CN106039287A

CN106039287A - 热休克蛋白gp96在治疗类风湿性关节炎中的应用

Info

Publication number: CN106039287A
Application number: CN201610486258.6A
Authority: CN
Inventors: 孟颂东; 郑华国
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2016-06-28
Filing date: 2016-06-28
Publication date: 2016-10-26
Anticipated expiration: 2036-06-28
Also published as: CN106039287B

Abstract

本发明公开了热休克蛋白gp96在治疗类风湿性关节炎中的应用。本发明所提供的热休克蛋白gp96为a1)或a2)或a3)或a4)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2自N末端起第2位至783位所示的蛋白质；a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a3)在a1)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a4)将序列表中序列2自N末端起第2位至783位或序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。实验证明，热休克蛋白gp96对治疗类风湿性关节炎和/或缓解类风湿性关节炎的症状有重要的应用价值。

Description

热休克蛋白gp96在治疗类风湿性关节炎中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及热休克蛋白gp96在治疗类风湿性关节炎中的应用。

背景技术

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、炎性、系统性的自身免疫性疾病，以关节和关节组织非化脓性炎症为主要特征，主要表现为关节滑膜炎，终致关节的软骨、韧带、肌腱等各种组织以及多脏器损害。80％的RA患者的发病年龄在20～45岁之间，人群发病率为1％～2％，其中女性是男性的3倍。RA的基本病理改变是滑膜炎，急性期滑膜肿胀、渗出，粒细胞浸润；慢性期滑膜增生肥厚，形成血管豁，后者是造成关节破坏、关节畸形、障碍、使疾病进入不可逆阶段的病理基础。RA患者同时伴有发热、贫血、巩膜炎、心包炎、血管炎及淋巴肿大等关节外表现，血清中可以查到多种自身抗体，故称类风湿性关节炎。RA多侵犯肢体小关节，如手、足及腕关节等，常为对称性,可有暂时性缓解。未经系统治疗的类风湿性关节炎可反复迁延多年，最终导致关节畸形、功能丧失，给RA患者身心带来极大影响。

目前，类风湿性关节炎不论采用中医还是西医治疗均不可能根治，只能通过药物缓解病情，给RA患者及其家属带来巨大的经济和精神负担。因此，开发治疗或预防RA的药物具有重要的社会和经济意义。

热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)是一类在生物进化中高度保守且广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质。HSP根据同源程度和分子量大小可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、小分子HSP和泛素等多个亚家族。热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)gp96属于HSP90亚家族的成员，该蛋白是细胞内质网上含量最丰富的热休克蛋白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何治疗类风湿性关节炎。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了热休克蛋白gp96在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下A1)至A10)中的至少一种：

A1)治疗类风湿性关节炎；

A2)缓解类风湿性关节炎的症状；

A3)诱导调节性T细胞的产生；

A4)降低抗Ⅱ型胶原抗体滴度；

A5)降低TNF-α浓度；

A6)降低IL-1β浓度；

A7)降低IL-6浓度；

A8)降低IL-17浓度；

A9)降低细胞增殖能力；

A10)预防类风湿性关节炎。

上述应用中，所述A1)、所述A2)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、所述A6)、所述A7)、所述A8)、所述A9)和所述A10)中，所述热休克蛋白gp96的剂量可为向哺乳动物注射100μg～500μg所述热休克蛋白gp96(如100μg所述热休克蛋白gp96或500μg所述热休克蛋白gp96)。

上述应用中，所述A9)中，所述降低细胞增殖指数具体可为降低小鼠脾脏淋巴细胞在鸡Ⅱ型胶原刺激下的增殖能力。

所述哺乳动物可为人、鼠。所述鼠具体可为雌性DBA/1小鼠。

上述应用中，所述热休克蛋白gp96可为a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2自N末端起第2位至783位所示的蛋白质；

a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a3)在a1)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a4)将序列表中序列2自N末端起第2位至783位或序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

上述应用中，编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子可为d1)或d2)或d3)或d4)：

d1)核苷酸序列是序列表中序列1自5’端起第4位至2352位所示的DNA分子；

d2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述热休克蛋白gp96的DNA分子；

d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述热休克蛋白gp96的DNA分子。

上述应用中，所述热休克蛋白gp96的获得方式可为D1)或D2)：

D1)从离体哺乳动物的胎盘组织中提取；

D2)将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中，培养，纯化。

所述D1)中，所述哺乳动物可为人、鼠。所述鼠具体可为雌性DBA/1小鼠。

所述D2)中，所述“将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中”可通过向受体中导入重组载体实现；所述重组载体可为将所述热休克蛋白gp96的编码基因插入出发质粒得到的重组质粒。所述重组载体具体可为重组质粒pFastBac1-gp96。所述重组质粒pFastBac1-gp96具体可为在质粒pFastBac1的多克隆位点插入序列表中序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。

