CN116236567A - 猪圆环病毒抗原组合物及其制备方法、应用和疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种猪圆环病毒抗原组合物及其制备方法、应用和疫苗，涉及生物技术领域。本发明提供的猪圆环病毒抗原，包括猪圆环病毒2a型抗原、猪圆环病毒2b型抗原、猪圆环病毒2d型抗原。该抗原的表达量高、免疫原性好，能够有效诱导机体产生相应抗体，适于制备用于预防猪圆环病毒2a亚型、2b亚型和2d亚型的产品。本发明提供的上述抗原的制备方法，以293T细胞作为表达体系，降低了杂蛋白的产量，提高了目的蛋白的表达量，该制备方法稳定、高效且质量可控。本发明提供的猪圆环病毒三价疫苗，安全性好，能够有效的激发机体的免疫反应，同时实现对猪圆环病毒三种亚型的预防，扩大了疫病防控范围，节省了劳力，提高了工作效率。

Description

猪圆环病毒抗原组合物及其制备方法、应用和疫苗
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种猪圆环病毒抗原组合物及其制备方法、应用和疫苗。
背景技术
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)属圆环病毒科圆环病毒属，为致病性病毒，在世界范围内流行，PCV2对猪具有较强的易感性。PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪免疫缺陷综合征(PIDS)、猪皮炎与肾病综合征(PNDS)等多种疾病的主要病原，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪，引起广泛分布于全身器官、组织的病理损伤。造成猪只生长发育迟缓/受阻、精神沉郁、贫血、呼吸困难/咳嗽、淋巴结肿大、皮肤苍白/病变等。PCV2严重侵害猪的免疫系统，导致患猪形成免疫抑制而造成免疫缺陷，使机体更易感染PRRSV、PRV、PPV、MHP、PEDV、SIV、多杀性巴氏杆菌等其他病原，使患猪呈二重感染或三重混合感染，病猪的病死率也大大提高，造成十分严重的危害。
基于PCV2基因序列的不同，又将PCV2分为PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d，PCV2e五个基因亚型。经过流行病学调查发现，我国主要以PCV2a、PCV2b、PCV2d，3个亚型占优势，已经成为我国的主要流行株。为有效控制该病而减少经济损失，所以研制针对PCV2主要流行株的三价疫苗，对该病的防治具有重要意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供猪圆环病毒抗原组合物，该抗原免疫原性高。
本发明的第二目的在于提供上述猪圆环病毒抗原组合物的制备方法。
本发明的第三目的在于提供上述猪圆环病毒抗原组合物在制备预防猪圆环病毒的产品中的应用。
本发明的第四目的在于提供一种猪圆环病毒三价疫苗，以解决上述问题中的至少一种。
第一方面，本发明提供了猪圆环病毒抗原组合物，包括猪圆环病毒2a型抗原、猪圆环病毒2b型抗原和猪圆环病毒2d型抗原；
所述猪圆环病毒2a型抗原由PCV2a-xht基因片段表达，所述PCV2a-xht基因片段的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述猪圆环病毒2b型抗原由PCV2b基因片段表达，所述PCV2b基因片段的核酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述猪圆环病毒2d型抗原由PCV2d基因片段表达，所述PCV2d基因片段的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
作为进一步技术方案，所述猪圆环病毒抗原组合物中猪圆环病毒2a型抗原、猪圆环病毒2b型抗原和猪圆环病毒2d型抗原的质量比为1～3:1～3:1～3；
优选地，所述猪圆环病毒抗原组合物中猪圆环病毒2a型抗原、猪圆环病毒2b型抗原和猪圆环病毒2d型抗原的质量比为1:1:1。
第二方面，本发明提供了一种猪圆环病毒抗原组合物的制备方法，包括在293T细胞中表达编码所述猪圆环病毒抗原组合物的基因，获得猪圆环病毒抗原组合物。
作为进一步技术方案，将表达载体转入293T细胞中实现编码所述猪圆环病毒抗原组合物的基因的表达；
优选地，所述表达载体为：包含表达所述猪圆环病毒2a型抗原的基因的表达载体、包含表达所述猪圆环病毒2b型抗原的基因的表达载体和包含表达所述猪圆环病毒2d型抗原的基因的表达载体；
