CN115025212A

CN115025212A - 用于预防猪繁殖与呼吸综合征的mRNA疫苗及制备方法

Info

Publication number: CN115025212A
Application number: CN202210697798.4A
Authority: CN
Inventors: 贺笋; 张伟; 李俊辉; 程兰玲; 杜久斌; 曹剑; 潘晓梅; 王雨朦; 张淑琴
Original assignee: Tiankang Pharmaceutical Suzhou Co ltd
Current assignee: Tiankang Pharmaceutical Suzhou Co ltd
Priority date: 2022-06-20
Filing date: 2022-06-20
Publication date: 2022-09-09

Abstract

本发明涉及mRNA疫苗技术领域，尤其是涉及用于预防猪繁殖与呼吸综合征的mRNA疫苗及制备方法。本发明利用猪繁殖与呼吸综合征病毒的结构蛋白和非结构蛋白，开发一种预防猪繁殖与呼吸综合征的mRNA疫苗，该疫苗使用后能够模拟天然感染的过程，在机体细胞内被翻译、修饰，可以被MHCI类分子和MHCII类分子呈递，诱发更强的细胞免疫和体液免疫应答，即双重功效。并且，本发明提供的mRNA具有自佐剂效应，无需进行佐剂筛选，即工序简化，功能强大。

Description

用于预防猪繁殖与呼吸综合征的mRNA疫苗及制备方法

技术领域

本发明涉及mRNA疫苗技术领域，尤其是涉及用于预防猪繁殖与呼吸综合征的mRNA疫苗及制备方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的母猪流产、死产、木乃伊胎等繁殖障碍以及各年龄猪的呼吸道症状为临床特征的一种高度接触性传染病。病毒主要危害为各年龄猪均感染，不同品种、性别及猪龄均有发病。病毒感染后排毒时间长，因此病毒可经水平和垂直传播方式在猪群中反复传播，很难根治。对母猪危害主要表现为母猪繁殖障碍、免疫力低下、延迟发情等。该病最初有外国流行传入我国，给我国生猪养殖业带来巨大危害，直接经济损失数十亿元。

PRRSV有囊膜，颗粒呈圆形，直径通常为40～60nm。囊膜表面含有不同基因编码的结构蛋白，其中GP3、GP4、GP5以及M蛋白为主要的囊膜蛋白，这些蛋白均含有中和抗原表位，能够诱导机体产生中和抗体，均被用于诊断和疫苗研究的候选抗原，具有重要的研究价值。

目前mRNA疫苗在人用疫苗，即新型冠状病毒疫苗、流感疫苗、寨卡疫苗等，取得了较快的发展，部分疫苗已用于到人体实验，取得了良好的效果。面对目前各种PRRSV疫苗在临床应用上出现的复杂问题，选择mRNA疫苗进行PRRS防控是一种不错的选择途径。

mRNA是编码DNA转录和细胞质核糖体产生蛋白质的中间步骤。mRNA疫苗的核心原理是将编码一个或多个免疫原的基因序列传递到宿主细胞的细胞质中，随后在细胞内表达翻译蛋白即抗原，使其位于细胞膜内或分泌到细胞膜外，进而呈现在主要组织相容性复合物(MHC)上即MHC I类和MHC II类，然后被CD8+和CD4+T细胞识别从而启动适应性免疫应答。mRNA疫苗在靶细胞内产生抗原，模拟了病毒在人体内自然感染的过程，能够有效的引起体液免疫与细胞免疫，安全性较高。mRNA疫苗可以绕过毒株、菌株等获取方面的限制，支持提供任何特定的抗原，无论是来自病毒、细菌还是寄生虫，能够支持针对多种病原体的疫苗开发。

mRNA疫苗相较于亚单位、灭活病毒和减毒活病毒以及DNA的疫苗具有一定相对优势。(1)安全性高:由于mRNA疫苗是一个非感染性、非整合平台技术，因此不存在感染或插入突变和基因组与宿主染色体潜在整合的风险。此外，mRNA能够被正常的细胞自然降解，其在体内的半衰期可以通过各种修饰和递送系统来调节。(2)高效率:多种修饰使mRNA更稳定，更易翻译。通过将mRNA合成载体分子，使其在细胞质中快速摄取和表达，可以实现高效的体内给药。mRNA是最小的遗传载体，因此避免了抗载体免疫，可以重复接种mRNA疫苗。(3)可大规模生产且成本低，不需要在细菌或细胞培养物中扩增，因此mRNA疫苗具有快速、廉价和可扩展的生产潜力。

目前国内还没有猪繁殖与呼吸综合征病毒mRNA疫苗研制上市的产品，因此开发一种mRNA疫苗，用于预防猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染。

综上所述，现有PRRSV疫苗存在的问题是:

(1)PRRSV灭活疫苗：具有安全、便于贮存和运输、母源抗体的干扰作用不敏感，但免疫剂量大、免疫次数多、免疫空白期长、产生大量非中和抗体，对异源毒株几乎没有保护作用，难以控制和根除PRRSV在猪场存在和流行，无法产生细胞免疫应答。

(2)PRRSV弱毒疫苗：弱毒疫苗抗体产生较快，诱导细胞免疫应答，但存在弱毒苗毒株毒力返强的风险，导致病毒的重组与变异，不利于疫病清除。

(3)DNA疫苗：目前有关于PRRSV DNA疫苗研究的报道，其存在的问题是，DNA可以整合到细胞的DNA中，造成机体癌基因的激活和自身免疫反应，具有潜在的生物安全风险。

(4)PRRSV疫苗生产工艺复杂，生产规模庞大，占地面积较大，无形中增加生产成本。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于，利用猪繁殖与呼吸综合征病毒的结构蛋白和非结构蛋白，开发一种预防猪繁殖与呼吸综合征mRNA疫苗，该疫苗施用后能够模拟天然感染的过程，在机体细胞内被翻译、修饰，可以被MHCI类分子和MHCII类分子呈递，诱发更强的细胞免疫和体液免疫应答，即双重功效。

本发明的另一个目的在于，提供制备上述mRNA疫苗的方法，以期能够实现快速安全生产，适宜推广应用。

为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

第一方面，本发明提供含有中和抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白在制备mRNA疫苗中的应用，所述结构蛋白选自(ⅰ)～(ⅲ)中至少一种；

(ⅰ)膜蛋白或其衍生物；

(ⅱ)M蛋白或其衍生物；

(ⅲ)N蛋白或其衍生物。

优选地，所述膜蛋白包括GP3、GP4或GP5中至少一种。

第二方面，本发明提供了前述实施方式所述含有中和抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白联合具有抗原活性的非结构蛋白在制备mRNA疫苗中的应用，所述非结构蛋白包括Nsp蛋白或其衍生物；

优选地，所述Nsp蛋白包括Nsp2、Nsp9或Nsp10中至少一种。

第三方面，本发明提供第一mRNA分子，所述第一mRNA分子编码第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包括通过柔性linker连接的至少两个来源于含有中和抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白的多肽片段。

优选地，所述含有中和抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白选自前述实施方式所述的结构蛋白。

