CN107019792A - gp96蛋白在制备治疗特发性血小板减少性紫癜药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供gp96蛋白在制备治疗特发性血小板减少性紫癜药物中的应用，所述gp96蛋白为热休克蛋白gp96。本发明首次将热休克蛋白gp96用于治疗特发性血小板减少性紫癜药物的制备中，实验证明，热休克蛋白gp96具有诱导调节性T细胞的产生、降低脾脏系数、提高血小板的数量的功能。因此，热休克蛋白gp96对治疗自身免疫性血小板减少性紫癜和/或缓解自身免疫性血小板减少性紫癜的症状具有重要的应用价值。

Description

gp96蛋白在制备治疗特发性血小板减少性紫癜药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，涉及热休克蛋白gp96在制备治疗特发性血小板减少性紫癜药物中的应用。

背景技术

自身免疫性血小板减少性紫癜，是一种自身免疫性出血性疾病，以血小板减少、骨髓巨核细胞数正常或增加伴成熟受阻，以及缺乏任何原因包括外源的或继发性因素为特征，又称为特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)。血小板减少性紫癜虽发病率较低，但死亡率却较高。血小板减少性紫癜的检验指标除作血常规外尚需查血小板计数(急性型一般低于20×10⁹/L，慢性型多在(30～80)×10⁹/L之间)，并注意观察血小板形态，促凝血时间，血块收缩时间，凝血酶原时间，血小板表面相关免疫球蛋白(PAIg)测定，抗人球蛋白试验，补体测定，毛细血管脆性试验，骨髓象检查。

血小板减少性紫癜药物治疗首选糖皮质激素。此外，经多种药物治疗4-6个月，不能控制症状或仍有反复发作者，可考虑脾摘除。凡摘脾后又发作者，仍可考虑用糖皮质激素及免疫抑制剂。

热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)是一类在生物进化中高度保守且广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质。HSP根据同源程度和分子量大小可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、小分子HSP和泛素等多个亚家族。热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)gp96属于HSP90亚家族的成员，该蛋白是细胞内质网上含量最丰富的热休克蛋白。研究表明gp96在免疫调节中具有重要的作用。低剂量的外源gp96注射小鼠能显著激活小鼠的免疫系统，高剂量的外源gp96注射小鼠后显著抑制小鼠的免疫系统。gp96调节免疫功能可能与调节性T细胞(Treg)相关。

发明内容

本发明的目的是提供gp96蛋白(即热休克蛋白gp96)在制备治疗特发性血小板减少性紫癜药物中的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供的gp96蛋白在制备治疗特发性血小板减少性紫癜药物中的应用，其中，所述gp96蛋白为：

i)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或

ii)SEQ ID NO:2去掉第一个蛋氨酸后的氨基酸序列；或

iii)在i)或ii)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；或

iv)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:2去掉第一个蛋氨酸后的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。

编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子，可为d1)或d2)或d3)或d4)：

d1)SEQ ID NO:1自5’端起第4位至2352位所示的DNA分子；

d2)SEQ ID NO:1所示的DNA分子；

d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述热休克蛋白gp96的DNA分子；

d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述热休克蛋白gp96的DNA分子。

所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

所述药物的功能为如下A1)至A3)中的至少一种：

A1)诱导调节性T细胞的产生；

A2)提高血小板的数量；

A3)降低脾脏系数。

本发明还提供gp96蛋白在制备诱导调节性T细胞产生的药物中的应用。

本发明所述调节性T细胞包括CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞等。

本发明还提供gp96蛋白在制备升血小板药物中的应用。

本发明还提供用于治疗特发性血小板减少性紫癜的药物，其有效成分为gp96蛋白。

本发明还提供用于诱导调节性T细胞产生的药物，其有效成分为gp96蛋白。

本发明还提供一种升血小板药物，其有效成分为gp96蛋白。

本发明所述药物的单次剂量单元为小鼠免疫单次剂量为100-400μg/18-22g体重，人免疫剂量为100-1500μg/人次。

施用对象为人和哺乳动物。优选所述哺乳动物为小鼠。更优选BALB/C小鼠。

本发明所述热休克蛋白gp96的获得方式为：

1)细胞和组织中天然纯化；或

2)利用酵母菌表达重组蛋白；或

3)利用昆虫细胞表达重组蛋白。

本发明首次将热休克蛋白gp96用于治疗特发性血小板减少性紫癜药物的制备中，实验证明，热休克蛋白gp96具有诱导调节性T细胞的产生、降低脾脏系数、提高血小板的数量的功能。因此，热休克蛋白gp96对治疗自身免疫性血小板减少性紫癜和/或缓解自身免疫性血小板减少性紫癜的症状具有重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中人胎盘组织制备的gp96提取物的SDS-PAGE和Westernblot鉴定结果。

图2为本发明实施例1中利用汉逊酵母表达重组gp96蛋白的SDS-PAGE和Westernblot鉴定结果。

图3为本发明实施例1中利用昆虫细胞表达重组gp96蛋白的SDS-PAGE和Westernblot的鉴定结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

BALB/C小鼠购自南京模式动物研究所；BALB/C小鼠在实施例中简称小鼠。

豚鼠，雌性，体重350g，共10只，购自南京模式动物研究所。弗氏完全佐剂(DH-1341-1)和弗氏不完全佐剂(DH-1341-2)购自北京鼎国生物技术有限公司。草酸氨购自广东光华科技股份有限公司。

获取小鼠脾脏淋巴细胞的具体方法参考文献：Zhen Liu，Xinghui Li，LipengQiu，et al.Treg suppress CTL responses upon immunization with HSPgp96.Eur.J.mmunol，2009，39(11)：3110–3120.