优选地，所述表达载体包括pCDNA3.1。
作为进一步技术方案，所述293T细胞拥有单加压系统。
作为进一步技术方案，将表达所述猪圆环病毒抗原组合物的293T细胞扩大培养。
作为进一步技术方案，所述扩大培养的步骤为：将293T细胞接种后在36～37℃下悬浮培养4～6天，然后在31～33℃下悬浮培养。
作为进一步技术方案，所述细胞接种的密度为5×105～5×106个/ml，优选为1×106个/ml；
优选地，悬浮培养的过程中，维持培养基中葡萄糖浓度为2.5～4g/L；
优选地，培养基的pH为7.2～7.6；
优选地，当细胞活率低于75％时，收获抗原。
第三方面，本发明提供了上述猪圆环病毒抗原组合物在制备预防猪圆环病毒的产品中的应用。
第四方面，本发明提供了一种猪圆环病毒三价疫苗，包括上述猪圆环病毒抗原组合物。
作为进一步技术方案，所述猪圆环病毒三价疫苗中还包括佐剂；
优选地，所述猪圆环病毒抗原组合物与佐剂的质量比为1～3:1～3；
优选地，所述佐剂优选水性佐剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的猪圆环病毒抗原组合物的表达量高、免疫原性好，能够有效诱导机体产生相应抗体，适于制备用于预防猪圆环病毒2a亚型、2b亚型和2d亚型的产品。
本发明提供的猪圆环病毒抗原组合物的制备方法，以293T细胞作为表达体系，降低了杂蛋白的产量，提高了目的蛋白的表达量，该制备方法稳定、高效且质量可控。
本发明提供的猪圆环病毒三价疫苗，主要以上述猪圆环病毒抗原组合物为活性物质，其安全性好，能够有效的激发机体的免疫反应，同时实现对猪圆环病毒三种亚型的预防，扩大了疫病防控范围，节省了劳力，提高了工作效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为pCDNA3.1-PCV2a-xht/PCV2b/PCV2d构建示意图；
图2为pCDNA3.1-PCV2a/PCV2b/PCV2d双酶切鉴定结果；
图3为7个片段的Western-blot结果；
图4为3个片段的Western-blot结果；
图5为2个片段的Western-blot结果。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面，本发明提供了猪圆环病毒抗原组合物，包括猪圆环病毒2a型抗原、猪圆环病毒2b型抗原和猪圆环病毒2d型抗原；
所述猪圆环病毒2a型抗原由PCV2a-xht基因片段表达，PCV2a-xht片段是由PCV2a去除NLS序列，增添信号肽组成，PCV2a-xht基因片段的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述猪圆环病毒2b型抗原由PCV2b基因片段表达，PCV2b片段由其Cap基因序列优化组成，PCV2b基因片段的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述猪圆环病毒2d型抗原由PCV2d基因片段表达，PCV2d序列如SEQID NO.3所示。
本发明提供的猪圆环病毒抗原组合物，表达量高、免疫原性好，能够有效诱导机体产生相应抗体，适于制备用于预防猪圆环病毒2a亚型、2b亚型和2d亚型的产品。
在一些优选的实施方式中，所述猪圆环病毒抗原组合物中猪圆环病毒2a型抗原、猪圆环病毒2b型抗原和猪圆环病毒2d型抗原的质量比例如可以为，但不限于1:3:1、1:1:1或3:1:3，优选为1:1:1。
第二方面，本发明提供了一种猪圆环病毒抗原组合物的制备方法，包括在293T细胞中表达编码所述猪圆环病毒抗原组合物的基因，获得猪圆环病毒抗原组合物。
在一些优选的实施方式中，将表达载体转入293T细胞中实现编码所述猪圆环病毒抗原组合物的基因的表达。
本发明提供的猪圆环病毒抗原组合物的制备方法，以293T细胞作为表达体系，降低了杂蛋白的产量，提高了目的蛋白的表达量，该制备方法稳定、高效且质量可控。
在一些优选的实施方式中，所述表达载体可以为1个、2个或3个，考虑到技术成本及操作的简便性，优选使用3个表达载体分别进行表达：包含表达所述猪圆环病毒2a型抗原的基因的表达载体、包含表达所述猪圆环病毒2b型抗原的基因的表达载体和包含表达所述猪圆环病毒2d型抗原的基因的表达载体。
优选地，所述表达载体包括但不限于pCDNA3.1，或者采用本领域技术人员所熟知的其他载体。
在一些优选的实施方式中，所述表达载体包含单加压系统，单加压系统为筛选用抗性基因标记，有利于高表达细胞的筛选。
