConA诱发的肝衰竭；
所述促炎性细胞因子可为TNF-α、IFN-γ和/或IL-6。
所述产品可为药物。
本发明的实验证明，TRA1蛋白具有预防和治疗肝衰竭、诱导调节性T细胞的产生、短期产生且长期提供免疫保护肝脏、缓解肝衰竭的症状、降低血液ALT含量、降低血液促炎性细胞因子含量的功能。因此，TRA1蛋白对预防和治疗肝衰竭和/或缓解肝衰竭的症状有重要的应用价值。
附图说明
图1为rTRA1的SDS-PAGE和Western Blot的鉴定结果。
图2为用rTRA1免疫小鼠的脾脏Treg细胞比例上调的检测结果。
图3为用rTRA1免疫小鼠经ConA诱导肝衰竭后血清ALT检测结果。
图4为用rTRA1免疫小鼠用ConA诱导肝衰竭后血清细胞因子检测结果。a为IFN-γ的检测结果，b为TNF-α的检测结果，c为IL-6的检测结果，d为IL-10的检测结果。
图5为用rTRA1免疫小鼠用ConA诱导肝衰竭后肝脏HE染色的检测结果。
图6为用rTRA1免疫小鼠后开始提供免疫保护的时间的检测结果。
图7为用rTRA1免疫小鼠后持续提供免疫保护的时间的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
获取小鼠脾脏淋巴细胞的具体方法参考如下文献：Zhen Liu，Xinghui Li，LipengQiu，et al.Treg suppress CTL responses upon immunization with HSPgp96.Eur.J.mmunol，2009，39(11)：3110–3120.
HepG2细胞(人肝癌细胞)为ATCC公司产品，产品目录号为HB-8065TM。Sf9细胞为Invitrogen公司产品，产品目录号为11496-015。Cellfectin II reagent为Lifetechnologies公司产品，产品目录号为10362-100。质粒pFastBacTM 1为Invitrogen公司产品，产品目录号为10359-016。TRA1单克隆抗体为Santa Cruz公司产品，产品目录号为sc-56399。辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，产品目录号为ZB-2307。HiTrap-Q Sepharose离子交换层析柱为GE公司产品，产品目录号为17-5053-01。Superdex 200 10/300GL分子筛层析柱为GE公司产品，产品目录号为17517501。大肠杆菌DH10Bac感受态细胞为北京原平皓生物技术有限公司产品，产品目录号为CL108-01。FITC-anti-CD3、PE-anti-CD4、Percp-Cy5.5-anti-CD25、固定/破膜剂、1×破膜液和APC-anti-Foxp3均为eBioscience公司产品，产品目录号分别为11-0031-63、12-0041-81、45-0251-80、00-5521-00、00-8333-56和17-5773-80。
Insect-XPRESSTM Protein-free Insect Cells medium with L-Glutamine为LONZA公司产品，产品目录号为12-730Q。
刀豆蛋白ConA为Sigma公司产品，产品目录为C2010。ALT检测试剂盒为上海荣盛生物药业有限公司产品。细胞因子检测试剂盒为eBioscience产品，相应的产品货号分别为88-7314-88(IFN-γ)，88-7324-88(TNF-α)，88-7064-88(IL-6)，88-7105-88(IL-10)。超滤管为Merck Millipore公司产品，产品目录号为UFC905096。
小鼠为斯贝福生物技术有限公司的雌性Babl/c小鼠。
实施例1、重组TRA1蛋白的制备
一、重组质粒pFastBac 1-TRA1的构建
1、采用Trizol法提取HepG2细胞的RNA，然后进行反转录获得cDNA。
2、根据人TRA1基因(GenBank号为AY040226.1)的序列，人工合成引物F1：5’-GGAATTCATGGACGATGAAGTTGAT-3’(下划线为限制性内切酶EcoR Ⅰ识别序列)和R1：5’-GCTCTAGACTATTAGAATTCATCTTTTTC-3’(下划线为限制性内切酶Xba Ⅰ识别序列)。
3、完成步骤1和2后，以步骤1获得的cDNA为模板，以步骤2合成的F1和R1为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
4、用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。
5、用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切质粒pFastBacTM 1，回收约4700bp的载体骨架。
6、将步骤4的酶切产物与步骤5的载体骨架连接，得到连接产物。
7、将步骤6获得的连接产物转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，得到重组大肠杆菌，然后提取该重组大肠杆菌的质粒，获得重组质粒pFastBac 1-TRA1。