所述重组质粒pFastBac1-gp96具体可为将质粒pFastBac1的EcoRⅠ和XbaⅠ识别序列间的片段(质粒pFastBac1被限制性核酸内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。

所述D2)中，所述受体可为Sf9细胞。

上述应用中，所述调节性T细胞可为CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞。

上述应用中，所述产品可为药物。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种产品。

本发明所提供的产品，其活性成分为热休克蛋白gp96；所述产品的功能为如下A1)至A10)中的至少一种：

A1)治疗类风湿性关节炎；

A2)缓解类风湿性关节炎的症状；

A3)诱导调节性T细胞的产生；

A4)降低抗Ⅱ型胶原抗体滴度；

A5)降低TNF-α浓度；

A6)降低IL-1β浓度；

A7)降低IL-6浓度；

A8)降低IL-17浓度；

A9)降低细胞增殖能力；

A10)预防类风湿性关节炎。

上述产品中，所述A1)、所述A2)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、所述A6)、所述A7)、所述A8)、所述A9)和所述A10)中，所述热休克蛋白gp96的剂量可为向哺乳动物注射100μg～500μg所述热休克蛋白gp96(如100μg所述热休克蛋白gp96或500μg所述热休克蛋白gp96)。

上述产品中，所述A9)中，所述降低细胞增殖指数具体可为降低小鼠脾脏淋巴细胞在鸡Ⅱ型胶原刺激下的增殖能力。

所述哺乳动物可为人、鼠。所述鼠具体可为雌性DBA/1小鼠。

上述产品中，所述热休克蛋白gp96可为a1)或a2)或a3)或a4)：

a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a3)在a1)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

上述产品中，编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子可为d1)或d2)或d3)或d4)：

d2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

上述产品中，所述热休克蛋白gp96的获得方式可为D1)或D2)：

D1)从离体哺乳动物的胎盘组织中提取；

所述D2)中，所述受体可为Sf9细胞。

上述产品中，所述调节性T细胞可为CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞。

上述产品中，所述产品可为药物。

实验证明，所述热休克蛋白gp96具有治疗类风湿性关节炎、缓解类风湿性关节炎的症状、诱导调节性T细胞的产生、降低抗Ⅱ型胶原抗体滴度、降低小鼠脾脏淋巴细胞在鸡Ⅱ型胶原刺激下的增殖能力、降低血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17A等炎性细胞因子水平以及预防类风湿性关节炎的功能。因此，热休克蛋白gp96对治疗类风湿性关节炎和/或缓解类风湿性关节炎的症状具有重要的应用价值。

附图说明

图1为pgp96的Western blot鉴定结果。

图2为rgp96的SDS-PAGE和Western Blot的鉴定结果。

图3为用pgp96或rgp96免疫的小鼠的脾脏淋巴细胞中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的频率。

图4为用pgp96或rgp96免疫小鼠的小鼠类风湿关节炎的评分数值的实验结果。

图5为用pgp96或rgp96免疫小鼠的抗II型胶原抗体滴度的检测结果。

图6为用pgp96或rgp96免疫小鼠的细胞增殖指数。

图7为用pgp96或rgp96免疫小鼠的细胞因子检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

雌性DBA/1小鼠为北京维通利华实验动物有限责任公司产品；雌性DBA/1小鼠在下文中简称小鼠。

获取小鼠脾脏淋巴细胞的具体方法参考如下文献：Zhen Liu，Xinghui Li，LipengQiu，et al.Treg suppress CTL responses upon immunization with HSPgp96.Eur.J.mmunol，2009，39(11)：3110–3120.

HepG2细胞(人肝癌细胞)为ATCC公司产品，产品目录号为HB-8065^TM。Sf9细胞为Invitrogen公司产品，产品目录号为11496-015。Cellfectin II reagent为Lifetechnologies公司产品，产品目录号为10362-100。质粒pFastBac^TM1为Invitrogen公司产品，产品目录号为10359-016。gp96单克隆抗体为Santa Cruz公司产品，产品目录号为sc-56399。辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，产品目录号为ZB-2307。HiTrap-Q Sepharose离子交换层析柱为GE公司产品，产品目录号为17-5053-01。Superdex 200 10/300GL分子筛层析柱为GE公司产品，产品目录号为17517501。大肠杆菌DH10Bac感受态细胞为北京原平皓生物技术有限公司产品，产品目录号为CL108-01。FITC-anti-CD3、PE-anti-CD4、Percp-Cy5.5-anti-CD25、固定/破膜剂和APC-anti-Foxp3均为eBioscience公司产品，产品目录号分别为11-0031-63、12-0041-81、45-0251-80、00-5521-00和17-5773-80。Insect-XPRESS^TM Protein-free Insect Cellsmedium with L-Glutamine为LONZA公司产品，产品目录号为12-730Q。BSA、PMSF、NaHCO₃、MnCl₂、CaCl₂、NaCl、Tris和甲基α-D-吡喃甘露糖苷均为Sigma-Aldrich公司产品，产品目录号分别为V900933、P7626、792519、V900197、793639、746398、T1378和M6882。辣根过氧化物酶羊抗鼠抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，产品目录号为ZB-2305。TMB底物溶液为eBioscience公司产品，产品目录号为00-4201。RPMI 1640培养液为Invitrogen公司产品，产品目录号为11875093。ConA琼脂糖凝胶柱为GE公司产品，产品目录号为17-0440-01，该柱的规格为1.6×2.5cm，填充介质为Con A-Sepharose4B。Hitrap Q阴离子交换柱为GE公司产品，产品目录号为17-1153-01，该柱的规格为0.7×2.5cm。HRP标记的IgG抗体为SEROTEC公司产品，产品目录号为STAR117P。1×洗涤液为含0.1％(体积百分比)Triton-X100的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液。鸡Ⅱ型胶原、MTT、PHA和弗氏完全佐剂均为SigmaAldrich公司产品，产品目录号分别为C9301、M5655、L9017和F5881。96孔酶标板为美国Nunc公司产品。超滤管为Merck Millipore公司产品，产品目录号为UFC905096。