所述含有单加压系统的表达载体和质粒构建完成后，在宿主细胞中进行高表达，利用该单加压系统对载体和质粒进行筛选，从而去除非质粒阴性正常细胞，获取含单加压系统质粒的细胞进行高表达。
在一些优选的实施方式中，将表达所述猪圆环病毒抗原组合物的293T细胞扩大培养，以提高目的抗原的产量。
在一些优选的实施方式中，所述扩大培养的步骤为：将293T细胞接种后在36～37℃下悬浮培养4～6天，然后在31～33℃下悬浮培养。
先将细胞在37℃培养4～6天，促进细胞正常增殖量，之后降温至31～33℃可降低细胞代谢，延迟细胞生长与蛋白表达时细胞活率，获取更高的抗原表达量。
在一些优选的实施方式中，所述细胞接种的密度为5×105～5×106个/ml，优选为1×106个/ml；
优选地，悬浮培养的过程中，维持培养基中葡萄糖浓度为2.5～4g/L；
优选地，培养基的pH为7.2～7.6；
优选地，当细胞活率低于75％时，收获抗原。
第三方面，本发明提供了上述猪圆环病毒抗原组合物在制备预防猪圆环病毒的产品中的应用。
本发明提供的猪圆环病毒抗原组合物，表达量高、免疫原性好，能够有效诱导机体产生相应抗体，适于制备用于预防猪圆环病毒2a亚型、2b亚型和2d亚型的产品。
第四方面，本发明提供了一种猪圆环病毒三价疫苗，包括上述猪圆环病毒抗原组合物。
该三价疫苗安全性好，能够有效的激发机体的免疫反应，同时实现对猪圆环病毒三种亚型的预防，扩大了疫病防控范围，节省了劳力，提高了工作效率。
在一些优选的实施方式中，所述猪圆环病毒三价疫苗中还包括佐剂；
优选地，所述猪圆环病毒抗原组合物与佐剂的质量比例如可以为，但不限于1:3、2:3、1:1、3:2或3:1；
优选地，所述佐剂优选水性佐剂，将该佐剂与猪圆环病毒抗原组合物配合制备疫苗，能够进一步提高疫苗的免疫效果。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1通过293T细胞表达系统表达抗原比较筛选
1材料和方法
1.1细胞培养
293T细胞、pcDNA3.1购自美国invitrogen公司，其中pcDNA3.1中包含单加压系统。
细胞密度和活率采用台盼蓝染色计数和观察。以感染后不同时间活细胞占总细胞的百分比计算细胞活率。细胞悬浮培养，细胞密度3×106个/ml，细胞活率大于95％时进行感染。
1.2ORF2基因合成与重组阳性质粒的构建
按照PCV2基因组(GenBank登录号AF055392，EU594437，AY181946)，人工优化与合成ORF2基因序列后，按不同的顺序插入至pMD-19T的HindIII和EcoR I或EcoRV和Xhol I酶切位点之间获得相应质粒pMD19-PCV2a-ys，pMD19-PCV2a-yh，pMD19-PCV2a-qxht，pMD19-PCV2a-xht，pMD19-PCV2a-P2A，pMD19-PCV2a-wuyi，pMD19-PCV2a-TAATG，pMD19-PCV2b，pMD19-PCV2b-xht，pMD19-PCV2d，pMD19-PCV2d-xht，11个质粒的目的基因片段的大小分别为714bp、714bp、663bp、675bp、1494bp、1431bp、1418bp、714bp、681bp、726bp、726bp，目的基因片段的序列依次如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.11所示。
1.3pCDNA3.1-PCV2a/2b/2d表达载体的构建及鉴定
将步骤1.2构建得到的11个克隆载体、pCDNA3.1表达载体，分别使用Hind III和EcoR I双酶切，或者EcoR V和Xhol I双酶切，酶切产物电泳后使用DNA回收试剂盒回收目的基因片段和pCDNA3.1基因片段，使用DNA连接试剂盒，将目的基因片段与pCDNA3.1基因片段连接过夜，构建得到11个重组质粒(即pCDNA3.1-PCV2a-ys、pCDNA3.1-PCV2a-yh、pCDNA3.1-PCV2a-qxht、pCDNA3.1-PCV2a-xht、pCDNA3.1-PCV2a-P2A、pCDNA3.1-PCV2a-wuyi、pCDNA3.1-PCV2a-TAATG、pCDNA3.1-PCV2b(即pCDNA3.1-PCV2b-yh)、pCDNA3.1-PCV2b-xht、pCDNA3.1-PCV2d(即pCDNA3.1-PCV2d-yh)和pCDNA3.1-PCV2d-xht)，其中pCDNA3.1-PCV2a-xht、pCDNA3.1-PCV2b和pCDNA3.1-PCV2d的结构图如图1所示。将表达载体导入DH5α感受态细胞并使用LB培养基培养过夜。