根据测序结果，对重组质粒pFastBac 1-TRA1进行结构描述如下：将质粒pFastBacTM 1的EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ识别序列间的片段(质粒pFastBacTM 1被限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中序列1所示的双链DNA分子。重组质粒pFastBac 1-TRA1表达重组TRA1蛋白(以下简称rTRA1)，rTRA1的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
二、rTRA1的表达
1、将步骤一构建的重组质粒pFastBac 1-TRA1共转染Sf9细胞(每1×106个Sf9细胞约转染4μg重组质粒pFastBac 1-TRA1；共转染过程中，转染试剂为Cellfectin IIreagent，27℃孵育72h，离心，上清液即为P1代病毒。
2、将Sf9细胞悬浮液1(含1×108个Sf9细胞)27℃培养8～10h，得到培养细胞；然后向所述培养细胞中加入P1代病毒(剂量为0.05～0.1MOI)，27℃孵育72h，4000rpm离心5min，上清液即为P2代病毒。
3、向Sf9细胞悬浮液2(含1.6×108个Sf9细胞)中加入P2代病毒(剂量为0.05～0.1MOI)，27℃、100～120rpm培养72h，4000rpm离心5min，上清液即为P3代病毒。
以TRA1单克隆抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体作为二抗，对P3代病毒进行western杂交，western杂交具体步骤参考如下文献：张悦鸣，段跃强，罗德炎，姚惠娟，王希良，李志奎.小鼠可溶性IL-5α受体在Bac-to-Bac系统中的表达及其鉴定[J].中国生物制品学杂志，2013，26：5.
western杂交实验结果表明，rTRA1在Sf9细胞中表达。
三、rTRA1的纯化
1、向300ml的Sf9细胞悬浮液3(含4.5×108个Sf9细胞)中加入P3代病毒(剂量为5MOI)，27℃、100～120rpm培养72h，得到悬浮液。
2、取步骤1培养得到的悬浮液，7000rpm离心20min，获得上清液1。
3、取步骤2的上清液1，经0.22mm滤膜过滤，获得上样液。
4、将步骤3得到的上样液上样于HiTrap-Q Sepharose离子交换层析柱(流速为1mL/min)，然后先用5mL的缓冲液1(缓冲液1为向pH7.5、20mM Tris-Cl中添加NaCl得到的NaCl浓度为200mM的缓冲液)冲洗(流速为1mL/min)；再用10mL的缓冲液2(缓冲液2为向pH7.5、20mM Tris-Cl中添加NaCl得到的NaCl浓度为300mM的缓冲液)(流速为1mL/min)；最后用3mL的缓冲液3(缓冲液3为向pH7.5、20mM Tris-Cl中添加NaCl得到的NaCl浓度为600mM的缓冲液)冲洗(流速为1mL/min)，收集过柱后溶液并采用截留分子量为50KD的超滤管进行超滤浓缩，得到1mL左右的浓缩液。所得浓缩液即含有rTRA1。
5、将步骤4得到的浓缩液上样于Superdex 200 10/300GL分子筛层析柱(流速为0.25mL/min)，然后用缓冲液4(缓冲液4为向pH7.5、20mM Tris-Cl中添加NaCl得到的NaCl浓度为150mM的缓冲液)洗涤(流速为0.25mL/min)，收集为9～12mL处的穿透液，进一步采用截留分子量为50KD的超滤管进行超滤浓缩，得到rTRA1的溶液。采用BCA法测定rTRA1的溶液中的蛋白浓度，最后分装，贮存于-80℃。
将步骤5得到的rTRA1的溶液进行SDS-PAGE电泳分析，实验结果见图1中左图(泳道1为高分子量标准蛋白质，泳道2为rTRA1)。将步骤5得到的rTRA1的溶液进行Western blot(WB)(以TRA1单克隆抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体作为二抗)，实验结果见图1中右图。结果表明，rTRA1的溶液显示单一分子量条带，对应的分子量为96kDa，符合rTRA1的大小。
实施例2、rTRA1在诱导小鼠调节性T细胞时剂量的确定
一、小鼠分组免疫
将40只7周龄体重为16-18g的小鼠随机分成rTRA1处理组1、rTRA1处理组2、rTRA1处理组3和对照组1(每组10只)，分别进行如下处理：
rTRA1处理组1：实验第1天，皮下注射实施例1制备的rTRA1的溶液；实验第8天，再次皮下注射实施例1制备的rTRA1的溶液；实验第22天，再次皮下注射实施例1制备的rTRA1的溶液。每次注射剂量均为100μg rTRA1/只。
rTRA1处理组2：按照rTRA1处理组1的操作步骤进行，仅将注射剂量100μg rTRA1/只替换为200μg rTRA1/只。
rTRA1处理组3：按照rTRA1处理组1的操作步骤进行，仅将注射剂量100μg rTRA1/只替换为500μg rTRA1/只。