HepG2细胞(人肝癌细胞)购自ATCC(美国菌种保藏中心)，产品目录号为HB-8065^TM。Sf9细胞为Invitrogen公司产品，产品目录号为11496-015。Cellfectin II reagent为Lifetechnologies公司产品，产品目录号为10362-100。质粒pFastBac^TM1为Invitrogen公司产品，产品目录号为10359-016。gp96单克隆抗体为Santa Cruz公司产品，产品目录号为sc-56399。辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，产品目录号为ZB-2307。HiTrap-Q Sepharose离子交换层析柱为GE公司产品，产品目录号为17-5053-01。Superdex 200 10/300GL分子筛层析柱为GE公司产品，产品目录号为17517501。大肠杆菌DH10Bac感受态细胞为北京原平皓生物技术有限公司产品，产品目录号为CL108-01。FITC-anti-CD3、PE-anti-CD4、Percp-Cy5.5-anti-CD25、固定/破膜剂和APC-anti-Foxp3均为eBioscience公司产品，产品目录号分别为11-0031-63、12-0041-81、45-0251-80、00-5521-00和17-5773-80。Insect-XPRESS^TM Protein-free Insect Cellsmedium with L-Glutamine为LONZA公司产品，产品目录号为12-730Q。

实施例1热休克蛋白gp96的获得

(一)胎盘组织中纯化gp96蛋白

1、组织匀浆

匀浆缓冲液配方：在pH 7.0的碳酸氢钠缓冲液中加PMSF(苯甲基磺酰氟，分子式为C₇H₇FO₂S)至终浓度1mM(置于冰上的烧杯中配制：PMSF在水溶液中数小时内分解，该溶液不可过夜)。

取烧杯至于冰上，将胎盘组织在烧杯中迅速用剪刀剪成直径约1-2毫米的碎块，然后加入组织8倍重量的匀浆缓冲液。将组织碎块搅匀倒入玻璃匀浆器，匀浆至底部组织块消失后再上下匀浆15次以上。匀浆液倒入离心管，50,000g离心60min，取上清加入1/10体积的10×PBS(pH7.5，200mM NaCl)，用于步骤2的ConA-Sepharose层析。

2、ConA-Sepharose亲和层析

载体为ConA-Sepharose(购自GE公司，产品号为17-0440-01)，按“1ml载体/4g组织”计算使用量。层析柱的内径和柱长是1.6×2.5cm。

将步骤1得到的上清用蠕动泵上样，0.25ml/min。在PBS(pH7.5，200mM NaCl)中加PMSF至终浓度1mM，作为洗脱液甲，用蠕动泵将10倍柱体积的洗脱液甲过层析柱(0.5ml/min)，以去除未结合蛋白。在PBS(pH7.5，200mM NaCl)中加α-D-吡喃葡萄糖至终浓度10％(10mg/ml)，加PMSF至终浓度1mM，作为洗脱液乙，用蠕动泵将3倍柱体积的洗脱液乙过柱层析(0.25ml/min)，收集洗脱液。

3、HiTrap-Q Sepharose离子交换层析

载体为HiTrap-Q Sepharose(层析柱为HiTrap Q HP，购自GE公司，产品号为17-1153-01)。层析柱的内径和柱长是0.7×2.5cm。

将载体装柱后，先用5ml PBS(pH7.5，200mM NaCl)清洗(1ml/min)。将步骤2得到的洗脱液上样(1ml/min)，然后将5ml PBS(pH7.5，200mM NaCl)过层析柱(1ml/min)，以去除未结合蛋白。然后将10ml PBS(pH7.5，300mM NaCl)过层析柱(1ml/min)，以去除未结合蛋白。然后将3ml PBS(pH7.5，600mM NaCl)过层析柱(1ml/min)，收集洗脱液，即为gp96提取物。

将gp96提取物进行10％SDS-PAGE，然后考马斯亮蓝染色。

将gp96提取物进行Western blot，一抗为大鼠抗gp96抗体(购自santa cruz，产品号为sc-56339)。

除了胎盘外，也可用如下细胞或者组织制备gp96提取物：黑色素瘤(B16)细胞、人肝癌细胞系HepG2培养细胞、临床手术切除的人肿瘤组织(乳腺癌、脑胶质瘤、肾癌、肠癌、肝癌、胃癌)，提取方法参照胎盘的提取。

gp96提取物的SDS-PAGE和Western blot鉴定结果见图1。其中，1：分子量标准；2：用胎盘组织制备的gp96提取物的SDS-PAGE电泳图；3：Western blot鉴定图。