溶液A：溶质及其浓度为PMSF 1mM和NaHCO₃ 30mM；溶剂为蒸馏水；pH值为7.4。

溶液B：溶质及其浓度为2mM MnCl₂、2mM CaCl₂、500mM NaCl和PMSF 1mM；溶剂为pH7.4、20mM Tris-HCl缓冲液。

溶液C：溶质及其浓度为10％(10g/100mL)甲基α-D-吡喃甘露糖苷、500mM NaCl和1mM PMSF；溶剂为pH7.4、20mM Tris-HCl缓冲液。

清洗液：用蒸馏水将溶液B稀释至10倍体积。

实施例1、pgp96的提取

组织中热休克蛋白gp96(以下简称pgp96)的提取步骤如下：

(1)分离分娩前的小鼠的胎盘组织，得到小鼠离体胎盘组织。取小鼠离体胎盘组织或人离体胎盘组织，剪碎，按质量体积比1g：4mL加入溶液A，然后用玻璃匀浆器磨碎。

(2)完成步骤(1)后，16500g离心1h，得到上清液甲。

(3)完成步骤(2)后，取上清液甲，16500g离心50min，得到上清液乙。

(4)完成步骤(3)后，取上清液乙，按体积比9：1加入溶液B，混匀后得到上样液。

(5)完成步骤(4)后，将上样液上样至ConA琼脂糖凝胶柱。

(6)完成步骤(5)后，用清洗液洗脱所述ConA琼脂糖凝胶柱，洗脱过程中实时监测紫外吸收值，检测波长为280nm，直至洗脱产物的紫外吸收值低于0.01。

(7)完成步骤(6)后，用溶液C洗脱所述ConA琼脂糖凝胶柱，弃去首先流出的过柱后溶液0.5个柱体积，然后收集之后流出的过柱后溶液1个柱体积；将所述ConA琼脂糖凝胶柱孵育50min后，再收集过柱后溶液1.5个柱体积。将两次收集的过柱后溶液合并，即为ConA洗脱液。

(8)完成步骤(7)后，将ConA洗脱液上样至Hitrap Q阴离子交换柱。

(9)完成步骤(8)后，用含NaCl的pH7.4、12mM的PBS缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为1mL/min。梯度洗脱程序：在pH7.4、12mM的PBS缓冲液中使NaCl含量由300mM匀速增至800mM，线性梯度洗脱20个柱体积。收集合并NaCl含量为400～450mM的洗脱液，即为洗脱液甲。

(10)完成步骤(9)后，取洗脱液甲，用超滤管进行超滤浓缩，得到pgp96的溶液。pgp96的溶液中，pgp96浓度为5mg/mL。

将pgp96的溶液进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot(以gp96单克隆抗体作为一抗，HRP标记的IgG抗体作为二抗)，实验结果见图1(箭头所指为pgp96)。结果表明，pgp96的溶液显示单一分子量条带，对应的分子量为96kDa。

实施例2、重组热休克蛋白gp96的制备

一、重组质粒pFastBac^TM1-gp96的构建

1、采用Trizol法提取HepG2细胞的RNA，然后进行反转录获得cDNA。

2、根据人gp96基因(GenBank号为AY040226.1)的序列，人工合成引物F1：5’-GGAATTCATGGACGATGAAGTTGAT-3’(下划线为限制性内切酶EcoRⅠ识别序列)和R1：5’-GCTCTAGACTATTAGAATTCATCTTTTTC-3’(下划线为限制性内切酶XbaⅠ识别序列)。

3、完成步骤1和2后，以步骤1获得的cDNA为模板，以步骤2合成的F1和R1为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

4、用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。

5、用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切质粒pFastBac^TM1，回收约4700bp的载体骨架。