对照组1：实验第1天皮下注射pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液，实验第8天，再次皮下注射pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液；实验第22天，再次皮下注射pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液。每次注射剂量均为100μL/只。
二、小鼠淋巴细胞的分离
1、取完成步骤一后第8天的小鼠，每组各取10只，获取小鼠脾脏淋巴细胞。
2、取小鼠脾脏淋巴细胞(少于1×106个)，1000rpm离心10min，弃上清，收集小鼠脾脏淋巴细胞。
3、完成步骤2后，加入100μL含5％BSA的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液重悬细胞，得到混合液甲，4℃封闭20min。
4、完成步骤3后，取混合液甲，加入FITC-anti-CD3、PE-anti-CD4和Percp-Cy5.5-anti-CD25，4℃避光孵育20min。
5、完成步骤4后，取孵育后的混合液甲，加入1mL pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液，震荡混匀，1000rpm离心10min，收集小鼠脾脏淋巴细胞，然后用400μL pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液重悬，得到混合液乙。
6、完成步骤5后，取混合液乙，加入600μL固定/破膜剂，4℃破膜30min(实际操作过程中不超过1h即可)；然后1000rpm离心10min，收集沉淀，得到沉淀1。
7、完成步骤6后，取沉淀1，加入1mL 1×破膜液重悬，1000rpm离心10min，得到沉淀2和上清液丙。取100μL上清液丙重悬沉淀2，得到混合液丙；向混合液丙中加入APC-anti-Foxp3，4℃避光孵育30min。
8、完成步骤7后，取孵育后的混合液丙，加入1mL 1×破膜液重悬，1000rpm离心10min，收集沉淀，得到沉淀3。取400μL多聚甲醛浓度为4g/100mL的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液(该溶液为将4g多聚甲醛溶解到100ml额pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液中得到的液体)重悬沉淀3，然后用流式细胞仪分析小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞的频率。
实验结果见图2，rTRA1处理组1、rTRA1处理组2、rTRA1处理组3的小鼠CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞的频率均显著高于对照组1(*P值均<0.1)，说明100-500μg的rTRA1均可以有效激活小鼠体内的调节性T细胞(Treg细胞)。
实施例3、rTRA1在治疗肝衰竭中的应用
一、小鼠分组免疫
将20只7周龄体重为16-18g的小鼠随机分成rTRA1处理组4和对照组2(每组10只)，分别进行如下处理：
rTRA1处理组4：实验第1天，皮下注射实施例1制备的rTRA1的溶液；实验第8天，再次皮下注射实施例1制备的rTRA1的溶液；实验第22天，再次皮下注射实施例1制备的rTRA1的溶液。每次注射剂量均为100μg rTRA1/只。
对照组2：实验第1天皮下注射pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液，实验第8天，再次皮下注射pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液；实验第22天，再次皮下注射pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液。每次注射剂量均为100μL/只。
二、小鼠肝衰竭的诱导
取完成步骤一后第8天(即实验第30天)的小鼠，尾静脉注射ConA，剂量为15μg/g，ConA溶在pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液中后注射，注射体积200μl。注射完成后，诱导12h。
三、小鼠血清ALT的检测
1、取完成步骤二的小鼠，摘眼球取血。室温静置1h，8000rpm离心，取血清。
2、按照ALT检测试剂盒说明书步骤，检测各组小鼠的血清中的丙氨酸氨基转移酶ALT。
四、小鼠血清细胞因子的检测
按照eBioscience的细胞因子检测试剂盒说明书的步骤，检测两组小鼠血清中TNF-α、IFN-γ和IL-6和IL-10的水平。
五、小鼠肝脏组织HE染色
1、将经过ConA诱导后的小鼠的肝脏组织取出一部分，在4％甲醛中固定48h，然后送到医院做石蜡切片。
2、将石蜡切片置于烘箱中60℃烤1h。
3、步骤2结束后，将石蜡切片以此经过二甲苯、二甲苯、100％乙醇、100％乙醇、95％乙醇水溶液、90％乙醇水溶液、75％乙醇水溶液和水进行脱蜡处理，每步5min。
