CN111471089A - 一种重组的非洲猪瘟病毒cd2v亚单位蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种重组的非洲猪瘟病毒cd2v亚单位蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组的非洲猪瘟病毒CD2V亚单位蛋白及其制备方法和应用，包括非洲猪瘟病毒表面囊膜蛋白的胞外区和胞内区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述制备方法如下：1)将密码子优化后的SEQ ID NO.1所示的基因序列克隆到真核表达载体中；2)再将含有非洲猪瘟病毒亚单位蛋白编码基因的重组表达载体转染至CHO细胞中；3)通过培养、筛选、驯化步骤2)中所述CHO细胞株，得到高度表达的细胞株；4)发酵培养3)中所述的细胞株，纯化后，得到非洲猪瘟病毒CD2V亚单位蛋白。5)将CD2V蛋白和药学上可以接受的佐剂混合得到亚单位疫苗。本发明能够提供一种可大规模工业化生产的非洲猪瘟表面CD2V亚单位蛋白且制备方法简单、成本低、制备的疫苗能够达到国家现有标准。

Description

一种重组的非洲猪瘟病毒CD2V亚单位蛋白及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域。涉及一种非洲猪瘟CD2V蛋白制备方法和应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的猪的急性、热性、高度接触性传染病，发病率及死亡率高达100％。猪感染非洲猪瘟病毒后出现皮肤充血，内脏器官出血，高热为特征临床症状，猪是ASFV自然感染的唯一哺乳动物宿主，包括家猪和野猪，尤其是家猪，易感性极高，对畜牧业影响巨大。世界动物卫生组织将其列为A类疫病，我国也将其列为一类动物传染病。
非洲猪瘟自1927年在非洲大陆发现以来，对非洲和欧洲的养猪业造成极大打击。2018年8月份以来，在我国多个省份爆发，给我国养猪业带来了严重的经济损失。虽然，国内外学者对非洲猪瘟做了大量的研究工作，但研究发现：常规制备的非洲猪瘟灭活苗效果不明显，而弱毒苗保护效果也不好，且安全性差，易造成散毒。目前，世界上尚未有有效预防非洲猪瘟的疫苗和治疗该病的药物发现，迫切需要新型疫苗的研发和生产来预防非洲猪瘟。
ASFV病毒是具有囊膜的虫媒DNA病毒。病毒颗粒呈二十面体对称结构，平均直径200nm，表面有含糖脂类的囊膜覆盖。其病毒基因组为双股线性DNA，大小为170-190kb，整个基因组大约有150个ORF，编码150-200中蛋白质。CD2V蛋白由EP402R基因编码，有一段信号肽和跨膜区域。胞外区的氨基酸残基与宿主的CD2蛋白相似，包含2个免疫球蛋白样结构域，能吸附红细胞在病毒扩散及损伤淋巴细胞的过程中起着重要的作用。研究发现，CD2V是病毒囊膜表面蛋白，针对CD2V的抗体可以很好的阻止病毒的吸附。因此，CD2V是一个很好的保护性抗原。在Ruiz-Gonzalvo,F.,Rodriguez,F.and Escribano,J.M.,Virology 218,285-289(1996),报道用杆状病毒系统表达CD2V胞外区，并且只有western的结果，没有SDS-PAGE，表达量很低。但未见其大量表达，说明CD2V胞外区的稳定性较差，因此，很难在实际生产中应用。在当前没有可能大规模制备灭活疫苗或弱毒疫苗的情况下，确定一种制备该病毒的免疫原性蛋白的方法，以便研究一种能够预防该疾病的疫苗或具有能够预防该疾病的亚单位蛋白具有重大的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题：一是提供一种可大规模工业化生产的重组的非洲猪瘟表面CD2V亚单位蛋白及其制备方法和应用；
为了解决该问题，本发明人在充分分析、研究目前所能得到的非洲猪瘟病毒的资料的基础上，并通过结构分析CD2V蛋白的整体结构，创造性的提出CD2V蛋白跨膜区的存在，影响了规模化生产，为了一种得到具有良好免疫原性且稳定的CD2V亚单位重组蛋白，将CD2V蛋白的跨膜区除去，得到重组的非洲猪瘟病毒CD2V亚单位蛋白，所述重组的非洲猪瘟病毒CD2V亚单位蛋白包括非洲猪瘟病毒表面囊膜蛋白的胞外区和胞内区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
为了能够产业化生产该亚单位蛋白，本发明人在充分分析、研究该亚单位蛋白的原始基因编码序列的基础上，提出了密码子优化后的能够在CHO细胞中高效分泌表达该亚单位蛋白的基因序列，所述密码子优化后的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本发明的技术方案，优选地，所述非洲猪瘟病毒亚单位蛋白包括在SEQ IDNO.3中的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有免疫原性的衍生的蛋白质。
根据本发明的技术方案，优选地，所述非洲猪瘟亚单位蛋白的表达系统包括但不限于哺乳动物细胞以及昆虫细胞。
根据本发明的技术方案，优选地，所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
根据本发明提供了一种制备非洲猪瘟CD2V蛋白的方法，所述制备方法包括以下步骤：1)将密码子优化后的非洲猪瘟病毒CD2V蛋白如SEQ ID NO.1所示的编码基因序列克隆到真核表达载体中，得到含有非洲猪瘟CD2V蛋白编码基因的重组质粒；2)再将含有洲猪瘟CD2V蛋白编码基因的重组质粒转染至CHO细胞中，得到CHO细胞株；3)通过培养、筛选、驯化步骤2)中所述CHO细胞株得到高度表达的细胞株；4)发酵培养步骤3)中所述高度表达的细胞株，纯化后得到重组非洲猪瘟CD2V蛋白。
本发明的技术方案中，优选地，所述密码子优化前的非洲猪瘟CD2V蛋白编码基因如SEQ ID NO.2所示。
本发明的技术方案中，优选地，所述真核表达载体可以为pEE6.4、pEE12.4、pGL4.13、pcDNA3.1。更优选地，所述真核表达载体为pEE12.4。
本发明的技术方案中，优选地，所述CHO细胞可以为DG44、DXB11、CHO-K1、CHO-S细胞株。更优选地，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。