6、将酶切产物与载体骨架连接，得到连接产物。

7、将步骤6获得的连接产物转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，得到重组大肠杆菌，然后提取该重组大肠杆菌的质粒，获得重组质粒pFastBac1-gp96。

根据测序结果，对重组质粒pFastBac1-gp96进行结构描述如下：将质粒pFastBac1的EcoRⅠ和XbaⅠ识别序列间的片段(质粒pFastBac1被限制性核酸内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中序列1所示的双链DNA分子。重组质粒pFastBac 1-gp96表达重组热休克蛋白gp96(以下简称rgp96)，rgp96的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

二、rgp96的表达

1、将步骤一构建的重组质粒pFastBac1-gp96共转染Sf9细胞(每1×10⁶个Sf9细胞约转染4μg重组质粒pFastBac1-gp96；共转染过程中，转染试剂为Cellfectin II reagent，培养基为Insect-XPRESS^TM Protein-free Insect Cells medium with L-Glutamine，27℃孵育72h，离心，上清液即为P1代病毒。

2、将Sf9细胞悬浮液1(含1×10⁸个Sf9细胞)27℃培养8～10h，得到培养细胞；然后向所述培养细胞中加入P1代病毒(剂量为0.05～0.1MOI)，27℃孵育72h，4000rpm离心5min，上清液即为P2代病毒。

3、向Sf9细胞悬浮液2(含1.6×10⁸个Sf9细胞)中加入P2代病毒(剂量为0.05～0.1MOI)，27℃、100～120rpm培养72h，4000rpm离心5min，上清液即为P3代病毒。

以gp96单克隆抗体作为一抗，辣根过氧化酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体作为二抗，对P3代病毒进行western杂交，western杂交具体步骤参考如下文献：张悦鸣，段跃强，罗德炎，姚惠娟，王希良，李志奎.小鼠可溶性IL-5α受体在Bac-to-Bac系统中的表达及其鉴定[J].中国生物制品学杂志，2013，26：5.

western杂交实验结果表明，rgp96在Sf9细胞中表达。

三、rgp96的纯化

1、向300ml的Sf9细胞悬浮液3(含4.5×10⁸个Sf9细胞)中加入P3代病毒(剂量为5MOI)，27℃、100～120rpm培养72h，得到悬浮液。

2、取所述悬浮液，7000rpm离心20min，获得上清液1。

3、取所述上清液1，经0.22mm滤膜过滤，获得上样液。

4、将所述上样液上样于HiTrap-Q Sepharose离子交换层析柱(流速为1mL/min)，然后先用5mL的pH7.5、200mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)；再用10mL的pH7.5、300mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)；最后用3mL的pH7.5、600mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)，收集过柱后溶液并采用截留分子量为50KD的超滤管进行超滤浓缩，得到1mL左右的浓缩液。所述浓缩液即含有rgp96。

5、将步骤4得到的浓缩液上样于Superdex 200 10/300GL分子筛层析柱(流速为0.25mL/min)，然后用pH7.5、150mM的PBS缓冲液洗涤(流速为0.25mL/min)，收集为9～12mL处的穿透液，进一步采用截留分子量为50KD的超滤管进行超滤浓缩，得到rgp96的溶液。采用BCA法测定rgp96的溶液中的蛋白浓度，最后分装，贮存于-80℃。

将步骤5得到的rgp96的溶液进行SDS-PAGE电泳分析，实验结果见图2中左图(泳道1为高分子量标准蛋白质，泳道2为rgp96，箭头为rgp96)。将步骤5得到的重组热休克蛋白gp96的溶液进行Western blot(以gp96单克隆抗体作为一抗，辣根过氧化酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体作为二抗)，实验结果见图2中右图。结果表明，rgp96的溶液显示单一分子量条带，对应的分子量与预期一致。

实施例3、pgp96或rgp96在活化调节性T细胞中剂量的确定

一、小鼠分组免疫

将90只九周龄体重为18～22g的小鼠随机分成pgp96处理组1、pgp96处理组2、pgp96处理组3、pgp96处理组4、rgp96处理组1、rgp96处理组2、rgp96处理组3、rgp96处理组4和对照组(每组10只)，分别进行如下处理：

pgp96处理组1：实验第1天，腹腔注射实施例1制备的pgp96的溶液；实验第8天，再次腹腔注射实施例1制备的pgp96的溶液；实验第22天，再次腹腔注射实施例1制备的pgp96的溶液。每次注射剂量均为10μg pgp96/只。

pgp96处理组2：按照pgp96处理组1的操作步骤进行，仅将注射剂量10μg pgp96/只替换为50μg pgp96/只。

pgp96处理组3：按照pgp96处理组1的操作步骤进行，仅将注射剂量10μg pgp96/只替换为100μg pgp96/只。

pgp96处理组4：按照pgp96处理组1的操作步骤进行，仅将注射剂量10μg pgp96/只替换为100μg pgp96/只。

rgp96处理组1：实验第1天，腹腔注射实施例2制备的rgp96的溶液；实验第8天，再次腹腔注射实施例2制备的rgp96的溶液；实验第22天，再次腹腔注射实施例2制备的rgp96的溶液。每次注射剂量均为10μgrgp96/只。