4、步骤3结束后，将切片在苏木素染液中染5分钟，流水冲洗。
5、步骤4结束后，将切片在1％盐酸乙醇中分化10秒钟，流水冲洗30秒。
6、步骤5结束后，将切片用0.5％伊红Y染1min，流水冲洗30秒。
7、步骤6结束后，将石蜡切片以此经过75％乙醇水溶液、90％乙醇水溶液、95％乙醇水溶液、100％乙醇、100％乙醇、二甲苯、二甲苯进行脱水，每步3min。
8、步骤7结束后，中性树胶进行封片。
小鼠的ALT检测的实验结果见图3，和对照组2中小鼠相比，rTRA1处理组4中小鼠的血清ALT显著降低(**P<0.01)，说明对小鼠进行100μg的rTRA1免疫能有效的降低血液中ALT的含量，能有效的预防和减轻小鼠的肝衰竭的发病症状。图3中，PBS+ConA表示对照组2，rTRA1+ConA表示rTRA1处理组4。
小鼠的血清细胞因子的检测的实验结果见图4，rTRA1处理组4中小鼠的血清中的具有促炎性细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的水平均明显低于对照组2(**P值均小于0.01)，说明rTRA1免疫过的小鼠经过ConA诱导后肝损伤程度明显得到减缓，炎症水平明显降低；而且rTRA1处理组4小鼠血清中具有抑制免疫过度活化的细胞因子IL-10的表达水平显著高于对照组2小鼠(*P<0.1)，说明rTRA1免疫可以激活小鼠体内的免疫调节系统，从而抑制免疫反应的过度活化。图4中，PBS+ConA表示对照组2，rTRA1+ConA表示rTRA1处理组4。
小鼠的肝脏切片的HE染色实验结果见图5。结果显示，rTRA1处理组4的小鼠经过ConA诱导后的肝脏损伤程度明显低于对照组2，且充血程度明显低于对照组2，说明rTRA1可以有效地预防和减轻ConA介导的对肝脏的直接损伤。图5中，PBS+ConA表示对照组2，rTRA1+ConA表示rTRA1处理组4。
实施例4、rTRA1诱导小鼠产生免疫保护的时间确定
一、小鼠免疫
将7周龄的体重为16-18g的小鼠，随机分成rTRA1处理组5、rTRA1处理组6、rTRA1处理组7和对照组3、对照组4、对照组5(每组10只)，分别进行如下处理：
rTRA1处理组5、6、7：实验第1天，皮下注射实施例2制备的rTRA1的溶液；注射剂量均为100μg rTRA1/只。
对照组3、4、5：实验第1天皮下注射pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液，注射剂量均为100μL/只。
二、小鼠诱导肝衰竭
实验第7天，将rTRA1处理组5和对照组3小鼠尾静脉注射ConA，剂量为15μg/g，ConA溶于pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液中进行注射，注射体积为200μl。注射完成后，诱导12h，将小鼠摘眼球取血后处死。
实验第10天，将rTRA1处理组6和对照组4小鼠尾静脉注射ConA，剂量为15μg/g，ConA溶于pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液中进行注射，注射体积为200μl。注射完成后，诱导12h，将小鼠摘眼球取血后处死。
实验第14天，将rTRA1处理组7和对照组5小鼠尾静脉注射ConA，剂量为15μg/g，ConA溶于pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液中进行注射，注射体积为200μl。注射完成后，诱导12h，将小鼠摘眼球取血后处死。
三、小鼠血清ALT的检测
1、取步骤二中的各组小鼠血液，室温静置1h，8000rpm离心，取血清。
2、按照ALT检测试剂盒说明书，检测各组小鼠的血清中的丙氨酸氨基转移酶ALT。
ALT检测的实验结果见图6，结果表明，rTRA1处理组6和rTRA1处理组7中的小鼠都产生了免疫保护，说明，rTRA1在免疫后的第10天即可产生免疫保护作用。图6中，a表示对照组3，b表示rTRA1处理组5，c表示对照组4，d表示rTRA1处理组6，e表示对照组5，f表示rTRA1处理组7。
实施例5、rTRA1诱导小鼠产生的免疫保护的持续时间的确定
一、小鼠免疫
按将60只7周龄的体重为16-18g的小鼠，随机分成rTRA1处理组8、rTRA1处理组9、rTRA1处理组10和对照组6、对照组7、对照组8(每组10只)，分别进行如下处理：
rTRA1处理组8、rTRA1处理组9、rTRA1处理组10：实验第1天，皮下注射实施例2制备的rTRA1的溶液；实验第8天，再次皮下注射实施例2制备的rTRA1的溶液；实验第22天，再次皮下注射实施例2制备的rTRA1的溶液。每次注射剂量均为100μg rTRA1/只。
对照组6、对照组7、对照组8、：实验第1天皮下注射pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液，实验第8天，再次皮下注射pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液；实验第22天，再次皮下注射pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液。每次注射剂量均为100μL/只。