(二)利用汉逊酵母表达重组gp96蛋白

1、重组质粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96的构建

①提取人肝癌细胞HepG2的mRNA，反转录合成cDNA。

②以步骤①的cDNA为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR引物如下：

Fp：5'-CCGgaattcATGGACGATGAAGTTGATG-3'

Rp：5'-CCGctcgagCTATTAGAATTCATCTTTTTCAGCTGTAG-3'

③用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。

④用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切质粒pHFMDZ-R1A(购自Invitrogen公司，产品号为V20520)，回收载体骨架。

⑤将步骤③的酶切产物和步骤④的载体骨架连接，得到重组质粒pHFMDZ-R1-gp96并测序。测序结果表明，重组质粒pHFMDZ-R1-gp96的骨架载体为pHFMDZ-R1A，在EcoRI和XhoI酶切位点之间插入了gp96蛋白的编码序列。

⑥在重组质粒pHFMDZ-R1-gp96的BglII酶切位点插入LEU2片段，LEU2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。BamHI酶切位点插入α-淀粉酶报告系统如SEQ ID No.4所示，得到重组质粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96。

2、gp96蛋白的表达

①采用电转化法将步骤1得到的重组质粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96导入汉逊酵母(购自ATCC，产品号为MYA-335)细胞，得到重组菌。

②将重组菌接种于5mL SD液体培养基(购自上海杰美基因医药公司，产品号为GMS12117.7)，37℃培养48h，然后转接到100mL SYN6培养基(购自上海杰美基因医药公司，产品号为GMS12116.1)，30℃培养48h，得到种子培养液。

③将两瓶种子培养液接种于含有2L SYN6培养基的5L发酵罐中，30℃培养。使用氨水控制pH维持在5.5，每4h检测1次发酵液中甘油含量，根据发酵液中甘油的浓度补加甘油，控制甘油终浓度在0.5％左右，同时控制溶氧在20％以上。根据菌体的生成情况检测菌体湿重，等菌体湿重达到180-200g/L的时候停止补加甘油，开始诱导重组gp96蛋白产生(补加甲醇，使甲醇浓度维持在0.5-0.8％左右)，诱导开始72小时后停止发酵，得到发酵液。

3、gp96蛋白的分离纯化

将步骤2得到的发酵液离心，收集菌体。用PBS缓冲液洗涤细胞2次，在球磨机(DYNO-MILL model KDL)中，按照厂家提供的操作手册使用玻璃珠球磨的方法破碎细胞，破碎后的细胞12000rpm/min离心20min，收集上清液。上清液用0.45μm滤膜进行过滤，得到滤液。将滤液进行浓缩，得到浓缩液。

将滤液进行亲和层析，具体步骤如下：采用英俊公司(Invitrogen Corporation)的Ni-NTA Purification System进行亲和层析，主要步骤为：先用PBS平衡柱子2h，然后用PBS(含20mM咪唑)平衡柱子2h。将浓缩液用PBS(含20mM咪唑)稀释后上样，用PBS(含20mM咪唑)冲洗柱子至OD值<0.01，用PBS(含200mM咪唑)洗脱1.5h，收集洗脱液。所有操作均在4℃下进行，流速为0.5mL/min。

每升步骤2得到的发酵液纯化后可以获得50毫克纯度90％以上的gp96蛋白。如果蛋白洗脱液中含有异源杂蛋白，可将亲和层析的洗脱液再进行离子交换层析，主要步骤为：200mM NaCl的PBS液平衡柱子，上样，300mM NaCl的PBS液洗杂质，800mM NaCl的PBS液洗脱目的蛋白。

将步骤2的发酵液、亲和层析后的洗脱液和离子交换层析后的洗脱液进行10％SDS-PAGE，然后考马斯亮蓝染色。将gp96蛋白进行western blot，一抗为大鼠抗gp96抗体(购自santa cruz，产品号为sc-56399)，结果见图2。其中，1：分子量标准；2：步骤2的发酵液；3：亲和层析后的洗脱液；4：离子交换层析后的洗脱液；5：Western blot鉴定图。

图2结果显示，离子交换层析后的洗脱液中的gp96蛋白纯度很高。

(三)利用昆虫细胞表达重组gp96蛋白

1、重组质粒pFastBac^TM1-gp96的构建

①采用Trizol法提取HepG2细胞的RNA，然后进行反转录获得cDNA。

②根据人gp96基因(GenBank号为AY040226.1)的序列，人工合成引物F1：5’-GGAATTCATGGACGATGAAGTTGAT-3’(下划线为限制性内切酶EcoR Ⅰ识别序列)和R1：5’-GCTCTAGACTATTAGAATTCATCTTTTTC-3’(下划线为限制性内切酶XbaⅠ识别序列)。

