CN106913862B

CN106913862B - 蛋白TIF1-β的多肽与热休克蛋白gp96形成的复合物在制备治疗与预防癌症的药物中的应用

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Publication number: CN106913862B
Application number: CN201710157653.4A
Authority: CN
Inventors: 孟颂东; 郑华国; 李杨
Original assignee: Beijing Rexiu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Rexiu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-03-16
Filing date: 2017-03-16
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2037-03-16
Also published as: CN106913862A

Abstract

本发明提供蛋白TIF1‑β及其多肽在制备治疗与预防癌症的药物中的应用，所述癌症为乳腺癌及肝癌。利用本发明提供的活性成分为蛋白TIF1‑β及其多肽的药物(疫苗)免疫数周后，可引发机体产生特异的免疫反应，清除体内肿瘤干细胞和/或肿瘤休眠细胞，以及癌变的细胞，从而达到预防和治疗癌症的目的。本发明可作为肿瘤预防性疫苗，用于自体或异体肿瘤防治，降低健康人群中癌症的发生率，也可作为肿瘤治疗性疫苗，患者术后即时施治能有效防转移防复发，或作为化学疗法的辅助治疗。本发明提供的蛋白TIF1‑β及其多肽也可以用于异体肿瘤的免疫防治。

Description

蛋白TIF1-β的多肽与热休克蛋白gp96形成的复合物在制备治疗与预防癌症的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，涉及蛋白TIF1-β及其多肽在制备治疗与预防癌症的药物中的应用。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。据资料统计，乳腺癌发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％，在很多地区已经超过子宫癌，成为严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的肿瘤之一。乳腺癌的发病与患者的遗传基因、生活习惯、常用食物、生育状况等紧密相关，不同人种、地域的乳腺癌发病率有着明显的区别。乳腺癌的高发地区，主要集中在北美、北欧和大洋洲，尤其白种女性居多。乳腺癌的中发地区，集中在南美、南欧和以色列。亚洲则是乳腺癌的低发地区。举例来说，美国白种女性一生乳腺癌发病率为13.1％，即平均每8-9人就有1人可能会患上乳腺癌，而亚洲女性的乳腺癌发病率为4-7％。WHO统计，全球每年新发乳腺癌达130万人左右，死亡50万人左右。在我国北京、上海、天津等大城市的乳腺癌发病已跃居女性各种癌瘤首位,而且有明显上升的趋势。

肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种。原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一。在世界范围内男性癌症患者中，肝癌比例排第六，死亡率排在第二；在女性癌症患者中，肝癌比例排第七，死亡率排第六。2008年，全世界共有748,300个新增肝癌病例，有695,900例肝癌患者死亡。而这些新增肝癌病例和死亡病例中有一半在中国。肝癌发生率最高的区域主要在东亚，东南亚，中非和西非国家。亚洲部分地区和非洲撒哈拉以南地区之所以肝癌发生率较高，可能是因为这些地区HBV盛行，因为这些地区8％的居民慢性感染HBV，在发展中国家60％的肝癌患者感染过HBV。

转录调节因子1-β(Transcription intermediary factor 1-beta，TIF1-β)又称为三重结构域蛋白28(Tripartite motif-containing protein 28),或KRAB相关蛋白1(KRAB-associated protein 1)。TIF1β属于锌指蛋白家族RBCC亚家族中的一员，其在维持细胞的多能性，胚胎干细胞的分化，以及控制不同类型细胞分化等方面起到重要的作用。同时越来越多的研究表明TIF1-β在肿瘤的发生及发展中起到关键作用，如肝癌、肺癌和乳腺癌等高发癌症中，TIF1-β蛋白的表达均显著提升，同时TIF1-β的表达水平与癌症患者的生存率直接相关。

热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)是一类在生物进化中高度保守且广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质。HSP根据同源程度和分子量大小可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、小分子HSP和泛素等多个亚家族。热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)gp96属于HSP90亚家族的成员，该蛋白是细胞内质网上含量最丰富的热休克蛋白。热休克蛋白gp96蛋白具有多肽结合特性，在内质网内其能接受来自TAP复合体的多肽片段，协助将其组装至MHC I类分子，递呈于细胞膜上。不同组织来源的热休克蛋白gp96能携带有其来源组织内特异性表达的多肽片段。

发明内容

本发明的目的是提供一种能预防及治疗癌症的靶标蛋白及其多肽的应用方法，具体地，提供蛋白TIF1-β及其多肽在制备治疗与预防癌症的药物中的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供蛋白TIF1-β及其多肽在制备治疗与预防癌症的药物中的应用。

本发明所述蛋白TIF1-β为：

i)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或

ii)SEQ ID NO:2去掉第一个蛋氨酸后的氨基酸序列；或

iii)在i)或ii)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；或

iv)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:2去掉第一个蛋氨酸后的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。

本发明所述多肽的氨基酸序列为：IYFQLHRALKMI、TVYCNVHKHEPL和FQLHRALKMIVDPV；或

所述多肽为来源于蛋白TIF1-β的任意长度的连续多肽。

编码所述蛋白TIF1-β的核酸分子，可为b1)或b2)或b3)或b4)：

b1)SEQ ID NO:1自5’端起第4位至最后一位所示的DNA分子；

b2)SEQ ID NO:1所示的DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白TIF1-Β的DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白TIF1-β的DNA分子。

所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

本发明所述蛋白TIF1-Β及其多肽的获得方式为C1)、C2)或C3)：

C1)从哺乳动物离体组织或体外培养细胞中提取；

C2)将编码所述蛋白及多肽的核酸分子导入受体中，培养、纯化；

C3)将所述蛋白及多肽以化学方法体外合成。

本发明所述癌症为乳腺癌及肝癌。所述乳腺癌包括TUBO乳腺癌细胞及DMBA诱导的乳腺癌。所述肝癌包括H22乳腺癌细胞及DEN诱导的乳腺癌。

本发明还提供一种预防和/或治疗癌症的药物(或疫苗)，其活性成分为蛋白TIF1-β及其多肽。

本发明还提供一种预防和/或治疗癌症的药物(或疫苗)，其活性成分为蛋白TIF1-β及其多肽与热休克蛋白gp96形成的复合物。其中热休克蛋白gp96作为免疫佐剂增强作用。

本发明所述热休克蛋白gp96为：

i′)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；或

ii′)SEQ ID NO:4去掉第一个蛋氨酸后的氨基酸序列；或

iii′)在i′)或ii′)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；或

iv′)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:4去掉第一个蛋氨酸后的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。

编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子，可为d1)或d2)或d3)或d4)：

d1)SEQ ID NO:3自5’端起第4位至2352位所示的DNA分子；

d2)SEQ ID NO:3所示的DNA分子；

d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述热休克蛋白gp96的DNA分子；

d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述热休克蛋白gp96的DNA分子。

本发明所述热休克蛋白gp96的获得方式为E1)或E2)：

E1)从离体哺乳动物的胎盘组织中提取；

E2)将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中，培养，纯化。

所述E1)中，所述哺乳动物可为人、鼠。所述鼠具体可为雌性C57BL/6及BALB/c小鼠。

所述E2)可以是利用酵母菌表达重组gp96蛋白。

所述E2)中，“将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中”可通过向受体中导入重组载体实现；所述重组载体可为将所述热休克蛋白gp96的编码基因插入出发质粒得到的重组质粒。所述重组载体具体可为重组质粒pFastBac1-gp96。所述重组质粒pFastBac1-gp96具体可为在质粒pFastBac1的多克隆位点插入SEQ ID NO:3所示的DNA分子得到的重组质粒。