为了使所述亚单位CD2V蛋白便于纯化，本领域的技术人员通过常规的技术手段，可在如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接如表1所示的标签，本实施例中具体以Poly-His为例，将其连接于如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的羧基末端处。
表1标签及其氨基酸序列
Figure BDA0001956923190000031
本发明构建并筛选了悬浮稳定高效分泌表达非洲猪瘟病毒CD2V蛋白的CHO细胞株，该细胞株表达CD2V蛋白产量高(产量高达0.5-0.8g/L)、易于纯化(如图4所示，只需一步亲和层析就能使目的蛋白纯度达到80％以上，远远满足亚单位疫苗和诊断试剂的需求)、易于大规模生产。因此，解决了非洲猪瘟亚单位疫苗存在的一个缺陷，即生产成本高的问题。另外，由于生产用的CHO细胞株在培养时可控制性高、质控容易、生产蛋白批次间稳定，生物安全高(没有病毒，不存在散毒的风险)。
附图说明
图1表示CD2V基因序列优化前后比对结果。
图2表示pEE12.4-OPTI-CD2V质粒图谱。
图3表示pEE12.4-OPTI-CD2V双酶切鉴定结果：M是DNA Marker：DL10000Marker；1是pEE12.4-OPTI-CD2V双酶切电泳结果。
图4表示重组CD2V的SDS-PAGE纯化检测结果：1是蛋白Marker，2是纯化后的CD2V蛋白。
图5表示CD2V蛋白纯化后Western-blot检测结果：1是蛋白Marker，2是CD2V蛋白。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
本发明实施例中所使用的菌株、质粒和试剂均为市售产品。
本发明试剂及药品的来源列单如下：
CHO-K1细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库中国科学院上海生命科学研究所细胞库；
细胞培养基和血清均购自美国gibco公司；
真核表达载体pEE12.4购自上海林渊生物科技有限公司；
Lipofectamine LTX购自美国Thermo Fisher公司；
甲硫氨酸亚砜亚铵((L-methioninesulfoximine，MSX))购于Sigma公司；
BCA蛋白质定量试剂盒购自美国Thermo Fisher公司。
实施例1CD2V蛋白表达及制备
1.1非洲猪瘟CD2V蛋白的选择
非洲猪瘟结构蛋白CD2V是由EP402R基因编码的一段多肽，预测分析在207Y-229L处有一个跨膜区，已有研究表明，CD2V蛋白能够与红细胞相互作用，在病毒的扩散和淋巴细胞损伤的过程中有很重要的作用。因此，利用CD2V蛋白作为抗原具有很好的防控非洲猪瘟的感染，目前还没有报道在真核表达系统中能大规模表达及纯化得到该蛋白，这也是本发明所要解决的一个重要的技术问题。
1.2非洲猪瘟CD2V蛋白密码子优化
本实验室以2018年在中国报道流行的非洲猪瘟毒株亚型，参考Georgia 2007/1全基因序列(GenBank：FR682468.1)为模板，发现基因组序列73369-74451bp编码非洲猪瘟CD2V蛋白序列。进一步分析1M-15S可能为CD2V蛋白的分泌信号肽，16Q-206Y可能为CD2V蛋白的胞外区，207Y-229L可能为CD2V蛋白的跨膜区，230C-360Y可能为CD2V蛋白的胞内区蛋白。
结合我们前期表达病毒囊膜蛋白研究的经验，我们选择CHO细胞表达CD2V蛋白的胞外区和胞内区作为我们的免疫原性蛋白，即1M-206Y和230C-360Y的氨基酸的氨基酸序列。我们通过蛋白结构预测和氨基酸本身结构的研究。1M-206Y的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示，编码该段氨基酸序列的基因序列如SEQ ID NO.5所示，该段氨基酸序列预测的三维结构与人的CD2蛋白类似。对编码非洲猪瘟CD2V蛋白的EP402R的核苷酸序列进行密码子优化，得到OPTI-CD2V序列，如SEQ ID NO.1所示，该序列合成工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。如图2所示，优化前后有28％的核苷酸序列不同。
实施例2：pEE12.4-OPTI-CD2V重组质粒构建
2.1PCR扩增目的片段OPTI-CD2V
2.1.1PCR反应
(1)引物设计及合成
上游引物:5’-cgAAGCTTGCCGCCACCATGATCATCCTG-3’
下游引物:5’-CGCGAATTCTTAATGGTGATGGTG-3’
(2)加样体系50μL，如下表所示：
Figure BDA0001956923190000051
PCR扩增程序：
Figure BDA0001956923190000052
2.1.2PCR产物进行胶回收
(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管；
(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值；
(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中；
(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μL PC buffer，50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；
(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm/min，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm/min，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中；
(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW buffer，静置3min，离心10,000rpm/min，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；
(8)重复步骤(7)；
(9)空吸附柱离心，12,000rpm/min，2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干；