③完成步骤1和2后，以步骤1获得的cDNA为模板，以步骤2合成的F1和R1为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

④用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。

⑤用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切质粒pFastBac^TM1，回收约4700bp的载体骨架。

⑥将酶切产物与载体骨架连接，得到连接产物。

⑦将步骤⑥获得的连接产物转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，得到重组大肠杆菌，然后提取该重组大肠杆菌的质粒，获得重组质粒pFastBac1-gp96。

根据测序结果，对重组质粒pFastBac1-gp96进行结构描述如下：将质粒pFastBac1的EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ识别序列间的片段(质粒pFastBac1被限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为SEQ ID NO:1所示的双链DNA分子。重组质粒pFastBac 1-gp96表达重组热休克蛋白gp96，gp96的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2、gp96的表达

①将步骤1构建的重组质粒pFastBac1-gp96共转染Sf9细胞(每1×10⁶个Sf9细胞约转染4μg重组质粒pFastBac1-gp96；共转染过程中，转染试剂为Cellfectin II reagent，培养基为Insect-XPRESS^TM Protein-free Insect Cells medium with L-Glutamine，27℃孵育72h，离心，上清液即为P1代病毒。

②将Sf9细胞悬浮液1(含1×10⁸个Sf9细胞)27℃培养8～10h，得到培养细胞；然后向所述培养细胞中加入P1代病毒(剂量为0.05～0.1MOI)，27℃孵育72h，4000rpm离心5min，上清液即为P2代病毒。

③向Sf9细胞悬浮液2(含1.6×10⁸个Sf9细胞)中加入P2代病毒(剂量为0.05～0.1MOI)，27℃、100～120rpm培养72h，4000rpm离心5min，上清液即为P3代病毒。

以gp96单克隆抗体作为一抗，辣根过氧化酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体作为二抗，对P3代病毒进行western杂交，western杂交具体步骤参考如下文献：张悦鸣，段跃强，罗德炎，姚惠娟，王希良，李志奎.小鼠可溶性IL-5α受体在Bac-to-Bac系统中的表达及其鉴定[J].中国生物制品学杂志，2013，26：5.

Western blot实验结果表明，gp96在Sf9细胞中表达。

3、gp96的纯化

①向300ml的Sf9细胞悬浮液3(含4.5×10⁸个Sf9细胞)中加入P3代病毒(剂量为5MOI)，27℃、100～120rpm培养72h，得到悬浮液。

②取所述悬浮液，7000rpm离心20min，获得上清液1。

③取所述上清液1，经0.22mm滤膜过滤，获得上样液。

④将所述上样液上样于HiTrap-Q Sepharose离子交换层析柱(流速为1mL/min)，然后先用5mL的pH7.5、200mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)；再用10mL的pH7.5、300mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)；最后用3mL的pH7.5、600mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)，收集过柱后溶液并采用截留分子量为50KD的超滤管进行超滤浓缩，得到1mL左右的浓缩液。所述浓缩液即含有gp96。

⑤将步骤④得到的浓缩液上样于Superdex 200 10/300GL分子筛层析柱(流速为0.25mL/min)，然后用pH7.5、150mM的PBS缓冲液洗涤(流速为0.25mL/min)，收集为9～12mL处的穿透液，进一步采用截留分子量为50KD的超滤管进行超滤浓缩，得到gp96溶液。采用BCA法测定gp96溶液中的蛋白浓度，最后分装，贮存于-80℃。

将步骤⑤得到的gp96溶液进行SDS-PAGE电泳分析，实验结果见图3，泳道1为高分子量标准蛋白质，泳道2为gp96。将步骤⑤得到的重组热休克蛋白gp96溶液进行Westernblot(以gp96单克隆抗体作为一抗，辣根过氧化酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体作为二抗)，实验结果见图3中泳道3。结果表明，gp96溶液显示单一分子量条带，对应的分子量与预期一致。

实施例2热休克蛋白gp96在活化调节性T细胞中的确定

一、小鼠分组免疫

将100只体重为18～22g的小鼠随机分成胎盘gp96处理组1、胎盘gp96处理组2、胎盘gp96处理组3、酵母gp96处理组1、gp96处理组2、酵母gp96处理组3、昆虫gp96处理组1、昆虫gp96处理组2、昆虫gp96处理组3和对照组(每组10只)，分别进行如下处理：

胎盘gp96处理组1：实验第1天，腹腔注射实施例1利用人胎盘组织提取的gp96溶液；实验第8天，再次腹腔注射实施例1利用人胎盘组织提取的gp96溶液；实验第22天，再次腹腔注射实施例1利用人胎盘组织提取的gp96溶液。每次注射剂量均为100μg gp96/只。