所述重组质粒pFastBac1-gp96具体可为将质粒pFastBac1的EcoRⅠ和XbaⅠ识别序列间的片段(质粒pFastBac1被限制性核酸内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为SEQ ID NO:3所示的DNA分子得到的重组质粒。

本发明还可以利用昆虫细胞表达重组gp96蛋白。所述昆虫细胞可为Sf9细胞。

所述药物可按如下D1)或D2)方法制得：

D1)将所述蛋白TIF1-β及其多肽与热休克蛋白gp96在体外以自然吸附或热击方式形成复合物。

D2)将所述蛋白TIF1-β及其多肽与热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中，培养、纯化获得复合物。

本发明提供的预防和/或治疗癌症的药物，其活性成分为SEQ ID NO:5-7所示的多肽与热休克蛋白gp96形成的复合物。

所述复合物可按如下方法制得：

分别化学合成SEQ ID NO:5-7所示的多肽，按等比例混合，用DMSO配制成浓度20mg/mL的多肽溶液，分别取1mg多肽溶液与1mg热休克蛋白gp96，用pH7.4 0.01mol/L PBS缓冲液溶解至总体积4mL，然后于55℃热击10分钟，在室温冷却30分钟，最后用50kD超滤管洗去未结合的多肽，即得gp96-多肽复合物。

本发明提供的预防和/或治疗癌症的药物，其功能为如下A1)至A8)中的至少一种：

A1)降低化学物诱导的乳腺癌的发生率；

A2)降低化学物诱导的肝癌发生率；

A3)减缓或停止已建立的乳腺癌肿瘤灶的生长；

A4)减缓或停止已建立的肝癌肿瘤灶的生长；

A5)减少或停止已建立的乳腺癌肿瘤灶的转移；

A6)减少或停止已建立的肝癌肿瘤灶的转移；

A7)诱导产生乳腺癌特异性的CTL细胞并对乳腺癌细胞杀伤；

A8)诱导产生肝癌特异性的CTL细胞并对肝癌细胞杀伤。

本发明药物或疫苗的施用对象为人和哺乳动物。优选所述哺乳动物为小鼠。更优选C57BL/6及BALB/c小鼠。针对免疫对象，免疫剂量为每次不少于10μg，总共不少于3次，采取皮下注射、皮内注射或腹腔注射方式进行免疫。

本发明的药物(疫苗)免疫数周后，可引发机体产生特异的免疫反应，清除体内肿瘤干细胞和/或肿瘤休眠细胞，以及癌变的细胞，从而达到预防和治疗癌症的目的。本发明可作为肿瘤预防性疫苗，用于自体或异体肿瘤防治，降低健康人群中癌症的发生率，也可作为肿瘤治疗性疫苗，患者术后即时施治能有效防转移防复发，或作为化学疗法的辅助治疗。本发明提供的蛋白TIF1-Β及其多肽也可以用于异体肿瘤的免疫防治。

附图说明

图1为本发明实施例1中胎盘gp96的SDS-PAGE和Western blot鉴定结果。

图2为本发明实施例2中酵母表达gp96的SDS-PAGE和Western Blot鉴定结果。

图3为本发明实施例3中昆虫表达gp96的SDS-PAGE和Western Blot的鉴定结果。

图4为本发明实施例5中多肽-gp96复合物对乳腺癌的治疗作用(肿瘤体积)。

图5为本发明实施例6中多肽-gp96复合物对肝癌的治疗作用(肿瘤体积)。

图6为本发明实施例7中多肽-gp96复合物诱导的特异性CTL对于人乳腺癌细胞杀伤作用。

图7为本发明实施例8中多肽-gp96复合物诱导的特异性CTL对于人肝癌细胞杀伤作用。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

雌性C57BL/6与雌性BALB/C小鼠为北京维通利华实验动物有限责任公司产品；在实施例中简称小鼠。多肽由上海吉尔生化有限公司合成。

HepG2细胞(人肝癌细胞)购自ATCC(美国菌种保藏中心)，产品目录号为HB-8065^TM。MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)购自ATCC，产品目录号为HTB-22^TM。H22及HHCC细胞购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，资源号分别为3111C0001CCC000309、3111C0002000000069。Sf9细胞为Invitrogen公司产品，产品目录号为11496-015。Cellfectin II reagent为Life technologies公司产品，产品目录号为10362-100。质粒pFastBac^TM1为Invitrogen公司产品，产品目录号为10359-016。gp96单克隆抗体为SantaCruz公司产品，产品目录号为sc-56399。辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，产品目录号为ZB-2307。HiTrap-Q Sepharose离子交换层析柱为GE公司产品，产品目录号为17-5053-01。Superdex 200 10/300GL分子筛层析柱为GE公司产品，产品目录号为17517501。大肠杆菌DH10Bac感受态细胞为北京原平皓生物技术有限公司产品，产品目录号为CL108-01。Insect-XPRESS^TM Protein-free InsectCells medium with L-Glutamine为LONZA公司产品，产品目录号为12-730Q。BSA、PMSF、NaHCO₃、MnCl₂、CaCl₂、NaCl₂、Tris、甲基α-D-吡喃甘露糖苷均为Sigma-Aldrich公司产品，产品目录号分别为V900933、P7626、792519、V900197、793639、746398、T1378、M6882。

溶液A：溶质及其浓度为PMSF 1mM和NaHCO₃ 30mM；溶剂为蒸馏水；pH值为7.4。

溶液B：溶质及其浓度为2mM MnCl₂、2mM CaCl₂、500mM NaCl和PMSF 1mM；溶剂为pH7.4、20mM Tris-HCl缓冲液。

溶液C：溶质及其浓度为10％(质量体积比)甲基α-D-吡喃甘露糖苷、500mM NaCl和1mM PMSF；溶剂为pH7.4、20mM Tris-HCl缓冲液。

清洗液：用蒸馏水将溶液B稀释至10倍体积。

ConA琼脂糖凝胶柱为GE公司产品，产品目录号为17-0440-01，该柱的规格为1.6×2.5cm，填充介质为Con A-Sepharose 4B。Hitrap Q阴离子交换柱为GE公司产品，产品目录号为17-1153-01，该柱的规格为0.7×2.5cm。HRP标记的IgG抗体为SEROTEC公司产品，产品目录号为STAR117P。1×洗涤液为含0.1％(体积百分比)Triton-X100的pH7.4、0.01mol/LPBS缓冲液。50kD与3kD超滤管为Merck Millipore公司产品，产品目录号分别为UFC905096、UFC500324。

实施例1胎盘组织gp96蛋白的提取

组织中热休克蛋白gp96(以下简称pgp96)的提取步骤如下：

(1)分离分娩前的小鼠的胎盘组织，得到小鼠离体胎盘组织。取小鼠离体胎盘组织或人离体胎盘组织，剪碎，按质量体积比1g：4mL加入溶液A，然后用玻璃匀浆器磨碎。

(2)完成步骤(1)后，16500g离心1h，得到上清液甲。

(3)完成步骤(2)后，取上清液甲，16500g离心50min，得到上清液乙。

(4)完成步骤(3)后，取上清液乙，按体积比9：1加入溶液B，混匀后得到上样液。

(5)完成步骤(4)后，将上样液上样至ConA琼脂糖凝胶柱。

(6)完成步骤(5)后，用清洗液洗脱所述ConA琼脂糖凝胶柱，洗脱过程中实时监测紫外吸收值，检测波长为280nm，直至洗脱产物的紫外吸收值低于0.01。

(7)完成步骤(6)后，用溶液C洗脱所述ConA琼脂糖凝胶柱，弃去首先流出的过柱后溶液0.5个柱体积，然后收集之后流出的过柱后溶液1个柱体积；将所述ConA琼脂糖凝胶柱孵育50min后，再收集过柱后溶液1.5个柱体积。将两次收集的过柱后溶液合并，即为ConA洗脱液。