使用质粒提取试剂盒提取培养菌质粒，使用双酶切鉴定目的片段，目的基因大小为714bp、714bp、663bp、675bp、1494bp、1431bp、1418bp、714bp、681bp、726bp、726bp；鉴定结果显示：酶切后，出现5400bp左右的载体片段和714bp、714bp、663bp、675bp、1494bp、1431bp、1418bp、714bp、681bp、726bp、726bp左右的目的条带，其中PCV2a-xht片段、PCV2b-yh片段和PCV2d-yh的凝胶电泳结果如图2所示(图中，1:2a-xht；2、6:DNAMarker 2000；3:2b-yh；4：DNA Marker 5000；5:2d-yh)，将阳性质粒送基因公司进行测序分析,测序结果与目的基因序列无碱基突变。
需要说明的是，Cap蛋白N端1～41位氨基酸为富含精氨酸的NLS(核定位信号肽)，能够介导蛋白进入细胞核。根据设计，例如PCV2a-xht基因片段，是指将PCV2a的NLS进行剪切，在添加其他信号肽，其他信号肽与NLS片段大小相差不多，因此片段大小基本一致，差别很小。
1.4表达细胞的建立与筛选
1.4.1转染
质粒的准备：将重组构建的质粒利用提取试剂盒进行提取(依照试剂盒说明书)，得到的质粒12000rpm下离心10min后待用；293T细胞的收集：将悬浮培养的293T细胞进行离心，并利用PBS溶液清洗一次后离心收集；
电转反应体系(200μl)：3×106个293T细胞、20μg质粒；电转条件及培养：将含有细胞和质粒的电转反应体系加入电击杯中，以1500V、10ms条件电击三次，电击后细胞转入两个含有10ml贴壁培养基的10cm平板中，以37℃、5％CO2培养1天。
1.4.2阳性克隆挑选
药物筛选：将培养1天的电击细胞培养平板换液，培养2天后加入终浓度0.7mg/ml的G418，培养2天后换入新的贴壁培养基培养7天；
阳性克隆挑选和检测：培养7天后的平板中，将贴壁生长的细胞挑至96孔板中，利用贴壁培养基，37℃、5％CO2培养7天后，加入100μl悬浮培养基表达培养2天，空板中培养基用于ELISA检测，将其中高表达克隆转至24孔板，利用贴壁培养基培养3天后换为6孔板培养，培养基用于蛋白质印迹法(Western-blot，WB)检测，根据实验结果最终得到高表达克隆。
1.4.3重组阳性克隆细胞的摇瓶培养
贴壁培养：将T75方瓶中培养的293T细胞利用胰酶消化后，加入15ml贴壁培养基静置37℃、5％CO2培养至单层，连续传代培养。
500ml锥形瓶悬浮培养：将T75方瓶中培养的2～3日后，293T细胞利用胰酶消化后，加入合适无血清培养基悬浮培养，然后将悬浮培养的重组293T细胞以1×106个/ml终浓度接入装有100ml 293T细胞培养基的500ml锥形瓶中，培养基中加入终浓度1mg/L维生素K，以转速80～100rpm，37℃、5％CO2，每天取样检测培养基中细胞密度、抗原组合物浓度和葡萄糖浓度。
1.4.4抗原组合物的表达、鉴定
蛋白质凝胶电泳：SDS-PAGE胶为上层5％浓缩胶和下层12％分离胶，以100V电压、400mA条件电泳10min，然后以150V电压、400mA电泳1h。
免疫印迹：将样品经SDS-PAGE凝胶分离后在转膜缓冲液中转至PDVF膜中，转膜条件为100V电压、400mA电流1h，PDVF膜经封闭和孵育Cap蛋白单克隆抗体作用4h后，加入HRP标记羊抗鼠二抗稀释液，室温孵育2h，经PBST清洗三次，每次10min，最后利用DAB显色液进行显色检测，结果如图3-图5所示。图3中，1:2a-xht；2:2a-qxht；3:2a-TAATG；4:2a-wuyi；5:2a-P2A；6:2a-yh；7:2a-ys。图4中，1:2a-xht；2:2b-yh；3:2d-yh。图5中，1:2b-xht；2:2d-xht(需要说明的是，“2a-xht”即为“PCV2a-xht片段”，其他同理)。
1.4.5抗原组合物的纯化
将表达的抗原组合物样品8000rpm离心10min，收集上清后，使用层析柱进行纯化，使用SDS-PAGE对其进行鉴定。鉴定结果表明：纯化产物经SDS-PAGE电泳后，目的蛋白片段与预期大小相符，于-80℃冻存。
2结果