胎盘gp96处理组2：按照胎盘gp96处理组1的操作步骤进行，仅将注射剂量100μggp96/只替换为200μg gp96/只。

胎盘gp96处理组3：按照胎盘gp96处理组1的操作步骤进行，仅将注射剂量100μggp96/只替换为400μg gp96/只。

酵母gp96处理组1：实验第1天，腹腔注射实施例1利用汉逊酵母表达制备的gp96溶液；实验第8天，再次腹腔注射实施例1利用人胎盘组织提取的gp96溶液；实验第22天，再次腹腔注射实施例1利用人胎盘组织提取的gp96溶液。每次注射剂量均为100μg gp96/只。

酵母gp96处理组2：按照酵母gp96处理组1的操作步骤进行，仅将注射剂量100μggp96/只替换为200μg gp96/只。

酵母gp96处理组3：按照酵母gp96处理组1的操作步骤进行，仅将注射剂量100μggp96/只替换为400μg gp96/只。

昆虫gp96处理组1：实验第1天，腹腔注射实施例1利用昆虫细胞表达制备的gp96溶液；实验第8天，再次腹腔注射实施例1利用昆虫细胞表达制备的gp96溶液；实验第22天，再次腹腔注射实施例1利用昆虫细胞表达制备的gp96溶液。每次注射剂量均为100μg gp96/只。

昆虫gp96处理组2：按照昆虫gp96处理组1的操作步骤进行，仅将注射剂量100μggp96/只替换为200μg gp96/只。

昆虫gp96处理组3：按照昆虫gp96处理组1的操作步骤进行，仅将注射剂量100μggp96/只替换为400μg gp96/只。

对照组：实验第1天腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，实验第8天，再次腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液；实验第22天，再次腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液。每次注射剂量均为100μL/只。

二、小鼠淋巴细胞分离

取完成步骤一后第8天的小鼠，获取小鼠脾脏淋巴细胞(每只小鼠取3×10⁶个脾脏淋巴细胞)。

三、gp96在活化调节性T细胞中剂量的确定

1、取步骤二获取的小鼠脾脏淋巴细胞(少于1×10⁶个)，1000rpm离心10min，收集小鼠脾脏淋巴细胞。

2、完成步骤1后，取所述小鼠脾脏淋巴细胞，加入100μL含5％(质量体积比)BSA的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液重悬，4℃封闭20min；然后1000rpm离心10min，用100μL上清液重悬沉淀，得到混合液甲。

3、完成步骤2后，取所述混合液甲，加入FITC-anti-CD3、PE-anti-CD4和Percp-Cy5.5-anti-CD25，4℃避光孵育20min。

4、完成步骤3后，取所述混合液甲，加入1mL pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，震荡混匀，1000rpm离心10min，收集小鼠脾脏淋巴细胞，然后用400μL pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液重悬，得到混合液乙。

5、完成步骤4后，取所述混合液乙，加入600μL固定/破膜剂，4℃破膜30min(实际操作过程中不超过1h即可)；然后1000rpm离心10min，收集沉淀，得到沉淀1。

6、完成步骤5后，取所述沉淀1，加入1mL 1×洗涤液重悬，1000rpm离心10min，得到沉淀2和上清液丙。取100μL上清液丙重悬沉淀2，得到混合液丙；向混合液丙中加入APC-anti-Foxp3，4℃避光孵育30min。

7、完成步骤6后，取所述混合液丙，加入1mL 1×洗涤液重悬，1000rpm离心10min，收集沉淀，得到沉淀3。取400μL含4％(质量体积比)多聚甲醛的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液重悬沉淀3，然后用流式细胞仪分析小鼠脾脏淋巴细胞中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的频率。

实验结果见表1，结果表明，胎盘、酵母和昆虫共9组gp96处理组中小鼠的脾脏淋巴细胞中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的频率显著均高于对照组。因此，人胎盘组织、汉逊酵母重组表达和昆虫细胞重组表达的gp96蛋白均可以显著诱导CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的产生。而200μg gp96和400μg人胎盘组织、汉逊酵母重组表达和昆虫细胞重组表达的gp96蛋白均可以显著诱导更高CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞的产生。

表1 gp96免疫对小鼠调节性T细胞的影响(平均值±sd值)

注：与对照组相比，^*P<0.01

实施例3 gp96在治疗免疫性血小板减少性紫癜中的应用

一、血小板数量的分析

1、豚鼠抗血小板抗血清(APS)的制备

取健康BALB/C小鼠，眼眶取血，静止1-2h，700rpm/min离心10min，取上层血清1500rpm/min离心15min，取上层血清900rpm/min离心10min，取上层血清3000rpm/min离心10min，弃去血清，得底部沉淀血小板，加入1％(质量体积分数)草酸氨1mL，静止5min，3000rpm/min离心10min，弃去上层液体，底部血小板用生理盐水洗涤3次，计数，用生理盐水稀释到浓度为1×10⁹-2×10⁹个/L,分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按1:1比例混合成弗氏完全佐剂血小板抗原混合物与弗氏不完全佐剂血小板抗原混合物，备用。取健康豚鼠10只，于第一周注射弗氏完全佐剂血小板抗原混合物于其四肢、腹股沟、背部皮下，每处注射100μL，于第2，3，4周注射同剂量的弗氏不完全佐剂血小板抗原混合物。第4周麻醉豚鼠，心脏取血。1500rpm/min离心10min，取上层血清，余下全血继续3000rpm/min离心10min。合并两次血清，得豚鼠抗小鼠血小板血清(APS)。在96孔板中滴加50μL血小板悬液(500×10⁹个/L)，滴加2倍比例稀释豚鼠抗小鼠血小板血清，37℃孵育24h。通过沉淀弧评价抗血清效价。-20℃保存备用。