(8)完成步骤(7)后，将ConA洗脱液上样至Hitrap Q阴离子交换柱。

(9)完成步骤(8)后，用含NaCl的pH7.4、12mM的PBS缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为1mL/min。梯度洗脱程序：在pH7.4 12mM的PBS缓冲液中使NaCl含量由300mM匀速增至800mM，线性梯度洗脱20个柱体积。收集合并NaCl含量为400～450mM的洗脱液，即为洗脱液甲。

(10)完成步骤(9)后，取洗脱液甲，用超滤管进行超滤浓缩，得到pgp96的溶液。pgp96的溶液中，pgp96浓度为5mg/mL。

将pgp96的溶液进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot(以gp96单克隆抗体作为一抗，HRP标记的IgG抗体作为二抗)，实验结果见图1(箭头所指为pgp96)。结果表明，pgp96的溶液显示单一分子量条带，对应的分子量为96kDa。

实施例2利用汉逊酵母表达重组gp96蛋白

一、重组质粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96的构建

1、提取人肝癌细胞HepG2的mRNA，反转录合成cDNA。

2、以步骤1的cDNA为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR引物如下：

Fp：5'-CCGgaattcATGGACGATGAAGTTGATG-3'

Rp：5'-CCGctcgagCTATTAGAATTCATCTTTTTCAGCTGTAG-3'

3、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切质粒pHFMDZ-R1A(购自Invitrogen公司，产品号为V20520)，回收载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pHFMDZ-R1-gp96并测序。测序结果表明，重组质粒pHFMDZ-R1-gp96的骨架载体为pHFMDZ-R1A，在EcoRI和XhoI酶切位点之间插入了gp96蛋白的编码序列。

二、gp96蛋白的表达

1、采用电转化法将步骤一得到的重组质粒pHFMDZ-R1-gp96导入汉逊酵母(购自ATCC，产品号为MYA-335)细胞，得到重组菌。

2、将重组菌接种于5mL SD液体培养基(购自上海杰美基因医药公司，产品号为GMS12117.7)，37℃培养48h，然后转接到100mL SYN6培养基(购自上海杰美基因医药公司，产品号为GMS12116.1)，30℃培养48h，得到种子培养液。

3、将两瓶种子培养液接种于含有2L SYN6培养基的5L发酵罐中，30℃培养。使用氨水控制pH维持在5.5，每4h检测1次发酵液中甘油含量，根据发酵液中甘油的浓度补加甘油，控制甘油终浓度在0.5％左右，同时控制溶氧在20％以上。根据菌体的生成情况检测菌体湿重，等菌体湿重达到180-200g/L的时候停止补加甘油，开始诱导重组gp96蛋白产生(补加甲醇，使甲醇浓度维持在0.5-0.8％左右)，诱导开始72小时后停止发酵，得到发酵液。

三、gp96蛋白的分离纯化

将步骤二得到的发酵液离心，收集菌体。用PBS缓冲液洗涤细胞2次，在球磨机(DYNO-MILL model KDL)中，按照厂家提供的操作手册使用玻璃珠球磨的方法破碎细胞，破碎后的细胞12000rpm/min离心20min，收集上清液。上清液用0.45μm滤膜进行过滤，得到滤液。将滤液进行浓缩，得到浓缩液。

将滤液进行亲和层析，具体步骤如下：采用英俊公司(Invitrogen Corporation)的Ni-NTA Purification System进行亲和层析，主要步骤为：先用PBS平衡柱子2h，然后用PBS(含20mM咪唑)平衡柱子2h。将浓缩液用PBS(含20mM咪唑)稀释后上样，用PBS(含20mM咪唑)冲洗柱子至OD值<0.01，用PBS(含200mM咪唑)洗脱1.5h，收集洗脱液。所有操作均在4℃下进行，流速为0.5mL/min。

每升步骤二得到的发酵液纯化后可以获得50毫克纯度90％以上的gp96蛋白。如果蛋白洗脱液中含有异源杂蛋白，可将亲和层析的洗脱液再进行离子交换层析，主要步骤为：200mM NaCl的PBS液平衡柱子，上样，300mM NaCl的PBS液洗杂质，800mM NaCl的PBS液洗脱目的蛋白。

将步骤二的发酵液、亲和层析后的洗脱液和离子交换层析后的洗脱液进行10％SDS-PAGE，然后考马斯亮蓝染色。将gp96蛋白进行Western blot，一抗为大鼠抗gp96抗体(购自santa cruz，产品号为sc-56399)，结果见图2。图2中，1：分子量标准；2：步骤二的发酵液；3：亲和层析后的洗脱液；4：离子交换层析后的洗脱液；5：Western blot鉴定图。图2结果显示，离子交换层析后的洗脱液中的gp96蛋白纯度很高。

实施例3利用昆虫细胞表达重组gp96蛋白

一、重组质粒pFastBac^TM1-gp96的构建

1、采用Trizol法提取HepG2细胞的RNA，然后进行反转录获得cDNA。

2、根据人gp96基因(GenBank号为AY040226.1)的序列，化学合成引物F1：5’-GGAATTCATGGACGATGAAGTTGAT-3’(下划线为限制性内切酶EcoRⅠ识别序列)和R1：5’-GCTCTAGACTATTAGAATTCATCTTTTTC-3’(下划线为限制性内切酶XbaⅠ识别序列)。

3、完成步骤1和2后，以步骤1获得的cDNA为模板，以步骤2合成的F1和R1为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

4、用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。

5、用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切质粒pFastBac^TM1，回收约4700bp的载体骨架。

6、将酶切产物与载体骨架连接，得到连接产物。

7、将步骤6获得的连接产物转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，得到重组大肠杆菌，然后提取该重组大肠杆菌的质粒，获得重组质粒pFastBac1-gp96。

根据测序结果，对重组质粒pFastBac1-gp96进行结构描述如下：将质粒pFastBac1的EcoRⅠ和XbaⅠ识别序列间的片段(质粒pFastBac1被限制性核酸内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中序列1所示的双链DNA分子。重组质粒pFastBac 1-gp96表达重组热休克蛋白gp96(以下简称rgp96)，rgp96的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

二、rgp96的表达

1、将步骤一构建的重组质粒pFastBac1-gp96共转染Sf9细胞(每1×10⁶个Sf9细胞约转染4μg重组质粒pFastBac1-gp96；共转染过程中，转染试剂为Cellfectin II reagent，培养基为Insect-XPRESS^TM Protein-free Insect Cells medium with L-Glutamine，27℃孵育72h，离心，上清液即为P1代病毒。

2、将Sf9细胞悬浮液1(含1×10⁸个Sf9细胞)27℃培养8～10h，得到培养细胞；然后向所述培养细胞中加入P1代病毒(剂量为0.05～0.1MOI)，27℃孵育72h，4000rpm离心5min，上清液即为P2代病毒。

3、向Sf9细胞悬浮液2(含1.6×10⁸个Sf9细胞)中加入P2代病毒(剂量为0.05～0.1MOI)，27℃、100～120rpm培养72h，4000rpm离心5min，上清液即为P3代病毒。

以gp96单克隆抗体作为一抗，辣根过氧化酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体作为二抗，对P3代病毒进行Western blot杂交，Western blot杂交具体步骤参考文献：张悦鸣，段跃强，罗德炎，姚惠娟，王希良，李志奎.小鼠可溶性IL-5α受体在Bac-to-Bac系统中的表达及其鉴定[J].中国生物制品学杂志，2013，26：5.