二、小鼠诱导肝衰竭
实验第52天，将rTRA1处理组8和对照组6小鼠尾静脉注射ConA，剂量为15μg/g，ConA溶于pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液中进行注射，注射体积为200μl。注射完成后，诱导12h，将小鼠摘眼球取血后处死。
实验第82天，将rTRA1处理组9和对照组7小鼠尾静脉注射ConA，剂量为15μg/g，ConA溶于pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液中进行注射，注射体积为200μl。注射完成后，诱导12h，将小鼠摘眼球取血后处死。
实验第112天，将rTRA1处理组10和对照组8小鼠尾静脉注射ConA，剂量为15μg/g，ConA溶于pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液中进行注射，注射体积为200μl。注射完成后，诱导12h，将小鼠摘眼球取血后处死。
三、小鼠血清ALT的检测
1、取步骤二中的各组小鼠血液，室温静置1h，8000rpm离心，取血清。
2、按照ALT检测试剂盒说明书步骤，检测各组小鼠的血清中的丙氨酸氨基转移酶ALT。
ALT检测的实验结果见图7，结果表明，rTRA1处理组8、rTRA1处理组9、rTRA1处理组10中的小鼠均具有免疫保护作用，能够显著降低ConA诱导后的血液ALT含量；说明小鼠在rTRA1免疫结束后可以提供较长时间的免疫保护，在至少第3个月时依然能够提供针对肝损伤的保护效果。图7中，a表示对照组6，b表示rTRA1处理组8，c表示对照组7，d表示rTRA1处理组9，e表示对照组8，f表示rTRA1处理组10。
上述结果表明，用rTRA1免疫小鼠，能够有效的预防或减轻肝衰竭的症状。
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 重组TRA1蛋白在治疗肝衰竭的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2352
<212> DNA
<213> 人
<400> 1
atggacgatg aagttgatgt ggatggtaca gtagaagagg atctgggtaa aagtagagaa 60
ggatcaagga cggatgatga agtagtacag agagaggaag aagctattca gttggatgga 120
ttaaatgcat cacaaataag agaacttaga gagaagtcgg aaaagtttgc cttccaagcc 180
gaagttaaca gaatgatgaa acttatcatc aattcattgt ataaaaataa agagattttc 240
ctgagagaac tgatttcaaa tgcttctgat gctttagata agataaggct aatatcactg 300
actgatgaaa atgctctttc tggaaatgag gaactaacag tcaaaattaa gtgtgataag 360
gagaagaacc tgctgcatgt cacagacacc ggtgtaggaa tgaccagaga agagttggtt 420
aaaaaccttg gtaccatagc caaatctggg acaagcgagt ttttaaacaa aatgactgaa 480
gcacaggaag atggccagtc gtcttctgaa ttgattggcc agtttggtgt cggtttctat 540
tccgccttcc ttgtagcaga taaggttatt gtcacttcaa aacacaacaa cgatacccag 600
cacatctggg agtctgactc caatgaattt tctgtaattg ctgacccaag aggaaacact 660
ctaggacggg gaacgacaat tacccttgtc ttaaaagaag aagcatctga ttaccttgaa 720
ttggatacaa ttaaaaatct cgtcaaaaaa tattcacagt tcataaactt tcctatttat 780
gtatggagca gcaagactga aactgttgag gagcccatgg aggaagaaga agcagccaaa 840
gaagagaaag aagaatctga tgatgaagct gcagtagagg aagaagaaga agaaaagaaa 900
ccaaagacta aaaaagttga aaaaactgtc tgggactggg aacttatgaa tgatatcaaa 960
ccaatatggc agagaccatc aaaagaagta gaagaagatg aatacaaagc tttctacaaa 1020
tcattttcaa aggaaagtga tgaccccatg gcttatattc actttactgc tgaaggggaa 1080