2、小鼠分组免疫

120只六周龄的体重为18～22g的健康BALB/C小鼠，随机分成4组(每组30只)，分别进行如下处理：

gp96处理组1：实验第1天，腹腔注射实施例1制备胎盘组织提取的gp96蛋白；实验第8天，再次腹腔注射实施例1制备胎盘组织提取的gp96蛋白；实验第22天，再次腹腔注射实施例1制备的gp96蛋白。每次注射剂量均为200μg gp96/只。

gp96处理组2：按照gp96处理组1的操作步骤进行，仅将注射用gp96蛋白改为酵母菌重组表达gp96蛋白。

gp96处理组3：按照gp96处理组1的操作步骤进行，仅将注射用gp96蛋白改为昆虫细胞重组表达gp96蛋白。

处理组1～3中注射的蛋白是指将实施例1中制备的gp96蛋白或重组gp96蛋白制成冻干粉针剂后，溶于适量溶剂(例如PBS缓冲液)中，按每只小鼠200μg gp96蛋白的给药量进行注射。

对照组：实验第1天腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，实验第8天，再次腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液；实验第22天，再次腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液。每次注射剂量均为100μL/只。

3、免疫性血小板减少性紫癜小鼠的制备

豚鼠抗小鼠血小板血清(APS)于56℃水浴30min灭活补体，以生理盐水稀释到1：4效价，对gp96免疫过的BALB/C小鼠和对照小鼠进行腹腔注射。于0，2，4，6，8，10d按照100μg/只小鼠腹腔注入稀释的抗血清。

第10天后，眼眶取血，检测血小板计数；处死小鼠，解剖取出脾脏，称重，计算脾脏系数。

小鼠的血小板数量检测结果见表2。结果表明，与对照组小鼠相比，经gp96免疫小鼠的血小板数量显著升高，3组gp96处理组无显著差异。

小鼠的脾脏系数检测结果见表2。结果表明，与对照组小鼠相比，经gp96免疫小鼠的脾脏系数显著下降，3组gp96处理组无显著差异。上述结果表明，用gp96免疫小鼠，能够有效的治疗或减轻免疫性血小板减少性紫癜症状。

表2 gp96免疫对小鼠血小板和脾脏系数的影响(平均值±sd值)