优选地，编码GP3蛋白的开放编辑框ORF3的核苷酸序列为SEQ ID No.1。

优选地，编码GP4蛋白的开放编辑框ORF4的核苷酸序列为SEQ ID No.2。

优选地，编码GP5蛋白的开放编辑框ORF5的核苷酸序列为SEQ ID No.3或SEQ IDNo.4。

优选地，编码M蛋白的开放编辑框ORF6的核苷酸序列为SEQ ID No.5。

优选地，编码N蛋白的开放编辑框ORF7的核苷酸序列为SEQ ID No.6。

第四方面，本发明提供第二mRNA分子，所述第二mRNA分子编码第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包括通过柔性linker连接的至少一个前述实施方式所述的多肽片段和至少一个来源于具有抗原活性的非结构蛋白的多肽片段。

优选地，所述具有抗原活性的非结构蛋白选自前述实施方式所述的非结构蛋白。

优选地，编码Nsp2蛋白的开放编辑框ORF1的核苷酸序列选自SEQ ID No.18～SEQID No.20中任一条序列。

优选地，编码Nsp9蛋白的开放编辑框ORF1的核苷酸序列为SEQ ID No.21。

优选地，编码Nsp10蛋白的开放编辑框ORF1的核苷酸序列为SEQ ID No.22。

第五方面，本发明提供构建体，所述构建体包括第一mRNA分子或第二mRNA分子，所述构建体的核苷酸序列还包括UTR序列、Kozak序列、信号肽编码序列、启动子序列和poly(A)序列。

优选地，所述UTR序列包括核苷酸序列如SEQ ID No.13所示的5’UTR序列和核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的3’UTR序列。

优选地，所述Kozak序列如SEQ ID No.15所示。

优选地，编码所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。

优选地，所述启动子包括T7启动子，核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。

优选地，所述poly(A)的碱基长度为50～150bps，进一步优选为129bps。

第六方面，本发明提供生物材料，包括：

(a)重组载体，包括前述实施方式所述的构建体和质粒载体；

(b)转化体，包括含有前述实施方式所述的构建体，或(a)重组载体的宿主细胞。

优选地，所述质粒载体包括pcDNA3.1、CET 1019HS-puro、pIRES或pRL-SV40，进一步优选为pcDNA3.1。

优选地，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

进一步优选地，所述原核细胞包括DH5α、JM109或BL21，更加优选为DH5α。

进一步优选地，所述真核细胞包括酵母细胞、Marco-145、PK-15、Hela或昆虫细胞，更加优选为Marco-145。

第七方面，本发明提供前述实施方式所述构建体的制备方法，所述制备方法包括：

(1)合成表达构建体的基因片段，所述构建体的核苷酸序列按照5’端～3’端依次包括，启动子序列-5’UTR序列-Kozak序列-信号肽编码序列-第一mRNA分子或第二mRNA分子-3’UTR序列-poly(A)序列；

(2)将步骤(1)得到的基因片段插入质粒载体得到重组载体，而后将重组载体转化进宿主细胞得到转化体，转化体增殖后提取重组载体，经体外转录后得到构建体。

第八方面，本发明提供前述实施方式所述的第一mRNA分子、前述实施方式所述的第二mRNA分子、前述实施方式所述的构建体、前述实施方式所述的生物材料，或者，前述实施方式所述的制备方法在制备mRNA疫苗中的应用。

第九方面，本发明提供mRNA疫苗的制备方法，所述制备方法包括，将前述实施方式所述的构建体，或采用前述实施方式所述制备方法得到的构建体与载体混匀后，依次经透析、浓缩和无菌过滤后得到mRNA疫苗。

优选地，所述载体包括脂质纳米颗粒。

优选地，所述脂质纳米颗粒组分包括D-Lin-MC3-DMA、二硬脂酞基磷脂酞胆碱、胆固醇和PEG化脂质PEG-DMG。

优选地，D-Lin-MC3-DMA、二硬脂酞基磷脂酞胆碱、胆固醇和PEG化脂质PEG～DMG的摩尔比为(50)：(14～9)：(35～40)：1，进一步优选为50:10:37.5:2.5。

优选地，所述制备方法包括，将D-Lin-MC3-DMA、二硬脂酞基磷脂酞胆碱、胆固醇和PEG化脂质PEG-DMG按照摩尔比于有机溶剂中混匀得到脂质纳米颗粒，而后与构建体混匀后，依次经透析、浓缩和无菌过滤后得到mRNA疫苗。

优选地，所述有机溶剂选自乙醇、异丙醇或甲醇，进一步优选为乙醇。

优选地，脂质纳米颗粒与构建体按照1：(1～10)的体积流速混匀，进一步优选地，所述体积流速为1:3。

第十方面，本发明提供采用前述实施方式所述制备方法制备得到的mRNA疫苗，所述mRNA疫苗粒径为90～100nm，Zeta点位为-20～-7.5mV，包封率在90％以上。

本发明提供的猪繁殖与呼吸综合征mRNA疫苗及其制备方法的有益效果包括：

(1)使用本发明提供的mRNA疫苗的制备方法，能够实现快速地研发和生产，能够标准化，易于量产和质量控制，同一生产流程适用于多个不同产品，即开发周期短和产品可控。

(2)本发明提供的mRNA疫苗在施用后，能够模拟天然感染的过程，在机体细胞内被翻译、修饰，可以被MHCI类分子和MHCII类分子呈递，诱发更强的细胞免疫和体液免疫应答，即双重功效，且无感染、基因组整合风险，即生物安全。

(3)本发明提供的mRNA具有自佐剂效应，无需进行佐剂筛选，即工序简化，降低成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的PRRSV mRNA疫苗设计与构建流程图；

图2为本发明实施例提供的pcDNA3.1-PRRSV-C质粒构建示意图；

图3为本发明实施例提供的pcDNA3.1-PRRSV-C质粒酶切电泳图；

图4A为10μg剂量PRRSV mRNA疫苗免疫小鼠后CD4+细胞检测结果；

图4B为5μg剂量PRRSV mRNA疫苗免疫小鼠后CD4+细胞检测结果；

图4C为2μg剂量PRRSV mRNA疫苗免疫小鼠后CD4+细胞检测结果；

图5A为10μg剂量PRRSV mRNA疫苗免疫小鼠后CD8+细胞检测结果；

图5B为5μg剂量PRRSV mRNA疫苗免疫小鼠后CD8+细胞检测结果；

图5C为2μg剂量PRRSV mRNA疫苗免疫小鼠后CD8+细胞检测结果；

图6为PRRSV mRNA疫苗免疫小鼠后细胞因子检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

在具体的实施方式中，第一方面，本发明提供含有中和抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白在制备mRNA疫苗中的应用，所述结构蛋白选自(ⅰ)～(ⅲ)中至少一种；

(ⅰ)膜蛋白或其衍生物；

(ⅱ)M蛋白或其衍生物；

(ⅲ)N蛋白或其衍生物。

在可选的实施方式中，所述膜蛋白包括GP3、GP4或GP5中至少一种。

GP3、GP4、GP5或M蛋白中包含了主要的中和表位，可以诱发高水平的中和抗体滴度。

第二方面，本发明提供了前述实施方式所述含有中和抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白联合具有抗原活性的非结构蛋白在制备mRNA疫苗中的应用，所述非结构蛋白包括Nsp蛋白或其衍生物。

在可选的实施方式中，所述Nsp蛋白包括Nsp2、Nsp9或Nsp10中至少一种。

在可选的实施方式中，所述含有中和抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白选自前述实施方式所述的结构蛋白。