为了筛选出更好的构建优化方式，进行了不同的构建理念设计：首先对PCV2a的Cap蛋白序列进行不同方式的构建与表达(共计7个)，1号(2a-ys)构建方式为PCV2a的Cap基因的原始序列；2号(2a-yh)为根据1号蛋白基础上进行的优化序列；3号(2a-qxht)为PCV2a去除Cap蛋白的核定位信号台(NLS)后序列，N端含有1～41位氨基酸为富含精氨酸的NLS，能够介导蛋白进入细胞核，形成胞内蛋白；4号(2a-xht)为剪切去NLS后，添加了一段分泌信号肽，为了增加蛋白的分泌蛋白量，有利于蛋白的收获与后期纯化；5号(2a-P2A)为添加2A肽序列形成融合蛋白，造成的剪切效率不同，其中P2A最高，F2A最低，我们选择最高的P2A肽进行实验；6号(2a-wuyi)为添加一段无意义寡聚核苷酸序列，不进行转录翻译，为了维护DNA结构稳定；7号(2a-TAATG)为添加TAATG，形成一个碱基重叠，连接相同的序列形成更多的位点表达。
据收获蛋白的检测结果显示，1号原始序列与2号优化后序列构建表达的蛋白有目的条带的条件下，WB检测的结果显示2号优化后具有更好的目的反应原性条带；5号、6号、7号结果反应条带较弱，不理想，3号与4号结果显示，直接剪切NLS后，没有显示出目的反应条带，而剪切NLS后再添加分泌信号肽后，进行优化的序列，具有更好的反应原性条带。因此，根据设计构建方式筛选具有相似表达结果且具有更亮反应原性条带的蛋白进行下一步实验。即选择2a-yh(2号)和2a-xht(4号)进行下一步实验。详细结果如表1所示。
表1 PCV2a不同构建方法实验室检测结果
Figure BDA0004089176290000121
为了筛选2b与2d的优化蛋白，在经过首次2a的不同构建方式筛选后，选择以2a更优的构建方式进行2b与2d的序列优化构建与蛋白同步表达优化及实验室检测。
经实验室蛋白检测与反应原性检测(检测方法参见1.44)，结果显示，2a基因的4号(2a-xht)较2号(2a-yh)具有更亮的反应原性目的条带，2b的8号(2b-yh)较9号(2b-xht)具有更亮的反应条带，2d的10号(2d-yh)较11号(2d-xht)具有更亮的反应原性条带。经过设计构建优化，最终选择具有相同表达的目的蛋白条带与更亮反应条带的构建方式，即2a-ys(4号)、2b-yh(8号)、2d-yh(10号)，具有更好的反应条带的蛋白进行后续实验。详细设计与构建方式如下表2所示：
表2PCV2a/2b/2d不同构建方法实验室检测结果
Figure BDA0004089176290000122
实施例2脂质体转染提高重组抗原的产量
1方法
以实施例1过程中获得的表达量最高的重组质粒制备抗原。
1.1.1质粒的准备：将重组构建的质粒利用提取试剂盒进行提取(依照试剂盒说明书)，得到的质粒加入75％乙醇，进行无菌处理，保证转染进细胞的质粒无菌，使用浓度检测仪测质粒浓度。
1.1.2细胞培养
37℃，8％CO2，湿度80％培养箱悬浮培养，细胞活率要求达到90％以上，对数期细胞活率应>95％。以3～5×105个/ml培养3～4天，进行传代培养。对应培养直径与转速，25mm对应120rpm±5rpm，50mm对应95rpm±5rpm。
1.1.3细胞冻存与复苏
冻存细胞，使培养的贴壁细胞1～2×106个/ml，300×g离心5min，加入合适体积，最终含10％DMSO和90％细胞完全培养基作为冻存液，使达3×106个/ml，按照常规方法冻存于液氮。使培养的悬浮细胞3～5×106个/ml，300×g离心5min，加入合适体积，最终含10％DMSO和90％细胞完全培养基作为冻存液，使达1×107个/ml。
复苏细胞，冻存从液氮取出，37℃水浴迅速恢复液态，离心去除冻存液，加入新的完全培养基培养细胞。
1.1.4转染
正常传代培养细胞，使培养细胞浓度达到较高水平，采用125ml摇瓶转染，每瓶25ml细胞，总量达75×106个细胞/瓶，95rpm±5rpm(50mm直径)培养速度。转染质粒终浓度达1.0μg/ml，质粒体积不超过25μL，与Opti-MEM I reduced Serum Medium 1.5ml配制为A液；Expifectamine 293 Reagent 80μL与Opti-MEM I reduced Serum Medium 1.4ml配制为B液，A液与B液混合后加入细胞内，混合于细胞液后于培养箱中。
1.1.5蛋白表达
已转染细胞于培养箱37℃，8％CO2，湿度80％培养箱悬浮培养，第2日添加ExpiFectamine 293Transfection Enhancer 1 150μL，第5日添加ExpiFectamine293Transfection Enhancer 2 1.5ml，最终体积～30ml。继续培养5～7日收获蛋白，实验室检测蛋白量与反应原性。
1.1.6阳性克隆筛选
药物筛选：将培养48h的转染细胞培养瓶，加入0.8mg/ml的G418筛选抗生素，分瓶以5×105个293T细胞/ml继续培养7天；