(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL Elutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm/min，2min；
(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品；
(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。
2.2PCR产物及载体双酶切反应
(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表进行加样、混匀：50μL反应体系
Figure BDA0001956923190000061
(2)将步骤(1)中的1.5mL EP管置于相应酶最适温度恒温水浴锅中，水浴2-3h。
双酶切产物胶回收：取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段，方法同1.2.1中PCR产物胶回收。
2.3连接反应
(1)准备洁净的1.5mL EP管若干，做好标记，置于EP管架上待用。
(2)在1.5mL EP管按照下表进行加样、混匀。
Figure BDA0001956923190000071
(3)按照步骤(2)中表格完成加样后，将每个10μl反应体系置于16℃低温冷却液循环机中，水浴10-16h；
(4)取出步骤(3)中EP管，将其置于65℃水浴锅中，水浴15min；
(5)取出步骤(4)中的EP管，置于4℃保存。
2.4转化反应
(1)将10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min；
(2)取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min；
(3)取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μL液体LB培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养1h；
(4)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm/min，2min，去掉600μL上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。
(5)将转化步骤(4)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h；
(6)观察转化结果。
2.5质粒抽提与双酶切鉴定
2.5.1质粒抽提
(1)用10μL移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min摇菌过夜；
(2)将菌液移至1.5mL EP管中，室温离心，12,000rpm/min，2min，弃上清；
(3)向步骤(2)的EP管中加入250μL质粒提取试剂P1buffer，彻底悬浮菌体；
(4)向步骤(3)溶液中加入250μL P2buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min；
(5)向步骤(4)溶液中加入350μL P3buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀；室温静置2-4min；
(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm/min，10min；
(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；
(8)向吸附柱中心加入500μL Buffer DW1，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；
(9)向吸附柱中心加入500μL wash solution，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体，重复一次；
(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。
(11)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中心加入30μL Elutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min。保存管中DNA溶液。
2.5.2双酶切鉴定
(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，按照下表进行加样：20μL反应体系
Figure BDA0001956923190000081
(2)将步骤(1)中的EP管20μL反应体系置于37℃恒温水浴锅中，水浴2h。
(3)将步骤(2)中的双酶切体系样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查插入片段大小是否正确；实验结果见图2：酶切鉴定构建正确。
(4)选择插入片段正确的克隆送测序公司测序。将测序结果正确的质粒保存备用。
实施例3：pEE12.4-OPTI-CD2V重组质粒转染CHO-K1细胞与单克隆筛选的建立
3.1CHO-K1细胞转染
(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)、DMEM/F12与PBS置于37℃水浴锅预热至37℃。
(2)从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8mLPBS洗细胞一次，并弃去PBS。
(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2mL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。
(4)加入4mL DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。
(5)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。
(6)用DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)重新悬浮细胞，计数。