Western blot杂交实验结果表明，rgp96蛋白在Sf9细胞中表达。

三、rgp96蛋白的纯化

1、向300ml的Sf9细胞悬浮液3(含4.5×10⁸个Sf9细胞)中加入P3代病毒(剂量为5MOI)，27℃、100～120rpm培养72h，得到悬浮液。

2、取所述悬浮液，7000rpm离心20min，获得上清液1。

3、取所述上清液1，经0.22mm滤膜过滤，获得上样液。

4、将所述上样液上样于HiTrap-Q Sepharose离子交换层析柱(流速为1mL/min)，然后先用5mL的pH7.5、200mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)；再用10mL的pH7.5、300mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)；最后用3mL的pH7.5、600mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)，收集过柱后溶液并采用截留分子量为50KD的超滤管进行超滤浓缩，得到1mL左右的浓缩液。所述浓缩液即含有rgp96。

5、将步骤4得到的浓缩液上样于Superdex 200 10/300GL分子筛层析柱(流速为0.25mL/min)，然后用pH7.5、150mM的PBS缓冲液洗涤(流速为0.25mL/min)，收集为9～12mL处的穿透液，进一步采用截留分子量为50KD的超滤管进行超滤浓缩，得到rgp96的溶液。采用BCA法测定rgp96的溶液中的蛋白浓度，最后分装，贮存于-80℃。

将步骤5得到的rgp96的溶液进行SDS-PAGE电泳分析，实验结果见图3，泳道1为高分子量标准蛋白质，泳道2为rgp96，箭头为rgp96)。将步骤5得到的重组热休克蛋白gp96的溶液进行Western blot(以gp96单克隆抗体作为一抗，辣根过氧化酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体作为二抗)，实验结果见图3中泳道3。结果表明，rgp96的溶液显示单一分子量条带，对应的分子量与预期一致。

实施例4与小鼠胎盘gp96结合的蛋白多肽鉴定

一、小鼠胎盘gp96结合的多肽鉴定

1、多肽洗脱：取5mg提取的浓度为10mg/mL小鼠胎盘pgp96，加入5μL含有20％(体积比)三氟乙酸的水溶液，4℃中孵育1h。

2、将步骤1中的孵育液加入3kD超滤管中，12,000rpm离心30min，取穿透液。

3、将步骤2中的穿透液注入Agilent 1200高压液相色谱仪进行脱盐纯化(色谱柱型号SB-C18

2.1mm×250mm)，程序如下：

A相：5％(体积比)乙腈水溶液，含0.1％三氟乙酸

B相：乙腈，含0.1％三氟乙酸

0-30min 100％A

30-70min 100％B

4、收集步骤3中30-70分钟的洗脱液，冻干。

5、将步骤4的冻干粉末用0.1％(体积比)的甲酸水溶液重溶，注入OrbitrapFusion高分辨率质谱仪，分析多肽序列，并从数据库中进行匹配。匹配结果见表1。

表1与小鼠胎盘gp96结合的蛋白多肽匹配结果

二、多肽-gp96复合物制备

1、将表1得到的蛋白结果氨基酸序列输入网址http://tools.immuneepitope.org/mhci/进行MHC I类分子的表位预测，分别选取最优的H-2K^d、H-2K^b及HLA-A2限制性表位并化学合成，预测HLA-A2表位时所选用的氨基酸序列应为人类中的同源蛋白。多肽表位筛选结果见表2。

表2多肽表位筛选结果

MHC I限制型	多肽序列	多肽位置
			H-2K<sup>d</sup>	IYFQLHRALKMI	369-380
H-2K<sup>b</sup>	TVYCNVHKHEPL	207-218
			HLA-A2	FQLHRALKMIVDPV	370-383

2、分别化学合成以上多肽(上海吉尔生化有限公司)，将合成的多肽等比例混合，用细胞级DMSO(Sigma-Aldrich公司，目录号D2650)复溶为20mg/mL浓度，分别取1mg多肽溶液与1mg实施例2中制备的重组rgp96(制成冻干粉针剂)，用pH7.4 0.01mol/L PBS缓冲液溶解至总体积4mL。55℃热击10分钟，在室温冷却30分钟。然后采用50kD超滤管洗去未结合的多肽，分别制备获得gp96-多肽复合物，用于实施例5-8。

实施例5多肽-gp96复合物对乳腺癌的预防与治疗作用

一、多肽-gp96复合物对原发性乳腺癌的预防作用

取8周龄C57BL/6小鼠20只分成两组，每组10只，分别进行如下处理：

第一组：腹部皮下注射实施实例4制备的多肽-gp96复合物，免疫三次(每次0.2ml)，单次免疫剂量为20μg/只；

第二组：腹部皮下注射实施实例2制备的rgp96，免疫三次(每次0.2ml)，单次免疫剂量为20μg/只；

以上两组中：实验第1天进行第一次免疫；第8天进行第二次免疫；第22天进行第三次免疫。

免疫完成后1周开始每只小鼠按50mg/kg剂量口服灌胃食用橄榄油配制的DMBA(Sigma-Aldrich公司，目录号D3254)溶液，每周1次，连续5周，诱导乳腺癌发病。

自有小鼠产生乳腺癌肿瘤开始(约造模后14周左右)每周检测肿瘤生长，并统计肿瘤发生率与计算肿瘤体积。肿瘤体积计算公式V＝ab²/2(V—体积,a—肿瘤长径,b—肿瘤短径)。一直观察到34周，计算肿瘤发生率、肿瘤个数与平均肿瘤大小。统计结果见表3。

表3 DMBA诱导的小鼠乳腺癌肿瘤统计结果

二、多肽-gp96复合物对诱导乳腺癌模型的治疗作用

取20只6-8周的雌性Balb/c小鼠，每只皮下分别接种6×10⁵TUBO细胞，第2天将小鼠分成两组，每组10只，分别进行如下处理：

第二组：腹部皮下注射实施实例2制备的gp96，免疫三次(每次0.2ml)，单次免疫剂量为20μg/只；

以上两组中：接种肿瘤细胞后第2天进行第一次免疫；第5天进行第二次免疫；第8天进行第三次免疫。从第一天免疫开始，每天观察肿瘤生长情况，记录肿瘤大小，按以下公式计算肿瘤体积：V＝ab²/2(V—体积,a—肿瘤长径,b—肿瘤短径)。肿瘤体积变化见图4。