gttaccttca aatcaatttt atttgtaccc acatctgctc cacgtggtct gtttgacgaa 1140
tatggatcta aaaagagcga ttacattaag ctctatgtgc gccgtgtatt catcccagac 1200
gacttccatg atatgatgcc taaatacctc aattttgtca agggtgtggt ggactcagat 1260
gatctcccct tgaatgtttc ccgcgagact cttcagcaac ataaactgct taaggtgatt 1320
aggaagaagc ttgttcgtaa aacgctggac atgatcaaga agattgctga tgataaatac 1380
aatgatactt tttggaaaga atttggtacc aacatcaagc ttggtgtgat tgaagaccac 1440
tcgaatcgaa cacgtcttgc taaacttctt aggttccagt cttctcatca tccaactgac 1500
attactagcc tagaccagta tgtggaaaga atgaaggaaa aacaagacaa aatctacttc 1560
atggctgggt ccagcagaaa agaggctgaa tcttctccat ttgttgagcg acttctgaaa 1620
aagggctatg aagttattta cctcacagaa cctgtggatg aatactgtat tcaggccctt 1680
cccgaatttg atgggaagag gttccagaat gttgccaagg aaggagtgaa gttcgatgaa 1740
agtgagaaaa ctaaggagag tcgtgaagca gttgagaaag aatttgagcc tctgctgaat 1800
tggatgaaag ataaagccct taaggacaag attgaaaagg ctgtggtgtc tcagcgcctg 1860
acagaatctc cgtgtgcttt ggtggccagc cagtacggat ggtctggcaa catggagaga 1920
atcatgaaag cacaagcgta ccaaacgggc aaggacatct ctacaaatta ctatgcgagt 1980
cagaagaaaa catttgaaat taatcccaga cacccgctga tcagagacat gcttcgacga 2040
attaaggaag atgaagatga taaaacagtt ttggatcttg ctgtggtttt gtttgaaaca 2100
gcaacgcttc ggtcagggta tcttttacca gacactaaag catatggaga tagaatagaa 2160
agaatgcttc gcctcagttt gaacattgac cctgatgcaa aggtggaaga agagcccgaa 2220
gaagaacctg aggagacagc agaagacaca acagaagaca cagagcaaga cgaagatgaa 2280
gaaatggatg tgggaacaga tgaagaagaa gaaacagcaa aggaatctac agctgaaaaa 2340
gatgaattct aa 2352
<210> 2
<211> 783
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
Met Asp Asp Glu Val Asp Val Asp Gly Thr Val Glu Glu Asp Leu Gly
1 5 10 15
Lys Ser Arg Glu Gly Ser Arg Thr Asp Asp Glu Val Val Gln Arg Glu
20 25 30
Glu Glu Ala Ile Gln Leu Asp Gly Leu Asn Ala Ser Gln Ile Arg Glu
35 40 45
Leu Arg Glu Lys Ser Glu Lys Phe Ala Phe Gln Ala Glu Val Asn Arg
50 55 60
Met Met Lys Leu Ile Ile Asn Ser Leu Tyr Lys Asn Lys Glu Ile Phe
65 70 75 80
Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu Asp Lys Ile Arg
85 90 95
Leu Ile Ser Leu Thr Asp Glu Asn Ala Leu Ser Gly Asn Glu Glu Leu
100 105 110
Thr Val Lys Ile Lys Cys Asp Lys Glu Lys Asn Leu Leu His Val Thr
115 120 125
Asp Thr Gly Val Gly Met Thr Arg Glu Glu Leu Val Lys Asn Leu Gly