(7)稀释细胞至2×105个/mL，取2mL混匀的细胞加入到六孔板，六孔板放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育过夜。
(8)取出步骤(7)细胞培养皿，观察细胞状态：当细胞交汇度达到80％-90％时即可开始转染，转染前将培养基换成无抗生素无血清的DMEM/F12，2mL/孔。
(9)稀释质粒：用OPTI-MEM稀释质粒，125μL OPTI-MEM中加入2.5μg质粒，然后加入2.5μL plus，混匀，室温静置5min。
(10)稀释Lipofectamine LTX：125μL OPTI-MEM中加入9μL Lipofectamine LTX，然后加入2.5μL plus，轻轻混匀，室温静置5min。
(11)将步骤(10)和步骤(11)混合物轻轻混匀。室温放置5min，然后逐滴加入六孔板中均匀分布。
(12)将六孔板置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养4-6h。
(13)换液：弃掉上清培养基，加入2mL DMEM/F12(含10％血清1％双抗)，将六孔板置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
3.2加压筛选
转染后24h开始加压：从37℃培养箱中取出六孔板细胞，弃去上清培养基，加入2mLDMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)，加压7d，中间观察细胞，死细胞多换液。
3.3单克隆筛选
(1)加压筛选至阴性对照细胞基本死光时，约7days，开始单克隆筛选。
(2)取出六孔板，弃掉培养基，PBS洗一次，然后加入300μL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。
(3)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。
(4)用DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)重新悬浮细胞，计数。
(5)铺板：稀释细胞至5个/mL，取200μL混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育4-6h。
(6)记录单个细胞的孔。
(7)待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，加入100μL0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞液转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，dot-blot检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养、冻存。经筛选8F11和15E6细胞株表达较高。
实施例4：CHO-K1细胞株驯化成悬浮培养
(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)置于37℃水浴锅中预热至37℃。
(2)从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8mLPBS洗细胞一次，并弃去PBS。
(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2mL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。
(4)加入4mL DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)终止消化反应，并用移液枪将细胞吹散。
(5)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。
(6)用100％DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)悬浮细胞，计数。
(7)稀释细胞至5×105个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm/min孵育过夜。
(8)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。
(9)每隔24h计数细胞密度及活力。
(10)待第一代细胞培养一次后细胞存活率达到94-97％时进行第二代培养。
(11)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；100％DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)，EX-CELL 302置于CO2细胞培养箱中预热至37℃。
(12)从37℃培养箱中取出细胞转移至50mL离心管中，常温200g离心5min。
(13)将DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)和EX-CELL 302按1：1混合，重新悬浮细胞，计数。
(14)稀释细胞至5×105个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm/min孵育过夜。
(15)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。
(16)每隔24h计数细胞密度及活力。
(17)第二代培养两次后得到的细胞存活率大于95％；第三至六代培养三次后得到的细胞存活率大于95％。7周后，细胞接种3天后繁殖三代，密度达到1×106个细胞/mL，同时细胞存活率达到95％，该细胞被认为已经适应悬浮培养。接种密度降低到3×105个/mL。
(18)经驯化，8F11和15E6株都满足要求，这表明，8F11和15E6株都驯化成功。
实施例5：细胞摇瓶发酵
(1)传代培养基的配制：60％的CD-CHO+40％的Ex-cell 302置于37℃水浴锅中预热至37℃。
(2)从CO2恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。