实施例6多肽-gp96复合物对肝癌的预防与治疗作用

一、多肽-gp96复合物对原发性肝癌的预防作用

取20只6周龄雌性C57BL/6小鼠，平均分为两组，每组10只，分别进行如下处理：

第一组：腹部皮下注射实例4制备的多肽-gp96复合物，免疫三次(每次0.2ml)，单次免疫剂量为20μg/只；

最后一次免疫结束后1周，将两组小鼠每日饮水换为含30μg/mL DEN(Sigma-Aldrich公司，目录号73861)的无菌蒸馏水，连续饲养40周，至第40周时处死小鼠，取出肝脏进行比较分析比较。结果见表4。

表4 DEN诱导的小鼠肝癌统计结果

二、多肽-gp96复合物对诱导肝癌模型的治疗作用

将液氮冻存的小鼠肝癌H22细胞于37℃水浴锅中快速解冻，细胞密度调至1×10⁷/mL，腹腔接种2只BALB/c小鼠，每只0.2mL。待小鼠腹部胀大后，将小鼠颈椎脱臼处死，消毒腹部，抽取腹水合并，用PBS调整细胞密度至1×10⁷/mL，皮下接种20只BALB/c小鼠，每只0.2mL。12天后将小鼠分成两组，每组10只，分别进行如下处理：

以上两组中：接种肿瘤细胞后第12天进行第一次免疫；第15天进行第二次免疫；第18天进行第三次免疫。从第一天免疫开始，每天观察肿瘤生长情况，记录肿瘤大小，按以下公式计算肿瘤体积：V＝ab²/2(V—体积,a—肿瘤长径,b—肿瘤短径)。肿瘤体积变化见图5。

实施例7多肽-gp96复合物诱导的特异性CTL对于人乳腺癌细胞杀伤效应

一、人源多肽特异性效应细胞的制备

1、使用人淋巴细胞分离液(Cellgro,25-072-CI)分离HLA-A2阳性志愿者的抗凝新鲜全血，获得外周血单个核细胞(PBMC)，用含10％胎牛血清(Gibco，10099-141-FBS)的RPMI-1640完全培养基(Gibco，12633012)调整细胞浓度为1.0X10⁶/ml，接种于24孔板，每孔1ml。

2、次日每组分别加入多肽-gp96复合物至终浓度为10μg/ml。

3、第三天每孔加入IL-2(PeproTech公司，目录号212-12)至终浓度为50U/ml，每2-3天半量换液并补充IL-2至终浓度为50U/ml。

4、分别于第七天、第十四天进行第二轮、第三轮多肽-gp96复合物刺激，次日加入IL-2至终浓度为50U/ml。

5、第三轮刺激后3天，得到效应细胞CTL。

二、靶细胞

人乳腺癌细胞系MCF-7(HLA-A2表达阳性)，多肽孵育的T2细胞(HLA-A2表达阳性)、T2细胞。

三、乳腺癌细胞特异性杀伤效应的检测

使用

非放射性细胞毒性检测(Promega，目录号G1780)进行细胞毒活性检测，主要步骤如下(详见试剂盒使用说明书)：

1、以MCF-7细胞、多肽孵育的T2细胞、Τ2细胞作为靶细胞，接种靶细胞数目为5×10³/孔，按照效靶比10:1的比例加入上述效应细胞，效应细胞以50μ1/孔接种于96孔培养板中，终体积100μ1；

此外另设效应细胞自发LDH释放组，用来校准效应细胞自发释放出来的LDH(各组效应细胞以50μ1/孔加入96孔板，补充50μ1含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基至终体积100μ1)。靶细胞自发LDH释放组，用来校正靶细胞自发释放出来的LDH(各组靶细胞以50μ1/孔加入96孔板，补充50μ1含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基至终浓度100μ1)。靶细胞最大LDH释放组,用来计算时作为确定100％的LDH释放的参照(细胞上样同靶细胞自发释放组；)。体积校正对照组，用来校正由于加入裂解液引起的体积变化(加入含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基100μ1)。培养基背景对照组，用来校正由培养基中血清产生的LDH活性以及酚红造成的背景吸收(加入含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基100μ1)。

2、细胞接种后，使用250g离心4min，接着于37℃培养箱中孵育4h；在收获上清前45min，向靶细胞最大LDH释放组中加入裂解液(10×)，10μ1/孔；接着使用250g离心4min，收获上清；

3、转移50μ1上清至酶标板中，用检测缓冲液配制底物，将配好的底物50μ1/孔加到酶标板中，盖好平板，室温避光反应30min，向每空加入50μ1终止液，1h内于酶标仪检测490nm吸光值OD。

4、计算细胞杀伤率

杀伤率(％)＝[(实验组OD值-效应细胞自发释放组OD值-靶细胞自发释放组OD值)/(靶细胞最大释放组OD值-靶细胞自发释放组OD值)]×100％

细胞杀伤结果见图6。

实施例8多肽-gp96复合物诱导的特异性CTL对于人肝癌细胞杀伤效应

一、人源多肽特异性效应细胞的制备

多肽-gp96复合物诱导的特异性CTL制备方法同实施例7，用含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基调整至适当浓度，作为效应细胞。

二、靶细胞

人肝癌细胞HHCC(HLA-A2表达阳性)，多肽孵育的T2细胞(HLA-A2表达阳性)、T2细胞

三、肝癌细胞特异性杀伤效应的检测

检测方法同实施例7，将靶细胞换为人肝癌细胞HHCC，实验组按效靶比10:1的比例加入效应细胞与靶细胞，同时设立效应细胞自发释放组、靶细胞自发释放组、靶细胞最大释放组、背景对照组、体积校正对照组。37℃条件下孵育4h后加入细胞裂解液，收获上清做LDH检测。细胞杀伤结果见图7。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京热休生物技术有限公司