阳性克隆挑选和检测：37℃、5％CO2培养7天后的细胞瓶中，将贴壁生长的存活细胞传代培养，提高G418浓度为0.8mg/ml终浓度，稳定2～3代，细胞传代培养5～7天后，收取样品上清，蛋白质印迹法(Western-blot，WB)检测，根据实验结果最终得到高表达克隆。
1.2 293T单细胞克隆筛选
将高表达传代细胞，细胞活率>90％，进行梯度稀释种于96孔细胞培养板，平均0.5-1.0个细胞/孔，每孔200μl细胞培养基，待细胞长至80～100％后进行ELISA检测分析，筛选高表达单细胞克隆，进行扩大体积培养至24孔板、6孔板与细胞瓶。
1.3 293T单细胞克隆株的适应和驯化培养
采用TPP管放于37℃、5％CO2培养箱以100rpm条件，并逐级降低血清含量的方法进行驯化，每次传代进行细胞计数，根据细胞生长增殖情况与细胞活率缓慢降低血清，最终达到无血清培养基培养细胞，完成贴壁细胞至悬浮细胞的驯化。驯化过程中，收集传代样品进行检测，保留高表达样品继续传代。
1.4 293T阳性细胞悬浮培养
选择表达较高的3-5株阳性细胞，进行传代培养，稳定后，选择最高表达量的细胞株进行无血清扩大培养，在透气的摇瓶(购自Corning公司)，以37℃、转速100rpm条件下，以3×105个细胞/ml浓度维持和扩增培养。
1.5 5L生物反应器发酵培养：将悬浮培养的重组293T细胞以1×106个/ml终浓度接入装有5L培养基的生物反应器中，一般进行5～8倍放大，放大到特定体积时进行抗原的表达，在37℃培养至第5日将温度降至32℃，pH调整至7.5±0.1，并以适宜转速(50～80rpm)进行培养，在第4日和第9日加入10％起始工作体积的EfficienT Feed，每日检测葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于2.5g/L时，补充葡萄糖到3～4g/L。当细胞活率低于75％时，收获上清即为所需抗原。
上述培养过程中，先将细胞在37℃培养5日，促进细胞正常增殖量，5日后降温至32℃可降低细胞代谢，延迟细胞生长与蛋白表达时细胞活率，获取更高的抗原表达量。若不降低细胞培养温度，则细胞活率快速降低，减少抗原表达量。
通过优化该细胞株的培养条件、补料时间，补料量最终获得了抗原组合物表达。
1.6抗原纯化：将表达的抗原组合物样品8000rpm离心10min，收集上清后，使用层析柱进行纯化，使用SDS-PAGE对其进行鉴定。鉴定结果表明：纯化产物经SDS-PAGE电泳后，目的蛋白片段与预期大小相符，于-80℃冻存。
2筛选检测结果
2.1 96孔板单细胞克隆与检测
ELISA检测后，选择OD值较高的进行下一步试验，继续培养后，再进行检测与筛选OD值较高，逐级扩大与筛选培养，提高表达量。
表3表达抗原部分96孔板单细胞克隆ELISA检测与筛选1)2a-xht：
Figure BDA0004089176290000151
Figure BDA0004089176290000161
2)2b-yh：
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.122 0.285 0.283 0.209 0.254 0.406 0.382 0.336 0.335 0.252 0.249 0.317
B 0.207 0.333 0.284 0.295 0.309 0.317 0.264 0.248 0.341 0.227 0.212 0.162
C 0.194 0.241 0.219 0.271 0.146 0.289 0.428 0.297 0.183 0.212 0.160 0.237
D 0.134 0.233 0.306 0.212 0.210 0.256 0.288 0.190 0.302 0.219 0.179 0.238
E 0.197 0.354 0.203 0.373 0.344 0.348 0.185 0.184 0.171 0.208 0.257 0.254
F 0.171 0.280 0.164 0.320 0.393 0.357 0.168 0.259 0.215 0.411 0.282 0.246
G 0.234 0.260 0.385 0.281 0.256 0.334 0.199 0.345 0.303 0.217 0.173 0.081
H 0.116 0.177 0.312 0.311 0.342 0.298 0.225 0.431 0.218 0.212 0.217 0.088
3)2d-yh：
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.395 0.286 0.265 0.309 0.494 0.413 0.428 0.372 0.390 0.449 0.379 0.516