(3)稀释实施例4得到的，8F11和15E6株细胞至2.5-3.5×105个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO2恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。
(4)每隔24h计数细胞密度及活力，测葡萄糖，当血糖低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1mL样品，上清用于检测蛋白表达情况。
(5)补料(约第四天)：补充70g/L CB5，添加基础培养基的10％。
(6)第5天开始，将CO2培养箱温度调整至32℃。
(7)第九天，补充70g/L CB5，添加基础培养基的10％。
(8)第十四天，收获细胞。
实施例6:稳定表达CD2V-Fc蛋白重组293T细胞系构建及驯化
按照实施例1-5的操作方法，本发明人也很容易的构建了表达重组CD2V蛋白的稳定细胞系，因此，可以预见常见的工程化的哺乳动物细胞系。很容易采用该方法构建重组表达CD2V的稳定细胞株，从而大规模生产该蛋白。因此，也在本发明保护范围内。
实施例7：蛋白纯化
收集实施例5的细胞培养液(每批均约100mL)，4℃，8,000g离心30min，取上清，过0.8μm滤膜，上样，预留80μL样品加入20μL的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测。
柱平衡：用超纯水平衡2～3CV(column volume柱体积)，排出乙醇保存液；然后用BufferA(20mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl)平衡2～3CV，4～7mL/min。
上样：若5mL预装柱一个，1mL/min进行上样(根据预装柱体积调节上样流速，保留时间5min)，收集Flow through(FT)，取80μL样品加入20μL的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测。
洗涤：用4％bufferB(20mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl，20mM imidazole)洗柱，流速为4mL/min，把未结合上柱的蛋白和结合能力较弱的杂蛋白冲洗干净，至OD280nm基线平稳为止。
洗脱：50％bufferB(20mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl，250mM imidazole)洗脱目的蛋白，至基线洗平，2mL/min,收集：10mL/管；收集样品混合后(Elutethrough-ET)取80μL样品加入20μL的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测。
洗涤：100％bufferB(20mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl，500mM imidazole)，4mL/min，不收集，冲洗2-3个柱体积，至UV基线洗平。超纯水平衡2～3CV。保存HisTrapexcel柱可用20％乙醇保存液平衡2～3CV。
透析换液：将含有目的蛋白的咪唑洗脱液倒入透析袋内，用1×PBS透析至少1,000倍，取80μl留样检测。
除菌过滤：在生物安全柜中，过0.22μm低蛋白结合针头滤器，或大量蛋白溶液过灭菌的0.22μm滤膜的Nalgene的滤器，过滤好的蛋白溶液样品存放于-80℃冰箱。
蛋白浓度测定：采用BCA法测定蛋白浓度，该批蛋白浓度分别为1mg/ml、1.6mg/ml，体积均约为50mL；经过计算(蛋白得率＝蛋白浓度*蛋白体积/所取发酵上清体积)，8F11和15E6株蛋白得率均约为0.5-0.8mg/L。
实施例8：CD2V蛋白的鉴定
8.1SDS-PAGE检测
将实施例6纯化后的蛋白进行SDS-PAGE检测，所用样品中CD2V蛋白浓度为2μg/孔，结果如图4所示：从图中可以计算出，纯化后的CD2V蛋白SDS-PAGE纯度为74％，分子量约为97kD。
8.2稳定性验证
将实施例6纯化后的蛋白用PBS稀释到0.4mg/ml，分成20份，每份0.5ml；十份置于4℃冰箱中，每周取样一份，连续取样10次；十份置于-20℃冰箱中，每周取样一份，连续取样10次；每次取样后用BCA检测蛋白浓度，结果如下表所示：
Figure BDA0001956923190000131
从蛋白浓度的变化来看，两组实验过程中蛋白基本保持稳定。
8.2ELISA检测
(1)包被：用包被液(50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.5)将纯化的CD2V蛋白稀释至0.5μg/ml，每种抗原均包被8孔(4孔加血清样品，4孔加封闭液作为对照)，每种抗原均加入100μl/孔，封口膜封好后4℃冰箱放置过夜；
(2)洗涤：从冰箱取出酶标板后，用PBST洗板5次；
(3)封闭：每孔加入200μl封闭液(5％脱脂奶)，封口膜封好后37℃孵育2h；
(4)血清稀释：将用CD2V蛋白免疫后的小鼠的阳性血清用封闭液稀释100倍(如495μl稀释液中加入5μl血清，混匀即可)；
(5)洗涤：同(2)；
(6)加样：加入稀释血清，同时用封闭液做阴性对照，37℃孵育1h；
(7)洗涤：同(2)；
(8)加二抗：每孔加入稀释(稀释比为1:5000)的HRP标记的兔抗鼠IgG二抗100μl，37℃孵育0.5h；
(9)洗涤：同(2)；
(10)显色：避光条件下每孔加入100μl的TMB显色液，37℃孵育10min；
(11)终止：每孔加入50μl终止液(2M H2SO4)，终止反应；
(12)检测：于450nm波长测定样品OD值，分析数据；
(13)结果如下表所示：包被CD2V蛋白的能与血清特异性结合，OD450均值为0.958；包被CD2V蛋白与封闭液均没有特异性结合，OD450均值为0.050。这说明，CD2V蛋白可以作为Elisa试剂盒的抗原，在摸索合适的包被浓度和血清稀释比后，可以开发一种检测非洲猪瘟感染和免疫的诊断试剂盒。
Figure BDA0001956923190000141
实施例9：重组CD2V蛋白安全性实验及免疫原性实验
9.1疫苗制备
水相准备：根据疫苗中CD2V蛋白含量，使用PBS(或生理盐水)将CD2V蛋白稀释适当浓度，即为水相；
油相准备：根据制备疫苗总量，按照抗原相和佐剂重量比为1:1，体积比为46:54，量取适量ISA 201VG佐剂；