注：与对照组相比，^**P<0.01

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京热休生物技术有限公司

<120> gp96蛋白在制备治疗特发性血小板减少性紫癜药物中的应用

<130> KHP171110217.1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2352

<212> DNA

<213> 热休克蛋白gp96

<400> 1

atggacgatg aagttgatgt ggatggtaca gtagaagagg atctgggtaa aagtagagaa 60

ggatcaagga cggatgatga agtagtacag agagaggaag aagctattca gttggatgga 120

ttaaatgcat cacaaataag agaacttaga gagaagtcgg aaaagtttgc cttccaagcc 180

gaagttaaca gaatgatgaa acttatcatc aattcattgt ataaaaataa agagattttc 240

ctgagagaac tgatttcaaa tgcttctgat gctttagata agataaggct aatatcactg 300

actgatgaaa atgctctttc tggaaatgag gaactaacag tcaaaattaa gtgtgataag 360

gagaagaacc tgctgcatgt cacagacacc ggtgtaggaa tgaccagaga agagttggtt 420

aaaaaccttg gtaccatagc caaatctggg acaagcgagt ttttaaacaa aatgactgaa 480

gcacaggaag atggccagtc gtcttctgaa ttgattggcc agtttggtgt cggtttctat 540

tccgccttcc ttgtagcaga taaggttatt gtcacttcaa aacacaacaa cgatacccag 600

cacatctggg agtctgactc caatgaattt tctgtaattg ctgacccaag aggaaacact 660

ctaggacggg gaacgacaat tacccttgtc ttaaaagaag aagcatctga ttaccttgaa 720

ttggatacaa ttaaaaatct cgtcaaaaaa tattcacagt tcataaactt tcctatttat 780

gtatggagca gcaagactga aactgttgag gagcccatgg aggaagaaga agcagccaaa 840

gaagagaaag aagaatctga tgatgaagct gcagtagagg aagaagaaga agaaaagaaa 900

ccaaagacta aaaaagttga aaaaactgtc tgggactggg aacttatgaa tgatatcaaa 960

ccaatatggc agagaccatc aaaagaagta gaagaagatg aatacaaagc tttctacaaa 1020

tcattttcaa aggaaagtga tgaccccatg gcttatattc actttactgc tgaaggggaa 1080

gttaccttca aatcaatttt atttgtaccc acatctgctc cacgtggtct gtttgacgaa 1140

tatggatcta aaaagagcga ttacattaag ctctatgtgc gccgtgtatt catcccagac 1200

gacttccatg atatgatgcc taaatacctc aattttgtca agggtgtggt ggactcagat 1260

gatctcccct tgaatgtttc ccgcgagact cttcagcaac ataaactgct taaggtgatt 1320

aggaagaagc ttgttcgtaa aacgctggac atgatcaaga agattgctga tgataaatac 1380

aatgatactt tttggaaaga atttggtacc aacatcaagc ttggtgtgat tgaagaccac 1440

tcgaatcgaa cacgtcttgc taaacttctt aggttccagt cttctcatca tccaactgac 1500

attactagcc tagaccagta tgtggaaaga atgaaggaaa aacaagacaa aatctacttc 1560

atggctgggt ccagcagaaa agaggctgaa tcttctccat ttgttgagcg acttctgaaa 1620

aagggctatg aagttattta cctcacagaa cctgtggatg aatactgtat tcaggccctt 1680

cccgaatttg atgggaagag gttccagaat gttgccaagg aaggagtgaa gttcgatgaa 1740

agtgagaaaa ctaaggagag tcgtgaagca gttgagaaag aatttgagcc tctgctgaat 1800

tggatgaaag ataaagccct taaggacaag attgaaaagg ctgtggtgtc tcagcgcctg 1860

acagaatctc cgtgtgcttt ggtggccagc cagtacggat ggtctggcaa catggagaga 1920

atcatgaaag cacaagcgta ccaaacgggc aaggacatct ctacaaatta ctatgcgagt 1980

cagaagaaaa catttgaaat taatcccaga cacccgctga tcagagacat gcttcgacga 2040

attaaggaag atgaagatga taaaacagtt ttggatcttg ctgtggtttt gtttgaaaca 2100

gcaacgcttc ggtcagggta tcttttacca gacactaaag catatggaga tagaatagaa 2160

agaatgcttc gcctcagttt gaacattgac cctgatgcaa aggtggaaga agagcccgaa 2220

gaagaacctg aggagacagc agaagacaca acagaagaca cagagcaaga cgaagatgaa 2280

gaaatggatg tgggaacaga tgaagaagaa gaaacagcaa aggaatctac agctgaaaaa 2340

gatgaattct aa 2352

<210> 2

<211> 783

<212> PRT

<213> 热休克蛋白gp96

<400> 2

Met Asp Asp Glu Val Asp Val Asp Gly Thr Val Glu Glu Asp Leu Gly

1 5 10 15

Lys Ser Arg Glu Gly Ser Arg Thr Asp Asp Glu Val Val Gln Arg Glu

20 25 30

Glu Glu Ala Ile Gln Leu Asp Gly Leu Asn Ala Ser Gln Ile Arg Glu

35 40 45

Leu Arg Glu Lys Ser Glu Lys Phe Ala Phe Gln Ala Glu Val Asn Arg

50 55 60

Met Met Lys Leu Ile Ile Asn Ser Leu Tyr Lys Asn Lys Glu Ile Phe

65 70 75 80

Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu Asp Lys Ile Arg

85 90 95

Leu Ile Ser Leu Thr Asp Glu Asn Ala Leu Ser Gly Asn Glu Glu Leu

100 105 110

Thr Val Lys Ile Lys Cys Asp Lys Glu Lys Asn Leu Leu His Val Thr

115 120 125

Asp Thr Gly Val Gly Met Thr Arg Glu Glu Leu Val Lys Asn Leu Gly

130 135 140

Thr Ile Ala Lys Ser Gly Thr Ser Glu Phe Leu Asn Lys Met Thr Glu

145 150 155 160

Ala Gln Glu Asp Gly Gln Ser Ser Ser Glu Leu Ile Gly Gln Phe Gly