rgp96处理组2：按照rgp96处理组1的操作步骤进行，仅将注射剂量10μgrgp96/只替换为50μgrgp96/只。

rgp96处理组3：按照rgp96处理组1的操作步骤进行，仅将注射剂量10μgrgp96/只替换为100μgrgp96/只。

rgp96处理组4：按照rgp96处理组1的操作步骤进行，仅将注射剂量10μgrgp96/只替换为500μgrgp96/只。

对照组：实验第1天腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，实验第8天，再次腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液；实验第22天，再次腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液。每次注射剂量均为100μL/只。

二、小鼠淋巴细胞分离

取完成步骤一后第8天的小鼠，获取小鼠脾脏淋巴细胞(每只小鼠取3×10⁶个脾脏淋巴细胞)。

三、pgp96或rgp96在活化调节性T细胞中剂量的确定

1、取步骤二获取的小鼠脾脏淋巴细胞(少于1×10⁶个)，1000rpm离心10min，收集小鼠脾脏淋巴细胞。

2、完成步骤1后，取所述小鼠脾脏淋巴细胞，加入100μL含5％(质量体积比)BSA的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液重悬，4℃封闭20min；然后1000rpm离心10min，用100μL上清液重悬沉淀，得到混合液甲。

3、完成步骤2后，取所述混合液甲，加入FITC-anti-CD3、PE-anti-CD4和Percp-Cy5.5-anti-CD25，4℃避光孵育20min。

4、完成步骤3后，取所述混合液甲，加入1mL pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，震荡混匀，1000rpm离心10min，收集小鼠脾脏淋巴细胞，然后用400μL pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液重悬，得到混合液乙。

5、完成步骤4后，取所述混合液乙，加入600μL固定/破膜剂，4℃破膜30min(实际操作过程中不超过1h即可)；然后1000rpm离心10min，收集沉淀，得到沉淀1。

6、完成步骤5后，取所述沉淀1，加入1mL 1×洗涤液重悬，1000rpm离心10min，得到沉淀2和上清液丙。取100μL上清液丙重悬沉淀2，得到混合液丙；向混合液丙中加入APC-anti-Foxp3，4℃避光孵育30min。

7、完成步骤6后，取所述混合液丙，加入1mL 1×洗涤液重悬，1000rpm离心10min，收集沉淀，得到沉淀3。取400μL含4％(质量体积比)多聚甲醛的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液重悬沉淀3，然后用流式细胞仪分析小鼠脾脏淋巴细胞中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的频率。

实验结果见图3(小鼠脾脏淋巴细胞中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的频率即FOXP3⁺细胞在CD4⁺细胞中比例)。结果表明，pgp96处理组1、pgp96处理组2、pgp96处理组3、pgp96处理组4、rgp96处理组1、rgp96处理组2、rgp96处理组3和rgp96处理组4中小鼠的脾脏淋巴细胞中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的频率均高于对照组，尤其是pgp96处理组3、pgp96处理组4、rgp96处理组3和rgp96处理组4中小鼠的脾脏淋巴细胞中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的频率均显著高于对照组。因此，100μgrgp96、500μgrgp96、100μgpgp96或500μgpgp96均可以显著诱导CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的产生。

实施例4、pgp96或rgp96在治疗类风湿性关节炎中的应用

一、小鼠分组免疫

1、发病小鼠的获得

(1)鸡Ⅱ型胶原混合液的制备

将鸡Ⅱ型胶原溶于浓度为0.1mol/L的醋酸水溶液中，4℃条件下搅拌使之充分溶解，得到鸡Ⅱ型胶原混合液；鸡Ⅱ型胶原混合液中，鸡Ⅱ型胶原的浓度为2g/L。

(2)鸡Ⅱ型胶原乳剂的制备

将鸡Ⅱ型胶原混合液和弗氏完全佐剂等体积混合，得到鸡Ⅱ型胶原乳剂。

(3)发病小鼠的获得

取九周龄体重为18～22g的小鼠，于背部皮下注射0.1mL鸡Ⅱ型胶原乳剂，24天后，关节肿胀的小鼠即为发病小鼠。

2、小鼠分组免疫

选取50只九周龄的体重为18～22g的关节肿胀程度相似的发病小鼠(即根据下述步骤二中小鼠类风湿关节炎评分标准计算得出的类风湿关节炎的评分数值基本相同的发病小鼠)，随机分成pgp96处理组5、pgp96处理组6、rgp96处理组5、rgp96处理组6和对照组(每组10只)，分别进行如下处理：