在可选的实施方式中，编码GP3蛋白的开放编辑框ORF3的核苷酸序列为SEQ IDNo.1；编码GP4蛋白的开放编辑框ORF4的核苷酸序列为SEQ ID No.2；编码GP5蛋白的开放编辑框ORF5的核苷酸序列为SEQ ID No.3或SEQ ID No.4；编码M蛋白的开放编辑框ORF6的核苷酸序列为SEQ ID No.5；编码N蛋白的开放编辑框ORF7的核苷酸序列为SEQ ID No.6。

第四方面，本发明提供第二mRNA分子，所述第二mRNA分子编码第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包括通过柔性linker连接的至少一个前述实施方式任一项所述的多肽片段和至少一个来源于具有抗原活性的非结构蛋白的多肽片段。

在可选的实施方式中，所述具有抗原活性的非结构蛋白选自前述实施方式所述的非结构蛋白。

在可选的实施方式中，编码Nsp2蛋白的开放编辑框ORF1的核苷酸序列选自SEQ IDNo.18～SEQ ID No.20中任一条序列；

编码Nsp9蛋白的开放编辑框ORF1的核苷酸序列为SEQ ID No.21；

编码Nsp10蛋白的开放编辑框ORF1的核苷酸序列为SEQ ID No.22。

上述第一mRNA分子和第二mRNA分子被证实了其表达产物能够在机体中诱发高水平中和抗体和细胞因子的产生。

在可选的实施方式中，所述UTR序列包括核苷酸序列如SEQ ID No.13所示的5’UTR序列和核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的3’UTR序列；

所述Kozak序列如SEQ ID No.15所示；

所述信号肽编码序列如SEQ ID No.14所示；

所述启动子包括T7启动子，核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；

所述poly(A)的碱基长度为50～150bps，优选为129bps。

第六方面，本发明提供生物材料，包括：

(a)重组载体，包括前述实施方式所述的构建体和质粒载体；

在可选的实施方式中，所述质粒载体包括pcDNA3.1、CET 1019HS-puro、pIRES或pRL-SV40，优选为pcDNA3.1；

所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；

优选地，所述原核细胞包括DH5α、JM109、或BL21，进一步优选为DH5α；

优选地，所述真核细胞包括酵母细胞、Marco-145、PK-15、Hela或昆虫细胞，进一步优选为Marco-145。

本发明提供的PRRSV mRNA基因设计、合成及mRNA疫苗及其制备方法得到的mRNA包含有不同谱系的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原的mRNA，能提供对异源毒株的交叉免疫保护。

在一次具体的实施方式中，本发明提供的mRNA的制备方法包括如下步骤:

筛选阳性重组质粒，采用限制性内切酶BamH I进行酶切并回收线性化质粒，然后通过体外转录得到PRRSV mRNA。

所述阳性重组质粒为具有编码上述PRRSV融合蛋白基因的质粒。

所述阳性重组质粒为含有序列表的SEQ ID No.8所示DNA分子的重组质粒或含有序列表的SEQ ID No.9所示DNA分子的重组质粒或序列表的SEQ ID No.10所示的重组质粒。

在某次具体的实施方式中，PRRSV mRNA的制备方法依次包括如下步骤:

(1)取阳性重组质粒，采用限制性内切酶BamH I进行酶切，回收线性化质粒；

(2)转录得到RNA；

(3)完成步骤(2)后，采RNA纯化试剂盒进行纯化，得到纯化后RNA；

(4)进行线性DNA的消化；

(5)完成步骤(4)后，采用RNA纯化试剂盒进行纯化，得到纯化后RNA；

(6)进行加帽；

(7)完成步骤(6)后，采用RNA纯化试剂盒进行纯化，得到纯化后RNA,即为PRRSVmRNA。

步骤(4)的方法:取纯化后RNA，加入DNase I并37℃孵育l h。具体的，每lug RNA加入1U DNase I。

在可选的实施方式中，所述载体包括脂质纳米颗粒。

在可选的实施方式中，所述脂质纳米颗粒组分包括D-Lin-MC3-DMA、二硬脂酞基磷脂酞胆碱、胆固醇和PEG化脂质PEG-DMG。

在可选的实施方式中，D-Lin-MC3-DMA、二硬脂酞基磷脂酞胆碱、胆固醇和PEG化脂质PEG～DMG的摩尔比为(50)：(14～9)：(35～40)：1，优选为50:10:37.5:2.5。

在可选的实施方式中，所述制备方法包括，将D-Lin-MC3-DMA、二硬脂酞基磷脂酞胆碱、胆固醇和PEG化脂质PEG-DMG按照摩尔比于有机溶剂中混匀得到脂质纳米颗粒，而后与构建体混匀后，依次经透析、浓缩和无菌过滤后得到mRNA疫苗。

在可选的实施方式中，脂质纳米颗粒与构建体按照1：(1～10)的流速混匀。

在一次具体的实施方式中，本发明提供的脂质纳米粒的制备方法具体包括如下步骤:

取PRRSV mRNA，用pH4.4 100mM的枸橼酸缓冲液稀释，得到溶液I；取D-Lin-MC3-DMA、二硬脂酞基磷脂酞胆碱、胆固醇、PEG化脂质PEG-DMG，溶于95％乙醇，得到溶液II；将溶液I和溶液II同时加样至微流体混合器，溶液I和溶液II的体积比为3:1，收集流出液，透析、浓缩、然后过滤，收集滤液，即为PRRSV mRNA LNPs溶液。D-Lin-MC3-DMA、二硬脂酞基磷脂酞胆碱、胆固醇、PEG化脂质PEG-DMG四个组分摩尔比依次为50:10:37.5:2.5。

在一次具体的实施方式中，本发明提供的包裹PRRSV mRNA的脂质纳米粒的制备方法，整体步骤如图1所示，具体包括如下步骤:

按照脂质纳米粒的制备方法中所述，将溶液I和溶液II同时加样至微流体混合器，溶液A和溶液B的体积比为3:1，总流速为5～8ml/min；收集流出液，将流出液转移至透析袋中，置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中4℃透析24h，取透析袋中的液相，使用离心过滤器浓缩至RNA浓度为2mg/ml，然后采用0.22um滤膜过滤，收集滤液，即为PRRSV mRNA LNPs溶液。

第十方面，本发明提供采用前述实施方式任一项所述制备方法制备得到的mRNA疫苗，所述mRNA疫苗粒径为90～100nm，Zeta点位为-20～-7.5mV，包封率在90％以上。

下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

本实施例提供三条融合mRNA的制备方法，具体如下：

1.1基因序列设计与合成

登录NCBI基因库，查阅并选择若干不同谱系的猪繁殖与呼吸综合征病毒主要膜蛋白基因序列，选择编码主要非结构蛋白Nsp2、Nsp9、Nsp10或主要膜蛋白GP3、GP4、GP5、M蛋白以及N蛋白等相关基因，优选GP3、GP4、GP5、M蛋白以及N蛋白相关基因。通过DNAStar和DNAMan生物软件分析，筛选和寻找出蛋白表面具有中和作用的抗原位点。根据相关文献，挑选合适的具有中和活性的抗原表位，通过不同组合方式，将挑选的含有抗原表位的基因通过linker连接起来，进行后期融合表达。对其进行分析与密码子优化。