乳化：将水相和油相都预热到33℃，将水相缓缓加到油相中，200-500rpm搅拌20-30min，于20℃静置1h置于4℃过夜；
分装、贮存：根据需要进行分装，检合格后于4℃保存备用。
9.2重组CD2V蛋白对小鼠的安全性实验
取健康16-20g SPF雌性小鼠(购于浙江中医药大学)20只，分别随机分4个组，每组5只，按照如下方法进行安全性实验。
单剂量一次免疫组：每组5只按肌肉注射接种100μL(25μg/只)，连续观察2周。
单剂量二次免疫组：每组5只按肌肉注射接种100μL(25μg/只)，连续观察2周。2周后以相同方法剂量再接种一次，继续观察2周。
超剂量一次免疫组：每组5只按肌肉注射接种100μL(200μg/只)，连续观察2周。
对照组：每组5只按肌肉注射接种100μL(PBS配制的疫苗)，连续观察2周。
实验期间，每天观察动物的精神，采食、活动、饮水、注射部位炎症变化和排泄情况等临床变化，记录动物的异常情况。
经过连续观察，对注射CD2V蛋白的小鼠的临床症状进行比较，单剂量，二次免疫剂量，超剂量免疫组和对照组，均饮食正常，精神无不良变化，排泄正常，注射部位未发现发炎现象，无死亡小鼠出现，接种动物没有遇到任何不良反应。说明，本发明制备的疫苗蛋白即使是以高剂量注射免疫(200μg)，也无明显副作用，是一种安全的免疫蛋白。
9.3免疫原性实验将实施例6纯化后的蛋白进行Werstern Blot检测，所用样品中CD2V蛋白(图中标记为1)浓度为2μg/孔；所用一抗来源于CD2V免疫后的鼠的血清，稀释比例为1:500；二抗为HRP标记的兔抗鼠IgG二抗，稀释比为1:3000。结果如图5所示：该血清能与CD2V蛋白特异性结合。
本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。
Figure BDA0001956923190000171
Figure BDA0001956923190000181
序列表
<110> 浙江海隆生物科技有限公司
<120> 一种重组的非洲猪瘟病毒CD2V亚单位蛋白及其制备方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 4
<211> 1014
<212> DNA
<213> 密码子优化后的CD2V蛋白核苷酸序列()
<400> 4
<210> 4
<211> 1014
<212> DNA
<213> 密码子优化前的CD2V蛋白核苷酸序列()
<400> 4
<210> 4
<211> 337
<212> PRT
<213> CD2V蛋白的氨基酸序列()
<400> 4
Met Ile Ile Leu Ile Phe Leu Ile Phe Ser Asn Ile Val Leu Ser Ile
1 5 10 15
Asp Tyr Trp Val Ser Phe Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser Asn Ile
20 25 30
Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe Asn
35 40 45
Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe Cys
50 55 60
Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn Asn Cys
65 70 75 80
Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr Tyr Gln
85 90 95
Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu Thr Pro
100 105 110
Ala Thr Pro Pro Asn Ile Thr Tyr Asn Cys Thr Asn Phe Leu Ile Thr
115 120 125
Cys Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ile Asn
130 135 140
Asp Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu Glu Tyr Asn Trp
145 150 155 160
Asn Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr Ala Thr Cys Ile Ile Asn Asn
165 170 175
Thr Ile Ser Thr Ser Asn Glu Thr Thr Leu Ile Asn Cys Thr Tyr Leu
180 185 190
Thr Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Tyr Thr Phe Phe Lys Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Arg Lys Arg Lys Lys His Val Glu Glu Ile Glu Ser Pro Pro Pro Glu
210 215 220
Ser Asn Glu Glu Glu Gln Cys Gln His Asp Asp Thr Thr Ser Ile His
225 230 235 240
Glu Pro Ser Pro Arg Glu Pro Leu Leu Pro Lys Pro Tyr Ser Arg Tyr
245 250 255
Gln Tyr Asn Thr Pro Ile Tyr Tyr Met Arg Pro Ser Thr Gln Pro Leu
260 265 270
Asn Pro Phe Pro Leu Pro Lys Pro Cys Pro Pro Pro Lys Pro Cys Pro
275 280 285
Pro Pro Lys Pro Cys Pro Pro Pro Lys Pro Cys Pro Ser Ala Glu Ser
290 295 300
Tyr Ser Pro Pro Lys Pro Leu Pro Ser Ile Pro Leu Leu Pro Asn Ile
305 310 315 320
Pro Pro Leu Ser Thr Gln Asn Ile Ser Leu Ile His Val Asp Arg Ile
325 330 335
Ile