<120> 蛋白TIF1-β及其多肽在制备治疗与预防癌症的药物中的应用

<130> KHP171110219.3

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2505

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

atggcggcct ccgcggcggc agcctcggca gcagcggcct cggccgcctc tggcagcccg 60

ggcccgggcg agggctccgc tggcggcgaa aagcgctcca ccgccccttc ggccgcagcc 120

tcggcctctg cctcagccgc ggcgtcgtcg cccgcggggg gcggcgccga ggcgctggag 180

ctgctggagc actgcggcgt gtgcagagag cgcctgcgac ccgagaggga gccccgcctg 240

ctgccctgtt tgcactcggc ctgtagtgcc tgcttagggc ccgcggcccc cgccgccgcc 300

aacagctcgg gggacggcgg ggcggcgggc gacggcaccg tggtggactg tcccgtgtgc 360

aagcaacagt gcttctccaa agacatcgtg gagaattatt tcatgcgtga tagtggcagc 420

aaggctgcca ccgacgccca ggatgcgaac cagtgctgca ctagctgtga ggataatgcc 480

ccagccacca gctactgtgt ggagtgctcg gagcctctgt gtgagacctg tgtagaggcg 540

caccagcggg tgaagtacac caaggaccat actgtgcgct ctactgggcc agccaagtct 600

cgggatggtg aacgtactgt ctattgcaac gtacacaagc atgaacccct tgtgctgttt 660

tgtgagagct gtgatactct cacctgccga gactgccagc tcaatgccca caaggaccac 720

cagtaccagt tcttagagga tgcagtgagg aaccagcgca agctcctggc ctcactggtg 780

aagcgccttg gggacaaaca tgcaacattg cagaagagca ccaaggaggt tcgcagctca 840

atccgccagg tgtctgacgt acagaagcgt gtgcaagtgg atgtcaagat ggccatcctg 900

cagatcatga aggagctgaa taagcggggc cgtgtgctgg tcaatgatgc ccagaaggtg 960

actgaggggc agcaggagcg cctggagcgg cagcactgga ccatgaccaa gatccagaag 1020

caccaggagc acattctgcg ctttgcctct tgggctctgg agagtgacaa caacacagcc 1080

cttttgcttt ctaagaagtt gatctacttc cagctgcacc gggccctcaa gatgattgtg 1140

gatcccgtgg agccacatgg cgagatgaag tttcagtggg acctcaatgc ctggaccaag 1200

agtgccgagg cctttggcaa gattgtggca gagcgtcctg gcactaactc aacaggccct 1260

gcacccatgg cccctccaag agccccaggg cccctgagca agcagggctc tggcagcagc 1320

cagcccatgg aggtgcagga aggctatggc tttgggtcag gagatgatcc ctactcaagt 1380

gcagagcccc atgtgtcagg tgtgaaacgg tcccgctcag gtgagggcga ggtgagcggc 1440

cttatgcgca aggtgccacg agtgagcctt gaacgcctgg acctggacct cacagctgac 1500

agccagccac ccgtcttcaa ggtcttccca ggcagtacca ctgaggacta caaccttatt 1560

gttattgaac gtggcgctgc cgctgcagct accggccagc cagggactgc gcctgcagga 1620

acccctggtg ccccacccct ggctggcatg gccattgtca aggaggagga gacggaggct 1680

gccattggag cccctcctac tgccactgag ggccctgaga ccaaacctgt gcttatggct 1740

cttgcggagg gtcctggtgc tgagggtccc cgcctggcct cacctagtgg cagcaccagc 1800

tcagggctgg aggtggtggc tcctgagggt acctcagccc caggtggtgg cccgggaacc 1860

ctggatgaca gtgccaccat ttgccgtgtc tgccagaagc caggcgatct ggttatgtgc 1920

aaccagtgtg agttttgttt ccacctggac tgtcacctgc cggccctgca ggatgtacca 1980

ggggaggagt ggagctgctc actctgccat gtgctccctg acctgaagga ggaggatggc 2040

agcctcagcc tggatggtgc agacagcact ggcgtggtgg ccaagctctc accagccaac 2100

cagcggaaat gtgagcgtgt actgctggcc ctattctgtc acgaaccctg ccgccccctg 2160

catcagctgg ctaccgactc caccttctcc ctggaccagc ccggtggcac cctggatctg 2220

accctgatcc gtgcccgcct ccaggagaag ttgtcacctc cctacagctc cccacaggag 2280

tttgcccagg atgtgggccg catgttcaag caattcaaca agttaactga ggacaaggca 2340

gacgtgcagt ccatcatcgg cctgcagcgc ttcttcgaga cgcgcatgaa cgaggccttc 2400

ggtgacacca agttctctgc tgtgctggtg gagcccccgc cgatgagcct gcctggtgct 2460

ggcctgagtt cccaggagct gtctggtggc cctggtgatg gcccc 2505

<210> 2

<211> 835

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ala

1 5 10 15

Ser Gly Ser Pro Gly Pro Gly Glu Gly Ser Ala Gly Gly Glu Lys Arg

20 25 30

Ser Thr Ala Pro Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala

35 40 45

Ser Ser Pro Ala Gly Gly Gly Ala Glu Ala Leu Glu Leu Leu Glu His

50 55 60

Cys Gly Val Cys Arg Glu Arg Leu Arg Pro Glu Arg Glu Pro Arg Leu

65 70 75 80

Leu Pro Cys Leu His Ser Ala Cys Ser Ala Cys Leu Gly Pro Ala Ala

85 90 95

Pro Ala Ala Ala Asn Ser Ser Gly Asp Gly Gly Ala Ala Gly Asp Gly

100 105 110

Thr Val Val Asp Cys Pro Val Cys Lys Gln Gln Cys Phe Ser Lys Asp

115 120 125

Ile Val Glu Asn Tyr Phe Met Arg Asp Ser Gly Ser Lys Ala Ala Thr

130 135 140

Asp Ala Gln Asp Ala Asn Gln Cys Cys Thr Ser Cys Glu Asp Asn Ala

145 150 155 160

Pro Ala Thr Ser Tyr Cys Val Glu Cys Ser Glu Pro Leu Cys Glu Thr

165 170 175

Cys Val Glu Ala His Gln Arg Val Lys Tyr Thr Lys Asp His Thr Val

180 185 190

Arg Ser Thr Gly Pro Ala Lys Ser Arg Asp Gly Glu Arg Thr Val Tyr

195 200 205

Cys Asn Val His Lys His Glu Pro Leu Val Leu Phe Cys Glu Ser Cys

210 215 220

Asp Thr Leu Thr Cys Arg Asp Cys Gln Leu Asn Ala His Lys Asp His

225 230 235 240

Gln Tyr Gln Phe Leu Glu Asp Ala Val Arg Asn Gln Arg Lys Leu Leu

245 250 255

Ala Ser Leu Val Lys Arg Leu Gly Asp Lys His Ala Thr Leu Gln Lys

260 265 270

Ser Thr Lys Glu Val Arg Ser Ser Ile Arg Gln Val Ser Asp Val Gln

275 280 285

Lys Arg Val Gln Val Asp Val Lys Met Ala Ile Leu Gln Ile Met Lys

290 295 300

Glu Leu Asn Lys Arg Gly Arg Val Leu Val Asn Asp Ala Gln Lys Val

305 310 315 320

Thr Glu Gly Gln Gln Glu Arg Leu Glu Arg Gln His Trp Thr Met Thr

325 330 335

Lys Ile Gln Lys His Gln Glu His Ile Leu Arg Phe Ala Ser Trp Ala

340 345 350

Leu Glu Ser Asp Asn Asn Thr Ala Leu Leu Leu Ser Lys Lys Leu Ile

355 360 365

Tyr Phe Gln Leu His Arg Ala Leu Lys Met Ile Val Asp Pro Val Glu

370 375 380

Pro His Gly Glu Met Lys Phe Gln Trp Asp Leu Asn Ala Trp Thr Lys

385 390 395 400

Ser Ala Glu Ala Phe Gly Lys Ile Val Ala Glu Arg Pro Gly Thr Asn