所述融合蛋白基因的设计与合成包括：(1)(PRRSV-A)：ORF3—linker—ORF4—linker—ORF5—linker—ORF6—linker—ORF7；(2)(PRRSV-B)：ORF3—inker—ORF4—linker—ORF6—linker—ORF5—linker—ORF7；(3)(PRRSV-C)：ORF3—linker—ORF4—linker—3’ORF5—linker—ORF6—linker—ORF7—linker—5’ORF5。PRRSV ORF3序列为SEQ ID No.1，PRRSV ORF4序列为SEQ ID N o.2，5’ORF5和3’ORF5序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。PRRSV ORF6序列为SEQ ID No.5，PRRSV ORF7序列为SEQ ID No.6。5’ORF5序列在融合蛋白基因3’端进行了重复设计，中间插入了功能序列SEQ ID No.7。所述功能序列是连接两个抗原表位，起到能够保证各抗原表位之间互相不干扰的作用。设计的融合蛋白基因见序列表中的SEQ ID No.8～No.10。

融合蛋白A基因序列设计见SEQ ID No.8，翻译氨基酸序列如下：

LEPGKSFWCRIGHDRCSENGPGPGPETMRWATVLACLLPSLLAIGPGPGSHIQLIYNLGPGPGLAALICFVIRLAKNCLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVVLDGSAATPLTRVSAELWGRLGPGPGCNDSTAPQKVLLAFSALKVSRGRLLGLLHLGPGPGVRHHFTPSEVRLIRATAS*(如SEQ ID No.23所示)。

融合蛋白B基因序列设计见SEQ ID No.9，翻译氨基酸序列如下：

LEPGKSFWCRIGHDRCSENGPGPGPETMRWATVLACLLPSLLAIGPGPGCNDSTAPQKVLLAFSALKVSRGRLLGLLHLGPGPGSHIQLIYNLGPGPGLAALICFVIRLAKNCLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVVLDGSAATPLTRVSAELWGRLGPGPGVRHHFTPSEVRLIRATAS*(如SEQ ID No.24所示)。

融合蛋白C基因序列设计见SEQ ID No.10，翻译氨基酸序列如下：

LEPGKSFWCRIGHDRCSENGPGPGPETMRWATVLACLLPSLLAIGPGPGLAALICFVIRLAKNCGPGPGLYRWRSPVIVEKGGKVEVEGHLIDLKRVVLDGSAATPLTRVSAELWGRLGPGPGCNDSTAPQKVLLAFSGPGPGALKVSRGRLLGLLHLGPGPGVRHHFTPSEGPGPGVRLIRATASGPGPGSHIQLIYNLAKFVAAWTLKAAASHIQLIYNL*(如SEQ ID No.25所示)。

将序列表中的SEQ ID No.10所示DNA分子的上下游增加非编码序列(UTR)，并且增加Kozak序列、信号肽、T7启动子序列以及下游129个A，得到SEQ ID No.11所示的DNA分子。SEQ ID No.8中，第1～19位核苷酸组成T7启动子(所示序列为SEQ ID No.12)、第20～77位核苷酸组成5’UTR(所示序列为SEQ ID No.13)、第84～144位核苷酸组成信号肽序列(所示序列为SEQ ID No.14)、第78～83位核苷酸组成Kozak序列(所示序列为SEQ ID No.15)、第84～812位核苷酸编码融合蛋白(所示序列为SEQ ID No.10)、第813～944位核苷酸组成3’UTR(所示序列为SEQ ID No.16)、第945～1073位核苷酸组成poly A(所示序列为SEQ IDNo.17)。将上述基因经密码子优化后送往南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成。

将序列表中SEQ ID No.8和SEQ ID No.9按照SEQ ID NO.10的方法，添加相应修饰序列和密码子优化后进行基因合成，选择pcDNA3.1作为载体，插入到载体中，重组质粒分别命名为pcDNA3.1-PRRSV-A、pcDNA3.1-PRRSV-B、pcDNA3.1-PRRSV-C(如图2所示)。

1.2重组质粒的转化

(1)取～70℃冻存的DH5a菌种划线接种于不含抗生素的LB琼脂平皿上，37℃温箱培养12～16h后，挑取生长良好的单个菌落，接种于5mL LB液体培养基中，37℃250～300r/min振荡培养5～6h。

(2)将适量活化后的菌液无菌转接到装有5mL LB的盐水瓶中，继续振荡培养约2.5～3h，至OD600nm值达到0.5～0.6时，在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的用冰预冷的50mL聚丙烯离心管中，冰上放置30min。

(3)4℃4000r/min离心l0min，弃上清，将离心管倒置1min使残留培养液流尽后，于沉淀中加入l0mL冰预冷的0.l mol/L CaCl₂重悬沉淀，冰浴30min。

(4)4℃4000r/min离心10min，弃上清，沉淀中加入用冰预冷的0.lmol/L CaCl₂约2min，轻轻重悬菌体，即为制备好的感受态细胞，可直接取少量用于转化或放冰浴中置4℃短期存放。可加入终浓度15％无菌甘油，分装0.1mL/管，-70℃冰箱保存备用。

(5)取制备好的感受态细胞100μL于一无菌的1.5mL EP管，加入连接产物(约10μL)混匀，冰浴30min后，于42℃水浴热击90s，再冰浴2～5min。加入400μL的LB，37℃200～220r/min摇床复苏培养45～60min 5000r/min离心3min，弃去400μL上清，用余下部分上清轻轻重悬细菌沉淀，并均匀涂布抗性平板，先正放于37℃温箱中1～2h，使平板表面液体充分吸入琼脂中后(以培养基表面无液体流动为适宜)，再倒放继续培养至12～18h，观察转化单菌落的出现。

若是转化现成质粒，则于42℃水浴热击90s，放回冰上2min后，直接取30～50μL菌液直接涂布含相应抗生素的LB平板，然后即可于37℃温箱培养。

1.3重组质粒的筛选与鉴定

1.3.1质粒的小量制备

(1)用灭菌牙签挑取平板上的单菌落，接种到4mL含相应抗生素的LB培养液中，37℃300r/min振摇培养过夜。

(2)将菌液转入1.5mL EP管中，12000r/min离心1min，弃上清，倒立离心管，使液体流尽，收集菌体。(注意:每份菌液都预留出0.5mL菌种，加入适量灭菌甘油后，-20℃保存备用，待小提鉴定完成后，留下阳性重组子菌液)。

(3)加入100μL冰预冷的溶液I，涡旋至菌体充分悬浮。

(4)加入新鲜配制的溶液II 200μL，颠倒混匀，冰浴5min。

(5)加入预冷的溶液III 150μL，颠倒离心管几次混匀后冰浴5min。

(6)12000r/min离心5min，吸取上清至另一个1.5mL离心管内，加入等体积的异丙醇，涡旋混匀，室温静置沉淀10min。

(7)12000r/min离心l0min，弃上清，沉淀用75％冷乙醇漂洗后，抽干或自然干燥，用200μL含适量RNA酶(RNase，20ug/mL)的TE(pH8.0)或ddH2O溶解沉淀，56℃水浴30min或37℃水浴1h以去除RNA。

(8)加入1/2倍体积的冰预冷7.5mo1/L NH4Ac 100μL，混匀后冰浴10min。

(9)4℃12000r/min离心l0min，吸取上清到另一支1.5mL离心管中，加1倍体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇室温沉淀30min。