pgp96处理组5：实验第0天，腹腔注射实施例1制备的pgp96的溶液；实验第7天，再次腹腔注射实施例1制备的pgp96的溶液；实验第21天，再次腹腔注射实施例1制备的pgp96的溶液。每次注射剂量均为100μg pgp96/只。

pgp96处理组6：按照pgp96处理组5的操作步骤进行，仅将注射剂量100μg pgp96/只替换为500μg pgp96/只。

rgp96处理组5：实验第0天，腹腔注射实施例2制备的rgp96的溶液；实验第7天，再次腹腔注射实施例2制备的rgp96的溶液；实验第21天，再次腹腔注射实施例2制备的rgp96的溶液。每次注射剂量均为100μg pgp96/只。

rgp96处理组6：按照rgp96处理组5的操作步骤进行，仅将注射剂量100μg pgp96/只替换为500μg pgp96/只。

对照组：实验第0天腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，实验第7天，再次腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液；实验第21天，再次腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液。每次注射剂量均为100μL/只。

二、小鼠类风湿关节炎的评分数值

进行步骤一中2的实验过程中，分别于实验的第0天、第4天、第8天、第12天、第16天、第20天、第24天、第28天和第32天观察各小鼠足部的基本情况，并根据小鼠类风湿关节炎评分标准计算类风湿关节炎的评分数值(每只小鼠的类风湿关节炎的评分数值为每只小鼠所有病变关节评分的总和，每只小鼠有四个关节，所以最大分数为16分)，然后根据各组小鼠的类风湿关节炎的评分数值取平均值，得到各组的类风湿关节炎的评分平均值(简称分值)。以免疫天数为横坐标，以分值为纵坐标，绘制曲线。

小鼠类风湿关节炎评分标准具体如下：

0分：无明显改变；

1分：一个趾头明显肿胀和发红；

2分：轻度的肿胀和肢体的红斑或两个趾头的肿胀；

3分：三个趾头出现明显的肿胀和肢体的红斑；

4分：整个关节出现肿胀和发红，甚至关节僵直，严重功能障碍。

三、抗Ⅱ型胶原抗体的滴度的测定

小鼠血清中抗Ⅱ型胶原抗体的滴度采用间接ELISA方法测定。

设置试验孔，进行三次重复试验，每次重复试验的步骤如下：

1、取鸡Ⅱ型胶原，用pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液溶解，得到包被液；包被液中，鸡Ⅱ型胶原的浓度为10μg/mL。

2、完成步骤1后，取96孔酶标板，加入100μL包被液，用封板膜封好，4℃过夜，然后弃上清，拍干。

3、完成步骤2后，取所述96孔酶标板，加入含0.05％(体积百分比)吐温-20的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，静置30s，然后弃上清，拍干。重复该步骤三次。

4、完成步骤3后，取所述96孔酶标板，每孔加入200μL含5％(体积百分比)BSA的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，用封口膜封好微孔板，封闭1h，然后弃上清，拍干。

5、取完成步骤一中2后第22天的小鼠，通过眼眶摘眼球取血200μL，然后室温静置30min，3000rpm离心20min，得到血清；将血清用含0.05％(体积百分比)吐温-20的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液稀释至32000倍体积，得到上清稀释液。

6、完成步骤4和5后，取所述96孔酶标板，每孔加入100μL上清稀释液，37℃孵育1h。

7、完成步骤6后，取所述96孔酶标板，加入含0.05％(体积百分比)吐温-20的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，静置30s，然后弃上清，拍干。重复该步骤三次。

8、完成步骤7后，取所述96孔酶标板，每孔加入100μL辣根过氧化物酶羊抗鼠抗体稀释液(工作浓度为1:2000，用含0.05％(体积百分比)吐温-20的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液稀释辣根过氧化物酶羊抗鼠抗体得到)，37℃孵育1h。

9、完成步骤8后，取所述96孔酶标板，加入含0.05％(体积百分比)吐温-20的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，静置30s，然后弃上清，拍干。重复该步骤三次。

10、完成步骤9后，取所述96孔酶标板，每孔加入100μLTMB底物溶液，轻轻震荡混匀，室温下避光放置10min显色；然后每孔加入50μL浓度为2M的硫酸水溶液终止反应。用自动酶标仪于450nm波长下读取每孔的OD值。

设置空白对照孔：按照上述步骤，将步骤5和6替换为步骤A，其它步骤均不变，得到空白对照孔的OD值。步骤A为：取96孔酶标板，每孔加入100μLpH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，37℃孵育1h。

四、细胞增殖指数的测定

设置试验孔，进行三次重复试验，每次重复试验的步骤均如下：

1、取完成步骤一中2后第22天的小鼠，分别获取小鼠脾脏淋巴细胞。

2、完成步骤1后，取所述小鼠脾脏淋巴细胞，用含10％(体积百分比)胎牛血清的RPMI 1640培养液稀释，得到细胞浓度为4×10⁶个/mL的细胞悬液。

3、完成步骤2后，取96孔酶标板，每孔先加入100μL细胞悬液，再加入PHA和鸡Ⅱ型胶原，使PHA在体系中的浓度为20μg/mL，鸡Ⅱ型胶原在体系中的浓度为100μg/mL。置于37℃培养72h。