405 410 415

Ser Thr Gly Pro Ala Pro Met Ala Pro Pro Arg Ala Pro Gly Pro Leu

420 425 430

Ser Lys Gln Gly Ser Gly Ser Ser Gln Pro Met Glu Val Gln Glu Gly

435 440 445

Tyr Gly Phe Gly Ser Gly Asp Asp Pro Tyr Ser Ser Ala Glu Pro His

450 455 460

Val Ser Gly Val Lys Arg Ser Arg Ser Gly Glu Gly Glu Val Ser Gly

465 470 475 480

Leu Met Arg Lys Val Pro Arg Val Ser Leu Glu Arg Leu Asp Leu Asp

485 490 495

Leu Thr Ala Asp Ser Gln Pro Pro Val Phe Lys Val Phe Pro Gly Ser

500 505 510

Thr Thr Glu Asp Tyr Asn Leu Ile Val Ile Glu Arg Gly Ala Ala Ala

515 520 525

Ala Ala Thr Gly Gln Pro Gly Thr Ala Pro Ala Gly Thr Pro Gly Ala

530 535 540

Pro Pro Leu Ala Gly Met Ala Ile Val Lys Glu Glu Glu Thr Glu Ala

545 550 555 560

Ala Ile Gly Ala Pro Pro Thr Ala Thr Glu Gly Pro Glu Thr Lys Pro

565 570 575

Val Leu Met Ala Leu Ala Glu Gly Pro Gly Ala Glu Gly Pro Arg Leu

580 585 590

Ala Ser Pro Ser Gly Ser Thr Ser Ser Gly Leu Glu Val Val Ala Pro

595 600 605

Glu Gly Thr Ser Ala Pro Gly Gly Gly Pro Gly Thr Leu Asp Asp Ser

610 615 620

Ala Thr Ile Cys Arg Val Cys Gln Lys Pro Gly Asp Leu Val Met Cys

625 630 635 640

Asn Gln Cys Glu Phe Cys Phe His Leu Asp Cys His Leu Pro Ala Leu

645 650 655

Gln Asp Val Pro Gly Glu Glu Trp Ser Cys Ser Leu Cys His Val Leu

660 665 670

Pro Asp Leu Lys Glu Glu Asp Gly Ser Leu Ser Leu Asp Gly Ala Asp

675 680 685

Ser Thr Gly Val Val Ala Lys Leu Ser Pro Ala Asn Gln Arg Lys Cys

690 695 700

Glu Arg Val Leu Leu Ala Leu Phe Cys His Glu Pro Cys Arg Pro Leu

705 710 715 720

His Gln Leu Ala Thr Asp Ser Thr Phe Ser Leu Asp Gln Pro Gly Gly

725 730 735

Thr Leu Asp Leu Thr Leu Ile Arg Ala Arg Leu Gln Glu Lys Leu Ser

740 745 750

Pro Pro Tyr Ser Ser Pro Gln Glu Phe Ala Gln Asp Val Gly Arg Met

755 760 765

Phe Lys Gln Phe Asn Lys Leu Thr Glu Asp Lys Ala Asp Val Gln Ser

770 775 780

Ile Ile Gly Leu Gln Arg Phe Phe Glu Thr Arg Met Asn Glu Ala Phe

785 790 795 800

Gly Asp Thr Lys Phe Ser Ala Val Leu Val Glu Pro Pro Pro Met Ser

805 810 815

Leu Pro Gly Ala Gly Leu Ser Ser Gln Glu Leu Ser Gly Gly Pro Gly

820 825 830

Asp Gly Pro

835

<210> 3

<211> 2409

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 3

atgagggccc tgtgggtgct gggcctctgc tgcgtcctgc tgaccttcgg gtcggtcaga 60

gctgacgatg aagttgatgt ggatggtaca gtagaagagg atctgggtaa aagtagagaa 120

ggatcaagga cggatgatga agtagtacag agagaggaag aagctattca gttggatgga 180

ttaaatgcat cacaaataag agaacttaga gagaagtcgg aaaagtttgc cttccaagcc 240

gaagttaaca gaatgatgaa acttatcatc aattcattgt ataaaaataa agagattttc 300

ctgagagaac tgatttcaaa tgcttctgat gctttagata agataaggct aatatcactg 360

actgatgaaa atgctctttc tggaaatgag gaactaacag tcaaaattaa gtgtgataag 420

gagaagaacc tgctgcatgt cacagacacc ggtgtaggaa tgaccagaga agagttggtt 480

aaaaaccttg gtaccatagc caaatctggg acaagcgagt ttttaaacaa aatgactgaa 540

gcacaggaag atggccagtc aacttctgaa ttgattggcc agtttggtgt cggtttctat 600

tccgccttcc ttgtagcaga taaggttatt gtcacttcaa aacacaacaa cgatacccag 660

cacatctggg agtctgactc caatgaattt tctgtaattg ctgacccaag aggaaacact 720

ctaggacggg gaacgacaat tacccttgtc ttaaaagaag aagcatctga ttaccttgaa 780

ttggatacaa ttaaaaatct cgtcaaaaaa tattcacagt tcataaactt tcctatttat 840

gtatggagca gcaagactga aactgttgag gagcccatgg aggaagaaga agcagccaaa 900

gaagagaaag aagaatctga tgatgaagct gcagtagagg aagaagaaga agaaaagaaa 960

ccaaagacta aaaaagttga aaaaactgtc tgggactggg aacttatgaa tgatatcaaa 1020

ccaatatggc agagaccatc aaaagaagta gaagaagatg aatacaaagc tttctacaaa 1080

tcattttcaa aggaaagtga tgaccccatg gcttatattc actttactgc tgaaggggaa 1140

gttaccttca aatcaatttt atttgtaccc acatctgctc cacgtggtct gtttgacgaa 1200

tatggatcta aaaagagcga ttacattaag ctctatgtgc gccgtgtatt catcacagac 1260

gacttccatg atatgatgcc taaatacctc aattttgtca agggtgtggt ggactcagat 1320

gatctcccct tgaatgtttc ccgcgagact cttcagcaac ataaactgct taaggtgatt 1380

aggaagaagc ttgttcgtaa aacgctggac atgatcaaga agattgctga tgataaatac 1440

aatgatactt tttggaaaga atttggtacc aacatcaagc ttggtgtgat tgaagaccac 1500

tcgaatcgaa cacgtcttgc taaacttctt aggttccagt cttctcatca tccaactgac 1560

attactagcc tagaccagta tgtggaaaga atgaaggaaa aacaagacaa aatctacttc 1620

atggctgggt ccagcagaaa agaggctgaa tcttctccat ttgttgagcg acttctgaaa 1680

aagggctatg aagttattta cctcacagaa cctgtggatg aatactgtat tcaggccctt 1740

cccgaatttg atgggaagag gttccagaat gttgccaagg aaggagtgaa gttcgatgaa 1800

agtgagaaaa ctaaggagag tcgtgaagca gttgagaaag aatttgagcc tctgctgaat 1860

tggatgaaag ataaagccct taaggacaag attgaaaagg ctgtggtgtc tcagcgcctg 1920

acagaatctc cgtgtgcttt ggtggccagc cagtacggat ggtctggcaa catggagaga 1980

atcatgaaag cacaagcgta ccaaacgggc aaggacatct ctacaaatta ctatgcgagt 2040

cagaagaaaa catttgaaat taatcccaga cacccgctga tcagagacat gcttcgacga 2100

attaaggaag atgaagatga taaaacagtt ttggatcttg ctgtggtttt gtttgaaaca 2160

gcaacgcttc ggtcagggta tcttttacca gacactaaag catatggaga tagaatagaa 2220

agaatgcttc gcctcagttt gaacattgac cctgatgcaa aggtggaaga agagcccgaa 2280

gaagaacctg aagagacagc agaagacaca acagaagaca cagagcaaga cgaagatgaa 2340

gaaatggatg tgggaacaga tgaagaagaa gaaacagcaa aggaatctac agctgaaaaa 2400

gatgaattg 2409

<210> 4

<211> 803

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 4

Met Arg Ala Leu Trp Val Leu Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Thr Phe