165 170 175

Val Gly Phe Tyr Ser Ala Phe Leu Val Ala Asp Lys Val Ile Val Thr

180 185 190

Ser Lys His Asn Asn Asp Thr Gln His Ile Trp Glu Ser Asp Ser Asn

195 200 205

Glu Phe Ser Val Ile Ala Asp Pro Arg Gly Asn Thr Leu Gly Arg Gly

210 215 220

Thr Thr Ile Thr Leu Val Leu Lys Glu Glu Ala Ser Asp Tyr Leu Glu

225 230 235 240

Leu Asp Thr Ile Lys Asn Leu Val Lys Lys Tyr Ser Gln Phe Ile Asn

245 250 255

Phe Pro Ile Tyr Val Trp Ser Ser Lys Thr Glu Thr Val Glu Glu Pro

260 265 270

Met Glu Glu Glu Glu Ala Ala Lys Glu Glu Lys Glu Glu Ser Asp Asp

275 280 285

Glu Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys Pro Lys Thr Lys

290 295 300

Lys Val Glu Lys Thr Val Trp Asp Trp Glu Leu Met Asn Asp Ile Lys

305 310 315 320

Pro Ile Trp Gln Arg Pro Ser Lys Glu Val Glu Glu Asp Glu Tyr Lys

325 330 335

Ala Phe Tyr Lys Ser Phe Ser Lys Glu Ser Asp Asp Pro Met Ala Tyr

340 345 350

Ile His Phe Thr Ala Glu Gly Glu Val Thr Phe Lys Ser Ile Leu Phe

355 360 365

Val Pro Thr Ser Ala Pro Arg Gly Leu Phe Asp Glu Tyr Gly Ser Lys

370 375 380

Lys Ser Asp Tyr Ile Lys Leu Tyr Val Arg Arg Val Phe Ile Pro Asp

385 390 395 400

Asp Phe His Asp Met Met Pro Lys Tyr Leu Asn Phe Val Lys Gly Val

405 410 415

Val Asp Ser Asp Asp Leu Pro Leu Asn Val Ser Arg Glu Thr Leu Gln

420 425 430

Gln His Lys Leu Leu Lys Val Ile Arg Lys Lys Leu Val Arg Lys Thr

435 440 445

Leu Asp Met Ile Lys Lys Ile Ala Asp Asp Lys Tyr Asn Asp Thr Phe

450 455 460

Trp Lys Glu Phe Gly Thr Asn Ile Lys Leu Gly Val Ile Glu Asp His

465 470 475 480

Ser Asn Arg Thr Arg Leu Ala Lys Leu Leu Arg Phe Gln Ser Ser His

485 490 495

His Pro Thr Asp Ile Thr Ser Leu Asp Gln Tyr Val Glu Arg Met Lys

500 505 510

Glu Lys Gln Asp Lys Ile Tyr Phe Met Ala Gly Ser Ser Arg Lys Glu

515 520 525

Ala Glu Ser Ser Pro Phe Val Glu Arg Leu Leu Lys Lys Gly Tyr Glu

530 535 540

Val Ile Tyr Leu Thr Glu Pro Val Asp Glu Tyr Cys Ile Gln Ala Leu

545 550 555 560

Pro Glu Phe Asp Gly Lys Arg Phe Gln Asn Val Ala Lys Glu Gly Val

565 570 575

Lys Phe Asp Glu Ser Glu Lys Thr Lys Glu Ser Arg Glu Ala Val Glu

580 585 590

Lys Glu Phe Glu Pro Leu Leu Asn Trp Met Lys Asp Lys Ala Leu Lys

595 600 605

Asp Lys Ile Glu Lys Ala Val Val Ser Gln Arg Leu Thr Glu Ser Pro

610 615 620

Cys Ala Leu Val Ala Ser Gln Tyr Gly Trp Ser Gly Asn Met Glu Arg

625 630 635 640

Ile Met Lys Ala Gln Ala Tyr Gln Thr Gly Lys Asp Ile Ser Thr Asn

645 650 655

Tyr Tyr Ala Ser Gln Lys Lys Thr Phe Glu Ile Asn Pro Arg His Pro

660 665 670

Leu Ile Arg Asp Met Leu Arg Arg Ile Lys Glu Asp Glu Asp Asp Lys

675 680 685

Thr Val Leu Asp Leu Ala Val Val Leu Phe Glu Thr Ala Thr Leu Arg

690 695 700

Ser Gly Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Lys Ala Tyr Gly Asp Arg Ile Glu

705 710 715 720

Arg Met Leu Arg Leu Ser Leu Asn Ile Asp Pro Asp Ala Lys Val Glu

725 730 735

Glu Glu Pro Glu Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Glu Asp Thr Thr Glu

740 745 750

Asp Thr Glu Gln Asp Glu Asp Glu Glu Met Asp Val Gly Thr Asp Glu

755 760 765

Glu Glu Glu Thr Ala Lys Glu Ser Thr Ala Glu Lys Asp Glu Phe

770 775 780

Claims (10)

1.gp96蛋白在制备治疗特发性血小板减少性紫癜药物中的应用，其中，所述gp96蛋白为：

i)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或

ii)SEQ ID NO:2去掉第一个蛋氨酸后的氨基酸序列；或

iii)在i)或ii)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；或

iv)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:2去掉第一个蛋氨酸后的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。

2.gp96蛋白在制备诱导调节性T细胞产生的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述调节性T细胞包括CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞。

4.gp96蛋白在制备升血小板药物中的应用。

5.用于治疗特发性血小板减少性紫癜的药物，其特征在于，有效成分为gp96蛋白。

6.用于诱导调节性T细胞产生的药物，其特征在于，有效成分为gp96蛋白。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述调节性T细胞包括CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞。

8.升血小板药物，其特征在于，有效成分为gp96蛋白。

9.根据权利要求5-8任一项所述的药物，其特征在于，小鼠免疫单次剂量为100-400μg/18-22g体重，人免疫剂量为100-1500μg/人次。

10.根据权利要求5-8任一项所述的药物，其特征在于，药物剂型为冻干粉针剂。