4、完成步骤3后，取96孔酶标板，每孔加入20μL的浓度为5μg/mL的MTT水溶液，37℃培养4h；然后弃上清，每孔加入150μL DMSO，震荡10min，在酶标仪上读取570nm下的OD值。

设置空白对照孔：按照上述步骤，将步骤3替换为步骤a，其它步骤均不变，得到空白对照孔的OD值。步骤a为：完成步骤2后，取96孔酶标板，每孔加入100μL所述细胞悬液，然后置于37℃培养72h。

根据下述公式计算细胞增殖指数(SI)：

细胞增殖指数(SI)＝(实验孔的OD值-空白对照孔的OD值)/空白对照孔的OD值。

五、小鼠血清中细胞因子含量的测定

小鼠IL-1βELISA试剂盒、小鼠IL-6ELISA试剂盒、小鼠TNF-αELISA试剂盒、小鼠IL-17A ELISA试剂盒均为eBioscience公司产品，产品目录号分别为88-7013、88-7064、88-7324和88-7371；每个试剂盒内均含有相应的细胞因子标准品、捕获抗体、生物素标记的检测抗体、亲和素标记的辣根过氧化物酶、稀释液以及TMB底物溶液等组件。

一、小鼠血清中TNF-α含量的测定

1、用pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液溶解捕获抗体，得到工作浓度为1:250的捕获抗体稀释液。

2、完成步骤1后，取96孔酶标板，加入100μL捕获抗体稀释液，用封板膜封好，4℃过夜，然后弃上清，拍干。

3、完成步骤2后，取所述96孔酶标板，加入含0.05％(体积百分比)吐温-20的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，静置30s，然后弃上清，拍干。重复三次。

5、取完成步骤一中2后第22天的小鼠，通过眼眶摘眼球取血200μL，然后室温静置30min，3000rpm离心20min，得到血清。

6、完成步骤4和5后，取所述96孔酶标板，每孔加入50μL血清，25℃孵育2h。

7、完成步骤6后，取所述96孔酶标板，加入含0.05％(体积百分比)吐温-20的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，静置30s，然后弃上清，拍干。重复三次。

8、完成步骤7后，取所述96孔酶标板，每孔加入100μL生物素标记的检测抗体稀释液(工作浓度为1:250，用稀释液稀释生物素标记的检测抗体)，37℃孵育1h。

9、完成步骤8后，取所述96孔酶标板，加入含0.05％(体积百分比)吐温-20的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，静置30s，然后弃上清，拍干。重复三次。

10、完成步骤9后，取所述96孔酶标板，每孔加入100μL亲和素标记的辣根过氧化物酶稀释液(工作浓度为1:250，用稀释液稀释亲和素标记的辣根过氧化物酶)，37℃孵育0.5h。

11、完成步骤10后，取所述96孔酶标板，加入含0.05％(体积百分比)吐温-20的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，静置30s，然后弃上清，拍干。重复三次。

12、完成步骤11后，取所述96孔酶标板，37℃孵育0.5h，然后加入含0.05％(体积百分比)吐温-20的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，静置30s，然后弃上清，拍干。重复五次。

13、完成步骤12后，取所述96孔酶标板，每孔加入100μL TMB底物溶液，轻轻震荡混匀，37℃避光放置10min显色；然后每孔加入50μL的浓度为2M的硫酸水溶液终止反应。用自动酶标仪于450nm波长下读取每孔的OD值。

设置空白对照孔：按照上述步骤，将步骤6中的血清替换为pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，其它步骤均不变，得到空白对照孔的OD值。

设置标准样品孔：按照上述步骤，将步骤6中的血清分别替换为浓度分别为500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL、15.625pg/mL、7.8125pg/mL或3.91pg/mL的TNF-α标准品稀释液(用稀释液稀释)，其它步骤均不变，得到各TNF-α标准品稀释液的OD值。以TNF-α标准品稀释液的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。