B 0.337 0.447 0.366 0.422 0.351 0.360 0.288 0.431 0.203 0.355 0.381 0.342
C 0.357 0.198 0.285 0.231 0.463 0.527 0.265 0.252 0.321 0.259 0.324 0.531
D 0.271 0.222 0.235 0.393 0.285 0.534 0.271 0.306 0.214 0.342 0.316 0.378
E 0.383 0.250 0.320 0.596 0.520 0.250 0.299 0.381 0.233 0.293 0.295 0.321
F 0.293 0.318 0.248 0.249 0.235 0.305 0.267 0.261 0.223 0.298 0.343 0.388
G 0.188 0.346 0.456 0.267 0.500 0.273 0.359 0.566 0.407 0.376 0.391 0.095
H 0.248 0.384 0.277 0.446 0.347 0.529 0.348 0.223 0.224 0.286 0.410 0.091
2.2较高OD值与扩大体积再检测与筛选部分ELISA检测结果
表4表达抗原单细胞筛选后继续培养与再筛选ELISA检测结果
1)2a-xht：
1 2 3 4
A 0.08 0.161 2.775 2.15
B 1.644 550 3.5 0.119
C 2.185 550 3.274 550
D 0.068 550 3.466 550
E 0.849 3.2 0.068 550
F 0.07 550 3.379 3.385
G 0.428 550 0.076 1.553
H 0.299 0.078 550 0.094
2)2b-yh：
Figure BDA0004089176290000162
Figure BDA0004089176290000171
3)2d-yh：
9 10 11 12
A 0.086 0.099 0.084 0.082
B 0.501 550 550 0.081
C 3.189 3.371 0.125 550
D 550 550 550 3.142
E 550 550 550 550
F 550 0.589 550 550
G 550 550 550 550
H 550 550 0.065 0.065
实施例3单价疫苗的配制
将表达收获的抗原组合物(即PCV2a-xht表达的猪圆环病毒2a型抗原、PCV2b表达的猪圆环病毒2b型抗原和由PCV2d表达的猪圆环病毒2d型抗原)中的单一抗原组分与水性佐剂按抗原组分与佐剂1:1质量比例混合在一起，最终配制成3个单苗。按照《中国兽药典》(现行版)附录要求无菌检验、稳定性测定合格后，放置于4℃备用。
实施例4三价疫苗的配制
将获得的猪圆环病毒2a型抗原、2b型抗原和2d型抗原按质量比1:1:1混合，然后将抗原组合物与水性佐剂按1:1比例混合在一起，最终配制成不同抗原含量的三价疫苗。按照《中国兽药典》(现行版)附录要求无菌检验、稳定性测定合格后，放置于4℃备用。
实施例5重组亚单位疫苗安全性和抗体检测
1方法
1.1动物和免疫
2～3周龄的仔猪(PCV2抗原和抗体阴性、PRRSV抗原和抗体阴性)。实施例3制备得到的疫苗。仔猪每组5只，分成4组，第一组为PCV2a-xht(猪圆环病毒2a型抗原)，第二组为PCV2b(猪圆环病毒2b型抗原)；第三组为PCV2d(猪圆环病毒2d型抗原)组，第四组为生理盐水对照组。仔猪分别肌肉注射2ml疫苗。在免疫前取血。新生仔猪免疫后28日采血，检测PCV2a、PCV2b、PCV2d抗体效价。在免疫前后观察每组猪的临床症状，观察是否有发热、厌食等现象。
1.2血清抗体检测
抗体检测方法按照猪圆环(PCV2)ELISA抗体检测试剂盒说明书进行。免疫后28日分离血清进行抗体检测。
2结果
2.1 PCV2抗体检测：20头免疫仔猪，免疫后28日采血检测PCV2 ELISA抗体效价，检测结果见表5。
表5实验仔猪PCV2抗体检测情况
Figure BDA0004089176290000181
实施例6重组三价亚单位疫苗安全性和抗体检测
1方法
1.1动物和免疫
2～3周龄的仔猪(PCV2抗原和抗体阴性、PRRSV抗原和抗体阴性)。实施例4制备得到的疫苗。新生仔猪每组5只，分成4组，1-3组新生仔猪分别肌肉注射5μg/头份、10μg/头份、20μg/头份疫苗。4组为生理盐水对照组，在免疫前取血。新生仔猪免疫后28日采血，检测PCV2a、PCV2b、PCV2d抗体效价。在免疫前后观察每组猪的临床症状，观察是否有发热、厌食等现象。