<210> 4
<211> 337
<212> PRT
<213> CD2V蛋白胞外区的氨基酸序列()
<400> 4
Met Ile Ile Leu Ile Phe Leu Ile Phe Ser Asn Ile Val Leu Ser Ile
1 5 10 15
Asp Tyr Trp Val Ser Phe Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser Asn Ile
20 25 30
Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe Asn
35 40 45
Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe Cys
50 55 60
Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn Asn Cys
65 70 75 80
Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr Tyr Gln
85 90 95
Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu Thr Pro
100 105 110
Ala Thr Pro Pro Asn Ile Thr Tyr Asn Cys Thr Asn Phe Leu Ile Thr
115 120 125
Cys Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ile Asn
130 135 140
Asp Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu Glu Tyr Asn Trp
145 150 155 160
Asn Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr Ala Thr Cys Ile Ile Asn Asn
165 170 175
Thr Ile Ser Thr Ser Asn Glu Thr Thr Leu Ile Asn Cys Thr Tyr Leu
180 185 190
Thr Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Tyr Thr Phe Phe Lys Leu Tyr
195 200 205
<210> 4
<211> 618
<212> PRT
<213> CD2V蛋白胞外区的优化后的编码序列()
<400> 4
Ala Thr Gly Ala Thr Cys Ala Thr Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr
1 5 10 15
Thr Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Thr Thr Thr Cys Thr Ala Ala
20 25 30
Cys Ala Thr Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Thr Cys Cys Ala Thr Cys
35 40 45
Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Gly Thr Cys Thr Thr
50 55 60
Thr Cys Ala Ala Thr Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Thr Cys Ala Thr
65 70 75 80
Cys Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Thr Cys
85 90 95
Ala Cys Cys Ala Ala Thr Gly Ala Cys Ala Ala Cys Ala Ala Thr Gly
100 105 110
Ala Thr Ala Thr Cys Ala Ala Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Thr Cys
115 120 125
Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Thr Thr Cys Thr Thr Thr Ala Ala Cys
130 135 140
Ala Ala Thr Ala Gly Cys Thr Thr Cys Ala Ala Cys Ala Cys Cys Cys
145 150 155 160
Thr Gly Gly Cys Cys Ala Cys Ala Thr Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala
165 170 175
Gly Gly Cys Thr Gly Gly Cys Ala Ala Cys Thr Thr Thr Thr Gly Cys
180 185 190
Gly Ala Gly Thr Gly Thr Thr Cys Thr Ala Ala Thr Thr Ala Cys Thr
195 200 205
Cys Thr Ala Cys Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Thr Ala Thr Ala Ala
210 215 220
Cys Ala Thr Cys Ala Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Thr Thr Gly Thr
225 230 235 240
Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Thr Cys Cys
245 250 255
Cys Ala Cys Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala Cys Gly Thr Gly Thr Thr
260 265 270
Thr Gly Ala Thr Ala Cys Cys Ala Cys Ala Thr Ala Cys Cys Ala Gly
275 280 285