130 135 140
Thr Ile Ala Lys Ser Gly Thr Ser Glu Phe Leu Asn Lys Met Thr Glu
145 150 155 160
Ala Gln Glu Asp Gly Gln Ser Ser Ser Glu Leu Ile Gly Gln Phe Gly
165 170 175
Val Gly Phe Tyr Ser Ala Phe Leu Val Ala Asp Lys Val Ile Val Thr
180 185 190
Ser Lys His Asn Asn Asp Thr Gln His Ile Trp Glu Ser Asp Ser Asn
195 200 205
Glu Phe Ser Val Ile Ala Asp Pro Arg Gly Asn Thr Leu Gly Arg Gly
210 215 220
Thr Thr Ile Thr Leu Val Leu Lys Glu Glu Ala Ser Asp Tyr Leu Glu
225 230 235 240
Leu Asp Thr Ile Lys Asn Leu Val Lys Lys Tyr Ser Gln Phe Ile Asn
245 250 255
Phe Pro Ile Tyr Val Trp Ser Ser Lys Thr Glu Thr Val Glu Glu Pro
260 265 270
Met Glu Glu Glu Glu Ala Ala Lys Glu Glu Lys Glu Glu Ser Asp Asp
275 280 285
Glu Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys Pro Lys Thr Lys
290 295 300
Lys Val Glu Lys Thr Val Trp Asp Trp Glu Leu Met Asn Asp Ile Lys
305 310 315 320
Pro Ile Trp Gln Arg Pro Ser Lys Glu Val Glu Glu Asp Glu Tyr Lys
325 330 335
Ala Phe Tyr Lys Ser Phe Ser Lys Glu Ser Asp Asp Pro Met Ala Tyr
340 345 350
Ile His Phe Thr Ala Glu Gly Glu Val Thr Phe Lys Ser Ile Leu Phe
355 360 365
Val Pro Thr Ser Ala Pro Arg Gly Leu Phe Asp Glu Tyr Gly Ser Lys
370 375 380
Lys Ser Asp Tyr Ile Lys Leu Tyr Val Arg Arg Val Phe Ile Pro Asp
385 390 395 400
Asp Phe His Asp Met Met Pro Lys Tyr Leu Asn Phe Val Lys Gly Val
405 410 415
Val Asp Ser Asp Asp Leu Pro Leu Asn Val Ser Arg Glu Thr Leu Gln
420 425 430
Gln His Lys Leu Leu Lys Val Ile Arg Lys Lys Leu Val Arg Lys Thr
435 440 445
Leu Asp Met Ile Lys Lys Ile Ala Asp Asp Lys Tyr Asn Asp Thr Phe
450 455 460
Trp Lys Glu Phe Gly Thr Asn Ile Lys Leu Gly Val Ile Glu Asp His
465 470 475 480
Ser Asn Arg Thr Arg Leu Ala Lys Leu Leu Arg Phe Gln Ser Ser His
485 490 495
His Pro Thr Asp Ile Thr Ser Leu Asp Gln Tyr Val Glu Arg Met Lys
500 505 510
Glu Lys Gln Asp Lys Ile Tyr Phe Met Ala Gly Ser Ser Arg Lys Glu
515 520 525
Ala Glu Ser Ser Pro Phe Val Glu Arg Leu Leu Lys Lys Gly Tyr Glu
530 535 540
Val Ile Tyr Leu Thr Glu Pro Val Asp Glu Tyr Cys Ile Gln Ala Leu
545 550 555 560
Pro Glu Phe Asp Gly Lys Arg Phe Gln Asn Val Ala Lys Glu Gly Val
565 570 575
Lys Phe Asp Glu Ser Glu Lys Thr Lys Glu Ser Arg Glu Ala Val Glu
580 585 590
Lys Glu Phe Glu Pro Leu Leu Asn Trp Met Lys Asp Lys Ala Leu Lys