1.2血清抗体检测
抗体检测方法按照猪圆环(PCV2)ELISA抗体检测试剂盒说明书进行。免疫后28日采血分离血清进行抗体检测。
2结果
2.1PCV2抗体检测：20头免疫仔猪，免疫28日采血检测PCV2 ELISA抗体水平，检测结果见表6。
表6实验仔猪PCV2抗体检测情况
Figure BDA0004089176290000191
上述结果可知，疫苗中抗原含量的增加，对应抗体效价相应的升高，第一组中针对猪圆环病毒2a型抗原、猪圆环病毒2b型抗原和猪圆环病毒2d型抗原的抗体转阳率60％、40％、60％，第二组中针对猪圆环病毒2a型抗原、猪圆环病毒2b型抗原和猪圆环病毒2d型抗原的抗体转阳率均为100％，第三组中针对猪圆环病毒2a型抗原、猪圆环病毒2b型抗原和猪圆环病毒2d型抗原的抗体转阳率均为100％。PCV2a/2b/2d三价疫苗的各组分有效抗原10μg/头份时，免疫猪只能诱导产生较高水平PCV2抗体效价。
2.2免后观察：仔猪免疫后体重与对照组仔猪体重增长无明显差异，也无观察到发热、厌食等现象，表明本发明的疫苗安全，见表7。
表7疫苗免疫后安全性试验临床观察情况
Figure BDA0004089176290000201
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.猪圆环病毒抗原组合物，其特征在于，包括猪圆环病毒2a型抗原、猪圆环病毒2b型抗原和猪圆环病毒2d型抗原；
所述猪圆环病毒2a型抗原由PCV2a-xht基因片段表达，所述PCV2a-xht基因片段的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述猪圆环病毒2b型抗原由PCV2b基因片段表达，所述PCV2b基因片段的核酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述猪圆环病毒2d型抗原由PCV2d基因片段表达，所述PCV2d基因片段的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒抗原组合物，其特征在于，所述猪圆环病毒抗原组合物中猪圆环病毒2a型抗原、猪圆环病毒2b型抗原和猪圆环病毒2d型抗原的质量比为1～3:1～3:1～3；
优选地，所述猪圆环病毒抗原组合物中猪圆环病毒2a型抗原、猪圆环病毒2b型抗原和猪圆环病毒2d型抗原的质量比为1:1:1。
3.权利要求1或2所述猪圆环病毒抗原组合物的制备方法，其特征在于，包括在293T细胞中表达编码所述猪圆环病毒抗原组合物的基因，获得猪圆环病毒抗原组合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，将表达载体转入293T细胞中实现编码所述猪圆环病毒抗原组合物的基因的表达；
优选地，所述表达载体为：包含表达所述猪圆环病毒2a型抗原的基因的表达载体、包含表达所述猪圆环病毒2b型抗原的基因的表达载体和包含表达所述猪圆环病毒2d型抗原的基因的表达载体；
优选地，所述表达载体包括pCDNA3.1。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体包含单加压系统。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将表达所述猪圆环病毒抗原组合物的293T细胞扩大培养。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述扩大培养的步骤为：将293T细胞接种后在36～37℃下悬浮培养4～6天，然后在31～33℃下悬浮培养。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述细胞接种的密度为5×105～5×106个/ml，优选为1×106个/ml；
优选地，悬浮培养的过程中，维持培养基中葡萄糖浓度为2.5～4g/L；
优选地，培养基的pH为7.2～7.6；
优选地，当细胞活率低于75％时，收获抗原。
9.权利要求1或2所述的猪圆环病毒抗原组合物在制备预防猪圆环病毒的产品中的应用。
10.一种猪圆环病毒三价疫苗，其特征在于，包含权利要求1或2所述的猪圆环病毒抗原组合物；
优选地，所述猪圆环病毒三价疫苗中还包括佐剂；
优选地，所述猪圆环病毒抗原组合物与佐剂的质量比为1～3:1～3；
优选地，所述佐剂优选水性佐剂。
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