根据标准曲线，得到小鼠血清中的TNF-α的含量。

二、小鼠血清中IL-1β含量的测定

按照上述步骤一的方法，将TNF-α替换为IL-1β，其它步骤均不变，得到小鼠血清中IL-1β的含量。

三、小鼠血清中IL-6含量的测定

按照上述步骤一的方法，将TNF-α替换为IL-6，其它步骤均不变，得到小鼠血清中IL-6的含量。

四、小鼠血清中IL-17A含量的测定

按照上述步骤一的方法，将TNF-α替换为IL-17A，其它步骤均不变，得到小鼠血清中IL-17A的含量。

小鼠类风湿关节炎的评分数值的实验结果见图4。结果表明，实验前15天，pgp96处理组5、pgp96处理组6、rgp96处理组5、rgp96处理组6和对照组中的小鼠类风湿关节炎的评分数值均无显著差异。从实验第16天开始，pgp96处理组5、pgp96处理组6、rgp96处理组5和rgp96处理组6中的小鼠类风湿关节炎的评分数值显著小于对照组(P<0.001)，而pgp96处理组5和rgp96处理组5中的小鼠类风湿关节炎的评分数值无显著差异，pgp96处理组6和rgp96处理组6中的小鼠类风湿关节炎的评分数值也无显著差异。pgp96处理组5和rgp96处理组5中的小鼠类风湿关节炎的评分数值均小于pgp96处理组6和rgp96处理组6，因此，最佳免疫剂量为100μg pgp96/只或100μg rgp96/只。

小鼠血清中抗II型胶原抗体滴度的检测结果见图5。结果表明，pgp96处理组5、pgp96处理组6、rgp96处理组5和rgp96处理组6中小鼠血清中抗II型胶原抗体滴度显著小于对照组(P<0.001)。pgp96处理组5和rgp96处理组5中小鼠血清中抗II型胶原抗体滴度无显著差异。pgp96处理组6和rgp96处理组6中小鼠抗II型胶原抗体滴度无显著差异。pgp96处理组5和rgp96处理组5中小鼠血清中抗II型胶原滴度均小于pgp96处理组6和rgp96处理组6，因此，最佳免疫剂量为100μg pgp96/只或100μg rgp96/只。

细胞增殖指数的实验结果见图6。结果表明，pgp96处理组5、pgp96处理组6、rgp96处理组5和rgp96处理组6中细胞增殖指数显著小于对照组(P<0.001)，pgp96处理组5和rgp96处理组5中细胞增殖指数无显著差异，pgp96处理组6和rgp96处理组6中细胞增殖指数无显著差异。pgp96处理组5和rgp96处理组5中细胞增殖指数均小于pgp96处理组6和rgp96处理组6，因此，最佳免疫剂量为100μg pgp96/只或100μg rgp96/只。

小鼠血清中各细胞因子检测结果见图7(A为IL-1β，B为IL-17A，C为IL-6，D为TNF-α)。结果表明，pgp96处理组5、pgp96处理组6、rgp96处理组5和rgp96处理组6中小鼠血清中的细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6或IL-17A)含量显著小于对照组(P<0.05)，pgp96处理组5和rgp96处理组5中小鼠血清中细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6或IL-17A)的含量无显著差异，pgp96处理组6和rgp96处理组6中小鼠血清细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6或IL-17A)的含量无显著差异。pgp96处理组5和rgp96处理组5中小鼠血清细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6或IL-17A)含量均小于pgp96处理组6和rgp96处理组6，因此，最佳免疫剂量为100μg pgp96/只或100μg rgp96/只。

上述结果表明，用pgp96或rgp96免疫发病小鼠，能够有效的治疗或减轻类风湿性关节炎的发病症状。

Claims

1.热休克蛋白gp96在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下A1)至A10)中的至少一种：

A1)治疗类风湿性关节炎；

A2)缓解类风湿性关节炎的症状；

A3)诱导调节性T细胞的产生；

A4)降低抗Ⅱ型胶原抗体滴度；

A5)降低TNF-α浓度；

A6)降低IL-1β浓度；

A7)降低IL-6浓度；

A8)降低IL-17浓度；

A9)降低细胞增殖能力；

A10)预防类风湿性关节炎。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述热休克蛋白gp96为a1)或a2)或a3)或a4)：

a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a3)在a1)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述热休克蛋白gp96的获得方式为D1)或D2)：

D1)从离体哺乳动物的胎盘组织中提取；

4.如权利要求1至3任一所述的应用，其特征在于：所述调节性T细胞为CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞。

5.如权利要求1至4任一所述的应用，其特征在于：所述产品为药物。

6.一种产品，其活性成分为热休克蛋白gp96；所述产品的功能为如下A1)至A10)中的至少一种：

A1)治疗类风湿性关节炎；

A2)缓解类风湿性关节炎的症状；

A3)诱导调节性T细胞的产生；

A4)降低抗Ⅱ型胶原抗体滴度；

A5)降低TNF-α浓度；

A6)降低IL-1β浓度；

A7)降低IL-6浓度；

A8)降低IL-17浓度；

A9)降低细胞增殖能力；

A10)预防类风湿性关节炎。

7.如权利要求6所述的产品，其特征在于：所述热休克蛋白gp96为a1)或a2)或a3)或a4)：

a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a3)在a1)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

8.如权利要求6所述的产品，其特征在于：

所述热休克蛋白gp96的获得方式为D1)或D2)：

D1)从离体哺乳动物的胎盘组织中提取；

9.如权利要求6至8任一所述的产品，其特征在于：所述调节性T细胞为CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞。

10.如权利要求6至9任一所述的产品，其特征在于：所述产品为药物。