595 600 605
Asp Lys Ile Glu Lys Ala Val Val Ser Gln Arg Leu Thr Glu Ser Pro
610 615 620
Cys Ala Leu Val Ala Ser Gln Tyr Gly Trp Ser Gly Asn Met Glu Arg
625 630 635 640
Ile Met Lys Ala Gln Ala Tyr Gln Thr Gly Lys Asp Ile Ser Thr Asn
645 650 655
Tyr Tyr Ala Ser Gln Lys Lys Thr Phe Glu Ile Asn Pro Arg His Pro
660 665 670
Leu Ile Arg Asp Met Leu Arg Arg Ile Lys Glu Asp Glu Asp Asp Lys
675 680 685
Thr Val Leu Asp Leu Ala Val Val Leu Phe Glu Thr Ala Thr Leu Arg
690 695 700
Ser Gly Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Lys Ala Tyr Gly Asp Arg Ile Glu
705 710 715 720
Arg Met Leu Arg Leu Ser Leu Asn Ile Asp Pro Asp Ala Lys Val Glu
725 730 735
Glu Glu Pro Glu Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Glu Asp Thr Thr Glu
740 745 750
Asp Thr Glu Gln Asp Glu Asp Glu Glu Met Asp Val Gly Thr Asp Glu
755 760 765
Glu Glu Glu Thr Ala Lys Glu Ser Thr Ala Glu Lys Asp Glu Phe
770 775 780

Claims (9)

1.TRA1蛋白在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下A1)至A7)中的至少一种：
A1)诱导调节性T细胞的产生；
A2)预防和/或治疗肝衰竭；
A3)预防和/或治疗肝损伤；
A4)降低血液中ALT的含量；
A5)预防和/或治疗肝脏炎症；
A6)降低血液中促炎性细胞因子的含量；
A7)保护肝脏。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述TRA1蛋白为哺乳动物TRA1蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述TRA1蛋白为人源TRA1蛋白。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述TRA1蛋白为a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2的第2-783位的蛋白质；
a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a3)在a1)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a4)将序列表中序列2的第2-783位或序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述调节性T细胞为CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞；
所述肝损伤为肝衰竭导致的肝损伤或ConA诱发的肝损伤；
所述肝衰竭为ConA诱发的肝衰竭；
所述促炎性细胞因子为TNF-α、IFN-γ和/或IL-6。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：所述产品为药物或疫苗。
7.一种产品，含有权利要求1-4中任一所述TRA1蛋白；所述产品的功能为如下A1)至A7)中的至少一种：
A1)诱导调节性T细胞的产生；
A2)预防和/或治疗肝衰竭；
A3)预防和/或治疗肝损伤；
A4)降低血液中ALT的含量；
A5)预防和/或治疗肝脏炎症；
A6)降低血液中促炎性细胞因子的含量；
A7)保护肝脏。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于：所述调节性T细胞为CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞；
所述肝损伤为肝衰竭导致的肝损伤或ConA诱发的肝损伤；
所述肝衰竭为ConA诱发的肝衰竭；
所述促炎性细胞因子为TNF-α、IFN-γ和/或IL-6。
9.根据权利要求7或8所述的产品，其特征在于：所述产品为药物。
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