(10)12000r/min离心5min，弃上清，75％冷乙醇漂洗沉淀，抽干后溶于适量ddH₂O或TE(pH8.0)，取样1～2μL电泳观察提取质粒的质量，其余置-20℃保存备用。

(11)将提取质粒选用Sac II和BamH I进行双酶切鉴定(见图3)，37℃，3h。将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，条带正确的质粒送往金斯瑞生物技术有限公司进行测序。

1.3.2重组质粒的大量提取

(1)将-20℃冻存的已鉴定为阳性重组子菌液接种于100mL含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃250～300r/min培养过夜。

(2)将菌液转至50mL离心管中，6000r/min离心5～10min，收集细菌沉淀。

(3)向沉淀中加入3mL冰预冷的溶液I，吹散并涡旋至菌体充分悬浮。

(4)加入6mL新配的溶液II，颠倒离心管几次，冰浴7～10min。

(5)加入4.5mL冰预冷的溶液III，颠倒离心管几次后，冰浴7～10min。

(6)4℃10000r/min离心15～20min，转移上清至另一个50mL离心管中，加0.6倍体积的异丙醇，混匀，置-20℃或室温30min。

(7)室温10000r/min离心15～20min，弃上清，沉淀用75％冷乙醇洗涤后，真空抽干或自然干燥，加入1.5mL TE(pH8.0)充分溶解沉淀，再加入等体积即1.5mL冰预冷的5mol/LNH4Ac,混匀。

(8)4℃10000r/min离心15～20min，弃沉淀，将上清转移到7mL离心管中，向上清中加入等体积(3mL)的异丙醇，混匀，置-20℃或室温30min。

(9)10,000r/min离心15～20min，弃上清，用冰预冷75％乙醇洗涤沉淀，真空抽干或自然干燥，加入500μL的TE(pH8.0)充分溶解后转移至1.5mL离心管中。

(10)加入适量的RNA酶(RNase)，37℃1h或56℃30min去除RNA。

(11)加入等体积即500μL的新配制的13％PEG8000(含1.6mo1/L NaCl)混匀，置-20℃或室温30min。

(12)4℃12000r/min离心l0min，弃上清，用400μLTE(pH8.0)重悬沉淀。

(13)加入等体积即400μL苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提2次，氯仿:异戊醇抽提1次。每次抽提以12000r/min离心10min。

(14)小心吸取上层水相(尽量避免吸到下层油相)转移到另一个1.5mL离心管中，加入100μL的10mol/L NH₄Ac，充分混匀后，加入2倍体积(一般1mL)冰预冷无水乙醇混合，置-20℃30min。

(15)4℃12000r/min离心5～10min，弃上清，用冰预冷的75％乙醇洗涤沉淀，真空抽干或自然干燥，加50～100μL TE(pH8.0)或灭菌ddH₂O溶解沉淀。

(16)取0.5μL在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察所提取质粒的质量，剩余部分置-20℃保存备用。

1.4mRNA制备

1.4.1重组质粒的线性化

大量提取的重组质粒pcDNA3.1-PRRSV-A/B/C后，使用超微量分光光度计对其进行浓度和纯度测定。单酶切反应体系如表1所示，反应条件为:37℃3h。

表1酶切反应体系

1.4.2重组质粒的体外转录反应

选用T7-Flash ScribeTM Transcription Kit进行体外转录，在体外转录体系配制过程中，将UTP替换为N1-Methylpseudouridine-5’-Triphosphate。反应体系如表2所示，反应条件为:第一步反应，35℃30min；反应后将20μL上述产物加入Rnase-Free DNaseI酶1μL，继续反应。35℃15min。

表2体外转录反应

1.4.3转录产物的加帽

选用试剂盒ScriptCapTM Cap 1Capping System进行操作，反应体系如表3所示。加帽反应液65℃，15min。

表3加帽反应(Step1)

Step2

Step3

1.4.4 Cap-mRNA纯化

选用Purification for Large Scale Transcription Reactions试剂盒进行纯化反应。在操作的过程中要注意清洁台子，使用无Rnase的枪头，更换手套。具体操作步骤如下:

(1)100μL的Elution Solution溶解RNA，用移液器轻轻混匀；

(2)加350μLBinding Solution Concentrate到样本中，用移液器轻轻混匀；

(3)再加250μL无水乙醇，用移液器轻轻混匀；

(4)将混合后的样本加到过滤柱中，离心12000rpm，1min，弃掉滤液；

(5)加500μLWash Buffer，离心12000rpm，1min，弃掉滤液；

(6)重复第5步一次；

(7)放回过滤柱继续空离，去净Wash Buffer，离心12000rpm，1min；

(8)将柱子转移至新的收集管中，加50μLEluent Solution，在65～70℃温浴5～10min；

(9)室温离心12000rpm，1min；

(10)为提升RNA的回收量，可以再加50μL进行洗脱，收集到同一管中。

1.5 Cap-mRNA体外细胞转染试验

1.5.1细胞转染

选用LipofectamineTM 3000Reagent进行Cap-mRNA的细胞转染试验，具体操作步骤如下:

(1)将Marco-145细胞以1×10⁴个/孔的数量接种于12孔板，选用含10％胎牛血清的MEM培养基进行培养。放入含5％CO₂的37℃培养箱中培养，直至细胞融合度近80％；

(2)更换无血清的MEM培养基，每孔加入500μL；

(3)参照转染试剂使用说明书，将Lipofectamine 3000Reagent和Cap-mRNA按体积与质量比为3μL/2ug的比例进行混合，室温静置15min后，逐滴加入孔中，将孔板中液体轻轻摇晃均匀后，放入温箱中继续培养；

(4)若培养时间超过12h，需要在第6h时补加完全培养基，每孔500μL。

1.5.2 mRNA转染后检测

1.5.2.1免疫印迹试验PRRSV-A/B/C转染Marco-145细胞12h后，弃净孔中原有培养基，用PBS洗涤两次，去净残留培养基，加入RIPA细胞裂解液(100:1加入蛋白酶抑制剂PMSF)，充分裂解后将细胞收集至1.5mL EP管中，14000rpm离心10min。将上清液转移至新的1.5mL EP管中，取2μL用于蛋白浓度测定，具体测定方法参考BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书。

取相同质量的蛋白样本，补水定量至相同体积，加入1/4体积的5×SDS上样液，混匀后，沸水煮5min，取25μg样本上样，通过10％SDS-PAGE凝胶电泳(聚丙烯酞胺凝胶电泳)，具体操作步骤如下:

(1)电泳：首先80V，30min，使蛋白样本统一进入分离胶，然后调整电压至120V，待条带接近胶块底部时结束电泳；

(2)转膜：采用半干法将凝胶中的蛋白转印至0.45μm的硝酸纤维素膜(NC膜)上，参数设定为15V，31min；

(3)封闭：将NC膜置于5％的脱脂乳中，封闭2h；

(4)洗涤：封闭结束后，使用TBST洗涤1次，用于清除膜表面的脱脂乳残留；

(5)一抗孵育：使用5％的BSA配制1:2000倍稀释的一抗，兔源PRRSV GP5蛋白阳性血清，室温孵育3h，或者40C下孵育过夜；

(6)洗涤：TBST洗涤3次，每次8分钟；

(7)二抗孵育：使用TBST配制1:4000倍稀释的二抗，HRP标记的山羊抗兔IgG抗体，室温孵育30min；

(8)洗涤：TBST洗涤3次，每次10min；

(9)显影：在膜上滴加ECL显影液，作用1分钟后，放入仪器中成像。

1.5.2.2间接免疫荧光实验

(1)细胞培养3日后取出细胞板，弃去上清，每孔加入200μl PBST(0.1mol/L PBS中加入0.05％吐温20，以下同)洗3次后，每孔加入100μl 80％预冷丙酮，室温固定10分钟。弃去固定液，拍干细胞板中余液，放置于开启风机生物安全柜中约5分钟使细胞板自然干燥。每孔加入200μl PBST，洗4次。将PBST倒干后，抗原盘存放于4℃或-20℃备用。

(2)在抗原盘中每孔加入75μl 3％PBA。将25μl PRRSV阴性血清和阳性血清(1:200稀释)振荡均匀。置于4℃感作过夜。

(3)去除一抗后，每孔加入200μl PBST，洗4次。每孔加入50μl的用1％PBA200倍稀释FITC标记的羊抗兔的IgG二抗，置于室温感作4小时。将二抗倒干后，然后每孔加入200μlPBST洗4次。

(4)将PBST倒干后，再加入50μl PBST，并于倒置荧光显微镜200倍视野下判读抗体效价。阳性对照孔应观察到阳性细胞的胞浆或胞核内有典型的特异性亮绿色荧光，而阴性对照孔内无特异性绿色荧光。

实施例2 mRNA疫苗的制备

2.1原料准备

将各阳离子脂质D-Lin-MC3-DMA、二硬脂酞基磷脂酞胆碱、胆固醇、PEG化脂质PEG-DMG四个组分按摩尔比50:10:37.5:2.5在乙醇中溶解、混合。

2.2试验步骤

以脂质混合物:mRNA体积流速比1:3，在Precision Nanosystems的纳米颗粒制备仪器中分别混合包装得到包装好的mRNA-LNP，分别简写为PRRSV-A mRNA LNP、PRRSV-BmRNA LNP、PRRSV-C mRNA LNP。将包装好的mRNA-LNP透析并超滤浓缩到DPBS中，无菌过滤后获得用于后续动物实验的样品。

取PRRSV-A/B/C mRNA LNPs溶液，采用Malvern仪器测量LNPs的粒径、PDI和zeta电位。粒径介于90nm～100nm之间，见表4。PDI:0.129。Zeta电位:-7.5Mv。分别取PRRSV-A/B/CmRNA LNPs溶液，用RNA分析试剂盒计算LNPs的包封率，包封率不低于90％。

表4疫苗制备相关参数

名称	平均粒径	强度	标准差
				PRRSV-A-LNP	92.42	100％	32.93
PRRSV-B-LNP	91.54	100％	30.35
				PRRSV-C-LNP	92.36	100％	31.19

实施例3 mRNA疫苗免疫评价

3.1实验操作

用实施例1和2提供的方法制备不同成分的猪繁殖与呼吸综合征病毒mRNA疫苗。选择18～25g BALB/c小鼠，按照下表分组方式免疫小鼠，分组见表5。首免后14日，进行二次免疫。首免后28日，进行采血，检测细胞因子和膜蛋白抗体水平。

表5实验分组情况

3.2实验结果

3.2.1细胞因子检测结果

通过采集小鼠全血进行血液分析，IFN-γ、IL-2、CD4+T以及CD8+细胞Thl类细胞免疫反应检测结果如图4～6所示，结果显示，不同免疫剂量下，PRRSV-C-LNP组抗原组合相对于其他组合在细胞免疫应答方面具有一定的优势。进一步验证了PRRSV-C-LNP组抗原肽的组合设计在疫苗应用方面的优越性。

3.2.2中和抗体检测结果

一免、二免后针对产生的特异性抗体进行中和试验检测，选择不同谱系种毒与特异性抗体进行反应。具体检测结果见表6所示，各组之间没有显著性差异。免疫后28日，所有10ug剂量组平均中和抗体滴度均不低于1:16，相关文献报道，PRRSV中和抗体滴度不低于1:16可100％阻止病毒血症的产生和PRRSV经胎盘途径的感染。

表6疫苗免疫小鼠抗体检测分析

各免疫组之间，PRRSV-C-LNP组抗原组合相对于其他组合在中和抗体滴度方面具有一定的优势，抗体滴度介于1:16～1:32之间。说明对GP5抗原进行合理拆分和优化，祛除抗原表位之间的“遮蔽效应”，对中和抗体的产生具有显著的作用。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 天康制药（苏州）有限公司