1 5 10 15

Gly Ser Val Arg Ala Asp Asp Glu Val Asp Val Asp Gly Thr Val Glu

20 25 30

Glu Asp Leu Gly Lys Ser Arg Glu Gly Ser Arg Thr Asp Asp Glu Val

35 40 45

Val Gln Arg Glu Glu Glu Ala Ile Gln Leu Asp Gly Leu Asn Ala Ser

50 55 60

Gln Ile Arg Glu Leu Arg Glu Lys Ser Glu Lys Phe Ala Phe Gln Ala

65 70 75 80

Glu Val Asn Arg Met Met Lys Leu Ile Ile Asn Ser Leu Tyr Lys Asn

85 90 95

Lys Glu Ile Phe Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu

100 105 110

Asp Lys Ile Arg Leu Ile Ser Leu Thr Asp Glu Asn Ala Leu Ser Gly

115 120 125

Asn Glu Glu Leu Thr Val Lys Ile Lys Cys Asp Lys Glu Lys Asn Leu

130 135 140

Leu His Val Thr Asp Thr Gly Val Gly Met Thr Arg Glu Glu Leu Val

145 150 155 160

Lys Asn Leu Gly Thr Ile Ala Lys Ser Gly Thr Ser Glu Phe Leu Asn

165 170 175

Lys Met Thr Glu Ala Gln Glu Asp Gly Gln Ser Thr Ser Glu Leu Ile

180 185 190

Gly Gln Phe Gly Val Gly Phe Tyr Ser Ala Phe Leu Val Ala Asp Lys

195 200 205

Val Ile Val Thr Ser Lys His Asn Asn Asp Thr Gln His Ile Trp Glu

210 215 220

Ser Asp Ser Asn Glu Phe Ser Val Ile Ala Asp Pro Arg Gly Asn Thr

225 230 235 240

Leu Gly Arg Gly Thr Thr Ile Thr Leu Val Leu Lys Glu Glu Ala Ser

245 250 255

Asp Tyr Leu Glu Leu Asp Thr Ile Lys Asn Leu Val Lys Lys Tyr Ser

260 265 270

Gln Phe Ile Asn Phe Pro Ile Tyr Val Trp Ser Ser Lys Thr Glu Thr

275 280 285

Val Glu Glu Pro Met Glu Glu Glu Glu Ala Ala Lys Glu Glu Lys Glu

290 295 300

Glu Ser Asp Asp Glu Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys

305 310 315 320

Pro Lys Thr Lys Lys Val Glu Lys Thr Val Trp Asp Trp Glu Leu Met

325 330 335

Asn Asp Ile Lys Pro Ile Trp Gln Arg Pro Ser Lys Glu Val Glu Glu

340 345 350

Asp Glu Tyr Lys Ala Phe Tyr Lys Ser Phe Ser Lys Glu Ser Asp Asp

355 360 365

Pro Met Ala Tyr Ile His Phe Thr Ala Glu Gly Glu Val Thr Phe Lys

370 375 380

Ser Ile Leu Phe Val Pro Thr Ser Ala Pro Arg Gly Leu Phe Asp Glu

385 390 395 400

Tyr Gly Ser Lys Lys Ser Asp Tyr Ile Lys Leu Tyr Val Arg Arg Val

405 410 415

Phe Ile Thr Asp Asp Phe His Asp Met Met Pro Lys Tyr Leu Asn Phe

420 425 430

Val Lys Gly Val Val Asp Ser Asp Asp Leu Pro Leu Asn Val Ser Arg

435 440 445

Glu Thr Leu Gln Gln His Lys Leu Leu Lys Val Ile Arg Lys Lys Leu

450 455 460

Val Arg Lys Thr Leu Asp Met Ile Lys Lys Ile Ala Asp Asp Lys Tyr

465 470 475 480

Asn Asp Thr Phe Trp Lys Glu Phe Gly Thr Asn Ile Lys Leu Gly Val

485 490 495

Ile Glu Asp His Ser Asn Arg Thr Arg Leu Ala Lys Leu Leu Arg Phe

500 505 510

Gln Ser Ser His His Pro Thr Asp Ile Thr Ser Leu Asp Gln Tyr Val

515 520 525

Glu Arg Met Lys Glu Lys Gln Asp Lys Ile Tyr Phe Met Ala Gly Ser

530 535 540

Ser Arg Lys Glu Ala Glu Ser Ser Pro Phe Val Glu Arg Leu Leu Lys

545 550 555 560

Lys Gly Tyr Glu Val Ile Tyr Leu Thr Glu Pro Val Asp Glu Tyr Cys

565 570 575

Ile Gln Ala Leu Pro Glu Phe Asp Gly Lys Arg Phe Gln Asn Val Ala

580 585 590

Lys Glu Gly Val Lys Phe Asp Glu Ser Glu Lys Thr Lys Glu Ser Arg

595 600 605

Glu Ala Val Glu Lys Glu Phe Glu Pro Leu Leu Asn Trp Met Lys Asp

610 615 620

Lys Ala Leu Lys Asp Lys Ile Glu Lys Ala Val Val Ser Gln Arg Leu

625 630 635 640

Thr Glu Ser Pro Cys Ala Leu Val Ala Ser Gln Tyr Gly Trp Ser Gly

645 650 655

Asn Met Glu Arg Ile Met Lys Ala Gln Ala Tyr Gln Thr Gly Lys Asp

660 665 670

Ile Ser Thr Asn Tyr Tyr Ala Ser Gln Lys Lys Thr Phe Glu Ile Asn

675 680 685

Pro Arg His Pro Leu Ile Arg Asp Met Leu Arg Arg Ile Lys Glu Asp

690 695 700

Glu Asp Asp Lys Thr Val Leu Asp Leu Ala Val Val Leu Phe Glu Thr

705 710 715 720

Ala Thr Leu Arg Ser Gly Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Lys Ala Tyr Gly

725 730 735

Asp Arg Ile Glu Arg Met Leu Arg Leu Ser Leu Asn Ile Asp Pro Asp

740 745 750

Ala Lys Val Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Glu

755 760 765

Asp Thr Thr Glu Asp Thr Glu Gln Asp Glu Asp Glu Glu Met Asp Val

770 775 780

Gly Thr Asp Glu Glu Glu Glu Thr Ala Lys Glu Ser Thr Ala Glu Lys

785 790 795 800

Asp Glu Leu

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Ile Tyr Phe Gln Leu His Arg Ala Leu Lys Met Ile

1 5 10

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Thr Val Tyr Cys Asn Val His Lys His Glu Pro Leu

1 5 10

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Phe Gln Leu His Arg Ala Leu Lys Met Ile Val Asp Pro Val

1 5 10

Claims

1.蛋白TIF1-β的多肽与热休克蛋白gp96形成的复合物在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的应用；

所述蛋白TIF1-β的多肽的氨基酸序列为：IYFQLHRALKMI、TVYCNVHKHEPL和FQLHRALKMIVDPV；所述热休克蛋白gp96的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述复合物按如下方法制得：

化学合成SEQ ID NO:5-7所示的多肽，按等比例混合，用DMSO配制成浓度20mg/mL的多肽溶液，分别取1mg多肽溶液与1mg热休克蛋白gp96，用pH7.4 0.01mol/L PBS缓冲液溶解至总体积4mL，然后于55℃热击10分钟，在室温冷却30分钟，最后用50kD超滤管洗去未结合的多肽，即得gp96-多肽复合物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述癌症为乳腺癌或肝癌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，其功能为如下A1)或A2)：

A1)诱导产生乳腺癌特异性的CTL细胞并对乳腺癌细胞杀伤；

A2)诱导产生肝癌特异性的CTL细胞并对肝癌细胞杀伤。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌包括MCF-7乳腺癌细胞，所述肝癌包括HHCC肝癌细胞。