Gly Thr Gly Gly Thr Gly Thr Gly Gly Ala Ala Cys Cys Ala Gly Ala
290 295 300
Thr Cys Ala Thr Cys Ala Ala Thr Thr Ala Thr Ala Cys Ala Ala Thr
305 310 315 320
Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Cys Cys Thr
325 330 335
Gly Cys Cys Ala Cys Ala Cys Cys Cys Cys Cys Thr Ala Ala Cys Ala
340 345 350
Thr Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys Thr Gly Cys Ala Cys
355 360 365
Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Cys Thr Gly Ala Thr Cys Ala Cys Cys
370 375 380
Thr Gly Thr Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Ala Thr Gly
385 390 395 400
Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala Cys Ala Cys Ala Ala Ala Thr Ala Thr
405 410 415
Cys Thr Ala Thr Cys Thr Gly Ala Ala Cys Ala Thr Cys Ala Ala Thr
420 425 430
Gly Ala Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Gly Thr Gly Ala Ala Gly Thr
435 440 445
Ala Cys Ala Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys Ala Thr
450 455 460
Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly
465 470 475 480
Ala Ala Cys Ala Ala Cys Thr Cys Thr Ala Ala Cys Ala Thr Cys Ala
485 490 495
Ala Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Gly Cys Thr Ala Cys
500 505 510
Ala Thr Gly Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Ala Thr
515 520 525
Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Cys Ala Thr Cys Thr Ala
530 535 540
Ala Cys Gly Ala Gly Ala Cys Cys Ala Cys Ala Cys Thr Gly Ala Thr
545 550 555 560
Cys Ala Ala Thr Thr Gly Thr Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys Thr Gly
565 570 575
Ala Cys Ala Cys Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Thr
580 585 590
Ala Cys Thr Thr Cys Thr Ala Thr Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Thr
595 600 605
Thr Ala Ala Gly Cys Thr Gly Thr Ala Cys
610 615

Claims (9)

1.一种重组的非洲猪瘟病毒CD2V亚单位蛋白，其特征在于，所述重组的非洲猪瘟病毒CD2V亚单位蛋白包括非洲猪瘟病毒表面囊膜蛋白的胞外区和胞内区，其氨基酸序列如SEQID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的重组的非洲猪瘟病毒CD2V亚单位蛋白，其特征在于，密码子优化后的非洲猪瘟病毒CD2V蛋白基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种制备如权利要求1～2任一所述的重组的非洲猪瘟病毒CD2V亚单位蛋白的方法，
其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将密码子优化后的非洲猪瘟病毒CD2V蛋白如SEQ ID NO.1所示的编码基因序列克隆到真核表达载体中，得到含有非洲猪瘟病毒CD2V亚单位蛋白编码基因的重组质粒；
2)再将所述含有非洲猪瘟病毒CD2V亚单位蛋白编码基因的重组质粒转染至表达系统的细胞中；
3)通过培养、筛选、驯化步骤2)中所述细胞株，得到高度表达的细胞株；
4)发酵培养3)中所述的细胞株，纯化后，得到如SEQ ID NO.3所示非洲猪瘟病毒亚单位蛋白。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述真核表达载体为pEE12.4。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述表达系统的细胞包括酵母，哺乳动物细胞以及昆虫细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为CHO细胞或293T细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述CHO细胞包括DG44、DXB11、CHO-K1、CHO-S细胞株。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述CHO细胞为CHO-K1细胞株。
9.一种根据权利要求1-2任一所述的重组的非洲猪瘟病毒CD2V亚单位蛋白在制备用于诊断、预防和治疗非洲猪瘟的疫苗中的应用。
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