<120> 用于预防猪繁殖与呼吸综合征的mRNA疫苗及制备方法

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码GP3蛋白的开放编辑框ORF3的核苷酸序列

<400> 1

cttgaacccg gcaagtcttt ttggtgcagg atagggcatg accgatgtag tgagaac 57

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码GP4蛋白的开放编辑框ORF4的核苷酸序列

<400> 2

cctgagacca tgaggtgggc aaccgtttta gcctgtcttt tgccatccct actggcaatt 60

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码GP5蛋白的开放编辑框ORF5的核苷酸序列一

<400> 3

tctcatattc agttgattta taactta 27

<210> 4

<211> 192

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码GP5蛋白的开放编辑框ORF5的核苷酸序列二

<400> 4

ctggctgcgc tgatttgctt tgtcattagg cttgcgaaga actgcctcta tcgttggcgg 60

tcgcccgtca ttgtggagaa agggggtaag gttgaggtcg aaggtcacct gatcgacctc 120

aagagagttg tgcttgatgg ttccgcggca acccctttaa ccagagtttc agcggaacta 180

tggggtcgtc tc 192

<210> 5

<211> 90

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码M蛋白的开放编辑框ORF6的核苷酸序列

<400> 5

tgcaatgata gcacagctcc acagaaggtg cttttggcgt tttccgctct aaaggtaagt 60

cgcggccgac tgctagggct tctgcacctt 90

<210> 6

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码N蛋白的开放编辑框ORF7的核苷酸序列

<400> 6

gtcaggcatc actttacccc tagtgaggtg cgtctgatcc gcgccacagc atca 54

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 功能序列

<400> 7

gcgaagttcg tcgcggcgtg gactttgaag gcggcggcg 39

<210> 8

<211> 558

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 融合蛋白A基因序列

<400> 8

cttgaacccg gcaagtcttt ttggtgcagg atagggcatg accgatgtag tgagaacggt 60

ccaggcccag gtcctgagac catgaggtgg gcaaccgttt tagcctgtct tttgccatcc 120

ctactggcaa ttggtccagg cccaggttct catattcagt tgatttataa cttaggtcca 180

ggcccaggtc tggctgcgct gatttgcttt gtcattaggc ttgcgaagaa ctgcctctat 240

cgttggcggt cgcccgtcat tgtggagaaa gggggtaagg ttgaggtcga aggtcacctg 300

atcgacctca agagagttgt gcttgatggt tccgcggcaa cccctttaac cagagtttca 360

gcggaactat ggggtcgtct cggtccaggc ccaggttgca atgatagcac agctccacag 420

aaggtgcttt tggcgttttc cgctctaaag gtaagtcgcg gccgactgct agggcttctg 480

caccttggtc caggcccagg tgtcaggcat cactttaccc ctagtgaggt gcgtctgatc 540

cgcgccacag catcatga 558

<210> 9

<211> 558

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 融合蛋白B基因序列

<400> 9

cttgaacccg gcaagtcttt ttggtgcagg atagggcatg accgatgtag tgagaacggt 60

ccaggcccag gtcctgagac catgaggtgg gcaaccgttt tagcctgtct tttgccatcc 120

ctactggcaa ttggtccagg cccaggttgc aatgatagca cagctccaca gaaggtgctt 180

ttggcgtttt ccgctctaaa ggtaagtcgc ggccgactgc tagggcttct gcaccttggt 240

ccaggcccag gttctcatat tcagttgatt tataacttag gtccaggccc aggtctggct 300

gcgctgattt gctttgtcat taggcttgcg aagaactgcc tctatcgttg gcggtcgccc 360

gtcattgtgg agaaaggggg taaggttgag gtcgaaggtc acctgatcga cctcaagaga 420

gttgtgcttg atggttccgc ggcaacccct ttaaccagag tttcagcgga actatggggt 480

cgtctcggtc caggcccagg tgtcaggcat cactttaccc ctagtgaggt gcgtctgatc 540

cgcgccacag catcatga 558

<210> 10

<211> 669

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 融合蛋白C基因序列

<400> 10

cttgaacccg gcaagtcttt ttggtgcagg atagggcatg accgatgtag tgagaacggt 60

ccaggcccag gtcctgagac catgaggtgg gcaaccgttt tagcctgtct tttgccatcc 120

ctactggcaa ttggtccagg cccaggtctg gctgcgctga tttgctttgt cattaggctt 180

gcgaagaact gcggtccagg cccaggtctc tatcgttggc ggtcgcccgt cattgtggag 240

aaagggggta aggttgaggt cgaaggtcac ctgatcgacc tcaagagagt tgtgcttgat 300

ggttccgcgg caaccccttt aaccagagtt tcagcggaac tatggggtcg tctcggtcca 360

ggcccaggtt gcaatgatag cacagctcca cagaaggtgc ttttggcgtt ttccggtcca 420

ggcccaggtg ctctaaaggt aagtcgcggc cgactgctag ggcttctgca ccttggtcca 480

ggcccaggtg tcaggcatca ctttacccct agtgagggtc caggcccagg tgtgcgtctg 540

atccgcgcca cagcatcagg tccaggccca ggttctcata ttcagttgat ttataactta 600

gcgaagttcg tcgcggcgtg gactttgaag gcggcggcgt ctcatattca gttgatttat 660

aacttatga 669

<210> 11

<211> 1073

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 添加表达组件后的融合蛋白基因

<400> 11

taatacgact cactataggg cgaattgaca tttgcttctg acacaactgt gttcactagc 60

aacctcaaac agacaccgcc accatggaac aagagaaaga gcacaagaca gtggaaatga 120

aagcgagggg gacacggagg aatcttgaac ccggcaagtc tttttggtgc aggatagggc 180

atgaccgatg tagtgagaac ggtccaggcc caggtcctga gaccatgagg tgggcaaccg 240

ttttagcctg tcttttgcca tccctactgg caattggtcc aggcccaggt ctggctgcgc 300

tgatttgctt tgtcattagg cttgcgaaga actgcggtcc aggcccaggt ctctatcgtt 360

ggcggtcgcc cgtcattgtg gagaaagggg gtaaggttga ggtcgaaggt cacctgatcg 420

acctcaagag agttgtgctt gatggttccg cggcaacccc tttaaccaga gtttcagcgg 480

aactatgggg tcgtctcggt ccaggcccag gttgcaatga tagcacagct ccacagaagg 540

tgcttttggc gttttccggt ccaggcccag gtgctctaaa ggtaagtcgc ggccgactgc 600

tagggcttct gcaccttggt ccaggcccag gtgtcaggca tcactttacc cctagtgagg 660

gtccaggccc aggtgtgcgt ctgatccgcg ccacagcatc aggtccaggc ccaggttctc 720

atattcagtt gatttataac ttagcgaagt tcgtcgcggc gtggactttg aaggcggcgg 780

cgtctcatat tcagttgatt tataacttat gagctcgctt tcttgctgtc caatttctat 840

taaaggttcc tttgttccct aagtccaact actaaactgg gggatattat gaagggcctt 900

gagcatctgg attctgccta ataaaaaaca tttattttca ttgcaaaaaa aaaaaaaaaa 960

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1073

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> T7启动子

<400> 12

taatacgact cactatagg 19

<210> 13

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5'UTR序列

<400> 13

gcgaattgac atttgcttct gacacaactg tgttcactag caacctcaaa cagacacc 58

<210> 14

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 信号肽的编码序列

<400> 14

atggaacaag agaaagagca caagacagtg gaaatgaaag cgagggggac acggaggaat 60

<210> 15

<211> 12

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Kozak序列

<400> 15

gccaccgcca cc 12

<210> 16

<211> 132

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3'UTR序列

<400> 16

gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 60

taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 120

tattttcatt gc 132

<210> 17

<211> 129

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> poly A序列

<400> 17

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120

aaaaaaaaa 129

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码Nsp2蛋白的开放编辑框ORF1的核苷酸序列一

<400> 18

gctggaaaaa gagcgaga 18

<210> 19

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码Nsp2蛋白的开放编辑框ORF1的核苷酸序列二

<400> 19

gagagagtga gaccttcaga cgactgggcc actgacgagg acctagtgaa cact 54

<210> 20

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码Nsp2蛋白的开放编辑框ORF1的核苷酸序列三

<400> 20

aaggccaacc cggtcactcc gggagaggta aaggaaaaga ttgaccagta tctc 54

<210> 21

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码Nsp9蛋白的开放编辑框ORF1的核苷酸序列

<400> 21

ggtaggtgtc ttgaagctga tctagcatct tgcgatcgga gcacccct 48

<210> 22

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码Nsp10蛋白的开放编辑框ORF1的核苷酸序列

<400> 22

gcgattcaac cggattaccg ggacaagctg atgtctatg 39

<210> 23

<211> 185

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 融合蛋白A氨基酸序列

<400> 23

Leu Glu Pro Gly Lys Ser Phe Trp Cys Arg Ile Gly His Asp Arg Cys

1 5 10 15

Ser Glu Asn Gly Pro Gly Pro Gly Pro Glu Thr Met Arg Trp Ala Thr

20 25 30

Val Leu Ala Cys Leu Leu Pro Ser Leu Leu Ala Ile Gly Pro Gly Pro

35 40 45

Gly Ser His Ile Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Gly Pro Gly Pro Gly Leu

50 55 60

Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala Lys Asn Cys Leu Tyr

65 70 75 80

Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile Val Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val

85 90 95

Glu Gly His Leu Ile Asp Leu Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala

100 105 110

Ala Thr Pro Leu Thr Arg Val Ser Ala Glu Leu Trp Gly Arg Leu Gly

115 120 125

Pro Gly Pro Gly Cys Asn Asp Ser Thr Ala Pro Gln Lys Val Leu Leu

130 135 140

Ala Phe Ser Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu

145 150 155 160

His Leu Gly Pro Gly Pro Gly Val Arg His His Phe Thr Pro Ser Glu

165 170 175

Val Arg Leu Ile Arg Ala Thr Ala Ser

180 185

<210> 24

<211> 185

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 融合蛋白B的氨基酸序列

<400> 24

Leu Glu Pro Gly Lys Ser Phe Trp Cys Arg Ile Gly His Asp Arg Cys

1 5 10 15

Ser Glu Asn Gly Pro Gly Pro Gly Pro Glu Thr Met Arg Trp Ala Thr

20 25 30

Val Leu Ala Cys Leu Leu Pro Ser Leu Leu Ala Ile Gly Pro Gly Pro

35 40 45

Gly Cys Asn Asp Ser Thr Ala Pro Gln Lys Val Leu Leu Ala Phe Ser

50 55 60

Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu Gly

65 70 75 80

Pro Gly Pro Gly Ser His Ile Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Gly Pro Gly

85 90 95

Pro Gly Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala Lys Asn

100 105 110

Cys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile Val Glu Lys Gly Gly Lys

115 120 125

Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu Lys Arg Val Val Leu Asp

130 135 140

Gly Ser Ala Ala Thr Pro Leu Thr Arg Val Ser Ala Glu Leu Trp Gly

145 150 155 160

Arg Leu Gly Pro Gly Pro Gly Val Arg His His Phe Thr Pro Ser Glu

165 170 175

Val Arg Leu Ile Arg Ala Thr Ala Ser

180 185

<210> 25

<211> 222

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 融合蛋白C的氨基酸序列

<400> 25

Leu Glu Pro Gly Lys Ser Phe Trp Cys Arg Ile Gly His Asp Arg Cys

1 5 10 15

Ser Glu Asn Gly Pro Gly Pro Gly Pro Glu Thr Met Arg Trp Ala Thr

20 25 30

Val Leu Ala Cys Leu Leu Pro Ser Leu Leu Ala Ile Gly Pro Gly Pro

35 40 45

Gly Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala Lys Asn Cys

50 55 60

Gly Pro Gly Pro Gly Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile Val Glu

65 70 75 80

Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu Lys Arg

85 90 95

Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Leu Thr Arg Val Ser Ala

100 105 110

Glu Leu Trp Gly Arg Leu Gly Pro Gly Pro Gly Cys Asn Asp Ser Thr

115 120 125

Ala Pro Gln Lys Val Leu Leu Ala Phe Ser Gly Pro Gly Pro Gly Ala

130 135 140

Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu Gly Pro

145 150 155 160

Gly Pro Gly Val Arg His His Phe Thr Pro Ser Glu Gly Pro Gly Pro

165 170 175

Gly Val Arg Leu Ile Arg Ala Thr Ala Ser Gly Pro Gly Pro Gly Ser

180 185 190

His Ile Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr

195 200 205

Leu Lys Ala Ala Ala Ser His Ile Gln Leu Ile Tyr Asn Leu

210 215 220

Claims

1.含有中和抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白在制备mRNA疫苗中的应用，所述结构蛋白选自(ⅰ)～(ⅲ)中至少一种；

(ⅰ)膜蛋白或其衍生物；

(ⅱ)M蛋白或其衍生物；

(ⅲ)N蛋白或其衍生物；

优选地，所述膜蛋白包括GP3、GP4或GP5中至少一种。

2.权利要求1所述含有中和抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白联合具有抗原活性的非结构蛋白在制备mRNA疫苗中的应用，所述非结构蛋白包括Nsp蛋白或其衍生物；

优选地，所述Nsp蛋白包括Nsp2、Nsp9或Nsp10中至少一种。

3.第一mRNA分子，其特征在于，所述第一mRNA分子编码第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包括通过柔性linker连接的至少两个来源于含有中和抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白的多肽片段；

优选地，所述含有中和抗原表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白选自权利要求1所述的结构蛋白；

优选地，编码GP3蛋白的开放编辑框ORF3的核苷酸序列为SEQ ID No.1；

优选地，编码GP4蛋白的开放编辑框ORF4的核苷酸序列为SEQ ID No.2；

优选地，编码GP5蛋白的开放编辑框ORF5的核苷酸序列为SEQ ID No.3或SEQ ID No.4；

优选地，编码M蛋白的开放编辑框ORF6的核苷酸序列为SEQ ID No.5；

4.第二mRNA分子，其特征在于，所述第二mRNA分子编码第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包括通过柔性linker连接的至少一个权利要求3所述的多肽片段和至少一个来源于具有抗原活性的非结构蛋白的多肽片段；

优选地，所述具有抗原活性的非结构蛋白选自权利要求2所述的非结构蛋白；

优选地，编码Nsp2蛋白的开放编辑框ORF1的核苷酸序列选自SEQ ID No.18～SEQ IDNo.20中任一条序列；

优选地，编码Nsp9蛋白的开放编辑框ORF1的核苷酸序列为SEQ ID No.21；

5.构建体，其特征在于，所述构建体包括第一mRNA分子或第二mRNA分子，所述构建体的核苷酸序列还包括UTR序列、Kozak序列、信号肽编码序列、启动子序列和poly(A)序列；

优选地，所述UTR序列包括核苷酸序列如SEQ ID No.13所示的5’UTR序列和核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的3’UTR序列；

优选地，所述Kozak序列的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；

优选地，编码所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；

优选地，所述启动子包括T7启动子，核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；

6.生物材料，其特征在于，包括：

(a)重组载体，包括权利要求5所述的构建体和质粒载体；

(b)转化体，包括含有权利要求5所述的构建体，或(a)重组载体的宿主细胞；

优选地，所述质粒载体包括pcDNA3.1、CET 1019HS-puro、pIRES或pRL-SV40，进一步优选为pcDNA3.1；

优选地，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；

进一步优选地，所述原核细胞包括DH5α、JM109或BL21，更加优选为DH5α；

7.权利要求5所述构建体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

8.权利要求3所述的第一mRNA分子、权利要求4所述的第二mRNA分子、权利要求5所述的构建体、权利要求6所述的生物材料，或者，权利要求7所述的制备方法在制备mRNA疫苗中的应用。

9.mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括，将权利要求5所述的构建体，或采用权利要求7所述制备方法得到的构建体与载体混匀后，依次经透析、浓缩和无菌过滤后得到mRNA疫苗；

优选地，所述载体包括脂质纳米颗粒；

优选地，所述脂质纳米颗粒组分包括D-Lin-MC3-DMA、二硬脂酞基磷脂酞胆碱、胆固醇和PEG化脂质PEG-DMG；

优选地，D-Lin-MC3-DMA、二硬脂酞基磷脂酞胆碱、胆固醇和PEG化脂质PEG-DMG的摩尔比为(50)：(14～9)：(35～40)：1，进一步优选为50:10:37.5:2.5；

优选地，所述制备方法包括，将D-Lin-MC3-DMA、二硬脂酞基磷脂酞胆碱、胆固醇和PEG化脂质PEG-DMG按照摩尔比于有机溶剂中混匀得到脂质纳米颗粒，而后与构建体混匀后，依次经透析、浓缩和无菌过滤后得到mRNA疫苗；

优选地，所述有机溶剂选自乙醇、异丙醇或甲醇，进一步优选为乙醇；

10.采用权利要求9所述制备方法制备得到的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗粒径为90～100nm，Zeta点位为-20～-7.5mV，包封率在90％以上。